modulation der interferon-γ vermittelten persistenz von ... · aus dem institut für medizinische...
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Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. med. Werner Solbach
Modulation der Interferon-γ vermittelten
Persistenz von Chlamydia pneumoniae durch
Hypoxie
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
Aus der Sektion Naturwissenschaften
vorgelegt von
Inga Dietz
aus Bremen
Lübeck 2012
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jan Rupp 2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Norbert Tautz
Tag der mündlichen Prüfung: 04.07.2012
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 05.07.2012
Inhaltsverzeichnis 1
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ 4
1 Zusammenfassung ............................................................................................... 8
2 Einleitung ............................................................................................................ 9
2.1 Grundlagen von Chlamydien ...................................................................... 9
2.1.1 Taxonomische Einteilung ..................................................................... 9
2.1.2 Biologie des Entwicklungszyklus ....................................................... 11
2.1.3 Persistenz ........................................................................................... 12
2.1.4 C. pneumoniae assoziierte Krankheitsbilder ....................................... 13
2.2 Wechselwirkung zwischen dem Immunsystem und C. pneumoniae .......... 15
2.2.1 Typ II Interferon vermittelte Jak-STAT Signalkaskade ...................... 16
2.2.2 Indolamin 2,3-Dioxygenase ............................................................... 17
2.3 Hypoxie .................................................................................................... 19
2.3.1 Bedeutung von Sauerstoff in der Zelle ............................................... 19
2.3.2 Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1) ............................................ 20
2.3.3 C. pneumoniae-Infektionen unter Hypoxie ......................................... 21
2.4 Fragestellung ............................................................................................ 22
3 Material ............................................................................................................. 23
3.1 Geräte ....................................................................................................... 23
3.2 Verbrauchsmaterialien .............................................................................. 24
3.3 Chemikalien und Reagenzien.................................................................... 25
3.4 Puffer und Lösungen ................................................................................ 27
3.5 Zelllinien .................................................................................................. 27
3.6 Medien und Medienzusätze ...................................................................... 28
3.7 Enzyme und Kits ...................................................................................... 28
3.8 Oligonukleotide ........................................................................................ 28
3.8.1 Primer für die cDNA Synthese ........................................................... 28
3.8.2 Primer für die quantitative RT-PCR ................................................... 29
3.8.3 siRNA für RNA-Interferenz Analysen ............................................... 30
3.9 Antikörper ................................................................................................ 31
3.9.1 Antikörper für Western Blot Analysen ............................................... 31
3.9.2 Antikörper für Immunfluoreszenzfärbungen....................................... 32
3.10 Software ................................................................................................... 32
4 Methoden........................................................................................................... 33
4.1 Zellkultur ................................................................................................. 33
4.1.1 Kultivierung von Zelllinien ................................................................ 33
Inhaltsverzeichnis 2
4.1.2 Bestimmung der Zellzahl ................................................................... 34
4.1.3 Konservierung von Zelllinien ............................................................. 34
4.2 Präparation von humanem Lungengewebe ................................................ 35
4.3 Infektionsbiologische Methoden ............................................................... 35
4.3.1 Herstellung eines Infektionsstocks von C. pneumoniae ...................... 35
4.3.2 Infektion von Zelllinien mit C. pneumoniae ....................................... 36
4.3.3 Infektion von humanem Lungengewebe ............................................. 36
4.3.4 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Tryptophan ............. 36
4.3.5 Reaktivierungs-Modell von C. pneumoniae durch Hypoxie ................ 37
4.3.6 Wiederanzucht ................................................................................... 37
4.3.7 Quantifizierung des Chlamydien-Gehalts ........................................... 38
4.4 Mikroskopie ............................................................................................. 38
4.4.1 Direkter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae ........................... 38
4.4.2 Indirekter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae ......................... 39
4.4.3 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung von α-smooth muscle actin ........ 39
4.4.4 Live Cell Imaging .............................................................................. 40
4.5 Proteinbiochemische Methoden ................................................................ 40
4.5.1 Probengewinnung .............................................................................. 40
4.5.2 SDS-PAGE ........................................................................................ 40
4.5.3 Western Blot Analyse ........................................................................ 41
4.6 Molekularbiologische Methoden............................................................... 42
4.6.1 RNA-Isolation ................................................................................... 42
4.6.2 Reverse Transkription ........................................................................ 42
4.6.3 Quantitative RT-PCR ......................................................................... 43
4.6.4 RNA-Interferenz Analysen ................................................................ 44
4.6.5 Inhibition von TGF-β ......................................................................... 45
4.6.6 Transkriptom-Analysen ..................................................................... 45
4.7 Metabolom-Analysen ............................................................................... 46
4.7.1 Aufarbeitung von Metaboliten für das FT/ICR-MS ............................ 46
4.7.2 Analyse der Metabolite ...................................................................... 47
4.7.3 Auswertung der relevanten Massen .................................................... 47
4.8 Statistik .................................................................................................... 48
5 Ergebnisse ......................................................................................................... 49
5.1 Untersuchungen der IFN-γ induzierten Persistenz von C. pneumoniae unter Hypoxie ........................................................................................... 49
5.1.1 Aufhebung der Persistenzbildung von C. pneumoniae durch Hypoxie 49
5.1.2 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Hypoxie .................. 52
5.2 Analyse von IFN-γ induzierenden Signalwegen unter Hypoxie ................. 53
Inhaltsverzeichnis 3
5.2.1 Beeinflussung der Jak-STAT Signalkaskade durch Hypoxie .............. 53
5.2.2 Beeinflussung der IDO Expression durch Hypoxie ............................. 57
5.2.3 Beeinflussung weiterer IFN-γ regulierter Proteine durch Hypoxie ...... 61
5.3 Analyse von IL-6 unter Hypoxie ............................................................... 65
5.4 Einfluss von C. pneumoniae auf Differenzierungs-prozesse von Epithelzellen............................................................................................. 66
5.4.1 Einfluss von C. pneumoniae auf E-Cadherin ...................................... 66
5.4.2 Einfluss von C. pneumoniae auf α-smooth muscle actin (α-SMA) ...... 68
5.4.3 Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten Zellen ................... 70
5.4.4 TGF-β unabhängige C. pneumoniae vermittelte Remodelingprozesse 70
5.4.5 Beteiligung von HIF-1 an C. pneumoniae vermittelten Remodelingprozessen ........................................................................ 71
5.5 Etablierung von Transkriptom-Analysen .................................................. 75
5.6 Etablierung von Metabolom-Analysen ...................................................... 79
5.6.1 Hauptkomponentenanalyse ................................................................ 79
5.6.2 Unterschiede der Metabolite in infizierten Zellen unter Normoxie und Hypoxie ............................................................................................. 81
6 Diskussion ......................................................................................................... 83
6.1 Hypoxie verhindert die Persistenzinduktion von C. pneumoniae ............... 83
6.2 Hypoxie reduziert die Aktivität der Jak-STAT Signalkaskade ................... 85
6.3 Entzündungsvorgänge in persistent infizierten Zellen ............................... 88
6.4 C. pneumoniae vermittelt Umbauprozesse von Epithelzellen .................... 89
6.5 Weiterführende Analysen zu C. pneumoniae Infektionen unter Hypoxie ... 93
6.6 Schlussbetrachtung ................................................................................... 96
Literaturverzeichnis ................................................................................................ 98
Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... 106
Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 108
A Anhang ............................................................................................................ 109
A.1 Lebenslauf .............................................................................................. 109
A.2 Publikationen ......................................................................................... 110
A.3 Kongressbeiträge .................................................................................... 111
A.4 Danksagung ............................................................................................ 112
Abkürzungsverzeichnis 4
Abkürzungsverzeichnis Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Abkürzungen aufgelistet.
Englische Abkürzungen wurden ins Deutsche übersetzt, wenn diese im deutschen
Sprachgebrauch vorhanden sind.
°C Grad Celsius
A. dest. Destilliertes Wasser
ADP Adenosindiphosphat
ALK Activin receptor-like kinase
APS Ammoniumpersulfat
ATCC American Type Culture Collection
ATP Adenosintriphosphat
bHLH Basic helix-loop-helix
bp Basenpaare
CAP Community acquired pneumonia, ambulant erworbene Pneumonie
cDNA Complementary DNA, komplementäre DNA
COPD Chronic obstructive pulmonary disease, chronisch obstruktive Lungenerkrankung
CPAF Chlamydial protease-like activity factor
Cpn Chlamydia pneumoniae
CXCR C-X-C Chemokinrezeptor
DEPC Diethylpyrocarbonat
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DTT 1,4-Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EK Elementarkörperchen
EMT Epithelial-mesenchymal transition
ESI Elektrospray Ionisation
Abkürzungsverzeichnis 5
et al. Und andere
Fa. Firma
FEV1 Forciertes exspiratorisches Volumen in der ersten Sekunde
FGFR2 Fibroblast-growth-factor receptor-2
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FKS Fötales Kälberserum
FSP1 Fibroblast-specific protein-1
FT/ICR-MS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer, Fouriertransformation-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer
GAS IFN-γ aktivierte Sequenz
GLUT Glukosetransporter
GOLD Global initiative for chronic obstructive lung disease
h Hour, Stunde
HIF-1 Hypoxia-inducible factor-1, Hypoxie-induzierbarer-Faktor-1
hpi Hours post infection
HRE Hypoxia responsive element
HRP Horseradish peroxidase, Meerrettichperoxidase
IDO Indolamin 2,3-Dioxygenase
IFN-γ Interferon-gamma
IFNGR IFN-γ Rezeptor
IFT Immunfluoreszenztest
IFU Infection forming units
IL Interleukin
iNOS Inducible nitric oxide synthase, induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase
IP-10 IFN-γ induzierbares Protein 10
IRF-1 Interferon regulierter Faktor-1
ISRE IFN-stimulated response element
Jak Januskinase
kbp Kilobasenpaare
Abkürzungsverzeichnis 6
kDA Kilodalton
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
LDHA Laktatdehydrogenase A
LPS Lipopolysaccharid
m/z Masse-zu-Lade-Verhältnis
mmHg Millimeter-Quecksilbersäule
mRNA Messenger RNA
NEAA Non-essential amino acid, nicht-essentielle Aminosäuren
NF-κB Nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells
NK-Zellen Natürliche Killerzellen
NO Stickstoffmonoxid
NTP Nukleotidtriphosphat
PAMP Pathogen-associated molecular pattern, Pathogen-assoziierte molekulare Muster
PBS Phosphate buffered saline, Phosphatgepufferte Salzlösung
PCA Principal component analysis, Hauptkomponentenanalyse
PCR Polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion
PDK Pyruvatdehydrogenase Kinase
PHD Prolyl-Hydroxylase
PIAS Protein inhibitors of activated STATs
PKCδ Protein kinase C δ
PLS-DA Partial least squares-Diskriminanzanalyse
ppb Parts per million
ppm Parts per billion
PRR Pattern recognition receptors
RK Retikularkörperchen
RNA Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
rpm Rounds per minute
rRNA Ribosomale RNA
RSV Respiratorisches Synzytial-Virus
Abkürzungsverzeichnis 7
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse-Transkriptase PCR
SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
Ser Serin
SH2 Src-homology 2
SHP SH2 containing phosphatase
SMA Smooth muscle actin
SMAD Small mother against decapentaplegic
SOCS Suppressor of cytokine signaling
STAT Signal transducers and activators of transcription
STRA13 Stimulated with retinoic acid 13
TBS Tris-gepufferte Saline
TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin
TGF-β Transforming growth factor β
Th T-Helferzellen
TLR Toll-like Rezeptor
Tuf Thermo unstable elongation factor
Tyr Tyrosin
U Units
VEGF Vascular endothelial growth factor
VHL Von Hippel-Lindau Protein
VIP Variable importance in the projection
Zusammenfassung 8
1 Zusammenfassung Chlamydia pneumoniae ist ein obligat intrazelluläres Bakterium, welches im Rahmen
akuter und chronisch-persistierender Infektionen in der Lunge mit dem
Krankheitsbild der COPD (chronisch obstruktive Lungenerkrankung) assoziiert wird.
Direkte Wechselwirkungen zwischen dem Erreger und pulmonalen Wirtszellen
wurden bislang hauptsächlich unter Normoxie (20% O2) untersucht. Dabei treten in
der Lunge bereits physiologisch geringere Sauerstoffkonzentrationen auf, die durch
Entzündungsreaktionen oder bei reduzierter Ventilation von Lungenabschnitten
weiter abfallen können. Es ist bekannt, dass C. pneumoniae von niedrigen
Sauerstoffkonzentrationen (Hypoxie) profitiert, indem die Infektionsrate und das
Wachstum gesteigert sind. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal das Verhalten der
Interferon-gamma (IFN-γ) vermittelten Persistenz von C. pneumoniae in
Lungenepithelzellen unter Hypoxie analysiert. Es zeigte sich, dass bei
Sauerstoffkonzentrationen ≤ 3% die antibakterielle Wirkung von IFN-γ aufgehoben
wurde. Die verhinderte Persistenzinduktion ging mit einer reduzierten Aktivität der
Jak-STAT Signalkaskade und Expression von Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) in
der frühen Phase der Infektion einher. In Zellen mit persistierender C. pneumoniae-
Infektion führte ein Abfall der Sauerstoffkonzentration zu einer Reaktivierung.
Hauptmerkmale einer COPD sind chronisch-rezidivierende Entzündungsprozesse
und fortschreitende Umbauvorgänge des Lungenepithels. Interessanterweise war ein
Entzündungsprozess, gekennzeichnet durch Interleukin-6 (IL-6), stärker in persistent
infizierten Zellen als in Zellen mit einer reaktivierten Infektion zu detektieren.
Zudem konnten zelluläre Umbauvorgänge in C. pneumoniae infizierten
Lungenepithelzellen nachgewiesen werden. Dabei wiesen persistent infizierte Zellen
unter Normoxie sowie akut infizierte Zellen unter Hypoxie einen ausgeprägten
Umbau auf. Demnach könnten Umbauprozesse, verursacht durch eine persistente
oder reaktivierte C. pneumoniae-Infektion, zur Pathogenese von chronischen
Erkrankungen beitragen. Um weitere Einblicke auf Erreger- und Wirtsseite unter
Hypoxie zu erlangen, wurden Transkriptom- und Metabolom-Analysen etabliert.
Erste Analysen des Metaboloms zeigten, dass sich dieses während einer Infektion
unter Normoxie und Hypoxie unterschied und Veränderungen z.B. im
Kohlenhydrat-, Lipid- und Aminosäure-Metabolismus zu detektieren waren. Diese
Methode könnte in Zukunft neue Ansatzpunkte für Therapien oder Biomarker
liefern.
Einleitung 9
2 Einleitung
2.1 Grundlagen von Chlamydien Chlamydien sind gramnegative Bakterien, die auf Grund ihrer obligat intrazellulären
Lebensform zuerst zu den Viren gezählt wurden. Schon 1907 entdeckten Ludwig
Halberstädter und Stanislaus von Prowazek Einschlusskörper von Chlamydien in
Konjunktivalabstrichen von Trachomen [42]. Im Jahre 1932 beschrieben Bedson
et al. den für Chlamydien charakteristischen Entwicklungszyklus [11], aber erst 1966
wurden Chlamydien den Bakterien zugeordnet [80].
Eine Vielzahl von Lebewesen wird von Chlamydien infiziert. So infiziert z.B.
Chlamydia psittaci in erster Linie Vögel, kann jedoch von diesen, bei engem
Kontakt, auf den Menschen übergehen und zur Ornithose führen [12]. Ein wichtiger
Vertreter der humanpathogenen Chlamydien ist Chlamydia trachomatis, dessen
verschiedene Serovar Infektionen des Auges sowie sexuell übertragbare Infektionen
des Urogenitaltrakts verursachen [99]. Der Fokus dieser Arbeit liegt bei dem dritten
Vertreter der humanpathogenen Chlamydien, Chlamydia pneumoniae. Dieser wurde
1965 von der Bindehaut eines Kindes aus Taiwan isoliert und seit 1971 als TW-183
bezeichnet [61]. Nach Isolation eines respiratorischen Isolats (AR-39) von einem
Studenten mit Pharyngitis in Seattle 1983 wurde es als humanpathogen eingestuft.
Zuerst wurde der Erreger, entsprechend der beiden Erstisolate, als TWAR bezeichnet
und erst 1989 wurde TWAR als dritte Spezies C. pneumoniae taxonomisch
eingeordnet [61].
2.1.1 Taxonomische Einteilung
Chlamydien werden auf Grund ihres charakteristischen, biphasischen
Entwicklungszyklus und basierend auf rRNA Analysen in eine eigene Ordnung
(Chlamydiales) eingruppiert. Die Ordnung der Chlamydiales beinhaltet die Familien
der Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Waddliaceae und Simkaniaceae
(Abbildung 2.1), wobei nur die Familie der Chlamydiaceae human- und
tierpathogene Organismen beinhaltet [6;15;30;84]. Bis 1999 bestand die Familie der
Chlamydiaceae nur aus der Gattung Chlamydia, die jedoch auf Grund von 18S und
23S rRNA Analysen in die Gattungen Chlamydophila und Chlamydia unterteilt
wurde [30]. Diese Einteilung wurde jedoch von vielen Wissenschaftlern abgelehnt,
Einleitung 10
da sie die biologische Bedeutung dieser Organismen nicht berücksichtigt. So wurde
vorgeschlagen ausschließlich die Gattung Chlamydia zu verwenden [100;106]. In
dieser Arbeit wurde einzig die alte Taxonomie für Chlamydia pneumoniae
verwendet.
Abbildung 2.1: Taxonomie der Ordnung Chlamydiales. Schematische Darstellung der Verwandtschaftsverhältnisse der Taxonomie von 1999 mit Angabe der typischen Wirte. Die Länge der Linien stellt nicht die tatsächlichen phylogenetischen Abstände dar. Abbildung modifiziert nach [15].
Einleitung 11
2.1.2 Biologie des Entwicklungszyklus
Chlamydien sind als obligat intrazelluläre Bakterien auf eine intakte Wirtszelle für
ihre Replikation angewiesen. Ihr charakteristischer, biphasischer Entwicklungszyklus
ist in Abbildung 2.2 dargestellt. Der Zyklus beginnt mit einem Elementarkörperchen
(EK), welches mit einer Größe von ca. 0,3 µm die infektiöse, metabolisch wenig
aktive Lebensform darstellt [120]. Bei der Infektion adhäriert ein EK an die
Wirtszelle und wird über Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen. Dabei
bilden die Chlamydien ein eigenes zelluläres Kompartiment, die sogenannte
Inklusion (Einschlusskörper). Bereits 8 h nach der Aufnahme in die Zelle erfolgt die
Dekondensation der DNA der EK, welche sich vergrößern und zu
Retikularkörperchen (RK) umwandeln. Das RK hat eine Größe von ca. 1 µm und ist
die intrazelluläre, metabolisch aktive Form der Chlamydien. Die Replikation der RK
erfolgt 12 und 24 hpi (hours post infection) mittels binärer Teilung [38]. Durch ihre
an die Wirtszelle angepasste Lebensweise, weist C. pneumoniae ein mit 1,2 Mio.
Basenpaaren reduziertes Genom auf [57]. Zwar konnten im chlamydialen Genom
Gene des Energiestoffwechsels (u.a. Glykolyse, Zitratzyklus, Atmungskette)
nachgewiesen werden [51;57], jedoch sind die Stoffwechselwege häufig
unvollständig kodiert. Daher müssen Zwischenprodukte vom Wirt bezogen werden
[76]. So weisen Chlamydien z.B. einen Adenosintriphosphat/Adenosindiphosphat
(ATP/ADP) Transporter auf, mit dem sie ATP im Austausch gegen ADP von der
Wirtszelle aufnehmen können [45].
Zwischen 48 und 72 hpi findet die Redifferenzierung der RK zurück zu den EK
statt [38]. Durch Lyse der Wirtszelle oder Abschnürung (Extrusion) des
Einschlusskörpers aus der Zelle werden die EK schließlich freigesetzt und können
neue Wirtszellen infizieren [50]. Ein vollständiger Entwicklungszyklus ist nach 72 h
abgeschlossen [38]. Des Weiteren gibt es eine Erscheinungsform, die als Persistenz
bezeichnet wird (Abschnitt 2.1.3). Durch extrazelluläre Stimuli verbleiben
Chlamydien mit atypischer Morphologie in diesem Zustand. Wird der Stimulus der
zur Persistenz führte wieder entzogen, gelangen die Chlamydien zurück in ihren
aktiven Entwicklungszyklus [10].
Einleitung 12
Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des Entwicklungszyklus von C. pneumoniae. Ein Elementarkörperchen (EK) infiziert die Wirtszelle und differenziert sich innerhalb der Inklusion zu einem Retikularkörperchen (RK). Nach einigen Teilungen redifferenzieren die RK zurück zu den EK und werden durch Extrusion oder Lyse der Zelle freigesetzt. Durch exogene und zelluläre Faktoren können die Chlamydien für lange Zeit im Stadium der Persistenz verharren (rote Pfeile), können aber auch wieder in den aktiven Entwicklungszyklus eintreten.
2.1.3 Persistenz
Die Persistenz von Chlamydien ist charakterisiert durch kleinere Einschlusskörper, in
denen vergrößerte, atypische RK mit einem veränderten Metabolismus zu finden
sind. In diesem Zustand sind sie lebensfähig, weisen jedoch kein Wachstum auf [10].
In vitro kann die Persistenz durch verschiedene Faktoren hervorgerufen werden.
Dabei sind Nährstoffmangel (z.B. von Aminosäuren, Glukose), Antibiotika
Behandlung z.B. mit Penicillin sowie Eisenentzug beschrieben [19;43;74;93]. Zudem
kann die Persistenz über Interferon-gamma (IFN-γ) induziert werden [108]. IFN-γ
führt in der Wirtszelle über die Induktion von Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) zu
Einleitung 13
einem Tryptophanabbau (Abschnitt 2.2.2). Da für Chlamydien diese Aminosäure
essentiell ist, wird das chlamydiale Wachstum gehindert und sie gelangen in das
Stadium der Persistenz [86]. Die Wirkung von IFN-γ ist dabei
konzentrationsabhängig. Eine hohe Konzentration führt zum Absterben des
Bakteriums, während bei einer niedrigen Konzentration die Persistenz von
Chlamydien induziert wird [9]. Die Aufhebung der Persistenz und damit die
Reaktivierung von Chlamydien erfolgt in vitro meist durch Wegfall des
Persistenz-stimulierenden Faktors (z.B. Entzug von IFN-γ oder Zugabe von
Tryptophan). Man nimmt an, dass persistierende Chlamydien-Infektionen über Tage
bis Wochen andauern und für chronische Krankheiten verantwortlich sein können
(Abschnitt 2.1.4).
2.1.4 C. pneumoniae assoziierte Krankheitsbilder
Persistente C. pneumoniae-Infektionen sind mit verschiedensten chronischen
Erkrankungen, wie der Arteriosklerose, Asthma und der chronisch obstruktiven
Lungenerkrankung (COPD) (Abschnitt 2.1.4.1) assoziiert [41;85;112;116]. Die
primären Zielzellen von C. pneumoniae sind Epithelzellen des Respirationstrakts,
wodurch akute respiratorische Krankheiten der oberen und unteren Atemwege wie
Pharyngitis, Sinusitis und Bronchitis hervorgerufen werden [88]. Auch ca. 10% der
ambulant erworbenen Pneumonien (CAP) gehen auf eine C. pneumoniae-Infektion
zurück [36]. Die meisten Primärinfektionen verlaufen jedoch asymptomatisch. Da
die serologische Prävalenz für C. pneumoniae schon im Kindes- und Jugendalter
hoch ist (50%) und in den höheren Altersgruppen weiter ansteigt (75%) [61] kann die
Rolle einer C. pneumoniae-Infektion an chronischen Erkrankungen schwer
eingeschätzt werden. Zudem fehlt bisher ein diagnostischer Standard, um zuverlässig
akute von persistierenden Infektionen unterscheiden zu können. In Studien zeigte
sich eine erhöhte Seroprävalenz für eine C. pneumoniae-Infektion bei
COPD-Patienten [113]. Daneben konnten Infektionen mit C. pneumoniae in 15% der
COPD-Patienten direkt mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) nachgewiesen
werden [27].
Einleitung 14
2.1.4.1 Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD)
COPD ist weltweit die vierthäufigste Todesursache [73]. Die Symptome einer COPD
sind Auswurf, Husten und Atemnot. Die Diagnose und Einstufung erfolgt nach der
GOLD Klassifikation (global initiative for chronic obstructive lung disease) und
wird anhand der Abnahme des forcierten exspiratorischen Volumens in der ersten
Sekunde (FEV1) beurteilt. Es werden dabei 4 Schweregrade von „mild“ bis „sehr
schwer“ unterschieden [91]. Wichtige Risikofaktoren für die Entstehung einer COPD
sind Tabakkonsum sowie genetische Disposition, Stäube, Chemikalien und toxische
Dämpfe [91]. Die COPD ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Lunge mit
langsam fortschreitender Atemwegsobstruktion. Persistierende Entzündungs- und
Umbauprozesse führen zur Entwicklung von chronischer Bronchitis und
Lungenemphysem, als Manifestation späterer Stadien der COPD. Zu den
Umbauprozessen einer COPD gehören fibrotische Veränderungen der
Atemwegswand, Metaplasien des Epitheliums und strukturelle Änderungen der
kleinen Atemwege [55]. Die Gesamtheit dieser Umbauprozesse wird auch als
Remodeling bezeichnet. Während der Embryonalentwicklung ist solch ein Prozess
grundlegend und wird epithelial-mesenchymal transition (EMT) genannt [55].
Remodeling bei Epithelzellen kann charakterisiert werden durch eine Abnahme von
Zell-Zell-Kontakten, was den Verlust eines organisierten Zelllayers zur Folge hat
(Abbildung 2.3). Dadurch bekommen sie den Charakter von mesenchymalen Zellen,
welche sich durch eine spindelförmige Morphologie auszeichnen. Zudem weisen
mesenchymale Zellen eine höhere Beweglichkeit als Epithelzellen auf [110].
Einleitung 15
Abbildung 2.3: Remodeling (epithelial-mesenchymal transition, EMT) von Epithelzellen. Durch Wachstumsfaktoren oder Zytokine verlieren Epithelzellen die für sie typischen Marker und zeigen Charakteristika von mesenchymalen Zellen. FGFR2: fibroblast-growth-factor receptor-2; FSP1: fibroblast-specific protein-1. Abbildung modifiziert nach [110].
Charakteristisch für eine COPD sind wiederkehrende Zyklen von akuten
Exazerbationen. Dafür ursächlich sind vor allem exogene Noxe wie virale und
bakterielle Infektionen, die zu einer Reaktivierung der Entzündung führen. Am
häufigsten werden bakterielle Infektionen mit Haemophilus influenzae, Moraxella
catarrhalis, Streptococcus pneumoniae oder Pseudomonas aeruginosa beobachtet
[117]. Daneben wurden auch C. pneumoniae-Infektionen in 34% der Patienten mit
akuten Exazerbationen nachgewiesen [58]. Die bei Exazerbationen vorherrschende
Entzündungsreaktion ist durch eine Vermehrung von Neutrophilen und CD8+
T-Lymphozyten in der Lunge gekennzeichnet [55]. Das Zytokin-Profil von COPD
Patienten entspricht dabei hauptsächlich einer Th1-vermittelten Immunantwort
(T-Helferzellen Typ 1), mit IFN-γ als vorherrschendes Zytokin [70].
2.2 Wechselwirkung zwischen dem Immunsystem und C. pneumoniae
Eine Th1-vermittelte Immunantwort spielt eine entscheidende Rolle bei der
Kontrolle einer C. pneumoniae-Infektion [92]. Die Ausbildung einer Th1-Antwort
kann über die proinflammatorischen Zytokine Interleukin-12 (IL-12), welches von
Makrophagen und IL-18, welches von Epithelzellen nach Kontakt mit
C. pneumoniae sekretiert wird, erfolgen [20;67]. Die frühe Sekretion von IFN-γ
durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) ist dabei ebenfalls von Bedeutung [111].
Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems erfolgt über spezielle pattern
Einleitung 16
recognition receptors (PRR), die hoch-konservierte Strukturen von C. pneumoniae,
welche als pathogen-associated molecular patterns (PAMP) bezeichnet werden,
erkennt. Der Toll-like Rezeptor-4 (TLR-4) ist ein PRR und erkennt z.B. chlamydiales
Lipopolysaccharid (LPS) [20]. In Rauchern mit COPD ist gerade die Expression von
TLR-4 reduziert, wodurch die Th1-vermittelte Immunantwort nach Infektion von
Gram-negativen Bakterien beeinträchtigt ist [60].
Droemann et al. konnten eine erhöhte Entzündung während einer akuten
C. pneumoniae Infektion, nicht in Lungengewebe von COPD Patienten mit
vermutlich persistierender Infektion nachweisen. Daher wird vermutet, dass Zyklen
von Persistenz und Reaktivierungen in die aktive Form nötig sind, um zur
Pathogenese beizutragen [27]. Mediatoren, die zu einer Reaktivierung in vivo führen,
sind jedoch bisher unbekannt. Das vorherrschende Zytokin während einer
Th1-vermittelten Immunantwort ist IFN-γ, welches durch CD4+/CD8+ T-Helferzellen
und NK-Zellen ausgeschüttet wird [95].
2.2.1 Typ II Interferon vermittelte Jak-STAT Signalkaskade
IFN-γ ist der einzige Vertreter der Typ II Interferone, welche die Jak-STAT
Signalkaskade aktivieren (Abbildung 2.4). Auch Typ I und Typ III Interferone
aktivieren diese Signalkaskade [109]. Die Signaltransduktion erfolgt jedoch über
andere Rezeptoren und wird in dieser Arbeit nicht weiter behandelt. IFN-γ bindet an
den inaktiven IFN-γ Rezeptor-Komplex (IFNGR), der aus den Untereinheiten
IFNGR1 und IFNGR2 besteht. Diese Untereinheiten sind mit der Januskinase 1
(Jak1) und Jak2 konstitutiv assoziiert [109]. Die Bindung von IFN-γ führt zu
Konformationsänderungen des IFNGR. Dadurch rücken Jak1 und Jak2 in enge
Beziehung und phosphorylieren spezifische Tyrosinreste des Rezeptors. Die Tyrosin-
Phosphorylierung der Jaks werden von dem signal transducer and activator of
transcription 1 (STAT1) über seine Src-homology 2-Domäne (SH2-Domäne)
gebunden, wodurch STAT1 am Tyrosin 701 durch eine Jak-abhängige Reaktion
phosphoryliert wird. Phosphoryliertes STAT1 dissoziiert vom Rezeptorkomplex und
bildet, durch reziproke Bindung der SH-2 Domäne mit der Tyrosin-
Phosphorylierung, ein Dimer [101]. Das Homodimer transloziert in den Nukleus und
bindet dort an eine spezifische DNA-Erkennungssequenz, die IFN-γ aktivierte
Sequenz (GAS) und initiiert damit die Expression der entsprechenden Gene [22].
Eine Phosphorylierung am Serin 727 von STAT1 trägt zu einer vollständigen
Einleitung 17
Transkriptionsaktivität des Transkriptionsfaktors bei [118]. Um eine unkontrollierte
Aktivität der Jak-STAT Signalkaskade zu verhindern, wird diese über SHP
(SH2 containing phosphatase), PIAS (protein inhibitors of activated STATs) und
SOCS (suppressor of cytokine signaling) kontrolliert. SHP und PIAS sind konstitutiv
exprimierte Proteine, wohingegen SOCS-Proteine erst über die Jak-STAT
Signalkaskade aktiviert werden [123]. Daneben wird auch die Expression von IDO
über die Jak-STAT Signalkaskade induziert, die einen Einfluss auf das Wachstum
von C. pneumoniae hat (Abschnitt 2.2.2).
Abbildung 2.4: Vereinfachte Darstellung der Jak-STAT Signalkaskade. Durch Bindung von IFN-γ an den IFN-γ Rezeptorkomplex (IFNGR) vermitteln die am Rezeptor assoziierten Jaks (Januskinasen) eine Tyrosin-Phosphorylierung des Rezeptors. STATs (Signal transducer and activator of transcription) erkennen die Phosphorylierung, binden IFNGR, woraufhin STAT phosphoryliert wird. STATs dissoziieren vom Rezeptor, bilden Homodimere und translozieren in den Nukleus, wo sie an GAS-Elemente (IFN-γ activated sequences) binden und die Transkription IFN-γ-abhängiger Gene initiieren. IDO: Indolamin 2,3-Dioxygenase, IRF-1: IFN regulierter Faktor-1. Abbildung modifiziert nach [101].
2.2.2 Indolamin 2,3-Dioxygenase
IDO ist ein ca. 45 kDA großes Protein und wird von einem ca. 15 kbp großen Gen
mit 10 Exons kodiert [59]. In der Promotorregion des Gens befindet sich ein
GAS-Element, wodurch die Expression durch IFN-γ über die Jak-STAT
Signalkaskade aktiviert wird [18]. Daneben befinden sich noch weitere Sequenzen
wie ein Homolog des IFN-stimulated response element (ISRE) in der
Promotorregion. ISRE-Sequenzen können zu einem geringen Maße direkt über die
IFN-γ induzierte Jak-STAT Signalkaskade aktiviert werden oder sekundär über den
Einleitung 18
Interferon regulierten Faktor-1 (IRF-1), welcher seinerseits ebenfalls über die IFN-γ
induzierte Jak-STAT Signalkaskade aktiviert wird [109]. Auch Typ I Interferone
induzieren Gene mit einer ISRE-Sequenz, wohingegen GAS-Elemente nur selten
aktiviert werden. Deshalb wird IDO nur schwach durch Typ I Interferone induziert,
da beide Sequenzen (GAS, ISRE) zur vollständigen Induktion der Expression
benötigt werden [18;59].
Nach der Translation liegt IDO als Apoenzym vor und benötigt für seine
Aktivität Häm als prosthetische Gruppe. Für die weitere Aktivierung wird die
Reduktion von Eisen (III) zu Eisen (II) benötigt, damit Tryptophan und Sauerstoff
das aktive Zentrum erreichen können. Dieses aktive Holoenzym ist das erste und
geschwindigkeitsbestimmende Enzym des Kynurenin-Stoffwechselwegs. Dabei wird
Tryptophan durch Spaltung des Indolrings zu N-Formylkynurenin oxidiert, aus
welchem im weiteren Verlauf L-Kynurenin entsteht [59]. IDO ist nicht
gewebsspezifisch und akzeptiert neben L-Tryptophan auch andere Indolamine [59].
IDO wirkt antimikrobiell gegen Tryptophan auxotrophe Pathogene, wie z.B.
Toxoplasma gondii, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis und
Staphylococcus aureus, da ihnen Tryptophan für viele metabolische Prozesse nicht
mehr zur Verfügung steht [68;69;90;102]. Auch das Wachstum von Chlamydien
wird durch die Aktivität von IDO beeinflusst. Dabei ist der Tryptophanabbau ein
zentraler Mechanismus der Persistenzinduktion von Chlamydien durch IFN-γ [78].
Bisherige Untersuchungen zur Jak-STAT Signalkaskade und IDO-Aktivität
sowie dessen antichlamydialer Wirkung beschränkten sich bislang auf
Untersuchungen unter atmosphärischen Sauerstoffbedingungen. Analysen zu deren
Funktionen und den Einfluss auf C. pneumoniae unter physiologischen (5-20% O2)
oder pathophysiologischen Sauerstoffverhältnissen (<5% O2) wurden bisher nicht
durchgeführt.
Einleitung 19
2.3 Hypoxie
2.3.1 Bedeutung von Sauerstoff in der Zelle
Der Sauerstoffpartialdruck im Gewebe ist niedriger als der in der atmosphärischen
Luft (Normoxie) und variiert von 4-110 mmHg (0,5-14%) (Tabelle 2.1). Eine
zusätzliche Reduzierung der Sauerstoffkonzentration kann z.B. durch gestörte
Gefäßnetze, eine verminderte Blutversorgung oder eine unzureichende
Neovaskularisierung auftreten. Diese kommen vor allem in Tumoren, ischämischen
Geweben, Wunden oder bei Entzündungsprozessen vor [14]. Bei diesen
pathophysiologischen Sauerstoffkonzentrationen übersteigt der Sauerstoffbedarf der
Zelle das Sauerstoffangebot [82]. In Zellkulturexperimenten werden im Allgemeinen
Sauerstoffkonzentrationen von 0,5-3% mit dem Begriff Hypoxie beschrieben [82].
Tabelle 2.1: Extrazelluläre Sauerstoffkonzentrationen in verschiedenen Geweben. Modifiziert nach [17;24;56].
Gewebe O2 [mmHg] O2 [%]
Luft 160 21,1
Brutschrank 151 20
Luft der Alveolen 110 14,5
Arterielles Blut 100 13,2
Bindehaut 58 7,7
Lunge 42,8 5,6
Venöses Blut 40 5,3
Herzmuskel 34 4,5
Gebärmutterhals 13-48 1,7-6,3
Vagina 3,8 0,5
Sauerstoff wird von aeroben Organismen zur Energiegewinnung benötigt. Um das
Überleben bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen zu sichern, haben Zellen
Regulationsmechanismen, die Einfluss auf die Homöostase nehmen, entwickelt. Der
wichtigste Regulator ist dabei der Hypoxie-induzierbare Faktor-1 (HIF-1).
Einleitung 20
2.3.2 Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1)
Der Transkriptionsfaktor HIF-1 reguliert, wenn geringe Sauerstoffverhältnisse
vorliegen, eine Vielzahl von zellulären Prozessen von eukaryotischen Zellen
(Abbildung 2.5). HIF-1 besteht aus einer α- und β-Untereinheit, die konstitutiv
exprimiert werden. Während HIF-1β stabil im Zellkern vorliegt, unterliegt HIF-1α
unter Normoxie einem ständigen Abbau. Dabei wird HIF-1α durch eisen- und
sauerstoffabhängige Prolyl-Hydroxylasen (PHD) im Zytoplasma der Zelle
hydroxyliert. Über die Hydroxylierung interagiert das von Hippel-Lindau (VHL)
Protein mit HIF-1α, welches durch eine Polyubiquitinierung HIF-1α für die
Degradation durch das Proteasom markiert. Durch Substratmangel (O2) unter
Hypoxie wird die Prolyl-Hydroxylierung verhindert und HIF-1α transloziert in den
Nukleus, wo es mit HIF-1β dimerisiert. Dieses Heterodimer bindet an das hypoxia
responsive element (HRE) in den Promoterregionen von HIF-1 regulierten Genen
[82]. Eine Vielzahl von Prozessen, wie z.B. die Glykolyse, Angiogenese und das
Zellüberleben werden von HIF-1 reguliert [103].
Eine HIF-1α Stabilisierung innerhalb der Zelle erfolgt jedoch nicht nur aufgrund
von geringen Sauerstoffkonzentration, sondern kann auch durch eine Reihe anderer
Einflussfaktoren (z.B. Eisenentzug, LPS) unter Normoxie erreicht werden [34;44].
So ist außerdem bekannt, dass bakterielle Infektionen wozu auch Infektionen mit
C. pneumoniae gehören, HIF-1α stabilisieren [97;119].
Einleitung 21
Abbildung 2.5: Vereinfachte Darstellung der HIF-1α Stabilisierung durch Hypoxie. (A) In der Anwesenheit von Sauerstoff wird HIF-1α durch sauerstoffabhängige Prolyl-Hydroxylasen (PHD) hydroxyliert. Dies führt zur Rekrutierung des von Hippel-Lindau Proteins (VHL), welches HIF-1α durch Polyubiquitynierung zur Degradation durch das Proteasom markiert. (B) Unter hypoxischen Bedingungen sind die PHD inaktiv und HIF-1α gelangt in den Nukleus, wo es mit HIF-1β einen Komplex bildet. Durch Bindung an HRE-Sequenzen (hypoxia responsive element) in Promotorregionen von HIF-1 regulierten Genen werden diese transkribiert. GLUT: Glukosetransporter, LDHA: Laktatdehydrogenase A, PDK: Pyruvatdehydrogenase Kinase, VEGF: vascular endothelial growth factor.
2.3.3 C. pneumoniae-Infektionen unter Hypoxie
Die Interaktion von C. pneumoniae mit HIF-1α unterscheidet sich zwischen der
frühen und späten Phase des Entwicklungszyklus. In der frühen Phase einer
C. pneumoniae-Infektion wird HIF-1α unter Normoxie und Hypoxie stabilisiert.
Ohne eine HIF-1α Stabilisierung unter Hypoxie wäre eine hohe Infektionsrate nicht
möglich [97]. Neben einer erhöhten Infektionsrate weist C. pneumoniae unter
Hypoxie zudem größere Einschlusskörper und ein schnelleres Wachstum auf, woraus
eine höhere Wiederanzuchtsrate resultiert [56]. Eine Stabilisierung von HIF-1α wird
Einleitung 22
in der späten Phase der Infektion hingegen verhindert. Dabei wird HIF-1α durch die
chlamydiale Protease CPAF (chlamydial protease-like activity factor) degradiert.
Dies kommt dem Entwicklungszyklus von C. pneumoniae zugute, da Hypoxie über
die Aktivierung von HIF-1 den programmierten Zelltod initiieren kann. Durch einen
Abbau von HIF-1α in der späten Phase der Infektion unter Hypoxie unterbindet
C. pneumoniae somit aktiv die Apoptose, um den Entwicklungszyklus abzuschließen
[97]. Weitere Untersuchungen, wie z.B. zur IFN-γ induzierten Persistenz von
C. pneumoniae unter Hypoxie, wurden bislang nicht durchgeführt.
2.4 Fragestellung In dieser Arbeit sollten direkte Interaktionen zwischen C. pneumoniae und
Lungenepithelzellen in der Entstehung der COPD analysiert werden. Hauptmerkmale
einer COPD sind chronisch-rezidivierende Entzündungsprozesse und fortschreitende
Umbauvorgänge des Lungenepithels. Zu berücksichtigen ist dabei, dass bei
chronischen Entzündungsprozessen ein verminderter Sauerstoffgehalt im Gewebe
vorliegt, was das Wachstum von C. pneumoniae begünstigt. Untersuchungen zur
Persistenz von C. pneumoniae unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen
wurden bislang nicht durchgeführt.
Daher waren folgende Ziele Grundlage dieser Arbeit:
Der Einfluss von Hypoxie auf die IFN-γ induzierte Persistenz von
C. pneumoniae sollte morphologisch charakterisiert sowie Änderungen in
der für die Persistenz relevanten Jak-STAT Signalkaskade näher analysiert
werden.
Ein Langzeit-Modell der Persistenz von C. pneumoniae sollte entwickelt
werden und bezüglich des Wachstumsverhaltens von C. pneumoniae unter
Hypoxie analysiert werden. Weiterhin sollte dieses Modell der Untersuchung
von chronischen Entzündungsprozessen dienen.
Es sollte untersucht werden, ob zelluläre Umbauprozesse durch eine
C. pneumoniae-Infektion von Lungenepithel ausgelöst werden und ob die
Sauerstoffumgebung einen Einfluss auf diese ausübt.
Um ein umfassenderes Verständnis über eine C. pneumoniae-Infektion bei
niedrigen Sauerstoffverhältnissen zu bekommen, sollten Metabolom- und
Transkriptom Analysen etabliert werden.
Material 23
3 Material
3.1 Geräte
Blotapparatur Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Brutschränke (37°C, 5% CO2)
Forma Series II 3131 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA
Typ: BB 6220 Heraeus Instruments GmbH, Hanau
Brutschränke (37°C, 5% CO2, N2- Regulation, O2-Sensor)
Forma Series II 3141 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA
Hypoxiekammer THC08 124 Toepffer Lab Systems, Göppingen
Elektrophoresekammer Mini-Protean Tetra
Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Gewebehomogenisator Precellys 24 Bertin Technologies, Villeurbanne, Frankreich
Heizblock PCH-2 Grants-Instruments Ltd, Shepreth, Großbritannien
Imagingsystem Fusion FX7 Vilber Lourmat GmbH, Eberhardzell
Kamera AxioCam HRc Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen
LightCycler 1.0 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Magnetrührer, RMO Gerhardt GmbH, Königswinter
Mikroskope
Axioskop 2, 25, 40 Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen
Axiovert 25 Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen
BZ-9000 Keyence, Osaka, Japan
NanoDrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA
pH-Meter MP220 Mettler Toledo, Gießen
Pippetierhilfe accu-jet Brand GmbH, Wertheim
PowerPac 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Material 24
Präzisionswaage KB Kern & Sohn GmbH, Balingen-Frommen
Sicherheitswerkbänke
EN 12469 Clean Air Techniek B.V., Woerden, Niederlande
SterilGard Hood Class II A/B3 Baker Company, Sanford, ME, USA
Taumelschüttler Polymax 1040 Heidolph Instruments GmbH, Schwalbach
Thermocycler C1000 Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Ultraschallbad Transsonic 460/H Elma GmbH & Co KG, Singen
Vortex-Schüttler REAX 2000 Heidolph Instruments GmbH, Schwalbach
Zentrifugen
Centrifuge 5417R Eppendorf AG, Hamburg
Megafuge 2.0 R Heraeus Instruments GmbH, Hanau
Multifuge 3 S-R Heraeus Instruments GmbH, Hanau
Rotina 38R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen
Optima L-90K Beckmann Coulter, Brea, CA, USA
3.2 Verbrauchsmaterialien
6-, 24-Lochplatte Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Blotpapier Schleicher & Schuell, Dassel
Deckgläser, Ø10 mm Menzel-Gläser, Braunschweig
Gelkämme: Mini Protean 3 (1,0 mm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Glasplatten: Mini Protean 3 (1,0 mm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Glasschrot Karl Hecht GmbH & Co KG, Sondheim
Kryoröhrchen Nalgene Cryoware Nunc Brand Products, Rochester, NY, USA
LightCycler Kapillaren (20 µl) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Neubauer-Zählkammer Hassa Laborbedarf, Lübeck
Nitrocellulosemembran Protran Whatman Inc, Florham Park, NJ, USA
Material 25
Objektträger (76 x 26 mm) Menzel-Gläser, Braunschweig
Pipetten Eppendorf Reference 10, 100, 1000 µl
Eppendorf AG, Hamburg
Pipettenspitzen Biosphere filter tips 10, 100, 1000 µl
Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
Pipettenspitzen, Prot/Elec tips 1-200 µl Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Precellys-Keramik-Kit 1,4/2,8 mm PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen
Reaktionsgefäße (0,5/ 1,5 ml) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
Röhrchen (12, 15, 50 ml) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
Transferpipetten (5, 10, 25 ml) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
Zellkulturflaschen Cellstar Filter Top (175 cm2)
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen
Zellkulturschalen (9,6 cm2) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
Zellschaber TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz
3.3 Chemikalien und Reagenzien
1,4-Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Acrylamid-Bis (40%) Lösung, 19:1 Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
Bambanker-Kryokonservierungsmittel Wako Chemicals GmbH, Neuss
Bromphenolblau Serva Elecrophoresis GmbH, Heidelberg
Cycloheximid Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 x 12 H2O)
Merck KGaA, Darmstadt
Ethanol, absolute Merck KGaA, Darmstadt
Glycerol Merck KGaA, Darmstadt
Glycin Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
Material 26
HRP-Substrat
Immobilon Western Millipore, Billerica, MA, USA
Super Signal West Femto Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA
Kaliumchlorid (KCl) Merck KGaA, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck KGaA, Darmstadt
L-Glutamin (10 mg/ml) PAA Laboratories GmbH, Cölbe Lipofectamin 2000 Invitrogen, Darmstadt
Methanol Merck KGaA, Darmstadt
Methanol LC-MS Chromasolv Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED)
Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
Natriumchlorid (NaCl) Merck KGaA, Darmstadt
Natriumhydogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 x H2O)
Merck KGaA, Darmstadt
PCR Nukleotid Mix (dNTP) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Prestained Protein Marker, Broad Range New England Biolabs, Ipswich, MA, USA
Rekombinantes humanes IFN-γ PeproTech GmbH, Hamburg
Saccharose Merck KGaA, Darmstadt
Sodiumdodecylsulfat (SDS) Merck KGaA, Darmstadt
TGF-β Inhibitor, SB-431542 Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis MO, USA
Titriplex III (EDTA) Merck KGaA, Darmstadt
Tris (hydroxymethyl)-aminomethan Bio-Rad Laboratories GmbH, München
Tris-HCl Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
Trockenmilchpulver Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
Trypanblau (0,4%) Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
Trypsin-EDTA (1x) PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Material 27
Tween-20 Serva Elecrophoresis GmbH, Heidelberg
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA
3.4 Puffer und Lösungen
Blockpuffer (5%) 5 g Trockenmilchpulver, 100 ml T-TBS Puffer
Blotpuffer 3 g Tris, 14,4 g Glycin, 200 ml Methanol, ad 1 l A. dest.
Cycloheximid, Stammlösung 1 g Cycloheximid, ad 1 ml A. dest.
Elektrophoresepuffer (5x) 15 g Tris, 72 g Glycin, 5 g SDS, ad 1 l A. dest., pH8,3
Lysispuffer (Western-Blot) 3,94 g Tris HCl, 40 ml Glycerol, 8 g SDS, 20 ml DTT (1 M), Bromphenolblau, ad 200 ml A. dest., pH 7,8
PBS-Puffer 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4 12xH2O, 2 g KH2PO4, ad 1 l A. dest., pH 7,2
Sammelgelpuffer 30 g Tris, ad 500 ml A. dest. pH 6,8
SPG-Puffer 75 g Saccharose, 2,47 g Na2HPO4, 0,36 g NaH2PO4, 0,72 g L-Glutaminsäure, ad 1 l A. dest., pH 7,3
TBS-Puffer (10x) 24,2 g Tris, 80 g NaCl, ad 1 l A. dest., pH 7,6
Trenngelpuffer 90,5 g Tris, ad 500 ml A. dest., pH 8,8
T-TBS Puffer 100 ml TBS-Puffer (10x), 1 ml Tween-20, ad 1 l A. dest.
3.5 Zelllinien Tabelle 3.1: In dieser Arbeit verwendete Zelllinien
Name Ursprung Nummer Vertrieb
A549 Lungenkarzinom ACC 107 DSMZ, Braunschweig
HEp-2 Epidermoides Larynxkarzinom CCL-23 ATCC, Manassas, USA
Material 28
3.6 Medien und Medienzusätze Sofern nicht anders angegeben, stammen die hier aufgeführten Medien und -zusätze
von der Fa. PAA Laboratories GmbH, Cölbe
Dauerkulturmedium DMEM mit Glucose (4,5 g/l) und L-Glutamin, versetzt mit 10% FKS, 20 µg/ml Gentamycin, 33,2 mM HEPES-Puffer
Transfektionsmedium Opti-MEM I (Invitrogen, Darmstadt)
Versuchsmedium 1 RPMI 1640 ohne L-Glutamin, versetzt mit 5% FKS, 0,1 mg/ml L-Glutamin, 1x NEAA
Versuchsmedium 2 RPMI 1640 ohne L-Glutamin, versetzt mit 0,1 mg/ml L-Glutamin, 1x NEAA
3.7 Enzyme und Kits
IMAGEN Chlamydia Kit Oxoid, Cambridgeshire, Großbritannien
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I
Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
MICROBEnriche Kit Ambion, Austin, TX, USA
MICROBExpress Kit Ambion, Austin, TX, USA
Mykoplasmen-Test, Venor GeM Minerva Biolab, Berlin
NucleoSpin RNA II Macherey Nagel GmbH & Co. KG, Düren
Reverse Transkriptase, RevertAid Premium
Fermentas, St. Leon-Rot
Reverse Transkriptase, Transcriptor Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
RNase-Inhibitor, Protector Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
RNase-Inhibitor, RiboLock Fermentas, St. Leon-Rot
3.8 Oligonukleotide
3.8.1 Primer für die cDNA Synthese
Die Random Hexamer Primer p(dN)6 zur cDNA Synthese wurden von der Fa. Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim bezogen
Material 29
3.8.2 Primer für die quantitative RT-PCR
Alle Primer wurden als Lyophilisat von der Fa. TIB MOLBIOL, Berlin bezogen.
Nach Herstellerangaben wurden diese zu einer Arbeitskonzentration von 20 µM mit
RNase-freiem H2O gelöst.
Tabelle 3.2: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für humane Sequenzen
Primerpaar Sequenz 5‘>3‘
IDO Forward GCGCTGTTGGAAATAGCTTC Reverse TTTGGGTCTTCCCAGAACC
18S rRNA Forward TCAAGAACGAAAGTCGGAGG Reverse GGACATCTAAGGGCATCACA
SOCS1 Forward TTTTTCGCCCTTAGCGTGAA Reverse GCCATCCAGGTGAAAGCG
SOCS3 Forward GAAGATCCCCCTGGTGTTGA Reverse TCCCGACAGAGATGCTGAAGA
IP10 Forward AGGAACCTCCAGTCTCAGCA Reverse CAAAATTGGCTTGCAGGAAT
Tabelle 3.3: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für chlamydiale Sequenzen
Primerpaar Sequenz 5‘>3‘
AhpC Forward AGGAAGCCCCTGATTTTGTT Reverse CAATGTCATCCACGGAACAG
AspC Forward ACCTCCCGCCATCTCTTTAT Reverse GTCAGAGCGGAGAAACGAAC
AtpE Forward CGAATCTTAATGCCGATGGT Reverse CCTGCTTGGCTTAGAGCAAC
DnaK Forward CCTGCGGTTACCATCGTAGT Reverse GAAGTCCTGAGCTTGCTTCG
Euo Forward TCCCTTACGCTCTCCTCGTA Reverse GACGCGCTGGGAAATAGATA
IncA Forward TTGTTCTGCGCTACGTCAAG Reverse TTGTTGGTGGAGGTGTTTCA
Material 30
Primerpaar Sequenz 5‘>3‘
IncB Forward AGCCGCAGCCCTAATCTTAT Reverse CCGCAAGCAGCAATAATACA
IncC Forward AGCTGTGCTTGGATTTACGG Reverse TTGTTCTGCGCTACGTCAAG
Pyk Forward AGCTTGCGGATGGAATTATG Reverse ATGCAGTTTCCCCTGACAAC
RpoA Forward TGATCTGGGTTAACGGCTTC Reverse GCAATCGAAGGGGTTATTGA
Tal Forward TAGTTTGGGGAATCCGACAG Reverse TCCTCCCATAGCTTCGAAAA
Tuf Forward ACTACGCTAACAGCGGCAAT Reverse CGGCGCCTGTAATCATATTT
TyrB Forward ATAAGCGTCCCGAAAAGGTT Reverse AAAAACCAGCTCACGCATCT
3.8.3 siRNA für RNA-Interferenz Analysen
Die im Folgenden aufgeführten siRNAs der Fa. Invitrogen, Darmstadt wurden für
RNA-Interferenz Experimente verwendet. Das Lyophilisat wurde mit DEPC-Wasser
zu einer Arbeitskonzentration von 20 µM gelöst. Für Kontroll-Experimente wurde
die stealth RNAi negativ control mit niedrigem GC-Gehalt (Invitrogen, Darmstadt)
verwendet.
Tabelle 3.4: In dieser Arbeit verwendete siRNAs
siRNA (RNA)-Sequenz 5‘>3‘
HIF-1α Stealth RNAi CCAGCCGCUGGAGACACAAUCAUAU
AUAUGAUUGUGUCUCCAGCGGCUGG
Material 31
3.9 Antikörper
3.9.1 Antikörper für Western Blot Analysen
Tabelle 3.5: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für Western Blot Analysen
Name Herkunft Hersteller Klonalität Verdünnung
Anti-β-Aktin Kaninchen Cell Signaling Technology, MA, USA
polyklon 1:2000
Anti-CPAF Kaninchen Aus dem Institut für Biochemie, Universität zu Lübeck
polyklon 1:1000
Anti-E-Cadherin Maus BD Bioscience, Heidelberg
monoklon 1:2000
Anti-HIF-1α Maus BD Bioscience, Heidelberg
monoklon 1:500
Anti-IDO Maus Chemicon, MA,USA monoklon 1:1000
Anti-phospho-STAT1 (Tyr701)
Kaninchen Cell Signaling Technology, MA, USA
polyklon 1:1000
Anti-phospho-STAT1 (Ser727)
Kaninchen Cell Signaling Technology, MA, USA
polyklon 1:1000
Tabelle 3.6: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für Western Blot Analysen
Name Herkunft Hersteller Klonalität Verdünnung
Anti-Kaninchen, HRP konjugiert
Ziege Cell Signaling Technology, MA, USA
polyklon 1:4000
Anti-Maus, HRP konjugiert
Pferd Cell Signaling Technology, MA, USA
polyklon 1:4000
Material 32
3.9.2 Antikörper für Immunfluoreszenzfärbungen
Tabelle 3.7: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für Immunfluoreszenzfärbungen
Tabelle 3.8: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für Immunfluoreszenzfärbungen
Name Herkunft Hersteller Klonalität Verdünnung
Anti-Kaninchen, FITC konjugiert
Ziege Invitrogen, Darmstadt polyklon 1:100
Anti-Maus, DyLight549 konjugiert
Esel Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA
polyklon 1:100
Anti-Maus, FITC konjugiert
Kaninchen Dako Deutschland GmbH, Hamburg
polyklon 1:250
3.10 Software
Adobe Photoshop CS2 Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA
AxioVision Rel. 4.5 Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen
Bio1D Vilber Lourmat GmbH, Eberhardzell
BZ Analyzer Software Keyence, Osaka, Japan
Image J National Institutes of Health, USA
LightCycler Data Analysis Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
Microsoft Office 2007 Microsoft Cooperation, Redmond, USA
Name Herkunft Hersteller Klonalität Verdünnung
Anti-Chlamydien-LPS
Maus Prof. H. Brade, FZ Borstel
polyklon 1:50
Anti-α-SMA Maus Sigma-Aldrich, MO, USA
monoklon 1:400
Anti-IncA Kaninchen Eurogentec, Köln polyklon 1:3000
Methoden 33
4 Methoden
4.1 Zellkultur
4.1.1 Kultivierung von Zelllinien
Die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien sind epitheliale Adhäsionszellen. Die
Kultivierung erfolgte mit Dauerkulturmedium in 175 cm2 Zellkulturflaschen im
Inkubator bei 37°C und 5% CO2. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage mit Hilfe von
Trypsin/EDTA von der Zellkulturflasche gelöst. Danach wurden die Zellen entweder
in einem Verhältnis von 1:8 - 1:10 auf eine neue Zellkulturflasche verteilt oder die
Zellzahl wurde bestimmt (Abschnitt 4.1.2). Folgende Zellzahlen wurden in die
Versuchsbedingungen eingesetzt:
Tabelle 4.1: Zellkulturbedingungen in den durchgeführten Versuchen
Versuche Zellkulturplatte Zellen Volumen Medium
Persistenz-versuche
6-Loch 2,5x105 HEp-2/A549
5 ml Versuchsmedium 1
Wieder-anzucht
24-Loch 3x105 HEp-2 1 ml Dauerkultur-medium
Transfektions-experimente
6-Loch 2,5x105 A549 2 ml Versuchsmedium 2
Live-Cell Imaging
9,6 cm2 Zellkulturschale
2x105 A549 2 ml Versuchsmedium 1
Metabolom- Analysen
6-Loch 2,5x105 HEp-2 5 ml Versuchsmedium 1 (7 h), Wechsel auf Versuchsmedium 2
Transkriptom- Analysen
6-Loch 2,5x105 HEp-2 5 ml Versuchsmedium 1
Zur Induktion der Persistenz wurde zu den ausgesäten Zellen 10 U/ml IFN-γ
gegeben. Die Zellen wurden im Inkubator ohne Sauerstoffregulation (im weiteren
Verlauf Normoxie genannt) oder in einer Hypoxiekammer mit eingestellter
Sauerstoffkonzentration von 2% (im weiteren Verlauf Hypoxie genannt) bis zur
Infektion (Abschnitt 4.3.2) für 24 h inkubiert. Optional wurde, bei
Methoden 34
Sauerstoffkonzentrationen abweichend von 2%, ein Brutschrank mit
Sauerstoffregulation genutzt.
Wöchentlich wurden die Zellkulturen mittels PCR auf eine mögliche
Mykoplasmenkontamination getestet.
4.1.2 Bestimmung der Zellzahl
Um die Zellzahl zu bestimmen, wurden 10 µl Zellsuspension mit 80 µl PBS-Puffer
und 10 µl Trypanblau verdünnt. 10 µl dieser 1:10 Verdünnung wurden in eine
Neubauer-Zählkammer mit einer Tiefe von 0,1 mm pipettiert. 4 Großquadrate
wurden bei 10-facher Vergrößerung ausgezählt. Intakte Zellen wiesen dabei keine
Färbung auf, wohingegen tote Zellen blau erschienen, da der saure Farbstoff
Trypanblau durch die Zellmembran von abgestorbenen Zellen diffundiert. Die
Formel zur Berechnung der Zellzahl lautet:
푍푒푙푙푒푛 푚푙⁄ =푔푒푧äℎ푙푡푒 푍푒푙푙푧푎ℎ푙 ∗ 푉푒푟푑ü푛푛푢푛푔푠푓푎푘푡표푟 ∗ 푉표푙푢푚푒푛 ∗ 10
퐴푛푧푎ℎ푙 푔푒푧äℎ푙푡푒푟 퐺푟표ß푞푢푎푑푟푎푡푒
4.1.3 Konservierung von Zelllinien
Die Zellen einer vollbewachsenen Zellkulturflasche wurden mittels einer
Trypsin/EDTA-Lösung gelöst und bei 200 x g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen. Das Zellpellet wurde in 1 ml Bambanker-
Kryokonservierungsmittel aufgenommen und in einer Styropor-Schachtel bei -80°C
bis zum nächsten Tag eingefroren. Danach wurden die Zellen in Stickstoff gelagert.
Zum Auftauen der Zellen wurde ein 37°C warmes Wasserbad verwendet. Da
DMSO in der Suspension enthalten ist, wurde dieses mit 10 ml warmen
Dauerkulturmedium verdünnt. Die Zellen wurden bei 200 x g für 5 min zentrifugiert
und das Medium verworfen. Die Zellen wurden in frisches Dauerkulturmedium auf
eine neue Zellkulturflasche verteilt.
Methoden 35
4.2 Präparation von humanem Lungengewebe Das verwendete humane Lungengewebe stammte von Patienten, bei denen im
Rahmen einer Lungenresektion Gewebe entnommen wurde (Klinik für Chirurgie des
UK-SH, Campus Lübeck, Prof. Dr. med. P. Kujath und Mitarbeiter). Vor der
Operation stimmten die Patienten einer Nutzung des Gewebes, welches für die
pathologische Begutachtung nicht benötigt wurde, zu. Ein Ethikantrag der Sektion
Medizin der Universität zu Lübeck (Az 08-131) zur Nutzung des Lungengewebes
liegt vor.
Tumorfreies Gewebe wurde vom Institut für Pathologie ausgewählt und bis zur
Verarbeitung bei 4°C gelagert. Unter sterilen Bedingungen wurden 25-30 mg große
Stücke mit Hilfe einer chirurgischen Schere zugeschnitten. Jeweils ein Stück wurde
in einem Loch einer 24-Lochplatte mit 1 ml Versuchsmedium 1 inkubiert. Direkt im
Anschluss erfolgte die Infektion (Abschnitt 4.3.3).
4.3 Infektionsbiologische Methoden
4.3.1 Herstellung eines Infektionsstocks von C. pneumoniae
Zwölf 6-Lochplatten mit je 8x105 HEp-2 Zellen pro Loch wurden ausgesät. Nach
24 h Inkubation bei Normoxie wurde das Medium verworfen und 2 ml
Dauerkulturmedium, versetzt mit 1 µg/ml Cycloheximid, zugegeben. Die Zellen
wurden mit C. pneumoniae (10 IFUs/Zelle) durch Zentrifugation bei 700 x g und
30°C für 1 h infiziert und für 72 h bei Normoxie inkubiert. Die infizierten Zellen
wurden mit einem Zellschaber vom Plattenboden abgelöst und 10 min mit Glasschrot
auf einem Rüttler aufgeschlossen. Die Zellbestandteile wurden für 5 min bei 200 x g
und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand, welcher die Chlamydien enthielt, wurde
weitere 90 min bei 15500 x g und 4°C zentrifugiert. Das entstandene Chlamydien-
Pellet wurde in 2 ml SPG-Puffer gelöst und in 20 µl Aliquots bei -80°C gelagert. Zur
Bestimmung des Chlamydien-Gehalts wurde eine 1:2 Verdünnungsreihe in mit
HEp-2 Zellen bewachsenen Löchern einer 24-Lochplatte durchgeführt und die
Chlamydien-Einschlüsse ausgezählt (Abschnitt 4.3.7).
Methoden 36
4.3.2 Infektion von Zelllinien mit C. pneumoniae
Das entsprechende Zellmedium wurde zur Infektion mit 0,1 µg/ml Cycloheximid
versetzt. Die dadurch erzielte Hemmung der Proteinsynthese der Zelle begünstigt die
Infektion mit C. pneumoniae. HEp-2 Zellen wurden für die Persistenzversuche mit
einer Infektionsdosis von 2 IFUs pro Zelle in Versuchsmedium 1 infiziert. Dies
entspricht einer Infektionsrate von ca. 20% unter Normoxie und 70-80% unter
Hypoxie. Für die Metabolom-Analysen wurden HEp-2 Zellen mit 5,6 IFUs pro Zelle
in Versuchsmedium 2 infiziert, was einer Infektionsrate unter Normoxie von 10%
und unter Hypoxie von 60-70% entspricht. Für die Transkriptom-Analysen wurden
die HEp-2 Zellen mit 20 IFUs pro Zelle in Versuchsmedium 1 infiziert, was einer
Infektionsrate von 50-70% unter Normoxie entspricht. A549 Zellen für Persistenz-
und Transfektionsexperimente wurden mit 3 IFUs pro Zelle in Versuchsmedium 1
infiziert. Dies entspricht einer Infektionsrate von 10% unter Normoxie und 60-70%
unter Hypoxie. Nach der Zugabe von C. pneumoniae in das Medium, folgte eine
Zentrifugation für 1 h (700 x g, 30°C). Anschließend wurden die Platten bei
Normoxie oder Hypoxie inkubiert. Nach einer Inkubation von 72 hpi, wurde das
Medium gewechselt.
4.3.3 Infektion von humanem Lungengewebe
Zu den Gewebestücken wurde 0,1 µg/ml Cycloheximid ins Versuchsmedium 1
gegeben. Auf ein Lungenstück wurden 1x106 IFUs pipettiert. Die Inkubation erfolgte
unter Normoxie oder Hypoxie für 24 h.
4.3.4 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Tryptophan
Das IFN-γ haltige Medium wurde 24 hpi unter Normoxie verworfen und frisches
Medium mit einem Tryptophangehalt von 10 µg/ml zugegeben. Danach wurden die
Zellen für weitere 48 h bei Normoxie inkubiert und anschließend der
Chlamydiengehalt durch Wiederanzucht bestimmt (Abschnitt 4.3.6).
Methoden 37
4.3.5 Reaktivierungs-Modell von C. pneumoniae durch Hypoxie
Die Persistenz von C. pneumoniae wurde mit 10 U/ml IFN-γ induziert
(Abschnitt 4.1.1). Die Persistenz wurde über 144 h unter Normoxie beibehalten. Für
Reaktivierungs-Versuche wurden die persistent infizierten Zellen nach 48 h in
Hypoxie überführt und für weitere 48 h und 96 h inkubiert. Zur Kontrolle wurden
persistent infizierte Zellen parallel weiter unter Normoxie inkubiert. Das Medium
wurde alle 3 Tage durch frisches Versuchsmedium 1, versetzt mit 10 U/ml IFN-γ,
ausgetauscht. Anschließend erfolgte eine Wiederanzucht von C. pneumoniae
(Abschnitt 4.3.6) oder RNA-Isolation (Abschnitt 4.6.1).
4.3.6 Wiederanzucht
Zu dem Medium der Zellen einer 24-Lochplatte (Abschnitt 4.1.1) wurde 1 µg/ml
Cycloheximid hinzupipettiert. Die infizierten Zellen, von denen die Wiederanzucht
erfolgen sollte, wurden im Medium mit Hilfe eines Zellschabers vom Boden der
Zellkulturplatte abgeschabt und suspendiert. 2 ml der Suspension wurden in ein
10 ml Röhrchen mit 1 ml Glasschrot überführt. Für 5 min wurden die Zellen auf
einem Rüttler aufgeschlossen und die Chlamydien freigesetzt. Mit 250 µl der
Suspension wurde ein Loch der 24-Lochplatte infiziert. Weitere 250 µl wurden aus
dem ersten Loch entnommen, um das nächste Loch zu infizieren. Dieses wurde über
6 Löcher fortgeführt und es entstand eine Verdünnungsreihe von 1:5. Anschließend
wurde die 24-Lochplatte 1 h (700 x g, 30°C) zentrifugiert. Nach einer Inkubation für
72 h unter Normoxie wurde das Medium von den Zellen abgenommen und die Zellen
mit Methanol bei -20°C fixiert. Die Chlamydien wurden mit dem indirekten
Immunfluoreszenztest (IFT) (Abschnitt 4.4.2) nachgewiesen und ausgezählt
(Abschnitt 4.3.7), um so die Wiederanzuchtsrate zu bestimmen.
Methoden 38
4.3.7 Quantifizierung des Chlamydien-Gehalts
Die Einschlüsse von Chlamydien wurden mit dem indirekten IFT (Abschnitt 4.4.2)
angefärbt und wie im Folgenden beschrieben ausgezählt. Zehn Gesichtsfelder eines
Loches der Verdünnungsreihe wurden am Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher
Vergrößerung ausgezählt. Dafür wurde das Loch indem die Einschlusskörper
vereinzelt vorlagen ausgewählt. Anhand der Verdünnungsreihe war bekannt, wie viel
µl der Chlamydien-Suspension eingesetzt wurden. Unter Einbeziehung der Größe
eines Gesichtsfelds (0,139 mm2) und der Fläche eines Lochs einer 24-Lochplatte
(200 mm2), ergibt sich folgende Formel zur Bestimmung des Chlamydien-Gehalts:
퐼퐹푈푠 µ푙⁄ =퐺푒푧äℎ푙푡푒 퐸푖푛푠푐ℎ푙ü푠푠푒 ∗ 200 푚푚
퐺푒푧äℎ푙푡푒 퐺푒푠푖푐ℎ푡푓푒푙푑푒푟 ∗ 퐸푖푛푔푒푠푒푡푧푡푒 µ푙 ∗ 0,139 푚푚
4.4 Mikroskopie
4.4.1 Direkter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae
Zur Bestimmung der Infektionsrate und zur Analyse der Morphologie von Zellen und
chlamydialen Einschlüssen wurde der direkte IFT genutzt. Hierfür wurden
Deckgläser, die mit Zellen bewachsen waren, in eine 24-Lochplatte überführt und
mit Methanol bei -20°C fixiert. Das Methanol wurde anschließend verworfen und die
Deckgläser bei 37°C getrocknet. Vor der Verwendung des IMAGEN Chlamydia Kits
wurde dem Antikörper 1 ml PBS-Puffer zugefügt. Die Zellen wurden mit 10 µl des
verdünnten Antikörpers gefärbt und bei 37°C inkubiert. Die Deckgläser wurden dann
mit PBS-Puffer gewaschen und mit einem Tropfen Mountain Fluid auf einem
Objektträger, mit der bewachsenen Seite nach unten, gelegt. Zur Fixierung der
Deckgläser wurde Nagellack verwendet. Die Präparate konnten im
Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Zelluläre Bestandteile wurden rot und
chlamydiale Einschlusskörper grün dargestellt.
Methoden 39
4.4.2 Indirekter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae
Der indirekte IFT wurde in einer 24-Lochplatte durchgeführt. Das Medium der
Zellen wurde verworfen und die Zellen mit Methanol bei -20°C fixiert. Anschließend
wurde das Methanol verworfen und die Zellen einmal mit PBS-Puffer gespült. Zu
den Zellen wurden 250 µl eines Anti-Chlamydien-LPS-Antikörpers gegeben und die
Zellen mit dem Antikörper für 45 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde der
Antikörper abgenommen und die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Es
folgte eine weitere Inkubation mit dem entsprechenden FITC konjugierten
Sekundärantikörper für 30 min. Der Sekundärantikörper wurde verworfen und die
Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Am Fluoreszenzmikroskop konnte die
Infektionsrate bestimmt werden (Abschnitt 4.3.7).
4.4.3 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung von α-smooth muscle actin
Mit Zellen bewachsene Deckgläser wurden entsprechend zum direkten IFT
(Abschnitt 4.4.1) fixiert und anschließend 3 x 2 min mit PBS + 0,1% Tween-20
gewaschen. Der Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) Antikörper und der Anti-IncA
Antikörper wurden in PBS-Puffer + 0,1% Tween-20 verdünnt. 250 µl dieser
Primärantikörper wurden auf ein Deckglas pipettiert und für 90 min bei RT auf
einem Taumelschüttler inkubiert. Anschließend wurden die Antikörper verworfen
und die Zellen 3 x 2 min mit PBS-Puffer + 0,1% Tween-20 gewaschen. Die
entsprechenden Sekundärantikörper wurden in PBS-Puffer + 0,1% Tween-20
verdünnt und 250 µl auf die Zellen gegeben. Dunkel abgedeckt erfolgte eine
Inkubation für 90 min bei RT auf einem Taumelschüttler. Die Deckgläser wurden
3 x 2 min mit PBS-Puffer gewaschen. Die Fixierung der Deckgläser auf einem
Objektträger erfolgte entsprechend zum direkten IFT (Abschnitt 4.4.1). Die Zellen
wurden am Fluoreszenzmikroskop fotografiert und mit der BZ Analyzer Software
ausgewertet. Chlamydien-Einschlusskörper wurden dabei grün und α-SMA rot
dargestellt. Dazu wurde die Intensität von je 100 Pixel von 5 Zellen bei
3 biologischen Replikaten gemessen. Bei der Analyse von infizierten Proben wurden
nur Zellen die einen chlamydialen Einschlusskörper enthielten analysiert.
Methoden 40
4.4.4 Live Cell Imaging
Um die Migration von infizierten Zellen zu analysieren, wurden diese direkt nach der
Infektion in den Inkubator des Mikroskops gestellt. Mit dem 20-fachem Objektiv
wurden in einem Intervall von 30 min 96 Bilder aufgenommen. Anschließend
wurden diese Bilder zu einem Zeitraffer mit 5 Bildern pro Sekunde zusammengefügt.
Die Auswertung der Migration erfolgte mit dem „Chemotaxis and Migration Tool“
von ImageJ. Dabei wurde die durchschnittliche Distanz [µm] die eine Zelle migrierte
in 10 Zellen zwischen 12 und 24 hpi sowie zwischen 36 und 48 hpi bestimmt.
4.5 Proteinbiochemische Methoden
4.5.1 Probengewinnung
Die Probenaufarbeitung erfolgte aus einem Loch einer 6-Lochplatte. Es wurden
Proteine aus der frühen Phase (4 hpi), der mittleren Phase (24 hpi) und der späten
Phase (48 hpi) sowie 96 hpi gewonnen. Die folgenden Schritte wurden für Proben
die unter Hypoxie bebrütet wurden in der Hypoxiekammer durchgeführt. Das
Medium wurde von den Zellen abgenommen und unverzüglich 300 µl Lysispuffer
zugegeben. Die Zellen wurden mit einer Pipettenspitze homogenisiert und in ein
gekühltes Reaktionsgefäß überführt. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20°C.
4.5.2 SDS-PAGE
Zur Auftrennung von Proteinen nach ihrer Molekularmasse wurde die
diskontinuierliche Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese
(SDS-PAGE) nach Laemmli verwendet [63]. Es wurde ein 10%iges Trenngel mit
einem 4%igem Sammelgel in einer Größe von 8 x 7,3 cm gegossen (Tabelle 4.2).
Die auspolymerisierten Gele wurden in eine vertikale Elektrophoresekammer
eingesetzt und mit Elektrophoresepuffer übergossen. Die Proteine wurden bei 95°C
für 5 min denaturiert und anschließend 30 µl Probe ins Gel aufgetragen. Als
Größenstandard dienten 7 µl eines Molekulargewichtsmarkers. Die Migration der
Proteine durch das Sammelgel erfolgte bei einer Spannung von 70 V für 15 min. Im
Trenngel wurden die Proteine nach ihrer Molekularmasse bei einer Spannung von
200 V für 55 min aufgetrennt.
Methoden 41
Tabelle 4.2: Zusammensetzung des Sammel- und Trenngels
Trenngel (10%) Sammelgel (4%)
H2O 2,45 ml 3,2 ml
Trenngelpuffer 1,25 ml -
Sammelgelpuffer - 1,25 ml
Acrylamid/Bisacrylamid 1,25 ml 0,5 ml
10% SDS-Lösung 50 µl 50 µl
TEMED 2,5 µl 5 µl
10% APS-Lösung 25 µl 25 µl
4.5.3 Western Blot Analyse
Um spezifische Proteine nachzuweisen, wurden die aufgetrennten Proteine der
SDS-PAGE auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen. In dieser Arbeit wurde
dafür ein Nass-Blot verwendet. In einer horizontalen Blotapparatur erfolgte der
Transfer der Proteine aus der SDS-PAGE auf eine Nitrocellulosemembran für 1,5 h
bei 75 V unter ständiger Kühlung durch Eisblöcke. Anschließend wurden
unspezifische Bindungsstellen der Membran mit Blockpuffer für 1 h bei
Raumtemperatur (RT) blockiert. Über Nacht wurde die Membran bei 4°C und
leichtem Schwenken mit dem Primärantikörper (Abschnitt 3.9.1) in der
entsprechenden Verdünnung im Blockpuffer inkubiert. Am nächsten Tag wurde die
Membran 2 x 15 min mit T-TBS gewaschen. Der Sekundärantikörper wurde in
Blockpuffer verdünnt und für 1 h bei RT mit der Membran inkubiert. Es folgte ein
erneutes Waschen für 2 x 15 min mit T-TBS. Die verwendeten Sekundärantikörper
sind mit einer Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) gekoppelt.
Durch Zugabe des Luminol-haltigen Substrats nach Herstellerangaben wurde das
Luminol oxidiert und die Lumineszenz konnte im Chemilumineszenz-Imager
detektiert werden. Dargestellt wurde jeweils ein repräsentatives Ergebnis der
Replikate der Western Blot Analysen. Die Bandenintensität der Replikate der
Western Blot Analysen wurde mit der Software Bio1D ausgewertet. Die
Proteinmenge wurde gegen das Housekeeping-Protein β-Aktin normalisiert. Die
Bande mit der stärksten Intensität wurde als 100% definiert.
Methoden 42
4.6 Molekularbiologische Methoden
4.6.1 RNA-Isolation
Zur Isolation von total-RNA wurde das NucleoSpin RNA II Kit verwendet. Der
RNA-Lysispuffer wurde im Verhältnis 1:100 mit β-Mercaptoethanol versetzt. Zur
Isolierung von RNA aus Zellkulturen wurden Zellen eines Lochs einer 6-Lochplatte
mit 350 µl RNA-Lysispuffer lysiert. Um humanes Lungengewebe zu lysieren, wurde
ein Stück Lunge in 600 µl RNA-Lysispuffer in ein Precellys Kryoröhrchen gegeben.
Bei 6500 rpm für 15 sec im Gewebehomogenisator, wurde das Gewebe
homogenisiert. Die weitere Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.
4.6.2 Reverse Transkription
RNA wurde mit Hilfe der reversen Transkription in cDNA umgeschrieben.
Tabelle 4.3: Pipettierschema der reversen Transkription mit Roche und Fermentas
Volumen Endkonzentration
Reagenzien Roche Fermentas Roche Fermentas
RNase-freies H2O 6,0 µl 5,5 µl
Reaktionspuffer (5x) 4,0 µl 4,0 µl 1x 1x
dNTP Mix 2,0 µl 2,0 µl 1 mM 1 mM
Random Hexamer Primer 2,0 µl 2,0 µl 0,04 U/µl 0,04 U/ml
RNase-Inhibitor 0,5 µl 0,5µl 50 U 2 U
Reverse Transkriptase 0,5 µl 1,0 µl 20 U 10 U
RNA 5,0 µl 5,0 µl
Die Reaktion erfolgte im Thermocycler mit den folgenden Programmen:
Methoden 43
Tabelle 4.4: Temperaturprofil der reversen Transkription
Temperatur Dauer (Roche) Dauer (Fermentas)
Hybridisierung 25°C 10 min 10 min
Reverse Transkription 50°C 60 min 30 min
Inaktivierung des Enzyms 85°C 5 min 5 min
Kühlung 4°C ∞ ∞
Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20°C.
4.6.3 Quantitative RT-PCR
Die hier verwendete quantitative reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) wurde mit
dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR-Green in Glas-Kapillaren durchgeführt. Die aus der
reversen Transkription entstandene cDNA (Abschnitt 4.6.2) wurde mit den in
Abschnitt 3.8.2 aufgeführten Primer analysiert.
Tabelle 4.5: Pipettierschema der quantitative RT-PCR
Reagenz Volumen Endkonzentration
H2O 12,6 µl
MgCl2 2,4 µl 4,0 mM
Forward Primer (20 µM) 0,5 µl 0,5 µM
Reverse Primer (20 µM) 0,5 µl 0,5 µM
LightCycler FastStart Reaktionsmix SYBR-Green 2,0 µl 1x
cDNA 2,0 µl
Zuvor wurde dem Lightcycler FastStart Reaktionsmix 10 µl LightCycler FastStart
Enzym zugegeben. Die Amplifizierung erfolgte im LightCycler bei folgendem
Temperaturprofil:
Methoden 44
Tabelle 4.6: Temperaturprofil der quantitativen RT-PCR
Temperatur Dauer Zyklen
Initiale Denaturierung 95°C 10 min
Denaturierung 95°C 10 sec
Primerhybridisierung 60°C 5 sec 45
Elongation 72°C 10 sec
Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm LightCycler Data Analysis.
Die Daten wurden entsprechend der mRNA Menge des Housekeeping-Gens
18S rRNA normalisiert. Die Probe mit der stärksten Expression wurde als 100%
definiert. Bei der Analyse von chlamydialen Genen wurde gegen die Expression des
chlamydialen Elongationsfaktors Tuf (thermo unstable elongation factor)
normalisiert, der zuvor als geeignetes Housekeeping Gen beschrieben wurde [75].
4.6.4 RNA-Interferenz Analysen
In dieser Arbeit wurde HIF-1α in A549 Zellen mittels RNA-Interferenz inhibiert.
Dazu wurde je ein Ansatz von 250 µl Optimem Medium mit 5 µl Lipofectamin oder
5 µl der HIF-1α siRNA (20 µM) versetzt. Beide Ansätze wurden 5 min bei RT
inkubiert und anschließend zusammen pipettiert. Dieses Gemisch wurde in ein kurz
zuvor angesetztes Loch einer 6-Lochplatte mit A549 Zellen und 2 ml
Versuchsmedium 2 gegeben. Der Ansatz wurde für 5 h bei Hypoxie inkubiert.
Anschließend wurde das Medium in der Hypoxiekammer verworfen und mit 5 ml
Versuchsmedium 1 und z.T. mit 10 U/ml IFN-γ versetzt. Alle Ansätze wurden
parallel mit einer Kontroll-siRNA durchgeführt.
Methoden 45
4.6.5 Inhibition von TGF-β
A549 Zellen wurden ausgesät (Abschnitt 4.1.1) und nach 24 h Inkubation unter
Normoxie und Hypoxie infiziert (Abschnitt 4.3.2). Der TGF-ß Inhibitor SB-431542
wurde zu einer Arbeitskonzentration von 26 mM in DMSO gelöst. Vor der
Verwendung wurde die Suspension 1:10 mit Versuchsmedium 1 verdünnt. Das
Medium wurde 4 hpi mit 5 µM SB-431542 versetzt und die Zellen für weitere 44 h
bei Normoxie oder Hypoxie inkubiert. Anschließend wurden die Proteine der Zelle
für Western Blot Analysen gewonnen (Abschnitt 4.5.1).
4.6.6 Transkriptom-Analysen
Um hohe Ausbeuten an chlamydialer mRNA zu erhalten, wurden zwei verschiedene
Aufreinigungsverfahren verglichen.
4.6.6.1 Aufreinigung 1
Für die Analyse des chlamydialen Transkriptoms wurden 6 Löcher einer
6-Lochplatte pro Probe für die RNA-Isolation eingesetzt (Abschnitt 4.6.1). Um die
humane RNA aus der total-RNA abzureichern, wurde das MICROBEnrich Kit nach
Herstellerangaben verwendet. Die erhaltene RNA konnte direkt in das
MICROBExpress Kit eingesetzt werden, um chlamydiale rRNA zu entfernen. Dieses
Kit wurde ebenfalls nach Herstellerangaben durchgeführt. Die RNA wurde in 30 µl
RNase-freiem H2O gelöst. Der RNA-Gehalt sowie die Reinheit wurden im
NanoDrop bestimmt.
4.6.6.2 Aufreinigung 2
Vor der Durchführung einer total-RNA-Isolation erfolgte eine Separation von
humanen und chlamydialen Bestandteilen mittels Differentialzentrifugation. Dazu
wurden infizierte Zellen von zehn 6-Lochplatten für eine Probe mit einem
Zellschaber vom Plattenboden abgelöst und die Zellen 2 min mit Glasschrot
aufgeschlossen. Die zellulären Bestandteile wurden bei 200 x g und 4°C für 5 min
abzentrifugiert. Der Überstand wurde in der Ultrazentrifuge bei 28000 x g und 4°C
für 1 h zentrifugiert. Das entstandene Chlamydien-Pellet wurde in 600 µl
RNA-Lysispuffer, versetzt mit β-Mercaptoethanol (1:100), lysiert und in die
Methoden 46
total-RNA-Isolation eingesetzt (Abschnitt 4.6.1). Die weitere Aufreinigung erfolgte
entsprechend (Abschnitt 4.6.6.1).
4.6.6.3 BioAnalyzer
Die Durchführung und Auswertung der Proben am BioAnalyzer erfolgte durch die
Fa. GATC Biotech AG, Konstanz.
4.6.6.4 RNA-Sequenzierung
Die RNA-Sequenzierung besteht aus der c-DNA Synthese und der Sequenzierung
am HiSeq2000 und wurde von der Fa. GATC Biotech AG, Konstanz durchgeführt.
Pro Probe wurden Sequenzen mit einer Länge von 100 bp auf dem HiSeq2000
(Illumina) im 3fach-Ansatz sequenziert. Die bioinformatische Auswertung des
Transkriptoms wurde von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. T. Rattei des Departments für
Computational Systems Biology, Universität Wien durchgeführt.
4.7 Metabolom-Analysen
4.7.1 Aufarbeitung von Metaboliten für das FT/ICR-MS
Das Medium wurde 7 h nach Aussaat der HEp-2 Zellen (Abschnitt 4.1.1)
abgenommen und die Zellen mit 1 ml Versuchsmedium 2 gewaschen. Danach
wurden 5 ml Versuchsmedium 2 auf die Zellen gegeben. Zu den Zellen wurden
10 U/ml IFN-γ gegeben und diese für weitere 17 h bei Normoxie oder Hypoxie
bebrütet. Die Infektion der Zellen erfolgte entsprechend zu Abschnitt 4.3.2. Das
Medium wurde 24 hpi von den Zellen abgenommen. Der Zellrasen wurde sofort mit
1 ml eiskaltem Methanol bedeckt, welches direkt wieder verworfen wurde. Dieser
Schritt diente dem Quenchen der Proben, wodurch der Metabolismus der Zelle
gestoppt wurde. Die Zellen wurden nun in 1 ml eines eiskalten Methanol:H2O
Gemischs (50:50) mit einem Zellschaber von der Platte gelöst und in ein
Reaktionsgefäß überführt. In einem gekühlten Ultraschallbad wurden die Zellen und
Chlamydien für 30 min aufgeschlossen, wobei bevorzugt hydrophile Metabolite vom
Lösungsmittel aufgenommen wurden. Die Zellbestandteile wurden für 5 min bei
2000 x g abzentrifugiert und der Überstand bei -80°C gelagert. Zu dem Zellpellet
wurde 1 ml Methanol gegeben und die Zellsuspension erneut für 30 min im
Methoden 47
Ultraschallbad behandelt. Dabei wurden hauptsächlich Metabolite mittlerer Polarität
extrahiert. Nach einer weiteren 5 minütigen Zentrifugation bei 2000 x g wurde der
Überstand zu dem ersten Überstand gegeben und bei -80°C gelagert. Die Proben
wurden zur weiteren Analyse ins Helmholtz Zentrum München gesendet. Alle
weiteren Methoden und Analysen wurden in Kooperation mit Constanze Müller der
Arbeitsgruppe von PD Dr. Ph. Schmitt-Kopplin am Helmholtz Zentrum München,
Abteilung Analytische BioGeoChemie durchgeführt.
4.7.2 Analyse der Metabolite
Das Lösungsmittel, welches die extrahierten Metabolite der Zellen enthielt, wurde
direkt in das ESI FT/ICR-MS (Elektrospray Ionisation Fouriertransformation-
Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer) bei positiver und negativer Polarität
injiziert. Dafür wurden die Proben 1:50 (positive Polarität) bzw. 1:20 (negative
Polarität) mit Methanol verdünnt. Bei positiver Polarität ionisieren bevorzugt
basische Metabolite, wohingegen bei negativer Polarität saure Metabolite ionisieren.
Durch das starke 12 Tesla Magnetfeld wurde eine Ultra-hohe Auflösung (>300000)
und Massengenauigkeit (<100 ppb) erzielt. Die Spektren wurden in einer
Massenbreite von 120-1000 m/z (positive Polarität) bzw. 150-1200 m/z (negative
Polarität) analysiert.
4.7.3 Auswertung der relevanten Massen
Mittels der Hauptkomponentenanalyse (principal componant analysis, PCA) erfolgte
eine Vereinfachung der Datenmatrix. Dabei wurden Proben, die eine ähnliche
Stoffwechselsituation aufwiesen, nach zwei grundsätzlichen Komponenten
zusammengruppiert. In dieser non-supervised Methode wurde dem System nicht
mitgeteilt, welche Proben sich unterscheiden sollen und welche nicht. Anschließend
wurde eine Partial Least Squares Diskriminanzanalyse (PLS-DA) für die
Datenmatrix aufgebaut. Mit dieser supervized multivarianten Methode konnten
Metaboliten, welche sich am stärksten in den vorher definierten Gruppen
unterschieden (variable importance in the projection (VIP) > 1), bestimmt werden.
Die Analyse erfolgte separat für den positiven als auch negativen Breitbandmodus
und die erhaltenen Massen wurden für weitere Analysen extrahiert. Zur Annotierung
und Translation in biochemische Stoffwechselwege wurde die Software MassTRIX,
Methoden 48
mit einem Fehler von 1 ppm, verwendet. Die annotierten Massen der infizierten
Zellen unter Normoxie und Hypoxie wurden mittels des Wilcoxon-Mann-Whitney
Test (non parametrischer Test) auf signifikante Unterschiede in ihrer Signalintensität
analysiert. P-Werte von ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Zusätzlich wurden die statistisch signifikanten Massen der nicht-infizierten Zellen in
Normoxie und Hypoxie identifiziert und mit denen der infizierten Zellen
abgeglichen. Bei gleichem Verhältnis der Massen in den beiden Konditionen
untereinander, wurden die Massen aus dem Datenset entfernt. Auf diese Weise
wurden nur die für die Infektion relevanten Massen analysiert.
4.8 Statistik Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Für die statistische
Auswertung wurde ein Student‘s t-test (einseitig, ungepaart) angewandt. P-Werte
von ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
Ergebnisse 49
5 Ergebnisse
5.1 Untersuchungen der IFN-γ induzierten Persistenz von C. pneumoniae unter Hypoxie
5.1.1 Aufhebung der Persistenzbildung von C. pneumoniae durch Hypoxie
Die Sauerstoffverfügbarkeit in der Lunge nimmt gegenüber der atmosphärischen
Luft entlang der Bronchien ab. Bei reduzierter Ventilation von Lungenzellen oder bei
Entzündungsreaktionen sinkt die Sauerstoffkonzentration weiter. Auf Grund der
obligat intrazellulären Lebensweise von C. pneumoniae, müssen sich diese an
geringe Sauerstoffverhältnisse anpassen. Zuvor konnte gezeigt werden, dass
C. pneumoniae unter Hypoxie ein schnelleres Wachstum und größere
Einschlusskörper aufweist als unter Normoxie. In dieser Arbeit sollte der Einfluss
von Hypoxie auf die Persistenz von C. pneumoniae analysiert werden. Dazu wurden
HEp-2 Zellen 24 h vor der Infektion mit 10 U/ml IFN-γ behandelt, unter Normoxie
und Hypoxie inkubiert sowie mit C. pneumoniae infiziert. Zuerst wurde die
Morphologie der Einschlusskörper im direkten IFT analysiert (Abbildung 5.1).
Charakteristisch für die Persistenz sind kleine Einschlusskörper. Diese waren in
C. pneumoniae infizierten Zellen mit IFN-γ unter normoxischen Bedingungen zu
finden. Dagegen führte eine Infektion unter Hypoxie zu größeren Einschlusskörpern,
die vergleichbar mit denen der Kontrolle waren. IFN-γ hatte demnach keinen
Einfluss auf die Morphologie der Einschlusskörper unter Hypoxie.
Ergebnisse 50
Abbildung 5.1: C. pneumoniae Einschlusskörper nach IFN-γ Behandlung unter Normoxie und Hypoxie. Im direkten IFT waren unter Normoxie und Hypoxie in den Kontrollen die kein IFN-γ enthielten große Einschlusskörper (grün) in HEp-2 Zellen (rot) zu detektieren (48 hpi). Durch IFN-γ Behandlung (10 U/ml) lagen kleine Einschlusskörper unter Normoxie vor, wohingegen unter Hypoxie große Einschlusskörper zu detektieren waren. Die Abbildung stammt aus einem repräsentativem Experiment von n=3.
Eine weitere Eigenschaft der Persistenz ist, dass keine infektiösen EK im
Entwicklungszyklus entstehen. Die kleinen Einschlusskörper in IFN-γ behandelten
Zellen unter Normoxie wiesen keine Wiederanzucht von C. pneumoniae auf
(0 ± 0,2 IFUs/µl) (Abbildung 5.2). Durch das Auswaschen von IFN-γ und der
Zugabe von Tryptophan 24 hpi konnte eine Reaktivierung von C. pneumoniae
erreicht werden (1,4x103 ± 8,2x102 IFUs/µl). Dies zeigte, dass die Behandlung mit
IFN-γ unter Normoxie tatsächlich zur Persistenz und nicht zu einem Absterben von
C. pneumoniae führte. In den IFN-γ behandelten Zellen unter Hypoxie zeigte sich
hingegen eine hohe Wiederanzuchtsrate von C. pneumoniae
(1,4x105 ± 3,9x104 IFUs/µl), die vergleichbar mit dem Wachstum ohne IFN-γ
Zugabe unter Normoxie und Hypoxie war.
Ergebnisse 51
Abbildung 5.2: Wiederanzucht von C. pneumoniae in HEp-2 Zellen nach IFN-γ Behandlung unter Normoxie und Hypoxie (72 hpi). Eine IFN-γ-Behandlung (10 U/ml) führte unter Normoxie zu keiner Wiederanzucht, wohingegen unter Hypoxie eine hohe Wiederanzuchtsrate erreicht wurde. Eine Wiederanzucht von persistenten C. pneumoniae unter Normoxie konnte durch einen Wechsel auf ein tryptophanhaltiges Medium ohne IFN-γ (24 hpi) erzielt werden (n=3, *p≤0,05).
Um zu analysieren, bei welchen Sauerstoffkonzentrationen die IFN-γ induzierte
Persistenz von C. pneumoniae verhindert wird, wurden ansteigende
Sauerstoffkonzentrationen getestet. Im direkten IFT zeigten sich bei 1-2% O2 in
IFN-γ behandelten Zellen große Einschlusskörper, die jedoch bei ≥ 3% O2 nicht
mehr sichtbar waren (Abbildung 5.3 A). Eine Wiederanzucht von C. pneumoniae in
IFN-γ behandelten Zellen wurde ebenfalls nur bei Konzentrationen ≤ 2% O2 erreicht
(Abbildung 5.3 B).
Ergebnisse 52
Abbildung 5.3: Persistenzinduktion von C. pneumoniae bei ansteigender Sauerstoffkonzentration in HEp-2 Zellen. (A) Der direkte IFT zeigte große Einschlusskörper von C. pneumoniae (grün) in IFN-γ (10 U/ml) behandelten HEp-2 Zellen (rot) 48 hpi bei 1-2% O2. Bei ≥ 3% O2 waren keine Einschlusskörper mehr zu erkennen (Die Abbildung stammt aus einem repräsentativem Experiment von n=3). (B) Eine Wiederanzucht von C. pneumoniae infizierten und IFN-γ behandelt Zellen, war bei 1-2% O2, jedoch nur sehr gering bei Sauerstoffkonzentrationen ≥ 3% möglich (n=3).
5.1.2 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Hypoxie
Bisher sind Faktoren, die in vivo zu einer Reaktivierung von persistenten
C. pneumoniae führen nicht bekannt. Da Hypoxie die Persistenzinduktion
verhinderte, wurde der Einfluss von Hypoxie auf eine bereits persistierende
C. pneumoniae-Infektion untersucht. Dazu wurden IFN-γ behandelte HEp-2 Zellen
für 48 h mit C. pneumoniae unter Normoxie infiziert. Danach wurden die nun
persistent infizierten Zellen unter Normoxie oder Hypoxie weiter bebrütet. Nach 48 h
und 96 h wurde ein direkter IFT und eine Wiederanzucht durchgeführt. Dabei zeigte
sich, dass ein leichter Anstieg der Wiederanzuchtsrate nach 48 h und ein
signifikanter Anstieg der Wiederanzuchtsrate nach 96 h hypoxischer Inkubation, im
Vergleich zu den persistent infizierten Zellen unter Normoxie, erreicht werden
konnte (Abbildung 5.4 A). Die persistent infizierten Zellen unter Normoxie wiesen
zu keinem Zeitpunkt eine Wiederanzuchtsrate auf. Im direkten IFT konnte ebenfalls
eine Veränderung der Größe der Einschlusskörper zwischen Normoxie und Hypoxie
detektiert werden (Abbildung 5.4 B). In der Persistenz-Kontrolle waren keine
Einschlüsse sichtbar, wohingegen deren Größe unter hypoxischer Inkubation nach
48 h und verstärkt nach 96 h zunahm.
Ergebnisse 53
Abbildung 5.4: Reaktivierung von persistenten C. pneumoniae durch Hypoxie in HEp-2 Zellen. (A) Die Persistenz wurde unter Normoxie durch die Zugabe von IFN-γ (10 U/ml) induziert. Die Zellen wurden 48 hpi für weitere 48 h oder 96 h entweder bei Normoxie (grün) oder Hypoxie (rot) bebrütet. C. pneumoniae infizierte Zellen ohne IFN-γ (blau) dienten als Kontrolle der Infektion. Nach 96 h hypoxischer Inkubation zeigte sich eine hohe Wiederanzucht von C. pneumoniae, wohingegen C. pneumoniae kein Wachstum unter Normoxie aufwies (n=5, *p≤0,05 im Vergleich zu Normoxie). (B) Im direkten IFT zeigten sich vergrößerte Einschlusskörper (grün) in IFN-γ behandelten HEp-2 Zellen (rot) nach 96 h Inkubation in Hypoxie (Die Abbildung stammt aus einem repräsentativem Experiment von n=5).
5.2 Analyse von IFN-γ induzierenden Signalwegen unter Hypoxie
5.2.1 Beeinflussung der Jak-STAT Signalkaskade durch Hypoxie
Die IFN-γ induzierte Persistenz basiert hauptsächlich auf der Aktivität der Jak-STAT
Signalkaskade. Um die verminderte Aktivität von IFN-γ unter Hypoxie zu
charakterisieren, wurden die Phosphorylierungen von STAT1 am Tyrosin 701 und
Serin 727 unter Hypoxie in Western Blot Analysen untersucht. Die
Ergebnisse 54
Phosphorylierungen waren verstärkt nach IFN-γ Behandlung sichtbar und werden im
Weiteren hier beschrieben. Es zeigte sich unter Normoxie, dass eine Infektion mit
C. pneumoniae (4 hpi) zu einer erhöhten Phosphorylierung am Tyrosin gegenüber
nicht-infizierten Zellen führte (Abbildung 5.5 A und B). Zudem war die Tyrosin-
Phosphorylierung signifikant stärker in infizierten Zellen unter Normoxie als in
infizierten Zellen unter Hypoxie. Die Phosphorylierung am Serin 727 unterschied
sich hingegen nicht zwischen Normoxie und Hypoxie (Abbildung 5.5 A und C).
Abbildung 5.5: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (4 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B/C) zeigten, dass C. pneumoniae infizierte Zellen unter Normoxie eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung (B) aufwiesen, welche unter Hypoxie signifikant reduziert war. Bei der Serin-Phosphorylierung (C) konnte kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie detektiert werden (n=3, *p≤0,05).
Die Tyrosin-Phosphorylierung war in der mittleren Phase der Infektion (24 hpi) in
infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie gegenüber Normoxie verstärkt
(Abbildung 5.6 A und B). Dies war jedoch nicht signifikant. Dahingegen war eine
signifikant niedrigere Tyrosin-Phosphorylierung in C. pneumoniae infizierten Zellen,
Ergebnisse 55
im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen, unter Hypoxie zu detektieren. Die
Phosphorylierung am Serin 727 in nicht-infizierten Zellen war stärker unter Hypoxie
als unter Normoxie. Die Serin-Phosphorylierung sank jedoch unter Hypoxie in
C. pneumoniae infizierten Zellen gegenüber nicht-infizierten Zellen signifikant ab
(Abbildung 5.6 A und C).
Abbildung 5.6: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (24 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B/C) zeigten keinen Unterschied zwischen der Tyrosin-Phosphorylierung (B) unter Normoxie und Hypoxie in C. pneumoniae infizierten sowie nicht-infizierten Zellen. Die Serin-Phosphorylierung (C) war unter Hypoxie in nicht infizierten Zellen erhöht. In infizierten Zellen war kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie zu detektieren (n=3, *p≤0,05).
In der späten Phase der Infektion (48 hpi) war die Tyrosin-Phosphorylierung am
STAT1 in nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie stärker als in nicht infizierten
Zellen unter Normoxie (Abbildung 5.7 A und B). Die in nicht-infizierten Zellen
erhöhte Phosphorylierung unter Hypoxie war jedoch in infizierten Zellen unter
Hypoxie signifikant reduziert und entsprach der unter Normoxie. Die
Ergebnisse 56
Serin-Phosphorylierung am STAT1 blieb in infizierten und nicht-infizierten Zellen
unter Normoxie und Hypoxie unverändert (Abbildung 5.7 A und C).
Abbildung 5.7: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (48 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B/C) zeigten eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung (B) in nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie. In infizierten Zellen war kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie zu detektieren. Bei der Serin-Phosphorylierung (C) konnte kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie detektiert werden (n=3, *p≤0,05).
Ergebnisse 57
5.2.2 Beeinflussung der IDO Expression durch Hypoxie
Über die IFN-γ-induzierte Jak-STAT Signalkaskade werden Gene, die in ihrem
Promotor das GAS Element tragen, exprimiert. Das Enzym IDO trägt dieses Element
und wandelt, nach Induktion durch IFN-γ, Tryptophan zu N-Formylkynurenin um,
womit es zur Persistenzinduktion von C. pneumoniae beiträgt. Die Expression von
IDO wurde auf Gen- und Protein-Ebene analysiert. IDO war nur in Zellen nach
IFN-γ Behandlung zu detektieren. Deshalb wurden nur die IFN-γ behandelten Proben
für die densitometrische Auswertung der Western Blot Analysen herangezogen und
hier weiter beschrieben. In der frühen Phase der Infektion (4 hpi) war die
Genexpression von IDO in nicht-infizierten wie auch in C. pneumoniae infizierten
Zellen unter Normoxie signifikant stärker als unter Hypoxie (Abbildung 5.8 A).
Zudem zeigte sich unter Normoxie in infizierten Zellen gegenüber nicht-infizierten
Zellen eine signifikant erhöhte Genexpression von IDO. Übereinstimmend zu der
Genexpression zeigten auch die Western Blot Analysen, dass die Proteinexpression
von IDO in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Normoxie
signifikant stärker war als unter Hypoxie (Abbildung 5.8 B und C).
Ergebnisse 58
Abbildung 5.8: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (4 hpi). (A) Quantitative RT-PCR Analysen wiesen unter Normoxie und Hypoxie eine höhere Genexpression von IDO sowohl in C. pneumoniae infizierten als auch in nicht-infizierten Zellen nach (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001). Die Western Blot Analysen (B) und deren densitometrische Auswertung (C) zeigten ebenfalls, dass unter Hypoxie eine signifikant niedrigere IDO Proteinexpression als unter Normoxie vorlag (n=3, ***p≤0,001).
In der mittleren Phase des Entwicklungszyklus (24 hpi) war die Genexpression von
IDO in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen zwischen Normoxie
und Hypoxie vergleichbar (Abbildung 5.9 A). Lediglich eine Infektion unter
Normoxie führte gegenüber nicht-infizierten Zellen zu einer signifikanten Reduktion
der Genexpression. Hingegen verblieb die Proteinexpression von IDO unverändert.
Ergebnisse 59
Hier lag weiterhin eine niedrigere Proteinkonzentration von IDO unter Hypoxie als
unter Normoxie in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen vor
(Abbildung 5.9 B und C). Daneben war die Proteinkonzentration von IDO unter
Normoxie in infizierten Zellen, im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen, signifikant
erhöht.
Abbildung 5.9: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (24 hpi). (A) Quantitative RT-PCR Analysen wiesen keinen Unterschied in der Genexpression von IDO zwischen Normoxie und Hypoxie auf (n=3, *p≤0,05). Die Western Blot Analysen (B) und deren densitometrische Auswertung (C) zeigten eine erniedrigte IDO Proteinexpression in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie (n=3, **p≤0,005, ***p≤0,001).
Ergebnisse 60
Interessanterweise kehrte sich das Verhältnis der IDO Genexpression zu der
Proteinexpression in der späten Phase der Infektion (48 hpi) um. So lag eine
signifikant höhere Genexpression unter Hypoxie gegenüber Normoxie in
C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen vor (Abbildung 5.10 A). Im
Gegensatz dazu blieb die Proteinexpression von IDO weiterhin signifikant unter
Hypoxie gegenüber Normoxie in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten
Zellen erniedrigt (Abbildung 5.10 B und C).
Abbildung 5.10: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (48 hpi). (A) Quantitative RT-PCR Analysen wiesen eine erhöhte Genexpression von IDO in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie auf (n=3, **p≤0,005, ***p≤0,001). Die Western Blot Analysen (B) und die densitometrische Auswertung (C) wiesen hingegen eine reduzierte IDO Proteinexpression in infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie auf (n=3, **p≤0,005).
Ergebnisse 61
5.2.3 Beeinflussung weiterer IFN-γ regulierter Proteine durch Hypoxie
Um die Analysen nicht nur auf die Mediatoren der Jak-STAT Signalkaskade zu
beschränken, wurden Proteine deren Expression über die Jak-STAT Signalkaskade
reguliert werden mittels quantitativer RT-PCR analysiert. Das IFN-γ induzierbare
Protein 10 (IP-10) ist ein Chemokin, welches eine ISRE-Sequenz in seiner
Promotorregion trägt [81]. Dadurch war IP-10 in den IFN-γ behandelten Zellen zu
detektieren und wird diesbezüglich hier weiter beschrieben. IP-10 zeigte 4 hpi eine
signifikant niedrigere Genexpression unter Hypoxie gegenüber Normoxie sowohl in
C. pneumoniae infizierten als auch in nicht-infizierten Zellen (Abbildung 5.11 A).
Interessanterweise fand im weiteren Verlauf der Infektion (24 hpi und 48 hpi) eine
Gegenregulation von IP-10 statt. Daher lag in C. pneumoniae infizierten und
nicht-infizierten Zellen eine signifikant reduziert Genexpression von IP-10 unter
Normoxie gegenüber Hypoxie vor (Abbildung 5.11 B und C).
Ergebnisse 62
Abbildung 5.11: Quantitative RT-PCR von IP-10 in HEp-2 Zellen. (A) Die Genexpression von IP-10 war 4 hpi sowohl in nicht-infizierten als auch in C. pneumoniae-infizierten Zellen unter Hypoxie signifikant reduziert. Eine erhöhte Genexpression lag 24 hpi (B) und 48 hpi (C) in nicht-infizierten und C. pneumoniae infizierten Zellen unter Hypoxie vor (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).
Ergebnisse 63
Weiterhin wurde die Expression der über die Jak-STAT Signalkaskade regulierten
Gene SOCS1 und SOCS3 analysiert. Eine Aktivierung der Expression wurde nur in
IFN-γ behandelten Zellen detektiert, weshalb sich die folgenden Analysen auf IFN-γ
behandelte Zellen beziehen. Eine Induktion der SOCS1 Expression durch IFN-γ
zeigte sich ausschließlich 4 hpi und von SOCS3 4 hpi und 24 hpi, weshalb spätere
Zeitpunkte nicht dargestellt wurden. Es zeigte sich, dass die Expression von SOCS1
(Abbildung 5.12) und SOCS3 (Abbildung 5.13 A) 4 hpi unter Normoxie in
C. pneumoniae infizierten Zellen, im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen signifikant
erhöht war. Dagegen war eine signifikant niedrigere Expression in infizierten Zellen
unter Hypoxie, gegenüber infizierten Zellen unter Normoxie, zu detektieren. Diese
entsprach der Expression von nicht-infizierten Zellen. SOCS3 wies in
nicht-infizierten und infizierten Zellen 24 hpi eine erniedrigte Genexpression unter
Hypoxie gegenüber Normoxie auf (Abbildung 5.13 B).
Abbildung 5.12: Quantitative RT-PCR von SOCS1 in HEp-2 Zellen. (A) In C. pneumoniae infizierten Zellen lag 4 hpi eine signifikant höhere Genexpression von SOCS1 unter Normoxie gegenüber Hypoxie vor (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).
Ergebnisse 64
Abbildung 5.13: Quantitative RT-PCR von SOCS3 in HEp-2 Zellen. (A) Die Genexpression von SOCS3 war in infizierten Zellen 4 hpi unter Hypoxie gegenüber Normoxie reduziert. (B) Die Genexpression von SOCS3 war in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen 24 hpi unter Hypoxie gegenüber Normoxie reduziert (n=3, *p≤0,05, **p≤0,005, ***p≤0,001).
Ergebnisse 65
5.3 Analyse von IL-6 unter Hypoxie Die erste Barriere gegen eine C. pneumoniae-Infektion stellen die Epithelzellen der
Atemwege dar. Eine Infektion führt zur Sekretion von proinflammatorischen
Zytokinen. Hier sollte untersucht werden, ob das proinflammatorische Zytokin IL-6
während einer aktiven Infektion sowie in der Persistenz und der Reaktivierung
exprimiert wird. Zusätzlich sollte dabei der Einfluss von Hypoxie untersucht werden.
Dazu wurde das humane Lungengewebs-Modell und das Reaktivierungs-Modell
genutzt. Es zeigte sich, dass eine akute Infektion (24 hpi) von humanem
Lungengewebe eine signifikante IL-6 Expression unabhängig von der
Sauerstoffkonzentration herbeiführte (Abbildung 5.14).
Abbildung 5.14: Quantitative RT-PCR von IL-6 in C. pneumoniae infiziertem humanen Lungengewebe (24 hpi). Eine C. pneumoniae-Infektion führte zu einer signifikant erhöhten IL-6 Expression unter Normoxie und Hypoxie (n=3, **p≤0,005, ***p≤0,001).
Weiterhin wurde die IL-6 Expression in dem Reaktivierungs-Modell von
Epithelzellen untersucht. In diesem Modell lag unter Normoxie eine persistente
C. pneumoniae-Infektion vor, wohingegen unter Hypoxie (96 h) eine zuvor
persistente Infektion reaktiviert wurde. Eine C. pneumoniae-Infektion führte unter
Normoxie und Hypoxie, im Vergleich zu den nicht-infizierten, IFN-γ behandelten
Zellen, zu einem signifikanten Anstieg der IL-6 Expression (Abbildung 5.15). Jedoch
war die IL-6 Expression in infizierten Zellen geringer unter Hypoxie als unter
Normoxie. IFN-γ führte bei nicht-infizierten Zellen ebenfalls zu einer erhöhten IL-6
Expression unter Normoxie und Hypoxie. Die IFN-γ induzierte IL-6 Expression in
nicht-infizierten Zellen war hier ebenfalls unter Normoxie stärker als unter Hypoxie.
Ergebnisse 66
Abbildung 5.15: Quantitative RT-PCR von IL-6 in dem Reaktivierungs-Modell von C. pneumoniae infizierten HEp-2 Zellen. IFN-γ (10 U/ml) führte in nicht-infizierten Zellen zu einer Aktivierung der IL-6 Expression. Eine C. pneumoniae-Infektion von IFN-γ stimulierten Zellen wies eine signifikant erhöhte IL-6 Expression gegenüber nicht-infizierten, IFN-γ stimulierten Zellen auf. Die induzierte IL-6 Expression war in nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen sowie in C. pneumoniae infizierten, IFN-γ behandelten Zellen unter Normoxie stärker als unter Hypoxie (n=3, *p≤0,05, **p≤0,005, ***p≤0,001).
5.4 Einfluss von C. pneumoniae auf Differenzierungs-prozesse von Epithelzellen
Umbauprozesse (Remodeling) von Epithelzellen sind charakteristisch für das
Fortschreiten von chronischen Atemwegserkrankungen wie der COPD. Ob eine
C. pneumoniae Infektion zu einem Umbau von Lungenepithelzellen (A549) führte,
sollte im folgenden Abschnitt untersucht werden. Anhand der Expression von
E-Cadherin und α-SMA sowie der Beweglichkeit von Epithelzellen, kann ein
Umbauprozess charakterisiert werden.
5.4.1 Einfluss von C. pneumoniae auf E-Cadherin
Um den Effekt einer C. pneumoniae-Infektion auf das Remodeling von
Lungenepithelzellen zu untersuchen, wurden A549 Zellen mit C. pneumoniae
infiziert, sowie mit IFN-γ behandelt und unter Normoxie oder Hypoxie inkubiert.
Mittels Western Blot Analysen wurde E-Cadherin untersucht. E-Cadherin ist
hauptsächlich in Epithelzellen nachzuweisen und wird beim Zellumbau vermindert
exprimiert. C. pneumoniae infizierte Zellen (48 hpi) wiesen im Vergleich zu
nicht-infizierten Zellen eine signifikant verminderte Proteinexpression von
Ergebnisse 67
E-Cadherin auf (Abbildung 5.16 A und B). Dieser Abbau war unabhängig davon, ob
eine akute oder persistente C. pneumoniae-Infektion vorlag sowie unabhängig von
der Sauerstoffkonzentration.
Abbildung 5.16: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (48 hpi). Die Western Blot Analyse (A) und deren densitometrische Auswertung (B) ergaben, dass eine C. pneumoniae-Infektion, unabhängig der IFN-γ Stimulation oder Sauerstoffkonzentration, zu einem Abbau von E-Cadherin führten (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).
Eine signifikant reduzierte Proteinexpression von E-Cadherin war unter Hypoxie
gegenüber Normoxie in C. pneumoniae infizierten Zellen ohne IFN-γ Stimulation
96 hpi zu detektieren (Abbildung 5.17). Interessanterweise war auch in den
nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen unter Normoxie eine geringere
Expression von E-Cadherin zu verzeichnen. Diese Reduktion war bei einer
persistenten Infektion stärker ausgeprägt. Die alleinige Zugabe von IFN-γ zu
hypoxischen Zellen hatte wiederum keinen Einfluss auf die E-Cadherin Expression.
Ergebnisse 68
Abbildung 5.17: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (96 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B) zeigten eine reduzierte E-Cadherin Expression in C. pneumoniae infizierten Zellen unter Hypoxie. Unter Normoxie führte IFN-γ (10 U/ml) zu einem Abbau von E-Cadherin, wobei der Abbau bei zusätzlicher C. pneumoniae-Infektion verstärkt war (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).
5.4.2 Einfluss von C. pneumoniae auf α-smooth muscle actin (α-SMA)
Eine Expression von α-SMA ist in Zellen mit mesenchymalem Phänotyp zu finden,
tritt jedoch nur schwach in Epithelzellen auf. α-SMA wurde mittels
Fluoreszenzfärbung nachgewiesen und dessen Intensität wurde ausgewertet. Die
Fluoreszenz von infizierten Zellen unter Normoxie war stärker als von
nicht-infizierten Zellen (Abbildung 5.18 A und B). Dabei machte es keinen
Unterschied ob eine akute oder persistente C. pneumoniae-Infektion vorlag. Unter
Hypoxie war die Fluoreszenzintensität der α-SMA Expression in infizierten Zellen
ohne IFN-γ Behandlung verglichen mit einer normoxischen Infektion weiter erhöht.
Ergebnisse 69
Abbildung 5.18: Fluoreszenzfärbung von α-SMA in A549 Zellen (72 hpi). (A) α-SMA (rot) und C. pneumoniae Einschlusskörper (grün) wurden mittels Fluoreszenzfärbung in A549 Zellen detektiert. (B) Die Intensitätsauswertung der Fluoreszenz zeigte, dass α-SMA in infizierten Zellen unter Normoxie, unabhängig von IFN-γ, erhöht war. Ein signifikanter Anstieg der α-SMA Fluoreszenzintensität war in C. pneumoniae infizierten Zellen ohne IFN-γ Stimulation unter Hypoxie gegenüber Normoxie zu verzeichnen (n=3, *p≤0,05, **p≤0,005).
Ergebnisse 70
5.4.3 Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten Zellen
Ein Charakteristikum von Zellen mit mesenchymalen Phänotyp ist eine erhöhte
Beweglichkeit. Um zu untersuchen, ob C. pneumoniae infizierte Zellen ebenfalls
stärker migrieren als nicht-infizierte Zellen, wurde deren Beweglichkeit mittels
Live-Cell Imaging analysiert (Abbildung 5.19). Dabei zeigte sich, dass unter
Normoxie zwischen 12-24 hpi infizierte Zellen eine 3,5-fache und zwischen
36-48 hpi eine 1,8-fache größere Distanz migrierten, als nicht-infizierte Zellen.
Abbildung 5.19: Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten A549 Zellen unter Normoxie. C. pneumoniae infizierte und nicht-infizierte Zellen wurden mittels Live-Cell Imaging aufgenommen und deren Beweglichkeit analysiert. Zwischen 12-24 hpi und 36-48 hpi migrierten infizierte Zellen eine größere Distanz als nicht-infizierte Zellen (n=3, ***p≤0,001).
5.4.4 TGF-β unabhängige C. pneumoniae vermittelte Remodelingprozesse
TGF-β (transforming growth factor-β) ist der am besten beschriebene Mediator des
Remodelings in Lungenepithelzellen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob
das durch C. pneumoniae induzierte Remodeling abhängig von diesem Zytokin ist.
Es zeigte sich, dass eine Inhibition der Signalübertragung von TGF-β durch den
Inhibitor SB-431542 keine Auswirkungen auf den Abbau von E-Cadherin durch eine
Infektion (48 hpi) hatte (Abbildung 5.20 A und B). Daher zeigten die
Bandenintensitäten der Western Blot Analysen, weder unter Normoxie noch unter
Hypoxie, einen Unterschied zwischen Inhibitor-behandelten und nicht-behandelten
Zellen.
Ergebnisse 71
Abbildung 5.20: Western Blot Analysen der Inhibition der TGF-β Signaltransduktion durch SB-431542 in C. pneumoniae infizierten A549 Zellen. Die Western Blot Analysen (A) und die densitometrische Auswertung (B) zeigten, dass weder unter Normoxie noch unter Hypoxie der Inhibitor SB-431542 (5 µM) einen Einfluss auf den Abbau von E-Cadherin durch C. pneumoniae (48 hpi) hatte (n=3).
5.4.5 Beteiligung von HIF-1 an C. pneumoniae vermittelten Remodelingprozessen
Da viele Funktionen der Zelle unter hypoxischen Bedingungen über den
Transkriptionsfaktor HIF-1 reguliert werden, wurde untersucht ob HIF-1 ebenfalls
bei dem ausgeprägtem Abbau von E-Cadherin in infizierten Zellen unter Hypoxie
eine Rolle spielt. Dazu wurde die Untereinheit HIF-1α mittels RNA-Interferenz unter
Hypoxie inhibiert und der Abbau von E-Cadherin untersucht. Der Erfolg der
Inhibition konnte im Western Blot dargestellt werden (Abbildung 5.21 A). Es zeigte
sich 48 hpi ein signifikanter Anstieg der E-Cadherin Expression durch die siRNA in
nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen (Abbildung 5.21 A und B). Die siRNA
hatte hingegen keinen Einfluss auf den Abbau von E-Cadherin in C. pneumoniae
infizierten Zellen.
Ergebnisse 72
Abbildung 5.21: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (48 hpi). (A) Die Western Blot Analysen zeigten, dass HIF-1α durch die siRNA herunterreguliert wurde. (B) Die densitometrische Auswertung von E-Cadherin ergab, dass Zellen mit einer Inhibition von HIF-1α eine unveränderte Expression von E-Cadherin gegenüber Zellen die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden aufwiesen. Nur in nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen konnte ein signifikanter Anstieg der Expression durch eine HIF-1α Inhibition detektiert werden (n=3, ***p≤0,001).
Auch 96 hpi konnte HIF-1α mittels siRNA signifikant inhibiert werden
(Abbildung 5.22 A). RNA-Interferenz von HIF-1α führte, im Vergleich zu den
Zellen die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden, in allen Konditionen zu einer
erniedrigten Expression von E-Cadherin (Abbildung 5.22 A und B). Nur in
C. pneumoniae infizierten Zellen war die Reduktion von E-Cadherin durch die
siRNA nicht signifikant.
Ergebnisse 73
Abbildung 5.22: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (96 hpi). (A) Die Western Blot Analysen zeigte, dass HIF-1α durch die siRNA herunterreguliert wurde. (B) Die densitometrische Auswertung von E-Cadherin zeigte, dass eine signifikant reduzierte Expression von E-Cadherin in Zellen die mit der siRNA gegen HIF-1α behandelt wurden vorlag. Nur C. pneumoniae infizierte Zellen ohne IFN-γ Stimulation zeigten keinen signifikanten Unterschied (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).
Da zuvor beschrieben wurde, dass CPAF in der späten Phase der Infektion HIF-1α
degradiert, wurde die Expression von CPAF in infizierten Zellen (48 hpi) unter
Normoxie und Hypoxie analysiert. Die Expression von CPAF war hoch in infizierten
Zellen unter Hypoxie, die mit oder ohne IFN-γ stimuliert wurden. Dagegen konnte
keine Expression von CPAF in infizierten Zellen unter Normoxie detektiert werden
(Abbildung 5.23).
Ergebnisse 74
Abbildung 5.23: Western Blot Analysen von CPAF in C. pneumoniae infizierten A549 Zellen (48 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B) zeigten, dass nur in infizierten Zellen unter Hypoxie und nicht unter Normoxie CPAF nachzuweisen war (n=4, ***p≤0,001).
Ergebnisse 75
5.5 Etablierung von Transkriptom-Analysen Um einen besseren Einblick in die transkriptionelle Regulation von C. pneumoniae
unter Normoxie und Hypoxie zu bekommen, sollten Transkriptom Analysen mittels
RNA-Sequenzierung etabliert werden. Zum Vergleich auf welche Weise das
chlamydiale Transkriptom am besten dargestellt werden kann, wurden zwei
verschiedene Aufreinigungs-Methoden analysiert. Die Auswertung der BioAnalyzer
Daten zeigte, dass die Abreicherung der humanen rRNA bei der Aufreinigung 2
effizienter war, als in der Aufreinigung 1 (Daten nicht dargestellt). Bei der
Aufreinigung 2 entfielen noch 6,5% der RNA in der Probe auf die 28S rRNA und
0,2% auf die 18S rRNA, wohingegen noch 26,3% auf die 28S rRNA und 1,1% auf
die 18S rRNA bei der Aufreinigung 1 zurückfielen.
Die RNA wurde in 3 Ansätzen parallel sequenziert. Um eine höhere Anzahl an
Sequenzen für die folgenden Auswertungen zu erhalten, wurden die
3 Sequenzierungen zusammen analysiert. Es zeigte sich eine 5x höhere Ausbeute an
Reads (vom Sequenzierer gemessene kleine Sequenzstücke) bei der Aufreinigung 2
verglichen zu der Aufreinigung 1 (8.425.321 vs. 44.702.024) (Abbildung 5.24). Die
Reads wurden mit dem chlamydialen und humanen Genom abgeglichen. Nur 5% der
Sequenzen von Aufreinigung 1 konnten auf das chlamydiale Genom zugeordnet
werden, wohingegen 8% von der Aufreinigung 2 zugeordnet werden konnten. Bei
beiden Methoden ging jedoch der größte Teil der Sequenzen auf das humane Genom
zurück. Zudem konnte ein Teil der Sequenzen auf keines der beiden Genome
zugeordnet werden. Um auszuschließen, dass es sich bei diesen Sequenzen um
Kontaminationen, z.B. durch eine Mykoplasmen-Infektion der Zellkultur handelt,
wurden die Sequenzen mit den Genomen von Mycoplasma genitalium sowie
Mycoplasma hominis verglichen. Die Sequenzen konnten jedoch nicht zu einem der
Referenzgenome zugeordnet werden (Daten nicht dargestellt).
Ergebnisse 76
Abbildung 5.24: Zuordnung der Sequenzen auf das humane und chlamydiale Genom. Bei der Sequenzierung der Aufreinigung 1 (A) konnten 5% der Reads auf das chlamydiale Genom abgebildet werden und bei der Aufreinigung 2 (B) 8%. Die Reads wurden von 3 Sequenzierungen addiert.
Ergebnisse 77
Folgend wurde die Abdeckung des chlamydialen Genoms genauer betrachtet. Es
wurde analysiert wie häufig Gene eine bestimmte Abdeckung an Sequenzen
aufwiesen (Abbildung 5.25). In der Aufreinigung 1 wies der Großteil der Gene eine
Abdeckung < 10 auf. Höhere Abdeckungen (bis zu 120) fanden sich nur noch
vereinzelt wieder. Dahingegen zeigte die Aufreinigung 2, dass die meisten Gene eine
Abdeckung von ca. 50 aufwiesen. Bei einzelnen Genen konnte eine Abdeckung bis
zu 250 nachgewiesen werden.
Abbildung 5.25: Häufigkeit der Sequenz-Abdeckung pro Gen. In der Aufreinigung 1 (A) zeigten viele Gene eine geringe Sequenzabdeckung, wohingegen bei der Aufreinigung 2 (B) die Gene im Durchschnitt eine Abdeckung von ca. 50 aufwiesen.
Bei weiteren Analysen sollte näher charakterisiert werden, ob die Aufreinigung 1
und 2 einen Einfluss auf das Expressionsprofil der mRNA hatte. Dafür wurde mittels
einer quantitativen RT-PCR die Expression verschiedenster chlamydialer Gene in
den Aufreinigungen mit der Expression in cDNA von total-RNA verglichen
(Abbildung 5.26). Die Mehrzahl der Gene in der Aufreinigung 2 war, verglichen zu
der total-RNA, erhöht. Dahingegen wiesen die Expressionen der meisten Gene der
Aufreinigung 1 eine ähnliche Expression auf wie die total-RNA.
Ergebnisse 78
Abbildung 5.26: Vergleich der mRNA Expression von chlamydialen Genen zwischen verschiedenen RNA-Aufreinigungen. Die Genexpressionen (24 hpi) der Aufreinigung 1 und Aufreinigung 2 wurden mit der Genexpression von total-RNA verglichen. Die Aufreinigung 1 ähnelte der Genexpression der total-RNA, wohingegen die Aufreinigung 2 erhöhte Expressionen aufwies (n=1).
Ergebnisse 79
5.6 Etablierung von Metabolom-Analysen Um weitere Einsichten zu dem erhöhten Wachstum sowie der aufgehobenen
Persistenzinduktion unter Hypoxie zu erhalten, wurde eine Metabolom-Analyse in
Kooperation mit Constanze Müller aus der AG Schmitt-Kopplin, Abteilung
Analytische BioGeoChemie des Helmholtz Zentrums München, durchgeführt. Dazu
wurden HEp-2 Zellen mit und ohne C. pneumoniae-Infektion sowie mit und ohne
IFN-γ Stimulation unter Normoxie und Hypoxie analysiert.
5.6.1 Hauptkomponentenanalyse
Um einen ersten visuellen Überblick über die Proben-Separation zu erhalten, wurde
eine Hauptkomponentenanalyse der Massen, gemessen bei positiver Polarität im
FT/ICR-MS, durchgeführt. Zur besseren Darstellung wurden die normoxischen von
den hypoxischen Konditionen getrennt analysiert. Unter Normoxie zeigte sich, dass
die 10 Replikate einer Kondition jeweils eine Gruppe bildeten (Abbildung 5.27 A).
Dabei unterschieden sich die Replikate der akut infizierten Zellen sowie der IFN-γ
behandelten Zellen unter Normoxie von den beiden anderen Konditionen. Lediglich
die Replikate der nicht-infizierten Zellen überschnitten sich mit denen der
persistenten Infektion. Unter Hypoxie bildeten die 10 Replikate einer Kondition
ebenfalls jeweils eine Gruppe, wobei die verschiedenen Konditionen eindeutig
voneinander separiert werden konnten (Abbildung 5.27 B).
Ergebnisse 80
Abbildung 5.27: Hauptkomponentenanalyse des Datensets. Jeweils ein Punkt stellt eine Probe dar. 10 Replikate pro Kondition wurden unter Normoxie (A) und Hypoxie (B) analysiert. Dabei zeigte sich unter Normoxie und Hypoxie, dass die Replikate einer Kondition jeweils eine Gruppe bildeten. Unter Normoxie waren die IFN-γ stimulierten, nicht-infizierten und C. pneumoniae infizierten Zellen getrennt voneinander darzustellen, wohingegen die nicht-infizierten und C. pneumoniae infizierten Zellen nicht voneinander separierten. Unter Hypoxie separierten die Konditionen voneinander (n=10).
Ergebnisse 81
5.6.2 Unterschiede der Metabolite in infizierten Zellen unter Normoxie und Hypoxie
Die für die Infektion relevanten Metabolite, welche sich bei einer Infektion unter
Normoxie und Hypoxie unterschieden, wurden annotiert und in die Datenbank
KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) geladen, um eine Übersicht der
veränderten Stoffwechselwegen zu erhalten. In C. pneumoniae infizierten Zellen
ohne IFN-γ Behandlung waren in allen Stoffwechselwegen Metabolite zu
detektieren, die unter Normoxie höher waren als unter Hypoxie. Ebenfalls waren
Metabolite in einigen Stoffwechselwegen zu detektieren die signifikant höher unter
Hypoxie als unter Normoxie waren. Diese fanden sich vor allem im
Lipid-Metabolismus wieder. Während einer Infektion unter Normoxie mit IFN-γ
Stimulation wurden ebenfalls in allen Stoffwechselwegen Metabolite mit erhöhter
Konzentration zu Hypoxie gefunden. Dahingegen waren nur 3 Metabolite, die zum
Aminosäure-Metabolismus gehörten, unter Hypoxie erhöht.
Tabelle 5.1: Übersicht über die Veränderung der Stoffwechselwege der Infektion relevanter Metabolite. Analysiert wurde wie viele Metabolite in dem jeweiligen Stoffwechselweg erhöht in der entsprechenden Kondition vorlagen.
Cpn Cpn + IFN-γ
Metabolismus von 20% O2 > 2% O2
20% O2 < 2% O2
20% O2 > 2% O2
20% O2 < 2% O2
Kohlenhydraten 8 3 80 -
Energie 5 - 2 -
Lipiden 6 30 47 -
Aminosäuren 11 7 2 3
Nukleotiden 8 1 6 -
Glykanen 2 - 5 -
Kofaktoren + Vitaminen 8 5 7 -
Ergebnisse 82
Zur Validierung dieser Methode sollte Tryptophan herangezogen werden.
Tryptophan wird von IFN-γ induziertem IDO abgebaut und trägt damit zur
Persistenzinduktion von C. pneumoniae bei. In ersten Analysen zeigte sich eine
verminderte Expression von IDO unter Hypoxie (Abschnitt 5.2.2), weshalb die
Vermutung vorlag, dass Tryptophan unter Hypoxie in höherer Konzentration
vorliegen müsste. Tatsächlich konnte Tryptophan in dieser Metabolom-Analyse als
ein für die Infektion relevantes Metabolit in IFN-γ behandelten Zellen detektiert
werden. Die Massenintensität von Tryptophan war unter Hypoxie höher als unter
Normoxie. Daher wurde die Massenintensität von Tryptophan über das gesamte
Datenset analysiert (Abbildung 5.28). Es zeigte sich ein Abbau von Tryptophan in
IFN-γ behandelten Zellen. Jedoch war der Abbau signifikant stärker unter Normoxie
als unter Hypoxie. Zudem konnte auch in C. pneumoniae infizierten Zellen ein
geringerer Abbau detektiert werden.
Abbildung 5.28: Massenintensität von Tryptophan in IFN-γ behandelten HEp-2 Zellen. Tryptophan wurde mittels FT/ICR-MS detektiert und dessen Massenintensität dargestellt. Tryptophan wurde verstärkt unter Normoxie in IFN-γ (10 U/ml) behandelten Zellen abgebaut und weniger unter Hypoxie (n=10, * p≤0,05, **p≤0,005, ***p≤0,001).
Diskussion 83
6 Diskussion
6.1 Hypoxie verhindert die Persistenzinduktion von C. pneumoniae
COPD ist eine chronische Erkrankung der Lunge, die sich in unterschiedlichen
Stadien mit dem Bild einer chronischen Bronchitis oder eines Lungenemphysems
manifestieren kann. Ursächlich hierfür wird ein chronisch-rezidivierender
Entzündungsprozess angenommen. Das vorherrschende Zytokinprofil in der Lunge
von COPD-Patienten ist das einer Th1-vermittelten Immunantwort, mit IFN-γ als
Hauptakteur [55]. In der Lunge wird IFN-γ zur Abwehr von einer Reihe bakterieller
und viraler Infektionen benötigt [107]. Dazu zählen auch Infektionen mit
C. pneumoniae. Jedoch führt eine niedrige IFN-γ Konzentration nicht zum Absterben
von C. pneumoniae, sondern löst die Persistenz aus [9]. In einer Studie von
Knobloch et al. wiesen gerade Th-1 Lymphozyten von Rauchern mit einer COPD
eine verminderte Immunantwort und damit eine reduzierte Sekretion von IFN-γ
gegen Gram-negative Bakterien auf [60]. Eine unzureichende IFN-γ Konzentration
in Patienten mit COPD könnte demnach die Persistenzinduktion von C. pneumoniae
begünstigen. Ein wesentliches Charakteristikum in der Pathophysiologie der COPD
ist die emphysematöse Lungenschädigungen und Verdickung der Atemwegswände
der kleinen Bronchien. Dadurch wird die elastische Rückstellkraft der Lunge von
COPD Patienten reduziert, welche zur Ausatmung benötigt wird. Als Folge sinkt die
Sauerstoffverfügbarkeit der Lunge durch Lufteinschlüsse (trapped air) [47;48;77].
Weiterhin können Entzündungsprozesse durch den Einstrom von Entzündungszellen
zu einer verminderten Sauerstoffverfügbarkeit im Gewebe beitragen [14]. Bisher ist
bekannt, dass niedrige Sauerstoffkonzentrationen einen positiven Einfluss auf das
Wachstum von C. pneumoniae ausüben. So liegt eine höhere Infektionsrate und ein
besseres Wachstum von C. pneumoniae bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen vor
[56]. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Stabilisierung von HIF-1α, dem zentralen
Regulator zur Aufrechterhaltung der Homöostase unter Hypoxie [97]. Unklar war
bislang, ob die umgebende Sauerstoffkonzentration auch einen Einfluss auf die
IFN-γ vermittelte Persistenz von C. pneumoniae hat. Es konnte in der vorliegenden
Arbeit gezeigt werden, dass Hypoxie die IFN-γ induzierte Persistenz von
C. pneumoniae verhindert. Dabei entsprach die Morphologie der Inklusion und die
Wiederanzuchtsrate von C. pneumoniae mit IFN-γ Behandlung den Kontrollen ohne
Diskussion 84
IFN-γ unter Normoxie. Die durch IFN-γ induzierte Immunantwort ist demzufolge bei
niedrigen Sauerstoffverhältnissen nicht ausreichend, um das intrazelluläre Wachstum
von C. pneumoniae in Epithelzellen zu unterdrücken. Eine reduzierte IFN-γ Aktivität
durch eine verminderte Sauerstoffverfügbarkeit in der Lunge könnte auch für andere
respiratorische Erreger eine Rolle spielen. So wurde in der Studie von Aberle et al.
eine geringe IFN-γ Konzentration mit dem Schweregrad einer Respiratorischen
Synzytial-Virus-Infektion (RSV) assoziiert. RSV-Infektionen sind ursächlich für
akute Atemwegserkrankungen, die vor allem bei Säuglingen zur Entwicklung von
unteren Atemwegserkrankungen (z.B. Bronchitis) führen können. Kinder mit einer
niedrigen IFN-γ Konzentration im Blut wiesen einen schwereren Verlauf der
Infektion auf, als Kindern mit einer höheren IFN-γ Konzentration [1]. Zudem wurde
gezeigt, dass die Replikation und Knospung von RSV von der Aktivität der
PKCδ/HIF-1α/NF-κB Signalkaskade abhängig ist [71]. Dadurch könnte eine
RSV-Infektion unter Hypoxie begünstigt werden. Hypoxie scheint darüber hinaus
eine Vielzahl von Bakterien und Viren hinsichtlich der Pathogenität und des
Wachstumsverhalten zu beeinflussen [25]. So wies z.B. Pseudomonas aeruginosa
unter Hypoxie eine erhöhte Biofilmproduktion auf; Herpes simplex Viren zeigten ein
gesteigertes Wachstum und das Humane Herpesvirus-8 ging von einer latenten in
eine lytische Infektion über [2;21;25;122].
In dieser Arbeit zeigte sich, dass schon Sauerstoffkonzentrationen ≥ 3%
ausreichten, um die Persistenz von C. pneumoniae durch IFN-γ zu induzieren. Bei
einem Anstieg der Sauerstoffkonzentration von 2% auf 3% gab es einen starken
Abfall der Größe der Einschlusskörper und Wiederanzuchtsrate. Dies könnte
bedeuten, dass C. pneumoniae im Peribronchialgewebe, in dem
Sauerstoffkonzentrationen von ca. 4-6% vorherrschen [46;64], persistieren und erst
im Rahmen von entzündlichen Prozessen die mit einem Absinken der
Sauerstoffkonzentration einhergehen erneut replizieren.
Im Falle einer unzureichenden Immunantwort des Wirts unterliegen persistente
Chlamydien Reaktivierungen. In vitro geschieht die Reaktivierung durch Aufhebung
des Persistenzstimulus. In vivo sind hingegen Faktoren welche die Reaktivierung
begünstigen, bislang nicht beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass
eine Reduktion der Sauerstoffverfügbarkeit dazu führte, dass persistente
C. pneumoniae wieder in den replikativen Entwicklungszyklus eintreten. Es ist
anzunehmen, dass unter pathophysiologischen Bedingungen in der Lunge, bei denen
Diskussion 85
die Sauerstoffverfügbarkeit abnimmt eine C. pneumoniae-Infektion reaktiviert,
benachbarte Zellen infiziert und der Entzündungsprozess aufrecht erhalten wird.
6.2 Hypoxie reduziert die Aktivität der Jak-STAT Signalkaskade
Ausschlaggebend bei der IFN-γ induzierten Persistenz von C. pneumoniae ist der
Tryptophanabbau durch IDO [86]. IDO ist das erste Enzym des Kynurenin-
Stoffwechselwegs und spaltet oxidativ den Indolring des Tryptophans, wodurch
N-Formylkynurenin entsteht. Die Induktion von IDO erfolgt über die IFN-γ
induzierte Jak-STAT Signalkaskade [79]. Nach Bindung von IFN-γ an den Rezeptor
findet eine Aktivierung von STAT1 durch Phosphorylierung des Tyrosins 701 und
Serin 727 statt [118]. Beide Phosphorylierungen werden für die maximale Aktivität
von STAT1 benötigt [118]. In der vorliegenden Arbeit war die IFN-γ induzierte
Phosphorylierung am Serin 727 (4 hpi) in infizierten Zellen unter Normoxie und
Hypoxie unverändert. Dahingegen war die durch IFN-γ induzierte Phosphorylierung
am Tyrosin 701 unter Normoxie in C. pneumoniae infizierten Zellen (4 hpi) höher
als in nicht-infizierten Zellen. Da eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung vorlag, ist
anzunehmen, dass C. pneumoniae infizierte Epithelzellen unter Normoxie während
der frühen Phase der Infektion eine erhöhte STAT1 Aktivität aufweisen und damit
die IFN-γ aktivierte antimikrobielle Antwort verstärken. Damit werden die Befunde
von Lad et al. gestützt, in denen eine Chlamydien-Infektion ebenfalls zu einer
verstärkten Aktivität einiger Mediatoren der Jak-STAT Signalkaskade führte [62].
Erstaunlicherweise wurde die erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung in C. pneumoniae
infizierten Zellen durch hypoxische Bedingungen aufgehoben. Daher ist
anzunehmen, dass die STAT1 Aktivität in infizierten Zellen unter Hypoxie
schwächer ist als unter Normoxie. Diese Vermutung spiegelte sich ebenfalls in der
Expression von IFN-γ regulierten Genen wieder (IDO, IP-10, SOCS1, SOCS3), die
unter Hypoxie signifikant reduziert vorlagen. Dies lässt darauf schließen, dass die
gesamte IFN-γ induzierte Jak-STAT Signalkaskade in der frühen Phase der Infektion
unter Hypoxie eine verminderte Aktivität aufwies. Bei der Expression von IDO
zeigte sich, dass diese nicht nur in infizierten Zellen sondern auch in nicht-infizierten
Zellen unter hypoxischen Bedingungen herunterreguliert war. Roth et al. zeigten
zusätzlich eine verminderte Enzymaktivität von IDO bei geringer
Sauerstoffverfügbarkeit [96]. Eine geringe IDO Expression in hypoxischen Zellen
Diskussion 86
lässt auf eine höhere Konzentration an Tryptophan schließen. Da ein
Tryptophanentzug das Wachstum von C. pneumoniae einschränkt und die Persistenz
induziert [86], ist eine erhöhte Tryptophankonzentration unter Hypoxie eine
mögliche Erklärung, weshalb C. pneumoniae in Hypoxie nicht persistiert. Auch
andere Pathogene werden von einem Tryptophanabbau durch IFN-γ induziertes IDO
beeinflusst. Dazu zählen Toxoplasmen, Streptokokken, Enterokokken und
Staphylokokken [68;69;90;102]. Diese Erreger könnten folglich ebenfalls von einer
geringen Sauerstoffverfügbarkeit profitieren. Untersuchungen von Ivanov et al. zum
Einfluss von Hypoxie auf die STAT1-Expression zeigten, dass die Expression von
STAT1 unter hypoxischen Bedingungen in einem HIF-1 abhängigem Prozess
erniedrigt war [53]. HIF-1α wird bei ausreichender Sauerstoffverfügbarkeit durch
VHL abgebaut, bleibt jedoch stabil unter Hypoxie und induziert als
Transkriptionsfaktor u.a. Gene der Glykolyse, Angiogenese und des Zellüberlebens
[103]. Durch hypoxische HIF-1α Stabilisierung oder in VHL-defizienten Zellen
zeigte sich eine erhöhte STRA13 (stimulated with retinoic acid 13) Expression,
einem Transkriptionsfaktor der bHLH Familie (basic helix-loop-helix). Dieser weist
eine Hemmungsaktivität gegenüber STAT1 auf. Eine negative Wirkung von HIF-1
auf die Phosphorylierung von STAT1 am Tyrosin 701 konnte in VHL-defizienten
Zellen jedoch nicht nachgewiesen werden [53]. Daher ist anzunehmen, dass die hier
gezeigte Reduzierung der Tyrosin-Phosphorylierung durch Hypoxie nicht durch
HIF-1 bedingt war.
Die Signaltransduktion der Jak-STAT Signalkaskade wird über IFN-γ induzierte
SOCS-Proteine reguliert [5]. SOCS-Proteine können mit ihrer SH-2 Domäne
Tyrosin-Phosphorylierungen binden, die am IFNGR oder am Jak-Protein zu finden
sind. Dadurch inhibieren sie die Aktivität der Jaks, konkurrieren um diese
Bindestelle mit STAT1 oder markieren die gebundenen Signalmoleküle zur
Degradation durch das Proteasom [123]. In der Forschungsarbeit von Yang et al.
wurde bei einer C. pneumoniae-Infektion von Mäusen eine erhöhte SOCS1 und
SOCS3 Expression im Lungengewebe nachgewiesen, wodurch eine unkontrollierte
IFN-γ Signalwirkung verhindert wurde. SOCS1-defiziente Mäuse wiesen zwar eine
niedrigere Bakterienlast von C. pneumoniae auf, die mit einer erhöhten IDO
Expression in der Lunge einherging, jedoch starben diese Mäuse auf Grund von
schwerer Lungenentzündung [125]. Der in der vorliegenden Arbeit beschriebene
Effekt der reduzierten IDO Expression unter Hypoxie scheint jedoch SOCS
Diskussion 87
unabhängig zu sein, da nach Stimulation mit IFN-γ unter Hypoxie SOCS1 und
SOCS3 ebenfalls erniedrigt in infizierten Zellen vorlagen.
IDO trägt ein GAS-Element in seiner Promotorregion, wodurch es über die
Jak-STAT Signalkaskade induziert wird [18]. Jedoch waren nicht nur über das GAS-
Element aktivierte IFN-γ regulierte Gene unter Hypoxie vermindert exprimiert, auch
IP-10, welches über eine ISRE-Sequenz aktiviert wird [81], zeigte eine verminderte
Expression unter Hypoxie (4 hpi). Da u.a. Typ I Interferone die Transkription von
Genen mit einer ISRE-Sequenz induzieren, wäre es möglich, dass auch Typ I
Interferone eine geringere Wirkung unter Hypoxie aufweisen. Die reduzierte
Expression des Chemokins IP-10 unter Hypoxie könnte zudem Auswirkungen auf
die Th1 Lymphozyten Rekrutierung haben, da dieses Chemokin über den
C-X-C Chemokinrezeptor Typ 3 (CXCR3) zur Rekrutierung von Th1 Immunzellen
führt [13].
Im Gegensatz zu der frühen Phase der Infektion (4 hpi) lag in den späteren
Phasen (24 hpi und 48 hpi) kein signifikanter Unterschied zwischen Normoxie und
Hypoxie in der IFN-γ induzierten Phosphorylierung des Tyrosins 701 sowie
Serins 727 am STAT1 in infizierten Zellen vor. In nicht-infizierten Zellen 48 hpi lag
hingegen eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung am STAT1 unter Hypoxie
verglichen zu Normoxie vor. Gleichzeitig mit der gesteigerten
Tyrosin-Phosphorylierung am STAT1 unter Hypoxie, war auch die Genexpression
von IP-10 und IDO in nicht-infizierten Zellen sowie C. pneumoniae infizierten
Zellen unter Hypoxie gesteigert. Vermutlich lag eine kompensatorische
Hochregulation der Jak-STAT Signalkaskade zu späten Zeitpunkten der Infektion
unter Hypoxie vor. Erstaunlicherweise zeigte die IDO Proteinexpression keine
Veränderung und verblieb unter Hypoxie, im Vergleich zu Normoxie, erniedrigt. Ein
geringer Proteingehalt von IDO unter Hypoxie könnte zum einen Folge einer
erhöhten Degradation des Proteins oder zum anderen einer länger dauernden
post-trankriptionellen Modifizierungen von IDO unter Hypoxie sein. Bisher ist
jedoch über Modifizierungen, die zur Feinabstimmung der IDO Expression beitragen
wenig bekannt. Huck et al. zeigten, dass Stickstoffmonoxid (NO), gebildet durch die
induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) in Epithelzellen, eine Degradation
von IDO über das Proteasom begünstigt [49]. Jedoch konnte eine Beteiligung von
NO an der reduzierten IDO Expression unter Hypoxie von Roth et al. ausgeschlossen
werden, da sich die iNOS Expression unter Hypoxie nicht veränderte [96].
Diskussion 88
6.3 Entzündungsvorgänge in persistent infizierten Zellen Der fortschreitende Lungengerüstumbau bei COPD-Patienten ist gekennzeichnet
durch chronisch-rezidivierende Entzündungsvorgänge sowie Umbauprozesse. So
konnte im Serum von COPD-Patienten eine erhöhte IL-6 Konzentration
nachgewiesen werden [28]. Dieser Entzündungsmarker konnte in einer mehrjährigen
Studie in Zusammenhang mit einem reduzierten FEV1 gebracht werden, an dem das
Fortschreiten einer COPD gemessen werden kann. Ein schneller Anstieg der IL-6
Sputumkonzentration wurde in Patienten mit hohen Exazerbationsraten und dadurch
bedingtem reduzierten FEV1 nachgewiesen. Patienten mit stabiler Erkrankung
wiesen hingegen einen langsameren Anstieg der IL-6 Konzentration auf [26]. Ein
Anstieg der IL-6 Expression konnte auch in vitro durch eine C. pneumoniae-
Infektion gezeigt werden [29]. In der Regulation der IL-6 Expression ist NF-κB ein
wichtiger Regulator [65]. Jedoch war der Nachweis einer C. pneumoniae-Infektion in
Lungengewebe von Patienten mit einer stabilen COPD Erkrankung (GOLD I-III)
nicht mit einer erhöhten Expression von proinflammatorischen Zytokinen und einer
Aktivierung des NF-κB Signalwegs verbunden [27]. Aus in vitro Versuchen ist
zudem bekannt, dass bei langanhaltender, persistenter C. pneumoniae-Infektion, wie
sie mutmaßlich bei der COPD vorliegt, keine Wirtszell-Antwort, gemessen an der
Sekretion von z.B. IL-8 und IL-11 auftritt [89].
In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine C. pneumoniae induzierte
IL-6 Expression durch Hypoxie beeinflusst wird. Zudem wurde der Einfluss einer
persistenten und reaktivierten Infektion durch Hypoxie auf die IL-6 Expression
analysiert. Im humanen Lungengewebs-Modell induzierte eine akute
C. pneumoniae-Infektion die Expression von IL-6. Dabei hatte der Sauerstoffgehalt
keinen Einfluss auf die Expression von IL-6. Daneben führte auch eine persistente
C. pneumoniae-Infektion zu einer vermehrten IL-6 Expression in
Lungenepithelzellen. Damit werden die Befunde von Baltch et al. gestützt, in denen
keine aktive C. pneumoniae-Infektion notwendig war, um die IL-6 Expression zu
stimulieren [7]. Interessanterweise führte eine durch Hypoxie reaktivierte
C. pneumoniae-Infektion zwar zu einer IL-6 Expression, doch war diese vermindert
im Gegensatz zu einer persistenten Infektion. Eine in der Lunge erhöhte IL-6
Expression wurde von Pedroza et al. mit der Entstehung der pulmonalen Fibrose in
Zusammenhang gebracht [87].
Diskussion 89
IL-6 weist in seiner Promotorregion eine IRF-1 Bindungsstelle auf [31].
Vermutlich konnte deshalb in der vorliegenden Arbeit ebenfalls eine erhöhte
Expression von IL-6 in IFN-γ behandelten Zellen detektiert werden. Neben IP-10,
welches ebenfalls eine IRF-1 Bindungsstelle aufweist, war auch die IFN-γ induzierte
Expression von IL-6 unter Hypoxie geringer als unter Normoxie. Dies ist ebenfalls
auf die verminderte IFN-γ Wirkung unter Hypoxie zurückzuführen.
6.4 C. pneumoniae vermittelt Umbauprozesse von Epithelzellen
Es existieren verschiedene Entstehungsmodelle wie eine C. pneumoniae-Infektion
chronische Erkrankungen fördert. So wurde angenommen, dass infizierte Epithel-
oder Endothelzellen Zytokine exprimieren, die zur Rekrutierung und Aktivierung
von Immunzellen führen (Abbildung 6.1). Diese sekretieren weitere Zytokine und
Wachstumsfaktoren, welche schließlich bei andauernder Ausschüttung zu
Umbauprozessen und Vernarbung des Gewebes führen [104]. Zudem konnte gezeigt
werden, dass eine C. pneumoniae-Infektion von Makrophagen, die von COPD
Patienten stammten, ein Ungleichgewicht von pro- und antiinflammatorischen
Zytokinen herbeiführte, welches für die Entstehung von Umbauprozessen
verantwortlich gemacht wurde [98].
Diskussion 90
Abbildung 6.1: Schematische Darstellung des Einfluss einer Chlamydien-Infektion auf Umbauprozesse von Gewebe. Durch eine Chlamydien-Infektion sekretieren Epithelzellen Zytokine, welche Immunzellen aktivieren. Eine chronische Ausschüttung von Zytokinen durch aktivierte Immunzellen führt zu Umbauprozessen und Vernarbung von Gewebe. Abbildung aus [104].
Ob eine C. pneumoniae-Infektion von Epithelzellen tatsächlich Einfluss auf zelluläre
Umbauprozesse hat, sollte anhand der Expression von E-Cadherin, α-SMA und der
Beweglichkeit von Epithelzellen untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass
eine C. pneumoniae-Infektion unter Normoxie und Hypoxie die Differenzierung von
Lungenepithelzellen induzierte, was gekennzeichnet war durch eine erniedrigte
E-Cadherin und eine erhöhte α-SMA Expression. E-Cadherin wird hauptsächlich in
Epithelzellen exprimiert, wo es mit Cateninen interagiert und Adhärenzverbindungen
bildet. Diese verbinden das Aktin zweier Zellen miteinander und bilden so eine
dichte, polarisierte Zellschicht, die Barriere- und Transport-Funktionen übernimmt
[37]. α-SMA ist ein Bestandteil von Stressfasern in Myofibroblasten und daher ein
sicherer Marker für die Differenzierung zu Myofibroblasten [23]. Ein Abbau von
Diskussion 91
E-Cadherin führt zum Verlust der Zell-Zell-Kontakte und durch die Expression von
α-SMA weisen die Zellen einen mesenchymalen Charakter auf. Weiterhin verändert
sich während eines Remodelingprozess die Zusammensetzung der extrazellulären
Matrix (z.B. Kollagen) [33]. Bereits Baumert et al. berichteten, dass eine
C. pneumoniae-Infektion von Fibroblasten und glatten Muskelzellen zu einer
Herunterregulation von Typ I/II Kollagen und Fibronektin führt [8]. Durch
verminderte Zellkontakte weisen Zellen mit mesenchymalem Charakter auch eine
erhöhte Migrationsaktivität auf. Eine erhöhte Beweglichkeit konnte mittels Live-Cell
Imaging bei infizierten Zellen unter Normoxie nachgewiesen werden und bestärken
damit den Befund des strukturellen Umbaus der Zelle durch eine
C. pneumoniae-Infektion.
Zuvor wurden niedrige Sauerstoffverhältnisse mit Umbauprozessen in
Lungenepithelzellen in Zusammenhang gebracht. Dabei zeigten Zhou et al., dass ab
dem achten Tag einer hypoxischen Inkubation Lungenepithelzellen einen
mesenchymalen Phänotyp aufwiesen [126]. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch
kein Umbau allein durch Hypoxie detektiert werden. Dennoch stehen diese
Ergebnisse nicht im Gegensatz zueinander, da in dieser Arbeit frühere Zeitpunkte
untersucht wurden.
Des Weiteren zeigte sich, dass ein andauernder Stimulus von IFN-γ auf
Epithelzellen in einer reduzierten E-Cadherin Expression resultierte. Dieser Effekt
konnte jedoch nur unter Normoxie dargestellt werden, da unter Hypoxie die Wirkung
von IFN-γ vermindert war. Schon zuvor wurde in einem Mausmodel gezeigt, dass
die Überexpression von IFN-γ zu Emphysembildung sowie zu einem
COPD-ähnlichen Phänotyp führte [115]. Umbauprozesse die durch IFN-γ induziert
werden, könnten auch in anderen Infektionen bei denen eine IFN-γ Reaktion
herbeigeführt wird eine Rolle spielen.
Um den Mechanismus des Umbauprozesses durch C. pneumoniae zu
charakterisieren, wurde die Rolle des am besten beschriebenen Mediators (TGF-β1)
des Remodelings in Lungenepithelzellen analysiert. Die Wirkung von TGF-β1
erfolgt über Bindung an die TGF-β Rezeptoren Typ I, woraufhin diese multimere
Rezeptormoleküle bilden. Die aktivierten Rezeptoren haben eine Serin/Threonin-
Kinaseaktivität und phosphorylieren Rezeptor-regulierte SMAD-Proteine
(small mother against decapentaplegic), welche im Zytosol einen Komplex mit
Co-SMAD bilden. Der Komplex wandert in den Zellkern und kooperiert mit
Diskussion 92
weiteren DNA-Bindungspartnern, um die Expression spezifischer Zielgene zu
aktivieren [66;72]. Für die Untersuchungen wurde ein Inhibitor (SB-431542)
eingesetzt, der spezifisch die TGF-β Rezeptoren Typ I, ALK4 (activin receptor-like
kinase), ALK5 und ALK7 inhibiert und dadurch die Signalübertragung durch
TGF-β1 blockiert. Die weiteren ALKs, die wichtig für die Signalübertragung anderer
Mitglieder der TGF-β Superfamilie sind, werden nicht durch SB-431542 inhibiert
[52]. Es zeigte sich, dass der durch eine C. pneumoniae-Infektion herbeigeführte
E-Cadherin Abbau nicht durch eine Inhibition der TGF-β1 Signaltransduktion
unterbunden werden konnte. Hier liegt somit ein TGF-β1 unabhängiges Ereignis vor.
Der Remodelingprozess in dieser Arbeit war während einer Infektion (96 hpi)
unter Hypoxie stärker ausgeprägt. Um zu analysieren, ob HIF-1 als zentraler
Regulator der Homöostase unter Hypoxie einen Einfluss auf die Umbauprozesse
hatte, wurden HIF-1α Inhibitions-Experimente durchgeführt. In der mittleren Phase
der Infektion (48 hpi) spielte HIF-1 keine Rolle bei den Umbauprozessen und so
zeigten Zellen, die durch RNA-Interferenz kein HIF-1α bildeten, keine Veränderung
in ihrem Expressionsprofil von E-Cadherin. Dahingegen kam HIF-1α zu späteren
Zeitpunkten (96 hpi) eine protektive Funktion zu. Es schützte vor einer
mesenchymalen Differenzierung, denn in Zellen mit HIF-1α Inhibition zeigte sich
eine Zunahme des E-Cadherin Abbaus. Allerdings wird HIF-1α in C. pneumoniae
infizierten Zellen in der mittleren und späten Phase des Entwicklungszyklus von
CPAF degradiert [97]. In infizierten Zellen unter Hypoxie wurde CPAF verstärkt
exprimiert. Der verstärkte Abbau von E-Cadherin in infizierten Zellen unter Hypoxie
könnte somit durch CPAF verursacht werden, welches direkt mit HIF-1α interagiert.
Dadurch könnte in infizierten Zellen unter Hypoxie HIF-1 verursachte
Reperaturmechanismen vermieden werden.
Diskussion 93
6.5 Weiterführende Analysen zu C. pneumoniae Infektionen unter Hypoxie
In dieser Arbeit stand die Analyse der IFN-γ induzierten Persistenz im Vordergrund.
Um jedoch ein umfassenderes Bild der Wirt-Pathogen Interaktion unter Normoxie
und Hypoxie zu bekommen, wurden weitergehende Analysen vorgenommen. Zuerst
sollte eine Transkriptom Analyse etabliert werden, um für zukünftige Projekte
Einblicke in die Unterschiede der transkriptionellen Regulation von C. pneumoniae
unter Normoxie und Hypoxie zu bekommen.
Durch die Entstehung von Sequenzierungen der zweiten Generation
(next generation sequencing), wie der RNA-Sequenzierung ist es möglich geworden,
die gesamten Transkripte einer Zelle (Transkriptom) während einer
Entwicklungsphase oder einer physiologischen Kondition zu bestimmen. So
bekommt man eine Momentaufnahme der Zelle [114]. Mit dieser quantitativen
Methode ist es möglich, die bakterielle Regulation und auch Interaktion mit dem
Wirt zu bewerten und zu beschreiben [32].
Der Anteil der mRNA einer Zelle geht auf 3-5% der total-RNA zurück. Deshalb
wird eine Anreicherung der kodierenden RNA empfohlen, um den Anteil der
Genabdeckung zu erhöhen [32]. Die Anreicherung von prokaryotischer mRNA ist im
Gegensatz zu eukaryotischer mRNA, bei der die polyA-Enden der mRNA zur
Separation genutzt werden können, jedoch schwierig. Eine weitere Limitierung bei
der Darstellung des Transkriptoms von C. pneumoniae ist die intrazelluläre
Lebensweise, wodurch die bakterielle RNA nur in Kombination mit humaner RNA
isoliert werden kann. Es gibt verschiedene Verfahren um die kodierenden RNAs
einer Probe anzureichern. Albrecht et al. nutzten für das Transkriptom von
C. trachomatis und C. pneumoniae ein Verfahren, um die 5‘-Enden der primären
Transkripte anzureichern. Dadurch konnten Transkriptionsstartpunkte analysiert
werden [3;4]. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur Reduktion des Gehalts an
rRNA sowie des humanen Hintergrundes angewendet und die Effizienzen
verglichen. Es zeigte sich, dass die Aufreinigung 2 eine höhere Abreicherung des
humanen Hintergrunds aufwies. Dadurch konnte eine höhere Anzahl an
chlamydialen Reads und eine höhere Genabdeckung erzielt werden. Dagegen war die
Abreicherung des humanen Hintergrunds bei der Aufreinigung 1 geringer, wodurch
weniger Reads und eine geringere Genabdeckung erreicht wurden. Die
Aufreinigung 2 zeigte, dass die meisten Gene eine Abdeckung von ca. 50 aufwiesen.
Diskussion 94
Dies stellte vermutlich den transkriptionellen Hintergrund dar. Dagegen wiesen in
der Aufreinigung 1 nicht alle Gene eine Abdeckung auf und vermutlich wurden nur
aktivierte Gene dargestellt. Durch eine höhere Anzahl an Sequenzierungen die pro
Probe durchgeführt werden, könnte die Anzahl an Sequenzen erhöht werden, so dass
die Aufreinigung 1 ebenfalls zur Darstellung des Transkriptoms geeignet wäre.
Deutliche Unterschiede zwischen den beiden Aufreinigungs-Methoden zeigten
sich bei dem Vergleich der Genexpression in der quantitativen RT-PCR verglichen
mit der total-RNA, die als Referenzexpression genutzt wurde. Die Aufreinigung 2
wies häufig ein abweichendes Expressionsprofil der analysierten Gene auf,
wohingegen die Aufreinigung 1 der total-RNA glich. Eine Erklärung dafür könnte
die Differentialzentrifugation sein, welche in der Aufreinigung 2 noch vor der
RNA-Isolation durchgeführt wurde. Aufgrund der starken Artefakte des
Transkriptoms durch die Differentialzentrifugation ist diese Aufreinigung nicht für
Transkriptom Analysen zu empfehlen. Zukünftig soll die Aufreinigung 1 genutzt
werden, um Veränderungen des chlamydialen Transkriptoms durch eine hypoxische
Inkubation zu analysieren.
Auch für das Metabolom der Zelle sollte eine Momentaufnahme von
verschiedenen Konditionen erstellt werden. Dazu wurde eine Methode durchgeführt,
die nicht zielgerichtet (non-targeted) auf eine Hypothese war und schon in
vorherigen Studien erfolgreich genutzt wurde, um z.B. den Einfluss von Metaboliten
der Darm-Mikrobiota auf die chronisch entzündliche Darmerkrankung Morbus
Crohn zu untersuchen [54]. Bei der Durchführung einer Hauptkomponentenanalyse
mit den erhaltenen Massen aus dem FT/ICR-MS zeigte sich eine Gruppierung der
Replikate und eine Separation der Konditionen voneinander. Dies bestätigte, dass
eine hohe Reproduzierbarkeit vorlag und sich die Metabolome der verschiedenen
Konditionen stark unterschieden. Nur die Gruppe der persistent infizierten Zellen
ließ sich nicht von den nicht-infizierten Zellen unter Normoxie trennen. Der Einfluss
von IFN-γ auf das Metabolom wurde demzufolge durch eine persistierende
C. pneumoniae-Infektion zum Teil aufgehoben und es glich einer nicht-infizierten
Zelle. Vermutlich werden daher persistente C. pneumoniae-Infektionen nicht richtig
vom Wirt erkannt. Die Massen, welche zu der Separation der Konditionen führten
und diskriminierend zwischen einer Infektion unter Normoxie und Hypoxie waren,
zeigten Veränderungen in einem breitem Spektrum von Signalwegen. Es waren
deutliche Unterschiede zwischen einer Infektion ohne IFN-γ in Normoxie und
Diskussion 95
Hypoxie sichtbar. Vor allem im Lipid- und Aminosäure-Metabolismus konnten viele
unterschiedlich regulierte Metabolite annotiert werden. Es ist bekannt, dass das
chlamydiale Genom einige Aminosäuretransporter kodiert, um Zwischenprodukte für
ihre unvollständigen Biosynthesewege zu erhalten [57;94;105]. Davon wird der
Aminosäure-Metabolismus in C. pneumoniae infizierten-Zellen vermutlich
beeinflusst. Zudem werden Wirtslipide, wie z.B. Sphingolipide, Phosphatidylcholin,
Phosphatidylinositol und Cholesterol, in die Inklusion transloziert. Auch
Chlamydien-spezifische verzweigtkettige Fettsäuren werden gebildet und in die
Inklusionsmembran eingebaut, womit sie sich vor der phagolysosomalen Fusion
schützen [16;39;40;121;124]. Welche Metabolite genau verändert sind und warum
Infektionen unter Normoxie und Hypoxie zu diesen Unterschieden führen soll in
weiteren Studien im Detail betrachtet werden.
Veränderungen im Lipid-Metabolismus waren auch bei dem Vergleich einer
persistenten Infektion unter Normoxie und einer aktiven Infektion unter Hypoxie mit
IFN-γ Behandlung zu finden. Auffällig waren zudem die starken Veränderungen im
Kohlenhydrat-Metabolismus. In diese Kategorie gehören u.a. die Glykolyse, der
Zitratzyklus oder auch der Pentosephosphatweg. Schon zuvor wurde beschrieben,
dass eine Chlamydien-Infektion mit einem erhöhten Kohlenhydrat-Metabolismus in
der Wirtzelle verbunden ist, welches den hohen Energieverbrauch in infizierten
Zellen kompensiert [83]. Auch unter hypoxischen Bedingungen konnte ein erhöhter
Glukose-Verbrauch in C. pneumoniae infizierten Zellen in der ersten Phase des
Entwicklungszyklus detektiert werden [97]. Zudem wurde zuvor in Studien, die u.a.
die chlamydialen Gene der Glykolyse oder des Pentosephosphatwegs analysierten,
gezeigt, dass diese sich in ihrer Regulation zwischen aktiver und persistenter
Infektion unterschieden [35;75]. Dennoch bleibt in weiteren Einzelheiten zu klären,
welche Metabolite verantwortlich für den Wechsel zwischen persistenten und aktiven
Wachstum bei IFN-γ unter Normoxie und Hypoxie sind. Dazu beitragen könnte z.B.
Tryptophan, welches in den IFN-γ behandelten Zellen während einer Infektion unter
Hypoxie erhöht detektiert wurde und zur Validierung dieser Methode genutzt werden
konnte. Bei der Betrachtung dieses Metabolits über alle analysierten Konditionen,
zeigte sich, dass dessen Massenintensität mit der Expression von IDO korrelierte.
Daher war ein starker Abbau von Tryptophan in IFN-γ behandelten Zellen unter
Normoxie zu detektieren, wohingegen in Zellen unter Hypoxie, in denen die
Expression von IDO reduziert war, ein geringerer Abbau nachzuweisen war. Somit
Diskussion 96
ließ sich mit dieser Methode die zuvor getätigte Vermutung bestätigen, dass bei einer
Infektion unter Hypoxie eine höhere Konzentration an Tryptophan in der Zelle
vorliegt. Damit hätte C. pneumoniae einen Wachstumsvorteil unter Hypoxie nach
IFN-γ Stimulation. Obwohl diese Metabolom-Analyse nicht zielgerichtet auf eine
Hypothese war, konnten zuvor getätigte Annahmen bestätigt und neue Ansatzpunkte
gefunden werden, die in Zukunft weiter im Detail betrachtet werden sollen. Bisher
wurden dabei jedoch nur die annotierten Metaboliten untersucht. Es ist weiterhin
anzustreben, unbekannte Massen zu identifizieren, um eventuell Biomarker oder
neue Angriffspunkte für Medikamente zu finden.
6.6 Schlussbetrachtung Aus den vorliegenden Ergebnissen wurde ein Modell entwickelt wie C. pneumoniae
und der Einfluss von Hypoxie zu Umbauprozessen und dadurch zur Pathogenese der
COPD beitragen könnten (Abbildung 6.2). Es zeigte sich, dass die antichlamydiale
Aktivität von IFN-γ nur unter Normoxie auftrat und dort zur Persistenz führte. Bei
einem Abfall der Sauerstoffkonzentration lag eine reduzierte IFN-γ Wirkung vor, die
mit einer vermindert ablaufenden Jak-STAT Signalkaskade, geringer IDO
Expression und dadurch erhöhter Tryptophankonzentration einherging. Dies war ein
Stimulus zur Reaktivierung. Eine reaktivierte sowie akute und persistente
C. pneumoniae Infektion war durch eine Entzündungsreaktion (IL-6)
gekennzeichnet. Zudem wiesen Zellen mit persistenter oder akuter Infektion eine
direkte Schädigung von Lungenepithelzellen auf. Die Entzündungsreaktion war
jedoch vermehrt während einer persistenten Infektion zu detektieren, wohingegen
zelluläre Umbauprozesse besonders stark während einer akuten Infektion unter
Hypoxie zu detektieren waren. Daher sind persistente und durch Hypoxie reaktivierte
Infektionen, die zu einer akuten Infektion führen, ein besonders starker Stimulus zur
Pathogenese der COPD. Die hier etablierten Transkriptom- und
Metabolom-Analysen können in Zukunft genutzt werden, um weitere Einblicke über
den Einfluss von Hypoxie auf C. pneumoniae zu erhalten.
Diskussion 97
Abbildung 6.2: Modell zu C. pneumoniae induzierten Umbauprozessen. (1) C. pneumoniae infiziert Lungenepithelzellen was zu einer akuten Infektion führt. (2) Bei einer abgeschwächten IFN-γ Immunabwehr gelang C. pneumoniae in die Persistenz. (3) Durch Reduktion der Sauerstoffkonzentration im Gewebe gelangen die persistenten C. pneumoniae wieder in ihren aktiven Entwicklungszyklus. Eine persistente Infektion hat einen verstärkten Einfluss auf die IL-6 Expression und auf direkte Umbauprozesse von Epithelzellen. Unter Hypoxie ist der Einfluss einer C. pneumoniae-Infektion auf Umbauprozesse verstärkt.
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Abbildungsverzeichnis 106
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2.1: Taxonomie der Ordnung Chlamydiales. ......................................... 10 Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des Entwicklungszyklus von
C. pneumoniae. .............................................................................. 12 Abbildung 2.3: Remodeling (epithelial-mesenchymal transition, EMT) von
Epithelzellen. ................................................................................. 15 Abbildung 2.4: Vereinfachte Darstellung der Jak-STAT Signalkaskade. ................. 17 Abbildung 2.5: Vereinfachte Darstellung der HIF-1α Stabilisierung durch Hypoxie.
....................................................................................................... 21 Abbildung 5.1: C. pneumoniae Einschlusskörper nach IFN-γ Behandlung unter
Normoxie und Hypoxie. ................................................................. 50 Abbildung 5.2: Wiederanzucht von C. pneumoniae in HEp-2 Zellen nach IFN-γ
Behandlung unter Normoxie und Hypoxie (72 hpi)......................... 51 Abbildung 5.3: Persistenzinduktion von C. pneumoniae bei ansteigender
Sauerstoffkonzentration in HEp-2 Zellen. ....................................... 52 Abbildung 5.4: Reaktivierung von persistenten C. pneumoniae durch Hypoxie in
HEp-2 Zellen. ................................................................................. 53 Abbildung 5.5: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-
Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (4 hpi). ............... 54 Abbildung 5.6: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-
Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (24 hpi). ............. 55 Abbildung 5.7: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-
Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (48 hpi). ............. 56 Abbildung 5.8: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (4 hpi). .................. 58 Abbildung 5.9: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (24 hpi). ................ 59 Abbildung 5.10: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (48 hpi). .............. 60 Abbildung 5.11: Quantitative RT-PCR von IP-10 in HEp-2 Zellen. ........................ 62 Abbildung 5.12: Quantitative RT-PCR von SOCS1 in HEp-2 Zellen. ..................... 63 Abbildung 5.13: Quantitative RT-PCR von SOCS3 in HEp-2 Zellen. ..................... 64 Abbildung 5.14: Quantitative RT-PCR von IL-6 in C. pneumoniae infiziertem
humanen Lungengewebe (24 hpi). .................................................. 65 Abbildung 5.15: Quantitative RT-PCR von IL-6 in dem Reaktivierungs-Modell von
C. pneumoniae infizierten HEp-2 Zellen. ........................................ 66 Abbildung 5.16: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (48 hpi). . 67 Abbildung 5.17: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (96 hpi). . 68 Abbildung 5.18: Fluoreszenzfärbung von α-SMA in A549 Zellen (72 hpi). ............ 69 Abbildung 5.19: Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten A549 Zellen unter
Normoxie. ...................................................................................... 70 Abbildung 5.20: Western Blot Analysen der Inhibition der TGF-β Signaltransduktion
durch SB-431542 in C. pneumoniae infizierten A549 Zellen. ......... 71 Abbildung 5.21: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter
Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (48 hpi). ................................... 72 Abbildung 5.22: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter
Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (96 hpi). ................................... 73 Abbildung 5.23: Western Blot Analysen von CPAF in C. pneumoniae infizierten
A549 Zellen (48 hpi). ..................................................................... 74 Abbildung 5.24: Zuordnung der Sequenzen auf das humane und chlamydiale Genom.
....................................................................................................... 76 Abbildung 5.25: Häufigkeit der Sequenz-Abdeckung pro Gen. ............................... 77
Abbildungsverzeichnis 107
Abbildung 5.26: Vergleich der mRNA Expression von chlamydialen Genen zwischen verschiedenen RNA-Aufreinigungen. .............................. 78
Abbildung 5.27: Hauptkomponentenanalyse des Datensets. .................................... 80 Abbildung 5.28: Massenintensität von Tryptophan in IFN-γ behandelten HEp-2
Zellen. ............................................................................................ 82 Abbildung 6.1: Schematische Darstellung des Einfluss einer Chlamydien-Infektion
auf Umbauprozesse von Gewebe. ................................................... 90 Abbildung 6.2: Modell zu C. pneumoniae induzierten Umbauprozessen. ................ 97
Tabellenverzeichnis 108
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1: Extrazelluläre Sauerstoffkonzentrationen in verschiedenen Geweben. . 19 Tabelle 3.1: In dieser Arbeit verwendete Zelllinien ................................................. 27 Tabelle 3.2: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für humane Sequenzen......... 29 Tabelle 3.3: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für chlamydiale Sequenzen .. 29 Tabelle 3.4: In dieser Arbeit verwendete siRNAs ................................................... 30 Tabelle 3.5: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für Western Blot Analysen
....................................................................................................... 31 Tabelle 3.6: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für Western Blot
Analysen ........................................................................................ 31 Tabelle 3.7: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für
Immunfluoreszenzfärbungen .......................................................... 32 Tabelle 3.8: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für
Immunfluoreszenzfärbungen .......................................................... 32 Tabelle 4.1: Zellkulturbedingungen in den durchgeführten Versuchen .................... 33 Tabelle 4.2: Zusammensetzung des Sammel- und Trenngels................................... 41 Tabelle 4.3: Pipettierschema der reversen Transkription mit Roche und Fermentas 42 Tabelle 4.4: Temperaturprofil der reversen Transkription ....................................... 43 Tabelle 4.5: Pipettierschema der quantitative RT-PCR ........................................... 43 Tabelle 4.6: Temperaturprofil der quantitativen RT-PCR........................................ 44 Tabelle 5.1: Übersicht über die Veränderung der Stoffwechselwege der Infektion
relevanter Metabolite. ..................................................................... 81
Lebenslauf 109
A Anhang
A.1 Lebenslauf
Inga Dietz
Geburtsdatum 15.05.1984 in Bremen
Familienstand Ledig
Beruflicher Werdegang
Seit 03/2009 Wissenschaftliche Angestellte
Arbeitsgruppe Prof. Dr. med Jan Rupp, Institut für Medizinische
Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Schleswig-
Holstein, Campus Lübeck
Hochschulausbildung
10/2008 Abschluss als Diplom-Biologin (Note: sehr gut)
Thema der Diplomarbeit: „Proteinbiochemischer Nachweis des
Thyroid Adenoma Associated (THADA) Proteins“ durchgeführt am
Zentrum für Humangenetik, Universität Bremen
10/2005 Vordiplom (Note: gut)
Universität Bremen
10/2003-10/2008 Studium der Biologie
Universität Bremen
Schulbildung
06/2003 Allgemeine Hochschulreife (Note: gut)
Schulzentrum des Sekundarbereichs II Walle, Bremen
03/2000 Mittlere Reife mit bilingualem Abschluss (Note: gut)
Schulzentrum am Waller Ring, Bremen
Auslandsaufenthalt
11/2008-12/2008 Sprachaufenthalt in Cambridge, England
Publikationen 110
A.2 Publikationen Übersichtsartikel
Dietz I, Jerchel S, Szaszak M, Shima K, Rupp J. (2012). When oxygen runs short:
the microenvironment drives host-pathogen interactions. Microbes Infect, 14:311-
316.
Dietz I, Jerchel S, Rupp, J. (2011). Die Bedeutung von Sauerstoff und HIF-1α für
Infektionsprozesse. Der Mikrobiologe, 21:109-114.
Originalarbeiten
Dietz I, Osbahr S, Drömann D, Rohmann K, Goldmann T, Solbach W, Dalhoff
K, Rupp J. (2012). Oxygen is needed for bacterial clearance in the lung and to
prevent bacteria-induced cell remodeling. Submitted.
Kongressbeiträge 111
A.3 Kongressbeiträge
Dietz I, Müller C, Schmitt-Kopplin P, Rupp J. (2012). Metabolic profiling of
acute and persistent Chlamydia pneumoniae infection under different environmental
oxygen concentrations. 10. Deutscher Chlamydien Workshop in Erfurt (Vortrag).
Dietz I, Osbahr S, Drömann D, Solbach W, Dalhoff K, Rupp J. (2011). Impact of
hypoxia on persistent Chlamydia pneumoniae infection and its effect on airway
remodelling. 63. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und
Mikrobiologie (DGHM) in Düsseldorf (Poster).
Dietz I, Osbahr S, Drömann D, Solbach W, Dalhoff K, Rupp J. (2011). A low
oxygen environment promotes epithelial to mesenchymal cell transition during
Chlamydia pneumoniae infection. 9. Deutscher Chlamydien Workshop in Ascona,
Schweiz (Vortrag).
Dietz I, Drömann D, Dalhoff K, Solbach W, Rupp, J. (2010) Interaction between
hypoxia and IFN-γ mediated persistence of Chlamydia pneumonia. 62. Jahrestagung
der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) in Hannover
(Poster).
Dietz I, Drömann D, Dalhoff K, Solbach W, Rupp J. (2010). IFN-γ mediated
control of Chlamydia pneumoniae lung infection is oxygen-dependent. 8. Deutscher
Chlamydien Workshop in Herrsching bei München (Vortrag).
Danksagung 112
A.4 Danksagung
Abschließend möchte ich mich ganz herzlich, bei allen die mich bei der Anfertigung
dieser Dissertation unterstützt haben, bedanken.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Jan Rupp für die Überlassung des Themas
und der fortwährend wissenschaftlichen Betreuung. Seine stets konstruktiven
Vorschläge und Anregungen haben zu dem Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Zudem bin ich für seine kritische Durchsicht des Manuskripts dankbar.
Herrn Prof. Dr. Werner Solbach möchte ich für die Möglichkeit der Durchführung
der vorliegenden Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie und
Hygiene danken.
Für die stets herzliche Zusammenarbeit und die zahlreichen wissenschaftlichen
Diskussionen möchte ich an dieser Stelle Constanze Müller danken. Zudem bin ich
ihr sehr Dankbar für die gemeinsame Ausarbeitung der Metabolom-Analysen.
Ein weiterer Dank gilt hier Prof. Dr. Thomas Rattei für seine Hilfestellung im
Rahmen der Etablierung der Transkirptom-Analysen und Thomas Weinmaier für die
Durchführung der bioinformatischen Auswertungen.
Sünja Osbahr, Kristina Rohmann und Ute Knuppertz danke ich für die Einarbeitung
in das Lungengewebs-Modell sowie der Klinik für Chirurgie des UK-SH, Campus
Lübeck für die Bereitstellung von Patienten-Material.
Sebastian Marwitz danke ich für die Überlassung des TGF-β Inhibitors.
Meinen lieben Kollegen Kristin Wischnat, Siegrid Pätzmann, Anke Hellberg und
Angela Gravenhorst gilt hier ein großer Dank. Sie hatten zu jeder Zeit ein offenes
Ohr für mich und unterstützten mich auch in schwierigen Situationen. Innerhalb und
außerhalb des Laboralltags wurde es mit ihnen nicht langweilig.
Ein großes Dankeschön geht an meine Kollegen Stefan Jerchel, Kensuke Shima und
Marta Szaszak für die stets hilfreichen Diskussionen und konstruktiven Ratschläge.
Zum Schluss möchte ich ganz besonders meiner Familie für die uneingeschränkte
Geduld und den stets festen Rückhalt Danken. Sie haben mich zu jedem Zeitpunkt
liebevoll unterstützt und immer an mich geglaubt. Vielen Dank, dass ihr mit mir
durchgehalten habt!