métodos para el estudio de flujo genético en plantas

C harles Wesley BAR NE S et al.

CIENCIAMÉRICA, N° 3, diciembre 2014, pp (13-18)Universidad Tecnológica Indoamérica

Nora OLE AS

Centro de Investigación de la Biodiversidady Cambio C limático, y Facultad de

Ingeniería Industrial, Universidad Tecnológica Indoamérica

noraoleas@ uti.edu.ec

RESUMEN

El �ujo genético es un proceso que ocurre naturalmente vía dispersión de semillas, movimiento de polen o individuos, y su incorporación al acervo génico en una nueva localidad. El �ujo genético depende de factores como la forma de dispersión, tiempo de viabilidad, distancia de dispersión, entre otros. El intercambio gené-tico entre individuos es estudiado mediante la genética de poblaciones. El presente trabajo es una revisión en la que se discuten l os factores que in�uyen en el �ujo genético en plantas. Se detallan técnicas molecula-res para estimar el �ujo genético entre poblaciones, con ejemplos de investigaciones realizadas en Ecuador. Finalmente, se explican algunas aplicaciones para el control biológico mediante el uso de varias herramientas moleculares para identi�car el �ujo genético de organismos transgénicos.

ABSTRACT

Métodos para el Estudio de Flujo Genético en Plantas

KEYWORDS

PALABRAS CLAVE

Gene �ow is a naturally occurring process via seed dispersal, pollen movement or individuals, and their incorporation into the gene pool at a new location. Gene �ow depends on factors like dispersion feasibility, dispersal distance, among others. Genetic exchange between individuals is studied with population genetics. The following review explains some of the factors that in�uence gene �ow in plants. Several molecular techniques are described for estimating gene �ow between populations, with examples from research conducted in Ecuador. Finally, some applications for biological control using molecular tools to identify gene �ow from transgenic organisms, are explained.

Biocontrol, gene�ow, microsatellites, genetically modi�ed organisms, molecular techniques.

Biocontrol, �ujo genético, microsatélites, organismos genéticamente modi�cados, técnicas moleculares.

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Métodos Para el E s tudio de F lujo G enético en PlantasNora OLE AS

E l 6 y 7 de mayo de 2013 se llevó a cabo en Quitoel S imposio titulado “Flujo genético en cultivosagrícolas y sus implicaciones para la B ioseguri-dad”. E l evento contó con el auspicio del Pro-grama de las Naciones Unidas para el Ambiente(UNE P, por sus s iglas en inglés) y el Fondo parael Medio Ambiente Mundial (GE F, por sus s iglasen inglés). Durante ese s imposio, la autora pre-sentó una vis ión introductoria sobre los métodosde estudio de flujo genético en plantas y su rela-ción con el manejo de cultivos transgénicos . E lpresente trabajo es una extensión de esa exposi-ción, con miras a un mejor entendimiento de losprocesos biológicos detrás del flujo génico enplantas y sus posibles implicaciones para la bio-seguridad. Más específicamente, se exponenconceptos básicos sobre los procesos implicadosen el flujo génico en plantas , los métodos para lamedición del flujo génico, algunos ejemplos deestudios de flujo génico en plantas, realizados enel país, y las implicaciones de flujo génico de trans-génicos para la bioseguridad. Por último, se ex-pone una perspectiva general sobre el futuro delcontrol de flujo génico en presencia de transgénicos.

E l flujo genético es el movimiento de gametos(polen), cigotos (semillas ) y plantas desde unlugar a otro y su incorporación al acervo génicoen una nueva localidad [1]. E ste proceso ocurrenaturalmente vía dispers ión de semillas , movi-miento de polen e individuos, o sus partes. E l flujogenético, tanto para el polen como para las semi-llas , depende de factores como la forma de dis-pers ión, tiempo de viabilidad, dis tancia de

Flujo genético en plantas

dispersión, entre otros . E l flujo genético a travésdel polen también podría estar limitado debido afactores como la incompatibilidad. E n el caso delas semillas , otro factor limitante es la especifici-dad de sustrato y clima. En el flujo genético, comoresultado de la introducción de individuos, depen-derá de la capacidad de los mismos para sobre-vivir, reproducirse, y para que su progeniesobreviva y se reproduzca [1].

E l flujo genético en angiospermas esta estrecha-mente ligado a los diferentes tipos de flores, frutosy semillas . E xiste un s innúmero de formas y colo-res en flores para atraer polinizadores y transferirel polen a otras flores . Así mismo los frutos y se-

millas tienen adaptaciones para dispers ión poranimales , viento, agua, entre otros [2]. Todosestos mecanismos son importantes para entenderla dispersión en angiospermas y por ende el flujogenético. E l fruto de las angiospermas es unafuente de información del origen materno, ya queel pericarpio se desarrolla a partir de estructurasflorales maternas. Las semillas dentro del fruto, encambio, cuentan con información biparental. Porlo general el ADN nuclear es heredado en formabiparental, en cambio el ADN de las organelas(mitocondria y cloroplasto) por lo general es he-redado de forma uniparental [3].

E l intercambio genético entre individuos es estu-diado mediante la genética de poblaciones.C uando una población está en equilibrio, las fre-cuencias de los alelos y las frecuencias genotípicastienden a permanecer sin cambios por generacio-nes — lo que es conocido como equilibrio Hardy-Weinberg [4]. Los cambios de las frecuencias dealelos y/o genotipos a través del tiempo son el re-sultado de migración, flujo genético, mutación,deriva génica, endogamia (combinación no alea-toria de alelos) y selección natural [1].

La migración evita la divergencia genética entrepoblaciones. E l índice de fijación F S T ha s ido utili-zado tradicionalmente como una medida de dife-renciación genética [5]. Además este índice has ido empleado como un método indirecto paraestimar flujo genético [6]. E n este sentido cuandoF S T es igual a 1, s ignifica que no hay migración .E l valor de F S T = 0,50 representa a un migrantepor cada cuatro generaciones. S i FST = 0,33 existeun migrante por cada segunda generación [6].R ecientemente se publicó un estudio que explorólas limitaciones de FS T y otros índices derivadosdel mismo principio, porque en presencia de múl-tiples alelos raros , el valor de FS T no refleja dife-renciación genética [7]. E n la actualidad lamayoría de los estudios reportan D [7] en lugar oademás de F S T. Al igual que F S T, el valor de Dasume que mientras más cercano a 1, menor enel grado de migración entre las poblaciones.

Métodos moleculares para estimar�ujo genético

Para estudiar el flujo genético y su origen en plan-tas , se pueden utilizar diferentes marcadores di-señados para identificar herencia biparental o

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uniparental. Existen múltiples tipos de marcadoresmoleculares que permiten estudiar el flujo gené-tico. E ntre los más utilizados están los microsaté-lites , los polimorfismos en la longitud defragmentos amplificados (AFLPs por sus siglas eninglés) y los polimorfismos de nucleótido s imple(SNPs). Los microsatélites son una de las técnicasmás utilizadas para el estudio de la genética depoblaciones y del flujo genético [8, 9]. E stos mar-cadores moleculares son repeticiones de dos aseis nucleótidos en tándem. La popularidad deesta técnica se debe en gran parte a la alta varia-bilidad de alelos , que permite incluso identificarindividuos . Además, como los microsatélites seamplifican por reacción en cadena de la polime-rasa (PC R ) se requiere poco ADN, lo cual es tam-bién una caracterís tica deseable para estudiosgenéticos. Otros de los factores que han favore-cido al uso de los microsatélites , es que sonusualmente heredados en forma mendeliana yson codominantes, lo que permite distinguir hete-rocigotos (lo que no es posible con otras técnicascomo los AFLPs). F inalmente, son marcadoresneutrales - lo que significa que sus frecuencias noson determinadas por selección natural [10].Hasta hace poco una de las mayores desventajasde esta técnica, era que los cebadores para ex-traer microsatélites tenían que ser diseñados es-pecíficamente para cada especie, a un costocons iderable. G racias al desarrollo de la nuevageneración de técnicas de secuenciamiento,ahora es posible obtener gran cantidad de datosgenómicos, a un costo mucho más bajo que endécadas anteriores [11]. S e ha calculado quepara estudios de genética de poblaciones, 20 locide microsatélites polimórficos proveen con la va-riabilidad necesaria para investigaciones a nivelpoblacional [12].

Ejemplos de estudios de �ujo genético en el Ecuador

A nivel poblacional, los estudios con marcadoresmoleculares pueden dar información sobre los as-pectos reproductivos de las especies, la distanciade dispersión de las semillas , e incluso permitenrealizar anális is de paternidad e identificar el ori-gen de los individuos. Un ejemplo de este tipo deaplicaciones es el estudio de la palma Ungurahua(Oenocarpus bataua), que habita los bosques ne-otropicales [13]. E n la E stación Biológica Bilsa seestudió la estructura genética de esta especie. S e

amplificaron 12 loci de microsatélites de 357 fru-tos y de 185 individuos adultos de la población.E sta información permitió identificar el origen del90% de los frutos. Además se estimó que la dis-pers ión de polen se da entre los 300 y 1200 m dela planta adulta. E l anális is genético de la pobla-ción de Oenocarpus bataua en el Ecuador propor-cionó evidencia de exogamia en esta especie.

E studios genéticos con marcadores molecularestambién pueden revelar flujo genético entre dife-rentes especies . Por ejemplo, Phaedranassa viri-diflora y Phaedranassa dubia son dos especies dela familia Amaryllidaceae que existen en s impatriaen la Reserva Geobotanica Pululahua, en el cráterdel mismo nombre (provincia de Pichincha). E lcolor de la flor de P. viridiflora es amarillo, mientrasque el de P. dubia es predominantemente rojo. E nel cráter del Pululahua también se encuentran in-dividuos del género con flores anaranjadas [14].Utilizando 13 loci de microsatélites diseñadospara Phaedranassa (Amaryllidaceae), se pudoidentificar el primer caso de hibridización naturalentre estas dos especies [14]. S e colectaron alre-dedor de 30 individuos por cada especie, y un nú-mero similar de individuos con flores anaranjadas.Utilizando anális is bayes iano de agrupamiento,los individuos de P. dubia y P. viridiflora en su ma-yoría formaban grupos distintos . Los individuosde flores anaranjadas mostraban en general unamezcla genética entre estos dos grupos [14].

Flujo genético: implicaciones para la bioseguridad

La tecnología para crear organismos transgénicoso genéticamente modificados (OGM) en plantasno es un método nuevo. Inclusive el volumen demarzo del 2013 de revista Nature, presenta variosartículos alusivos a los 30 años del uso de OGMen plantas . S in embargo, existe inquietud sobreel impacto que el flujo genético de OGM puedatener en poblaciones naturales y en el medio am-biente en general. También existe la percepciónde riesgo de los alimentos originados de OGM enla salud humana, específicamente la resistencia aantibióticos , alergias , o cáncer. E l flujo genéticode transgenes es bien documentado. Para citaralgunos ejemplos , se ha detectado flujo génicode una variedad resistente a herbicidas en canola,Brassica sp., [15], y en una especie resistente a

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herbicidas de Agrostis (Poaceae) y las variedadessilvestres [16]. Un ejemplo clás ico de las implica-ciones de la presencia de OGM en comida es elcaso del maiz de la marca S tarLink. E l maíz S tar-Link, producido por la compañía Aventis , es unmaíz resistente al glifosato que fue aprobado paraconsumo animal solamente. E ste maíz fue encon-trado en tortillas de Taco Bell y los gastos genera-dos por producto retirado del mercado estácalculado en $1000 millones [17].

E xisten múltiples métodos para detectar el flujode genes de organismos genéticamente modifi-cados. No es una sorpresa que la OrganizaciónInternacional de E standarización (IS O) haya cre-ado normativas IS O para identificar OG M [18].E ntre las técnicas de detección están las basadasen la identificación de proteína como por ejemplolos ensayos ELIS A para la dectección de anticuer-pos monoclonales [19]. También se pueden detec-tar metabolitos mediante espectrometría de masao a través de la detección de moléculas derivadas.Además, se pueden emplear técnicas basadas enácidos nucleícos , tales como la reacción en ca-dena de la polimerasa (PC R , por sus s iglas en in-glés), electroforesis en gel, entre otras . La técnicaque utiliza PC R requiere, en primer lugar, el ais la-miento de ADN de la planta o producto a ser ana-lizado. Para esto existen múltiples técnicas y kitsdisponibles en el mercado. E l principio para iden-tificar plantas o alimentos que provengan de or-ganismos genéticamente modificados esrelativamente sencillo. La mayor parte de los or-ganismos genéticamente modificados pueden serdetectados a través de un PC R con un cebadorpara el promotor 35S y el terminador NOS [20].Inclusive se encuentran en el mercado kits dise-ñados para la identificación de OGMs, para pro-pós itos educativos . Por ejemplo, la compañíaBio-rad (www.bio-rad.com) comercializa un kit queidentifica la presencia del promotor 35S del virusde mosaico y el terminador del gen de la nopalinas intetasa del Agrobacterium tumefaciens NOS .Tanto el promotor 35S , como el terminador NOSse encuentran en más del 85% de organismosmodificados aprobados . E l método se basa enPC R y electroforesis . E l kit de detección de OGMpermite analizar 8 muestras de alimentos para untotal de 32 estudiantes a un precio razonable($230 aproximadamente en E E UU).

S i bien es cierto que detectar la mayoría de casosde individuos con transgenes o de productos ge-nerados a partir de transgenes es posible, inclusoa un costo accesible, la identificación de la pre-sencia de transgenes es todavía un desafío. Porun lado, los transgenes son productos de com-pañías multinacionales , por lo tanto, por motivosde propiedad intelectual o patentes , las secuen-cias usualmente pertenecen a las empresas y sucontenido molecular no necesariamente es com-partido. En este sentido, el consumidor de los pro-ductos podría exigir que las compañías proveanmecanismos para identificar productos provenien-tes de transgenes y además que sirvan para iden-tificar flujo genético. E l intercambio de informaciónes importante para la detección de OGMs, en estesentido se creó la plataforma GMOME THODS(http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/gmomethods/) endonde se encuentra información útil, como las se-cuencias de los cebadores para la detección deOGMs específicos [21].

El futuro del control del �ujo genético

Una de las mayores preocupaciones sobre el usode organismos genéticamente modificados es lapresencia de ADN foráneo. Una propuesta es eli-minar los transgenes de polen, semillas , frutos yotros órganos. E sto es posible mediante una téc-nica llamada gene deletor [17]. E l método delgene deletor, o borrador de gen, se basa en unsistema de recombinación de s itio específico deADN. E ste tipo de tecnología se ha utilizado enanimales para controlar expres ión de genes ,desde hace 20 años [17]. Por ejemplo, para eli-minar transgenes de frutos y semillas se puedeutilizar la tecnología de s itio directo de recombi-nación. E sta tecnología de recombinación deADN fue derivada de bacterias y hongos y permitemanipular el ADN de un organismo in vivo [22].E ste proceso involucra la recombinación entreuna secuencia específica (de alrededor de 30bases de pares) (como el FR T) con una enzimarecombinasa que actua sobre esa secuencia es-pecífica [17]. E l mecanismo permite insertar, cor-tar, invertir o translocar ADN [22]. E l mecanismopara eliminar un transgen en polen o semillas con-sistiría en colocar el trasgen entre dos secuenciasde s itio directo de recombinación, junto con unpromotor específico para polen o semillas [17].

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E ntonces la expresión del mecanismo de s itio di-recto de recombinanción ocurriría solamente enpolen y semillas. Entonces, como resultado, todaslas demás partes de la planta mantendrán eltransgen, excepto el polen o semillas [17]. E statecnología permitirá eliminar el problema del flujogenético de OGMs a cultivos no modificados.Finalmente, los intragenics o cisgenes, son OGMsderivados del acervo génico de la misma especie,y representan otro de los desafíos para la identifi-cación de organismos genéticamente modifica-dos [23]. La forma de detectar estos organismosno se logra detectando solamente los elementosinsertados , s ino que require identificar el ordenespecífico del loci insertado y los motivos de ADNespecíficos al evento de insertar el ADN [23]. De-pendiendo del origen del elemento insertado, sepuede realizar una serie de evaluaciones para de-tectar la presencia de una o varias regiones deADN asociadas a la inserción genética [23].

Identificar el flujo genético en cultivos agrícolasactualmente es importante en el por múltiples ra-zones. Por un lado, el uso de organismos genéti-camente modificados está prohibido por laC onstitución de la R epublica del E cuador [24].Por el otro, el Artículo 16 de la Ley de DesarrolloAgrario permite la libre importación y comerciali-zación de transgénicos , los mismos que no re-querirán autorización s i cumplen con la LeyOrgánica de Aduanas, y la Ley de S anidad Vege-tal y Animal [24]. E sta ambigüedad legal ejempli-fica la dualidad de criterios acerca de lostransgénicos: por un lado se los prohíbe (por con-siderarlos peligros) y por otro se los incentiva (porsu mayor rendimiento y producción). Además losalimentos procesados que se comercialicen enE cuador y que contengan más del 0,9% de mate-rial transgénico deben ser etiquetados s iguiendoel R eglamento Técnico E cuatoriano R TE INE N022 (1R ) “R otulado de Productos AlimenticiosProcesados, E nvasados y E mpaquetados” a par-tir del presente año [25]. E n este contexto socialcomplejo, las técnicas discutidas en este ensayoson una herramienta para identificar los productostransgénicos. La decisión de su uso, comercializa-ción y consumo es un debate todavía no resuelto.

Conclusiones

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Recibido: 2 junio 2014Aceptado: 28 octubre 2014

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