CAROTENOIDES, CONCEPTOS FUNDAMENTALES Y SU IMPORTANCIA EN EL

HOMBRE

INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………………3

PRIMERAS INVESTIGACIONES SOBRE FOTOSÍNTESIS

1.1 Resumen histórico de las primeras investigaciones sobre la fotosíntesis………………4

CONCEPTOS FUNADAMENTALES SOBRE FOTOSÍNTESIS Y PIGEMENTOS FOTOSINTÉTICOS, ROL DE LOS CAROTENOIDES

1.1Cloroplastos: estructuras y pigmentos fotosintéticos……………………………………6

1.2Nociones sobre la absorción de luz por vegetales………………………………………8

1.3Efecto Emerson: fotosistemas cooperativos……………………………………………11

CAROTENOIDES: CONCEPTOS Y FUNDAMENTOS

1.1 Pigmentos carotenoides: consideraciones estructurales y fisicoquímicas……………12

1.2 Estructura química……………………………………………………………………...13

1.3 Propiedades físico-químicas……………………………………………………………15

CAROTENOIDES Y SUS DERIVADOS EN LA SALUD DEL HOMBRE

1.1Concentraciones de Carotenoides, Tocoferol y Retinol en el Cerebro de Personas de Edad Avanzada…………………………………………………………………………18

1.2Contenido en la dieta de carotenoides y vitaminas A, E, y C, y degeneración macular avanzada relacionada con la edad………………………………………………………20

1.3Niveles Plasmáticos de Retinol y Riesgo de Hepatocarcinoma…………………….….22

BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………….………...23

INTRODUCCIÓN

Los pigmentos carotenoides constituyen un grupo de compuestos ubicuos en la naturaleza que realizan una serie de funciones que los hacen especiales. Así, son considerados compuestos indispensables para la vida, fundamentalmente debido a las diferentes funciones que llevan a cabo en relación con la fotosíntesis tal y como se conoce hoy en día. Durante muchos años, la importancia nutricional de los carotenoides se debió a que algunos de ellos poseen actividad provitamínica A, si bien el que el interés por estos isoprenoides se haya multiplicado en los últimos años se ha debido a una gran variedad de estudios que parecen indicar que actúan como antioxidantes y que podrían ser beneficiosos para la prevención de diversas enfermedades crónicas humanas no transmisibles, si bien existe todavía cierta controversia al respecto. En cualquier caso, las funciones y efectos debidos a estos pigmentos se deben a sus propiedades físico-químicas y que éstas a su vez son consecuencia de su estructura química.

Alto

Resumen histórico de las primeras investigaciones sobre la fotosíntesis

Antes del siglo XVIII los científicos pensaban que los vegetales obtenían todos sus componentes del suelo. En 1727, Stephen Hales sugirió que parte de sus nutrientes provenían de la atmósfera, y que la luz participaba de alguna manera en el proceso. En aquellos mementos todavía no se sabía que el aire contenía diferentes elementos en estado gaseoso.

Figura 01. Relaciones energéticas de fotosíntesis y respiración

En 1771, Joseph Priestly, un clérigo y químico inglés, descubrió que las plantas verdes eran capaces de renovar el aire "viciado" por la

respiración de los animales y sugirió la participación del O2 (aunque todavía no se sabía que este "aire desflogistado", como él lo llamó, estaba formado per moléculas). Posteriormente un medico holandés, Jan Ingenhousz, demostró que la luz resultaba necesaria para la purificación del aire. Descubrió que las plantas también producían "aire viciado" en la oscuridad. De manera sorprendente (en la actualidad) esto le llevó a recomendar sacar las plantas de las casas durante la noche, ¡para evitar la posibilidad de que los ocupantes se intoxicaran! Gest (1988) revisó este y otros experimentos pioneros que realizó Stephen Hales a principios del siglo XVIII.

En 1782, Jean Senebier demostró que la presencia del gas "nocivo" que producen los animales y las plantas en la oscuridad (CO2) estimulaba la generación de "aire purificado" (O2) en presencia de luz. Así, ya en aquella época se demostró la participación de dos gases en la fotosíntesis. Los trabajos de Lavoisier y otros investigadores dejaron claro que estos gases eran en realidad CO2 y O2. En 1804, N. T. de Saussure propuso la participación del agua al efectuar las primeras cuantificaciones de la fotosíntesis. Descubrió que las plantas ganaban más peso seco durante la fotosíntesis del que se podía explicar por la diferencia entre el peso del CO2 absorbido y el peso del O2

liberado. Atribuyó correctamente la diferencia a la captación de H2O. También se dio cuenta de que durante la fotosíntesis se intercambiaban volúmenes más o menos iguales de CO2 y O2.

En 1864, Julius Sachs demostró la naturaleza del otro producto químico de la fotosíntesis (es decir, de la materia orgánica), cuando observó el crecimiento de granos de almidón (granos amiláceos) en cloroplastos iluminados. El almidón sólo se detectaba en las zonas de la hoja que se encontraban expuestas a la luz. Entonces se demostró que la reacción general de la fotosíntesis era la siguiente:

nCO2 + nH2O + luz → (CH2O)n + nO2 (1)

En esta reacción, (CH2O)n es una forma abreviada de representar al almidón y otros carbohidratos mediante una fórmula empírica. El almidón es el producto fotosintético más abundante en el mundo que está formado por cloroplastos.

Otro descubrimiento importante fue el de C. B. van Niel, quien a comienzos de la década de los 30 indicó la similitud existente entre el proceso fotosintético general en las plantas verdes y el de ciertas bacterias. Se sabía que diversas bacterias reducían el CO2 utilizando la energía luminosa y una fuente de electrones distinta del agua. Algunas de estas bacterias utilizan ácidos orgánicos, tales como ácido acético o el succínico, como fuentes de electrones, mientras que aquéllas a las que van Niel prestó especial atención utilizan H2S y depositan azufre como sub-producto. Se pensó que la ecuación fotosintética general para estas bacterias era la siguiente:

CarbohidratRespiración: transporte espontaneo de electrones

Fotosíntesis: transporte de electrones impulsados por la luz

Bajo

nCO2 + 2nH2S + luz → (CH2O)n + nH2O + 2nS (2)

Al comparar la reacción 2 con la 1 se puede comprobar la analogía existente entre las funciones de H2S y H2O, y entre las de O2 y el azufre. Esto sugirió a van Niel que el O2 liberado por las plantas provenía del agua y no del CO2. Hacia finales de la década de los 30 apoyaron esta idea Robin Hill y R. Scarisbrick, en Inglaterra, ya que con su trabajo demostraron que los cloroplastos aislados, así como fragmentos de los mismos, son capaces de liberar O2 en presencia de luz si se les proporciona un aceptor adecuado para los electrones que se extraen del H2O. Los primeros aceptores de electrones que se proporcionaron a los cloroplastos fueron algunas sales férricas (Fe+3), que se reducían a la forma ferrosa (Fe+2), Esta "rotura" del agua provocada por la luz (fotólisis), en ausencia de la fijación del CO2, se conoció con el nombre de reacción de Hill. Los trabajos de Hill y Scarisbrick demostraron que, al menos para ciertas reacciones de la fotosíntesis, no es necesaria toda la célula, y que la liberación de O2 inducida por la luz no se encuentra obligadamente unida a la reducción de CO2.

En 1941 apareció una evidencia más convincente de que el O2 liberado proviene del H2O, con el trabajo de Samuel Ruben y Martin Kamen. Proporcionaron H2O al alga verde Chlorella con 18O, un isótopo pesado no radiactivo del oxígeno que puede detectarse mediante un espectrómetro de masas. El O2 que se libera en la fotosíntesis estaba marcado con 18O, lo que sustenta la hipótesis de Niel. Por razones técnicas, los experimentos de Ruben no podían probar que el O2 procedía por completo del H2O, pero investigaciones subsecuentes de Man Stemler y Richard Radmer (1975) parecen proporcionar esa prueba. Por ello, hay que modificar la ecuación resumida para la fotosíntesis que se da en la Reacción 1 para incluir dos moléculas de H2O como reactivos:

nCO2+2nH2O+luz (CH2O)n+nO2+nH2O (3)

En 1951 se descubrió que un constituyente natural de los vegetales, una coenzima que contiene vitamina B (niacina o nicotinamida), y que se denomina fosfato dinucleótico de nicotinamida y adenina (abreviado NADP+) también era capaz de comportarse como reactivo de Hill al aceptar electrones del agua en reacciones que se producen en membranas aisladas de tilacoides o en cloroplastos fracturados. Este descubrimiento estimuló de nuevo la investigación de la fotosíntesis, y como ya se sabía que la forma reducida del NADP+, el NADH, es capaz de transferir electrones a varios compuestos vegetales, se podía suponer que su función normal en los cloroplastos es la de reducir el CO2. Por consiguiente, una de las dos funciones esenciales de la luz en la fotosíntesis consiste en impulsar a los electrones provenientes del H2O para reducir el NADP+ a NADH; mientras que la otra función consiste en proporcionar energía para la formación de ATP a partir de ADP P i, tal como vamos a explicar a continuación.

La conversión de ADP y Pi a ATP en los cloroplastos se descubrió en el laboratorio de Daniel Aman en la University of California, en el campus Berkeley, durante 1954. Anteriormente, el único mecanismo importante que se conocía para la formación de ATP era la respiración, especialmente las reacciones que reciben el nombre de fosforilación oxidativa, y que se llevan a cabo en las mitocondrias. Arnon descubrió que el ATP se sintetiza en forma de cloroplastos aislados sólo en presencia de luz, lo que se llamó fosforilación fotosintética, o simplemente fotofosforilación. Este proceso de formación de ATP mediante fotofosforilación se puede resumir de la forma siguiente:

ADP + Pi + luz ATP + H2O (4)

La fotofosforilación en los cloroplastos es la causa de que en las hojas se realice mucha más formación de ATP durante la luz del día que fotofosforilación en las mitocondrias de las mismas hojas, por lo que claramente tiene gran importancia cuantitativa. Sin embargo, hay que advertir que la ecuación resumida para la fotosíntesis (es decir, la reacción 3) no dice nada sobre compuestos del tipo de ATP, NADPH o NADP+. La razón es que, cuando se forman ATP y NADPH, la energía de ambos se utiliza en el proceso de la reducción de CO2 y en la síntesis de carbohidratos, donde vuelven a liberarse ADP, P i y NADP+. Así, ADP y Pi

convierten rápidamente en ATP, mediante la energía luminosa, mientras que el ATP se degrada con la misma rapidez cuando la fotosíntesis se efectúa a un ritmo constante.

Cloroplastos: estructuras y pigmentos fotosintéticos

En diversos tipos de vegetales se pueden encontrar cloroplastos de muchos tamaños y formas. Esos cloroplastos surgen de diminutos protoplastidios (plástidos inmaduros, pequeños y casi incoloros, con pocas o ninguna membrana interna). Casi siempre, los protoplastidios se derivan sólo de óvulos sin fecundar; el esperma no contribuye en absoluto. Los protoplastidios se dividen a medida que se va desarrollando el embrión, y se convierten en cloroplastos al formarse los tallos y las hojas. Los cloroplastos jóvenes también se dividen de una forma activa, especialmente cuando el órgano que los contiene se expone a la luz, por lo que a menudo cada célula de una hoja madura contiene unos cuantos cientos de cloroplastos. La mayoría de los cloroplastos se aprecian con facilidad al microscopio óptico, pero su estructura fina sólo pudo revelarse por medio de microscopía electrónica.

Suponiendo que los organismos pueden dividirse de manera lógica en cinco reinos, los cloroplastos se presentan en casi todos los miembros del reino Plantae y en ciertas algas, o miembros semejantes a éstas, del reino Protista. Las únicas excepciones que se conocen son algunas angiospermas parásitas e incoloras. Las cianobacterias y otras bacterias fotosintéticas del reino Monera carecen de cloroplastos, pero poseen pigmentos fotosintéticos embebidos en membranas especializadas, como sucede en el caso de los cloroplastos. No se presentan cloroplastos en los reinos Animalia y Fungi (hongos). Ahora sólo discutiremos los cloroplastos típicos de las plantas vasculares, las briofitas y numerosas algas verdes del reino Plantae.

La Fig. 02 muestra la estructura de un cloroplasto de una hoja. Cada cloroplasto se encuentra rodeado por un sistema de doble membrana o envoltura que controla el tránsito de moléculas hacia dentro y hacia fuera. En el interior del cloroplasto se encuentra el material amorfo, gelatinoso y rico en enzimas llamado estroma, que contiene enzimas que convierten el CO2 en carbohidratos, especialmente almidón. Embebidos por todo el estroma se encuentran los tilacoides (del griego tilakos, "saco" o "bolsita"), que contienen

pigmentos y en los que se emplea la energía de la luz para oxidar el H2O y formar ATP y NADPH, que son ricos en energía y necesarios a su vez para que el estroma convierta el CO2

en carbohidratos. En algunas porciones del cloroplasto se encuentran pilas de tilacoides que reciben el nombre de grana (cada pila o saco individual es un granum o elemento de grana). La región en la que un tilacoide se encuentra en contacto con otro recibe el nombre de región apresada.

Figura 02. Estructura de un cloroplasto

Estas regiones del tilacoide efectúan fotorreacciones ligeramente diferentes a las que se realizan en las regiones tilacoidales sin apresar y en los tilacoides estromáticos, ya que ambos se encuentran en contacto directo con el estroma. Los tilacoides estromáticos son tilacoides más alargados, que conectan un elemento de grana con otro y se extienden por todo el estroma. Muchas veces llegan a formar parte de uno o más grana, situación en la que, en los puntos de contacto, no existe distinción obvia entre ellos y los tilacoides de la grana. La Fig. 03 es una interpretación tridimensional de la relación entre los tilacoides estromáticos y los de la grana. Observe que existe una cavidad, comúnmente llamada luz o lumen, entre las dos membranas de cada tilacoide. Este lumen se encuentra lleno de agua y de sales disueltas, y además tiene una función especial en la fotosíntesis.

Figura 03. Interpretación tridimensional de la disposición de las membranas internas en el cloroplasto, realizando la relación entre los tilacoides estromáticos y los del grana

Los pigmentos que hay en las membranas tilacoidales consisten principalmente en dos tipos de

clorofilas verdes, la clorofila a y la clorofila b. También aparecen pigmentos amarillo-naranja que se clasifican como carotenoides. Existen dos tipos de carotenoides: los carotenos, que son hidrocarbonos puros, y las xantofilas, que contienen oxígeno. Ciertos carotenoides (en especial la violaxantina, que es una xantofila) también aparecen en la envoltura del cloroplasto, dándole cierto color amarillento, mientras que las clorofilas nunca se presentan en las envolturas. La Fig. 04 muestra las estructuras de las clorofilas a y b, así como las de algunos carotenoides. En la mayoría de los vegetales, incluyendo las algas verdes, el β-caroteno y la xantofila luteína son los

Membrana plasmática

Membrana

Grana

Estroma

Membrana del cloroplasto (externa e interna)

Gránulo de

Lume

Lumen de Granu

Tilacoide

Tilacoide de

Zona apresadaZona

carotenoides que más abundan en los tilacoides.

Figura 04. a) las clorofilas a y b y la bactericlorofila, principales colectores de energía luminosa. b) Ficoeritrobilina y Ficocianobilina (ficobilinas), pigmentos antena en cianobacterias y algas rojas. c) el β-caroteno y d) Luteína, pigmentos accesorios.

La microscopia electrónica no proporciona información sobre cómo se disponen las clorofilas y los carotenoides en los tilacoides, pero existen otras técnicas que muestran que todas las clorofilas, así como la mayoría (o todos) de los carotenoides se encuentran embebidos en los tilacoides, y están unidos mediante enlaces no covalentes a moléculas de proteína. En conjunto, los pigmentos del cloroplasto representan cerca de la mitad del contenido lipídico en las membranas tilacoidales, mientras que la otra mitad está compuesta principalmente por galactolípidos, con pequeñas cantidades de fosfolípidos. La cantidad de esteroles es escasa o nula, en contraste con lo que se observa en otras membranas vegetales. Los galactolípidos y los fosfolípidos conforman una bicapa típica de las membranas. Las porciones de ácidos grasos de los lípidos tilacoidales son ricas en ácido linolénico (con tres enlaces dobles) y ácido linoleico (con dos enlaces dobles). Estos ácidos grasos insaturados hacen que las membranas tilacoidales sean inusualmente fluidas, por lo que algunos compuestos que se localizan en su interior adquieren gran movilidad.

En la Enlace saturado en la

En la Ficocianobili

Enlace insaturado en la Ficocianobilina

Clorofila a

Ficoeritrobilina

β- Caroteno

Luteína

En los cloroplastos también se presentan ADN, ARN, ribosomas y, por supuesto, diversas enzimas. Todas estas moléculas se encuentran principalmente en el estroma, donde se produce tanto la transcripción como la traducción. El ADN del cloroplasto (es decir, el genoma) existe en forma de 50 o más círculos de cadenas dobles superenrolladas por plástido. Parece que muchos de los genes de plástido codifican todas las moléculas de ARN de transferencia (unas 30) y ARN ribosómico (cuatro) que los plástidos utilizan en la traducción. Existen unos 85 genes más que codifican las proteínas que participan en la transcripción, la traducción y la fotosíntesis, pero la mayoría de las proteínas que se localizan en los plástidos se codifican mediante los genes del núcleo.

Nociones sobre la absorción de luz por vegetales

Para averiguar por qué la luz induce la fotosíntesis, hay que aprender algunas cosas sobre sus propiedades. En primer lugar, la luz tiene características de partícula y de onda. La luz representa sólo la porción de la energía radiante con longitudes de onda visibles para el ojo humano (comprendidas aproximadamente entre 390 y 760 nanómetros, nm). Esta es una región muy reducida del espectro electromagnético.

Cuando se dice que la luz tiene la forma de cuantos o fotones (paquetes discretos de energía, cada uno asociado a una longitud de onda específica) se está haciendo referencia a la naturaleza particulada de la luz. La energía de cada fotón es inversamente proporcional a su longitud de onda, por lo que las longitudes de onda del azul y del violeta tienen fotones más energéticos que las longitudes del rojo y del anaranjado, que son más largas.

Un principio fundamental de la absorción de luz, que suele recibir el nombre de ley de Stark Einstein, es que cualquier molécula sólo puede absorber un fotón al mismo tiempo, y que ese fotón producirá la excitación de un solo electrón. Los electrones de valencia (es decir, de enlace) específicos en orbitas que tienen un estado fundamental (basal) estable son los que casi siempre resultan excitados; cada uno de estos electrones puede alejarse de su estado basal respecto al núcleo (con carga positiva) hasta una distancia que corresponde a una energía exactamente igual a la energía del fotón que se absorbió (consulte la Fig. 05). Una molécula de pigmento en esta si tuación está en un estado excitado, y esta energía de excitación es la que se utiliza en la fotosíntesis.

Las clorofilas y otros pigmentos pueden permanecer en estado de excitación sólo durante periodos muy cortos, casi siempre de una mil millonésima de segundo (es decir, un nanosegundo) o menos. Como muestra la Fig. 05, la energía de excitación puede perderse por completo por la liberación de calor que se presenta cuando el electrón regresa a su estado banal. Esto es precisamente lo que sucede en ese momento con los electrones contenidos en

Figura 05. La excitación que producen las luces roja o azul llevan al mismo nivel energético final (A menudo se denomina primer singlete excitado).

Resonancia

Transferencia de

Transferencia de

ε ε

la tinta de estas palabras. Una segunda forma en la que algunos pigmentos (incluyendo la clorofila) pueden perder energía de excitación es debido a una combinación de fluorescencia y pérdida de calor (la fluorescencia es la producción de luz que acompaña a la rápida disminución de energía en los electrones que se encuentran en estado excitado). La fluorescencia de la clorofila sólo produce luz de color rojo oscuro cuya longitud de onda puede verse con facilidad cuando se ilumina una solución de clorofila a o b lo suficientemente concentrada, o bien una mezcla de pigmentos de cloroplasto, especialmente con radiaciones azules o ultravioletas. En la hoja, la fluorescencia es débil porque la energía de excitación se utiliza en la fotosíntesis.

La Fig. 05 explica, en términos energéticos, por qué en la fotosíntesis la luz azul es siempre menos eficiente que la luz roja. Después de excitarse mediante un fotón azul, el electrón de una clorofila siempre pierde su contenido energético con extrema rapidez, al liberar calor, lo que lo sitúa en un nivel energético menor. Sin embargo, cuando se absorbe un fotón rojo este nivel se alcanza con luz roja de menor energía sin esa pérdida de calor. Desde este nivel inferior, se pueden presentar la pérdida adicional de calor, la fluorescencia o la fotosíntesis.

Para que se produzca la fotosíntesis es necesario que se transfiera la energía de los electrones excitados de varios pigmentos a un pigmento colector de energía, es decir a un centro de reacción. Hay dos tipos de centros de reacción en los tilacoides, ambos consistentes en moléculas de clorofila a, que son especiales por estar asociadas con proteínas particulares y otros componentes de la membrana. La Fig. 05 ilustra el hecho de que la energía en un pigmento excitado puede transferirse a un pigmento adyacente, y de éste a otro pigmento, y así hasta que, por último, la energía llega al centro de reacción. Existen diversas teorías para explicar la emigración de la energía dentro de un grupo de moléculas de pigmento adyacentes entre si, pero la más popular de ellas establece que la energía emigra por transferencia de un excitón, mediante resonancia inductiva. No vamos a explicar esta teoría, pero hemos de indicar que la excitación de cualquiera de las muchas moléculas de pigmento en un tilacoide posibilita una colecta momentánea de la energía luminosa que hay en el centro de reacción de una clorofila a.

Las hojas de la mayoría de las especies absorben más del 90% de las longitudes de onda del violeta y del azul que inciden sobre ellas, y un porcentaje casi tan elevado de las correspondientes al rojo y al anaranjado. Casi toda esta absorción la llevan a cabo los pigmentos del cloroplasto. En los tilacoides cada fotón es capaz de excitar a un electrón de un carotenoide o de una clorofila. Las clorofilas son verdes porque absorben de manera poco eficiente las longitudes de onda del color verde, de manera que las reflejan o las transmiten. Se puede utilizar un espectrofotómetro para medir la absorbancia relativa de diversas longitudes de onda luminosas por un pigmento purificado. Un gráfico en el que se representa esta absorción en función de la long. de onda recibe el nombre de espectro de absorción. En la Fig. 06A se muestran los espectros de absorción de las clorofilas a y b. Dichos espectros revelan que, in vitro, se absorbe muy poco de la luz verde y verdeamarilla comprendidas entre 500 y 600 nm, y que ambas clorofilas absorben intensamente las long. de onda violeta, azul, anaranjada y roja.

La mayoría de los carotenoides (tanto β-caroteno como xantofilas) de los tilacoides transfieren de una forma eficiente su energía de excitación a los mismos centros de reacción que las clorofilas, por lo que también contribuyen a la fotosíntesis. La Fig. 06B muestra los espectros de absorción del β-caroteno y

la luteína. Estos pigmentos in vitro, sólo absorben longitudes de onda violeta y azul. Reflejan y transmiten los colores verde, amarillo, anaranjado y rojo; una combinación que, para nosotros, aparece como amarillo. Los carotenoides además de comportarse corno pigmentos colectores de luz, que contribuyen a la fotosíntesis, protegen a las clorofilas contra la destrucción oxidativa por el O2 cuando los niveles de irradiancia son elevados.

Cuando se comparan los efectos de longitudes de onda diferentes sobre la relación (o tasa) fotosintética, asegurándose de que no se añade demasiada energía de cualquier longitud de onda (porque el proceso se saturaría), se obtiene un espectro de acción. Los espectros de acción deis fotosíntesis, así como otros procesos fotobiológicos, ayudan a identificar al pigmento implicado, porque estos espectros coinciden a menudo estrechamente con el espectro de absorción de cualquier pigmento participante. Para que la luz sea efectiva, debe absorberse. Las relaciones fotosintéticas relativas para varias especies de dicotiledóneas herbáceas y pastos pueden trazarse en función de la longitud de onda que incide sobre cierta unidad de área foliar. Inada (1976) obtuvo unos resultados similares. Todas las especies presentan un pico principal en la región correspondiente al rojo, así corno un pico distintivo menor en la región del azul; ambos picos resultan

de la absorción de luz por clorofilas y carotenoides1. En árboles deciduos se presentan resultados similares. Sin embarco, las coníferas muestran una respuesta menor a la luz azul porque sus agujas cerosas reflejan más la luz azul, y porque contienen cantidades elevadas de carotenoides, algunos de los cuales absorben la luz azul pero

no transfieren la energía á las clorofilas para que éstas realicen la fotosíntesis. En particular, el abeto azul y el abeto verdeazulado de Colorado fotosintetizan poco con luz azul o violeta.

Comparada con el espectro de absorción de carotenoides y clorofilas purificadas, la acción de la luz verde y de la amarilla para inducir fotosíntesis en plantas con semilla, y la absorción de estas longitudes de onda por parte de las hojas, es sorprendentemente elevada. Por otra parte, parecer que los carotenoides y las clorofilas son los únicos pigmentos que absorben estas longitudes de onda. La razón principal de que los espectros de acción sean superiores a los de absorción para las longitudes de onda correspondientes al amarillo y al verde es que, aunque la probabilidad de que cualquiera de estas longitudes de onda se absorba es pequeña, las longitudes de onda que no se

A

Clorofila

Clorofila

B

Longitud de onda

Figura 06. A) espectros de absorción de las clorofilas a y b disueltas en éter dietílico. El coeficiente de absortividad que se ha utilizado aquí es igual a la absorbancia (densidad óptica) de una solución con una concentración de 1g/L en una profundidad (longitud de trayecto óptico) de 1cm. B) espectros de absorción de β-caroteno en hexano y de la luteína (una xantofila) en etanol. El coeficiente de

absorben se reflejan repetidamente en la compleja red de células fotosintéticas, de cloroplasto a cloroplasto. Con cada reflexión se absorbe un pequeño porcentaje adicional de estas longitudes de onda hasta que, por último, la mayoría de las hojas absorben la mitad o más y se induce la fotosíntesis. Esta reflexión interna no se presenta en la celda (o en la cubeta de un espectrofotómetro que contenga clorofila disuelta), por lo que la absorbancia de las longitudes de onda correspondientes al color verde es muy baja (consulte la Fig. 06A). Además, la absorción in vitro que realizan estos pigmentos en un solvente orgánico se produce a longitudes de onda más cortas que cuando se encuentran en los tilacoides del cloroplasto.

1Cuando los datos se trazan en función de la energía que hay en cada longitud de onda que se aplica se obtienen espectros de acción diferentes, con picos menores en la región del azul. Esto se debe a que, aunque un fotón azul que absorbe un pigmento fotosintéticamente activo es tan eficaz como cualquier otro fotón, contiene más energía que otros, y una parte mayor de esta energía se pierde en forma de calor. Por ello, la luz azul puede ser igual de eficaz que la roja en la fotosíntesis, pero nunca tan eficiente. En muchas algas, los pigmentos llamados ficobilinas y carotenoides (las ficoeritrinas rojas, o las ficocianinas azules) absorben luz, originando la actividad fotosintética. El espectro de acción de estas algas es muy distinto al de las plantas con semilla.

En las hojas vivas, la absorción de los carotenoides se desplaza desde la porción azul del espectro hacia la verde, de manera que cierta cantidad de actividad fotosintética en la porción verde, a unos 500 nm, se debe a la absorción que realizan los carotenoides activos. Ambos tipos de clorofilas presentan sólo desplazamientos pequeños in vivo en la región azul, pero la clorofila a muestra varios desplazamientos en la región del rojo. La asociación de clorofila a con las proteínas de los tilacoides produce picos de actividad adicionales en la región del rojo. Nos interesan dos de estos picos menores, que son los que se presentan alrededor de los 680 y los 700 nm, porque se originan partiendo de moléculas de clorofila a situadas en ambientes químicos especiales y que actúan como pigmentos de centros de reacción. Estos pigmentos se abrevian corno P680 y P700.

Efecto Emerson: fotosistemas cooperativos

En la década de los 50, Robert Emerson, de la University of Illinois, se interesó en la razón por la que la luz roja con longitudes de onda mayores de 690 nm es tan ineficiente para inducir actividad fotosintética, aunque gran parte de ella se absorbe por la clorofila a in vivo. Su equipo de investigación descubrió que si se proporciona una luz de longitud de onda más corta al mismo tiempo que otras longitudes del rojo (que son más largas), la fotosíntesis era aún más rápida que la suma de las tasas individuales que se producen al aplicar por separado cualquiera de ambos colores. A este sinergismo o intensificación se le denominó efecto Emerson.

Este efecto es como si las longitudes de onda largas del rojo fuesen útiles a las longitudes de onda más cortas, o viceversa. Ahora se sabe que en la fotosíntesis cooperan dos grupos independientes de pigmentos o fotosistemas, y que además las longitudes de onda largas sólo las absorbe un fotosistema, el fotosistema I (FS I). El segundo fotosistema, el fotosistema II (FS II), absorbe longitudes de onda menores de 690 nm; para que se presente una fotosíntesis máxima, las longitudes de onda que absorben ambos sistemas deben trabajar a la par. Normalmente los dos fotosistemas cooperan para propiciar la fotosíntesis a todas las longitudes de onda menores de 690 nm, lo que incluye al rojo, anaranjado, amarillo, verde, azul y violeta, ya que ambos fotosistemas absorben esas longitudes. La importancia del trabajo de Emerson es que sugirió la presencia do dos fotosistemas distintos. Sin embargo, fueron R. Hill y E Bendall (1960) quienes propusieron por primera vez, y con claridad, cómo

+ Luz+ Luz

pueden cooperar dos fotosistemas, propuesta que después se enriqueció con el trabajo de L. N. M. Duysens y sus colaboradores, en los Países Bajos. En la reacción 5 se resume cómo FS I y FS II utilizan la energía luminosa para oxidar H2O y transferir cooperativamente los dos electrones disponibles de ésta al NADP+, formando así NADPH:

FS II FS I 2NADPH + 2H+

2H2O O2 + 4H+ 2NADP+ (5)

Pigmentos carotenoides: consideraciones estructurales y fisicoquímicas

Los carotenoides son compuestos ubicuos en la naturaleza, cuya presencia en diversas estructuras de plantas y en gran variedad de animales, algas, hongos y bacterias se ha descrito desde hace décadas. Estos pigmentos no sólo son responsables del color de flores y frutos para favorecer la polinización y dispersión de semillas, o de estructuras animales como las plumas y picos de algunos pájaros, el exoesqueleto de crustáceos y el músculo o la piel de algunos peces para otros fines, en algunos casos no muy claros, sino que realizan otras funciones que los hacen pigmentos especiales. Así, son considerados compuestos indispensables para la vida, fundamentalmente debido a las funciones que llevan a cabo en relación con la fotosíntesis, hasta el punto de que sin ellos, la fotosíntesis, tal y como se conoce hoy en día, sería inviable. Así, se ha demostrado ampliamente que como consecuencia de la inhibición de la enzima fitoenosintasa con herbicidas se producen fenómenos de fotooxidación que conducen a la destrucción de las moléculas de clorofila.

Durante años, la importancia nutricional de los carotenoides se debió sobre todo al hecho de que algunos poseen actividad provitamínica A, la cual sigue siendo objeto de estudio en la actualidad (ver Fig. 07). No obstante, el que el interés por estos compuestos isoprenoides se haya multiplicado no solo en Latinoamérica, sino a nivel mundial, se ha debido a estudios en los que se concluye que son compuestos antioxidantes y beneficiosos para la prevención de diversas enfermedades, como ciertos tipos de cáncer, trastornos oculares y vasculares, etc., si bien existe aún cierta controversia al respecto. Así, el interés actual en los pigmentos carotenoides desde un punto de vista nutricional es

claro, tal que los artículos de revisión en los que se discute las propiedades antioxidantes y beneficiosas para la salud de los humanos son numerosos, así como aquellos que tratan sobre la biodisponibilidad de los mismos.

Figura 07. Vitamina A1, sus precursores y derivados. (a) el β-caroteno es el precursor de la vitamina A1. Se resaltan las unidades estructurales de isopreno mediante líneas de trazos rojas. La rotura de β-caroteno produce dos moléculas de Vitamina A1. (b) la oxidación en C-15 convierte el retinol en su aldehído retinal (c) y la posterior oxidación produce acido retinoico (d), una hormona que regula la expresión génica. La rodopsina (no mostrada), pigmento visual muy utilizado en la naturaleza, esta formada por la combinación del retinal con la proteína opsina. En la oscuridad, el retinal de la rodopsina está en la forma 11-cis (c). Cuando se excita una molécula de rodopsina con luz visible, el 11-cis-retinal sufre varias reacciones fotoquímicas que lo convierten en todo-tras-retinal (e) forzando un cambio en la forma de la molécula completa de rodopsina.

En relación con todo ello, resulta claro afirmar que las funciones y efectos de estos pigmentos se deben a sus propiedades físicas y químicas, las cuales son consecuencia de su estructura química. Debido a las acciones beneficiosas de las que son responsables, y sobre todo a su creciente importancia en el campo de la Nutrición, el objetivo de esta revisión es la descripción de dichas características.

Actividad provitamínica A de algunos carotenoides en el hombreRetinol(100%)

β-caroteno(100%)

(2) (3)

β-caroteno 17 100 100 10013-cis-β-caroteno - - - 539-cis-β-caroteno 6 50 - 38α-caroteno (all-trans) 8-9 50 50-54 53β-criptoxantina 8-10 50 50-60 57γ-caroteno - 50 42-50 42β-apo-8’-carotenal 12 50-60 72 -β-apo-10’-carotenal 0 0 - -

Punto de ruptura

Oxidación del alcohol a aldehído

Luz visible

Oxidación del aldehído a ácido

Ácido retinoico (d)

Señal hormonal a las células epiteliales

Señal neuronal al cerebro

β-caroteno (a)

Vitamina A1

(Retinol) (b)

11-cis-Retinal (Pigemnto

visual) (c)

Todo-trans-Retinal (e)

α-criptoxantina 0 0 - -Luteína 0 0 - -Zeaxantina 0 0 - -Licopeno 0 0 - -Fitoeno 0 0 - -Fitoflueno 0 0 - -*Adaptado de Zechmeister, 1962; Bauerfeind, 1981; Simpsom, 1983.(1) Según las últimas DRI (2001) para vitamina A, los valores de equivalentes de actividad enretinol de los carotenoides a partir de alimentos serían la mitad de los especificados hasta el presentee indicados en esta tabla (1 Eq. Actividad retinol = 12 μg β-caroteno o 24 μg otros provitamínicos).(2) Valores según Zechmeister, 1944.(3) Valores según Rodríguez-Amaya, 1997.

Estructura química

Como ocurre con cualquier compuesto químico, las funciones de los carotenoides son debidas en última instancia a su estructura química. En el caso particular de estos isoprenoides, la característica estructural más llamativa es el sistema de d.e.c. (d.e.c.) característico de sus moléculas, que es el principal responsable de su espectro de absorción, reactividad, forma, localización en estructuras subcelulares y de su papel en procesos de transferencia de energía. Así, el número de d.e.c. no sólo afecta a sus propiedades de absorción de luz y por tanto a su color, sino también a su reactividad frente a radicales, a la forma de la molécula y a su efectividad en los procesos de transferencia de energía dentro del aparato fotosintético.

Químicamente la mayoría de los carotenoides son tetraterpenoides, compuestos de 40 átomos de carbono formados por ocho unidades isoprenoides unidas de forma que la secuencia se invierte en el centro de la molécula. Es decir, la unión de dichas unidades es “cabeza-cola”, excepto en el centro de la molécula, donde es “cabeza-cabeza”. Debido a ello, los dos grupos metilo centrales de la cadena poliénica están separados por seis átomos de carbono, mientras que el resto están separados por cinco. Algunos carotenoides son acíclicos, si bien la mayoría contienen anillos a uno o ambos extremos de la molécula. Considerando los elementos químicos presentes en sus moléculas, los carotenoides pueden dividirse en dos grandes grupos: carotenos, que son hidrocarburos, y xantófilas, que contienen átomos de oxígeno. Éste puede estar presente en forma de grupo hidroxilo (zeinoxantina, lactucaxantina, etc.), metoxilo (esferoidenona, espiriloxantina, etc.), epóxido (anteraxantina, licopeno-1,2-epóxido, etc.), carbonilo (capsantina, esferoidenona, etc.) o carboxilo (norbixina, neurosporaxantina, etc.), principalmente. Otros grupos oxigenados presentes en carotenoides son acetatos (fucoxantina, dinoxantina, etc.), lactonas (peridinina, uriólido, etc.) y sulfatos (caloxantina-3-sulfato, nostoxantina- 3-sulfato, etc.).

Las xantófilas hidroxílicas pueden existir en la naturaleza en estado libre o esterificadas con ácidos grasos (palmítico, linoleico, linolénico, esteárico, mirístico, láurico, oleico, etc.) en pimientos y derivados, patatas, mango, cítricos, etc. Precisamente, la esterificación de carotenoides está suscitando gran interés recientemente, concretamente en relación a la biodisponibilidad de los pigmentos, a su efecto en las reacciones de los carotenoides con radicales libres y a su papel durante la maduración de frutos. Existen asimismo glucósidos (crocina, zeaxantina monoramnósido, etc.) y glucosil ésteres de xantófilas (crocetina monoglucosil éster, glucosil éster del ácido diapolicopenodioico, etc.), los cuales se han descrito en estigmas de azafrán, frutos de gardenia, bacterias, etc. Los carotenoides pueden encontrarse además formando complejos hidrosolubles estables con proteínas, lipoproteínas o glucoproteínas sobre todo en animales invertebrados acuáticos como gambas, langostas y cangrejos, entre muchos otros. No todos los carotenoides constan de ocho unidades isoprenoides, ya que algunos, denominados apocarotenoides, poseen un esqueleto de menos de 40 átomos de carbono, debido probablemente a escisiones en uno (por ejemplo el β-apo-8’-carotenal, pigmento presente en el níspero y en cítricos, entre otras fuentes) o ambos extremos de la molécula (como por ejemplo la crocetina, pigmento característico del azafrán (Fig. 08). Otros apocarotenoides han sido identificados en diversas fuertes, como las semillas de Bixa orellana,

el pimiento, flores de Boronia megastigma, etc. Otros carotenoides con un número de átomos de carbono diferente de 40 son los norcarotenoides, como la peridinina, en los que uno, dos o tres átomos de carbono han sido eliminados del esqueleto hidrocarbonado, o los secocarotenoides (como la β-carotenona) en los que se ha roto un enlace entre carbonos adyacentes (excepto los carbonos 1 y 6 de anillos). Otros carotenoides poseen 45 o 50 átomos de carbono, y se forman por la adición de unidades isoprenoides a los grupos terminales, como por ejemplo la decaprenoxantina. En cuanto a los retrocarotenoides (como la rodoxantina), la posición de los dobles enlaces a lo

Figura. 08

β-apo-8’-carotenal

Crocetina

Peridinina

Decaprenoxantina

Semi-β- carotenona

Rodoxantina

Figura 08. Estructuras químicas de β-apo-8’-carotenal, crocetina, peridinina, decaprenoxantina, semi-β-carotenona y rodoxantina.

largo de la cadena poliénica está invertida, de forma que los carbonos 15 y 15’ están unidos por un enlace simple (Figura 08).

Debido a la presencia del sistema de d.e.c., podrían existir, en teoría, muchos isómeros geométricos de cada carotenoide, si bien, debido a impedimentos estéricos, sólo algunos son estables. La mayoría de los carotenoides naturales son isómeros todo-trans (todo-E), aunque también existen isómeros cis (isómeros Z) en fuentes naturales, como es el caso de la bixina, presente como (9’Z)-bixina en las semilla de Bixa orellana, y del fitoeno, presente comúnmente como (15Z)-fitoeno en productos vegeta les y microorganismos, entre otros. El análisis por cromatografía líquida de isómeros geométricos de carotenoides se ha visto favorecido en los últimos años debido al desarrollo de columnas C30, cuyo diseño las hace muy eficientes para su separación. Así, diferentes isómeros de carotenoides han sido objeto de estudio en una gran variedad de fuentes, como vegetales, zumo de zanahorias y bebidas enriquecidas en vitaminas, mango, zumo de naranja, flores, etc. El estudio de isómeros geométricos de carotenoides resulta especialmente interesante debido a que parece que presentan distintas actividades o reactividad frente a diversos agentes y que podrían absorberse en diferente medida. No obstante, debe tenerse en cuenta que los isómeros cis pueden ser en ocasiones artefactos, producidos durante la manipulación de las muestras o debido a tratamientos tecnológicos o culinarios. Por otra parte, muchos carotenoides naturales poseen centros quirales, por lo que pueden existir diversos isómeros ópticos de cada uno de ellos, como es el caso de la zeaxantina (Fig. 09), capsantina, aloxantina, neoxantina y muchísimos otros.

Propiedades físico-químicas

Son compuestos lipídicos, aunque existen algunas excepciones, por lo que son insolubles en agua y solubles en disolventes orgánicos como acetona, metanol,

Figura 09. Configuraciones de la Zeaxantina

(3R-3’R)-zeaxantina

Meso-zeaxantina ((3R-3’S)-zeaxantina)

(3S-3’S)-zeaxantina

éter dietílico, hexano, cloroformo y piridina, entre muchos otros. Debido a su carácter hidrofóbico se encuentran normalmente en ambientes lipófilos, como en membranas, si bien su asociación con proteínas o reacciones de glicosilación les permiten también estar presentes en medios acuosos. En relación con el papel de los pigmentos carotenoides en membranas de distinta naturaleza, cabe señalar que los carotenos permanecen en el interior de las mismas, mientras que las xantófilas pueden encontrarse en otras localizaciones en las que interaccionan a través de sus grupos hidroxílicos con moléculas de fosfolípidos. La asociación con proteínas permite además a los carotenoides permanecer en una posición correcta con respecto a otras moléculas, siendo ejemplos claros de este hecho los complejos pigmento-proteína que mantienen a carotenoides y clorofilas en posiciones adecuadas para los procesos de transferencia de energía que tienen lugar durante la fotosíntesis.

Los carotenoides ácidos pueden formar sales sódicas o potásicas solubles en agua por tratamiento con álcali, como es el caso de bixina, astaceno o mitiloxantina. Las carotenoproteínas son también solubles en agua y muy estables. El color de estos complejos es estable durante años a temperatura ambiente y en contacto con el aire, por lo que tienen un gran interés como posibles colorantes. El carácter hidrofóbico de la mayoría de los carotenoides hace que tiendan a la agregación y cristalización en medio acuoso, siendo un ejemplo típico los cristales de licopeno en los cromoplastos de los tomates. Los puntos de fusión son elevados, generalmente comprendidos en el rango 130-220°C y la solubilidad de los cristales generalmente pequeña, siendo mejor en disolventes orgánicos clorados y en benceno.

El sistema de d.e.c. de las moléculas de carotenoides es responsable de su intenso color. Para que estos pigmentos tengan una coloración perceptible son necesarios al menos siete d.e.c.. Así, el α-caroteno (7 d.e.c.) es amarillo pálido, mientras que fitoeno (3 d.e.c.) y fitoflueno (5 d.e.c.), son incoloros. El color se debe concretamente a la oscilación de los electrones a lo largo de la cadena hidrocarbonada insaturada. La absorción de luz produce el paso de la molécula de su estado energético basal a otro de mayor energía llamado estado excitado. En el caso de los carotenoides, la transición electrónica se produce de orbitales π enlazantes a orbitales π* antienlazantes. Como consecuencia de la deslocalización de los electrones a lo largo de la cadena hidrocarbonada, debido a la presencia de numerosos d.e.c. en ésta, la molécula en estado excitado no posee un alto contenido energético, de ahí que la energía de la radiación visible sea normalmente suficiente para que se produzca el salto electrónico. La asociación de carotenoides con proteínas estabiliza a los pigmentos además de extender el rango de colores a verde, azul y púrpura. Así, el máx. de absorción de astaxantina en acetona es 478 nm, mientras que el de la β-crustacianina es 632 nm, de ahí su coloración azulada. Analíticamente, el color de los carotenoides es de gran importancia, ya que un cambio de color durante el análisis es indicativo de degradación o de modificación estructural de los pigmentos. De igual forma, el color permite monitorizar su separación mediante cromatografía en columna y en capa fina.

En los últimos años, han aparecido estudios en los que se propone la medida objetiva del color como una potente herramienta en el ámbito del control de calidad para la estimación rápida del contenido en carotenoides en diversas fuentes, como tomates, zumo de naranja y albaricoques, fundamentalmente debido a las ventajas que ofrecen tales medidas, como rapidez, no destrucción de las muestras, versatilidad, etc. Así, la medida objetiva del color se ha propuesto recientemente como un método apropiado para la determinación de la actividad vitamínica A de zumos de naranja de una forma más eficiente, rápida y realista en el ámbito del control de calidad. Aparte de estos estudios

en los que el color se ha correlacionado de algún modo con el contenido en carotenoides, existen otros muchos en los que el contenido de estos pigmentos y el color de diferentes muestras se han analizado paralelamente. En este sentido debe también tenerse en cuenta que diversas técnicas espectroscópicas se usan, aunque sin obtener parámetros cromáticos, para el análisis de estos compuestos.

El espectro de absorción UV-Vis de los carotenoides es de interés para aclarar su estructura. Normalmente aparecen tres máximos cuyas longitudes de onda (λ) dependen del número de d.e.c. y del disolvente empleado para la medida, si bien el máximo de absorción (λmáx.) de los carotenoides in vivo aparece a longitudes de onda unos 10 nm mayores en comparación con los máximos en hexano o etanol, debido a su presencia en un ambiente proteico o lipídico. Independientemente del disolvente, las λmáx. aumentan con la longitud del cromóforo, de forma que los dobles enlaces no conjugados no afectan significativamente al espectro. No obstante, cuando existen d.e.c. en un anillo, debido a que éste no es coplanar con la cadena poliénica lineal, las λmáx.

aparecen a longitudes de onda menores en comparación con los carotenoides no cíclicos con el mismo número de d.e.c. .Los grupos carbonílicos conjugados con la cadena poliénica también aumentan la longitud del cromófobo. Así, la presencia de uno de estos grupos en un anillo hace que los máximos se localicen a ë aproximadamente 10 nm superiores, mientras que su presencia en la cadena poliénica hace que se desplacen a longitudes de onda en torno a 30 nm superiores. Los grupos hidroxilo y metoxilo, sin embargo, no afectan al cromóforo, de ahí que los espectros del β-caroteno y sus hidroxiderivados β-criptoxantina y zeaxantina sean prácticamente idénticos. Por otra parte, la forma del espectro y la persistencia de las bandas de absorción, lo que comúnmente se conoce como estructura fina, reflejan el grado de planaridad del cromóforo. El sistema de d.e.c. de los carotenoides acíclicos puede adoptar una conformación casi planar, de ahí que sus espectros presenten máximos y mínimos perfectamente definidos, aunque la persistencia de las bandas disminuye cuando existen más de nueve d.e.c. El espectro de los carotenoides cíclicos en los que el cromóforo no se extiende a los anillos presenta también bandas de absorción persistentes, aunque cuando la conjugación se extiende a anillos existen impedimentos estéricos entre el grupo metilo en el carbono 5 del anillo y el átomo de hidrógeno del carbono 8 de la cadena poliénica, que hacen que los dobles enlaces de los anillos no sean coplanares con los de la cadena poliénica. Como consecuencia se produce un desplazamiento hipsocrómico (a λ menores) de las λmáx., un efecto hipocrómico (disminución de la absorción) y una pérdida de estructura fina (115,120). Así, la primera banda de absorción de carotenoides con dos anillos β, como β-caroteno, β -criptoxantina y zeaxantina, se reduce a una mera inflexión. Cuando existen grupos carbonilos conjugados con la cadena poliénica, se produce un desplazamiento batocrómico (a λ mayores) de los máximos, además de una pérdida de estructura fina, de forma que el espectro de estos compuestos, como astaxantina, cantaxantina o capsorrubina, entre otros, se reduce a una curva simétrica o a una banda principal con inflexiones a uno y otro lado. El espectro de isómeros Z o cis presenta algunas peculiaridades con respecto a los de isómeros todo-E o todo-trans. Así, el máximo de absorción se localiza a λ entre 2 y 6 nm menores en el caso de isómeros mono-cis, la estructura fina disminuye y una nueva banda de absorción aparece en la región ultravioleta.

Los carotenoides en disolución, obedecen la ley de Lambert-Beer, de ahí que se cuantifiquen espectrofotométricamente, relacionando la absorbancia a una determinada ë con un valor estándar expresado como coeficiente de absorción,

ya sea el coeficiente de absorción específico, (A1%1cm

), que se define como la

absorbancia teórica de una disolución de concentración 1% (P/V) en una cubeta de 1 cm de paso de luz, o el coeficiente de absorción molar, ε, definido como la absorbancia teórica de una disolución de concentración 1 molar. Ambos

coeficientes están relacionados por la fórmula å = (A1%1cm

× peso molecular)/10.

Teóricamente, å es característico del cromóforo e independiente del peso molecular del carotenoide, por lo que podría ser considerado el mismo para carotenoides distintos con idéntico cromóforo, como por ejemplo β-caroteno y

zeaxantina. En cambio, los valores de A1%1cm

no serían los mismos para ambos

compuestos, si bien están relacionados por sus pesos moleculares:

A1%1cm

(zeaxantina) = A1%1cm

(β-caroteno) × (536/568)

La exactitud de la cuantificación de los carotenoides depende, por tanto, de la de los coeficientes de absorción. Para la determinación de estos coeficientes se recomienda pesar con precisión entre 1 y 2 mg del pigmento puro y disolverlos completamente en un disolvente apropiado. Este procedimiento suele ser bastante complicado, sobre todo si los carotenoides están cristalizados, por lo que el contenido en carotenoides es frecuentemente subestimado. La determinación cuantitativa de los pigmentos carotenoides, implica por tanto una cierta inexactitud. En relación con este hecho, cabe señalar que los coeficientes de absorción de los isómeros cis son sensiblemente menores que los de los correspondientes isómeros todo-trans, si bien pocos han sido determinados experimentalmente, por lo que la cuantificación de los isómeros cis con los valores tabulados para los isómeros todotrans implica aún un mayor grado de inexactitud. En la literatura existen tablas en las que se indican los valores de los coeficientes de absorción, generalmente el específico, para distintos carotenoides en varios disolventes, especificándose asímismo la λ a la que debe llevarse a cabo la medida de absorbancia. No obstante, debido a las dificultades inherentes a la determinación experimental de los coeficientes de absorción, existen discrepancias en algunos de los valores de tabulados. Para calcular la concentración de un determinado carotenoide se aplica la fórmula x

= Ay/(A1%1cm

×100), donde x es el peso del carotenoide en gramos, y es el

volumen de la disolución en mililitros, A la absorbancia medida

experimentalmente y A1%1cm

el coeficiente de absorción específico. Cuando no se

ha determinado el coeficiente de absorción específico para un carotenoide o bien se pretende estimar el contenido total de carotenoides de un extracto, se suele usar un valor arbitrario de 2500.

Concentraciones de Carotenoides, Tocoferol y Retinol en el Cerebro de Personas de Edad Avanzada

Los carotenoides y los tocoferoles presentan especial interés para los investigadores médicos debido a sus características antimutagénicas y anticarcinogénicas y a su asociación con mayor longevidad y disminución del riesgo de cáncer y enfermedades cardiovasculares observadas en estudios epidemiológicos. Aunque el suplemento con β-carotenos no ha sido asociado con efectos beneficiosos sobre la reducción del riesgo de cáncer o enfermedades cardiovasculares, en estudios recientes se ha señalado que tanto la luteína como la zeaxantina dietarias o plasmáticas elevadas se asociaron con

reducción de la progresión de lesiones ateroscleróticas y con menor riesgo de cataratas. (Fig. 09)

Se ha señalado que hay carotenoides y tocoferoles en el cerebro humano, y varios indicios indican que ambos antioxidantes pueden enlentecer los cambios degenerativos en éste y disminuir el riesgo de enfermedad de Alzheimer (EA). También existe evidencia sustancial acerca de que los carotenoides y tocoferoles tienen efecto protector sobre otro derivado neural, la retina. En este sentido, el Estudio acerca de las Patologías Oculares relacionadas con la Edad (AREDS) demostró que el tratamiento con altas dosis de α-tocoferol, vitamina C, β-caroteno y cinc retrasa la progresión de la maculopatía degenerativa asociada con la edad.

Si bien se han incrementado los indicios de que los antioxidantes de la dieta desempeñan un papel fundamental en la prevención de enfermedades neurodegenerativas, no se ha informado que haya distribución de carotenoides individuales y de los isómeros de tocoferol en regiones cerebrales y en la sustancia gris y blanca. Esta ausencia de información condujo a este análisis sobre la distribución de carotenoides individuales, retinol, y α-, γ- y δ- tocoferoles en el lóbulo frontal y la corteza occipital de cerebros de seres humanos de edad avanzada, con el objetivo de determinar las concentraciones de los principales carotenoides, tocoferoles y retinoles en las regiones frontales y occipitales.

Se obtuvieron muestras de cerebro congeladas de 5 donantes humanos de edad avanzada que habían fallecido por causas no relacionadas con demencia del Massachusetts Alzheimer's Disease Research Center del Hospital General de Massachusetts. Se examinaron los lóbulos frontales y occipitales para crear una base para un estudio posterior de comparación entre los nutrientes

Figura 09. Estructuras químicas de la Luteína y la Zeaxantina

Luteína

Zeaxantina

antioxidantes en el tejido cerebral de sujetos normales de edad avanzada y aquellos en cerebros con EA. Los donantes fueron 2 mujeres de 85 y 90 años, y 3 hombres de 67, 73 y 77 años. Las muestras fueron disecadas en cuanto llegaron al laboratorio; se colocaron en cajas secciones de 0.5 cm de cada región cerebral, las cuales fueron congeladas en hielo seco y mantenidas a -80° C. El laboratorio había examinado previamente secciones microscópicas con tinciones de plata, azul Luxol y hematoxilina-eosina para confirmar que los cerebros no presentaban procesos neuropatológicos identificables. Las 10 muestras individuales de las cortezas frontal y occipital pesaron entre1 g y más de 100 g. Las secciones seleccionadas fueron disecadas en sustancia gris y blanca, extraídas con solventes orgánicos y analizadas mediante HPLC.

Dado que sólo se contó con 5 donantes, no se tuvo en cuenta el sexo para el análisis. Debido a la relevancia potencial para neurodegeneración, las muestras se agruparon en aquellas provenientes de las regiones frontales y vulnerables a la EA; y en aquellas de regiones occipitales menos vulnerables. El análisis estadístico se efectuó mediante programas de computación comerciales. Debido a la distribución no normal de la población y al reducido número de la muestra, se utilizó la prueba de correlación de Spearman para evaluar la relación entre la edad y las concentraciones de antioxidantes. Los análisis de varianza de Wilcoxon y las pruebas U de Mann-Whitney se utilizaron para comparar las regiones frontales y occipitales, la sustancia gris y blanca. Los valores de p iguales a 0.05 fueron considerados significativos.

Se halló que la β-criptoxantina fue el carotenoide principal en el cerebro (Fig. 10), y que luteína, zeaxantina, anhidroluteína y α-criptoxantina estuvieron presentes en cantidades significativas. La concentración total de carotenoides (licopeno, cis-licopeno, α-caroteno, β-caroteno, y cis-β-caroteno) fue significativamente menor (p < 0.0001, según el análisis de Wilcoxon) que el valor total de los carotenoides xantófilos (oxigenados), los cuales constituyeron entre el 66% y 77% del total de carotenoides en la región frontal y occipital. También se hallaron presentes niveles cuantificables de retinol, β-criptoxantina, luteína, zeaxantina y α-tocoferol en cada una de las muestras cerebrales analizadas. Los límites de detección fueron de 0.3 pmol/g para el retinol, 2 pmol/g para los tocoferoles y 0.06 pmol/g para la mayoría de los carotenoides, pero variaron en proporción al peso de la muestra.

Se encontró mayor abundancia de tocoferoles que de carotenoides en todas las regiones cerebrales, siendo el α-tocoferol el que presentó las concentraciones más elevadas, seguido por γ-tocoferol, δ-tocoferol, retinol, β-criptoxantina y luteína. Las concentraciones de luteína fueron significativamente mayores que las de zeaxantina (p < 0.02). Las razones informadas entre luteína y zeaxantina en el suero humano varían entre 3 y 9. La razón media en el cerebro encontrada fue de 1.39.

Se detectaron 8 sustancias no identificadas, pero que fueron tentativamente asignadas como xantófilos. La mayoría de estos compuestos desconocidos se presentó en concentraciones entre 10% y 50% menores respecto de la

Figura 09. Estructura química de la (3R)-β-criptoxantina

anhidroluteína. La zeaxantina y la luteína se hallaron altamente correlacionadas entre sí (p < 0.0001) y con anhidroluteína, α-criptoxantina, β-criptoxantina (p = 0.0006). La concentración total de carotenos oxigenados excedió significativamente la de los carotenos tanto en la sustancia gris como en la blanca (p < 0.005 para ambas, según el análisis de Wilcoxon). Las concentraciones medias de luteína y zeaxantina en la sustancia gris de la región occipital fue de casi el doble respecto de la hallada en la sustancia blanca (p < 0.03 para ambas); y las concentraciones de β-criptoxantina y de los xantófitos totales también tuvieron la tendencia a ser mayores en esta misma región, lo que indica que estos xantófilos estuvieron selectivamente distribuidos en la sustancia gris. Los tocoferoles y los carotenos en la sustancia gris no difirieron significativamente de las mediciones halladas en la sustancia blanca. Cabe señalar que fibras mielínicas pasan a través de la sustancia gris de la corteza occipital, lo que sugiere que la diferencia verdadera entre la sustancia gris y blanca en la corteza occipital puede estar subestimada.

En la comparación de las concentraciones de antioxidantes en los lóbulos frontales (una región cerebral que resulta precozmente afectada en la EA) con las presentes en los lóbulos occipitales -una región que en general no se encuentra afectada en la EA sino hasta estadios más tardíos- los lóbulos frontales presentaron valores significativamente más elevados de α-tocoferol, tocoferol total y xantófilos totales y tendieron a presentar mediciones más elevadas de zeaxantina, luteína, α-criptoxantina y β-criptoxantina. La comparación de la sustancia blanca en las regiones frontales y occipitales mostró que las regiones frontales más vulnerables tuvieron además 4 veces más zeaxantina y 3 veces más luteína, anhidroluteína, β-criptoxantina, xantófilos totales y carotenoides totales que la sustancia blanca en las regiones occipitales, pero las diferencias no alcanzaron significación estadística.

Con sólo 5 especímenes de entre 67 y 90 años, fue sorprendente observar correlaciones con la edad. Los lóbulos frontales -pero no los occipitales- presentaron descensos significativos relacionados con la edad en retinol, α-tocoferol, γ-tocoferol, tocoferoles totales, carotenoides totales y xantófitos totales. Los descensos más significativos ocurrieron con la α-criptoxantina y con varios de los compuestos no identificados. No se encontraron pérdidas relacionadas con la edad de zeaxantina o luteína en ninguna de las regiones cerebrales. El análisis adicional señaló descensos significativos en el α-tocoferol en la sustancia blanca (p < 0.04) pero no en la sustancia gris (p = 0.18). En general, los carotenos no variaron con la edad, pero se halló una declinación significativa de los β-carotenos en la sustancia blanca (p < 0.04).

Contenido en la dieta de carotenoides y vitaminas A, E, y C, y degeneración macular avanzada relacionada con la edad

Un total de 356 pacientes que fueron diagnosticados en la fase avanzada de DME durante el año previo a su participación en el estudio, con edades de 55-80 años, y que residían en las proximidades de alguno de los centros clínicos participantes en el estudio. Los 520 participantes que actuaron como controles fueron personas que residían en las mismas zonas que los pacientes, que presentaban otras enfermedades oculares y que estaban equiparados con los casos en cuanto a edad y sexo.

Se estimó el riesgo relativo de DME en relación con los indicadores dietéticos del estado antioxidante, con control del consumo de cigarrillos y de otros factores de riesgo, y aplicando análisis de regresión logística múltiple.

El mayor consumo de carotenoides en la dieta se asocio a una disminución en el riesgo de DME. Tras el ajuste de otros factores de riesgo para la DME, observamos que los pacientes situados en el quintil mayor de ingestión de carotenoides mostraron un riesgo de DME un 43% menor que el que presentaron los pacientes situados en el quintil menor (ODDS RATIO, 0.57 ; Intervalo de Confianza [IC] del 95%. 0.35-0.92 ; p para la tendencia= 0.02). Entre los diversos carotenoides específicos, la luteína y la zeaxantina- que existen principalmente en la verdura de hoja oscura- fueron los que se asociaron con mayor fuerza a la disminución del riesgo de DME ( p para la tendencia= 0.001). Varios alimentos ricos en carotenoides se asociaron en forma inversa con la DME. En particular, el elevado consumo de espinaca y de col rizada se asoció a un riesgo sustancialmente menor de DME (p para la tendencia < 0.001). El consumo de vitamina A preformada (retinol) no se relacionó de forma apreciable con la DME. Los consumos de vitamina E y C tampoco se acompañaron de una disminución estadísticamente significativa en el riesgo de DME, aunque en los pacientes con mayor consumo de vitamina C procedente - en especial - de los alimentos se observó un riesgo menor de DME.

Niveles Plasmáticos de Retinol y Riesgo de Hepatocarcinoma

Los retinoides (el retinol y sus derivados) intervienen en el control del crecimiento y la diferenciación celular. En estudios experimentales se demostró que pueden contrarrestrar la actividad carcinogénica de diversos factores de riesgo que predisponen a la aparición de hepatocarcinoma, como la infección crónica por hepatitis B y C, el consumo excesivo de alcohol, la dieta rica en aflatoxinas, la obesidad y la diabetes. Además, se les atribuyen numerosas acciones, como inhibir la transformación de células estrelladas del hígado, la producción de metabolitos tóxicos de la aflatoxina y de citoquinas proinflamatorias, suprimir la proliferación de células de hepatoma y ejercer efectos antioxidantes.

En el presente estudio, los autores analizaron la relación entre las concentraciones plasmáticas de diferentes micronutrientes (retinoides, carotenoides, tocoferoles, selenio) y el riesgo de aparición de hepatocarcinoma en una cohorte de pacientes de la ciudad de Shanghai, China, después de un seguimiento de 15 años.

Participaron del estudio 18 244 hombres de entre 45 y 64 años sin antecedentes de cáncer reunidos entre enero de 1986 y septiembre de 1989. Durante la entrevista inicial se obtuvo información sobre características demográficas, dieta habitual, consumo de alcohol y tabaco y antecedente de enfermedades de los participantes. Luego, a cada uno se le extrajo una muestra de 10 ml de sangre que posteriormente fue congelada a -70° C. También se recolectaron muestras de orina para valorar los metabolitos urinarios de aflatoxina.

Hasta el día final del estudio, 31 de diciembre de 2001, fueron identificados 214 participantes con hepatocarcinoma que fueron establecidos como casos. El diagnóstico se llevó a cabo mediante análisis histopatológico (n = 39), por la presencia de elevación plasmática de feto proteína más antecedentes clínico-radiológicos compatibles (n = 53), por hallazgos tomográficos o ecográficos y clínicos compatibles (n = 115) o por el certificado de defunción (n = 7). De la misma cohorte de pacientes se eligieron los controles.

Las muestras de sangre fueron analizadas en una habitación protegida de la luz para evitar los cambios químicos que ésta puede provocar en el retinol y en

ciertos carotenoides. Las concentraciones de α -caroteno, β -caroteno, β-criptoxantina, luteína, licopeno, zeaxantina, retinol y , y -tocoferoles fueron determinadas por cromatografía líquida de alta resolución. Las concentraciones de selenio fueron medidas por espectrofotometría de absorción atómica. En todas las muestras se examinó la presencia de marcadores de hepatitis B (HBbsAg) y C (anti-HVC).

Se utilizaron análisis de covariancia para comparar las diferencias en las concentraciones plasmáticas de los micronutrientes entre los casos y los controles y entre los controles fumadores y no fumadores, consumidores de alcohol y no consumidores y con serología para hepatitis B positiva y negativa. Se emplearon métodos estadísticos estándar y de regresión logística multivariable para el análisis de los datos con los programas SAS 9.1 y Epilog 1.0.

Los factores de riesgo para la aparición de hepatocarcinoma en la población estudiada fueron tabaquismo, consumo elevado de alcohol (> 50g de etanol día), antecedente de hepatitis o cirrosis, positividad para el HBsAg y exposición a aflatoxinas en la dieta. En la cohorte evaluada, la incidencia de hepatitis C fue muy baja y no representó un factor de riesgo.

En el grupo control, los pacientes HBsAg positivos tuvieron niveles de retinol significativamente más bajos pero concentraciones de criptoxantina, licopeno y zeaxantina más elevados que los pacientes HBsAg negativos. Por su parte, los consumidores de alcohol mostraron niveles más elevados de retinol y luteína. En los individuos que presentaron hepatocarcinoma (casos), las concentraciones plasmáticas de retinol, β -caroteno, β -criptoxantina y y tocoferol fueron significativamente menores que las de los controles.

Cuando se analizó la asociación entre niveles plasmáticos de micronutrientes e incidencia de hepatocarcinoma se observó una relación inversa: cuanto mayor eran los niveles plasmáticos, menor era la incidencia de cáncer. Después de eliminar la influencia de posibles aspectos que pudieran producir sesgo (hepatitis B, alcoholismo, cirrosis, tabaquismo) se analizó el efecto de cada micronutriente y se advirtió que el retinol era responsable de esta relación inversa. Luego de estudiar todos los casos, la influencia de este micronutriente se apreció con mayor nitidez en aquellos con hepatitis B (por ejemplo, los pacientes que tuvieron niveles más bajos de retinol mostraron un riesgo 70 veces mayor de presentar hepatocarcinoma).

La vitamina A se encuentra en alimentos de origen animal y en forma de provitamina A (carotenoides) en los alimentos de origen vegetal. Se estima que ejerce un efecto protector contra la aparición de hepatocarcinoma al modular la diferenciación celular y la respuesta inmunitaria frente a la infección viral. Datos de estudios clínicos previos demostraron que los pacientes con enfermedades hepáticas crónicas (hepatitis, cirrosis) tienen menores niveles de retinol en el hígado y en sangre.

Según los autores, este estudio mostró la existencia de una relación inversa entre los niveles de retinol plasmático previos al diagnóstico y el riesgo de presentar hepatocarcinoma en una cohorte de 18 000 pacientes de sexo masculino seguidos durante 15 años en la ciudad de Shangai, China.

Una limitación del trabajo que reconocen los autores señala la baja incidencia de hepatocarcinoma, que determinó el relativamente bajo número de casos. Esto provocó que, para algunas asociaciones (por ejemplo, niveles de retinol,

hepatitis B y hepatocarcinoma), los intervalos de confianza medidos fueran bastante amplios. Sin embargo, fue un estudio prospectivo, de grandes dimensiones, con muestras de sangre y en el que se analizó un número importante de micronutrientes. Estas muestras fueron obtenidas al momento del ingreso de los pacientes, vale decir, antes de la aparición de hepatocarcinoma, lo que minimizó la influencia de cambios eventuales en la dieta realizados durante el seguimiento.

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