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Berufskolleg Olsberg des Hochsauerlandkreises Höhere Berufsfachschule für Biologisch-Technische-Assistenten

Laborausbildung: Mikrobiologie/Bioverfahrenstechnik

Arbeitsmaterialien

Zusammengestellt von Manfred Albracht, Olsberg (2007/2008)

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Arbeitsregeln für den Umgang mit Mikroorganismen

Mikroorganismen existieren überall in unserer Umgebung. Um einerseits sich selbst beim Arbeiten mit Mikroorganismen vor einer Infektion zu schützen und andererseits eine Kontamination der Proben und eigenen Kulturen zu vermeiden, sind folgende Regeln beim Umgang mit Mikroorganismen zu beachten:

1. Behandeln Sie jede Probe so, als ob sich pathogene Keime darin befänden.

2. Essen und Trinken sind am Arbeitsplatz zu unterlassen. Im Labor sind stets Kittel und bei Bedarf Schutzbrille und Schutzhandschuhe zu tragen.

3. Der Sitzplatz muss sauber sein (Desinfektionslösung!), Fenster und Türen sind während der Untersuchungen zu schließen. Unnötiges Herumgehen ist zu vermeiden, um das Aufwirbeln der Luftkeime zu reduzieren.

4. Am Arbeitsplatz befinden sich nur die für die Untersuchung unmittelbar benötigten Geräte und Chemikalien. Taschen, Kleidungsstücke u.ä. sind gesondert aufzubewahren.

5. Flüssigkeiten werden nie mit dem Mund sondern stets mit Pipettierhilfen angesaugt.

6. Gefäße, die sterile Lösungen, Proben oder Reinkulturen enthalten, sind stets so kurz wie möglich und immer in Brennernähe zu öffnen.

7. Öffnungen von Kulturgefäßen sind nach der Entnahme durch die entleuchtete Flamme zu führen.

8. Impfösen sind vor und nach jedem Benutzen in der Brennerflamme auszuglühen.

9. Kolbenhubpipetten, Reagenzgläser und Impfösen sind immer im entsprechenden Ständer aufzubewahren.

10. Wenn versehentlich keimhaltiges Material auf die Arbeitsplatte gelangt, wird diese durch Übergießen mit einer Desinfektionslösung gereinigt.

11. Geräte, die mit keimhaltigem Material kontaminiert sind, werden vor dem Reinigen abgekocht (Petrischalen etc.). Nach dem Spülen und Klarspülen werden die Geräte in der Hitze sterilisiert.

12. Die Hände werden nach Abschluss der Arbeiten − spätestens beim Verlassen des Labors − mit einer geeigneten Lösung desinfiziert.

Man sollte sich vom Misslingen einer erstmalig durchgeführten Untersuchung nicht entmutigen lassen. Nach kritischem Durchdenken sollte eine neue Untersuchung durchgeführt werden.

Zu guten Ergebnissen führen nur größte Sauberkeit, Ausdauer und geschickter, fachgerechter Umgang mit den Arbeitsgeräten und den Proben.

Ich bestätige hiermit, dass ich die Sicherheitsbestimmungen für den Umgang mit Mikroorganismen zur Kenntnis genommen habe.

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Inhaltsverzeichnis:

Arbeitsregeln für den Umgang mit Mikroorganismen 2

1.0 Methodische Grundlagen der Mikrobiologie: 5 1.1 Umgang mit Mikroorganismen 5 1.2 Bereitung von Nährböden 6 1.3 Sterilisationstechniken 10 1.3.1 Sterilisation durch trockene Hitze 11 1.3.2 Sterilisation durch feuchte Hitze (Dampf) 12 1.3.3 Andere Sterilisationsmethoden 14 1.4 Kulturgefäße 15 1.5 Impftechniken 18 1.6 Kulturtechniken 22 1.7 Beschaffung und Aufbewahrung von Mikroorganismen 25 2.0 Allgemeine Grundlagen: 27 2.1 Bunsenbrenner (Ausglühen und Abflammen 27 2.2 Umgang mit dem pH-Meter 29 2.3 Umgang mit dem Mikroskop 30 2.4 Herstellung von Nährböden 32 2.5 Sterile-Werkbank 34 3.0 Allgemeine mikrobiologische Methoden: 36 3.1 Risikogruppen von Bakterien und Pilzen 36 3.2 Identifizierung (Bestimmen) von Bakterien 39 3.3 Mikroskopie fixierter und gefärbter Bakterien 44 3.3.01 Herstellung eines gefärbten Ausstrichpräparates mit Methylenblau 44 3.3.02 Negativ-Darstellung von Mikroorganismen 45 3.3.03 Sporenfärbung 46 3.3.04 Färbung von Zellinhaltsstoffen 47 3.3.05 Der Katalase-Nachweis 49 3.3.06 Oxidase-Nachweis 50 3.3.07 Gramfärbung 51 3.3.08 Unterscheidung gramnegativer und -positiver Bakterien mittels KOH-Test 52 3.3.09 Aminopeptidase-Test 53 3.3.10 Geißelfärbung nach LEIFSON 54 3.3.11 Nachweis der Beweglichkeit 55 3.3.12 Lactobacillus spec. 56 3.3.13 Micrococcus spec. 57 3.3.14 Streptococcus spec. 58 3.3.15 Actinomyceten 59 3.3.16 Anreicherung und mikroskopische Untersuchung von Schimmelpilzen 60 3.3.17 Saccharomyces – Hefen 63 3.3.18 Einführung in die mikrobiologische Diagnostik mit Hilfe verschiedener Nährmedien 64 4.0 Versuchsanleitungen: 68 4.01 Mikroorganismen der Luft, der Haut und an Gebrauchsgegenständen 68 4.02 Gewinnung von Reinkulturen der Luftfangplatten(Techniken zum fraktionierten Ausstrich von Mikroorganismen) 72 4.03 Herstellung und Beimpfen eines Schrägagarröhrchens 76 4.04 Isolierung von Streptokokken aus Zahnbelag 77 4.05 Anreicherung und Isolierung fluoreszierender Pseudomonaden 79 4.06 Anreicherung,Kultur und Identifizierung buttersäurebildender Clostridien (Saccharolytische Clostridien) 81 4.07 Quantitative und qualitative Bestimmung von Milchsäurebakterien 85 4.08 Bestimmung der Keimzahl von Milch 89

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4.09 Antibiogramm mittels Agardiffusionstest 91 4.10 Bestimmung der Penicillinkonzentration durch ein Antibiogramm 93 4.11 ATB Antibiogramm 96 4.12 Bouillondilutionstest 98 4.13 Bakteriologische Trinkwasseruntersuchung 99 4.14 Keimtiter, Coliformen -Titer von Wasser, wahrscheinlichste Keimzahl (MPN) 101 4.15 Zellzahlbestimmung bei Hefen 109 4.16 Fermentation von Hefezellen 116 4.17 Bakteriologische und chemische Harndiagnostik 120 5.0 Anhang: 124 5.1 Gebrauchsanleitung API 20 E 124 5.2 Gebrauchsanleitung Enterotube II 130 5.3 Gebrauchsanleitung „Sensi Disc-Dispenser“ 135 5.4 Hemmhofdurchmesser zur Bewertung von Agardiffusionstest-Ergebnissen 140 5.5 Identifizierung von Mikroorganismen 144 5.6 Bactident E.coli-Test 145 5.7 Gebrauchsanleitung Autoklav 146 5.8 Vorlage für Betriebsanleitung 147 6.0 Literatur: 148

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1.0 Methodische Grundlagen der Mikrobiologie: Zur Untersuchung von Mikroorganismen werden im wesentlichen, ungeachtet der zahlreichen Merkmalsunterschiede zwischen den verschiedenen Gruppen, die gleichen Verfahren angewendet. Die beiden wichtigsten sind die Isolierung und Kultivierung. Isolierung: Trennung einer einzelnen Zelle eines bestimmten Mikroorganismus aus einer von verschiedenen Stämmen und Arten gebildeten natürlichen Population mit dem Ziel eine Reinkultur dieses Organismus zu gewinnen. Unter einer Reinkultur versteht man in der Bakteriologie die durch vegetative Vermehrung entstandene Nachkommenschaft (= Klon) einer einzelnen Zelle. Es handelt sich also um eine Kultur, die aus genetisch identischen Bakterien besteht. In der Mykologie gilt auch die Kultur einer Art als Reinkultur. Kultivierung: Züchtung von Mikroorganismen unter Bereitstellung einer künstlichen Umwelt (Nährboden, Kulturgefäß, kontrollierte Temperaturbedingungen u. a.). Das Kultivieren kann einem der folgenden Zwecke dienen: 1. Reinkulturen zu gewinnen und unter Ausschluss stamm- und artfremder Mikroorganismen zu erhalten, 2. morphologische, physiologische und biochemische Merkmale eines bestimmten Mikroorganismenstammes zu

untersuchen, 3. die in gemischten Populationen bestehenden zwischenartlichen Beziehungen zu erkunden und 4. mikrobielle Produkte zu erzeugen. Isolieren und Kultivieren setzen voraus, dass man bestimmte grundlegende Techniken beherrscht und sorgfältig und umsichtig mit Mikroorganismen umgeht.

1.1 Umgang mit Mikroorganismen Der Arbeitsraum sollte möglichst staubfrei gehalten werden. Sein Fußboden und die Fläche des Arbeitsplatzes sollten leicht zu säubern und zu desinfizieren sein (Beläge aus Fliesen oder aus Kunststoff). Protokollieren und Mikroskopieren sollten nicht am Arbeitsplatz selbst erfolgen, da Schreibzeug und Mikroskop im Fall einer Kontamination (unbeabsichtigte mikrobiologische Verschmutzung, Verseuchung) nur schwer zu desinfizieren sind. Zur ständigen Ausrüstung des Arbeitsplatzes gehören in der Regel ein Brenner, Impfbestecke (s. Kap.1.5) und ein Gefäß mit einem Desinfektionsmittel (z.B. 70%iger Alkohol (s. Kap. 1.3.)). Zur Desinfektion von verschmutzten Geräten (Objektträger, Glasstäbe, Pipetten, Spatel u.a.). eine Spritzflasche mit 70%igem Alkohol oder einem anderen Desinfektionsmittel. Dies muss auch für die Flächendesinfektion der Arbeitsplatte bereitstehen. Bei der Arbeit ist ein kochfester Baumwollkittel zu tragen, der nach Möglichkeit im Arbeitsraum verbleiben sollte. Die Kontamination des Arbeitsplatzes erfolgt in der Regel durch Luftkeime, die zusammen mit Staubpartikeln sedimentieren und durch, vom Menschen, eingeschleppte Mikroorganismen. Einige Angaben sollen das verdeutlichen: 1. Keimgehalt der Raumluft (in Abhängigkeit von der Anzahl der in einem Raum beschäftigten Menschen): 500-2000 Keime/m³ 2. Keimgehalt der Außenluft (je nach Standort und Jahreszeit): 100-500/m³ 3. Keimabgabe durch den Menschen: Fingerkuppe: 20-100/cm² Handfläche: 1000-6000 einmal Niesen: 104-106

1 ml Speichel: 106-108

1 ml Nasensekret: 106-107

Folgende Verhaltensmaßregeln müssen beim mikrobiologischen Arbeiten beachtet werden:

1. Vor und nach der Arbeit gründlich die Hände waschen. 2. Arbeitsplatzoberfläche vor und nach der Arbeit mit 70%igem Alkohol abreiben. 3. Essen und Trinken sowie Rauchen unterlassen. 4. Unnötiges Umherlaufen und zu viele Bewegungen vermeiden.

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5. Beim Hantieren mit Kulturen darauf achten, dass keine Keime unkontrolliert aus dem Kulturgefäß nach außen gelangen können. Vorsicht bei Bildung von Kondens- und Synäereswasser (Kap.1.4): Verschlüsse von Kulturgefäßen sind in der Regel nicht wasserdicht. 6. Kulturgefäße nur kurzfristig öffnen. 7. Sprechen, Husten und Niesen nach Möglichkeit unterlassen. 8. Mikroorganismensuspensionen nicht mit dem Mund pipettieren, sondern Pipettierhilfen (z.B. Pipettierbälle) verwenden.

9. Durch Mikroorganismen verunreinigte Geräte nicht ablegen, sondern in eine Desinfektionsmittellösung geben bzw. flämmen oder ausglühen. 10. Impfgeräte sofort nach Gebrauch sterilisieren. 11. Gefäße mit nicht mehr benötigten Kulturen vor der Reinigung durch feuchte Hitze sterilisieren (Kap.1.3.2) oder 2 h in 10%iges Formalin legen. Plattenkulturen können zu Demonstrationszwecken gefahrlos aufbewahrt und herumgereicht werden, wenn man zuvor ein mit 10 %igem Formalin gefülltes Uhrglas über Nacht in die umgekehrt aufgestellte Schale setzt. Die Formalindämpfe (s. S. 45) töten die Kolonien ab. 12. Alle Arbeiten in der Nähe der Brennerflamme ausführen, da die aufsteigende heiße Luft dem Sedimentieren von Keimen entgegenwirkt. Erste-Hilfe-Maßnahmen Die Hände kamen versehentlich mit Mikroorganismen in Berührung

Hände 2 min mit einem Desinfektionsmittel waschen (70%iger Alkohol + l% Glycerin, 2%iges Sagrotan u. a.)

Mikroorganismensuspension ist in den Mund gelangt

Mit viel Wasser spülen und mit 0,1%iger Kaliumpermanganat-Lsg. gurgeln

Mikroorganismensuspension ist ins Auge gelangt

Auge unter fließendem Wasser spülen oder Augendusche verwenden, Arzt aufsuchen.

Mikroorganismensuspension wurde verschluckt Erbrechen herbeiführen (starke NaCI-Lsg. trinken). Arzt aufsuchen

Mikroorganismen sind in eine Hautwunde gelangt Kleinere Wunden lässt man gegebenenfalls zunächst ausbluten und deckt sie dann steril ab. Arzt aufsuchen.

1.2 Bereitung von Nährböden Mikroorganismen werden auf bzw. in Nährböden kultiviert, die alle für das Wachstum wichtigen Stoffe enthalten. Die Zusammensetzung der Nährmedien richtet sich nach den Ansprüchen des zu züchtenden Mikroorganismus. Je nach Verwendung unterscheidet man folgende Nährböden: I. Allgemeine (kollektive) Nährböden: sie genügen den Nährstoffansprüchen vieler Arten, II. Spezielle (selektive) Nährböden: nur wenige Arten gelangen darauf zur Entwicklung. Nährböden können auch nach ihrer Herkunft unterschieden werden: a) Komplexe -(natürliche) Nährböden: sie enthalten Naturprodukte oder aus ihnen gewonnene Substanzen, dabei ist

ihre Zusammensetzung nicht immer identisch, b) Synthetische Nährböden: sie bestehen aus Chemikalien und sind daher von ihrer chemischen Zusammensetzung her

genau definiert. In der Bakteriologie werden auch Indikatornährböden verwendet, mit deren Hilfe besondere Stoffwechselleistungen erkannt werden können.

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Zur Bereitung komplexer Nährböden werden folgende Nährstoffquellen häufig verwendet: 1.Fleischwasser: 500 g fettarmes Rind- oder Pferdefleisch werden im Fleischwolf zerkleinert und mit 1 l Wasser überschichtet. Der Ansatz wird etwa 12 h im Kühlschrank aufbewahrt. Man presst dann das Fleischwasser durch ein Tuch ab und füllt mit Wasser auf ein Liter auf. 2.Fleischextrakt ist ein konzentrierter Auszug aus enzymatisch angedautem Fleisch. Er dient als Stickstoffquelle und enthält außerdem Vitamine und mineralische Bestandteile. Anwendung: 0,2-1,0% 3.Peptone enthalten vor allem Eiweißspaltprodukte, die durch Behandlung pflanzlicher oder tierischer Eiweiße mit Enzymen hergestellt wurden (Pepton aus Fleisch, aus Casein, aus Sojamehl u. a.). Anwendung: 0,2-2,0 % 4.Hefeextrakt wird aus Hefe gewonnen und kann an Stelle von Fleischextrakt gebraucht werden. Der Extrakt ist reich an Vitaminen. Anwendung: 0,1 -0,5% 5.Malzextrakt wird durch Auslaugen von Malz bei 55°C und anschließende Einengung hergestellt. Er dient vor allem als Zusatz für Pilznährböden. Anwendung: 3-5% 6.Kohlenhydrate dienen ausschließlich als Kohlenstoff- und Energiequelle. Die gleiche Aufgabe erfüllen auch ein- bis mehrwertige Alkohole (Glycerin, Mannit u. a.) sowie verschiedene Säuren (Citronensäure, bestimmte Fettsäuren u. a.). Auch Sojamehl, Extrakte aus pflanzlichen Organen (z. B. Möhren, Kartoffeln, Tomaten) und Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut und Serum (in der medizinischen Mikrobiologie), werden bestimmten Nährböden zugesetzt. Alle Nährmedien enthalten einen hohen Anteil an Wasser. Man kann bei der Nährbodenbereitung Leitungswasser verwenden, wenn keine für Mikroorganismen schädlichen Stoffe darin vorkommen. Häufig nimmt man auch Aqua destillata und deionisiertes Wasser, vor allem bei der Herstellung genau definierter synthetischer Nährböden. Je nach Konsistenz der Nährmedien unterscheidet man flüssige und feste Nährböden. Als Verfestigungsmittel werden Agar-Agar oder Gelatine eingesetzt. Agar-Agar (kurz Agar genannt) ist ein aus bestimmten Rotalgen gewonnenes Polysaccharid, das in fädiger und pulverisierter Form angeboten wird. Die im Handel befindlichen Fabrikate in Pulverform sind weitgehend gereinigt und enthalten daher, im Gegensatz zum Fadenagar, nur noch wenige Begleitstoffe (organische Nährstoffe, Salze). Agar wird in 1-2%iger Konzentration verwendet. Er verflüssigt sich bei etwa 95°C und erstarrt bei 40-45°C zu einem Gel. Gelatine ist ein Gerüsteiweiß, das durch Auskochen aus Knochen und Sehnen gewonnen wird. Sie löst sich bei 25-30°C und verfestigt sich bei 20-22°C. Je Liter Nährlösung werden in der Regel etwa 150g Gelatine zugesetzt. Da eine gelatinehaltige Lösung sauer reagiert, muss sie vor dem Erhitzen mit 1 N NaOH-Lösung neutralisiert werden. Nachteilig ist, dass Gelatine von bestimmten Mikroorganismen abgebaut wird, einen niedrigen Schmelzpunkt besitzt und bei zu starkem Erwärmen ihre Gelierfähigkeit verliert. Gelatinenährböden werden zur Sterilisierung an zwei aufeinanderfolgenden Tagen 20 min auf 100°C erhitzt (s. Kap.1.3). Das Wachstum von Mikroorganismen ist in hohem Maße vom pH-Wert des Substrats abhängig. Bakterien wachsen am besten bei pH 6-8, während Pilze einen pH von 4-6 bevorzugen. Die notwendige Wasserstoffionenkonzentration ([H+]) wird bei der Nährbodenbereitung mit 1 N NaOH und 1 N HCl eingestellt. Bakteriennährböden stellt man vor dem Sterilisieren auf pH 7,3 ein, da die H +-Konzentration durch das Erhitzen auf pH 7 absinkt, einen Wert, der für die meisten Bakterien optimal ist. Ist eine starke Ansäuerung des Mediums infolge des Bakterienwachstums zu erwarten, so setzt man dem Nährboden zur Pufferung CaC03 zu. Im Folgenden sollen einige allgemeine (= kollektive) Nährböden für Bakterien bzw. Pilze und als Beispiel für einen Selektiv- und gleichzeitig Indikatornährboden der ENDO-Agar angegeben werden. Weitere Nährmedien werden in späteren Kapiteln berücksichtigt.

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I. Nährböden für Bakterien

1. Fleischextrakt-Pepton-Bouillon (FPB) Fleischextrakt 3,0 g Pepton aus Fleisch 5,0 g

Aqua dest. 1000 ml pH 7 (einstellen)

2. Fleischextrakt-Pepton-Agar (FPA) Fleischextrakt 3,0 g Pepton aus Fleisch 5,0 g Agar (pulverisiert und gereinigt)

Aqua dest. 1000 ml pH 7 (einstellen)

3. Hefeextrakt-Pepton-Bouillon Hefeextrakt 1,0 g Pepton aus Fleisch 10,0 g Glucose 4,0 g

Aqua dest. 1000 ml pH 7 (einregulieren)

4. Hefeextrakt-Pepton-Agar Der zuvor angegebenen Nährlösung 18,0 g Pulver-Agar zusetzen.

5. Nährbouillon Pepton aus Fleisch 10,0 g NaC1 3,0 g

Fleischwasser 1000 ml pH 7 (einstellen)

6. Nähragar Der Nährbouillon 18,0g Pulver-Agar zugeben.

7. ENDO-Agar (ENDO, japanischer Bakteriologe) ENDO-Agar ist ein häufig verwendeter Selektiv- und Indikator-Nährboden zur Differenzierung (Unterscheidung) von Darmkeimen (Enterobacteriaceae). Er zeigt an, ob Bakterien Lactose (Milchzucker) abbauen können. Der Nährboden enthält außer Lactose und anderen Zutaten noch sulfitreduziertes Fuchsin, auch fuchsinschweflige Säure genannt. Die beim Lactoseabbau entstehenden Aldehyde wandeln das nahezu farblose, reduzierte Fuchsin in rotes Fuchsin um. Demzufolge färben sich die Kolonien lactoseverwertender Darmbakterien rot, während bei lactosenegativen Keimen kein Farbumschlag eintritt. Die Anfärbung ist besonders bei den Kolonien von Escherichia coli sehr intensiv. Diese Kolonien zeigen auf ihrer Oberfläche einen grüngoldenen Glanz, Fuchsinglanz genannt. Das Medium kann auch als Trockennährboden fertig bezogen werden (z.B. Merck 4044). Als Selektiv- und Indikatornährböden für Darmkeime werden auch der MACCONKEY-Agar (MCA) (Merck 5465, Oxoid CM 115) und der Eosin-Methylenblau-Agar (EMA) (Merck 1347, Oxoid CM 69) verwendet. E. coli bildet auf MCA violettrote, oft von einem trüben Hof (= ausgefallene Gallensalze) umgebene Kolonien. Auf EMA zeigen diese Kolonien im reflektierten Licht einen grünlichen Metallglanz.

Zusammensetzung: Lactose 10,0 g K2HPO4 3,5 g Pepton aus Fleisch 10,0 g Agar 15,0 g Na2SO3 (Na-Sulfit) 2,5 g dest. Wasser 1000 ml basisches Fuchsin 0,4 g pH 7,4 (vorgegeben)

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II. Nährböden für Pilze 1. Sabouraud-Glucose-Agar (benannt nach dem franz. Dermatologen SABOURAUD (1869-1938), der dieses Substrat zur Züchtung von Hautpilzen einsetzte. Pepton aus Fleisch 10,0 g Aqua dest. 1000 ml Glukose (für Hefen Maltose) 40,0 g pH 5,6 (einstellen) 2. Czapek- Dox-Agar Saccharose (oder Glukose) 30,0 g Fe SO4 x 7H2O 0,01 g MaNO3 2,0 g Agar 15,0 g MgSO4 x 7H2O 0,5 g dest. Wasser 1000 ml KCl 0,5 g pH 4,5 (vorgegeben) KH2PO4 1,0 g 3. Czapek-Dox-Nährlösung Obige Bestandteile, aber ohne Agar Die Zubereitung eines Agarnährbodens soll am Beispiel des Fleischextrakt-Pepton-Agars (FPA, s. o.) dargestellt werden. Material: Fleischextrakt, Pepton aus Fleisch, gepulverter Agar, dest. Wasser, je eine Tropfflasche mit 1 N NaOH und 1 N HCl, Indikatorpapier pH 4-8 oder pH-Meter, graduierter 300 ml-Erlenmeyerkolben, 2 100 ml-Bechergläser, 3 Spatel, 1 Glasstab, Schere, Zellstoff, Aluminiumfolie, Wasserbad 100°C oder Heizplatte, Autoklav oder Dampfdrucktopf (s. Kap. 1.3.2), Waage Ausführung: a. 0,3 g Fleischextrakt und 0,5 g Pepton in je ein Becherglas geben und in ein wenig Wasser lösen. b. Beide Lösungen mischen und unter Zugabe von NaOH bzw. HCl auf etwa pH 7,3 einstellen. c. Mischung in den 300 ml-Kolben schütten, 1,8 g Agar dazugeben und mit dest. Wasser auf 100 ml auffüllen. d. pH-Wert kontrollieren. e. Kolben ins Wasserbad oder auf eine Heizplatte stellen und unter Rühren oder Schwenken erhitzen, bis der Agar gelöst ist f. Kolben nun locker mit einem Zellstoffstopfen verschließen (Abb. 1.7) und als Schutz gegen herabtropfendes Wasser

über den Verschluss eine Kappe aus Alufolie legen. g. 15 min bei 121°C im Autoklav sterilisieren. h. Gerät auf etwa 80°C abkühlen lassen, den Nähragar entnehmen und in Mengen von etwa 15 ml in sterile Petrischalen

oder Röhrchen (Abb.1.6) abfüllen. Die Schalen können mehrere Tage, die Röhrchen dagegen wesentlich länger im Kühlschrank bevorratet werden (Abb. 1.4). Man kann den pH-Wert eines Nährbodens auch so regulieren, dass man an einem Aliquot des fertigen Nährmediums, z. B. an 10,0 ml, den NaOH- bzw. HCl-Verbrauch beim Einstellen misst und daraus errechnet, wie viel ml einer 1 N Lösung der Gesamtnährbodenmenge beigegeben werden müssen. Beim Abfüllen von Nährböden ist immer darauf zu achten, dass das Medium nicht mit den Verschlüssen der Kulturgefäße in Berührung kommt, sonst können Organismen von außen in das Gefäß eindringen oder aus dem Gefäß nach außen gelangen. Zur Bereitung von zuckerhaltigen Nährböden, die bei Gärungsprüfungen eingesetzt werden, sollten die Kohlenhydrate getrennt vom übrigen Medium sterilisiert werden, weil bei der Erhitzung des Gesamtmediums auf 120°C stoffliche Veränderungen eintreten, die sich auf die Versuchsergebnisse auswirken. Man stellt in der Regel konzentrierte Zuckerlösungen her und gibt davon den separat sterilisierten übrigen Nährbodenbestandteilen so viel bei, dass die Endkonzentration erreicht wird. Im Handel befinden sich auch Fertignährböden, die in Pulverform angeboten werden. Man muss diese Trockennährböden lediglich mit der erforderlichen Wassermenge versetzen und dann sterilisieren. Die Vorteile liegen in der leichten Handhabung und der gleichbleibenden Zusammensetzung.

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1.3 Sterilisationstechniken Mikrobiologisches Arbeiten setzt in der Regel voraus, dass Nährböden, Kulturgefäße und Geräte steril sind. Unter Sterilisation versteht man die Abtötung von lebenden Mikroorganismen oder deren Ruhestadien (Sporen). Als Indiz dafür gilt der irreversible Verlust der Fortpflanzungsfähigkeit. Die nicht mehr vermehrungsfähigen Zellen verbleiben in der Regel am sterilisierten Gut. Der Begriff Entkeimung wird häufig im Sinne von Sterilisation verwendet. In der Hygiene versteht man darunter auch die Entfernung aller lebenden und toten Zellen aus einem Medium, was nur durch Filtration erreicht werden kann. Viruspartikel verbleiben allerdings in der filtrierten Lösung. Unter Desinfektion versteht man die Vernichtung von pathogenen Mikroorganismen. Man meint also eine selektiv wirksame Maßnahme zur Verhinderung einer Übertragung von Krankheitserregern. Oft beschränkt man sich lediglich auf die Verringerung der Keimmenge, z. B. bei der Händedesinfektion. Desinfektionsmaßnahmen zielen aber häufig nicht nur auf die Beseitigung pathogener Keime sondern auch auf die Vernichtung saprophytischer Mikroorganismen, z. B. in der Lebensmittelindustrie und bei der Oberflächendesinfektion des mikrobiologischen Arbeitsplatzes. In diesen Fällen kann man den Ausdruck pathogen durch die Bezeichnung "unerwünscht" ersetzen. Die Pasteurisierung ist eine Teilsterilisation, durch die nur die vegetativen Zellen, nicht jedoch die Sporenstadien von Pilzen und Bakterien abgetötet werden. Bei der Pasteurisierung wird das Gut in der Regel 5-10 min auf 75-80 °C erhitzt. Milch wird zur Erhaltung des Geschmackswerts kürzeren Erhitzungszeiten unterworfen:

Kurzzeiterhitzung: 20-40 s auf 71 - 74 °C Hocherhitzung: 2-5 s auf 85 - 87 °C Ultrahocherhitzung: - 1-2 s auf 135-150 °C (durch Einleiten von überhitztem Dampf)

Die wichtigsten Verfahren zur Sterilisierung basieren auf der Anwendung von Hitze. Das folgende Diagramm gibt einen Überblick über die wichtigsten Formen der Hitzesterilisierung.

Bei den einzelnen Formen der Heißluft- und Dampfsterilisation ist zu beachten, dass das Sterilisiergut in den Sterilisatoren erst nach einer bestimmten Zeit die Sterilisiertemperatur annimmt. Der Ablauf einer Sterilisierung lässt sich von der Zeit her in vier Abschnitte gliedern (vgl. Abb.1.1):

1. Anheizzeit - Zeit für das Anheizen des Sterilisators, 2. Ausgleichszeit: Zeitspanne, bis das Gut die Sterilisiertemperatur angenommen hat, 3. Abtötungszeit: Einwirkungszeit der für das Abtöten erforderlichen Temperatur, 4. Abkühlzeit: Die für die Abkühlung des Gutes notwendige Zeit.

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Abb. 1.1: Zeitlicher Ablauf einer Sterilisation im Autoklaven.

1.3.1 Sterilisation durch trockene Hitze 1. Behandlung mit trockener Heißluft Gefäße und Geräte aus Glas werden in der Regel mit Heißluft sterilisiert. Verbindungen zwischen Geräteteilen werden gelockert, wenn diese aus verschiedenen Materialien bestehen (unterschiedliche Ausdehnungskoeffizienten!). Alle Geräte müssen vor der Sterilisation in Metallbehälter oder Aluminiumfolie verpackt werden, um sie vor Rekontamination zu schützen. Folgende Richtwerte gelten für trockenes Sterilisiergut:

Tab. 1.1: Richtwerte für die Heißluftsterilisation.

Temperatur in °C Zeit in min 160 170 180

180 120 30

Lange Ausgleichszeiten müssen eingeplant werden. So nimmt z.B. ein Stapel Petrischalen in einem auf 180°C aufgeheizten Heißluftschrank erst nach 3,5 Stunden an der für die Sterilisation ungünstigsten Stelle eine Temperatur von 160°C an. Wenn zwischen das Sterilisiergut gelegte Watte nach der Hitzebehandlung leicht braun geworden ist, kann man annehmen, dass die erforderliche Temperatur herrschte. Als sogenannte Bioindikatoren für die richtige Geräteinstellung können auch im Boden enthaltene Bakteriensporen herangezogen werden. Dazu wird eine Spatelspitze lufttrockener Komposterde in einem Kulturröhrchen im Heißluftschrank erhitzt. Eine nach dem Abkühlen in das Röhrchen gegebene Nährlösung (z.B. FPB) darf nach 10tägiger Bebrütung bei 30°C keine Trübung, d.h. keinen Bewuchs, zeigen. Wenn kein spezieller Heißluftschrank zur Verfügung steht, kann auch ein Backofen als Sterilisator verwendet werden.

2. Ausglühen Die metallenen Impfgeräte (Öse, Nadel u.a.) werden in der Brennerflamme zum Glühen gebracht. Auch die

Teile des Halters (Abb.1.1), die in ein Kulturgefäß eingeführt werden, müssen in der Flamme erhitzt werden. Weitere Ausführungen hierzu finden Sie im Kapitel 1.5.

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3. Abflammen Metallgeräte wie Membranfiltergeräte, Scheren, Pinzetten usw. sowie Glasgeräte wie Pipetten und Glasstäbe werden oft zur schnellen Sterilisation abgeflammt. Die Glasgeräte taucht man vor dem Abflammen in 70%igen Alkohol. Auch die Ränder und Verschlüsse von Kulturgefäßen werden unmittelbar nach dem Öffnen und vor dem Verschließen der Gefäße abgeflammt.

Die Methode gilt als unzuverlässig, da ihre Wirksamkeit nur schwer überprüft werden kann und zudem Sporen von Bodenbakterien kurzfristig wirkende Temperaturen von 290°C überleben können. Beim Abflammen muss also mit einer Teilsterilisation gerechnet werden.

1.3.2 Sterilisation durch feuchte Hitze (Dampf)

1. Strömender Dampf Strömender Dampf wird in sogenannten Dampftöpfen erzeugt (Abb.1.2). Man kann sich auch mit einem Einwecktopf behelfen, der mit einem passenden Siebeinsatz versehen wurde. Die Dampfanwendung setzt die Temperaturresistenz der Bakteriensporen herab, da diese bei Benetzung quellen und dann hitzeempfindlicher sind. Aber auch bei 100°C heißem Dampf ist mit einer mehrstündigen Abtötungszeit zu rechnen, wenn es sich um Bakteriensporen handelt während vegetative Zellen bereits nach kurzer Zeit abgetötet werden. Nährmedien werden zur Sterilisation an drei aufeinanderfolgenden Tagen 30 min auf 100°C erhitzt. Damit wird erreicht, dass die das erste Erhitzen überlebenden Sporen auskeimen können und die dann gebildeten vegetativen Zellen vor einer erneuten Sporenbildung beim zweiten bzw. dritten Erwärmen abgetötet werden. Diese als fraktionierte Sterilisation oder Tyndallisation bezeichnete Methode ist nur für die Sterilisierung von Nährmedien geeignet.

Abb. 1.2: Aufbau eines Dampftopfs für die fraktionierte Sterilisation (Tyndallisation).

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2. Gespannter Dampf Das wichtigste und zuverlässigste Verfahren zur Keimtötung ist die Dampfsterilisation im Autoklaven (Abb.1.3). In diesem Druckgefäß können Wasserdampftemperaturen von über 100°C erzielt werden. Hierzu wird Wasser zum Sieden gebracht. Durch das geöffnete Ventil treibt der erzeugte Dampf die im Gefäß enthaltene Luft aus. Nach Verschluss des Ventils steigt nun die Temperatur des Wasserdampfes parallel mit dem ansteigenden Druck bis auf den durch einen Thermostaten oder ein Ventilgewicht vorgegebenen Wert. Tab. 1.2: Abhängigkeit der Temperatur im Autoklaven vom jeweils herrschenden Dampfdruck

Dampfdruck in bar Temperatur in °C

2 3 4

121 134 144

Der zeitliche Ablauf der Sterilisation ist aus Abb.1.1 ersichtlich. Während die Anheizzeit vom Autoklaventyp abhängig ist, verdienen Ausgleichszeit und Abtötungszeit besondere Beachtung. Für die Ausgleichszeit wurden folgende Richtwerte ermittelt:

Tab. 1.3: Richtwerte für die Ausgleichszeit beim Autoklavieren Gefäß Inhalt (in ml) Ausgleichszeit (in min) dünnwandige Ampulle bis 10 0 dickwandige Arzneiflaschen 100 10 250 15 500 20 1000 22 Die Abtötungszeit muss bei 121°C (2,1 bar) 20 Minuten und bei 134°C (3 bar) 5 Minuten betragen. Nach Ablauf der Abtötungszeit darf der Druck nicht abgelassen werden; man lässt vielmehr das Gerät nach Abschalten auf etwa 80°C abkühlen, bevor man das Sterilisiergut entnimmt. Auch bei der Dampfsterilisation müssen die Materialien vor einer späteren Rekontamination geschützt werden. Petrischalen und Pipetten werden daher schon vor der Sterilisation in entsprechende Büchsen (Petrischalen- bzw. Pipettenbüchsen) gestellt oder in Aluminiumfolie gepackt. Mit Watte oder Zellstoff verschlossene Gefäße werden im Dampftopf und im Autoklaven mit Aluminiumfolie abgedeckt und so vor herabtropfendem Kondenswasser geschützt. In der Schule kann man statt eines Autoklaven auch einen Schnellkochtopf benutzen. Die Betriebstemperatur dieses Gerätes beträgt etwa 125°C.

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Abb. 1.3: Aufbau eines doppelwandigen Autoklavs

1.3.3 Andere Sterilisationsmethoden Lösungen hitzeempfindlicher Stoffe werden in der Regel durch Sterilfiltration entkeimt. Hierbei werden engporige Filter verwendet, deren Poren eine definierte Größe aufweisen (∅ z.B. 0,2 µm). Die in einer Flüssigkeit enthaltenen Mikroorganismen werden an der Filteroberfläche zurückgehalten. Das in einem sterilen Gefäß aufgefangene Filtrat ist frei von Mikroorganismen (Ausnahme: Viren). Spezielle Bakterienfilter sind im Handel erhältlich. Sterilfiltrationen können auch mittels Membranfiltergeräten vorgenommen werden. Auch chemische Mittel werden zur Sterilisation bzw. Desinfektion eingesetzt. Die gebräuchlichsten sind 70%iger Alkohol (z.B. Ethanol, Isopropanol) und 10%iges Formalin. Diese Stoffe bewirken das Fällen von Eiweißen. Von Bedeutung sind auch das Phenol und seine Derivate (z.B. Sagrotan), deren Angriffspunkt die Cytoplasmamembran ist. Das gasförmige, mit Luft leicht entflammbare Ethylenoxid wird bei der Sterilisation von Nahrungsmitteln, Medikamenten und Kunststoffgeräten (z.B. Plastikpetrischalen) verwendet. Dieser sehr giftige Stoff - er wird mit CO2 oder N2 gemischt - wirkt nur, wenn Wasser zugegen ist. Zum Abtöten von Mikroorganismen in Raumluft und auf Oberflächen wird häufig UV-Strahlung eingesetzt. Sie wirkt jedoch nur im direkt angestrahlten Bereich von Räumen. Die UV-Strahlen schädigen die Erbsubstanz und töten auf diese Weise Mikroorganismen ab. Besonders wirksam ist UV-Strahlung aus dem Wellenlängenbereich um 260 nm.

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1.4 Kulturgefäße Die der Züchtung von Mikroorganismen dienenden Gefäße werden als Kulturgefäße bezeichnet. Einige zur Kultur kleinerer Mengen von Mikroorganismen verwendete Gefäße sollen im folgenden beschrieben werden.

Abb. 1.4 Gießen von Agarplatten Petrischalen sind aus Boden und Deckel bestehende Doppelschalen. Meistens werden Schalen mit 9-10 cm Bodendurchmesser verwendet. Sie werden mit 15-20 ml Nährboden beschickt. In der Regel bewahrt man eine größere Anzahl bereits sterilisierter Nährbodenportionen in Röhrchen abgefüllt im Kühlschrank auf, um sie bei Bedarf zu verflüssigen (erhitzen) und dann in sterile Petrischalen zu gießen (Abb.1.4). Solche mit Nährboden beschickte Schalen werden Platten genannt. Da sich an der Innenseite des Schalendeckels und am Innenrand des Bodens nach dem Plattenguss Kondenswasser ansammelt und der Agar beim Abkühlen infolge Entquellung Wasser auspresst (Synäresewasser), müssen Agarplatten vor der Beimpfung in einem keimarmen, 37 - 40°C warmen Trockenschrank 30-60 Minuten getrocknet werden. Dabei werden Boden und Deckel getrennt und mit den Öffnungen nach unten schräg aufgestellt (Abb.1.5). Werden nasse Platten nicht getrocknet, so können nach Beimpfen keine deutlich voneinander abgegrenzten Kolonien entstehen (s. Kap.4.1), da das Kondenswasser Bakterien abschwemmt und die Bakterien selbst sich in dem Feuchtigkeitsfilm durch Schwimmen ausbreiten können. Um beimpfte Platten vor herabtropfendem Kondenswasser zu schützen, werden Petrischalen mit der Bodenseite nach oben aufbewahrt.

Abb. 1.5: Aufstellen von Agarplatten zum Trocknen bei 40°C.

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Kulturröhrchen besitzen im Gegensatz zu Reagenzgläsern eine dickere Wand und einen geraden Rand (Abb.1.6). Sie werden mit luftdurchlässigem Material (Watte, Zellstoff) oder Leichtmetallkappen (z.B. Kapsenbergkappen), die der Röhrchenöffnung elastisch anliegen, verschlossen. Zwischen Gefäßwand und Kappenrand darf sich keine Flüssigkeit ansammeln, da diese den Gasaustausch behindern und zudem zur Infektionsquelle für den sterilen Röhrcheninhalt werden könnte. Abb. 1.7 zeigt, wie man Verschlüsse aus Watte bzw. Zellstoff herstellen kann.

Abb. 1.6: Kulturröhrchen mit Kapsenbergkappe bzw. Zellstoffstopfen.

Abb. 1.7: Herstellung von Watte- oder Zellstoffverschlüssen für Röhrchen

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Abb. 1.8: Kulturröhrchen. A Hoschichtröhrchen, B Herstellen eines Schrägagarröhrchens. Kulturröhrchen können mit festen, halbfesten oder flüssigen Nährmedien beschickt werden. Die Röhrchen werden anschließend in Bechergläsern, deren Boden mit Watte gepolstert wurde oder in besonderen Metallgestellen aufbewahrt. Für einen sicheren Stand sorgen auch Holzklötze, die mit etwa 6 cm tiefen Bohrungen von ca. 18 mm Durchmesser versehen wurden. Hochschichtröhrchen dienen der Bevorratung von abgemessenen, sterilen Nährbodenmengen (Abb.1.4) oder dem Anlegen von Stichkulturen. Schrägagarröhrchen enthalten etwa 5-7 ml in schräger Lage erstarrten Nährboden (Abb.1.8). Dadurch steht beim Beimpfen eine größere Oberfläche zur Verfügung. Flüssigkeitskulturen aerober Mikroorganismen werden vorzugsweise in Erlenmeyerkolben, Steilbrustflaschen und Kulturkolben (Fernbachkolben) angelegt (Abb.1.9). Die große Grenzfläche zwischen Kulturmedium und Luft erleichtert den Gasaustausch und begünstigt so das Wachstum der Kultur. Die genannten Kulturgefäße können sowohl mit Watte- und Zellstoffstopfen als auch mit entsprechenden Metallkappen verschlossen werden.

Abb. 1.9: Verschiedene Typen von Kulturflaschen. Die Zahlenangaben beziehen sich auf die am häufigsten verwendeten Größen (Nenninhalt).

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1.5 Impftechniken In der Mikrobiologie versteht man unter Impfen die Übertragung lebender Mikroorganismen auf oder in ein Nährmedium. Dabei bedient man sich verschiedener Impfgeräte (Abb.1.10).

Abb. 1.10: Impfgeräte für die Übertragung von Mikroorganismen. Die Impföse besteht aus einem 5-6 cm langen Draht aus Platin-Iridium oder einer hitzebeständigen Stahllegierung. Der Draht ist am Vorderende zu einem Ring gebogen, der je nach Durchmesser und Drahtdicke verschiedene Flüssigkeitsmengen aufnehmen kann:

Tab. 1.4: Fassungsvermögen von Impfösen

Ösendurchmesser (in mm) Flüssigkeitsmengen (in mm³)

2 3 4

2 5

7,5 Mit der Impföse werden vorwiegend Agarnährböden und kleinere Mengen flüssiger Nährmedien beimpft. Die Öse wird vor und nach Gebrauch in der Entleuchteten, prasselnden Brennerflamme ausgeglüht. Man hält den Kollerhalter dabei fast senkrecht und bewegt die Öse im äußeren (oxidierenden) Teil der Flamme langsam auf und ab (Abb.1.11). Die Hitze soll auch den Raum unter der Überwurfmutter erreichen, wo sich Keime ansammeln können. In gleicher Weise müssen die Teile des Kollerhalters, die beim Impfen mit dem Kulturgefäß in Berührung kommen könnten, abgeflammt werden, aber ohne den Halter zu überhitzen. Vorsicht ist geboten, wenn nach dem Impfen noch größere Mengen von Mikroorganismen an der Öse haften. In diesem Fall wird die Öse zunächst über der Brennerflamme getrocknet oder in 70%igen Alkohol getaucht und erst dann ausgeglüht, um ein Verspritzen noch lebenden Impfmaterials und die Bildung eines keimhaltigen Aerosols zu vermeiden.

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Abb. 1.11: Trocknen (1) und Ausglühen (2) der Impföse in der Brennerflamme.

Der Drigalski-Spatel dient der gleichmäßigen Verteilung von Impfmaterial (z.B. einer Bakteriensuspension) auf einer festen Nährbodenoberfläche (Spatelplatten-Methode). Spatel werden zur Sterilisierung in 70%igen Alkohol getaucht und danach abgeflammt. Impfgeräte sind nicht auf den Arbeitsplatz zu legen, sondern auf- rechtstehend in einem mit passenden Bohrungen versehenen Holzblock aufzubewahren.

Definierte Mengen von Mikroorganismensuspensionen und Verdünnungsmedien werden mit sterilen Pipetten aufgezogen und übertragen. Die Pipetten werden vor dem Sterilisieren (bei trockener Hitze oder gespanntem Dampf) am oberen Ende ("Mundstück") mit einem etwa 2 cm langen, lockeren Wattepfropfen versehen, damit beim Ablassen der Flüssigkeit mit der nachströmenden Luft keine Keime in den Innenraum der Pipette gelangen. Beim Pipettieren von Flüssigkeitskulturen und gefährlichen Materialien verwendet man einen Pipetierball (z.B. Peleus-Ball). Pipetten werden nach Gebrauch in einen mit 70%igem Alkohol oder Desinfektionslösung gefüllten Glaszylinder gestellt.

Einige grundlegende Impftechniken sollen im folgenden dargestellt werden.

I. Übertragung von Mikroorganismen aus einem Kulturröhrchen auf eine Agarplatte mit der Öse (Abb.1.12 u.1.13) Material: Schrägagarkultur, Agarplatte, Brenner, Impföse, Reagenzglasständer, Filzschreiber Ausführung: a) Röhrchen in die linke Hand, Impfgerät zwischen Daumen, Zeige- und Mittelfinger der rechten Hand nehmen

(Schreibhaltung). b) Öse und unteren Teil des Kollerhalters ausglühen bzw. abflammen. c) Verschluss des Röhrchens, mit dem Handrücken nach unten, zwischen Mittel- und Ringfinger der rechten Hand nehmen

und entfernen, ohne ihn abzulegen. Sofort die Öffnung des waagerecht gehaltenen Röhrchens abflammen. d) Impföse ohne Randberührung einführen, abkühlen lassen und das Bakterien- oder Sporenmaterial entnehmen. e) Nach Abflammen der Öffnung und des Verschlusses das Röhrchen verschließen und wegstellen. f) Mit der linken Hand den Deckel der Petrischale auf einer Seite anheben und Impfmaterial in Schlangenlinie auf Nährbodenoberfläche ausstreichen, Deckel wieder schließen. g) Öse trocknen, ausglühen und den Halter wegstellen. h) Schale mit dem Boden nach oben aufstellen und beschriften (Kennzeichnung des Mikroorganismus, Datum/Uhrzeit, evtl. Kulturbedingungen und Name der Person, die die Überimpfung vornahm ).

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II. Überimpfung von Mikroorganismen aus einem Kulturröhrchen in ein anderes mittels Öse (Abb.1.14) Material. Schrägagarkultur, frisches Schrägagarröhrchcn, Brenner, Impföse, Reagenzglasständer Ausführung: 1.) Beide Röhrchen in die linke Hand nehmen. 2.) Impfgerät sterilisieren (wie oben angegeben). 3.) Die beiden Röhrchenverschlüsse mit dem 3. und 4. bzw. dem 4. und 5 Finger nacheinander entfernen und in der Hand behalten. Öffnungen der beiden Röhrchen abflammen. 4.) Mit der abgekühlten Öse Impfmaterial aus dem einen Röhrchen entnehmen und auf der Nährbodenoberfläche des anderen Röhrchens in Schlangenlinie ausstreichen. 5.) Öffnungen sowie Verschlüsse abflammen und Röhrchen verschließen. 6.) Öse trocknen, ausglühen und Halter wegstellen. 7.) Das beimpfte Röhrchen beschriften.

Abb. 1.14: Überimpfen von Mikroorganismen aus einem Röhrchen in ein anderes mittels Impföse.

III. Verteilen von Mikroorganismen auf einer Agaroberfläche mit Hilfe des Drigalski-Spatels (Spatelplatten-Methode) Material: Mikroorganismensuspension, Agarplatte mit trockener Oberfläche, Gefäß mit 70%igem Alkohol, sterile 0,1 ml-Pipette, Pipettier-Ball, steriler Spatel, Brenner Ausführung: 1.) Röhrchen mit der Suspension in die linke Hand, die Pipette in die rechte Hand nehmen. 2.) Mit dem 3. und 4. Finger der rechten Hand den Verschluss des Röhrchens entfernen. 3.) Öffnung des Röhrchens und unteren Teil der Pipette kurz abflammen. 4.) Pipette in das Gefäß einführen und 0,1 ml Suspension aufziehen. 5.) Röhrchen verschließen und wegstellen. 6.) Mit der linken Hand Deckel der Petrischale anheben und Suspension in 3-4 Tropfen portioniert auf die Agaroberfläche tropfen. 7.) Pipette in Alkohol stellen und die aufgetragene Suspension sofort etwa 30 s lang ausstreichen. Dabei die Platte fortwährend drehen und den Spatel in radialen Bahnen hin- und herschieben. 8.) Glasspatel in Alkohol stellen. 9.) Platte verschließen, auf der Bodenseite beschriften und auf dem Deckel stehend aufbewahren. Die Beherrschung der hier dargestellten Impftechniken wird in späteren Kapiteln vorausgesetzt. Eine besondere Impftechnik ist die von Lederberg entwickelte Stempelmethode, die es erlaubt, alle auf einer Platte (Mutterplatte) vorhandenen Kolonien von Mikroorganismen, Koloniemuster genannt, auf frische Platten (Tochterplatten) zu überimpfen. Bis zu 100 Kolonien können so in einem einzigen Impfvorgang übertragen werden. Diese Überimpfung erfolgt mit dem sogenannten Ledercke-Stempel, den man sich wie folgt herstellen kann (Abb.1.15):

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Abb. 1.15: Ledercke-Stempel für die Überimpfung von Koloniemustern. Erklärung im Text.

Die Fläche eines zylindrischen Holzblocks, Durchmesser 80 mm, Höhe 50 mm, mit einem im Autoklaven sterilisierten feinflorigen Samttuch der Größe 15 x 15 cm fest bespannen. Dabei die Ränder des Samtstücks mit einem vorgefertigten, sterilen Metallring (z.B. Drahtring) seitlich am Holzblock festklemmen. Am Ring eine Markierung anbringen. Jedes der Samthaare hat die Funktion einer winzigen Impföse, die Bakterienmaterial aufnimmt und auf frischen Nährboden überträgt. Im folgenden wird der Arbeitsgang bei der Stempelmethode kurz dargestellt:

a) Brenner mit nichtleuchtender Flamme in der Nähe des Stempels aufstellen. b) An der Mutterplatte (master plate), und zwar am Rand des Schalenbodens, Markierung anbringen. c) Die Nährbodenoberfläche der bewachsenen Mutterplatte von oben her, so dass die Markierungen an Metallring und Schale übereinanderstehen, leicht auf die Samtfläche des Stempels drücken. d) Die frischen Tochterplatten, die in gleicher Weise wie die Mutterplatte mit einer Markierung versehen wurden, nacheinander auf die Samtfläche drücken. Auch hierbei müssen die Marken an Stempel und Platten überein- anderstehen. Die letzte Tochterplatte dient als Kontrolle. Sie enthält den gleichen Nährboden wie die Mutterplatte und wird in der gleichen Weise bebrütet. Nur wenn diese Kontrollplatte nach Bebrütung das gleiche Koloniemuster wie die Mutterplatte zeigt, kann man davon ausgehen, dass dieses Muster auch auf die übrigen Tochterplatten überimpft wurde. Die überimpften Mikroorganismen können unterschiedlichen Wachstumsbedingungen ausgesetzt werden (Nährbodenzusammensetzung, Temperatur, Belüftung, Hemmstoffzusatz u.a.). Auf den entsprechenden Tochterplatten werden nur die Kolonien derjenigen Bakterien erscheinen, die unter den vorgegebenen Bedingungen wachsen können. Lücken im Koloniemuster erlauben dann Rückschlüsse auf entsprechende physiologische Ansprüche oder andere Eigenschaften.

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1.6 Kulturtechniken Die Kultivierung von Mikroorganismen umfasst in der Regel zwei Schritte: 1. Beimpfung des sterilen Nährmediums mit einer kleinen Keimmenge, Inokulum oder

Einsaat genannt, 2. Bereitstellung der notwendigen Wachstumsbedingungen. Neben der Temperatur spielt die Sauerstoffversorgung eine wichtige Rolle. Man unterscheidet zwischen aeroben und anaeroben Kulturverfahren.

Aerobe Kulturverfahren dienen der Züchtung von Mikroorganismen, die entweder als obligate Aerobier nur zur Atmung oder als fakultative Anaerobier sowohl zum Atmungs- als auch zum Gärungsstoffwechsel befähigt sind. Den an der Oberfläche von Nährmedien wachsenden Mikroorganismen steht genügend Sauerstoff zur Verfügung. Solche OberfIächenkulturen werden in der Regel auf festen Nährböden (Platten, Schrägagar) oder als Deckenkulturen an der Oberfläche von Nährlösungen angelegt, was besonders für die Kultivierung von Pilzen gilt. Diese Pilzdecken bestehen aus einem stark verflochtenen Mycel, das sich aber nur dann bilden kann, wenn die Kulturflüssigkeit nicht geschüttelt wird. Auch aerobe Bakterien können geschlossene Decken entwickeln, die durch Verkleben der Zellen infolge Schleimbildung entstehen und Kahmhäute genannt werden. Während der Sauerstoff bei Oberflächenkulturen leicht ins Zellinnere gelangen kann, ist die Diffusion dann sehr stark behindert, wenn die Zellen in einer Nährlösung wachsen. In einer solchen Submerskultur entstehen infolge der Sauerstoffzehrung unter der Flüssigkeitsoberfläche alsbald anaerobe Bedingungen. Aerobe Mikroben lassen sich daher nur dann submers züchten, wenn für eine fortlaufende Sauerstoffversorgung gesorgt wird. Hierzu wird eine im Verhältnis zum Flüssigkeitsvolumen große Phasengrenzfläche zwischen Luft und Nährmedium geschaffen. Dafür bieten sich folgende Techniken an:

1. Kultur in flacher Schicht (Abb.1.16 A), 2. Schütteln oder Rollern, was eine fortlaufende Erneuerung der Grenzschicht bewirkt (Abb.1.17 A bzw. C), 3. Einleitung von entkeimter Luft in die Nährlösung (submerse Belüftung, Abb.1.17 B).

Verschiedene Formen der submersen Belüftung werden bei der Kultivierung von Mikroorganismen in Fermentern (Tanks mit einem Fassungsvermögen bis zu 1000 hl Nährlösung) angewandt.

Bei den anaeroben Kulturverfahren erfolgt die Züchtung der Mikroorganismen in einer nahezu sauerstofffreien Atmosphäre. Diese Organismen, es handelt sich um die obligat anaeroben und fakultativ anaeroben Formen, gewinnen unter diesen Bedingungen die notwendige Energie in der Regel auf dem Weg der Gärung. Fakultativ anaerobe Mikroorganismen werden oft in Röhrchen, die bis zu 2/3 ihres Volumens mit Nährlösung gefüllt sind, gezüchtet. Über die kleine Phasengrenze zwischen Medium und Luft kann nur wenig Sauerstoff eindringen, so dass am Grund des Gefäßes anaerobe Bedingungen herrschen (Kultur in hoher Schicht, Abb.1.16 C). Das anaerobe Milieu in einem Hochschichtröhrchen kann noch besser geschützt werden, wenn bei der Züchtung anaerober Mikroorganismen anstelle eines flüssigen Substrates Nähragar verwendet wird.

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Abb. 1.16: Einfache aerobe und anaerobe Kulturverfahren. Stichkulturen verraten, ob ein Mikroorganismus aerob (D), fakultativ anaerob (E) oder obligat anaerob (F) ist. Ein beimpfter Hochschichtagar kann noch mit sterilem Agar oder Paraffinöl überschüttet werden (0). Weitere Erklärungen im Text. Dieser wird entweder im noch flüssigen Zustand, d.h. bei 46°C, mit dem Impfmaterial durch Schütteln vermischt (Schüttelagar-Kultur) oder nach Erstarren durch Einstich mit einer Nadel beimpft (Stichkultur, Abb.1.16 D-G). Überschichtet man den beimpften Agar noch mit sterilem Agar oder Paraffinöl, so entsteht eine zusätzliche Barriere gegen den Luftsauerstoff (Abb.1.16 G). Stichkulturen werden häufig angelegt, um zu erkunden, ob ein Mikroorganismus aerob, fakultativ anaerob oder obligat anaerob ist. Der betreffende Keim entwickelt sich nach Überimpfung in dem Teil des Hochschichtagars, erkennbar am Abstand der Trübungszone (Wachstumszone) von der Substratoberfläche, in dem die für ihn günstigste Sauerstoffspannung herrscht (Abb.1.16 D-F). Nichtgasbildende Anaerobier können auch in luftblasenfrei verschlossenen Flaschen gezüchtet werden (Flaschenkultur, Abb.1.16 B).

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Abb.1.17: Einrichtungen für die Belüftung und Bewegung von Submerskulturen. A. Schüttelapparatur (Horizontalschüttler); Kulturflaschen

sind zwecks stärkerer Turbulenz oft mit Einbuchtungen (Schikanen) versehen (siehe Grundriss oben mitte). B Belüftung mit Hilfe einer

Aquarienpumpe. Zur Luftentkeimung können Waschflaschen mit Kaliumpermanganat (1 %) und Sublimat (0,1 %) vorgeschaltet werden. C

Rollerapparatur zum Selbstbau. Für die Kultur im sauerstofffreien Raum verwendet man in der Regel spezielle Anaerobentöpfe, aus denen der Sauerstoff entweder durch Absaugen oder durch Verdrängen mit Stickstoff, Wasserstoff oder Edelgasen unter Zugabe von 5 Vol.% Kohlendioxid entfernt wurde. Der Sauerstoff kann außerdem auf chemischem Wege mit Hilfe eines Absorptionsmittels wie z. B. alkalischem Pyrogallol und auf biologischem Wege mittels fakultativ anaerober Mikroorganismen, die zusammen mit den obligat anaeroben Keimen kultiviert werden, aus dem Kulturgefäß entfernt werden. Einige dieser anaeroben Verfahren werden bei der Anreicherung und Züchtung von Clostridien angewandt.

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1.7 Beschaffung und Aufbewahrung von Mikroorganismen Die für Praktika benötigten Mikroorganismen sollten von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) oder einer anderen zuverlässigen Quelle bezogen werden. Manche Stämme können auch im Praktikumsverlauf aus dem Boden, dem Wasser und der Luft isoliert werden. Die Gefahr der Isolierung pathogener Keime kann eingeschränkt werden, wenn man die Anreicherungskulturen bei Raumtemperatur, d.h. bei etwa 21°C, bebrütet. Grundsätzlich müssen alle unbekannten und noch nicht sicher bestimmten Isolate wie pathogene Formen behandelt werden. Auch beim Umgang mit Kulturen von Mikroorganismen, die als nichtpathogen gelten, ist zu bedenken, dass Zellen infolge Mutationen ihr Verhalten so verändert haben könnten, dass sie nunmehr für den Menschen gefährlich sind oder dass die Kulturen möglicherweise durch pathogene Formen verunreinigt wurden. Folgende Mikroorganismen werden als nahezu ungefährlich angesehen und können unter Beachtung der entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen auch in Schulen verwandt werden': 1. Bakterien: Acetobacter aceti (Essigsäurebakterium), Bacillus subtilis ("Heubazillus"), Janthinobacterium lividum (= Chromobacterium lividum), Erwinia carotovora, Escherichia coli (nur spezielle Stämme!), Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens, Rhizobium leguminosarum (Knöllchenbakterium), Spirillum serpens, Staphylococcus warneri (= Staphylococcus albus), Staphylococcus epidermidis, Streptococcus lactis, Streptomyces griseus, Vibrio natriegens (= Beneckea natriegens) 2. Pilze: Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Botrytis cinerea (Grauschimmel), Chaetomium-globosum, Coprinus lagopus, Fusarium solani, Mucor hiemalis, Mucor mucedo, Penicillium notatum, Phycomyces blakesleeanus, Pythium debaryanum, Phytophthora infestans, Rhizopus sexualis, Rhizopus niger (= Rhizopus stolonifer), Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces ellipsoideus, Saccharomyces pombe, Saprolegnia litoralis, Sordana fimicola 3. Viren: Bacteriophagen (T-Typ bei E. coli) Die Liste erfasst nicht sämtliche für die Schule bzw. ein Anfängerpraktikum geeigneten Mikroorganismen, sondern berücksichtigt nur jene, die in Großbritannien im Rahmen von Science Teaching Projects eingesetzt werden und sich dabei bewährt haben. Gleichwohl sei darauf hingewiesen, dass auch die hier erwähnten Schimmelpilze, vor allem die Aspergillen und Köpfchenschimmel, mit Vorsicht zu behandeln sind. So muss z. B. im Hinblick auf mögliche Infektionen der Luftwege, Allergien und Kontaminationen des Arbeitsraumes vermieden werden, dass beim Öffnen von Kulturgefäßen größere Sporenmengen eingeatmet werden bzw. in die Raumluft gelangen. Für einführende mikrobiologische Untersuchungen eignen sich auch Bacillus megaterium und Bacillus cereus var. mycoides ("Wurzelbazillus") sowie Schwefelbakterien, ebenso einige bei der Lebensmittelbereitung genutzte Mikroorganismen wie z. B. Penicillium camemberti, P. roqueforti und die zur Herstellung von Sauermilchprodukten verwendete Milchsäurebakterien.

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Abb. 1.18: Sicherung der Stammkultur und Anlegen von Gebrauchskulturen. Mikroorganismen werden in der Regel in Form von Stammkulturen verfügbar gehalten. Dazu überimpft man die Keime am besten in Stichröhrchen (Abb. 1.16 und 1.18), die man anschließend, z. B. bei Raumtemperatur, bebrütet. Nach Anwachsen der Kultur werden die Röhrchen luftdicht verschlossen (Plastikklebeband um Kapsenbergkappe, steriler Gummistopfen, in verflüssigtes Paraffin getauchter Watte- oder Zellstoffstopfen). Stichröhrchen sind vorteilhafter als Schrägagarröhrchen, weil der Nährboden nicht so schnell austrocknet und der Bewuchs schwächer ist. Infolgedessen werden weniger Nährstoffe verbraucht und geringere Mengen schädlicher Stoffwechselprodukte gebildet. Hinzu kommt, dass Zellen im sauerstoffarmen Stichkanal länger leben. Als Nährböden für Stammkulturen von Bakterien eignen sich vor allem kohlenhydratarme Medien. Auf solchen Substraten produzieren Bakterien nur kleine Säuremengen, so dass der pH-Wert nicht bedrohlich absinken kann. Als wirksames Verfahren für die Sicherung von Stammkulturen gilt das sogenannte Oil Sealing. Hierbei werden die Kulturen, sobald sie reichliches Wachstum zeigen, mit Paraffinöl, das zuvor 3 h bei 160 °C trockensterilisiert wurde, überschichtet. Stammkulturen können in der Regel mehrere Wochen im Kühlschrank (nicht zusammen mit Lebensmitteln!) oder bei Raumtemperatur aufbewahrt werden. Sie müssen aber nach einem festen Zeitplan, in der Regel etwa alle vier Wochen, auf frischen Nährboden übertragen und so erneuert werden. Ab und zu sollte durch Ausstrich getestet werden, ob die Kulturen nicht mit fremden Keimen verunreinigt sind. Mikroorganismen können auch in Form von Stammkonserven bereitgehalten werden. Bei der Konservierung werden die Zellen durch Trocknen oder Tiefgefrieren in einen Ruhezustand versetzt, der weder Lebensvorgänge noch Mutationen zulässt. Das Verfahren erfordert allerdings einen hohen technischen Aufwand und wird daher nur bei großen Stammsammlungen, z.B. bei der DSMZ, angewandt.

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2.0 Allgemeine Grundlagen: 2.1 Bunsenbrenner (Ausglühen und Abflammen) Zum Ausglühen und Abflammen benutzt man einen Bunsenbrenner (Abb.2.1). Ist kein Gasanschluss vorhanden, so kann man einen Kartuschenbrenner (Campingbrenner) verwenden, den man auf eine Propan- oder Butangas- Kartusche aufsetzt. Vor Benutzung stellt man die Luftzufuhr am Bunsenbrenner so ein, dass eine nichtleuchtende, rauschende Flamme mit einem hellblauen Innenkegel und einem blasseren, dunkelblauvioletten Außenkegel entsteht (Abb.2.2). Der Innenkegel ist im Innern verhältnismäßig kalt (ca. 300°C), während im Außenkegel Temperaturen bis zu 1500°C erreicht werden.

Abb. 2.1: Bunsenbrenner mit Wipphahn

Ausglühen: Durch das Ausglühen im äußeren Teil des Außenkegels der Bunsenbrennerflamme werden Impfösen - und -nadeln schnell und zuverlässig sterilisiert. Die dabei erreichten Temperaturen von über 1000°C (Gelbglut) töten die Mikroorganismen in Sekundenbruchteilen ab. Auch andere Instrumente aus Metall, z.B. Präpariernadeln, Pinzetten, Scheren oder Skalpelle, kann man im Notfall durch Ausglühen sterilisieren, jedoch leidet das Material sehr stark , besonders die Schneidschärfe von Klingen. Vor der Benutzung müssen die Instrumente abgekühlt werden, damit sie keine Zellen schädigen oder thermolabile Substanzen schädigen.

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Abb. 2.2: Ausglühen der Impföse in der Bunsenbrennerflamme Abflammen: Es ist weitverbreitete Praxis, Metall-, Glas- und Porzellangeräte abzuflammen, um sie oberflächlich zu sterilisieren. Pinzetten, Spatel, Scheren oder Skalpelle werden kurze Zeit in die Flamme gehalten, ohne sie zum Glühen zu bringen; Filtrationsgeräte werden vor der Filtration mit der Bunsenbrennerflamme bestrichen. Der Erfolg dieser Methode ist jedoch zweifelhaft, da Temperaturen und Einwirkzeit oft nicht ausreichen, um alle Keime abzutöten. Dies gilt besonders für raue Oberflächen, in deren Spalten und Poren die Mikroorganismen vor der Flamme geschützt sind. Auch das Eintauchen in 96%igen Ethanol und anschließende Abbrennen des anhaftenden Alkohols bewirkt keine sichere Sterilisation. Beide Verfahren stellen daher nur einen Notbehelf dar. Bei ihrer Anwendung ist zu beachten, dass die Geräte vor der Benutzung genügend abgekühlt seien müssen. Besser ist es aber in jedem Falle, die benötigten Geräte im Autoklaven oder Heißluftsterilisator zu sterilisieren.

Auch das Abflammen sterilisierter Pipetten und der Öffnungen von Kulturgefäßen beim Überimpfen ist in der Regel überflüssig und allenfalls gerechtfertigt, um störende Wattefäden abzubrennen. Es reduziert nicht nennenswert die Kontaminationsgefahr, sondern kann sie durch die dabei auftretenden Luftbewegungen sogar erhöhen. Aus demselben Grunde bringt es keinen Vorteil, Kulturgefäße oder Pipettenbüchsen über der Flamme zu öffnen. Watte- und Zellstoffstopfen sollte man auf keinen Fall abflammen, da dabei Verbrennungsprodukte entstehen, die ins Nährmedium gelangen und das Wachstum der Mikroorganismen hemmen können; außerdem geraten zu locker gefertigte Wattestopfen beim Abflammen leicht in Brand.

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2.2 Umgang mit dem pH-Meter Eichung des pH-Meters 1. pH-Elektrode mit dem Messgerät verbinden, Messgerät einschalten, 2. Elektrode entnehmen und gründlich mit A.dest. abspülen, 3. Pufferlösungen und Elektrode temperaturmäßig angleichen. Temperatur messen und mit dem geeigneten Drehregler am pH-Meter einstellen. 4. Elektrode in den „Nullpuffer“ (6,9 oder 7,0 o.ä.) geben, gleichmäßig langsam drehen, bis eine stabile Anzeige erscheint, 5. mit dem Stellknopf „ pH“ oder „Nullpunkt“ (je nach Gerät) den auf der Pufferlösung angegebenen Wert (6,9 oder 7,0 o.ä.) am pH-Meter einstellen, 6. Elektrode entnehmen und mit A. dest. abspülen, � wenn der pH-Wert der Lösung auf einen alkalischen Wert eingestellt werden soll: Pufferlösung für den alkalischen Bereich nehmen (9,0 oder 9,2 o.ä.), pH-Elektrode langsam bewegend eintauchen und den vorgegebenen Wert mit dem Stellrad „Steilheit“ , „Slope“ oder „mV/pH“ einstellen; � wenn der pH-Wert der Lösung auf einen sauren Wert eingestellt werden soll: Pufferlösung für den sauren Bereich nehmen (4,0 o.ä.), pH-Elektrode langsam bewegend eintauchen und den vorgegebenen Wert mit dem Stellrad „Steilheit“ , „Slope“ oder „mV/pH“ einstellen; � ist der pH-Wert der Probe noch unbekannt: ist noch unbekannt, ob der pH-Wert der Probe im alkalischen oder sauren Bereich liegt, so kann zur richtigen Einstellung der Steilheit so verfahren werden, dass man die auf den Nullpunkt geeichte Elektrode in die Probelösung taucht und die Tendenz abliest und demgemäss den zweiten Puffer wählt; als weitere Möglichkeit bietet sich an, den ungefähren pH-Wert mit Hilfe eines Teststäbchens zu erfassen. 7. zur Kontrolle kann der Eichvorgang wiederholt werden. Messung des pH-Wertes: a) Elektrode entnehmen und mit A..dest. spülen; b) Puffergefäß verschließen und wegstellen; c) pH-Elektrode in die Probelösung eintauchen und dort (nach Temperaturangleich) langsam gleichmäßig bewegen (oder durch ein Rührwerk die Probe anströmen lassen), bis sich ein stabiler Messwert ergibt; d) Messwert(e) notieren und Gerät ausschalten. Reinigung der Elektrode: ���� nach dem Messvorgang die Elektrode entnehmen und gründlich mit A. dest. spülen; ���� enthält das Messgut der Probe Eiweißbestandteile, wird die Elektrode nach dem Abspülen eine Stunde lang in eine Pepsinlösung gestellt, anschließend wird gründlich mit A..dest. abgespült; stärker anhaftender Schmutz kann mit einer weichen Bürste oder mit weichem Papier und einer verdünnten Spülmittellösung vorher entfernt werden. Aufbewahren der Elektrode: ���� zur Aufbewahrung wird die Elektrode mit einer mit 3M KCl-Lösung gefüllten Kunststoffkappe bedeckt: ���� Elektroden mit Schliff werden mit einem entsprechenden mit 3M KCl gefüllten Messkolben aufbewahrt.

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2.3 Umgang mit dem Mikroskop Mikroskopieren mit der Ölimmersion Einstellen des Mikroskopes: Der Objektträger wird auf dem Kreuztisch eingespannt und durch Drehen an den Bedienungsschrauben in das aus dem Kondensor austretende Lichtbündel gebracht. Mit der Grob- und Feineinstellung am Mikroskopstativ wird das Präparat an das Objektiv (40x) herangeführt und die Bildebene scharf eingestellt. Nun senkt man den Kreuztisch ganz nach unten und dreht am Objektivrevolver das Objektiv (Oel/100x) ein - mit diesem Objektiv wird in der Mikrobiologie (Bakteriologie) stets mikroskopiert. Jetzt wird bei abgesenktem Kreuztisch auf das Präparat ein sehr kleiner Tropfen Immersionsöl gebracht. Dann wird der Kreuztisch durch Drehen am Grob- bzw. Feintrieb vorsichtig gehoben, bis die Frontlinse des Objektives in das Öl eintaucht und den Objektträger fast berührt.

► Eintauchen von der Seite beobachten -- Abstand der Frontlinse vom Objektträger etwa 0,1 mm ◄ Während man durch das Okular blickt wird der Kreuztisch langsam mit dem Feintrieb bewegt.

( -- TIPP: Bewegen Sie den Kreuztisch dabei leicht wechselweise von rechts nach links -- ) Sobald das Bild erscheint, wird scharf eingestellt. Dieses Vorgehen verhindert Beschädigungen von Objekt und Objektiv und ist infolgedessen stets anzuwenden. Nach Gebrauch ist das Immersionsobjektiv mit Linsenreinigungspapier und Mikroskop-Reinigungsflüssigkeit zu reinigen. Achtung: Alkohol und Spiritus dürfen in keinem Fall verwendet werden!

Abb. 2.3: Labormikroskop mit Phasenkontrasteinrichtung (Zeiss)

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Die häufigsten Störungen beim Mikroskopieren und ihre Ursachen: -- Das mikroskopische Bild ist schwarz. -- Mikroskopierlampe nicht eingeschaltet -- Mikroskopierlampe oder Sicherung im Mikroskop durchgebrannt -- Regeltransformator defekt -- Zuleitungskabel nicht richtig eingesteckt oder defekt -- Netzsicherung durchgebrannt oder Stromnetz ausgefallen -- Irisblende des Kondensors nicht ganz geöffnet (bei Phasenkontrast)

-- Das Sehfeld ist ungleichmäßig oder nur teilweise ausgeleuchtet. -- Objektrevolver oder Ringblendenrevolver nicht eingerastet -- Wechselkondensor nicht ganz eingeschoben -- Filterhalter unter dem Kondensor oder vor der Mikroskopierleuchte nicht bis zum Anschlag ein- geschwenkt -- Kondensorfrontlinse je nach benutztem Objektiv nicht (oder nicht völlig) ein- bzw. ausgeklappt -- Kondensor nicht zentriert oder nicht in der richtigen Höhe -- Leuchtfeldblende zu stark geschlossen -- Mikroskopierlampe nicht fest in der Fassung -- Mikroskopierlampe nicht zentriert.

-- Das Bild ist kontrastarm. -- Objektivlinse verschmutzt -- Kondensorblende zu weit geöffnet -- Leuchtfeldblende zu weit geöffnet Bei starken Trockenobjektiven außerdem: -- Deckglas vergessen -- Deckglas zu dick oder zu dünn -- zu viel Einschlussmittel Bei Immersionsobjekten außerdem: -- Immersionsöl vergessen -- Öltropfen zu klein: Ölverbindung zwischen Objektivfrontlinse und Deckglas abgerissen -- Objektivfrontlinse durch alte Ölrückstände verunreinigt -- Deckglas von falscher Dicke oder Brechzahl verwendet. -- Das Präparat lässt sich nicht scharfstellen. -- Objektträger mit dem Deckglas nach unten auf den Objekttisch gelegt -- zwei Deckgläser aufgelegt -- Deckglas viel zu dick -- viel zu viel Einschlussmittel -- Feineinstellung am Anschlag Bei Immersionsobjekten außerdem: -- Immersionsöl vergessen -- Öltropfen zu klein: Ölverbindung zwischen Objektivfrontlinse und Deckglas abgerissen -- Objektivfrontlinse durch alte Ölrückstände verunreinigt. -- Starke Unschärfe nach Objektivwechsel. -- Objektiv nicht ganz in den Revolver eingeschraubt -- vor dem Wechsel Objekttisch gesenkt. -- Unbewegliche, unscharfe Flecken oder Schatten im Bild. (wandern beim Verschieben des Präparats nicht mit) -- Staub oder Schmutz auf den optischen Flächen. -- „Mückensehen“ („Mouches volantes“) (unscharfe Flecken oder Fäden, die bei Änderung der Blickrichtung mitwandern) -- feine Trübungen im Glaskörper oder Schlieren in der Kammerflüssigkeit des Auges, die die Netzhaut verschattet.

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2.4 Herstellung von Nährböden Für das Praktikum gibt es fast alle Medien fertig gemischt als Trockenmedien. Hierbei handelt es sich um dehydrierte Produkte in Pulver- oder Granulatform, die zum Teil stark hygroskopisch sind. Diese Medien sind nach Lösen und Sterilisieren gebrauchsfertig, jedoch erfolgt die Zubereitung strikt nach den Packungsvorschriften der Hersteller. Im Folgenden werden die grundsätzlichen Schritte der Herstellung eines Trockenmediums beschrieben. (Abweichungen ergeben sich aus der Zielsetzung einer Untersuchung, sie sind der entsprechenden Versuchsvorschrift zu entnehmen.) -- Grundsätzlich müssen alle Geräte, die zum Zubereiten der Medien benutzt werden, gründlich gereinigt werden. Fabrikneue Gefäße werden erst mit verdünnter Salzsäure gereinigt und anschließend mit destilliertem Wasser gespült. -- Zur Nährbodenherstellung ist grundsätzlich sauberes, frisch destilliertes oder vollentsalztes Wasser zu verwenden. -- Die zur Entnahme des Trockenmediums benutzten Metallspatel oder Apothekerlöffel sollten vor Gebrauch in Ethanol getaucht und abgeflammt werden. a) Lösen des Trockennährmediums -- Zu der abgewogenen Trockennährbodenmenge gibt man etwa die Hälfte der erforderlichen Wassermenge zu; dann schüttelt man das Ansatzgefäß bis eine homogene Suspension entstanden ist. -- Nun gibt man die restliche Wassermenge so zu, dass die an der Innenwand des Gefäßes anhaftenden Bestandteile abgespült werden. -- Enthalten die Medien Agar-Agar oder Gelatine, so müssen sie zum Lösen erhitzt werden, dies erfolgt z.B. im Wasserbad für ca. 15 Minuten bei 100°C, durch Aufkochen auf einem heizbaren Magnet- rührer o.ä. Wichtig: Nährböden dürfen nicht mehr als unbedingt nötig erhitzt werden! -- Nährmedien ohne Agar-Agar oder Gelatine sind bereits bei leichter Erwärmung lösbar. -- Anschließend wird das Glasgefäß mit einer überlappenden Aluminiumfolie verschlossen und beschriftet (gegebenenfalls Kippautomat aufsetzen). Man achtet darauf, dass die zu sterilisierenden Ansätze nie mehr als die Hälfte des Volumens des Ansatzgefäßes ausmachen. b) Einstellung des pH-Wertes -- Bei gekauften Trockennährmedien kann auf eine pH-Einstellung bzw. -Korrektur meist verzichtet werden, durch die standardisierte Rezeptur garantiert der Hersteller pH-Schwankungen in engen Grenzen. -- Bei selbst hergestellten Nährsubstraten muss eine pH-Einstellung vor, manchmal auch nach der Sterilisation erfolgen. -- Die Messung und eventuell erforderliche Korrektur des pH-Wertes erfolgt bei festen Nährböden in geschmolzenen Zustand bei ca. 45°C, bei flüssigen Medien bei Raumtemperatur; grundsätzlich ist darauf zu achten, dass das Medium gelöst ist. -- Zum Einstellen des pH-Wertes verwendet man entweder eine 1 N NaOH oder zum Säuern eine 1 N HCl. ���� pH-Einstellung siehe: Umgang mit einem pH-Meter.

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c) Sterilisation Die Sterilisation erfolgt im Autoklaven. Hier erfolgt eine Hitzeabtötung von vegetativen und versporten Formen von Keimen in gespannten Dampf. Bedienungsanleitung: AUTOKLAV (alt) -- ca. 1,5 Liter A.dest. bis zum unteren Rand der Metallplatte in den Autoklav geben -- Heizung auf Stufe 1 zum Vorheizen -- alle Ventile geöffnet; Deckel geschlossen, jedoch nicht zugedreht -- unteres Ventil (am Schlauch) schließen: darauf achten, dass der Auffangeimer leer ist -- Sterilisiergut in den Autoklaven stellen -- Deckel fest verschließen -- Heizung auf Stufe 3 stellen (Kontrolllampe beachten - bei Versagen: Überlastungsschutzknopf wieder einrasten) -- wenn Temperatur von 100° Grad Celsius erreicht ist, oberes Ventil schließen -- bei 120° Grad Celsius oder 1bar Druck beginnt die Sterilisationszeit von 15 bis 29 Minuten (Uhr stellen),Heizung auf Stufe 1 zurückstellen -- nach 15 bis 20 Minuten: Heizung abstellen; der Autoklav muss bis auf ca. 95° Grad Celsius abgekühlt sein bevor er geöffnet wird -- unteres Ventil öffnen und warten, bis alles Wasser ausgetreten ist -- Ventil am Deckel öffnen, Deckel vorsichtig öffnen und Sterilisationsgut entnehmen. Nach dem Sterilisieren werden die Gefäße direkt aus dem Autoklaven genommen, unter kaltem Wasser rasch abgekühlt und in ein Wasserbad (55°C) gestellt. (siehe Anhang 5.7) d) Platten gießen -- Die Petrischalen werden zwischen 45°C und 55°C gegossen. Höhere Gießtemperaturen führen zu einer unerwünschten Kondenswasserbildung an den Schalendeckeln. -- Eventuell auftretende Luftblasen werden durch kurzes Befächeln mit der Bunsenbrennerflammenspitze (Vorsicht bei Plastikpetrischalen) beseitigt. -- Die Nährböden bei Raumtemperatur erstarren lassen, unterhalb 45°C werden die Nährböden fest. -- Die erstarrten Platten werden in umgekehrter Stellung gelagert. -- Vor Verwendung können feuchte Agar-Oberflächen bei ca. 40°C im Brutschrank (30 Minuten) getrocknet werden, dazu wird der Bodenteil der Petrischale mit der Innenseite nach unten auf den daneben liegenden Deckel aufgesetzt.

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2.5 Sterile-Werkbank Regeln für das Arbeiten an der Sterilen-Werkbank: -- Fenster und Türen des Labor sind geschlossen zu halten, eventuell vorhandene Raumbelüftung oder Klimaanlagen abzustellen. -- Der Ventilator der Werkbank wird mindestens 15 min vor Arbeitsbeginn eingeschaltet; er darf während der Arbeitspause nicht abgeschaltet werden. -- Während dieser Anlaufzeit desinfiziert und reinigt man alle Flächen des Arbeitsbereichs gründlich mit einem fusselfreien Tuch, das mit einem Flächendesinfektionsmittel, z.B. 70%igem Ethanol, getränkt ist. Gelegentlich sollte man auch das Schutzgitter mit dem Staubsauger vorsichtig absaugen. -- Man bringt alle benötigten Geräte vor Arbeitsbeginn in den Arbeitsraum; zuvor wischt man sie ebenfalls sorgfältig mit Alkohol ab. -- Auf der Arbeitsfläche der Werkbank dürfen nur die unbedingt erforderlichen Geräte aufgestellt werden, da sich an solchen Hindernissen Wirbel bilden, die eine Streuung von Aerosolen bewirken können. -- Die Luftabsaugschlitze am vorderen und hinteren Rand der Arbeitsfläche dürfen nicht zugestellt werden. -- Nicht mehr benötigte Geräte sowie Abfälle stellt man sofort auf eine Ablage außerhalb des Arbeitsbereichs. -- In der Werkbank sollte man möglichst keinen Brenner benutzen, auf keinen Fall aber einen einfachen Bunsenbrenner, da die durch die Flamme erzeugte Aufwärtsströmung den LF-Luftstrom stark beeinträchtigt. (Ähnliches gilt für alle anderen Wärmequellen und für Geräte mit starker Eigenbewegung, wie „Whirlimixer“, Rührer oder Zentrifugen.) Man arbeite nach Möglichkeit mit vorsterilisierten Einmalimpfgeräten aus Kunst- stoff. Falls erforderlich, verwende man einen elektrisch zündenden Sicherheitsbrenner. Die Arbeitsflamme darf nur dann brennen, wenn sie wirklich benötigt wird. -- Bleistift und Papier gehören nicht in den sterilen Arbeitsbereich. -- An der Werkbank dürfen sich nicht mehr Personen aufhalten als unbedingt erforderlich. -- An der Werkbank sollte man einen langärmligen Schutzkittel mit dicht schließenden Bündchen sowie Handschuhe tragen, die möglichst wenig Fasern abgeben. -- An Sicherheitswerkbänken darf man nur dann arbeiten, wenn sich die Frontscheibe in Arbeitsstellung befindet; sie darf auf keinen Fall weiter geöffnet werden. -- Der Kopf ist aus dem sterilen Raum herauszuhalten. Beim Sprechen, Husten oder Niesen sollte man sich unbedingt von der Werkbank wegdrehen. -- Man passiere nicht öfter als unbedingt nötig den Luftvorhang über der Arbeitsöffnung. -- Man lege die Unterarme nicht auf die Arbeitsplatte auf; die vorderen Lüftungsschlitze dürfen nicht verdeckt werden. -- Die Hände sollen sich möglichst immer in Luftstromrichtung hinter den kritischen Objekten oder Prozessen (stromaufwärts) befinden. Man sollte im sterilen Bereich auch nie von oben, sondern immer von der Seite oder von unten greifen. -- Man bewege sich an der Werkbank ruhig und überlegt. Man vermeide schnelle und hastige Bewegungen im Arbeitsbereich sowie starke Raumluftbewegungen vor der Arbeitsöffnung, z.B. durch vorbeigehende Personen oder durch das Öffnen und Schließen von Türen. -- An der Werkbank darf nicht gearbeitet werden, wenn optische oder akustische Signale eine Störung anzeigen.

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-- Nach Arbeitsende und Entfernung sämtlicher Geräte aus dem Arbeitsraum wird der Arbeitsbereich erneut desinfiziert und gereinigt. Der Ventilator soll noch etwa 5 min weiterlaufen.

Abb. 2.4: Sterile-Werkbank mit vertikaler Lamminar- Flow-Luftströmung (Sicherheitswerkbank der Sicherheitsklasse 2). Schematisch. A Seitlicher Längsschnitt. B Vorderansicht

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3.0 Allgemeine mikrobiologische Methoden: 3.1 Risikogruppen von Bakterien und Pilzen

Tab. 3.0: Eingruppierung von Bakterien und Pilzen in Risikogruppen1) (Auswahl)

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Tab. 3.0: Fortsetzung

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Abb. 3.0: Warnzeichen „Biogefährdung“ zur Warnung vor infektiösen Agenzien (schwarzes Symbol auf gelbem Grund; nach DIN 58956

Teil 10) Für den Umgang mit unbekannten, möglicherweise pathogenen Mikroorganismen sowie mit Mikroorganismen der Risikogruppe 2 (s. Tab.3.0) kommen zu den Grundregeln des sterilen Arbeitens noch Sicherheitsmaßnahmen der Schutzstufe 2 hinzu:

- Der Arbeitsraum sowie die Sicherheitswerkbank, Kühlschränke, Behälter, Kulturen und Geräte, von denen eine Infektionsgefahr ausgeht, sind mit dem Warnzeichen „Biogefährdung“ (Abb.3.0) auffällig zu kennzeichnen.

- Alle Flächen des Arbeitsraums müssen täglich desinfiziert werden. - Die Schutzkleidung darf nicht außerhalb des Sterilbereichs getragen werden. - Beim Arbeiten sind kräftige, dunkelgefärbte Schutzhandschuhe aus Latex zu tragen. - Arbeiten, bei denen erregerhaltige Aerosole auftreten können (und das gilt für fast alle Arbeiten

mit Mikroorganismen ), müssen in einer Sicherheitswerkbank der Klasse 2 durchgeführt werden. Dasselbe gilt, wenn mit hohen Erregerkonzentrationen gearbeitet wird oder mit Erregern, die über Atemwege infizieren.

- Zum Ausglühen der Impföse oder –nadel verwende man einen Brenner mit Spritzschutzglocke, oder man arbeite mit vorsterilisierten Einmalimpfgeräten aus Kunststoff.

- Man verwende vorzugsweise Einwegartikel. - Kontaminierte Geräte und Gefäße sowie mikroskopische Präparate werden sofort nach Gebrauch in

ein Desinfektionsbad eingelegt und anschließend – wenn es das Material zulässt – autoklaviert. Erst danach werden sie gereinigt oder entsorgt. Entsprechendes gilt für kontaminierte Kleidung.

- Bei einem Hautkontakt mit lebendem Material ist die betroffene Hautfläche sofort zu desinfizieren; dazu müssen an den Waschbecken Dosierspender mit einem Händedesinfektionsmittel zur Verfügung stehen.

- Wird Mikroorganismensuspension verschüttet oder durch Glasbruch freigesetzt, so muss der kontaminierte Bereich sofort gesperrt und desinfiziert werden.

- Kulturen und infektiöses Material in Glasgefäßen oder Petrischalen sollen in bruchfesten, flüssigkeitsdichten Behältern bebrütet, transportiert und aufbewahrt werden.

- Nicht mehr benötigte Kulturen und erregerhaltiger Abfall müssen gefahrlos gesammelt und durch Autoklavieren (121°C, 30min) unschädlich gemacht werden.

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3.2 Identifizierung (Bestimmen) von Bakterien (siehe Anhang 5.5)

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Tab. 3.1: Koloniemerkmale einiger Bakterienarten Erklärung: M. = Micrococcus

S. = Streptococcus E. = Escherichia Se. = Serratia Chr.= Chromatium (neu = Janthinobacterium lvidium, alt = Chromobacterium lvidium ) B. = Bacillus Str. = Streptomyces

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3.3 Mikroskopie fixierter und gefärbter Bakterien Die geringen Dimensionen von Bakterienzellen und der schwache Kontrast zwischen Medium und Zellen, der auf den fast gleichen Brechungsindex zurückzuführen ist, bewirken, dass nur wenige Details im Lichtmikroskop wahrgenommen werden können. Zur besseren Darstellung werden daher die Bakterien vor der mikroskopischen Untersuchung fixiert und gefärbt. Fixierung: Lebende Zellen nehmen Farbstoffe nur in kleinen Mengen auf, daher werden in der Regel nur fixierte Zellen gefärbt. Die Bakterien werden durch die Fixierung strukturschonend abgetötet; das Probematerial haftet durch Protein-Denaturierung am Objektträger-Glas fest. Das Präparat ist gleichzeitig haltbar gemacht worden. Färbung: Die Färbung von Bakterien dient verschiedenen Zwecken: -- Kontrastierung der Zellen durch einheitliches Anfärben (z.B. Methylenblau-Färbung) -- Unterscheidung verschiedener Bakteriengruppen -“Differenzierung“ (z.B. Gram-Färbung) -- Darstellung spezifischer Strukturen (Geißel-, Sporen- und Kapseldarstellung) Die verwendeten Farbstoffe besitzen in der Regel eine besondere Affinität zu bestimmten Zellbestandteilen. Die am häufigsten angewandten Farbstoffe sind Salze basischer Anilinfarbstoffe ( z.B. Methylenblau, Kristallviolett, Safranin). Sie geben in wässriger Lösung gefärbte Kationen des Farbstoffes ab, die mit sauren Gruppen von Zellbestandteilen (z.B. Carboxyl- und Phosphatgruppen) Salze bilden, indem sie Ionen mit geringerer Affinität ersetzen. Das Kation des Methylenblau kann z.B. K+ und Ca2+ verdrängen. Als saure Farbstoffe werden u.a. Eosin und Kongorot verwendet.

3.3.01 Herstellung eines gefärbten Ausstrichpräparates mit Methylenblau Material: -- Rachenabstrich, Hefen, Plaquematerial, versch. Bakterienkulturen -- Methylenblau nach LÖFFLER Lösung A: Methylenblau 0,3 g, Ethanol (96%) 10ml Lösung B: KOH Lösung (0,01%) 100 ml Gebrauchslösung: 10 ml Lösung A und 100 ml Lösung B mischen. -- Fettfreie Objektträger, Färbetrog, Fön, Spritzflasche, Impföse, Zahnstocher, Bunsenbrenner Arbeitsgang: a) Einen kleinen Tropfen Wasser auf den fettfreien Objektträger bringen. - nur absolut fettfreie Objektträger erlauben eine getrennte Lage der ausgestrichenen Bakterien, sie verhindern ein Zusammenfließen und Verklumpen; Entfettung erfolgt z.B. mit Ethanol.

b) Mit dem Zahnstocher und der sterilen Impföse etwas Bakterienmaterial entnehmen. c) Bakterien in Tropfen verrühren und ausstreichen. d) Ausstrich trocknen lassen. e) Hitzefixierung: Ausstrich mit Bakterienmaterial nach oben 3 x durch die Nichtrauschende-Flamme ziehen. - Die Hitzefixierung muss mit einem vollständig trockenen Objektträger durchgeführt werden, da sonst durch kochendes Wasser Strukturen zerstört werden.

f) Ausstrich auf Färbetrog legen und ca. 5 Minuten mit reichlich Färbelösung bedeckt halten.

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g) Färbelösung mit Wasser abspülen bis keine Farbwolke mehr sichtbar ist. h) Objektträger trocknen lassen. i) Mikroskopieren ohne Deckglas mit dem Ölimmersionsobjektiv. j) Zeichnen des mikroskopischen Bildes in genauen Proportionen.

3.3.02 Negativ-Darstellung von Mikroorganismen Bei dieser Darstellung wird der Kontrast nicht durch Anfärben der Mikroorganismen selbst erzielt, sondern die Umgebung wird „verdunkelt“. Dies erreicht man durch schwarze Farbstoffe, die nicht in Mikroorganismen eindringen. Geeignet ist z.B. chinesische Tusche (= Suspension von kleinsten Rußpartikeln), deren Kohlenstoffteilchen wesentlich kleiner sind als Bakterien, die aber nicht in diese eindringen. Bakterienformen und die typische Lagerung von Zellen (Ketten, Pakete ... ), aber auch Schleimhüllen und Schleimkapseln lassen sich im Tuschepräparat gut darstellen. Material: Verschiedene Bakterienkulturen, chinesische Tusche (Scribtol) Arbeitsgang: a) Einen kleinen Tuschetropfen seitlich auf den Objektträger bringen. b) Mit steriler Impföse Bakterienmaterial entnehmen. c) Bakterienmaterial im Tuschetropfen homogen suspendieren. d) Ausstrichglas an den Tropfen führen (Ausstrichwinkel ca. 45°) und Material über Objektträger ausstreichen. Der nun zwischen Objektträger und Ausstrichglas haftende Tropfen wird durch gleichmäßiges Nachziehen ausgestrichen. Zu dicke Ausstriche entstehen bei zu großem Winkel und schnellem Ausziehen, zu dünne Ausstriche bei kleinem Winkel und langsamen Ausziehen. (Randzone nicht mit Untersuchungsmaterial kontaminieren.)

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e) Ausstrich trocknen lassen. f ) Mikroskopieren ohne Deckglas bei offener Kondensorblende, Ölimmersion verwenden. Ergebnis: Auf dunklem Untergrund erscheinen die Bakterienzellen leuchtend hell. Die günstigste Schichtdicke muss durch Kontrolle des gesamten Ausstrichs gefunden werden.

3.3.03 Sporenfärbung Endosporen (eine Spore/Zelle) sind bisher nur bei Vertretern der Gattung Bacillus (aerob oder fakultativ anaerob), Clostridium (obligat anaerob) sowie bei Desulfotomaculum (Sulfatreduzierer), Sporosarcinaurea (obligate kokkoide Harnstoffverwerter) und Sporolactobacillus (Milchsäurebakterium) festgestellt worden. Die Gattungen wurden in der Familie der Bacillaceae zusammengefasst, obwohl sie wahrscheinlich polyphyletisch entstanden sind. Sporen sind Dauerformen, um physiologisch ungünstige Bedingungen zu überleben. Aufgrund der undurchlässigen Sporenwand und des geringen Wassergehaltes nehmen Sporen basische oder saure Farbstoffe kaum an. Sporen erscheinen infolgedessen als farblose, ovale Areale in der violett- oder rotgefärbten Sporenmutterzelle (Sporangium, vegetative Zelle). Ein solcher indirekter Nachweis von Sporen ist allerdings nicht ausreichend, da auch Reservesubstanzen Farbstoffe schlecht aufnehmen können. Eine direkte Färbung von Sporen gelingt jedoch nur, wenn die Sporenwand durch Erhitzen aufgeweicht und für Farbstoffe durchlässiger gemacht wird.

Sporenfärbung mit Malachitgrün - Safranin: Durchführung mit älteren Kulturen einiger Bacillus-Arten auf Standard-I-Agar. a) Hitzefixierten Ausstrich herstellen. b) In Objektträgergröße Filterpapier auflegen und mit Malachitgrünlösung (5 g / 100 ml A.dest.) bedecken und fächelnd bis kurz vor Siedebeginn („Dampfen“) gut 5 Minuten erhitzen; das Präparat darf nicht eintrocknen, deshalb bei Bedarf Malachitgrünlösung nachgeben. c) Das Papier wird mit der Pinzette entfernt und das Präparat vorsichtig mit Wasser abgespült. d) Zur Gegenfärbung lässt man die Safraninlösung ( 5 g / 100 ml A.dest. ) 5 Minuten einwirken. e) Vorsichtig abspülen, trocknen und mit Ölimmersion mikroskopieren.

►Ergebnis: Spore – grün, Sporangium - rot◄

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Sporenfärbung mit Karbolfuchsin - Methylenblau: a) Hitzefixierten Ausstrich herstellen. b) Karbolfuchsin auftropfen und den Ausstrich über der Sparflamme bis zur Blasenbildung ca. 2 Minuten leicht erhitzen. c) Abspülen mit Wasser. d) 1 Minute entfärben mit 10%iger Natriumsulfitlösung. e) Abspülen mit Wasser. f) ca. 1 Minute Gegenfärbung mit Methylenblau. g) Vorsichtig abspülen, trocknen und mit Ölimmersion mikroskopieren.

►Ergebnis: Spore – rot, Sporangium - blau◄ Achtung: R- und S-Sätze beachten! 3.3.04 Färbung von Zellinhaltsstoffen I. Nachweis von Volutin: Volutinkörnchen sind aus langkettigen Polyphosphaten bestehende Zelleinschlüsse (Speicher-Granula) in Bakterien, Pilzen und Cyanobakterien; sie dienen hauptsächlich als Phosphatreservestoff, die Verwertung als Energiequelle ist umstritten. Volutin wurde nach Spirillum volutans benannt, aus dem es zuerst isoliert wurde. Die langkettigen, stark lichtbrechenden Volutingranula erscheinen in Anwesenheit von Methylenblau dunkelblau gefärbt. Material: Methylenblau 1%ig in Ethanol 96%ig, Schwefelsäure 2%ig, Grams Jodlösung, Candida sp., Corynebacterium flavescens oder Mycobacterium phlei Arbeitsgang: a) Ein vorsichtig fixiertes Präparat wird 1-2 Minuten mit Methylenblau gefärbt, abgespült, vorsichtig abgetupft und mit einem Deckglas versehen. b) Mit einem Filterpapierstreifen wird die Schwefelsäure durchgesaugt.

Achten Sie darauf, dass niemals Teile des Mikroskopes mit Säure in Berührung kommen!

c) Nach Entfärben des Präparates wird auf gleiche Weise mit Wasser durchgespült. d) Grams Jodlösung durchsaugen und mit Ölimmersionsobjektiv mikroskopieren.

►Ergebnis: Volutingranula = dunkelblau, Zelle = gelb◄

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II. Nachweis von Glycogen: Glycogen („tierische Stärke“) ist ein stark verzweigtes Polysaccharid aus 1,4/1,6 glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen. Es dient den verschiedenen Bakterien, Hefen und Pilzen als Energiespeicher. Glycogen ist in seiner Struktur dem Amylopektin sehr ähnlich, gibt aber mit Jodlösung eine braune statt blaue Farbe. Material: Lugolsche Lösung (J-JK) (oder Grams Jodlösung), Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe): eine 40 Stunden alte Schüttelkultur in Standard-I-Nährlösung. Arbeitsgang: a) Ein Tropfen der Kulturflüssigkeit wird mit der Impföse entnommen und mit einem Tropfen Lugolscher Lösung auf dem Objektträger vermischt. b) Ein Deckglas wird aufgelegt und das Präparat mit Ölimmersion mikroskopiert.

►Ergebnis: Glycogeneinschlüsse rötlich bis braun◄

III. Nachweis von fettartigen Speichersubstanzen: Fettartige Speichersubstanzen sind als Tröpfchen oder Granula bei Mikroorganismen mit lipophilen Farbstoffen wie Sudanschwarz leicht nachweisbar. Zur Fettspeicherung kommt es besonders bei einem hohen C/N Quotienten der Nährstoffe. Vor allem Hefen speichern fettartige Substanzen und können bis zu 80% ihres Trockengewichts aus Triglyceriden bestehen. Material: Sudan-Schwarzlösung: 0,3 g werden in 100 ml Ethanol (70%ig) gelöst. Bacillus megaterium, Bäckerhefe Arbeitsgang: a) Ein wenig Kulturmaterial wird mit der Öse in einem Tröpfchen Wasser auf dem Objektträger verrieben. b) Einen Tropfen Sudanschwarz aufbringen und mit der Öse gut vermischen. c) Deckglas auflegen und mit Ölimmersionsobjektiv mikroskopieren.

►Ergebnis: Fetttröpfchen blau bis grau◄

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3.3.05 Der Katalase-Nachweis Bei aeroben Wachstum entsteht im Stoffwechsel u.a. Wasserstoffperoxyd (H2O2), das für die Zelle jedoch toxisch ist. Die meisten cytochrombildenden aeroben und fakultativ anaeroben Bakterien besitzen zur Entgiftung das Enzym Katalase, das Wasserstoffperoxyd in Wasser und Sauerstoff spaltet.

2H2O2 --------------------► 2H2O + O2 Anwendung: Mit Hilfe dieses Testes lassen sich Katalase-besitzende Bakterien schnell ermitteln; er dient als Hilfsmittel bei der Unterscheidung verschiedener Bakteriengattungen, wie z.B.:

Bacillus (+) von Clostridium (-) Mikrococcus (+) und Staphylococcus (+) von Streptococcus (-)

Durchführung:

Man gibt einen Tropfen einer 3-5%igen H2O2-Lösung zu einer zu prüfenden Bouillonkultur (A), auf eine mittels Impföse auf einen Objektträger übertragene Kolonie (B) oder auf eine Agarplatten-Kolonie (C). Das sofortige Auftreten feinster Gasblasen ist mit bloßem Auge gut zu erkennen. Hinweis: -- Platin- oder eisenhaltige Impfösen dürfen nicht mit H2O2 in Berührung kommen. -- Zu prüfende Kolonien sollen nicht älter als 24 Stunden sein. -- Der Test soll nicht auf Blutagarplatten durchgeführt werden, da Erythrocyten ebenfalls Katalase enthalten � falschpositives Ergebnis!

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3.3.06 Oxidase-Nachweis

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3.3.07 Gramfärbung Grundlagen: Ein wichtiges taxonomisches Kriterium in der Bakteriensystematik ist das Verhalten der Zellen bei der Gram-Färbung. Diese von dem dänischen Bakteriologen Gram eingeführte Färbemethode unterteilt die Bakterien in zwei große Gruppen, in die gramnegativen und grampositiven Bakterien. Diese Gruppen unterscheiden sich grundlegend im molekularen Aufbau und in der Zusammensetzung der Zellwand. Das Prinzip der Färbung ist es, die zunächst mit Karbolgentianaviolett gefärbte Zelle einer Beizung mit Jodlösung zu unterziehen, wobei sich der Farblack ausbildet. Beim anschließenden Auswaschen dieses Farblacks mit Alkohol halten die grampositiven Bakterien den Farbstoff erheblich fester als die gramnegativen, die bereits nach 20 – 30 sec. völlig entfärbt sind. Die Färbung ergibt nur dann reproduzierbare Ergebnisse, wenn man die angegebenen Vorschriften genau einhält. Die Bakterien sollten möglichst in der logarithmischen Wachstumsphase stehen, je nach Alter und Ernährungszustand können sich viele Arten auch „gram variabel“ verhalten. Um Unsicherheit in der Beurteilung der Färbung auszuschließen, kann man eine Kontrolle vornehmen: Auf ein und demselben Objektträger streicht man auf dem linken Drittel einen gram(+), auf dem rechten Drittel einen gram(-) Bakterienstamm aus und den zu untersuchenden Stamm in der Mitte. Ist die Färbung bei den Kontrollstämmen einwandfrei ausgefallen, so kann auch das färberische Verhalten des zu prüfenden Stammes sicher beurteilt werden. Zumindest sollte der zu prüfende Stamm auf einem Objektträger zweimal aufgebracht und fixiert werden, wobei einmal die gesamte Gram-Färbung und einmal nur die Gegenfärbung mit Karbolfuchsin (Grams Safranin) durchgeführt werden.

Abb. 3.1: Objektträger mit einem gram(+) und gram(-) Organismenstamm sowie einen unbekannten Präparat Arbeitsgang: 1.) Objektträger entfetten 2.) Hitzefixierten Ausstrich herstellen 3.) Durch Faltenfilter Karbolgentianaviolett (oder frisch filtrierte Farbstofflösung) auftropfen bis der Ausstrich vollkommen bedeckt ist (Präparation auf Färbebank bzw. Färbeschale) 4.) Nach ca. 3 min. die Färbelösung abgießen (nicht mit Wasser abspülen) 5.) Lugolsche Lösung aufgießen 6.) Nach einer Minute Lösung abgießen 7.) 96% igen Ethanol aufgießen bis kein Farbstoff mehr ausgewaschen wird 8.) Waschen mit Wasser (einige Sekunden) 9.) Ausstrich mit Karbolfuchsin (Grams Safranin), nach 15 bis 30 Sekunden abgießen 10.) Mit Leitungswasser spülen 11.) Mit Aqua dest. nachspülen 12.) Trocknen lassen 13.) Mit Ölimmersion mikroskopieren

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3.3.08 Unterscheidung gramnegativer und -positiver Bakterien mittels KOH-Test Methode: Durch Behandlung von Bakterienkoloniematerial mit Kalilauge kommt es bei gramnegativen Keimen vermutlich zur Zerstörung der Zellwand und damit bedingt zur Freisetzung der DNS. Diese Freisetzung führt beim Verrühren von Koloniematerial mit KOH-Lösung zur Schleimbildung (Fadenziehen), es liegt eine positive Reaktion vor. Die wichtigste Färbung für eine Bakterieneinteilung hinsichtlich gramnegativer und grampositiver Stämme ist jedoch die Gramfärbung. Der KOH-Test soll und kann die Gramfärbung keinesfalls ersetzen, ist aber bei zweifelhaften Gramfärbungen eine zusätzliche Hilfe; auch als Schnellverfahren für eine grobe Übersichtsuntersuchung bietet dieser Test einen ausreichenden Aussagewert. Für den KOH-Test muss allerdings ausreichendes Material (stecknadelkopfgroß) zur Verfügung stehen, bei kleinen Kolonien (stichgroß) versagt der Test. Arbeitsgang: a) Koloniematerial und 1 - 2 Tropfen 3%ige KOH-Lösung auf einen Objektträger bringen und 5 - 10 Sekunden verrühren; b) nun hebt man die Impföse oder Nadel vorsichtig vom Tropfen ab; c) kommt es zur Schleimbildung bzw. zum Fadenziehen (s. Abb. unten), so liegt eine positive Reaktion vor, die Kolonie ist gramnegativ oder verdächtig gramnegativ.

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3.3.09 Aminopeptidase-Test

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3.3.10 Geißelfärbung nach LEIFSON Einleitung: Die sehr feinen Geißeln der Bakterien (∅ 10-20 nm) können nur durch Beizen und Anfärben lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden. Das Beizen mit dem Gerbstoff Tannin bewirkt eine starke Aufquellung der Geißelproteine. Mit basischem Fuchsin färbt man dann die Geißel rot und macht sie so mikroskopisch sichtbar. Eine Gegenfärbung mit 1%iger, leicht alkalischer Methylenblaulösung kann sich noch anschließen. Man sollte immer mehrere Präparate anfertigen und sie unterschiedlich lange färben. Die Geißeln können bei schwacher Färbung leicht übersehen werden. Jedes Präparat sollte also gründlich untersucht werden. Material: ÜN-Schrägagarkulturen (25°C) von begeißelten Bakterien (z.B. Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, Bacillus megaterium u.a.), je Ausstrichpräparat etwa 1 ml Farbbeize nach LEIFSON (s.u.), Leitungswasser, 25 ml Becherglas, drei 5ml-Messpipetten, fettfreier Objektträger, Glastrichter, Tropfpipette, Färbewanne, Brenner, Öse und Immersionsöl. Farbbeize nach LEIFSON: Gleichgroße Mengen der folgenden Lösungen in dem Becherglas zusammengeben (1:1:1). A 1,5%ige wässrige NaCl-Lösung B 3%ige wässrige Tanninlösung C 1,2% basisches Fuchsin in Ethanol Arbeitsgang: a) einen Tropfen Leitungswasser auf den Objektträger pipettieren b) eine Öse voll Bakterienmaterial aus dem unteren (sehr feuchten Teil) der Schrägagarkultur entnehmen und ohne Rühren in den Wassertropfen übertragen, so dass gerade eine leichte Trübung zu erkennen ist. c) die Suspension durch leichte Kippbewegungen über den Objektträger verteilen d) Präparat lufttrocknen (keine Hitzefixierung!) e) auf den gerade noch feuchten Ausstrich durch das Papierfilter Farbbeize auftropfen und etwa 10 Minuten einwirken lassen (Zeiten variieren) f) vorsichtig mit Leitungswasser spülen, lufttrocknen g) bei Ölimmersion und guter Abblendung mikroskopieren Ergebnis: Die Zellkörper sind rot gefärbt und dünne Fäden (→ Geißeln) sind in der Umgebung der Zellen zu erkennen. Die Geißeln sind je nach Organismus entweder polar oder peritrich angeordnet. Anmerkung: Zum Spülen eignet sich hartes (→ leicht alkalisches) Leitungswasser besser als das leicht saure dest. Wasser (CO2-haltig).

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3.3.11 Nachweis der Beweglichkeit Gelegentlich kann bei der Keimdifferenzierung die Feststellung der Beweglichkeit von Bedeutung sein. Die Beweglichkeit der Bakterien wird durch eine oder mehrere Geißeln (polar oder peritrich) ermöglicht. Fimbrien dienen hingegen der Haftung an Oberflächen (Bodenkolloide, Epithelien) und Pili vorwiegend der parasexuellen Genübertragung (DNS-Transfer durch Konjugation). Geißeln sind im Lichtmikroskop nicht sichtbar (10 - 30 nm im Durchmesser). Erst nach Quellung und Beizfärbung lassen sie sich färben und mikroskopisch nachweisen. Die Art der Begeißelung ist jedoch für die taxonomische Einordnung von Bakterien von großer Bedeutung. Material: Bouillonkultur (möglichst 48 Stunden alt), frische Schweine-Jauche, Heu-Aufguss, Hohlschliff-Objektträger. Arbeitsgang: a) Ein sauberes aber nicht entfettetes Deckglas wird in der Mitte mit einem kleinen Tropfen Bouillonkultur oder einer frischen Jauche oder Heuaufgussprobe versehen. b) Der Rand des Hohlschliffobjektträgers wird an vier Punkten mit Vaseline versehen. c) Nun wird der Objektträger leicht gegen das Deckglas gedrückt, dann Deckglas mit Objektträger rasch drehen; der Tropfen hängt nun frei in der Schliffkammer des Objektträgers. d) Zunächst wird mit dem Objektiv (40x) der Rand des betreffenden Tropfens gesucht; dann wird Immersionsöl aufgebracht und mit dem Ölimmersionsobjektiv (100x) mikroskopiert. Beurteilung: Eine Eigenbewegung (aktiv) liegt dann vor, wenn die Organismen sich von ihrem anfänglichen Standort wegbewegen, und in das Gesichtsfeld eintreten oder es wieder verlassen. Falsche Resultate können vorgetäuscht werden durch BROWN`sche Molekularbewegung (passiv) oder Strömungen innerhalb der Bakteriensuspension bzw. Verdunstung am Deckglasrand.

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3.3.12 Lactobacillus spec. Einleitung: Lactobacillen, Familie Lactobacillaceae, sind grampositive, katalasenegative, unbewegliche Stäbchen,die keine Sporen bilden und häufig in Ketten auftreten. Sie stellen komplexe Nährstoffansprüche (Wuchsstoffe, Aminosäuren) und sind dementsprechend auf reinen Mineralsalzmedien nicht zu kultivieren. Zum Energiegewinn sind sie auf Kohlenhydrate angewiesen, bei deren Abbau Milchsäure gebildet wird. Sie sind weit verbreitet in der Natur und finden sich besonders auf Pflanzenmaterial, in Milch und Milchprodukten sowie im Verdauungstrakt vieler Tiere. In der Lebensmittel- und Getränkeindustrie spielen sie eine zwiespältige Rolle, denn einerseits sind sie als Schädlinge gefürchtet, andererseits leisten sie gute Dienste als Kulturorganismen bei der Herstellung von Milchprodukten, Käse, Brot, Sauerkraut etc. Zur Isolierung lässt sich die ausgeprägte Säuretoleranz ebenso benutzen, wie die spezifische Toleranz gegen Acetat, das als Selektionsfaktor in ROGOSA-Agar enthalten ist. Anaerobe Bebrütung erhöht die Selektivität. Arbeitsgang: a) Material: Sauerkraut b) Quadrantenausstrich auf ROGOSA-Agar; drei Tage anaerob bei 37 C bebrüten c) mikroskopische und makroskopische Kontrolle d) Reinzucht geeignet erscheinender Kolonien durch erneuten Quadrantenausstrich auf ROGOSA-Agar e) erneute Kontrolle, KOH-Test, Katalase-Test, GRAM-Färbung f) Stammkultur (Stichkultur in ROGOSA-Agar) ROGOSA-Agar: Wirkungsweise: Durch die hohe Acetatkonzentration und den niedrigen pH-Wert wird die Begleitflora in gewissem Umfang unterdrückt. Geringe Mengen an Mangan, Magnesium und Eisen gewährleisten ein optimales Wachstum der Lactobacillen. Zubereitung: 74,5g/Liter des ROGOSA-Agar auf dem heizbaren Magnetrührer lösen und 2-3 Minuten aufkochen, mit Essigsäure 96%ig (1,3ml/Liter Medium) auf pH 5,5 (s.u.) einstellen. Das Nährmedium für die Petrischalen wird nicht autoklaviert. Zur Entnahme des Mediums für die Stichkultur wird das Nährmedium im Kolben auf dem Magnetrührer so gerührt, dass die Agar-Partikel in der Schwebe bleiben, dann entnimmt man mit der Pipette (Mundstück nach unten) Portionen zu 10ml und überführt sie in die Reagenzgläser, der Nährboden in dem RG wird 10 Minuten bei 120°C sterilisiert, bevor man ihn senkrecht stehend erstarren lässt. Zusammensetzung (g/Liter): Pepton aus Casein 10,0; Hefeextrakt 5,0; D(+)- Glucose 20,0; Kaliumdihydrogenphosphat 6,0; Ammoniumcitrat 2,0; Tween 80 1,0; Natriumacetat 15,0; Magnesiumsulfat 0,575; Eisen(II)-sulfat 0,034; Mangansulfat 0,12; Agar-Agar 15,0.

► pH-Wert-Einstellung siehe: Umgang mit einem pH-Meter ◄

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3.3.13 Micrococcus spec. Einleitung: Die Bakterien der Gattung Micrococcus sind katalasepositive, unbewegliche Kokken, die in der Luft, der Erde, in Oberflächenwasser und auf der Haut von Mensch und Tier vorkommen. Durch Zellteilung in mehreren Ebenen entstehen Tetraden, „Pakete“ oder unregelmäßige Zellklumpen. Die Kolonien sind gelb, gelbgrün oder orange gefärbt (gelbe oder rote „Luftkokken“). Infolge ihrer auffälligen Koloniefarbe und ihres Auftretens in relativ dünn besiedelten Standorten (Luft, sauberes Oberflächenwasser) bedarf es keiner besonderen Anreicherungstechniken um Micrococcus zu isolieren. In der Regel bringen „Luftplatten“ mit Vollmedium (Standard-I-Agar) den gewünschten Erfolg. Isoliert werden sollen Mikrokokken, die früher als „Sarcinen“ bezeichnet wurden und sich durch auffallend gelbe Kolonien und Wachstum in „Paketen“ auszeichnen. Arbeitsgang: a) Petrischalen mit Standard-I-Agar bis zu eine Stunde an verschiedenen Standorten geöffnet aufstellen b) Platten verschließen und 2-3 Tage bei 28°C „auf dem Kopf“ bebrüten c) Makroskopische und mikroskopische Kontrolle d) Reinzucht ausgewählter Kolonien durch Quadrantenausstrich auf Standart-I-Agar e) Erneute Kontrolle, KOH-Test, Katalase-Test f) Stammkultur auf Standart-I-Schrägagar (s. Abb. unten)

Für ein Schrägagarröhrchen werden die mit etwa 5-7 ml gefüllten, sterilisierten Röhrchen so auf ein Schlauch gelegt, dass der Agar schräg erstarrt. Die auf diese Weise erzielte Oberfläche sollte zum Kultivieren von Mikroorganismen möglichst groß sein. Es sollte jedoch darauf geachtet werden, dass der Agar vor dem Erstarren nicht bis zum Stopfen läuft, da dadurch die Kontaminationswahrscheinlichkeit vergrößert wird.

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3.3.14 Streptococcus spec. Einleitung: Die Mundhöhle wird von einer außerordentlich komplexen Keimflora besiedelt. Zur Normalflora gehören u.a. Streptokokken, die hier ein harmloses Leben als Kommensalen führen. Sie neigen jedoch dazu sich an den Zähnen festzusetzen (Speisereste zwischen den Zähnen und besonders Zucker dienen als gute Nahrungsquelle) und die sog. Plaques zu bilden. Neben St. sanguis, St. mitis und St. milleri sind es vor allem St. mutans und St. salivarius, die große Schleimmengen produzieren, die besonders wegen ihrer klebrigen Konsistenz das Festhaften an den Zähnen erleichtert. Werden diese Plaques nicht regelmäßig entfernt, so können die Bakterien mit Hilfe von Mineralien aus dem Speichel Zahnstein bilden. Außerdem scheiden die Streptokokken Säuren aus, die den Zahnschmelz angreifen und zu kariösen Veränderungen führen. Arbeitsgang: a) Herstellung von zwei HTS-Agar b) Mit dem Zahnstocher Plaquematerial entnehmen c) Plaquematerial in einen Tropfen steriler 0,9%iger NaCl-Lösung auf Objektträger suspendieren d) Platten mit Suspension im Dreizehnstrichverfahren beimpfen e) Platten bei 37°C anaerob drei Tage bebrüten f) Auswertung der Platten (Koloniemorphologie, KOH-Test, Katalase-Test, GRAM-Färbung) HTS Medium:

A..dest. 1000 ml Hefeextrakt 5 g Tryptophan 10 g Saccharose 50 g KH2PO4 3 g Gelatine 10 g Agar 15 g

pH 7,2 (Einstellung mit 1N Essigsäure und 1N NaOH)

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3.3.15 Actinomyceten Einführung: Actinomyceten sind grampositive im Boden vorkommende Bakterien, deren auffälligstes Merkmal das mycelartige Wachstum ist. Über lange Zeit war unsicher, ob eine phylogenetische Verwandtschaft zu den Bakterien oder Pilzen besteht. Ihre prokaryotische Zellstruktur, die Beschaffenheit der Zellwand (Murein), ihr Stickstoffmetabolismus und ihre Sensibilität gegen bakterienspezifische Antibiotika und gegen Phagen lassen keinen Zweifel an ihrer Zugehörigkeit zu den Bakterien. Das Mycel wird entweder als Luft- oder Substratmycel ausgebildet, es ist verzweigt und septiert, wobei die einzelnen Hyphen einen Durchmesser von 1 µ haben. Alterndes Mycel zerfällt in stäbchenförmige Zellen. Die an den Enden des Luftmycels abgeschnürten Sporen unterscheiden sich von den Endosporen der Bacillaceae durch eine nur mäßige Hitzeresistenz, sie weisen aber gegenüber vegetativen Bakterienzellen eine erhöhte Phenolresistenz auf, was zur Isolierung ausgenutzt werden kann. Arbeitsgang:

10 g trockene, fein gesiebte Gartenerde und 10 ml Leitungswasser ↓

30 Minuten schütteln ↓ ↓ ↓ 1:10 verdünnen ↓ ↓ 0,1 ml 0,1 ml ↓

parallel in 10 ml Phenollösung (1g Phenol/140ml H2O) geben ↓

15 Minuten Raumtemperatur ↓

je 1ml in 100ml verflüssigten und auf 50°C temperierten Stärke-Casein-Agar geben und gut vermischen

↓ Platten zu 20 ml gießen

↓ 1 Tropfen Biphenyl-Lösung in Deckel geben, 1 Woche bei 28°C „auf dem Kopf“ bebrüten

↓ Täglich auf kalkig graue Kolonien mit 1-5 mm Ø kontrollieren

↓ falls positiv, mikroskopische Kontrolle

↓ etwas Luftmycel abimpfen und durch Quadrantenausstrich

auf Yeastextrakt-Glukose-Agar reinzüchten ↓

Kontrolle ↓

Stammkultur / Yeastextrakt-Glucose-Agar

Yeastextrakt-Glucose-Agar: g je Liter dest. H2O Stärke-Casein-Agar:

Hefeextrakt 10 10 Stärke löslich Glukose 10 0,3 Casein Agar 15 2 KNO3 2 NaCl 2 K2HPO4 0,05 MgSO4 0,02 CaCO3 0,01 FeSO4.7H2O 20 Agar

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3.3.16 Anreicherung und mikroskopische Untersuchung von Schimmelpilzen Einleitung: Die Gruppe der „Schimmelpilze“ umfasst keine systematisch abgegrenzte Pilzgruppe; vielmehr ist dies eine Bezeichnung für Pilze aus verschiedenen taxonomischen Gruppen, die sehr schnell auf Substraten (in erster Linie auf Lebens- und Futtermitteln) ein mit dem Auge sichtbares watteartiges Mycel („Schimmel“) ausbilden und durch die Fruktifikationsorgane (Sporangien, Konidien) auffallend gefärbt sind. Im Praktikum werden einige typische Vertreter der Schimmelpilze vorgestellt, wobei einige wichtige Verhaltensweisen zu beachten sind: I. Die mit Schimmelpilzen angereicherten Petrischalen bleiben grundsätzlich geschlossen. II. Die zur mikroskopischen Kontrolle notwendigen Entnahme von Mycel erfolgt nur in der Sterilbank (SK2) unter Aufsicht des Fachlehrers. Die mikroskopische Untersuchung einer Reinkultur sollte auf drei verschiedenen Wegen erfolgen: a) Objektträgerpräparat: -- Auf einen Objektträger gibt man einen Tropfen Lactophenol-Baumwollblau*). -- Vom Rand der Pilzkolonie wird mit einer Nadel etwas Agar mit Pilzmaterial herausgehoben und auf den Tropfen gelegt. -- Nun gibt man einen Tropfen Ethanol auf das Pilzmaterial und legt ein Deckglas auf. -- Über der Sparflamme des Brenners wird der Objektträger hin- und hergeschwenkt, bis der Agar geschmolzen ist, d.h. bis der Objektträger flach auf dem Deckglas liegt. -- Mikroskopiert wird bei 100 - 400facher Vergrößerung. *) Lactophenol-Baumwollblau: Phenol 5 g Milchsäure 5 g Glycerin 5 g Anilinblau 0,1 g Aqua dest. 10 ml b) Klebebandpräparat -- Auf einen Objektträger wird ein Tropfen Lactophenol-Baumwollblau gegeben. -- Mit einem breiten durchsichtigen und klaren Klebeband wird vorsichtig mit der Klebeseite die Kolonie (Randbereich) vom festen Medium abgedrückt und das Klebeband auf den Objektträger „geklebt“ und mikroskopiert. c) Zupfpräparat -- Ein Teil des Mycels und der Vermehrungsorgane wird mit zwei Nadeln (Pinzette) vom festen Medium vorsichtig abgezupft und in einem Tropfen Lactophenol-Baumwollblau, mit einem Deckglas bedeckt, mikroskopiert.

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I. Penicillium spec. Einleitung: Schimmelpilze der Gattung Penicillium (Pinselschimmel) gehören zu den am häufigsten vorkommenden Pilzen und sind deshalb leicht zu isolieren. Die Konidien sind überall in der Luft und in der Erde zu finden. Sie spielen eine Rolle als Lagerschädlinge in der Lebensmittelindustrie (z.B. Penicillium expansum), als Antibiotika- Produzenten (Penicillium chrysogenum) in der Biotechnologie und als Kulturorganismen bei der Käseherstellung (Penicillium roqueforti, Penicillium camenberti). Arbeitsgang: a) Bodenproben, Brot oder Käse ca. 10 g in 50 ml Leitungswasser suspendieren b) 1 - 2 Tropfen in Petrischale geben und mit ca. 20 ml verflüssigtem Malzextrakt-Agar*) von 50°C vermischen c) bei 28°C bebrüten und täglich auf Entwicklung von Penicillium-Kolonien prüfen d) makroskopische und mikroskopische Kontrolle *) Malzextrakt-Agar (ME-Agar): (g je Liter Aqua dest.) Malzextrakt 30 Pepton 5 Agar 15 Nach der Sterilisation werden die Erlenmeyerkolben im Wasserbad auf 50 – 55°C temperiert; pro Kolben (Inhalt 100 ml) werden 0,12 ml 10 %ige Milchsäure zugesetzt (pH 5,3), ohne Schaumbildung vorsichtig vermischen.

Abb. 3.1: Sporenträger von Aspergillus, Penicillium und von Gattungen der Familie Mucoraceae (von links; schematisch)

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II. Mucor mucedo Einleitung: Mucoraceen findet man häufig auf reifen, faulenden Früchten, feuchtem Schwarzbrot, Pferdeäpfeln, in der Luft und im Boden. Sie lassen sich leicht in einem synthetischen Nährmedium (MSM = Mucor-synthetic-medium *) kultivieren, das als Stickstoffquelle Asparagin enthält. Dem spezifischen Wuchsstoffbedürfnis trägt ein Thiaminzusatz Rechnung. Mit Hilfe des MSM lassen sich Mucoraccen leicht aus der Natur isolieren. Arbeitsgang: 10 g Erde in 50 ml Leitungswasser suspendieren Brot mit etwas sterilem Wasser anfeuchten ↓ ↓ 1 Tropfen in sterile Petrischale geben auf angefeuchtetes Filterpapier in ein Glas legen ↓ ↓ ca. 20 ml sterilisierten und auf 50°C temperierten täglich kontrollieren, ob lockerer grauer MSM-Agar zugeben und vorsichtig mischen Rasen entstanden ist ↓ ↓ makroskopische und mikroskopische Kontrolle mikroskopische Kontrolle *) MSM-Agar: (g je Liter Aqua dest.) Glucose 40,00 Asparagin 2,00 KH2PO4 0,50 MgSO4 0,25 Thiamin 0,50 Agar 15,00

III. Endomyces lactis (Milchschimmel) Einleitung: Endomyces lactis ist eigentlich kein Schimmelpilz im engeren Sinne. Der Pilz wird normalerweise zu den Hefen gezählt, obwohl er keine hefeartige Sprossung zeigt. E.lactis ist stets zu finden auf altem Quark, saurer Milch und Yoghurt, wo er einen weißen samtartigen Überzug bildet. Er ist ein typischer Begleiter milchsaurer Gärungen (Sauerkraut, saure Gurken), wo er die von den Milchsäurebakterien produzierte Milchsäure assimiliert Dies kann zum Anstieg des pH-Wertes und damit zu einer Gefährdung der Haltbarkeit führen. Arbeitsgang:

Quark ↓

Öse ↓

Ausstrich auf ME-Agar ↓

2-3 Tage bei 28°C bebrüten ↓

makroskopische und mikroskopische Kontrolle

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3.3.17 Saccharomyces - Hefen Einführung: Hefen der Gattung Saccharomyces sind die Hauptverursacher der alkoholischen Gärung. Sie kommen vor allem auf und in zuckerhaltigen Substraten vor, von denen ihre Isolierung relativ einfach gelingt. Zur Anreicherung nutzt man einerseits ihre Gärfähigkeit, die ihnen unter O2-limitierten Bedingungen Vorteile gegenüber Schimmelpilzen und den meisten anderen Hefen bringt und andererseits ihre im Vergleich zu Bakterien höhere Säuretoleranz aus. Diese Voraussetzungen sind in Gäransätzen mit pH-Wert - 4,5 gegeben. Da auf diesem Wege aber keine sichere Unterdrückung anderer gärfähiger Hefen gewährleistet ist, ist eine nähere Charakterisierung über die typische Ascosporenbildung auf Acetat-Agar *) und die fehlende Pseudomycelbildung auf Kartoffelwasser-Agar **) erforderlich. *) Acetat-Agar: ( g je Liter) Natriumacetat 5 KCl 10 Agar 20 **) Kartoffelwasser-Agar: Kartoffelwasser 230 ml Leitungswasser 770 ml Glukose 20 g Agar 20 g Kartoffelwasser: 300 g gewaschene und geschälte Kartoffeln werden sehr klein geschnitten und in 300 ml Leitungswasser mehrere Stunden im Kühlschrank eingeweicht. Dann wird durch ein Tuch filtriert und das Filtrat eine Stunde autoklaviert. Arbeitsgang: a) Probe von Oberfläche einer Frucht b) Standkultur-ME-Bouillon (pH=4,0) drei Tage bei 28°C c) Dreizehnstrichverfahren auf ME-Agar (pH=4,0), 1-2 Tropfen Biphenyl-Lösung in den Deckel, 2-3 Tage „auf dem Kopf“ bebrüten bei 28°C d) makroskopische und mikroskopische Kontrolle e) drei verschiedene Einzelkolonien f) drei Stammkulturen auf ME-Schrägagar g) mit den Stammkulturen werden zur Differenzierung folgende Untersuchungen durchgeführt: I. Gärfähigkeit: -- RG mit ME-Bouillon / Durham-Röhrchen beimpfen -- drei Tage bei 28°C II. Askosporenbildung: -- 5 ml ME-Bouillon in Zentrifugenröhrchen beimpfen -- zwei Tage bei 28°C -- abzentrifugieren -- Bodensatz auf Acetat-Agar, 5-7 Tage bei 28°C, mikroskopieren III. Pseudomycelbildung: -- Kartoffelwasser-Agar punkt- und strichförmig beimpfen, Punkt mit Deckglas abdecken -- 4 Tage bei 28°C, mikroskopieren

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3.3.18 Einführung in die mikrobiologische Diagnostik mit Hilfe verschiedener Nährmedien Einführung: Die Nährstoffansprüche von Mikroorganismen sind sehr unterschiedlich. Kennt man die Nährstoffansprüche bestimmter Mikroorganismen und auch die damit verbundenen Stoffwechselleistungen, so kann man z.B. mit Hilfe verschiedener Nährmedien verschiedene Keime sicher differenzieren. Im Folgenden sollen die unterschiedlichen Nährstoffansprüche und Stoffwechselleistungen am Beispiel von vier Bakterienarten (Bacillus subtilis, Escherichia coli K 12, Micrococcus luteus, Enterococcus casseliflavus) mit Hilfe verschiedener Nährmedien werden verwendet: (Zubereitung und Zusammensetzung sind den u.g. Ausführungen zu entnehmen). Blut-Agar: Nährmedium zur Isolierung und Züchtung verschiedener anspruchsvoller, vor allem pathogener Mikroorganismen und zur Bestimmung von deren Hämolyseformen. a-Hämlyse: Um die Kolonien herum findet man grüne bis grüngelbliche, trübe Höfe, die dadurch zustande kommen, dass das Hämoglobin zu Methämoglobin und Sulfhämoglobin umgewandelt ist; die Erythrozytenmembran ist weitgehend erhalten. b-Hämolyse: Bei der b-Hämolyse kommt es zu einer vollständigen Auflösung der Erythrozytenmembran und zu einer Verdauung des Hämoglobins; dadurch entstehen um die b-hämolytischen Kolonien durchsichtige, ungefärbte Höfe. Brolac-Agar (Bromthymolblau-Lactose-Agar): Hemmstofffreier Selektivnährboden zur Trennung Lactose-positiver Kolonien von Lactose-negativen, insbesondere bei der Diagnostik von Enterobacteriaceae. Wirkungsweise: Brolac-Agar enthält Lactose, deren Abbau zu Säure einen Umschlag des pH-Indikators Bromthymolblau nach gelb bewirkt. Alkalisierung bewirkt Umschlag nach blau. Calcium-Caseinat-Agar: Selektivagar zum Nachweis und zur Keimzahlbestimmung von proteinabbauenden Mikroorganismen (Proteolyten) in Nahrungsmittel und anderem Untersuchungsmaterial. Wirkungsweise: Der Nährboden enthält Casein, welches von Proteolyten abgebaut werden kann. Als Folge davon entstehen um die Kolonien klare Höfe im sonst trüben Medium (zur Verstärkung der Trübung kann vor dem Erhitzen ca. 5g - 10g / Liter Magermilchpulver zugesetzt werden - zum besseren Erkennen der Höfe können die Platten mit 5 - 10%iger Essigsäure überflutet werden). ENDO-C-Agar: Selektivnährboden zum Nachweis und zur Isolierung fäkaler E.coli und Coliformer in den verschiedensten Materialien nach ENDO (1904). Wirkungsweise. Natriumsulfit und Fuchsin hemmen grampositive Bakterien. E.coli und Coliforme verwerten Lactose unter Bildung von Aldehyd und Säure; Aldehyd wiederum setzt Fuchsin aus der Fuchsin-Sulfit-Verbindung frei, welches dann sie Kolonien rot anfärbt. Bei E.coli ist diese Reaktion so intensiv, dass Fuchsin auskristallisiert und dadurch den Kolonien einen grünschimmernden, beständigen Metallglanz (Fuchsinglanz) verleiht. (Durch Sauerstoffeinwirkung wird der ausgegossene Nährboden infolge Oxydation des Sulfits allmählich rot und dadurch unbrauchbar - Petrischalen mit Parafilm verschließen - Nährboden nur wenige Tage haltbar) Plate-Count-Agar (Caseinpepton-Glucose-Hefeextrakt-Agar): Hemmstoff- und indikatorfreier Nährboden zur Bestimmung der Gesamtkeimzahl in Milch, Milchprodukten, Wasser und anderen Materialien. Die Beschreibung der o.g. Nährböden ist dem „Nährböden Handbuch“ der Firma E.Merck/Darmstadt entnommen.

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Arbeitsgang:

pro Gruppe werden 16 Nährböden nach folgendem Muster hergestellt

↓ ↓

4x 4x 4x 4x ↓ ↓ ↓ ↓ Brolac- Calcium- ENDO-C- Plate- Agar Caseinat- Agar Count- Agar Agar

↓ nach dem Gießen Platten trocknen

↓ im Dreizehnstrichverfahren wird jeweils eine Plattengruppe mit dem gleichen Keim beimpft

↓ zusätzlich wird pro Keim eine Blut-Agar-Platte beimpft

↓ für die Gasbildung benötigt man pro Keim 2 Reagenzgläser mit je ca. 8 ml Medium (8 ml Plate-Count-Agar, 8 ml Brolac-Agar);

das Medium wird nach dem Autoklavieren im Wasserbad auf 50°C abgekühlt und dann mit je 1 ml der entsprechenden

Bakteriensuspension vermischt ↓

die Medien werden anschließend 24 Stunden bei 37°C bebrütet

Aufgaben: 1.) Ermitteln Sie die Koloniemorphologie der vier Bakterienarten für jeden Nährboden (siehe Auswertungsblatt). 2.) Ermitteln Sie die verschiedenen Stoffwechselleistungen der vier Bakterienarten (siehe Auswertungsblatt) und erklären Sie diese mit Hilfe der Veränderungen am Nährsubstrat. 3.) Wie ist das Gramverhalten der vier Bakterienarten?

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Koloniemorphologie von Bacillus subtilis auf: Blut-Agar Brolae-Agar Calcium-

Caseinat-Agar ENDO-C-Agar Plate-Count-

Agar Koloniegröße Oberfläche Kolonierand Profil Transparenz Farbe Koloniemorphologie von Escherichia coli K 12 auf:

Blut-Agar Brolae-Agar Calcium- Caseinat-Agar

ENDO-C-Agar Plate-Count-Agar

Koloniegröße Oberfläche

Kolonierand Profil

Transparenz Farbe

Koloniemorphologie von Micrococcus luteus auf:

Blut-Agar Brolae-Agar Calcium- Caseinat-Agar

ENDO-C-Agar Plate-Count-Agar

Koloniegröße Oberfläche

Kolonierand Profil

Transparenz Farbe

Koloniemorphologie von Enterococcus casseliflavus auf:

Blut-Agar Brolae-Agar Calcium- Caseinat-Agar

ENDO-C-Agar Plate-Count-Agar

Koloniegröße Oberfläche

Kolonierand Profil

Transparenz Farbe

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Stoffwechselleistungen verschiedener Bakterienarten:

Stoffwechselleistung

Bacillus subtilis

Escherichia coli

K 12

Micrococcus

luteus

Enterococcus casseliflavus

1

Lactoseabbau unter Säurebildung

(Brolae - Agar)

2

Eiweißaufbau unter Bildung

klarer Spaltprodukte (Calcium-Caseinat-Agar)

3

Anhäufung reaktiver

Aldehydgruppen beim Kohlenhydratabbau (ENDO-C-

Agar)

4

Gasbildung beim

Kohlenhydratabbau (Plate-Count-Agar 50°C)

5

Gasbildung beim Lactoseabbau

(Brolae-Agar 50°C)

6

α-Hämolyse (Blut-Agar)

7

β-Hämolyse (Blut-Agar)

8

Katalaseaktivität

9

Gramverhalten

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4.0 Versuchsanleitungen: 4.01 Mikroorganismen der Luft, der Haut und an Gebrauchsgegenständen

Einleitung: Die uns umgebende Luft enthält eine Vielzahl der verschiedensten Mikroorganismen. Neben typischen Luftbakterien und Lufthefen können sich auch alle möglichen andere Bakterien (z.B. Bodenbakterien) in der Luft nachweisen lassen, vor allem, wenn sie durch Wind aufgewirbelt worden sind. Die ständige Anwesenheit von Mikroorganismen in unserer unmittelbaren Umgebung, also auch am Arbeitsplatz im Labor, erfordert besondere Arbeitstechniken beim mikrobiologischen Arbeiten, um Verunreinigungen durch normalerweise unerwünschte Luftbakterien zu vermeiden. Typische Luftbakterien bilden häufig charakteristisch gefärbte Kolonien (rot-orange-gelb). Die Färbung kommt durch Carotinoide zustande, die in der Cytoplasmamembran sitzen und das Luftbakterium somit vor der UV-Strahlung schützen. Versuchsziel: Es soll eine quantitative und qualitative Erfassung der Luftkeime vorgenommen werden. Gleichzeitig soll mit diesem Versuch gezeigt werden, wie notwendig steriles arbeiten ist, dies betrifft auch die Kontamination mit Keimen an Gegenständen.

Arbeitsgang: Pro Person werden fünf Platten (jede Petrischale wird mit 20 ml Medium gefüllt) mit Standard-I-Nähragar benötigt. Drei Platten werden 5, 15, und 30 min lang an der Luft ausgesetzt. Von jeder Gruppe (2 Personen) wird der Versuch sowohl im Freien , als auch im Laborraum durchgeführt. Nach der entsprechenden Öffnungszeit wird die Platte wieder verschlossen, beschriftet und bis zum nächsten Praktikumstag bei 28°C umgekehrt( Deckel nach unten) bebrütet. Eine Platte wird für einen Hautabdruck (z.B. mit gewaschenem, ungewaschenem oder desinfiziertem Finger) und die 5. Platte für den Abdruck von Gebrauchsgegenständen (z.B. verschiedene Geldstücke) benutzt. Jede Bakterienzelle bzw. Pilzspore, die auf den Nährboden gelangt ist, hat nach ein- bis mehrtägiger Bebrützeit eine Kolonie gebildet, die man mit bloßem Auge erkennen kann, da sie aus ca. 109 – 1012 Zellen besteht. Zusammensetzung Standard-I-Nähragar: Pepton 15,0; Hefeextrakt 3,0; Natriumchlorid 6,0; D(+)Glucose 1,0; Agar-Agar 12,0; pH 7,5 +/- 0,2 bei 25°C. Vorbereitungen: 1) Berechnung der herzustellenden Menge Standard-I-Nähragar pro Gruppe 2) Ansetzen des Standard-I-Nähragar im Erlenmeyerkolben mit Schliff für jede Gruppe 3) pH-Einstellung 4) Autoklavieren mit aufgesetzten 20 ml Kippautomaten 5) Abkühlung im Wasserbad 6) Gießen des Nährbodens in sterile Petrischale 7) Erstarren lassen und u.U. im Trockenschrank die Petrischalen bei 40-50°C trocknen 8) Inkubation 9) Bebrütung im Brutschrank (28°C)

Abb. 4.0: Trocknen von Agarplatten (Lagerung der Petrischalen im Brutschrank)

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Auswertung: 1) quantitativ: Zählen Sie die auf jeder Luftfangplatte vorhandenen Kolonien. Tragen Sie ihr Ergebnis und die anderen

Ergebnisse ihres Kurses in einer Tabelle zusammen und bilden Sie den Mittelwert, falls für den gleichen Standort mehrere Werte vorliegen. Nehmen Sie eine graphische Darstellung ihrer Ergebnisse vor, indem Sie je eine Kurve für den Standort "Labor“ und "Draußen“ zeichnen.

2) qualitativ: Wählen Sie sich sechs verschiedene Kolonien (möglichst gefärbte) von den Luftfangplatten aus und beschreiben Sie die Koloniemorphologie. Dabei sind auf folgende Punkte zu achten: Farbe, Koloniegröße, Oberfläche, Profil, Kolonieform, Kolonierand, Konsistenz, Geruch (siehe Kriterien für eine Koloniebeschreibung). Mikroskopieren Sie ferner die beschriebenen Kolonien und achten Sie dabei auf Zellform, Zellaggregat und Zellgröße. Beschreiben Sie ferner die Hautabdrücke und die Abdrücke von Gebrauchsgegenständen (z.B. konfluierende Kolonien, verschiedene Kolonien, Anzahl usw.)

Für dieses Praktikum ist ein ausführliches Protokoll anzufertigen! Außerdem sind folgende Fragen zu beantworten:

1) Welche Grundformen lassen sich bei Bakterienzellen unterscheiden, und in welchen Zellverbänden können diese Grundformen auftreten?

2) Warum sind UV-Strahlen für Mikroorganismen besonders gefährlich? 3) Welche prinzipiellen Unterschiede bestehen zwischen einer Hefe- und einer Bakterienzelle?

Tab. 4.0: Koloniemerkmale einiger Bakterienarten Erklärung: M. = Micrococcus

S. = Streptococcus E. = Escherichia Se. = Serratia Chr.= Chromatium (neu = Janthinobacterium lividium, alt = Chromobacterium lividium ) B. = Bacillus Str. = Streptomyces

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Abb. 4.1: Wuchsformen von Bakterien

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4.02 Gewinnung von Reinkulturen der Luftfangplatten(Techniken zum fraktionierten Ausstrich von Mikroorganismen) Einleitung: Will man gezielte mikrobiologische oder biochemische Versuche durchführen, so ist es notwendig, mit einer ganz bestimmten Bakterienart, oft sogar mit einem einzigen Stamm, zu arbeiten. Dieser Stamm darf nur Bakterien mit dem gleichen Erbgut enthalten. Es gibt mehrere Methoden (siehe Abb.4.2), wie man eine Reinkultur herstellen kann, bzw. eine einmal hergestellte Reinkultur reinhalten kann. Die endgültige Isolierung einer Reinkultur von Mikroorganismen erfolgt, bis auf wenige Ausnahmen, auf oder in festen Nährböden. Sie beginnt mit der Abtrennung einer Zelle aus einer Zellpopulation und erfordert, dass auch die aus der Zelle hervorgehende Kolonie von anderen Zellen oder Kolonien getrennt bleibt. Versuchsziel: Es soll gezeigt werden, wie man aus einer Mischkultur mit Hilfe verschiedener fraktionierter Ausstrichverfahren (siehe Abb. 4.2, 4.3, 4.4 u. 4.5) eine Reinkultur herstellt. Arbeitsgang: 1. Praktikumstag: -- Pro Person werden sechs Standard-I-Agar-Platten mit je 20 ml gegossen. Standard-I-Agar: ( g pro Liter ) Pepton 15,0 Hefeextrakt 3,0 Natriumchlorid 6,0 D(+) – Glucose 1,0 Agar – Agar 12,0 pH: 7,5 +/- 0,2 -- Von einer Mischkultur der Luftfangplatte wird mit der Impföse, die vorher im Bunsenbrenner durch Rotglühen sterilisiert wurde, etwas Material entnommen und nach den schematisch dargestellten Methoden auf den Standard-I-Agar-Platten ausgestrichen -- Gegebenenfalls wird mit der sterilen Impföse künstlich eine Mischkultur erzeugt, indem nacheinander von isoliert liegenden, deutlich unterschiedlichen (Farbe) Kolonien wenig Material entnommen wird und dann gemeinsam ausgestrichen wird. -- Die Impföse muss nach Vorschrift ausgeglüht werden. -- Bebrütung der Platten umgekehrt bei 28°C. 2. Praktikumstag: -- Überprüfen der Platten. Liegt eine Reinkultur vor? Typische Fehler sind: -- Die Impföse wurde nicht parallel zum Nährboden gehalten und dieser daher „gepflügt“. -- Die Impföse wurde nicht genügend sterilisiert und daher keine Vereinzelung der Bakterien erzielt. -- Durch unsteriles Arbeiten erfolgt eine Verunreinigung mit Luftkeimen. Versuchsauswertung: -- Beschreiben Sie, an welcher Stelle der Ausstrichplatten eine Vereinzelung der Kolonie vorliegt. -- Beschreiben Sie das makroskopische und mikroskopische Bild der von Ihnen isolierten Bakterien und vergleichen Sie mit der Luftfangplatte. -- Führen Sie mit einer Reinkultur eine Gramfärbung durch und beimpfen Sie damit ein Schrägagarröhrchen.

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Abb. 4.2: Ausstrichmethoden

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Abb. 4.3: Ausstreichen von Mikroorganismensuspension mit der Impföse auf einer Agarplatte

Abb. 4.4: Agarplatte mit Verdünnungsausstrich nach dem 13-Strich-Verfahren. (A) Ausstrichschema. (B) Aussehen des Ausstrichs nach der Bebrütung und der Entwicklung von Kolonien.

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Abb. 4.5: Darstellung des Arbeitsganges zur Gewinnung einer Einzelkolonie

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4.03 Herstellung und Beimpfen eines Schrägagarröhrchens Einleitung: Schrägagarröhrchen sind Reagenzgläser mit Nährlösung und Agar, die in Schräglage erstarren. Man verwendet sie, wenn man Mikroorganismen für längere Zeit aufbewahren will. Dies gilt zum Beispiel für sogenannte „Stammkulturen“. Normale Petrischalen sind für längeres Aufbewahren ungeeignet, da sie sehr schnell austrocknen. In Reagenz- gläsern ist die Agarschicht erheblich dicker. Sie können daher erheblich länger (mindestens ein halbes Jahr) verwendet werden, wenn man die Stammkulturen im Kühlschrank aufbewahrt (bei 4°C). Agarböden sind maximal 4-5 Wochen haltbar. In den modernen Stammkultursammlungen werden Bakterien gefriergetrocknet und können dann unbegrenzt bei –20°C aufbewahrt werden. Man hat errechnet, dass man Bakterien, wenn man sie bei Temperaturen in der Nähe des absoluten Nullpunkts aufbewahrt, Millionen Jahre in lebensfähigem Zustand halten kann. Es gibt große Stammsammlungen, bei der jederzeit alle gewünschten Bakterienstämme angefordert werden können. In Deutschland ist es die DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen in Göttingen). Versuchsziel: Es sollen Schrägagarröhrchen hergestellt werden, und die in Versuch 4.2 isolierte Reinkultur zur Stamm- kultur gemacht werden. Im nächsten Halbjahr soll demonstriert werden, dass die Bakterien noch lebensfähig sind. Arbeitsgang: -- Herstellung von zwei Schrägagarröhrchen pro Person mit je ca. 5 ml Standard-I-Agar. -- Zum Erstarren legt man die Reagenzgläser einfach auf einen Bunsenbrennerschlauch. -- Die Reinkultur aus Versuch 4.2 wird in der auf der Abbildung dargestellten Art mit der vorher sterilisierten Impföse ausgestrichen. -- Falls sich in den Reagenzgläsern Kondenswasser abgesetzt hat, kann dies vorher vorsichtig entfernt werden. -- Die Schrägagarröhrchen werden 1-2 Tage bei 28°C inkubiert. -- Nach der Kontrolle, ob die Bakterien gewachsen sind, werden die Röhrchen in den Kühlschrank gestellt.

Abb. 4.6: Schrägagarröhrchen während des Erstarren des Agars

Abb. 4.7: Beimpfen eines Schrägagarröhrchens

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4.04 Isolierung von Streptokokken aus Zahnbelag Einleitung: Streptococcus salivarius ist ein Milchsäurebakterium, das zur normalen Mundflora eines gesunden Menschen gehört. Dort führen die Bakterien normalerweise ein harmloses Leben als Kommensalen des Menschen. Sie neigen jedoch dazu, sich an den Zähnen festzusetzen (dort finden sie die besten Nahrungsquellen in Speiseresten, die sich zwischen den Zähnen festsetzen) und die sogenannten Plaques zu bilden. Vor allem Streptococcus salivarius bildet enorme Schleimmengen, die wegen ihrer klebrigen Konsistenz das Festhaften an den Zähnen erleichtern. Werden diese Plaques nicht regelmäßig entfernt, so kann das absterbende Bakterienmaterial verhärten und zu Zahnsteinbildung führen. Außerdem scheiden die Streptococcen Milchsäure aus, die den Zahnschmelz angreifen kann. Die Folgen können Parandontitis und Karies sein. Versuchsziel: Aus eigenem Zahnbelag soll Streptococcus (saliva = Speichel; salivarius = schleimig) isoliert und mikroskopiert werden! Achtung! Aufgrund der Problematik einiger antibiotikaresistenten Stämme von Staphylococcus aureus (MRSA) wird eine Reinkultur der DSMZ benutzt. (MRSA = mehrfach- und gegen Methicillin resistenter Staphylococcus aureus) Arbeitsgang: 1. Praktikumstag: Gruppenweise werden 4 Platten HTS-Agar hergestellt. Charakteristisch für diesen Nährboden ist neben dem Hefeextrakt, Trypton und der hohen Saccharosekonzentration die Gelatine.

HTS-Nährmedium: Aqua dest. 1000 ml Hefeextrakt 5 g Trypton 10 g Saccharose 50 g KH2PO4 3 g Gelatine 10 g Agar 15 g pH 7,2 einstellen Mit einem Zahnstocher wird etwas Plaque-Material entnommen, wobei v.a. die hinteren Backenzähne sehr ergiebig sind, da sie von der Zahnbürste schwerer zu erreichen sind. Dieses Plaque-Material wird in einem Tropfen steriler, ¼-starker Ringerlösung verrieben, bis es sich suspendiert hat. Mit der sterilen Impföse wird ein Tropfen entnommen und nach der 13 Strichmethode auf dem HTS-Boden ausgestrichen. Die Platten werden bei 37°C (Mundtemperatur) inkubiert. Auswertung: 2. Praktikumstag: Auswerten der Platten und Mikroskopieren einer typischen Streptococcus salivarius-Kolonie. Sollte bei der Mikroskopie keine Reinkultur zu finden sein, wird von einer Kolonie ein 13 Strich Ausstrich auf einer HTS-Platte gemacht und erneut inkubiert. Stellen Sie das Gramverhalten fest durch Gramfärbung und KOH-Test. Führen Sie den Katalase-Test durch, gegebenenfalls mit einer Reinkultur des zweiten Ausstrichs. Waren Bakterien, besonders Streptococcus salivarius, vorhanden? Man erkennt sie an den typischen Kolonien: relativ groß, stark emporgewölbt (oft kegelförmig), zäh-schleimig bis knorpelig, durchscheinend oder kalkig weiß. Zeichen Sie das mikroskopische Bild! Wie ist das Gramverhalten der Streptococcen? Wie ist der Katalase-Test ausgefallen?

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Fragen: 1) Was versteht man unter Karies, was unter Paradontitis und welche Rolle spielt die Mundflora bei der Entstehung

dieser Krankheit? 2) Erklären Sie mit Hilfe der Zusammensetzung des HTS-Mediums, warum gerade der Verzehr von vielen

Süßigkeiten besonders förderlich für Karies ist! 3) Woraus besteht der von Streptococcus salivarius gebildete Schleim und wie wird er gebildet? 4) Welche Nährstoffansprüche haben Milchsäurebakterien? 5) Welche Bedeutung hat der Katalase-Test bei der Identifizierung von Milchsäurebakterien?

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4.05 Anreicherung und Isolierung fluoreszierender Pseudomonaden Einleitung: Als Pseudomonaden bezeichnet man alle gram-negativen, monopolar begeißelten Stäbchen. Sie sind weitverbreitet und kommen v.a. in Böden und Gewässern vor, die reich an organischer Substanz sind. Einige Pseudomonaden, v. a. Pseudomonas fluoreszens, bilden auf einem Spezialagar fluoreszierende Farbstoffe, die man mit Hilfe von UV-Licht sichtbar machen kann. Mit den in Reinkultur gebrachten Pseudomonaden wird ein für aerobe Bakterien wichtiges Enzym, die Katalase, nachgewiesen. Katalase wandelt das in höheren Konzentrationen stark giftige Wasserstoffperoxid in Wasser und Sauerstoff um. Wasserstoffperoxid entsteht in allen aeroben Lebewesen, auch in Tieren und Menschen, durch spontane Wasserstoffabgabe von NADH2 und anderen Wasserstoffcarriern auf Sauerstoff. Versuchsziel: Mit Hilfe von Teichwasser sollen fluoreszierende Pseudomonaden isoliert werden und die Existenz der fluoreszierenden Farbstoffe durch UV-Licht nachgewiesen werden. Mit Hilfe einer Reinkultur soll überprüft werden, ob die Pseudomonaden das Enzym Katalase besitzen. Arbeitsgang: -- Gruppenweise werden King-B-Platten hergestellt (ca. 8 Platten). Charakteristisch am KB-Medium ist die hohe Glycerinkonzentration. King-Agar B: ( g pro Liter) Pepton 20,0 Glycerin 10,0 K3PO4 . 3H2O 1,8 MgSO4 . 7H2O 1,5 Agar 15,0 pH 7,2 einstellen -- Mit der ausgeglühten Impföse wird von Teichwasserproben ein Tropfen entnommen und nach der 13-Strich-Methode auf KB-Platten beimpft. -- Die Platten werden bei 28°C 1-3 Tage inkubiert. -- Die bebrüteten Platten werden mit der Unterseite nach oben unter eine UV-Lampe gelegt (366 nm). Gelbgrün bis bläulich fluoreszierende, von einem gleichfalls fluoreszierenden Hof umgebene Kolonien, werden mit einem Filzschreiber markiert. Eventuell muss der Versuch in einem abgedunkelten Raum durchgeführt werden. -- Von einer fluoreszierenden Kolonie wird etwas Material entnommen und auf einer weiteren KB-Platte nach der 13-Strich-Methode ausgestrichen und bei 28 C 1-3 Tage inkubiert. -- Kontrollieren der Platten und mikroskopieren einer charakteristischen Kolonie. -- Überprüfen Sie nochmals mit der UV-Lampe, ob Sie Fluoreszenz nachweisen können. -- Mit der ausgewerteten Platte wird der Katalase-Test durchgeführt. Dazu werden pro Gruppe 50 ml einer 3%igen Wasserstoffperoxid-Lösung hergestellt und jede Platte mit soviel beschichtet, dass alle Kolonien bedeckt sind. Ist Katalase vorhanden, erscheinen nach 5-30 Sekunden viele Bläschen, die sogar zur Schaum- bildung führen können. -- Führen Sie mit den Pseudomonaden eine Geißelfärbung durch (siehe 3.3.10).

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Auswertung: -- Beschreiben Sie die Koloniemorphologie und das mikroskopische Bild der von Ihnen isolierten Pseudomonaden. -- War Fluoreszenz zu beobachten? -- War der Katalase-Test positiv? -- Warum kommt es bei Vorhandensein von Katalase zur Bläschenbildung? Fragen: 1.) Schreiben Sie die stöchiometrisch richtige Reaktionsgleichung der Katalasereaktion auf. 2.) Besitzt der Mensch Katalase (Begründung)? 3.) Warum ist Sauerstoff für alle Lebewesen toxisch? 4.) Wie kann in Mikroorganismen Wasserstoffperoxid (außer durch Katalase) noch abgebaut werden? 5.) Wie funktioniert Fluoreszenz bei Pseudomonaden?

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4.06 Anreicherung,Kultur und Identifizierung buttersäurebildender Clostridien (Saccharolytische Clostridien) Einleitung: Die Familie der Bacillaceae umfasst stäbchenförmige, sporenbildende gram-positive Bakterien. Neben der großen Gruppe der aeroben Sporenbildner (Gattung: Bacillus) gibt es eine ebenso große und bedeutsame Gruppe der anaeroben Sporenbildner (Gattung: Clostridium). Wie Bacillus kommt auch Clostridium im Boden vor, allerdings vorwiegend in tieferen Bodenschichten, wo sauerstoffarme bzw. sauerstofffreie Verhältnisse herrschen. Da Clostridien bis auf ganz wenige Ausnahmen obligate Anaerobier sind, müssen bei der Kultur strikt anaerobe Bedingungen gegeben sein. Die Clostridien sind eine große Bakteriengruppe, die sich durch viele Stoffwechsel- varianten auszeichnet. Peptolytische Clostridien vergären Proteine, Peptone und Aminosäuren (zu ihnen gehören die gefährlichen Toxinproduzenten). Saccharolytische Clostridien sind solche, die bevorzugt Polysaccharide oder Zucker abbauen. Arbeitsgang: --- Anreicherungskultur --- Eine Kartoffel mit einem Korkbohrer anbohren (nicht durchbohren) und unter Drehen den Korkbohrer mit dem Bohrkern herausziehen. Das Loch mit Gartenerde etwa zur Hälfte füllen und mit einem Teil eines Bohrkerns wieder verschließen (evtl. mit Tesafilm umwickeln). Die Kartoffel dann in ein hohes Gefäß (z.B. hohes Becherglas, Standzylinder) legen und mit Leitungswasser überschichten. Nach einigen Tagen, bei erhöhter Temperatur (30°C) schon nach 1 bis 2 Tagen, wird Gas gebildet, die Flüssigkeit wird trübe und ist mit Schaum bedeckt. Die Kartoffel fault, die Mittellamellen werden zersetzt, das Gewebe wird weich, durch die Gasbildung steigt die Kartoffel nach oben. Stärke wird zu Glucose gespalten und vergoren, hauptsächlich in verschiedenen Typen der Buttersäuregärung. Der Geruch ist faulig mit Buttersäuregeruch. Alle diese Veränderungen werden hauptsächlich durch Clostridien verursacht. In dieser Anreicherung dominiert in der Regel Clostridium butyricum („Buttersäurebacillus“). Morphologie: grampositives, peritrich begeißeltes Stäbchen, Größe 0,6-1,2 x 3,0.7,0 µm, ovale exzentrisch liegende Sporen; Zellen enthalten als Speicherstoff Granulose, die sich bei Zugabe von Jod braun bis blauviolett färbt; Kolonien auf Glucose-Nähragar grauweiß, glänzend, rund, Durchmesser bis 3 mm; beim Öffnen der Platten Buttersäuregeruch. 1. Praktikumstag: a) Herstellung eines Schrägagarröhrchens (5 ml HPG-Agar bzw. Standard-I-Agar). b) pro Schrägagarröhrchen werden zwei Wattebäusche autoklaviert (im abgedeckten Becherglas gegen Durch- feuchtung schützen). c) Gießen von 2 Plastikpetrischalen (Deckel mit Noppen) mit 20 ml Standard-I-Agar (eine Platte wird im Kühlschrank bis zum 2. Praktikumstag aufbewahrt). d) Herstellung eines Hochschichtagarröhrchens (10 ml Standard-I-Agar). e) Gewinnung des Impfmaterials: Entnahme von 5 ml Flüssigkeit aus unteren Schichten des Rohkulturgefäßes, Kulturflüssigkeit zentrifugieren (etwa 5 Minuten bei 2000 x g), Überstand verwerfen, Sediment pasteurisieren (10 Minuten bei 80 C° im Wasserbad).

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f) Anlegen einer Anaerobenkultur nach Wright-Burri: Bei einem Schrägagarröhrchen nach Beimpfung mit der Impföse einen sterilen Wattebausch hineingeben und den ausragenden Teil der Watte mit abgeflammter Schere abschneiden, den sterilen Rest mit einem Glasstab hineindrücken bis ca. 10 mm über Medium, 2-ten Wattebausch nachschieben, ca. 10-15 mm Abstand zum ersten Wattebausch lassen. Auf der oberen Watte werden 0,4 ml C6H6O3 = Pyrogallol-Lösung (200 g/l) und 0,6 ml K2CO3 = Kaliumcarbonat (200 g/l) gegeben und sofort mit Plastilin und Parafilm verschlossen. g) Eine Petrischale wird im 13-Strich-Verfahren mit dem Inokulum beimpft und im Plattenkorb in den 2,5 l Anaerobentopf gegeben. Ein Anaertest-Streifen (zur Feststellung der Anaerobiose) wird mit einem Tropfen Wasser befeuchtet und an der Lasche des Plattenkorbes befestigt; die Reaktionszone soll frei im Luftraum hängen. 35 ml Wasser werden gleichmäßig auf das Spezialpapier von einer Packung Anaerocult A verteilt: Anaerocult A sofort in den Anaerobentopf mit der bedruckten Seit zu den Platten einstellen und Anaeroben- topf sofort dicht verschließen. h) Das Hochschichtagarröhrchen wird mit einer Impfnadel beimpft (Einstich bis zur ganzen Länge der Nadel). i) Zwei Tage bei 37°C bebrüten. j) Mikroskopie des Sediments aus dem Vorkulturgefäß und von Material aus dem Impfkanal der Kartoffel mit Zeichnung. Achtung: Keine Pyrogallol-Lösung auf die Haut bringen! Pyrogallol ist giftig und wird langsam durch die Haut aufgenommen. Kleine Mengen führen zu einer Hautreizung, größere Mengen zu schweren Blutschädigungen.

Abb. 4.8: Schrägagarröhrchen mit Wright-Burri-Verschluss

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2. Praktikumstag: a) Kontrolle der Kulturröhrchen auf Wachstum und Beschreibung (Geruch).

Abb. 4.9: Auswertung von Sich- und Standkulturen b) Herrschen im Anaerobentopf anaerobe Verhältnisse? (Reaktionszone des Anaerotest-Streifens farblos?). c) Beschreibung des 13-Strich-Ausstriches auf der Platte, Mikroskopie und Anfertigung eines zweiten Aus- strichs von einer typischen Kolonie (z.B. sporentragende Bakterien, möglichst spindelförmig) zur Erzielung einer Reinkultur für die biochemische Identifizierung. Verpackung der Petrischale für die Bebrütung mit dem Anaerocult-A-System: auf den Deckel der Petrischale wird ein Anaerotest-Streifen mit Tesafilm aufgeklebt, so dass die Reaktionszone über den Rand (nach unten) hinausragt. - Befeuchtung der Reaktionszone mit einem Tropfen Wasser. Die Petrischale wird in einen Plastik- beutel gegeben, eine Packung mit Anaerocult P Reagenzmischung zur Erzeugung anaerober Verhältnisse hin- eingeben und mit wasser befeuchten. Dann wird der Plastikbeutel mit dem Folienschweißgerät sorgfältig ver- schweißt und 2 Tage bei 37°C bebrütet. d) Granulose-Nachweis: Eine Öse Clostridien-Suspension mit 2 Ösen verdünnter Lugolscher-Lösung (zur Gram- färbung) vermischen, mikroskopieren und zeichnen. e) Endosporenfärbung nach WIRTZ: -- Hitzefixierten Ausstrich herstellen, ca. 10 bis 20 mal durch die Flamme ziehen. -- Objektträger mit objektträgergroßem Filterpapier bedecken, darauf reichlich Malachitgrün-Lösung (0,5 g/100ml H2O) gießen, über einer schwachen Bunsenbrennerflamme 5-10 Minuten erhitzen (fächeln), nicht sieden und eintrocknen lassen! - Bei Bedarf Malachitgrün nachtropfen. -- Papier mit Pinzette abheben und Objektträger kurz (20 Sekunden) mit dest. Wasser abspülen; sofort trocken tupfen - nicht wischen. -- Mit 1:5 durch dest Wasser verdünnten Karbolfuchsin bedecken. -- Nach 15 Sekunden kurz mit dest. Wasser abspülen (ca. 20 Sekunden) und sofort Trockentupfen - nicht wischen. -- Nachtrocknen lassen. -- Mit Ölimmersion mikroskopieren. Endosporen sind hellgrün, die Mutterzelle und keine Endosporen enthaltenden Zellen rot. Zeichnung anfertigen.

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f) Sporenfärbung nach BARTHOLOMEW und MITTWER: Durchführung mit Agarkulturen (z.B. Wright-Burri-Röhrchen) und mit einer Sporensuspension von Bacillus subtilis (als Vergleichspräparat). -- Lufttrockenen Objektträgerausstrich intensiv hitzefixieren (ca. 10-20 mal durch die nicht rauschende Flamme ziehen). -- Objektträger mit Malachitgrün-Lösung (0,5 g/100 ml dest. Wasser) bedecken und fächelnd bis kurz vor Siedebeginn erhitzen, nicht eintrocknen lassen, evtl. Malachitgrün-Lösung nachgeben, ca. 10 Minuten heiß halten. -- Objektträger mit dest. Wasser gut abspülen (ca. 20 Sekunden) und zur Gegenfärbung 5 Minuten lang Safranin-Lösung (0,5 g/100 ml dest. Wasser) einwirken lassen. -- Vorsichtig abspülen, trocknen (abtupfen) und im Hellfeld mikroskopisch auswerten. Sporen besitzen die Fähigkeit bestimmte Farbstoffe stärker zu binden als das Cytoplasma; Sporen sind hellgrün, vegetative Zellen sind rot. Zeichnung anfertigen.

Abb. 4.10: Sporen unter dem Mikroskop

g) Katalase-Test mit Anaerobiern durchführen. 3. Praktikumstag: a) Beschreibung und Mikroskopie der zweiten 13-Strich-Kultur zur Gewinnung einer Clostridien-Reinkultur. b) Identifizierung der Anaerobier mit dem API 20 A System: Das API 20 A System ermöglicht die schnelle und einfache Durchführung von 21 biochemischen Reaktionen zur Identifizierung von anaeroben Bakterien. Für eine vollständige Identifizierung werden zusätzlich folgende Merkmale untersucht - Wachstum in Stichkultur, Aussehen der Kolonie, Zellmorphologie, Gramfärbung. Prinzip: Das API 20 A System besteht aus 20 Mikroröhrchen auf einem Plastikträgerstreifen, in denen sich die Substrate in dehydrierter Form befinden. Durch Zugabe der Bakteriensuspension in die Mikroröhrchen werden die Substrate gelöst. Die Stoffwechselprodukte werden durch verschiedene pH-Indikatoren oder durch Zugabe von Reagenzien nach 25 bis 48-stündiger Inkubation bei 35-37°C nachgewiesen. (siehe Anhang 5.1)

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4.07 Quantitative und qualitative Bestimmung von Milchsäurebakterien Einleitung: Die Milchsäurebakterien sind wie alle Gärer in der Lage, ohne Sauerstoff Energie zu gewinnen. Sie werden jedoch im Gegensatz zu fast allen Gärern nicht durch Sauerstoff gehemmt, vor allem wenn nur niedrige Sauerstoffpartialdrücke vorliegen. Man nennt solche Bakterien aerotolerant. Interessanterweise besitzen die Milchsäurebakterien (Familie: Lactobateriaceae) keine Katalase, werden aber trotzdem nicht durch Sauerstoff abgetötet. Hat man ein Bakterium unter aeroben Bedingungen kultiviert, und es besitzt trotzdem keine Katalase, so handelt es sich i.d.R. um ein Milchsäurebakterium. Sie kommen sowohl in pasteurisierter Rohmilch, als auch in vielen veredelten Milchprodukten wie z.B. Joghurt, Quark, Kefir u.a. vor. Im Joghurt handelt es sich meist um Streptococcus thermophilus und Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Versuchsziel: Es soll quantitativ und teilweise qualitativ die Zahl der Lactobacteriaceae in 1 g Joghurt, 1 ml Rohmilch o.a. bestimmt werden. Gleichzeitig soll nachgewiesen werden, dass Milchsäurebakterien keine Katalase besitzen, aber trotzdem bei aerober Bebrütung wachsen können. Arbeitsgang: 1. Praktikumstag: a) Pro Gruppe werden 12 CLA-Platten (Chinablau-Lactose-Agar) hergestellt. Da viele Milchsäurebakterien Suppline benötigen, ist dem Nährmedium Fleischextrakt zugesetzt. Chinablau-Lactose-Agar: Selektiv-Medium zu Unterscheidung Lactose-positiver und Lactose-negativer Mikroorganismen sowie zur Keimzahlbestimmung in Milch und Milchprodukten. Der hemmstofffreie Nährboden enthält Lactose als Reaktionskörper (Haupt-C-Quelle), deren Abbau zu Säure vom pH-Indikator Chinablau durch Farbumschlag von farblos nach blau angezeigt wird. Chinablau-Lactose-Agar: ( g/Liter ) Fleischextrakt (Wuchsstoffquelle) 3,0 Pepton aus Casein 5,0 Chinablau 0,375 Lactose 10,0 Agar 12,0-15,0 pH 7,0-7,2 einstellen Die Platten werden 15-30 Minuten bei 50°C im Brutschrank getrocknet. (Platten umgekehrt auf den ab- genommenen Deckel legen.) b) Daneben muss die erforderliche Verdünnungsreihe vorbereitet werden: pro Gruppe 200 ml ¼ starke Ringer-Lösung autoklavieren und 18 sterile Reagenzgläser mit Kapsenberg- kappen, sowie 20 sterile 1 ml Pipetten und 2 sterile 10 ml Pipetten bereithalten. c) 1 g bzw. 1 ml Probe wird unter möglichst sterilen Bedingungen bis zur Verdünnungsstufe 10-9 mit ¼ starker Ringer-Lösung verdünnt. Pro Gruppe werden zwei Verdünnungsreihen angefertigt. Von den letzten 6 Ver- dünnungsstufen wird pro Person eine CLA-Platte mit je 0,1 ml Flüssigkeit bedeckt und auf der Oberfläche bis zur Trocknung auf dem Drehteller ausgespatelt. Beginnt man mit der höchsten Verdünnungsstufe, so kann man zur Probennahme immer die gleiche Pipette verwenden und braucht den Drigalskispatel nur einmal zu Beginn zu sterilisieren (indem man ihn z.B. in etwas Ethanol taucht und diesen abbrennen lässt).

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Abb. 4.11: Ausspateln von Mikroorganismen auf einer Agarplatte mit Drigalskispatel und Drehtisch

d) Die beimpften Platten werden bis zum nächsten Praktikumstag (mindestens 2 Tage) bei 30°C bebrütet. 2. Praktikumstag: a) Auszählung der Platten und Berechnung der Keimzahl über das gewogene arithmetische Mittel. Dieses Ver- fahren findet Anwendung, wenn jeweils zwei Verdünnungsreihen angelegt und eine Doppelmessung durch- geführt wurde. Bei der Berechnung der Keimzahl werden Platten herangezogen, auf denen zwischen 1 und 300 Kolonien gewachsen sind. Mindestens eine Platte muss darunter sein, auf der zwischen 20 und 300 Kolonien vorliegen. Bei kleineren, gut auszählbaren Kolonien können auch Platten mit bis zu 400 Kolonien heran- zogen werden. Die Berechnung erfolgt nach der Gleichung: Σc c = ——————— · d n1 · 1 + n2 · 0,1 c = Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) je ml, bzw. g Σc = Summe der Kolonien aller Platten, die zur Berechnung herangezogen werden n1 = Zahl der Platten der niedrigsten auswertbaren Verdünnungsstufe n2 = Zahl der Platten der nächsthöheren Verdünnungsstufe d = Faktor der niedrigsten ausgewerteten Verdünnungsstufe, hierbei handelt es sich um die auf n1 bezogene Verdünnungsstufe Koloniezahlen werden nur mit einer Stelle nach dem Komma angegeben. Die Auf- und Abrundung erfolgt nach den mathematischen Rundungsregeln (z.B. 55,59 · 104= 5,6 · 105). b) Bei der Auswertung der Platten soll zwischen folgenden Gruppen differenziert werden: -- kleine Kolonien, tief dunkelblau gefärbt mit blauem Hof (Lactobacteriaceae). Aufgrund der Milchsäure- bildung kommt es zu einer starken Senkung des pH-Wertes, der Indikator schlägt von wasserblau nach dunkelblau um. Da die Milchsäurebakterien Gärer sind, bilden sie nur kleine Kolonien. (Im Zweifelsfall führen Sie den Katalase-Test durch.)

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-- große hellblaue Kolonien, meist ohne Hof (Coliforme Bakterien). Die Coliformen, eine Gruppe der Enterobacteriaceae, bilden ebenfalls aus Lactose Säure, jedoch nicht so stark wie Milchsäurebakterien. Als weiteres Unterscheidungsmerkmal dient die Koloniegröße und der Katalase-Test. -- nicht blaugefärbte Kolonien. Das sind alle übrigen Keime, die auf Lactose keine Säure bilden (evtl. Salmonella). -- grünliche Kolonien. Dabei handelt es sich i.d.R. um Staphylococcen. c) Aufgabe: 1.) Berechnen Sie -- wie viel der jeweiligen Bakterien in 1 g bzw. 1 ml Probe vorhanden sind -- die Gesamtkoloniezahl in 1 g bzw. 1 ml Probe 2.) Fertigen Sie einen Untersuchungsbericht an, der mindestens enthalten muss: -- Art, Herkunft und Bezeichnug der Probe -- Art und Datum der Probenahme -- Eingangs- und Untersuchungsdatum -- Temperatur, bei der die Probe bis zur Untersuchung gelagert wurde -- Art der Untersuchung -- Untersuchungsmenge -- Art der Medien -- Bebrütungszeit und Temperatur -- Verdünnungsflüssigkeit -- Anzahl der Kolonien bei den entsprechenden Verdünnungen -- Koloniezahl pro g oder ml (Art des Berechnungsverfahrens) -- gegebenenfalls Abweichungen vom festgelegten Verfahren 3.) Welche Gemeinsamkeiten und Unterschiede besitzen Enterobacteriaceae und Lactobacteriaceae? 4.) Warum bilden Lactobacteriaceae auch nach mehrtägigem Wachstum nur kleine Kolonien aus? Beispielberechnung:

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4.08 Bestimmung der Keimzahl von Milch Versuchsziel: a) Bestimmung der Koloniezahl für die Keime, die auf Chinablau-Lactose-Agar aerob wachsen und Säure aus Lactose bilden, sowie der Keime, die unter den gleichen Kulturbedingungen wachsen, aber keine Säure aus Lactose bilden. b) Bestimmung der Koloniezahl der Keime, die auf saurem Malzextrakt-Agar wachsen (vorwiegend Hefen und Pilze). Material: 4 Verdünnungsflaschen mit je genau 99 ml Ringerlösung (1/4 stark), steril 5 Messpipetten 1ml oder 5 Demeter-Pipetten für 2x1ml + 2x0,1ml, mit Wattestopfen, steril 14 Petrischalen, steril 100 ml Chinablau-Lactose-Agar (s.u.), steril 100 ml Malzextrakt-Agar (s.u.), steril 1 Wasserbad, 45°C, temperaturkonstant 1 Milchprobe, z.B. Vorzugsmilch oder Rohmilch Ringerlösung, ¼ stark: NaCl 2,25 g KCl 0,10 g CaCl2 . 2H2O 0,08 g NaHCO3 0,05 g dest. Wasser 1000 ml Man kann Ringerlösung-Tabletten kaufen (z.B. Merck, Art.-Nr. 10113), die jeweils eine bestimmte Menge des Salzgemisches enthalten und je nach gewünschter Konzentration in einem bestimmten Volumen dest. Wasser aufgelöst werden müssen (1 Tablette/500ml). Chinablau-Lactose-Agar: (als Fertignährboden vorhanden) D(+)-Lactose 10,0 g Pepton aus Casein, tryptisch 5,0 g Fleischextrakt für bakteriologische Zwecke 3,0 g NaCl 5,0 g Chinablau 0,375 g Agar (gereinigt) 12,0 g dest. Wasser 1000 ml pH-Wert mit 2N NaOH auf 7,0-7,2 einstellen. Sterilisation: Vorlösen im Wasserbad bei 100°C, Erhitzen im Autoklav, 15-20 Minuten, 120°C, 1,2 bar. Malzextrakt-Agar (sauer): (A) Malzextrakt 70 g dest. Wasser 500 ml pH-Wert mit 2N HCl auf 3,6-3,8 einstellen Aufkochen und durch ein Faltenfilter filtrieren. (B) Agar gereinigt 12 g dest. Wasser 500 ml In einem Gefäß ansetzen, das etwa das dreifache Volumen fast und sterilisieren. (A) und (B) getrennt sterilisieren durch Erhitzen im Autoklav, 15-20 Minuten, 121°C, 1,2 bar. Nach dem Abkühlen auf 60°C die Komponenten (A) und (B) aseptisch vereinigen (die Malzextrakt-Lösung zur Agar-Lösung geben) und durch Umschwenken mischen. Dann in einem Wasserbad bei 45°C bis zur Verarbeitung aufbewahren, nicht erstarren lassen, da es möglichst nicht wieder auf 100°C erhitzt werden sollte (Agar hydrolysiert dann). Soll das Medium nicht sofort verarbeitet werden, darf man die Komponenten nicht mischen, sondern bewahrt sie getrennt auf. Vor Gebrauch muss dann der Agar im Wasserbad verflüssigt und beide Komponenten auf etwa 60°C temperiert werden. Dann werden sie aseptisch gemischt.

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Die Komponenten (A) und (B) können nicht vor dem Sterilisieren vermischt werden, da dann der Agar in der sauren Lösung bei der hohen Sterilisiertemperatur schnell hydrolisieren und seine Gelierfähigkeit verlieren würde. Arbeitsgang: 1.) Die beiden flüssigen sterilen Kulturmedien im Wasserbad auf 45-48°C temperieren und bei dieser Temperatur im Wasserbad halten. 2.) Drei Verdünnungsflaschen beschriften mit: 10-2, 10-4 und 10-6. (Die 4. Flasche dient als Reserve). 3.) 6 sterile Petrischalen beschriften mit: 10-2, 10-3 ... 10-7 und mit dem Zusatz C versehen. 4.) 6 sterile Petrischalen beschriften mit: 100, 10-1 ... 10-5 und mit dem Zusatz M versehen. 5.) Milchprobe gründlich durchmischen, dann mit einer sterilen Demeter-Pipette 2, 10 ml Milch aufsaugen (ggfls. mit einer 1 ml Messpipette arbeiten). Diese folgendermaßen verteilen: 0,1 ml in Petrischale 10-1/M; 1,0 ml in Verdünnungsflasche 10-2; 1,0 ml in Petrischale 100/M. 6.) Verdünnungsplatte 10-2 gut verschließen und durch 25 maliges Auf- und Abschütteln den Inhalt gut durch- mischen. (Stopfen festhalten!) 7.) Mit neuer steriler Demeter-Pipette 1,0 ml aus der Verdünnungsflasche 10-2 in die Verdünnungsflasche 10-4 pipettieren. 8.) Mit derselben Pipette 2,20 ml aus Verdünnungsplatte 10-2 pipettieren: 0,1 ml in Petrischale 10-3/C; 0,1 ml in Petrischale 10-3/M; 1,0 ml in Petrischale 10-2/C; 1,0 ml in Petrischale 10-2/M. 9.) Verdünnungsflasche 10-4 gut verschließen und den Inhalt wie bei (6) gut durchmischen. 10.) Mit neuer steriler Demeter-Pipette 1,0 ml aus Verdünnungsflasche 10-4 in Verdünnungsflasche 10-6 pipettieren. 11.) Mit derselben Pipette 2,0 ml aus Verdünnungsflasche 10-4 pipettieren: je 0,1 ml in die Petrischale 10-5/C und 10-5/M und je 1,0 ml in die Petrischale 10-4/C und 10-4/M. 12.) Verdünnungsflasche 10-6 gut verschließen und Inhalt wie bei (6) gut durchmischen. 13.) Mit neuer steriler Demeter-Pipette aus Verdünnungsflasche 10-6 0,1 ml in die Petrischale 10-7/C und 1,0 ml in die Petrischale 10-6/C pipettieren. 14.) Kontrollieren, ob die Agarmedien im Wasserbad nicht wärmer als 45-48°C und noch vollständig flüssig sind. Sind die Medien teilweise oder vollständig erstarrt, müssen sie wieder durch Erhitzen verflüssigt werden. 15.) In die Petrischalen mit C Chinablau-Lactose-Agar, in die Petrischalen mit M Malzextrakt-Agar geben: In jede Petrischale unter aseptischen Bedingungen 15-20 ml Agarmedium geben und sofort, solange es noch flüssig ist (nur sehr kurze Zeit) mit der Probe durch vorsichtiges Schwenken der Schale möglichst gleich- mäßig vermischen (in Achterbewegung auf der Tischplatte). Dabei keinen Agar auf den Rand und an den Deckel der Schale gelangen lassen! Agarmedium waagerecht erstarren lassen. 16.) Alle Platten 2-3 Tage bei 30°C, aerob, dunkel bebrüten. Zusatzaufgabe: Zeichnen Sie ein Verdünnungsschema nach der obigen Beschreibung. Auswertung: Chinablau-Lactose-Agar-Platten a) Alle in den Agarplatten erkennbaren Kolonien zählen (gezählte Kolonien mit Faserschreiber - Punkt auf dem Schalenboden kennzeichnen). Nur Platten mit 10 bis 300 Kolonien auswerten. b) Blau gefärbte Kolonien zählen. Dies sind Kolonien von Säurebildner. Bei Milchproben sind die größeren hell- blauen Kolonien mit dunkelblauem Zentrum in der Regel Escherichia coli. Sehr kleine blaue Kolonien (etwa 0,5 mm groß): Enterokokken. Grünblaue und undurchsichtige Kolonien (etwa 1 mm Groß): Staphylokokken. c) Unter Berücksichtigung der Verdünnungsstufen und des Probenvolumens die Gesamtkoloniezahl und die Säurebildnerzahl der Milchprobe errechnen (bezogen auf 1 ml). Malzextrakt-Agar-Platten a) Alle in den Agarplatten erkennbaren Kolonien zählen. Nur Platten mit 10 bis 300 Kolonien auswerten. b) Unter Berücksichtigung der Verdünnungsstufen und des Probenvolumens errechnen, wie viel unter diesen Kulturbedingungen wachsende Keime in 1 ml Milchprobe enthalten sind. Wie ist die Milchprobe nach der bakteriologischen Untersuchung zu beurteilen - entspricht sie den gesetzlichen Bestimmungen (Güteklasseneinteilung)?

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4.09 Antibiogramm mittels Agardiffusionstest Einleitung Auf eine zuvor mit einer Keimsuspension gleichmäßig beimpfte Agarplatte werden wirkstoffhaltige Filterblättchen aufgelegt. Das Antibiotikum diffundiert aus den Filterblättchen in das Nährmedium gemäß eines Konzentrationsgefälles, d.h. je größer die Entfernung vom Zentrum des Blättchens, desto geringer ist die Wirkstoffkonzentration. Dementsprechend wird ein empfindlicher Keim nicht so nahe an das Antibiotikumblättchen heranwachsen können wie ein gegen dieses Antibiotikum weniger empfindlicher. Es entsteht ein Hemmhof um das Wirkstoffblättchen, der von der Rückseite der Platte mit einem Zirkel, einer Schieblehre oder auf Millimeterpapier gemessen werden kann. Dem Hemmhofdurchmesser wird die Sensibilität des Keimes zugeordnet (z.B. empfindlich, mittelmäßig bzw. resistent). Die Messung des Hemmhofdurchmessers erfolgt in mm, wobei als Grenze der Rand gilt, in dem die Kolonien deutlich vermindertes Wachstum zeigen. Teilweise gelten die Hemmhöfe nur für bestimmte Spezies. Daher sollte zur Auswertung immer in den entsprechenden Tabellen nachgeschlagen werden. Der Multidispenser Der Becton Dickinson Dispenser spendet 6 Sensi DiskR-Blättchen und drückt diese automatisch auf dem Agar an. Der Dispenser lässt sich durch einen Höhenstellring verschiedenen Agarhöhen anpassen. Durch die federnd gelagerten Andruckstempel wird gegenüber der Applikation mit der Hand oder mittels Dispensern ohne Andruckmechanik ein besonders gleichmäßiges Auflegen der Blättchen erreicht. Kleine Schwankungen der Nährbodenschichtdicke werden dabei ausreichend ausgeglichen. Hieraus resultiert eine optimale und reproduzierbare Diffusion der Antibiotika in den Agar. Für den Agardiffusionstest schlägt DIN eine Schichtdicke des Nährbodens von 3,5 ± 0,5 mm vor. WHO und FDA empfehlen 4 mm. Hemmhöfe sollen so ausgebildet sein, dass sie sich nicht überschneiden. Hierzu muss der Abstand der Sensi Disc-Blättchen ausreichend groß sein. Bei Verwendung der Becton Dickinson Dispenser für 6 bzw. 8 Kartuschen beträgt der Blättchenabstand (Mitte – Mitte) 25 mm bzw. 23 mm. Bei Aufbewahren des Dispensers mit eingesetzten Kartuschen ist er vor Luftfeuchtigkeit zu schützen. Es empfiehlt sich, den Dispenser in der mitgelieferten Styroporverpackung oder im passenden Plexiglasbehälter zu lagern. Zur Adsorption von Feuchtigkeit sollten die mit Trockenmittel gefüllten Verschlüsse aus den Kartuschenverpackungen beigelegt werden. Ein Aufbewahren über Trockenmittel im Exsikkator ist ebenfalls möglich. Reinigung und Dekontamination des Multidispensers: Der Dispenser sollte in regelmäßigen Abständen gemäß folgendem Schema dekontaminiert werden, insbesondere wenn ein oder mehrere Stempel eine beimpfte Agaroberfläche berührt haben: 1.) Alle Kartuschen entfernen. 2.) Eine leere Petrischale mit einer 3%igen Lysol – Lösung bis zu einer Höhe von 8mm füllen. (Stellung des Höheneinstellrings auf Position II) 3.) Eine weitere Petrischale mit 85%igem Isopropanol auf gleiche Höhe füllen. 4.) Zwei leere Petrischalen mit dest. Wasser füllen. 5.) Dispenser über die Petrischale mit Lysol – Lösung stellen und betätigen, jedoch den großen schwarzen Knopf

30 sec. Lang niedergedrückt halten. Durch Auf- und Abbewegen des Knopfes lässt sich der Dekontaminationseffekt steigern.

6.) Vorgang in den mit Isopropanol bzw. Wasser gefüllten Petrischalen wiederholen. 7.) Dispenser trocknen (durch Abtupfen und Inkubieren im Exsikkator). 8.) Der Dispenser kann durch Autoklavieren bei 121°C während 15 min. sterilisiert werden. Es ist jedoch streng darauf zu achten, dass danach auch das im Innern des Mechanismus befindliche Wasser restlos (z.B. im Exsikkator) entfernt wird, um die Haltbarkeit der Testblättchen nicht negativ zu beeinflussen. Eine weitere Möglichkeit der Sterilisation ist die Behandlung mit Ethylenoxid. Beachten Sie bitte: Sollte beim Gebrauch des Dispensers Störungen auftreten, überprüfen Sie bitte anhand der Gebrauchsanleitung sämtliche Arbeitsstufen des Gerätes. Wenn sich Sensi Disc-Kartuschen nicht einsetzen oder herausnehmen lassen, vermeiden Sie jede Gewaltanwendung. Prüfen Sie zunächst, ob Sie die Kartuschenverriegelung gelöst haben. Wenn Sensi Disc-Blättchen nicht korrekt auf den Agar zu liegen kommen, kann dies mehrere Ursachen haben: Die Kartuschen können durch falsche Lagerung innerhalb oder außerhalb des Dispensers feucht geworden sein. In diesem und in anderen Fällen können die Testblättchen schräg in der Kartusche liegen und klemmen.

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Durch mehrmaliges vorsichtiges Betätigen des Dispensers wird die normale Funktion häufig wiederhergestellt. Nehmen Sie auch die entsprechende Kartusche zum Überprüfen aus dem Dispenser. Entfernen Sie ggf. die untersten Blättchen. Bei verkanteten oder klemmenden Blättchen klopfen Sie die Kartusche auf den Tisch. Setzen Sie diese danach um 180° gedreht wieder in den Dispenser ein. (siehe Anhang 5.3 und 5.4)

Abb. 4.12: Agardiffusionstest. Vier verschiedene Möglichkeiten für die Applikation von Hemmstoffen sind dargestellt. I. Blättchen-, II. Loch-, III. Zylindertest, IV. direkte Auftragung von hemmstoffhaltigem Material.

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4.10 Bestimmung der Penicillinkonzentration durch ein Antibiogramm Einleitung: Antibiotikakonzentration können oft nur schwer auf chemischen Wege ermittelt werden. Da aber, wie bereits erwähnt, der Hemmhofdurchmesser von der Antibiotikakonzentration am Auftragungsort abhängig, kann man aus dem Hemmhofdurchmesser auf die Konzentration schließen. Man vergleicht dabei an einem geeigneten Testorganismus die biologische Wirksamkeit einer nicht bekannten Probe (z.B. eines Filtrates) mit der Aktivität von bekannten Antibiotikakonzentrationen (Standardverdünnung). Diese Form der Wertbestimmung eines Antibiotikums anhand eines Testorganismus wird als Antibiogramm bezeichnet. Bei Antibiogrammen können aber auch anstelle verschiedener Konzentrationen eines Antibiotikums verschiedene Hemmstoffe auf ihre Wirksamkeit gegenüber einem Mikroorganismus geprüft werden, ein Verfahren, das besonders wichtig bei der Bekämpfung von Infektionskrankheiten ist. Die Genauigkeit des Bestimmungsverfahrens steigt mit der Anzahl der parallelen Ansätze. Die folgenden Angaben beziehen sich auf zwei Parallelen. Versuchsziel: In einer wässrigen Probe soll die Penicillinkonzentration durch ein Antibiogramm mit dem Testorganismus Micrococcus luteus bestimmt werden. Material: - Standard-I-Bouillon-Kultur von Micrococcus luteus (oder Bac.subtilis) - Penicillin-G-Natrium oder Penicillin-G-Kalium - Sechs Röhrchen mit je 15,0 ml sterilem, 46°C warmen Standard-I-Agar - Ein Kölbchen mit 50,0 ml sterilem dest. H20 - Sieben Röhrchen mit 5,0 ml sterilem dest. H20 - Eine Petrischale mit einem Blatt trockenem, sterilem Filterpapier - Eine Petrischale mit etwa 15 sterilen Testblättchen (z.B. Sorte 3324 von Schleicher & Schüll, Aufnahmekapazität 220

µl/10 Blättchen) - Eine sterile 1 ml-Pipette - Sieben sterile 5 ml-Pipetten - Sechs sterile Petrischalen (Bodendurchmesser 8,5 cm) - Wasserbad 46°C - Brutschrank 30°C - Pinzette - Brenner - Filzschreiber Arbeitsgang: I) Herstellung der beimpften Gussplatten: 1.) In jede der sechs sterilen Schalen 1,0 ml Flüssigkeitskultur von

M.luteus und 15,0 ml verflüssigten, 46°C warmen Standard-I-Agar geben und gründlich vermischen (die Schalen müssen beim Plattenguss auf einer völlig ebenen Tischplatte stehen, damit die Agarschicht gleichmäßig dick wird). 2.) Nach Erstarren etwa 15 min bei 37 bis 40°C trocknen (Trockenschrank).

II) Herstellen einer Verdünnungsreihe mit bekannten Konzentrationsstufen: 1.) 6 mg Penicillin in 50,0 ml sterilem

dest. Wasser lösen (= 200 Internationale Einheiten (IE) pro ml, 1 IE = 0,6 µg). 2.) Mit einer sterilen 5 ml-Pipette 5,0 ml dieser Ausgangslösung zu 5,0 ml sterilem dest. H20 geben und gründlich durchmischen. 3.) Mit einer frischen Pipette 5,0 ml dieser auf 100 IE/ml verdünnten Lösung in ein weiteres Röhrchen mit 5,0 ml sterilem dest. Wasser übertragen (= 50 IE/ml). 4.) Das halbierende Verdünnen bis zur Konzentrationsstufe 1,6 IE/ml fortsetzen (25, 12,5, 6,3 3,2 1,6 IE/ml).

III) Auflegen der Testblättchen: 1.) Platten mit dem Deckel nach unten auf Millimeterpapier stellen und mit dem

Filzschreiber auf dem Bodenteil der Schale die Applikationsorte für die Testblättchen einzeichnen (siehe Abb. 4.13) und die jeweils vorgesehene Konzentrationsstufe vermerken. 2.) Mit der abgeflammten Pinzette nacheinander zwei Testblättchen in die Lösung mit 1,6 IE/ml gerade soweit eintauchen, dass die Blättchen die Lösung ansaugen können, an sterilem Filterpapier (Schale) abstreifen und nach dem vorgegebenen Schema auf den beimpften Platten deponieren. 3.) Platten 24 h bei 30°C im Dunkeln bebrüten.

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Auswertung: Die Platten auf Millimeterpapier stellen und die Durchmesser der klaren Hemmhofzonen ablesen. Diese Werte in tabellarischer Form den entsprechenden Konzentrationsstufen (IE/ml) zuordnen. Alle Punktepaare (in diesem Fall immer je zwei je Konzentrationsstufe) halblogarithmisch im Koordinatensystem auftragen. Es ergibt sich eine Punktewolke, die in der Regel einen deutlich erkennbaren Trend aufweist. Man zeichnet nun nach Augenmaß eine Ausgleichsgerade durch die Punktewolke und kann dann ablesen, welcher Hemmhofdurchmesser zu einem vorgegebenen Konzentrationswert zu erwarten ist und umgekehrt. Die Penicillinkonzentration der ausgegebenen Probe kann nun mittels der Eichkurve geschätzt werden.

Abb. 4.13: Verteilungsschema für die mit verschiedenen Konzentrationsstufen der Penicillinlösung getränkten Testscheibchen bei parallelen Ansätzen. Die Verteilung soll verhindern, dass die einzelnen Hemmhöfe auf einer Platte einander berühren.

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Abb. 4.14: Beziehung zwischen Hemmhofdurchmesser (arithmetisch aufgetragen) und Antibiotikumkonzentration (logarithmisch Aufgetragen). Testorganismus: Micrococcus luteus (DSMZ Stamm-Nr. 348). Die Kurve zeigt an, welche Penicillinkonzentration (IE/ml) in etwa bei einem vorgegebenen Hemmhofdurchmesser zu erwarten ist, vorausgesetzt, dass die gleiche Testblättchensorte (Aufnahmekapazität 220µl/10Blättchen) verwendet wurde und auch sonst die gleichen Bedingungen herrschten. (Testblättchen mit einer bestimmten Aufnahmekapazität können auch mit einem Aktenlocher aus Filterpapier hergestellt und ihr Aufnahmevermögen mittels dest. Wasser und Feinwaage ermittelt werden.)

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4.11 ATB Antibiogramm Einleitung: Der ATB Streifen (Fa. Bio Merieux) ermöglicht ein zuverlässiges Antibiogramm mit Hilfe eines halbfesten Mediums. Er vereint somit die Vorteile flüssiger und fester Nährböden in sich und ermöglicht die Ermittlung der Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika unter Bedingungen, die denen der Referenzmethode (Agardilutionstest) sehr nahe kommen. Prinzip: Die ATB Streifen enthalten elf Vertiefungen mit einem Antibiotikum in verschiedenen Konzentrationen und zwei Zweiergruppen von Vertiefungen ohne Antibiotikum. Eine Zweiergruppe dient als Wachstumskontrolle, die letzte Zweiergruppe bietet die Möglichkeit, ein Antibiotikum der eigenen Wahl einzusetzen. Das zu testende Bakterium wird in einem Kulturmedium (ATB Medium) in Suspension gebracht und in den Streifen überimpft. Nach 18 – 24 Stunden Inkubation wird das Wachstum visuell oder mit einem Ablesegerät überprüft. Je nach Ergebnis kann der Keim als sensibel, intermediär oder resistent eingestuft werden. Ermittelt wird die geringste Konzentration, bei der das Bakterienwachstum gehemmt wird (minimale Hemmkonzentration MHK). Die Packung ATB CMI ermöglicht die Durchführung von 10 Antibiogrammen. Sie enthält: - 10 einzeln verpackte Streifen mit Trockenmittel - 10 Deckel für die Inkubation - 10 Ampullen ATB Medium - 20 Ergebnisblätter - 1 Arbeitsanleitung (Engl./Franz.) Laborgeräte und Zubehör: - Brutschrank mit 35°C, Bunsenbrenner, Kühlschank (2 – 8°C), Markierstift Haltbarkeit: Die ATB Streifen und Medien können unter Lichtausschluss bei 2 – 8°C bis zum angegebenen Verfallsdatum aufbewahrt werden. Zusammensetzung der Medien: ATB Medium - Mueller-Hinton 1000 ml - Glucose 2 g - Ca2+ad. 50 mg - Mg2+ad. 20 mg - Agar 1,5 g pH 7,2 – 7,4 einstellen Die Medien befinden sich in Ampullen, die mit Hilfe der Verschlusskappe leicht zu öffnen sind. Obwohl das Medium Agar enthält, lässt es sich wie ein Flüssigmedium pipettieren. Es ist empfehlenswert, die Ampullen vor Gebrauch auf Zimmertemperatur zu bringen. Nicht Schütteln! Anmerkung: Der Gehalt an Calcium und Magnesium spielt bei dem ATB Medium eine wichtige Rolle, vor allem bei der Empfindlichkeitsbestimmung von Pseudomonas aeruginosa gegen Gentamycin und grampositiver Kokken gegen Tetracyclin. Arbeitsgang: 1. Vorbereitung des Inokulums Eine Bakteriensuspension entsprechend dem McFarland Standard Nr. 0,5, die durch visuellen Vergleich mit dem Trübungsstandard eingestellt wird, herstellen. Die Standardsuspension wird folgendermaßen hergestellt: BaCl2∗ 2 H2O, 0,048 M 0,5 ml H2SO4 0,36 (1% v/v) 99,5 ml Wenn der Trübungsstandard in luftdicht abgeschlossene Glasröhrchen gegeben wird, kann die Suspension im Dunkeln 5 Monate lang aufbewahrt werden.

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Mit Hilfe einer oder mehrerer Kolonien, die in einer Ampulle Suspensionsmedium oder steriler Ringerlösung bis zur angegebenen Trübung suspendiert werden, wird eine Bakteriensuspension hergestellt, von der mittels einer Transferpipette mit steriler Spritze in das ATB Medium pipettiert wird - 10 µl bei gramnegativen Stäbchen - 50 µl bei Staphylococcen 2. Vorbereitung des Streifens - Den Streifen aus der Verpackung nehmen. - Das Trockenmittel verwerfen. - Die Referenzdaten der jeweiligen Analyse auf dem Rand des Streifens notieren. - Eventuell aus der Liste Einzeltests ein zusätzlichen Antibiotikum auswählen und in den Streifen einbringen. 3. Beimpfung - Mit Hilfe einer ATB Pipette oder einer Eppendorf-Pipette mit steriler Spritze in jeder Vertiefung 135 µl ATB Medium

pipettieren (ca. 104 Keime/Vertiefung). - Den Deckel auf den Streifen legen. - 18-24 Stunden bei 35-37°C inkubieren. 4. Ablesung Das Bakterienwachstum in jeder Vertiefung überprüfen durch direktes Ablesen. Sichtbares Wachstum – der Keim wird nicht gehemmt durch die vorhandene Antibiotikumkonzentration. Kein sichtbares Wachstum – der Keim wird durch die vorhandene Antibiotikumkonzentration gehemmt – die Minimale Hemmstoffkonzentration (MHK) bezieht sich auf die niedrigste dieser Konzentrationen. Anmerkung: Tritt in beiden Kontrollvertiefungen kein Wachstum auf, kann das Antibiogramm nicht interpretiert werden und muss wiederholt werden. 5. Beseitigung des verwendeten Materials Nach Gebrauch werden die Ampullen, Streifen und Pipettenspitzen entweder autoklaviert oder desinfiziert. 6. Qualitätskontrolle - Teststämme: für die Überprüfung der Standardisierung der beschriebenen Methode können die in der betreffenden

beiliegenden Arbeitsanleitung empfohlenen ATCC-Stämme verwendet werden. - Mögliche Fehlerquellen, die die Aussagekraft von ATB beeinflussen können: a) Verwendung von Mischkulturen oder kontaminierten Kulturen. b) Keine oder schlechte Standardisierung der Trübung des Inokulums. c) Schlechte Herstellung oder Aufbewahrung des Trübungsstandards. d) Verwendung eines anderen Mediums als ATB Medium für Staphylococcen und gramnegative Stäbchen. e) Anwendung der für gramnegative Stäbchen beschriebenen Methode für langsam wachsende oder anaerobe Keime ohne entsprechende Vorkehrungen. f) Verwendung von Streifen mit überschrittenem Verfallsdatum oder Streifen, die unsachgemäß aufbewahrt wurden. g) Zu lange Wartezeiten zwischen den einzelnen Arbeitsschritten (von der Herstellung des Inokulums bis zur Inkubation des Streifens). h) Inkubationszeit und Temperatur nicht eingehalten. i) Keine Qualitätskontrolle mit Referenzstämmen.

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4.12 Bouillondilutionstest Einleitung: Bei der Bouillondilutionsmethode wird aus einer Antibiotikastammlösung eine Verdünnungsreihe mit abfallender Wirkstoffkonzentration angelegt. Die Konzentrationen werden so gewählt, wie sie im Organismus unter üblichen Dosierung vorkommen können. Die wirkstoffhaltigen Röhrchen werden mit einer definierten Menge des zu testenden Keims beimpft und bebrütet. Die Konzentration des Antibiotikums im ersten Röhrchen, das kein Wachstum (Trübung) zeigt, ist die minimale Hemmkonzentration (MHK). Arbeitsgang: Für die Wirkstoff-Verdünnungsreihe wird üblicherweise Müller-Hinton-Bouillon (evtl. Standard-I-Bouillon) verwendet. Jedes Reagenzglas soll mit 1 ml jeder Konzentrationsstufe gefüllt sein: z.B. 256, 128, 64, 32, 16, 8 µg/ml Penicillin. Für das Inokulum des zu testenden Keimes wird eine Bouillonkultur angelegt, die ca. 16-20 Std. bebrütet wird. Von dieser Kultur wird mit Bouillon eine Verdünnung hergestellt, die ungefähr 0,2-2 Mio. KBE/ml enthält (Vergleich mit dem McFarland-Standard 0,5). Davon wird jeweils ein ml in alle Röhrchen der Wirkstoffverdünnungsreihe einpipettiert, so dass sich die Keimzahl auf 0,1-1 Mio. KBE/ml und ebenso die Wirkstoffkonzentration auf die Hälfte reduziert. Ein wirkstofffreies, unbeimpftes Röhrchen dient als Sterilitätskontrolle, ein wirkstofffreies, beimpftes als Wachstumskontrolle. Die so beschickten Röhrchen werden bei 37°C 16-20 h bebrütet, mindestens aber so lange, bis in der Wachstumskontrolle eine deutliche Trübung zu sehen ist. Fragen zu ATB/MHK: 1. Warum wird die Bestimmung der MHK durchgeführt? 2. Wie ist der große Unterschied bei der MHK von E.coli gegenüber Penicillin und Ampicillin zu erklären?

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4.13 Bakteriologische Trinkwasseruntersuchung Einleitung: Escherichia coli und Enterobacter aerogenes sind z.B. in der normalen Darmflora vorhanden und von daher relativ ungefährlich, u.a. kann jedoch eine Dyspepsie v.a. bei Kleinkindern vorkommen. Beides sind jedoch wichtige Indikatorbakterien. Findet man sie, so deutet dies darauf hin, dass das Wasser mit Fäkalien in Berührung gekommen ist und es besteht die Gefahr, dass andere gefährlichere Keime wie Salmonellen oder Proteus vorliegen. Der Darm kann nämlich eine Reihe von Seuchenerregern beherbergen, die von akut Kranken, von Rekonvaleszenten und Dauerausscheidern mit dem Kot ausgeschieden werden und gemeinsam mit E.coli ins Wasser gelangen. Findet man solche Bakterien im Trinkwasser, so ist höchste Vorsicht geboten (Cholera, Thyphus, Ruhr etc.!). Nach der Trinkwasserverordnung muss Trinkwasser frei sein von Krankheitserregern. Als Richtwert gilt, dass in 100 ml Trinkwasser keine coliformen Keime enthalten sein sollen. Versuchziel: Mit Hilfe bakteriologischer Methoden soll Wasser (Trinkwasser, Hausbrunnenwasser, Oberflächenwasser) auf Güte, Keimfreiheit, Keimgehalt untersucht werden. Anschließend werden zur genaueren Differenzierung und Identifizierung der Keime biochemische Tests (Oxidase - Test, IMVIC - Test, Enterotube II - Test, API 20 E - Test) durchgeführt. Arbeitsgang: 1. Praktikumstag: Gruppenweise werden 10 EMB- Platten hergestellt, 2 Standard-I–Agar - Platten u. 100 ml Ringerlsg. 2 Platten werden je mit 0,1 ml Leitungswasser, 4 weitere Platten werden mit je 0,1 ml Flusswasser (unverd., 1:10, 1:100 und 1:1000 verdünnt) beimpft und im Oberflächenspatelverfahren ausgestrichen. Die Übrigen 4 Platten werden nicht beimpft und für die Herstellung der Reinkultur im Kühlschrank aufbewahrt , ebenso die 2 Standard–I-Agar – Platten. Die beimpften Platten werden bei 37° C inkubiert. EMB – Agar: Eosin – Methylenblau – Lactose – Saccharose – Agar (als Fertignährboden vorhanden). Zusammensetzung (g/l): Pepton aus Casein 10,0; K2 HPO4x 2,0; Lactose 5,0; Saccharose 5,0; Eosin Y (gelblich) 0,4; Methylenblau 0,065; Agar - Agar 13,5. Wirkungsweise: Der Gehalt an Lactose u. Saccharose ermöglicht die Unterscheidung der L. u. S. negativen Salmonellen u. Shigellen von den Lactose–positiven Coliformen und Lactose-negativen, jedoch Saccharose–positiven Begleitflora ( z.B. Proteus vulgaris, Citrobacter). Unerwünschte Begleitkeime wie insbesondere grampositive Bakterien werden durch die vorhandenen Farbstoffe im Wachstum weitgehend gehemmt. 2. Praktikumstag: Die Kolonien der Wasserprobe werden gezählt und die Zahl der jeweiligen Bakterien pro ml angegeben. Auf dem EMB–Agar lassen sich folgende Kolonien differenzieren: E.coli–Kolonien meist klein mit einem Durchmesser von 2–4 mm, kreisrund und flach, grünlicher Metallglanz im reflektierten Licht, blau–schwarzes Zentrum im durchfallendem Licht. Enterobacter aerogenes–Kolonien größer (Durchmesser größer bzw. gleich 4 mm), konvex, schleimig, konfluierend; grau–braunes Zentrum im durchfallendem Licht ohne Metallglanz; auch bei Klebsiella u.a. Lactose–negative Keime z.B. Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Kolonien durchsichtig, farblos. Von einer E. coli u. Enterobacter aerogenes Kolonie wird mit der 13–Strichmethode je eine Reinkultur auf EMB–Agar und Standard–I–Agar angelegt und die Platten bei 37 °C inkubiert. Für den nächsten Praktikumstag müssen folgende Nährmedien für den IMVIC–Test vorbereitet werden: Pro Person werden 2 Reagenzgläser mit je 5 ml der folgenden Medien angesetzt. I = Indolbildung: 1% Trypton M = Methylrot–Probe: Pepton 0,7%; Glucose 0,5%; K2HPO4 · 3H2O 0,5%; pH 6,9 V = Voges–Proskauer–Reaktion: gleiche Lösung wie für M C = Citratverwertung: Na–Citrat 0,3%; NaNH4HPO4 · 4H2O 0,15%; MgSO4 · 7H2O 0,02%; KH2PO4 0,1%; pH 6,7 Die autoklavierten, verschlossenen Reagenzgläser werden bis zum nächsten Praktikumstag im Kühlschrank aufbewahrt.

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3. Praktikumstag: Von den Reinkulturen wird jeweils etwas Material in sterile Ringerlösung suspendiert und damit die einzelnen Reagenzgläser beimpft (zwei verschiedene Keime). Inkubation bei 37°C. Zusätzlich führt jede Person den Oxidase-Test durch und zwar mit den ungefärbten Kolonien von den Standard-I-Agar-platten. Der Test kann mit flüssigem Reagenz auf Filterpapier oder Oxidase-Teststreifen durchgeführt werden. Sind die Keime Oxidase - negativ, kann die Beimpfung von Enterotube II und API 20E durchgeführt werden; die Beimpfung ist den Arbeitsanleitungen zu entnehmen. (siehe Anhang 5.1 und 5.2) Pro Gruppe kann je eines der biochemischen Identifizierungssysteme benutzt werden. 4. Praktikumstag: Auswertung: Indolbildung – züchtet man Bakterien in kohlenhydratfreiem Medium, das reichlich Aminosäuren u. Oligopeptide enthält, so werden die Aminosäuren teilweise in den katabolischen Stoffwechsel eingeschleust und zum Energiegewinn abgebaut. Beim Abbau von Tryptophan setzen manche Enterobakterien Indol frei, d.h. die Bakterien sind in der Lage, die Seitenkette des Tryptophans abzubauen. Kulturflüssigkeit mit 12 Tropfen (ca. 0,5 – 1 ml) Kovacs–Reagenz überschichten, RG leicht schwenken – nicht schütten – anschließend ruhig stehen lassen. Färbt sich die obere Phase nach wenigen Minuten dunkelrot, so ist das Testergebnis positiv, bleibt sie gelb, so ist es negativ. Methylrot–Probe – Glukose wird von allen Enterobacteriaceae ausgezeichnet verwertet. Beim unvollständigen Abbau während der Gärung entstehen jedoch artspezifisch unterschiedliche Produkte. E–coli bildet z.B. bei der Gemischtsäuregärung viele und starke Säuren (Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure) und säuert damit das Kulturmedium bis zu einem pH unter 5 an; Enterobacter dagegen bildet weniger Säuren, die zudem nach einiger Zeit wieder metabolisiert werden und häuft Acetoin an, wodurch die Kulturflüssigkeit nur vorübergehend angesäuert wird. Setzt man als pH–Indikator etwas Methylrot–Lsg. zu, so schlägt der Indikator je nach Säuregrad von gelb (pH 6,3) über orange (pH 5) nach rot (pH 4,4) um. Mit dieser Probe wird also nur der pH–Wert, nicht die Art und Menge der gebildeten Säuren untersucht. Kultur mit 5 Tropfen Methylrot–Lsg. versetzen und schütteln! Methylrot–Lsg.: Methylrot 0,04 g; Ethanol 60 ml; dest. Wasser 40 ml; pH 5,0. Voges–Proskauer–Reaktion – Einige Mikroorganismen (Enterobacter und Pseudomonas Arten, manche Hefen) bilden bei der Vergärung von Glucose auf verschiedenen Wegen Acetylmethylcarbinol (Acetoin), das z.T. als artspezifisches Produkt zur Differenzierung verwendet werden kann. Zu jeder Kultur zunächst 3 ml Barritt–Reagenz, anschließend 1 ml 40%ige KOH–Lsg. zugeben, gut schütteln. Bei positivem Ergebnis färbt sich die Kulturflüssigkeit innerhalb einiger Minuten rot. Barritt–Reagenz: Naphthol–1 2,5 g; Ethanol 50 ml. Citratverwertung – In Abwesenheit von Kohlenhydraten können viele Mikroorganismen ihren Energiebedarf aus dem Abbau von Citronensäure decken. Ist Citrat verwertet worden, kommt es zu einer Trübung, bei negativem Ergebnis bleibt das Citratmedium klar. Die Auswertung von Enterotube II ist nach Arbeitsanleitung und Codierbuch vorzunehmen. Die Auswertung von API 20E ist nach Arbeitsanleitung und mit Hilfe des Computerprogramms durchzuführen. Aufgaben: 1) Erstellen Sie eine Tabelle, aus der die stoffwechselphysiologischen Unterschiede (bzgl. IMVIC – Test) der von Ihnen identifizierten Keime, inklusive E.coli und Enterobacter aerogenes hervorgehen und vergleichen Sie mit den Literaturangaben. 2) Welche Vertreter der Enterobacteriaceae kennen Sie? Wie sind sie charakterisiert? Wo kommen sie vor? 3) Welcher Gärungstyp ist für Enterobacteriaceae charakteristisch? Welche wichtigen Endprodukte treten bei der Gärung auf? 4) Erläutern Sie den Chemismus der Indol – und Acetoinbildung.

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4.14 Keimtiter, Coliformen -Titer von Wasser, wahrscheinlichste Keimzahl (MPN) Einleitung: Der sog. Keimtiter gibt das kleinste Volumen der Probe an, in dem gerade noch ein Mikroorganismus durch seine Vermehrung nachweisbar ist( Dimension: ml). Er wird bestimmt, in dem verschiedene Volumina der flüssigen Probe bzw. von Verdünnungen einer Probe in einer abgestuften Reihe jeweils mit einem geeignetem flüssigen Kulturmedium vermischt und unter geeigneten Bedingungen bebrütet werden. Das kleinste Impfvolumen, bei dem gerade noch Wachstum im Kulturmedium nachgewiesen werden kann, ist der sogenannte Titer. Je kleiner das Probevolumen ist, in dem gerade noch ein vermehrungsfähiger Keim nachgewiesen werden kann, desto größer ist die Keimkonzentration in der Probe. Die Bestimmung des Titers ist bei Routineuntersuchungen schnell und einfach durchzuführen. Sie ergibt jedoch nur sehr ungenaue Werte für die Keimkonzentration (große Standardabweichungen). Wenn bei der Verdünnung eine Stufe erreicht ist, bei der im Impfvolumen im Mittel etwa ein Keim enthalten ist, ist es sehr vom Zufall abhängig, ob mit dem entnommenen Impfvolumen tatsächlich ein Keim, mehrere Keime oder kein Keim in das Kulturmedium übertragen wird, ob also darin bei der Bebrütung Wachstum eintritt oder nicht. Die zu erwartenden Abweichungen der Ergebnisse von den tatsächliche Keimkonzentrationen sind also mindestens von der Größenordnung der Verdünnungsstufen. Anmerkung: Die Bezeichnung Titer (franz. titre) wird leider für verschiedene Begriffe verwendet. Ursprünglich ist es eine Bezeichnung für Konzentration. In diesem Sinne wird sie auch z.B. noch im Zusammenhang mit Normallösungen und Phagenlysaten gebraucht. In der Serologie wird als Maß für die Antikörperkonzentration eines Antiserums ähnlich wie beim Keimtiter der Verdünnungsgrad verwendet, bei dem gerade noch Antikörper (z.B. durch Agglutinatiosreaktion) nachweisbar sind. Dieser Verdünnungsgrad wird mit Titer bezeichnet.

Versuchsziel: Es soll der coliformen -Titer bzw. E. coli - Titer in einem Wasser (z.B. Hausbrunnen, gering belastetes Oberflächenwasser aus Bach oder Fluss) bestimmt, und dadurch ein schneller Überblick über fäkale Verunreinigung der Wasserprobe gewonnen werden. Zusätzlich soll durch Schnelltests (z.B. Indol - Nachweis, Bactident E. coli (s. Anhang 5.5), Ausstrich auf Endo- C - Agar ) auf Vorhandensein von E. coli in der Anreicherungskultur geprüft werden. Arbeitsgang: (Versuchsdurchführung zum Coliformen – Titer) 1. Praktikumstag: Zunächst wird das Anreicherungsmedium für koliforme Keime angesetzt. Man verwendet BRILA- Bouillon. Es enthält Brillantgrün, Ochsengalle und Lactose und ist als Fertigmedium vorhanden. (Einwaage 40 g/l dest. Wasser). Es werden 7 normale unsterile Reagenzgläser pro Person mit je 10 ml Brila- Bouillon (10 ml Kippautomaten verwenden) gefüllt. Zusätzlich wird ein großes Reagenzglas ( Fassungsvermögen mind. 30 ml) mit Zellstoff- oder Wattestopfen mit 10 ml doppelt konzentrierter Brila- Boullion (80 g/l) gefüllt. In jedes Reagenzglas kommt ein Durham-Röhrchen, ein kleines Gasfangröhrchen, mit der Öffnung nach unten. Dann wird 15 min. bei 121°C sterilisiert. Pro Person wird eine Verdünnungsreihe (Verdünnung jeweils 1 : 10 mit 1/4 starker Ringerlösung) der Wasserprobe bis zur Verdünnungsstufe 10-6 angelegt. Dazu werden 6 sterile Reagenzgläser mit Kapsenbergkappen verwendet. Nach Abkühlung (< 50°C) kann die sterile Anreicherungsbouillon beimpft werden und zwar mit 1 ml der einzelnen Verdünnungen, das 7. Reagenzglas mit 1 ml der unverdünnten Probe. Fängt man bei der höchsten Verdünnungsstufe an, kann eine sterile 1 ml-Pipette für die Beimpfung verwendet werden. Das große Reagenzglas mit der doppelt konzentrierten Bouillon wird mit 10 ml der unverdünnten Probe beimpft. Die Beschriftung der Reagenzgläser sollte so erfolgen, dass jeweils die zugegebene unverdünnte Probe in ml angegeben wird, z. B. 10 ml, 1 ml, 10-1 ml, 10-2 ml, usw. So kann man bei der Auswertung direkt den Titer ablesen. Die Bebrütung erfolgt mind. 24 h bei 37°C. 2. Praktikumstag: Die Anreicherungskulturen werden auf Wachstum überprüft (s. Abb. 4.17). Dazu werden Trübung und Gasbildung

(Gasblase in Durham-Röhrchen?) in allen Reagenzgläsern geprüft und protokolliert (+ = positiv, - = negativ). Das Reagenzglas mit der geringsten Probemengenstufe, das sowohl Gasbildung als auch Trübung zeigt, ergibt den Coliformen-Titer (die notierte Probemengenstufe wird angegeben). Die Versuche einer Gruppe werden als Doppelbestimmung ausgewertet. Ein positives Röhrchen mit der geringsten Probemengenstufe genügt zur Angabe des Titers.

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Abb. 4.17

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1 ml

Ergebnisprotokoll: Bestimmung des Coliformentiters Name: Mitarbeiter: Probe: Datum: Medium: Bebrütung: Verdünnungsstufen 100 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Probe je 1 ml

10 ml Probe und 10 ml Bouillon (doppelt konz.)

Reaktion Probenmengenstufen (ml/g)

� �� �� �� �� �� �� ��

10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 0,00001 0,000001

� = positive Reaktion (Trübung und Gasbildung)

� = negative Reaktion

Der Coliformentiter beträgt .................................. , d.h. in ........................... ml Probe ist noch mindestens ein vermehrungsfähiger Coliformer nachweisbar. Bewertung: _______________________________________

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Zusatztests: Die beiden positiven Reagenzgläser mit der geringsten Probemengenstufe werden zum Nachweis von coliformen Keimen benutzt. Dazu wird ein Ausstrich mit der Impföse auf Endo-C-Agar Platten durchgeführt (3-Ösen Ausstrich oder 13-Strich Verfahren). Nach mind.24 h Bebrütung bei 37°C erkennt man coliforme Keime als rosa bis rot gefärbte Kolonien. Kolonien von E. coli zeigen grünlichen Metallglanz. Als Schnelltests auf E. coli können Indol-Nachweis und Bactident E.coli- Test durchgeführt werden. (siehe Anhang 5.6) Der Nachweis der Indol- Bildung erfolgt nach Zugabe von Kovacs'-Reagenz (ca.0,5 ml) in ein positives Reagenzglas über die Rotfärbung an der Berührungsstelle der beiden Lösungen (nicht schütteln, nur leicht schwenken!). Bei Bactident E.coli-Test der Firma Merck erfolgt die Identifizierung von E.coli über den Nachweis der Enzyme ß-D-Glucuronidase und Tryptophanase (Indolbildung). In der Familie der Enterobacteriaceae ist die ß-D-Glucuronidase-Aktivität ein spezifisches Charakteristikum von E.coli. 94% aller E. coli Stämme besitzen dieses Enzym. Daneben zeigen nur vereinzelte SalmoneIla- und Shigella-Spezies eine positive ß-D-GlucuronidaseReaktion. Die Bildung von Indol ist bei 99% aller E. coli Stämme positiv. Bei den vorliegenden Teststäbchen wird das Substrat 4-Methylumbelliferyl-ß-D-glucurunid(MUG) bei Anwesenheit von ß-D-Glucuridase gespalten. Ein hellblaue Fluoreszenz im UV-Licht (360nm) zeigt die Anwesenheit dieses Enzyms. Der Nachweis der Indol-Bildung erfolgt nach Zugabe von Kovacs-Reagenz über die Rotfärbung der Suspension. 200 µl der Brila-Bouillon werden in eine Reaktionsküvette gegeben und diese ins Tray (Halter) fixiert. Die Inkubation erfolgt bei 37°C über 30 bis 120 min je nach verwendetem Anzuchtmedium). Auswertung der Reaktion unter einer langwelligen UV-Lampe (etwa 360nm). Eine blaue Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von ß-D-Glucuronidase an. Zum Nachweis des gebildeten Indols Zugabe von einem Tropfen Kovacs-Reagenz in die Küvette. Eine positive Reaktion wird nach 1 - 2 min durch eine Rotfärbung angezeigt.

Unschädliche Beseitigung: Reagenzgläser mit bakterienhaltiger Lösung, Reaktionsgefäße und Teststäbchen sind zu autoklavieren und danach zu säubern.

Wahrscheinlichste Keimzahl, MPN-Verfahren: Einleitung: Genauere Werte für die Keimkonzentration als bei der Ermittlung des Keimtiters erhält man, wenn man wie bei der Bestimmung des Keimtiters verfährt, jedoch jeweils mehrere Parallelkulturen mit dem gleichen Volumen der Probe, bzw. ihrer Verdünnung ansetzt. Das Verfahren wird bevorzugt eingesetzt, wenn niedrige Keimzahlen, z.B. <100 /g bestimmt werden sollen. Je nach der Vorhandenen Keimzahl ergibt sich in den unteren Verdünnungen (Grenzverdünnungen) eine bestimmte Verteilung positiver und negativer Röhrchen. Aufgrund statistischer Überlegungen lässt sich jeder der möglichen Verteilungen an bewachsenen und unbewachsenen Röhrchen innerhalb der Verdünnungsreihen eine sog. wahrscheinlichste Keimzahl (most probable number, MPN) zuordnen, Es stehen Tabellen zur Auswertung von MPN-Zählungen mit jeweils drei, fünf und zehn Parallelen zur Verfügung. Mit steigender Zahl an Parallelen nimmt die Genauigkeit zu. Wichtig ist immer, dass genügend weit verdünnt worden ist, und eindeutig negative Ergebnisse vorliegen. Jedes positiv angesprochene Röhrchen muss, insbesondere im Bereich der Grenzverdünnungen und bei Verwendung von Selektivmedien, kulturell bestätigt werden. Arbeitsgang MPN: 1. Praktikumstag: Für Routineuntersuchungen werden im Allgemeinen 3 Verdünnungsreihen mit 3 Reagenzgläsern pro Serie (Ansatz) durchgeführt. Beim Anlegen der Verdünnung muss soweit gegangen werden, dass die höchstgewählte Verdünnung steril ist. Bei der Untersuchung von Hausbrunnenwasser oder geringbelastetem Oberflächenwasser genügen meist 5 Serien mit je 3 Parallelen. Dazu werden 3 x 5 Reagenzgläser mit je 9 ml Brila-BouiIlon (Einwaage 40g/l dest.Wasser) gefüllt, mit Durham-Röhrchen und Kapsenbergkappen versehen und sterilisiert. Der Autoklav darf erst nach Abkühlung auf 100°C geöffnet werden, um Verluste aus den Reagenzgläsern durch Überkochen zu vermeiden. Nach Abkühlung auf unter 50°C kann die erste Serie mit 3 x 1,0 ml Probe beimpft werden. Nach Vermischung auf dem Whirli wird aus jedem Reagenzglas der ersten. Serie ein Reagenzglas der zweiten Serie mit 1,0ml beimpft (eine neue sterile 1-ml-Pipette verwenden). Die Verdünnungsreihe wird entsprechend bis zur höchsten Verdünnungsstufe fortgesetzt. Jedes Röhrchen sollte mit der eingebrachten Probemengenstufe (100 – l0-4 ml der unverdünnten Probe) beschriftet werden. Die Bebrütung erfolgt mind. 24 h bei 37°C.

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2. Praktikumstag: Nach der Bebrütung werden die Ergebnisse in der Weise registriert, dass man die Anzahl der positiven Parallelröhrchen bei jedem Verdünnungsansatz feststellt. Es wird die Serie für die Berechnung herangezogen, die bei der kleinsten Probemengenstufe 3 positive Röhrchen aufweist und die nächst höheren zwei Verdünnungen (Ergebnisse im Bereich der Grenzverdünnungen). Die Anzahl der bewachsenen Röhrchen, in der Reihenfolge fortschreitender Verdünnung geschrieben, ergeben die Stichzahl (significant number), mit der aus der MPN-TabelIe (Tab. 4.1) die wahrscheinlichste Keimzahl ermittelt wird. Der in der Tabelle neben der Stichzahl angegebene MPN-Wert gibt die wahrscheinlichste Keimzahl der Probeverdünnung an, mit der die Parallelröhrchen der geringsten Verdünnungsstufe beimpft wurden. Um die wahrscheinlichste Keimzahl der unverdünnten Probe zu erhalten, wird durch den Verdünnungsfaktor bzw. die Probemengenstufe dieser Verdünnung dividiert. Beispiele: a) Verdünnungen bzw. Probemengenstufe 10-1 10-2 10-3 10-4 positive Röhrchen 3 3 1 0 Stichzahl 310 MPN / ml 450 Die wahrscheinlichste Keimzahl bei der Stichzahl beträgt 4,5 Tab.1). Nach Division durch den Faktor 10-2 ml (entsprechend der in den drei positiven Röhrchen dieser Serie enthaltenen Menge an unverdünnter Probe) ergibt sich die wahrscheinlichste Keimzahl von 450/ml. b) Verdünnungen bzw. Probemengenstufe 10-1 10-2 10-3 10-4

positive Röhrchen 2 2 1 1 Stichzahl 211 MPN/ml 200 Anmerkung: Positive Röhrchen im Bereich der Grenzverdünnungen sind kulturell zu bestätigen!

Tab. 4.1: Tabelle zur Ermittlung der wahrscheinlichsten Keimzahl (MPN) aus der Stichzahl. Verdünnungsschritte jeweils 1:10. Drei Parallelen. Benutzung siehe Text. ___________________________________________________________________________________________

Stichzahl 001 010 011 020 100 101 102 110 111 120 121 130 200 201 MPN 0,3 0,3 0,6 0,6 0,4 0,7 1,1 0,7 1,1 1,1 1,5 1,6 0,9 1,4 ________________________________________________________________________

Stichzahl 202 210 211 212 220 221 222 223 230 321 232 300 301 302 MPN 2,0 1,5 2,0 3,0 2,0 3,0 3,5 4,0 3,0 3,5 4,0 2,5 4,0 6,5 ________________________________________________________________________ Stichzahl 310 311 312 313 320 321 322 323 330 331 332 MPN 4,5 7,5 11,5 16,0 9,5 15,0 20,0 30,0 25,0 45,0 110,0 ____________________________________________________________ Fragen:

a. Wie groß darf der E.coli-Titer für Milch und Trinkwasser sein? b. Nennen Sie Genera und Species von in Brila-Bouillon wachsene Keime. c. Welches Gas produziert E.coli in Brila-Bouillon? d. Wie kommt es zur Indolbildung und wie funktioniert der Nachweis (Farbreaktion)?

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Abb. 4.18: Vorbereitung zur MPN-Bestimmung

Probemengenstufe

Abb. 4.19: Bebrütete Röhrchen ohne und mit Wachstum

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Tab. 4.2: Beziehung zwischen Titer und Keimzahl

Abb. 4.20: Beispiele zur Berechnung der Stichzahl

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Tab. 4.3: MPN-Auswertungstabelle – drei Parallel-Ansätze

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4.15 Zellzahlbestimmung bei Hefen Einleitung: Es gibt prinzipiell zwei verschiedene Möglichkeiten, Mikroorganismen zu zählen: Die Gesamtzellzahl und die Lebendzellzahl. Während bei der Gesamtzellzahl alle Mikroorganismen erfasst werden, werden bei der Lebendzellzahlbestimmung nur die wirklich stoffwechselaktiven erfasst. Zur Bestimmung der Gesamtzellzahl benutzt man Zählkammern. Eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung Der Lebendzellzahl ist das Koch´sche Plattengussverfahren. Dabei werden nur die Organismen gezählt, die Kolonien bilden können, also noch stoffwechselaktiv sind. Logischer Weise muss die Gesamtzellzahl immer größer als die Lebendzellzahl sein. Will man jedoch mit der Zählkammer lebende und tote Zellen voneinander unterscheiden, müssen diese mit Hilfe eines Vitalfarbstoffes differenziert werden. Versuchsziel: Von einem Gramm Hefe (Press- oder Trockenhefe) sollen die Gesamtzellzahl und die Lebendzellzahl bestimmt werden. Ferner soll eine Größenmessung der Zellen und eine Bestimmung des AP- Wertes durchgeführt werden. Arbeitsgang: 1. Praktikumstag: Pro Gruppe Herstellung von 200 ml steriler ¼ starker Ringerlösung (1 Ringer- Tablette in 500 ml dest. Wasser lösen und sterilisieren). Pro Person Herstellung von 3 Petrischalen mit je 10 ml HE – Nährboden und 3 Reagenzgläsern mit HE – Nährmedium: Hefeextrakt 1%; Saccharose 3%; Agar 1,5 %; pH 6,0. Sterilisieren bei 121 °C. Das HE – (Hefe) – Nährmedium ist durch eine hohe Saccharose – Konzentration und einen für Pilze vorteilhaften niedrigen pH – Wert gekennzeichnet. Herstellen der Hefesuspension: 0,1 g Hefe werden in 100 ml Ringer – Lösung gleichmäßig suspendiert. Die Suspension ist unmittelbar vor der Entnahme kräftig zu schütteln, um eine Gleichmäßige Verteilung der Zellen zu erreichen. Herstellen von Verdünnungsreihe: 1 ml der Hefesuspension (V1) wird in einem Reagenzglas mit 9 ml Ringerlösung auf dem Whirli (Reagenzglasschüttler) gut gemischt (V2). Dies wird solange in weiteren 1: 10 Verdünnugsschritten wiederholt, bis eine Verdünnung von V7 = 10 –9 g/ml erreicht ist; verwenden Sie bei jeder Verdünnung eine neue sterile 1,0 ml Pipette, da andernfalls Hefezellen mitgeschleppt werden. Bestimmung der Lebendzellzahl: Von den letzten 3 Verdünnungen V5, V6 und V7 wird jeweils 1 ml in ein im Wasserbad auf 50 °C temperiertes Reagenzglas mit sterilem HE – Medium pipettiert, schnell auf dem Whirli geschüttelt und sofort auf den HE – Nährboden gegeben. Dies muss alles schnell geschehen, da sonst das noch flüssige Nährmedium sehr schnell erhärtet. Nach dem Erstarren des Agars die Petrischalen mit der Unterseite nach oben bei 28 °C bebrüten. Die Reagenzgläser mit Resten von Nährmedium und Hefezellen können mitbebrütet werden. Füllen der Zählkammer: Die Zählkammer nach Thoma und zugehöriges Deckglas mit einem weichen Lappen oder weichen Papiertuch vorsichtig reinigen. Kammer anhauchen, Deckglas auf die Mitte der Kammer auflegen und leicht andrücken (auf den Auflagestegen sollten sich Newton´sche Ringe zeigen). Von der Seite her mit ausgezogener Tropfpipette soviel Hefesuspension (V1) an den Rand des Deckglases bringen, das der Raum unter dem Deckglas gerade gefüllt ist (Kapillarkräfte saugen die Suspension ins Zählfeld).

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Auszählung: Zählkammer unter das Mikroskop legen, bei schwacher Vergrößerung Netzteilung suchen und scharf einstellen (u.U. Aperturblende betätigen). Bei stärkerer Vergrößerung (400–fach) acht b–Felder (=Großquadrate) auszählen. Insgesamt werden (nach erneuter Füllung der Kammer) 2 · 8 b–Felder ausgezählt. Die Zahl der Zellen pro b–Feld sollte zwischen 50 und 80 liegen (entsprechend 3 – 5 Zellen pro c–Feld), sonst wird verdünnt. Während des Zählens verändert man ständig mit der Hand den Feintrieb der Höheneinstellung, weil die Tiefenschärfe oft nicht ausreicht, um alle Zellen über dem Zählnetz zu erfassen. Auf den Begrenzungslinien der c-Felder liegende Hefezellen werden nur einmal gezählt – nur die Zellen auf der oberen und der rechten Begrenzungslinie jedes c-Feldes mitzählen, nicht jedoch die auf der unteren und linken Linie liegenden. Zwischen den Begrenzungslinien der b-Felder liegende Zellen nicht mitzählen. Berechnung des Ergebnisses: Mittelwert der Zellzahl pro b-Felder bilden. Anzahl der Zellen pro c-Feld ermitteln. Die endgültige Berechnung der Gesamtzellzahl/g Hefe erfolgt durch den Umrechnungsfaktor 1 Zelle/c-Feld=̂4 · 106 Zellen/ml

Abb. 4.15: Zählkammerverfahren. (A) Zählkammer nach Thoma. (B) Einteilung der Fläche in Großquadrate (Zählquadrate). (C) Aufteilung eines der 16 Großquadrate in Kleinquadrate. Das Auszählen erfolgt entlang der gestrichelten Linie. Die kleinen Pfeile zeigen an, wie die auf den Grenzen liegenden Zellen zugeordnet werden. Hinweis: (c) = Kleinquadrat (b) = Großquadrat (=16 c) (a) =Netzquadrat (=16 b)

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Auswertungsblatt: Summe der Zellen je Großquadrat

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Auswertung: 2. Praktikumstag: Auszählen der Kolonien auf der Ihnen geeignet erscheinenden Platte ( die Koloniezahl sollte zwischen 20 und 300 liegen, wobei auf den Platten entsprechend der Verdünnungsreihe eine Abstufung in Zehnerpotenzen erkennbar sein sollte ). Auszählen ohne Rücksicht auf Größe und Form der Kolonien. Gezählte Kolonien auf der Rückseite der Platte mit dem Filzschreiber markieren. Sollten neben den charakteristischen Hefekolonien noch andere Kolonien zu sehen sein, so werden diese nicht mitgezählt. ( Kolonien in den bebrüteten Reagenzgläsern gleicher Verdünnungsstufe werden addiert ). Versuchsauswertung: a) Vergleichen Sie die Lebend– und Gesamtzellzahl und berechnen Sie in Prozent, wie viel der in 1 g Hefe vorkommenden Zellen noch lebensfähig sind! b) Ermitteln Sie die Standardabweichung ( s und s %) bezüglich der Auszählung der Großquadrate!

S = ±1

)²(

−−∑

n

XXi

X i = Einzelwert

=X Mittelwert n = Anzahl der Einzelwerte ( b–Felder) c) Beantworten Sie folgende Fragen:

a) Wie kommt der Kammerfaktor 4 · 106 zustande? b) Wie lautet der wissenschaftliche Name der Backhefe? c) Welche Funktion hat die Backhefe beim Backen? d) Warum kann man Hefen nicht als Bakterien bezeichnen?

3. Praktikumstag: Vitalfärbung mit Methylenblau / Größenmessung: Mit Hilfe von Methylenblau ( Vitalfarbstoff ) lassen sich lebende und tote Zellen voneinander unterscheiden. In lebende Zellen aufgenommenes Methylenblau wird durch Dehydrogenasen reduziert und so in die farblose Leukoform umgewandelt. In abgestorbenen Zellen sind diese Enzyme nicht mehr aktiv, d.h. Methylenblau wird nicht reduziert, tote Zellen erscheinen daher blau. Methylenblaulösung: 1) 0,02 g Methylenblau / 100 ml Wasser 2) 6,8 g KH2PO4 / 100 ml Wasser ( = 0,5 M) Versuchsdurchführung: Herstellen steriler ¼ starker Ringerlsg., 0,1 g Hefe in 100 ml Ringerlsg. Suspendieren. 1 ml Hefelösung + 4 ml Methylenblau / Puffergemisch (vor Gebrauch 1:1 mischen) 30 min bei 24° C halten (Wasserbad oder Brutschrank). Direkte Keimzahlbestimmung ( Gesamt – Lebendzellzahl) mit Hilfe des Zählkammerverfahrens; zählen Sie 2 · 8 b-Felder aus!

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Mikroskopische Größenmessumg von Hefezellen: Messen Sie drei verschieden große Zellen (Länge und Breite). (siehe Anleitung Mikroskopische Größenmessung) Versuchsauswertung: 1) Vergleichen Sie die Lebend- und Gesamtzellzahl, und berechnen Sie in % wie viel der in 1g Hefe vorkommenden

Zellen noch lebensfähig sind. 2) Vergleichen und diskutieren Sie die Ergebnisse des 3. Praktikumstages mit denen des 1. und 2. Tages

(Begründen Sie Ihre Aussagen). 3) Warum wird häufig ein geringerer Wert für die Lebendzellzahl nach dem Plattengussverfahren ermittelt, als die

mikroskopische Auszählung ergibt? 4) Wie groß sind Hefezellen im Durchschnitt? 4. Praktikumstag: Ermittlung des AP- Wertes Die Gäraktivität als Maß für die mikrobiologische Qualität eines Hefestammes lässt sich neben der manometrischen Messung auch über den AP- Wert (acidification power = Ansäuerungskraft) bestimmen. Je aktiver ein Stamm ist, desto größer ist der AP- Wert. Versuchsdurchführung: Je 100 mg Trockenhefe/Presshefe mit 5 ml 1% iger KCl- Lsg. suspendieren. 20 min. bei 40 °C im Wasserbad halten. 1min. (evtl. unter Zugabe von Glaskugeln) zur Rehydratation schütteln. 5 ml rehydrierte Suspension zentrifugieren. Zellen 3 Mal mit eisgekühltem dest. Wasser waschen, jedes Mal wieder zentrifugieren. In 10 ml Wasser suspendieren. Mit 0,1 N NaOH pH 3,6 einstellen (Anfangs pH). Bei 30 °C 10 min. bebrüten. Zugabe von 1 ml Glucoselsg. (9 mg/ ml). Weitere 10 min. bei 30 °C inkubieren und danach pH-Messung (End-pH) durchführen. Anfangs-pH – End-pH = AP-Wert Fragen: 1) Wie erklärt sich die Senkung des pH-Wertes? 2) Begründen Sie auftretende Unterschiede im AP-Wert zwischen Trocken- und Presshefe.

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Anleitung: Mikroskopische Größenmessung Einleitung: Größenmessungen an mikroskopischen Objekten sind unter dem Mikroskop mit Hilfe eines Okularmikrometers möglich. Ein Okularmikrometer ist ein kleines Glasplättchen mit einer in 100 Teilstriche geteilten Skala, das nach Einbau in ein Okular in den Strahlengang des Mikroskops gebracht werden kann. Für die Messung von Bakterien kann ein Okularmikrometer mit doppelt so vielen Teilstrichen bei gleicher Länge verwendet werden. Mit dieser Skala wird wie mit einem Lineal ausgemessen, wie vielen Skalenteilen die Länge einer Hefezelle entspricht. Für jede Kombination von Objektiv und Okular (verschiedene Vergrößerung) muss berechnet werden, welcher absoluten Länge ein Skalenteil des Okularmikrometers entspricht. Dafür wird als echter Maßstab ein Objektmikrometer benutzt, eine Skala von genau 1 mm Länge, die in 100 Teile unterteilt ist. Arbeitsgang: 1. Das Mikroskop wird aufgestellt und die Beleuchtung eingestellt. 2. Eichung des Okularmikrometers. Der das Objektmikrometer enthaltene Objektträger wird auf den Objekttisch des

Mikroskops gelegt und die kleine Skala in den Strahlengang des Mikroskops gebracht. Für die Größenmessung der Hefen ist mindestens das 40fache Objektiv erforderlich, das eingestellt wird. Anschließend wird auch mit dem 100fachen Objektiv geeicht.

3. Durch äußerst vorsichtiges Verstellen des Triebrades wird bei gleichzeitiger Beobachtung durch das Okular die Skala des Objektmikrometers scharf eingestellt.

4. Nun werden durch vorsichtiges Verschieben des Objektmikrometers und Drehen des Okulars die beiden Skalen von Okularmikrometer und Objektmikrometer parallel gelegt und teilweise zur Deckung gebracht. (Die ersten beiden Teilstriche < 0 und 0> sollen sich teilweise überlagern.) Sollte nur eine Skala scharf zu sehen sein, lässt sich durch Drehen an der Rändelschraube des Okulars auch die zweite Skala richtig einstellen.

5. Berechnung: Zum Beispiel entsprechen 100 Skalenteile des Okularmikrometers 38 Skalenteilen des Objektmikrometers ( 100. und 38. Teilstrich müssen sich genau decken). Da das Objektmikrometer 1mm lang ist und in 100 Teile zu 0,01 mm geteilt ist, entsprechen diese 38 Skalenteile 0,38 mm = 380 µm . Den 100 Einheiten des Okularmikrometers entspricht 0,38 mm , also ist eine Skaleneinheit des Okularmikrometers 0,38 mm : 100 = 0,0038 mm = 3,8µm. 100 Skalenteile entspricht 0,38 mm = 380µm, also ein Skalenteil entspricht 3,8 µm.

6. Von einer Hefesuspension wird mit einem Glasstab ein winziger Tropfen auf einen Objektträger getupft (nicht auf das Objektmikrometer!) und mit einem Deckglas abgedeckt. Das Deckglas wird fest angedrückt, austretende Flüssigkeit ist gegebenenfalls mit etwas Filtrierpapier abzusaugen.

7. Das Hefepräparat wird im Mikroskop eingestellt und mit dem Okularmikrometer ausgemessen, bzw. geschätzt, wie viel Skalenteilen Länge und Breite einer Hefezelle entsprechen.

116

Abb. 4.16: Größenmessung keimender Pilzsporen. (A) Eichen des Okularmikrometers (1) mit Hilfe eines Objektmikrometers (2): Nach Parallelisierung der beiden Mikrometerskalen erkennt man, dass die 100 Teilstriche (Intervalle) des Okularmikrometers mit einer Strecke von 0,2 mm auf dem Objektmikro- meter übereinstimmen, d. h. 1 Teilstrich (Intervall) entspricht einer Strecke von 2 µm (Objektiv 40 x, Messokular 10 x). (B) Messung der Objektgröße: Nach Entfernen des Objektmikrometers wird ein Prä- parat mit keimenden Pilzsporen auf den Mikroskoptisch gelegt und scharf eingestellt. Mit dem zuvor geeichten Okularmikrometer können nun die pilzlichen Strukturen ausgemessen werden (Objektiv 40 x, Messokular 10x).

117

4.16 Fermentation von Hefezellen Einleitung: Hefen sind äußerst wichtige eukaryontische Mikroorganismen geworden, wie ihre weite Verbreitung in Forschung und Industrie zeigt. Der Schwerpunkt ihrer biochemischen Leistungen liegt in der Produktion von Kohlenstoffverbindungen. Außer für Backzwecke eignen sich Hefen auch für die Futtermittelproduktion und für die Produktion von Alkoholen, aber auch als Produzenten von Vitaminen, Provitaminen, Enzymen, Coenzymen, Purinderivaten u.a. haben sie Bedeutung erlangt. Daneben leisten sie auch Erstaunliches bei der Biotransformation stoffwechselfremder Produkte; Beispiele sind hier die Bildung von Steroidhormonen und die Umwandlung von Fettsäuren in Prostaglandine. In jüngster Zeit gewinnt ein neuer Aspekt zusätzlich an Bedeutung: speziell die leicht zu züchtende Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) lässt sich im Bereich der Gentechnologie einsetzten. Bei S. cerevisiae als eukaryontischem Organismus kann ein fremdes eukaryontisches Gen eher zu einem Genprodukt führen als z.B. in dem Prokaryonten E.coli, da der eukaryontische Prozess der Transskription, Translation und der Spleißung sich deutlich von analogen Prozessen der Prokaryonten unterscheiden. Die Hefetechnologie erhält daher einen ständig wachsenden Anteil in den Bereichen Biotechnologie und Gentechnologie, die für Chemie, Biochemie und Landwirtschaft von Bedeutung sind. Hefen erzeugen unter aeroben Bedingungen aus Glucose neben CO2 und Wasser auch Ethanol, und zwar immer dann, wenn sie mehr Glucose zur Verfügung haben, als sie verstoffwechseln können. Ursache hierfür ist wohl, dass die Enzyme des oxidativen Substratabbaues gesättigt sind, so dass der Pasteur-Effekt (Unterdrückung der alkoholischen Gärung unter aeroben Bedingungen) hier nicht zum Tragen kommt. In dem Fall wird die überschüssige Glucose in einen anderen Stoffwechselweg „gezwungen“, nämlich in den des reduktiven Abbaus, der zur Bildung des Ethanols führt. Glucose Pyruvat (Pyruvatdecarboxylase) Ethanol, CO2 (reduktiver Glucoseabbau) Pyruvatdehydrogenase H2O, CO2 / Atmungskapazität (oxidativer Glucoseabbau) Da die Affinität der Pyruvatdehydrogenase größer ist als die der Pyruvatdecarboxylase (zum selben Substrat), wird aerob normalerweise der oxidative Abbau bevorzugt. Die Bildung von Ethanol beginnt erst dann, wenn infolge zu hoher Glucosekonzentration die Pyruvatkonzentration zu sehr ansteigt. Gelingt es, die Glucosekonzentration im Fermenter ständig im Bereich von 20 bis 40 mg/l zu halten, dann sind alle Zellen optimal mit Glucose versorgt, die Pyruvatkonzentration steigt nicht zu sehr an, die in der Glucose enthaltene Energie steht dann für die Bildung von Biomasse zur Verfügung. Arbeitsgang: I) Geräte/Chemikalien - Oberschalenwaage – Spatel – pH-Meter – 1 Messkolben 1000 ml – 1 Messzylinder 50 ml - 1 Becherglas 250 ml – 1 Becherglas 50 ml – 2 Messpipetten 10 ml – 1 Messpipette 1 ml - Backhefe (ca. 6 g in 40 ml Nährlösung suspendieren) – Glucose Monohydrat – Kaliumchlorid – Ammoniumsulfat –

KH2PO4 · 3H2O – MgSO4 · 7H2O – Hefeextrakt – Citronensäure (0,1 N) - H2SO4 (1 M) – NaOH (1 bzw. 0,1 M) – Polyethylenglykol (Antischaum) II) vorbereitende Aufgaben - Reinigung der für den Versuch benötigten Geräte durch Abwischen mit Ethanol (Desinfektion) und anschließendes

Spülen mit dest. Wasser. - Ansetzen der Lösung: es werden eingewogen

2,0 g KCl 2,0 g (NH4)2SO4 2,0 g K2HPO4 · 3H2O 0,5 g MgSO4 · 7H2O 0,1 g Hefeextrakt 22,0 g Glucose-Monohydrat

III) Herstellung der Kulturlösung - die Stoffe werden in einem 1000 ml Messkolben mit Wasser auf ca. 800 ml aufgefüllt, 5 ml H2SO4 (1 M) zugegeben

und der Ansatz durch Schütteln gelöst - anschließend wird die leicht gelblich gefärbte Lösung mit Natronlauge (1 M) auf pH 4,5 eingestellt - Zugabe von 1 ml Antischaummittel - Mit dest. Wasser auf 1000 ml auffüllen (schütteln).

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IV) Bestimmung der Zellzahl a) unter dem Mikroskop in der Thomakammer 8 b-Felder auszählen, Kammer ausspülen, trocknen, erneut füllen und

auszählen, Werte für spätere Auswertung notieren (auf Newtonsche Ringe achten). b) Parallel dazu Trübungsmessung vornehmen:

(Warmlaufzeit des Photometers berücksichtigen; Gasblasen in der Küvette?) (Filter 546 nm einsetzen, bzw. bei Spektralphotometer 587 nm einstellen)

- zur Nullpunkteichung 0,5 ml Kulturlösung (s.o.) mit 9,5 ml dest. Wasser verdünnen und Nullabgleich des Gerätes vornehmen; diesen Ansatz für spätere Kontrollen aufbewahren.

- zur Extinktionsmessung der Proben analog verfahren. - wenn die Proben nicht sofort gemessen werden können, müssen sie im Kühlschrank gelagert werden, um weitere

Stoffwechselaktivität zu reduzieren (eingefrorene Proben können auch noch nach Wochen gemessen werden). - für die Optische Dichte (OD) gilt OD = E · F

wobei E die Extinktion der jeweiligen Probelösung und F der Verdünnungsfaktor ist. Für die Extinktionen bis 0,3 besteht eine hohe Korrelation zur Biomasse der Probe. Bei höheren Werten muss die Probe weiter verdünnt werden, der Wert für F ändert sich entsprechend! Bei der industriellen Produktion von Backhefe wird entsprechend verfahren, indem gemäß dem aktuellen Bedarf Glucose so gering nachdosiert wird, dass es nicht zur Bildung von Ethanol kommt. Messtechnisch lässt sich Ethanol auf verschiedene Weise erfassen; u.a. kann z.B. das gebildete Ethanol direkt durch eine Elektrode (Ethanolsensor) oder photometrisch durch umsetzen des Ethanols mit ADH (Alkoholdehydrogenase) quantitativ erfasst werden. Bei dem zweiten Verfahren wird Ethanol enzymatisch durch NAD zu Ethanal oxidiert.

CH3CH2OH + NAD+ →ADH CH3CHO + NADH /H+ Da das Gleichgewicht dieser Reaktion auf der Eduktseite liegt, kann es nur durch Einstellen eines alkalischen Milieus und durch Entfernen des Reaktionsproduktes auf die Produktseite gebracht werden. In diesem Fall wird daher das gebildete Ethanal durch das Enzym Aldehyddehydrogenase (ALDH) zu Essigsäure oxidiert.

CH3CHO + NAD+ + H2O →ALDH CH3COOH + NADH /H+ Die bei dieser Reaktion gebildete Menge an NADH /H+ ist der in der Probe enthaltenen Menge an Ethanol äquivalent und wird im UV-Bereich photometrisch bestimmt. Ein Fermenter erlaubt die Durchführung dieses Versuches unter definierten Bedingungen. So lassen sich hierbei Belüftungsrate, Rührerdrehzahl, Temperatur und pH-Werte während der gesamten Versuchsdauer kontrollieren und ggf. korrigieren: - der O2-Gehalt lässt sich über die Einstellung der Belüftungsrate an der Luftpumpe über das Nadelventil am Durchflussmesser und über die Rührerdrehzahl beeinflussen.

- Der Anfangs-pH wird durch Zugabe von H2SO4 oder NaOH eingestellt, während des Versuches kann er je nach Einstellung der Regeleinheit manuell oder meist automatisch durch weitere Zugabe von NaOH oder Citronensäure beeinflusst werden

- Die Temperatur wird durch den Heizstab im Fermenter auf den an der Regeleinheit vorgegebenen Wert gebracht und dort gehalten. Bei diesem Versuch muss natürlich sauber aber nicht notwendigerweise steril gearbeitet werden.

Versuchsziel: 1) Der Bau und die Funktion eines Fermenters für Chargenbetrieb ist kennenzulernen. 2) Durch Bestimmung der Zellzahl durch direkte Messung mit der Zählkammer bzw. durch Trübungsmessung mit dem

Photometer über einen Zeitraum von mehreren Stunden wird die Teilungsrate und die Generationszeit für die Hefe ermittelt.

3) Durch Erfassung der Konzentrationsänderung von Glucose und Ethanol kann das hier zu beobachtende zweiphasige Wachstum (Diauxie) erklärt werden.

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V) Auswertung a) Ermittlung der Teilungsrate und der Generationszeit Die direkt und indirekt gemessenen Zellzahlen werden jeweils logarithmisch gegen die gemessene Zeit in Stunden aufgetragen. Aus dem Verlauf der Kurve während der log-Phase werden Teilungsrate υ und damit die Generationszeit g ermittelt.

Es gilt υ

υ 1;

)(2log

loglog

2

0 =−

−= g

tt

NNt

b) Aus der Steigung der Wachstumskurve (In OD gegen gemessene Zeit t in Stunden) lässt sich die spezifische

Wachstumsrate µ (Anzahl der Verdopplungen der Hefemasse pro Stunde) bestimmen, sowie die Verdopplungszeit td .

Es gilt µ

µ 2;

0

0 Int

tt

ODInODInd

t =−−

=

VI) Bestimmung der Konzentration der Glucose in der Nährlösung. Der im Verlauf der Fermentation abnehmende Glucosegehalt des Nährmediums wird durch photometrische Bestimmung mit 3,5-Dinitrosalizylsäure (2-Hydroxy-3,5-dinitrobenzoesäure) nachgewiesen. Versuchsdurchführung: Herstellung der 3,5-Dinitrosalyzylsäure (DNSS). 1 g DNSS wird im Becherglas in ca. 50 ml Natronlauge, c (NaOH) = 1 mol/l, unter Erwärmen gelöst. Anschließend werden 30 g Kaliumnatriumtartrat zugegeben und gelöst. Die erkaltete Lösung wird auf 100 ml mit Wasser aufgefüllt. Standard: 1 ml des unbewachsenen Nährmediums für die Hefefermentation mit 22,0 g/l Glucosemonohydrat wird in ein Reagenzglas pipettiert. 9 ml Wasser wird dazugegeben und das Ganze gut durchmischt. Proben: Aus dem Bioreaktor werden alle 30 min. 5 ml Probe entnommen und sofort in der Zentrifuge scharf abzentrifugiert. Aus dem Überstand werden 1 ml in ein Reagenzglas pipettiert und 9 ml dest. Wasser dazupipettiert und das Ganze gut durchgemischt. Hinweis: Können die Proben nicht sofort aufgearbeitet werden, müssen sie im Eisbad gekühlt werden! Glucosebestimmung: In beschriftete Reagenzgläser werden pipettiert: Reagenzienleerwert Standard Probe ---- 1ml* 1ml* DNSS 2ml 2ml 2ml dest. Wasser 8ml 7ml 7ml *nach Vorschrift verdünnt (F=10) Die Reagenzgläser werden genau 5 min. in siedendes Wasser gestellt. Anschließend werden sie 3 min. unter fließendem Wasser abgekühlt. Das Photometer wird auf 546 nm eingestellt, der Reagenzienleerwert in eine Küvette gefüllt und damit das Photometer auf 100% T bzw. 0,000 E abgeglichen. Danach wird der Standard in eine Küvette gefüllt und dessen Extinktion gemessen und notiert. Anschließend wird mit den Proben entsprechend verfahren. Hinweis: Es ist empfehlenswert, alle Ergebnisse der Glucosebestimmung durch Doppelbestimmung abzusichern! Berechnung des Glucosegehaltes: EProbe cProbe = ------------ · 10 EStandard Das Ergebnis ergibt die Glucosekonzentration (als Monohydrat!) in g/l und wird umgerechnet auf die Konzentration an wasserfreier Glucose und als solche in das vorbereitete Versuchsdiagramm eingetragen.

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VII) Bestimmung des Alkoholgehaltes durch Destillation Die Bestimmung des Alkoholgehaltes in der Kulturlösung nach beendeter Fermentation geschieht durch Destillation und Bestimmung des Gewichtsverhältnisses bei 20° / 20°C des Destillates. Dazu wird zunächst die Masse a eines leeren und trockenen 100-ml-Messkolbens (bzw. Pyknometers) mit Stopfen auf der Analysenwaage bestimmt. Danach wird der Messkolben mit destilliertem Wasser gefüllt und mindestens 15 Minuten in ein Wasserbad von 20°C gestellt. Dann wird die Oberfläche des Wassers genau auf die Marke eingestellt, der Messkolben außen sorgfältig getrocknet und auf der Analysenwaage seine Masse b bestimmt. Der Messkolben wird entleert und dient zum Auffangen des Destillates. Aus 150ml Kulturlösung werden nun nach Zugabe von Siedesteinen ca. 100ml in die Vorlage abdestilliert. Der Messkolben mit dem Destillat wird erneut im Wasserbad temperiert (mit Stopfen) und mit dest. Wasser bis zur Marke aufgefüllt. Nach sorgfältigem Abtrocknen wird seine Masse c bestimmt. Die Berechnung des Gewichtsverhältnisses bei 20°/20°C geschieht nach folgender Formel:

ab

acS

−−=

Aus der Tabelle wird für das ermittelte Gewichtsverhältnis S die Masse des Alkohols in g in einem Liter Destillat entnommen und auf den Alkoholgehalt in g in 1 Liter Kulturflüssigkeit umgerechnet. Dann kann mit Hilfe der Tabelle der Alkoholgehalt in Vol% für die Kulturflüssigkeit angegeben werden. VIII) Enzymatische Ethanol-Bestimmung (UV-Test) Prinzip: Ethanol wird durch Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) in Gegenwart des Enzyms Alkohol-Dehydrogenase (ADH) zu Acetaldehyd oxidiert. Ethanol + NAD+ →

ADH Acetaldehyd + NADH + H+

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4.17 Bakteriologische und chemische Harndiagnostik Mit Cult-Dip plus (Fa. MERCK) lässt sich die Keimzahl im Harn in Klinik und Praxis einfach, schnell und zuverlässig bestimmen. Darüber hinaus ist Cult-Dip-plus das ideale Transportmedium. Cult-Dip-plus kann anstelle von Urin zur Keimindentifizierung und Resistenzbestimmung an ein bakteriologisches Labor versandt werden. Klinik Der Harnweginfekt zählt zu den häufigsten bakteriellen Infektionen des Menschen. Ein hoher Prozentsatz dieser Harnweginfekte wird nicht erkannt und wird deshalb auch nicht behandelt. Darauf gründet die Forderung, auf breiter Basis nach Harnwegsinfektionen zu fahnden. Eine Reihe von prädisponierenden Faktoren, wie primäre oder sekundäre Obstruktionen mit Harnstauung, neurologische Störungen der Harnentleerung, Missbildung an den Nieren und ableitenden Harnwegen, vesikoureteraler Reflux, Diabetes mellitus, Gicht, Schwangerschaft, Hypertonie, Phenazetin-Missbrauch, chronische Obstipation, fördern die Entstehung eines Harnweginfektes bzw. einer Pyelonephritis oder begünstigen das Fortschreiten dieser Erkrankung. Denn wie aus klinischen Untersuchungen hervorgeht, stellt die Pyelonephritis die häufigste aller Nierenerkrankungen dar. Daher ist die Suche nach einer Pyelonephritis in besonderem Maße angezeigt. Diagnose von Harnwegsinfekten Die Diagnose einer Pyelonephritis gründet sich vor allem auf die Urinuntersuchung. Als Kardinalsymptome gelten signifikante Bakteriurie (nach Kass: >100000 Keime pro ml) und Leukozyturie. Die Keimzahlbestimmung im Harn ist daher neben klinischen Befunden eine der wichtigsten diagnostischen Maßnahmen zur Erkennung der akuten und chronischen Pyelonephritis. Die häufigsten Keimzahlen bei Bakteriurien liegen über 107 Keime/ml. Die Pyelonephritis kann auch zeitweise ohne Bakteriurie einhergehen. Fehlt eine Bakteriurie, weisen aber Angaben über frühere Nierenerkrankungen, Röntgenbilder und andere Befunde auf eine Pyelonephritis hin, so sind wiederholte Untersuchungen auf Bakterien angezeigt. Als Faustregel kann gelten: Im frisch gelassenen Mittelstrahlurin bedeuten: 100000 Keime/ml Harn und mehr eine signifikante Bateriurie und damit einen behandlungsbedürftigen Harnwegsinfekt. 10000 bis 100000 Keime/ml gelten als verdächtig (Wiederholung der Untersuchung erforderlich.) Keimzahlen unter 10000 pro ml sind als Kontamination anzusehen. Zur weiteren Diagnostik kann Cult-Dip Plus an ein bakteriologisches Labor gesandt werden, ohne dass eine Verfälschung der Ergebnisse eintritt. Der problematische Urinversand erübrigt sich. Statt dessen wird der mit Harn beschickte Nährbodenträger im verschraubten Röhrchen versand.(Versandgefäß benutzen!). Im bakteriologischen Labor können nach Abimpfen der Keime von Cult-Dip Plus eine Keimidentifizierung und die Bestimmung der Keimsensibilität (Antibiogramm) durchgeführt werden. Aber auch ohne Speziallabor bleibt Cult-Dip Plus die wichtigste Screeningmethode zur Erfassung einer Bakteriurie, ganz gleich, ob klinische Erscheinungen bestehen, oder es sich um eine asymptomatische Form handelt. Besonders wichtig ist die Fahndung nach einer asymptotischen Bakteriurie bei Schwangeren, Kindern oder Diabetikern. Die bakteriologische Harnuntersuchung ist darüber hinaus Voraussetzung für eine zuverlässige Kontrolle des Therapieverlaufs und des Therapieerfolgs. Bei der Kontrolle des Therapieverlaufs ist ein Absinken der Keimzahl mittels Cult-Dip Plus festzustellen, wenn das verabreichte Medikament wirkt. Kann mit Cult-Dip Plus nach Abschluss der chemotherapeutischen Behandlung keine Bakteriurie mehr nachgewiesen werden (Kontrolle frühestens nach 3 behandlungsfreien Tagen), so ist die Therapie als erfolgreich anzusehen. Rezidive müssen durch mehrere Wiederholungsuntersuchungen in monatlichen Abständen ausgeschlossen werden. Untersuchungen, die das herkömmliche, aufwendige Gussplattenverfahren mit Cult-Dip Plus verglichen haben, erbrachten eine fast hundertprozentige Übereinstimmung der Ergebnisse. Falsch negative Befunde können bei Anwendungen von Cult-Dip Plus praktisch nicht vorkommen. Falsch positive Befunde können durch Kontamination bei unsachgemäßer Harngewinnung, durch Verwendung von unsterilen Gefäßen und bei zu langer Lagerung des Urins bei Zimmertemperatur entstehen. Die Keimzahl liegt dann meist im Grenzbereich, in dem eine Wiederholung der Untersuchung erforderlich ist. Chemische Harnuntersuchung Harnteststreifen (z.B. Combur-Test, Ecur-Test u.a.) werden zur Bestimmung von Nitrit, pH, Eiweiß, Glucose, Keton, Urobilinogen, Bilirubin und Blut im Harn benutzt.

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Durchführung Der Teststreifen wird kurz (max. 1 sec) in den gut durchmischten, unzentrifugierten Harn eingetaucht. Beim Herausnehmen seitliche Kante am Gefäßrand abstreifen, um überschüssigen Harn zu entfernen. Nach 60 Sekunden Reaktionsfarbe mit der Farbskala vergleichen. Farbänderungen die nur an den Rändern der Testbezirke oder nach mehr als zwei Minuten auftreten, sind diagnostisch ohne Bedeutung. Der Teststreifen kann ins Protokoll eingeklebt werden. Fragen 1.Welche Bakterien kommen mit welcher Häufigkeit für eine Harnwegsinfektion in Frage? 2.Wie ist die Gattung Pseudomonas charakterisiert? 3.Welche Bedeutung haben die einzelnen chemischen Tests bei der Harnuntersuchung?

Abb. 4.17: Eintauchobjektträger

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5.0 Anhang 5.1 Gebrauchsanleitung API 20 E

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5.2 Gebrauchsanleitung Enterotube II

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5.3 Gebrauchsanleitung „Sensi Disc-Dispenser“

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5.4 Hemmhofdurchmesser zur Bewertung von Agardiffusionstest-Ergebnissen

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5.5 Identifizierung von Mikroorganismen

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5.6 Bactident E.coli-Test

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5.7 Gebrauchsanleitung Autoklav

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5.8 Vorlage für Betriebsanleitung

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6.0 Literatur: Lehrbücher: BAUERNFEIND, S.; SHAH, P.M.: Lexikon der Mikrobiologie und der Infektiologie, 2. Aufl. Schattauer, Stuttgart 1995 CYPIONKA, H.: Grundlagen der Mikrobiologie, 2. Aufl. Springer, Berlin 2002 FRITSCHE, W.: Mikrobiologie, 2. Aufl. Spektrum, Jena 1999 FUCHS, G.: Allgemeine Mikrobiologie, 8. Aufl. Thieme, Stuttgart 2006 GRAFE, A.: Viren, Parasiten unseres Lebensraumes, 1. Aufl. Springer, Berlin 1977 HAUSMANN, K.; KREMER, B. P.: Extremophile, Mikroorganismen in ausgefallenen Lebensräumen, 1. Aufl. VCH, Weinheim 1993 KULKE, C.: Bakteriologie, 1. Aufl. Wachholz, Nürnberg 1994 MADIGAN, M.; MARTINKO, J.: Brock, Mikrobiologie, 11. Aufl. Pearson, München 2006 MALMGREN, B.: Einführung in Mikrobiologie, 1. Aufl. UTB, Stuttgart 1976 MUNK, K.: Grundstudium Biologie, Mikrobiologie, 1. Aufl. Spektrum, Heidelberg 2001 SCHLEGEL, H.-G.: Allgemeine Mikrobiologie, 7. Aufl. Thieme, Stuttgart 1992 SINGELTON, P.: Einführung in die Bakteriologie, 2. Aufl. Quelle u. Meyer, Heidelberg 1995 SPRÖSSIG, M.; ANGER, G.: Mikrobiologisches Vademekum, 4. Aufl. Fischer, Stuttgart 1988 Methoden: ALEXANDER, S.; STRETE, D.: Mikrobiologisches Grundpraktikum, 1. Aufl. Pearson, München 2006 BAST, E.: Mikrobiologische Methoden, 2.Aufl. Spektrum, Heidelberg 2001 BAUMGART, J.: Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln, 3. Ergänzungslieferung Behrs, Hamburg 1997 BIRKENBEIL, H.: Laborbücher Biologie, Einführung in die prakt. Mikrobiologie, 1. Aufl. Diesterweg, Frankfurt a. M. 1983 DAWID, W.: Experimentelle Mikrobiologie, 4. Aufl. Quelle und Meyer, Heidelberg 1981 DREWS, G.: Mikrobiologisches Praktikum, 4. Aufl. Springer, Berlin 1983 OTTE, H.-J.: Leitfaden der Medizinischen Mikrobiologie, 5. Aufl. Fischer, Stuttgart 1974 PICHHARDT, K.: Lebensmittelmikrobiologie, Grundlagen für die Praxis, 2.Aufl. Springer, Berlin 1989 STEINBÜCHEL, A.: Mikrobiologisches Praktikum, Versuche und Theorie, 1. Aufl. Springer, Berlin 2003