modelos experimentais in vitro e in vivo empregados...
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Modelos experimentais in vitro e in vivo empregados internacionalmente
para desenvolver produtos anticâncer
Raquel Carvalho Montenegro
Laboratório de Citogenética HumanaInstituto de Ciências BiológicasUniversidade Federal do Pará[email protected]
24/09/2013Simpósio sobre desenvolvimento de medicamentos oncológicos no Brasil
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BRhttp://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BR
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P&D DE MEDICAMENTOS
• 5.000 a 10.000 compostos estudados para cadamedicamento desenvolvido
• O processo pode durar de 10 a 15 anos!• O custo pode chegar a 800 milhões de dólares!
Alvo terapêutico DescobertaQuímica
MedicinalEstudos in
vitroEstudos in
vivoTestes
clínicos
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POR QUE PESQUISAR DE NOVAS DROGAS ANTICÂNCER?
• Segunda causa de morte por doença;• 10 milhões de mortes a cada ano;• 75 milhões de pessoas vivas, anualmente, com câncer.• Responsável por 1 morte por minuto no mundo;
• Mais de 1.560 mortes por dia (EUA);
• No ano 2030:•Esperar 27 milhões de casos incidentes de câncer•17 milhões de mortes por câncer
American Cancer Society, 2012
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METÁSTASE FALHA TERAPÊUTICA
CâncerCAUSAS
TOXICIDADE
RESISTÊNCIA TUMORAL
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O que fazer?
Onde procurar?
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ORIGEM DE NOVOS FÁRMACOS
• Modelagem Molecular
• Síntese Química
• Prospecção de Produtos Naturais
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ND, 57 (28%)S, 44 (21%)
S/NM, 38 (9%)N, 27 (13%)
B, 26 (13%)V, 5 (2%)
NB, 1 (0%)
S*, 20 (10%)
S*/NM, 8 (4%)
Síntese Derivado Natural
Natural
Cragg & Newman, 2012. J. Nat. Prod. 75, 311-335
Natural
MiméticoNatural
Farmacóforo/Mimético NaturalFarmacóforo
Natural
BiológicosVacinas
64%
Mercado de Fármacos Antineoplásicos
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PESQUISA DE FÁRMACOS ANTICÂNCER
Pré screen em 3 linhagens iniciou em1999. Em seguida em 60 linhagens- Elimina 80% dos
candidatos. Identificado o alvo molecular antes de proceder o teste
Hollow Fiber e Xenográfico (in vivo)- desde de 1998.
TRIAGEM IN VITRO – 3 LINHAGENS
60 LINHAGENSMECANISMO DE
AÇÃOHOLLOW
FIBERMODELOS
XENOGRÁFICOS
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DESENHO EXPERIMENTAL
ExtratoFração
Substância Pura
Teste de 3 linhagens tumorais
Ensaio do MTT
MECANISMO DE AÇÃOAlvo molecular
Seletividade
EFICÁCIA:Modelos murinos
Hollow fiberModelos
xenográficos
TOXICIDADE
Fracionamento bioguiado
Identificação dos compostos ativos
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PESQUISA DE FÁRMACOS ANTICÂNCER
TRIAGEM IN VITRO – 3 LINHAGENS
60 LINHAGENSMECANISMO DE
AÇÃOHOLLOW
FIBERMODELOS
XENOGRÁFICOS
Concentração única - Determinação do % de inibição em
3 linhagens
Extrato – 50 μg/mL
Fração/sub-fração 25 μg/mL
Substância pura - 5μg/mL ou 10μM
Novo teste para determinação da CI50 (concentração
que causa 50% de inibição)
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Rápido
Sensível
Confiável
Seguro
Eficiente
Custo-benefício
EXIGÊNCIAS DE UM TESTE DE CITOXICIDADE IN VITRO:
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Princípio: Análise colorimétrica que quantifica indiretamente as células viáveisbaseada na conversão do sal de MTT, um composto de cor amarela, a formazan, decoloração púrpura.
Absorbância em 595nm
3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difeniltetrazolium bromida
Redutase
mitocondrial
MTT
FORMAZAN
MÉTODO DO MTT
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Célula Viável
Célula Morta
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DETERMINAÇÃO DA CI50
CI50
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Mama (5)HS-578T (Carcinoma)
MCF-7 (Adenocarcinoma)
MDA-MB-231 (Adenocarcinoma)
MDA-MB-435 (Adenocarcinoma)
•MX-1 (Carcinoma)
Pulmão (9)A549 (Adenocarcinoma)
•HOP92 (Cél. Gr&e Indiferenciada)
NCI-H226 (Células esquamosa)
NCI-H23 (Adenocarcinma)
•NCI-H358M (Carcinoma brônquio-alveolar
•SW 1573 (Carcinoma)
•SW 1573-S1 (Modificado)
•SW 1573-2R50 (Modificado)
•SW1573-2R160 (Modificado)Leucemia (4)
HL60 (Promielocítica)
•K-562 (Eritroleucemia-mielóide crônica)
•CCRF-CEM (Linfoblástica aguda)
•MOLT-4 (Linfoblástica aguda)
Próstata (3)PC-3 (Carcinoma)
•DU-145 (Carcinoma)
PC-3/M (Carcinoma)
Cervix (1) HELA (Carcinoma)
Linhagens Celulares
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Cólon (8)COLO 205 (Adenocarcinoma)
•HCC 2998 (Adenocarcinoma)
HCT-116 (Carcinoma)
HCT-15 (Adenocarcinoma)
•LOVO (Adenocarinoma)
•WIRD (Adenocarcinoma)
•HCT-8 (Adenocarcinoma)
•SW-620 (Adenocarcinoma)
Melanoma (3)M14 (Melanoma melanótico)
•UACC-257 (Melanoma maligno)
•UACC-62 (Melanoma maligno)
Renal (7)SN12S1 (Carcinoma)
•SN12A1 (Carcinoma)
A704 (Adenocarcinoma)
UO-31 (Carcinoma)
•TK-10 (Carcinoma)
•SN12C (Carcinoma)
•A498 (Carcinoma)
SNC (4)SNB-78 (Astrocytoma)
•SF-295 (Gliobastoma)
SNB-19 (Gliobastoma)
U373 (Glioblastoma)
Linhagens Celulares
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Linhagens Celulares
Cólon HCT-116 p53wt
HCT-29 p53mt
Melanoma SK-MEL-19 p53wt BRAFmt RASwt
SK-MEL-28 p53mt BRAFmt RASwt
SK-MEL-103 p53wt BRAFwt RASmt
Gástrico ACP-03 (Adenocarcinoma tipo Intestinal) CMYC amplificado
ACP-02 (Adenocarcinoma tipo Difuso) CMYC amplificado
AGP-01 (Carcinomatose Peritoneal) CMYC amplificado
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LINHAGENS CELULARES
Melanoma Mama
PulmãoLeucemia
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COSTA-LOTUFO et al. ,2002.
Sangue +
Solução
salina
centrifugação
1500 rpm /
3min
Incubação sob
agitação1 h
centrifugação
1500 rpm /
10min
leitura em
espectrofotômetro
a 450 nm
Adição das
substâncias
Salina
Salina
+
DMSO
Substâncias teste
Triton
X-100
SE 2%
ATIVIDADE HEMOLÍTICAERITRÓCITO DE CAMUNDONGO
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VIABILIDADE CELULAR EXCLUSÃO DO AZUL DE TRIPAN
Azul de Tripan
Princípio: O corante azul de tripan permite a distinção individual das células viáveis, queexpulsam o corante de seu espaço interno e das não-viáveis, onde o corante penetratornando-as azuis.
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ENSAIO ANTIPROLIFERATIVOINCORPORAÇÃO DO BrdU
Ab 1ºAb
biotinilado
Estreptav-peroxidase
Imunocitoquímica
Células → BrdU → síntese de DNA → desnaturação → revelação
Princípio: A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga à timidina que éincorporada ao DNA das células em proliferação. Este ensaio permite avaliar o efeito dadroga-teste sobre a síntese de DNA . A detecção é feita por imunocitoquímica.
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ENSAIO ANTIPROLIFERATIVOINCORPORAÇÃO DO BrdU
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COLORAÇÃO DIFERENCIALMAY GRUNWALD GIEMSA
Princípio: O corante May Grünwald Giemsa utilizado para coloração de células é umamistura de corantes (eosina e azul de metileno) com características neutras, que coramos componentes nucleares e citoplasmáticos das células.
May Grunwald Giemsa
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COLORAÇÃO DIFERENCIALMAY GRUNWALD GIEMSA
CONTROLES
COMPOSTO 1
COMPOSTO 2
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COLORAÇÃO DIFERENCIALLARANJA DE ACRIDINA/BROMETO DE ETÍDIO
Princípio: Este ensaio permite diferenciar células viáveis daquelas em processo demorte por apoptose ou necrose pela marcação diferencial com brometo de etídio eacridina laranja.
Células viáveis Células apoptóticas Células necróticas
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MORTE CELULAR
Padrão de Fragmentação do DNA
DNA Ladder
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A invasividade das células tumorais representauma das várias propriedade necessárias para aformação de metástase
INVASÃO
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CITOMETRIA DE FLUXO
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MICROSCOPIA CONFOCAL
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INIBIÇÃO DE TOPOISOMERASE
SC-DNATopoisomerase
Inibidor
Análise
• 30 min a 37ºC;
• Parar a reação com SDS 10%;
• Digestão com PK;
• Extração de impureza com
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)
Eletroforese em gel de agarose 1%
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Detectar formas ativas e latentes das MMPs e quantificar aatividade enzimática
INIBIÇÃO DE METALOPROTEINASEZIMOGRAFIA
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ANÁLISE MOLECULAR
PCR
qPCR:mRNA
MicroRNA
WesternBlot
FISH
TOXICOGENÉTICA:
TESTE DO COMETAMICRONÚCLEO
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D0 D3
D6 D9
ESTUDOS IN VIVO: ANGIOGÊNESE
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D12 D15
D18 D21
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Inibição da angiogênese por uma substância teste administrada por via oral.
(A) Controle: bFGF ( 0.1 g/pelet ) + PMMA
(B) Substância teste: bFGF( 0.1 g/pelet ) + FH (100 g/pelet)
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Melanoma B16F10Subcutâneo
Camundongos black (C57Bl6)
Peso
corpóreoSobrevida
ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO
MODELO MURINO
Massa
tumoral
Administração do
fármaco
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– Carcinossarcoma 256 de Walker
– Sarcoma 180
– Melanoma B16
– Leucemia L1210
– Carcinoma de Ehrlich
– Carcinoma de Lewis
– Fibro-histiocitoma TEGS
ATIVIDADE ANTITUMORAL IN VIVO
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Implantadas no animal
(SC ou IP)
Legenda:
Hollow Fiber
Células Tumorais
Retirado
cirurgicamente
MTT
595nm
Tratamento com a
substância teste
MODELO HOLLOW FIBER
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Células inoculadas
(SC)
Tratamento com a
substância teste
( IP ou VO)
Sobrevida (PS)
calculada
MODELO XENOGRÁFICO
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CITOTOXICIDADE
Linhagens Tumorais Humanas:3 linhagens
Célula Normal
SUBSTÂNCIAS
SUBSTÂNCIAS
TRIADAS
Hemólise
Eritrócito de
camundongo
1ª Etapa Dano ao DNA
Viabilidade celular
Análise Morfológica
2ª Etapa
Morte Celular
Proliferação
Diferenciação
Migração /Invasão celular
3ª Etapa
4ª Etapa SUBSTÂNCIA (S) MAISPROMSSORA (S)
Via de sinalização
celular
FISH
Western Blot
RT-PCR
Linhagens Tumorais Humanas:60 linhagens
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http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BRhttp://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BR
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Platymiscium floribundum
O
O
R1
R2O
R3
R4OCH3
H
H
R1 R2 R3 R4
1 H H H OH
2 H CH3 H H
3 H CH3 OCH3 H
4 OH H H H
5 H H H H
Gardênia MilitãoTese de doutorado
Estudos com Platymiscium floribundum
PTEROCARPANOS
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2,3,9-TRIMETOXIPTEROCARPANO
Indução de apopotose
4
3
2
O
O
10 9
H3CO
OCH3
H3CO
M1
M2M1
M2
M1
M2M1
M2
Control DMSO
5g/mL2.5g/mL
• Atraso no ciclo celular em G2/M
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A B C
D EF
control 2,3,9-trimethoxypterocarpan 3,9-dimethoxypterocarpan
3-hydroxy-9-methoxypterocarpan 3,4-dihydroxy-9-methoxypterocarpan 3,10-dihydroxy-9-methoxypterocarpan
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LAMIN B
Figure 6. Confocal laser scanning microscopy (LSM) images of MCF-7 cells. The nuclei inred are evidenced by Propidium Iodate and lamina B in green evidenced by anti-laminaB-FITC. (A) Control cells and (B) cells from the first treatment with compound 1.22/07/2013 65a. Reunião Anual da SBPC
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MECANISMO DE AÇÃOMONASTROL
Mayer et al., 1999, Science 286, 971.22/07/2013 65a. Reunião Anual da SBPC
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A B
A) Capraria biflora L.;
Capraria biflora L.
O
O
O
Biflorina
CI50:
Células tumorais –
0,43 a 10,11 μg/mL
Linfócitos periféricos –
5,12 μg/mLB) raízes da C. biflora.
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BIFLORINA
ANTIOXIDANTE
PROPERTIES
CELL
DIFFERENTIATIO
N
0 10 20 30 40 50 60 700
25
50
75
100
125
Controle Dacarbazina Biflorina Associado
Dias
Sob
revid
a (
%)
0 5 10 15 20 25 300.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
*
***
*
Dias após o implante do tumor
Volu
me
Tu
mora
l (c
c3)
TUMOR GROWTH
SURVIVAL CURVE
APOPTOSIS
INTERACTS
WITH DNA
BLOCKS MYC
AMPLIFICATION
CITOTOXIC TO
CANCER CELLS
BIFLORINA
NATURAL PRODUCTS
DISPLAY SEVERAL ACTIVITIES
Vasconcellos et al. 2005;2007; 2010; 2011; Montenegro et al., 2013
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BRhttp://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BR
-
0 10 20 30 40 50 60 700
25
50
75
100
125
Controle Dacarbazina Biflorina Associado
Dias
Sob
revid
a (
%)
BIFLORINA
INCREASE SURVIVAL IN MICE BEARING MELANOMA
BIFLORIN
Su
rva
vil
(%)
Days
Combinatio
n
Dacarbazin
e
Contr
ol
NATURAL PRODUCTS
-
INVASION ASSAY
BIFLORINA
INHIBITION OF MDA-MB-435 CELLS INVASION IN
VITRO
DMSO 1μM
2.5μM 5μM
1 2.5 5
NATURAL PRODUCTS
-
C
C
Compound 7
BIFLORINA
DISRUPT CYTOSQUELETON IN VITRO
Compound 7
Compound 7
Compound 7
NATURAL PRODUCTS
-
N-Cad
β-actina
DMSO B1 B2.5 B5.0
N-cadherin :
increase migration, invasion, and secretion of extracellular proteases in breast tumor cells
N-cadherin, is upregulated in invasive cancer;
N-cadherin expressing cells migrated more efficiently and showed increased invasion of Matrigel;
Gravdal et al., 2007.Christofori, G. NATURE, 2006.
BIFLORINA
DOWN-REGULATES N-CADHERIN
NATURAL PRODUCTS
-
Gravdal et al., 2007.Christofori, G. NATURE, 2006.
PROPOSED MECHANISM
Primary tumor
E E
EE
E- Cadherin
EEE
N
NN
N-Cadherin
NN
N
X
X
X
BIFLORINA
NATURAL PRODUCTS
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Toxicologia de Nanocarreadores em Primatas não-humanos
Cebus apella mantidos em cativeiro no Centro Nacional de Primatas;
- Cinética e Biodistribuição do Nanocarreador
- Toxicologia: Quimioterapia com Paclitaxel e Paclitaxel nanocarreado
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BRhttp://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BR
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• FIGURA 4. 1 Biodistribuição tecidual da nanoemulsão em Cebus apella, através da captação tecidual de [3H]-colesterol livre injetado pela via endovenosa após 24 horas.
719,28
33,23
50,14
177,66 190,27
49,8634,09
15,69
49,85 70,21
9,310,00
100,00
200,00
300,00
400,00
500,00
600,00
700,00
800,00
Fígado Testículo Rins Baço Suprarenal
Pâncreas Coração Musculo Pulmão Medulaóssea
Cérebro
BIODISTRIBUIÇÃO DA NANOPARTÍCULA
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BRhttp://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BR
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Universidade Federal do Ceará
Letícia V. Costa-Lotufo
Manoel Odorico de Moraes
Cláudia Pessoa
Ana Paula N.N.Alves
Paula Jimenez
Diego Veras
Danilo Rocha
Otília Pessoa
Edilberto Rocha Silveira
Maria Conceição F. Oliveira
Mary Anne Silva Lima
Universidade Federal do Pará
Raquel Carvalho Montenegro
Rommel Mário Rodrigues Burbano
Bruno Soares
Leilane Barreto
Laine Celestino
Gilmara Bastos
Milton Nascimento Silva
Alberto Arruda
Mara Arruda
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BRhttp://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/figuras/ufpa_logo.jpg&imgrefurl=http://www.ourinhos.unesp.br/gedri/&h=714&w=565&sz=90&hl=pt-BR&start=3&tbnid=GzOLb1Vqi8pN_M:&tbnh=140&tbnw=111&prev=/images?q=UFPA&gbv=2&svnum=10&hl=pt-BR
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MUITO OBRIGADA!!!
UNIVERSIDADE
FEDERAL DO PARÁ
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