myotonic dystrophy type 2 (dm2) : diagnostic methods and

Myotonic dystrophy type 2 (DM2): Diagnostic methods and molecular pathology Anna Naukkarinen Folkhälsan Institute of Genetics Helsinki, Finland Department of Medical Genetics University of Helsinki Helsinki, Finland Vaasa Central Hospital Department of Pathology Vaasa, Finland ACADEMIC DISSERTATION To be presented, with the permission of the Faculty of Medicine of the University of Helsinki, for public examination in lecture hall 3, Biomedicum, Haartmaninkatu 8, Helsinki on April 8 th 2011, at 1 PM. Helsinki 2011

Upload: others

Post on 15-Apr-2022




0 download


Page 1: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and


Myotonic dystrophy type 2 (DM2): Diagnostic methods and molecular pathology 


 Anna Naukkarinen 



Folkhälsan Institute of Genetics Helsinki, Finland 


Department of Medical Genetics University of Helsinki Helsinki, Finland 

 Vaasa Central Hospital 

Department of Pathology Vaasa, Finland 



To be presented, with the permission of the Faculty of Medicine of the University of Helsinki, for public examination in 

lecture hall 3, Biomedicum, Haartmaninkatu 8, Helsinki on April 8th 2011, at 1 PM. 

 Helsinki 2011 

Page 2: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

2 |

Supervisor:   Professor Bjarne Udd, MD, PhD 

Folkhälsan Institute of Genetics Department of Medical Genetics Biomedicum, C319a University of Helsinki PB 63, 00014 Helsinki  Neuromuscular Research Unit University of Tampere Department of Neurology Tampere University Hospital 33520 Tampere, Finland  Vasa Central Hospital Department of Neurology 65130 Vasa, Finland  

 Reviewers:   Professor Caroline Sewry, PhD 

Dubowitz Neuromuscular Centre Institute of Child Health Great Ormond Street Hospital London UK 

 Associate Professor Katarina Pelin, PhD Division of Genetics Department of Biosciences University of Helsinki Finland 

  Opponent:  Professor Jaakko Ignatius, MD, PhD 

Department of Clinical Genetics Turku University Hospital Finland 

   ISBN 978‐952‐92‐8732‐1 (paperback) ISBN 978‐952‐10‐6894‐2 (PDF)  Unigrafia Oy Helsinki 2011 

Page 3: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 3


















To my family 

Page 4: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

4 |



 1. LIST OF ORIGINAL PUBLICATIONS ................................................................................... 7 

2. ABBREVIATIONS  ............................................................................................................ 9 

3. ABSTRACT  .................................................................................................................... 10 

4. REVIEW OF THE LITERATURE  ........................................................................................ 12 

4.1. Introduction to cell and molecular biology  .................................................................. 12 

4.1.1. Microsatellite‐DNA  ................................................................................................ 13 

4.1.2. Mutations  .............................................................................................................. 13 

4.1.3. Proteins .................................................................................................................. 14 

4.2. Molecular methods for research and diagnostics ......................................................... 15 

4.2.1. Detecting nucleic acids with hybridization techniques  ......................................... 15  Southern blotting  ........................................................................................ 15  In situ –hybridization  ................................................................................... 16  Microarrays  ................................................................................................. 16 

4.2.2. Detecting proteins using antibody recognition  ..................................................... 17  Antibodies  ................................................................................................... 17  Immunohistochemistry  ............................................................................... 19  Western blotting  ......................................................................................... 21 

4.3. The muscle ..................................................................................................................... 21 

4.3.1. The muscle structure  ............................................................................................. 23 

4.3.2. Skeletal myogenesis  .............................................................................................. 25 

4.3.3. The satellite cells  ................................................................................................... 26 

4.3.4. Fiber types  ............................................................................................................. 27  Fiber type distributions in disease  .............................................................. 28 

4.3.5. The skeletal muscle fiber  ....................................................................................... 29 

4.3.6. The sarcomere  ....................................................................................................... 32 

4.3.7. Muscle contraction  ................................................................................................ 34 

4.3.8. Role of Ca2+ in muscle contraction  ........................................................................ 35  The ryanodine receptor  ............................................................................... 36  The SERCA family of Ca2+ re‐uptake channels  ............................................. 36  The triad and calsequestrin  ......................................................................... 37 

4.3.9. Role of Ca2+ in muscle signaling  ............................................................................. 37 

4.3.10. The muscle biopsy  ............................................................................................... 39 

4.4. The muscular dystrophies  ............................................................................................. 40 

Page 5: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 5

4.4.1. Repeat expansions and disease  ............................................................................. 41 

4.4.2. The myotonic dystrophies DM1 and DM2 ............................................................. 43  History and prevalence  ............................................................................... 43  DM1 and DM2 mutations  ............................................................................ 44  Symptoms  .................................................................................................... 47  Muscle histopathology  ................................................................................ 48  Diagnostics  .................................................................................................. 50  Pathomechanisms  ....................................................................................... 51 

       The muscleblind proteins  .................................................................. 53 

       CUGBP1 .............................................................................................. 55 

       Role of DMPK in DM1 ........................................................................ 56 

       Role of ZNF9 in DM2 .......................................................................... 57 

       The nuclear foci  ................................................................................. 58 

       Neighboring genes  ............................................................................ 58 

       Other pathomechanisms  .................................................................. 58  Animal models  ............................................................................................. 59  Management and gene therapy  .................................................................. 61 

5. AIMS OF THE STUDY  ..................................................................................................... 63 

6. MATERIALS AND METHODS  .......................................................................................... 64 

6.1. Patients and samples ..................................................................................................... 64 

6.1.1. Consent and ethics committee permissions .......................................................... 64 

6.1.2. Patients included in the histopathological study (I) ............................................... 65 

6.1.3. Patients included in the study of new diagnostic methods (II) .............................. 65 

6.1.4. Patients included in the studies of sarcomeric and Ca2+ handling proteins and mRNA expression (III, IV) .................................................................................................. 65 

6.1.5. Patients with neuromuscular diseases included in the study of protein expression in the highly atrophic fibers (U) ........................................................................................ 65 

6.2. Methods ........................................................................................................................ 66 

6.2.1. Immunohistochemistry (I, III, IV), immunofluorescence (III, IV) and microscopy (I‐IV)  .................................................................................................................................... 68 

6.2.2. Enzyme histochemistry (I)  ..................................................................................... 68 

6.2.3. Muscle morphometry (I) ........................................................................................ 68 

6.2.4. Chromogenic in situ –hybridization (II) .................................................................. 69 

6.2.5. Fiber‐FISH (II) .......................................................................................................... 69 

6.2.6. PCR‐based allele sizing (II) ...................................................................................... 70 

6.2.7. Repeat‐primed PCR (RP‐PCR) (II) ............................................................................ 70 

6.2.8. Field‐inversion gel electrophoresis (FIGE) (II) ........................................................ 71 

6.2.9. Western blotting (III, IV) ......................................................................................... 71 

Page 6: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

6 |

6.2.10. Microarray expression profiling (III, IV) ................................................................ 71 

6.2.11. Splice variant analysis (III, IV) ............................................................................... 72 

7. RESULTS AND DISCUSSION  ........................................................................................... 73 

7.1. Histopathology and protein expression in DM2 (I, III, IV, U) ......................................... 73 

7.1.1. The atrophy of type II fibers in DM2 (I) .................................................................. 76 

7.1.2. Protein expression in highly atrophic fibers (III, U) ................................................ 78 

7.1.3. Using fiber type II atrophy as a predictive factor for DM2 diagnosis  .................... 84 

7.1.4. Satellite cells (U) ..................................................................................................... 84 

7.1.5. Expression of Ca2+ ‐handling genes in DM (IV) ....................................................... 86 

7.2. Molecular genetic tools for DM2 mutation identification and size determination (II) . 88 

7.2.1. PCR‐based allele sizing (II) ...................................................................................... 88 

7.2.2. RP‐PCR and FIGE (II) ................................................................................................ 88 

7.2.3. In situ –hybridization (II) ......................................................................................... 88  CISH (II) ......................................................................................................... 89  Fiber‐FISH (II) ................................................................................................ 92 

7.3. Splice variant analysis (III, IV) ........................................................................................ 93 

7.4. Expression profiling (III, IV) ............................................................................................ 96 

7.4.1. Muscle‐specific gene array (III) .............................................................................. 97 

7.4.2. Ca2+ gene array (IV) ................................................................................................. 99 

8. CONCLUDING REMARKS AND FUTURE PROSPECTS  ..................................................... 101 

9. ACKNOWLEDGEMENTS  .............................................................................................. 104 

10. REFERENCES  ............................................................................................................. 107 


Page 7: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 7

1. LIST OF ORIGINAL PUBLICATIONS     This  thesis  is based on  the  following original publications, which are  referred  to  in the  text  by  their  roman  numerals.  In  addition,  some  unpublished  results  (U)  are presented.    I  Vihola A*, Bassez G*, Meola G, Zhang S, Haapasalo H, Paetau A, Mancinelli E, 

Rouche A, Hogrel J Y, Laforêt P, Maisonobe T, Pellissier J F, Krahe R, Eymard B, Udd B. Histopathological differences of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and PROMM/DM2. Neurology. 2003;60(11):1854‐7. 

 II  Sallinen R*, Vihola A*, Bachinski LL, Huoponen K, Haapasalo H, Hackman P, 

Zhang S, Sirito M, Kalimo H, Meola G, Horelli‐Kuitunen N, Wessman M, Krahe R, Udd B. New methods  for molecular diagnosis  and demonstration of  the (CCTG)n mutation in myotonic dystrophy type 2 (DM2). Neuromuscul Disord. 2004;14(4):274‐83. 

 III  Vihola A, Bachinski LL, Sirito M, Olufemi S‐E, Hajibashi S, Baggerly KA, Raheem 

O, Haapasalo H, Suominen T , Holmlund‐Hampf J, Paetau A, Cardani R, Meola 

G, Kalimo H, Edström  L, Krahe R, Udd B. Differences  in aberrant expression and  splicing  of  sarcomeric  proteins  in  the myotonic  dystrophies  DM1  and DM2. Acta Neuropathol. 2010;119(4):465‐79. 

 IV  Vihola  A,  Sirito M,  Bachinski  L,  Raheem  O,  Suominen  T,  Krahe  R,  Udd  B. 

Aberrant  expression  and  splicing  of  Ca2+  metabolism  genes  in  myotonic dystrophies DM1 and DM2. Manuscript submitted 

    Anna Naukkarinen née Vihola 

*These authors contributed equally to this work 

Publication II also appears in the thesis of Riitta Sallinen (2004) 

The articles are reprinted with the permission of their copyright holders 

Page 8: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

8 |

Page 9: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 9



aa  amino acid Ab  antibody Ach  acetylcholine ATP  adenosine‐5´‐triphosphate ATPase  adenosine‐5´‐triphosphatase BSA  bovine serum albumin cDNA  complementary DNA CISH  chromogenic in situ –hybridization CK  creatine kinase CNS  central nervous system DAB  3,3´‐diaminobentzidine DAG  dystrophin‐associated glycoprotein DHPR  dihydropyridine receptor DM1  myotonic dystrophy type 1 DM2  myotonic dystrophy type 2 DNA  deoxyribonucleic acid EP  expression profiling FIGE  field‐inversion gel electrophoresis FISH  fluorescent in situ –hybridization IF  immunofluorescence Ig  immunoglobulin IHC  immunohistochemistry ISH  in situ –hybridization LGMD  limb‐girdle muscular dystrophy nt  nucleotide mAb  monoclonal antibody MD  muscular dystrophy MRF  myogenic regulatory factor mRNA  messenger‐RNA MyHC  myosin heavy chain NMD  neuromuscular disease nNOS  neuronal nitric oxide synthase pAb  polyclonal antibody PCR  polymerase chain reaction PDM  proximal myotonic dystrophy PFA  paraformaldehyde PROMM  proximal myotonic myopathy RT‐PCR  reverse transcription –PCR RNA  ribonucleic acid RYR  ryanodine receptor SERCA  sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 

SNP  single nucleotide polymorphism SR  sarcoplasmic reticulum SVA  splice variant analysis TSF  transcription factor 

Page 10: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

10 |



Myotonic  dystrophies  type  1  (DM1)  and  type  2  (DM2)  are  autosomal  dominant 

multisystemic  disorders  caused  by  microsatellite  tri‐  or  tetranucleotide‐repeat 

expansion  mutations  in  transcribed  but  not  translated  gene  regions.  Since  the 

primary tissue affected  is muscle, they are classified as muscular dystrophies. DM1 

and  DM2  share  some  features  in  general  clinical  presentation  and  molecular 

pathology,  yet  they  show  distinctive  differences,  including  disease  severity  and 

differential muscle and fiber type involvement. Thus far more than 300 DM2 patients 

have  been  identified  in  Finland,  which  is  in  stark  contrast  with  the  previously 

reported prevalence of 1/105 (corresponding to 50 patients), and the true number is 

believed to be much higher. 


DM2  is particularly  intriguing, as  it shows an  incredibly wide spectrum 

of clinical manifestations. For this reason, it constitutes a real diagnostic challenge. It 

is  important  to  improve  the diagnostic accuracy  in order  to efficiently  identify  the 

symptomatic  DM2  patients  for  appropriate  medical  attention  and  management. 

Myalgic pains may be the most disabling symptom  for decades, sometimes  leading 

to  incapacity  for work. DM2 may  cause major  socio‐economical  consequences  for 

the patient, if not diagnosed, due to misunderstanding and false stigmatization. 


In this thesis work, DM2 patient skeletal muscle has been compared to 

muscle  from DM1  patients  and  healthy  individuals.  This  is  the  first  description  of 

histopathological  differences  between  DM1  and  DM2,  which  can  be  used  in 

differential  diagnostics.  Two  novel  high‐resolution  applications  of  in  situ  ‐

hybridization, which  can  be  used  for  direct  visualization  of  the  DM2 mutation  in 

patient muscle biopsy sections or on extended DNA‐fibers have been described. By 

measuring  protein  and mRNA  expression  in  the  samples,  differential  changes  in 

expression  patterns  affecting  contractile  proteins,  other  structural  proteins  and 

calcium handling proteins in DM2 compared to DM1 were found. The dysregulation 

at  mRNA  level  was  caused  by  altered  transciption  and  abnormal  splicing.  The 

Page 11: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 11

findings reported here indicated that the extent of aberrant splicing is higher in DM2 

compared to DM1. These abnormalities to some extent correlate to the differences 

in fiber type involvement in the two disorders. 

Page 12: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

12 |



4.1. Introduction to cell and molecular biology 


The eukaryotic cell contains a plasma membrane, delineating the cell, which is filled 

with  cytoplasm  and  organelles:  at  least  a  nucleus,  membranous  endoplasmic 

reticulum  system, mitochondria  and  ribosomes.  Even  though  genetically  identical, 

the cells of an individual organism develop into very distinctive forms depending on 

their  environment  and  functional  requirements. Groups  of  differentiated  cells  are 

organized to form tissues and organs with specialized functions. Complex networks 

of molecular pathways regulate the multitude of biochemical events taking place in 

individual cells, enabling the full spectrum of cellular functions: division, maturation, 

synthesis, degradation, respiration, secretion, movement, and senescence [1]. 


In  humans,  the  genetic  code,  composed  of  deoxyribonucleic  acid 

(DNA), is packed inside the nucleus in 46 chromosomes (23 pairs, one set from both 

parents)  [293].  The whole  human  genome  contains  approximately  20,000  ‐25,000 

different protein‐coding genes, as was  revealed by  the Human Genome Project  in 

2004  [116].  Four different nucleotides  (nt)  (Adenine,  Thymine, Cytosine, Guanine) 

serve  as  building  blocks  of  the  DNA,  connected  to  each  other  via  phosphate 

backbones,  to  form  long  filamentous molecules. The DNA molecule  is made up of 

two anti‐parallel and complementary strands, which pair to form A‐T and C‐G pairs, 

and fold into a secondary structure known as the double helix [314]. 


  Genes  carry  the  information  needed  to  build  proteins,  the  large 

biomolecules serving as structural components, enzymes and  regulatory molecules 

of the cell. First, the gene is transcribed, to create a pre‐messenger ribonucleic acid 

(mRNA) molecule complementary to the gene [155]. However, the eukaryotic gene 

also contains segments which do not code for a protein: these intron sequences are 

spliced  out  to  form  the  final mRNA molecule,  containing  only  exons, which  then 

serves as a template for ribosomal translation to a protein. The nucleotide sequence 

Page 13: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 13

of  the  mRNA  molecule  determines  the  order  in  which  the  20  amino  acids  are 

inserted into a growing polypeptide chain to create a protein. However, the number 

of different proteins  is much  larger  than  the number of genes. Differential splicing 

[72]  is one of  the means  the cells employ  to create more variability  in  the protein 

structure and function: in addition to introns, some of the exons may sometimes be 

excised.  In  fact,  it  is estimated  that approximately 80 percent of human genes go 

through such alternative splicing, giving rise to multiple isoforms [176]. Typically, the 

splicing  pattern  is  regulated  spatially  and  temporally:  exon  usage  is  specific  in 

different tissues and cell types, and at different points of development [155]. 


4.1.1. Microsatellite‐DNA 


In  addition  to  the  paradigmatic  protein‐coding  function,  both  DNA  and  RNA 

molecules  have  other,  regulatory  functions.  For  instance,  the  human  genome 

contains vast amounts of short tandem repeat (STR) sequences, most often 1 ‐ 6 nt 

in  length,  called microsatellite‐DNA  [28].  The  repetitive  sequences, which  can  be 

perfect or  interrupted  in nature, occur widely  in both eukaryotes and prokaryotes. 

The  functions  of  the  microsatellite  DNA  are  not  fully  elucidated.  However,  the 

repeat‐containing  mRNA  transcripts  have  been  implicated  in  regulation  of 

transcription,  translation  and  cell  signaling  [120].  These  highly  repetitive  tandem 

sequences typically show a high degree of polymorphism, enabling their use as tools 

for several applications  including  linkage analyses,  in the search for disease‐causing 

genes,  and  DNA  fingerprinting  [278,  284].  In  addition, microsatellites  have  been 

implicated  in  disease:  especially,  they  play  a  significant  role  in  neurodegenerative 

diseases [42]. 


4.1.2. Mutations 


Due to errors  in translation, radiation and chemical stress, genomes are constantly 

subject to modifications, or mutations: nucleotides are deleted, inserted, or replaced 

by others. All organisms  therefore  accumulate mistakes  in  their  genomes,  in both 

somatic  cells  and  gametes  [155].  Although  most  changes  are  silent,  causing  no 

Page 14: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

14 |

effect, mutations  in  somatic  cells  for  example  are  the  cause  of  cancer. When  a 

mutation occurs in a gamete, it is transmitted to every cell of the offspring. It should 

be  noted  that  mutations  in  gametes  make  evolution  possible:  sometimes  the 

transformed gene encodes a protein which gives more benefit to the organism than 

the  original  form,  which  may  lead  to  its  establishment  in  the  population. 

Unfortunately,  such beneficial mutations  are  very  rare.  It  is more  common  that  a 

mutation  leads  to malfunctioning of  the protein or a  regulatory element, which  is 

lethal or may lead to illness. [278] 


  Monogenic  disorders  follow  Mendelian  modes  of  inheritance: 

autosomal  recessive  (AR),  autosomal  dominant  (AD),  X‐linked  and  Y‐chromosomal 

[278]. The mutation is called dominant if just one mutated allele is sufficient to cause 

the  disease.  The  pathomechanisms,  through which  the mutations  cause  diseases, 

have  classically  been  divided  into  protein  loss‐of‐function  (mostly  recessive 

mutations)  and  protein  gain‐of‐function  (mostly  dominant  mutations).  However, 

increasing  numbers  of mutations  evoking  their  effect  via  an  RNA  gain‐of‐function 

mechanism  have  been  described; many  of  them  are  repeat  expansion mutations 

[238]. The myotonic dystrophies, which are the subject of this work, are autosomal 

dominant  diseases,  caused  by microsatellite  repeat  expansions  in  non‐coding  but 

transcribed gene regions, and the main pathomechanism underlying them is an RNA 

gain‐of‐function [158, 173]. 


4.1.3. Proteins 


Proteins  are  chains  of  polypeptides,  synthesized  of  20  different  amino  acids, 

according  to  the  genetic  blueprint.  The  linear  nascent  polypeptides  first  form 

secondary structures (α‐helices and β‐sheets), and then fold  independently, or with 

assistance  from  the  molecular  chaperones,  to  adapt  the  final  functional 

conformation,  the  tertiary  structure.  Proteins  often  form  permanent  or  transient 

complexes,  quaternary  structures, when multiple  cooperative  proteins  are  linked 

together via non‐covalent  interactions [38]. Posttranslational modifications, such as 

glycosylation  or  phosphorylation,  increase  the  versatility  of  the  protein molecules 

Page 15: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 15

[1]. Proteins are  the main building blocks of  the  living  cell,  serving  for example as 

structural and contractile components, enzymes, antibodies, and also as regulatory 

and  signaling  proteins.  They  show  huge  variation  in  size  and  shape,  from  small 

oligopeptide  signaling molecules  to  huge  filamentous  structural  proteins,  such  as 

titin  (TTN),  the  largest polypeptide  in nature with a molecular mass of more  than 

3,000 kD [147]. 


4.2. Molecular methods for research and diagnostics 


4.2.1. Detecting nucleic acids with hybridization techniques 


Hybridization methods  for detecting DNA or RNA  are based on  the double helical 

nature of these molecules, or the tendency of the nucleic acids to bind specifically to 

a complementary and anti‐parallel sequence [155]. The target sequence is a mixture 

of nucleic  acids  in  the  specimen examined.  The  target  is  incubated with  a  known 

probe sequence, under high‐stringency conditions which causes the denaturation of 

any double helical structures. Next,  the  target and probe are allowed  to hybridize, 

after which their binding is visualized and analyzed. DNA and RNA may be detected 

interchangeably, as all kinds of hybrids between them are possible [278]. Southern blotting 


A basic molecular biology  technique  for detecting specific DNA sequences  is called 

Southern blotting, according to  its  inventor [276]. The target sequence, most often 

genomic DNA,  is  cleaved  to  small  fragments  using  restriction  endonucleases.  The 

yielded DNA fragments are separated electrophoretically on agarose gels, according 

to their size.  In order to expose the fragments by hybridization, the DNA has to be 

transferred  (blotted)  from  the gel onto a membrane, often nitrocellulose or nylon, 

simply using capillary action, or electrically, taking advantage of the negative charge 

of the DNA molecule. After immobilizing the target DNA, it can be hybridized with a 

labeled probe. Fluorescent and chemiluminescence  labels are most commonly used 

today, whereas  radioactive  tags have been popular  in  the past. The binding of  the 

Page 16: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

16 |

probe  is  visualized  using  a  laser  reader  or  autoradiography.  The  Southern  blot 

method  may  be  used,  for  example,  for  detecting  gene  copy  numbers,  or  for 

diagnostics. [41, 278] In situ –hybridization 


The in situ ‐hybridization (ISH) technique dates back to the 1960´s [92]. The principle 

of in situ hybridization (ISH) is that the nucleic acid target sequence in the preparate, 

which  is  often  a  tissue  section,  cell  or  chromosome  on  a  microscope  slide,  is 

detected by  a  specific  labeled probe, which hybridizes with  a  region  in  the  target 

complementary to the probe. The binding site is then visualized and localized, hence 

the name in situ. Fluorescent labels are most often used for detection today, due to 

their  high  sensitivity  and  possibility  to  visualize  multiple  targets  simultaneously 

[162]. However, chromogenic  labels may be more convenient  in some cases as the 

procedure is more robust, the end product is more resistant, the specimens may be 

stored  for  later  documentation,  and  their  visualization  does  not  require  highly 

specialized  equipment.  In  addition,  high  sensitivity with  chromogenic methods  is 

possible to reach nowadays, due to improved detection systems, including the use of 

polymers [221]. Microarrays 


Microarray  technology  represents  a  multiplex  approach,  where  probes  are 

immobilized on  a  solid  support or microscopic beads,  and  they  are detected with 

labeled  target  sequence  mixture  in  solution,  such  as  cDNA.  The  probe‐target 

hybridization  is  detected  and  quantified  in  order  to  determine  the  presence  and 

relative abundance of a specific  target sequence  in  the sample solution. One array 

may  contain  tens  of  thousands  of  probes, which makes  it  a  highly  efficient  high‐

throughput method for research and diagnostic purposes. [108] 


Microarrays  can  be  used  in  a multitude  of  applications:  for  example 

using  the  cDNA  (DNA  complementary  to  mRNA)  library  as  a  target,  expression 

Page 17: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 17

profiling can be used to investigate the relative mRNA expression in a given tissue or 

cell  type;  similarly,  with  an  exon‐specific  array,  different  splice  variants  can  be 

detected  [48]. When  genomic  DNA  is  used  as  a  target,  it  is  possible  to  perform 

comparative genomic hybridization to detect copy number changes in closely related 

specimens, or to  identify single nucleotide polymorphisms (SNPs), or mutations. An 

increasingly used application utilizing microarrays is genetic testing [323]. Microarray 

experiments  produce  a  vast  amount  of  data,  handling  of  which  requires 

bioinformatics: elaborate statistical analysis and normalization  in order to filter out 

background noise and reach biologically and statistically significant conclusions [45]. 

Standardization methods are used  to enable comparison of  separate experimental 

data, even though it is often very difficult due to the numerous variables involved in 

the experimental procedure. Microarray results are commonly visualized using heat 



4.2.2. Detecting proteins using antibody recognition Antibodies 


Antibodies  (Ab)  are  Y‐shaped  immunoglobulin  (Ig)  molecules  composed  of  two 

identical  light  chains  and  heavy  chains. Hypervariable N‐termini  form  the  antigen 

binding site, whereas the C‐termini form the stabilizing Fc‐tail, which also serves as a 

binding site  for  the other Ab molecules  [244]. Most antibodies used  for  IHC are of 

IgG‐type, with two identical Ab‐binding sites (paratopes). 


A  good Ab  shows high  specificity  and  sensitivity.  Specificity describes 

the ability of a given Ab to recognize only its specific antigen, whilst sensitivity refers 

to  the  affinity of  an Ab  to  its  antigen. Ab‐antigen binding  is based on weak, non‐

covalent  bonds, mainly  hydrophobic  and  electrostatic  by  nature  [236].  Two main 

classes of antibodies are the polyclonal and monoclonal antibodies. 


Polyclonal antibodies (pAb) are produced by immunizing an animal, for 

example a mouse, rabbit or goat, by injecting the purified antigen, often linked to a 

Page 18: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

18 |

carrier protein to enhance its stability and introduction to the immune system. After 

a  successful  immunization,  usually  several  cell  clones  produce  immunoglobulin 

molecules raised against different epitopes in the antigen, and secrete them into the 

blood  serum.  The  serum may  be  used  as  such,  however  it  is  common  to  affinity 

purify  the  immunoglobulin molecules using  the antigen as bait,  in order  to  reduce 

cross‐reactions  caused  by  the  numerous  Ig  species  in  the  serum.  The  polyclonal 

antibodies  provide  a  powerful  tool  in  many  cases.  However,  there  are  some 

disadvantages:  while  the  polyclonal  antibodies  generally  show  more  sensitivity, 

because of several different Ig‐molecules binding to several different epitopes in the 

protein,  their  specificity  is  often  compromised  when  compared  to  monoclonal 

antibodies due to higher risk for cross‐reactions.  In addition, the exact epitope(s)  is 

often not known, especially when an intact protein has been used as an immunogen. 



Monoclonal antibodies  (mAb) are most often produced  in mice. After 

successful immunization, the animal is sacrificed and the spleen cells are collected to 

start a cell culture. The cells are  immortalized by fusing them with mouse myeloma 

cells,  after which  they  are  separated  and  cultured  individually,  so  that  every  sub‐

culture  is a clone derived  from a  single B‐cell. The clones are  then  screened  for  Ig 

molecules which specifically recognize the original immunogen [138]. The procedure 

results in stable hybridoma cell lines, which produce and secrete a single Ig species. 

In  general,  monoclonal  antibodies  provide  a  more  specific  tool  compared  to 

polyclonals. New technologies have been developed in the recent years to meet the 

restrictions of the traditional mouse hybridoma technique,  including phage  libraries 



Regardless of  the method used  for Ab production, each Ab  is unique, 

and should be carefully tested and characterized before research or diagnostic use, 

to avoid misinterpretation of results. 




Page 19: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 19 Immunohistochemistry 


The advent of the immunofluorescence (IF) technology in the 1940s [57, 58] initiated 

the  development  of  techniques  based  on  proteins  being  detected  in  situ  with 

antibodies,  methods  collectively  called  “immunohistochemistry”  (or 

immunocytochemistry,  if cells rather than tissues are used). The molecular basis of 

immunohistochemistry  (IHC)  is  the  specific  interaction of an antibody  (Ab) protein 

molecule with  its antigen, most often a protein,  residing  in  the  tissue  section. The 

antibody molecule recognizes a defined part of the protein, which  is called epitope 

or antigenic determinant. The epitope  is a  tertiary  structure on  the  surface of  the 

protein, and  it may be composed of  linear amino acid sequence (linear epitope), or 

non‐linear  amino‐acids,  residing  in  distinct  parts  of  a  protein,  which  come  into 

proximity  when  the  protein  folds  into  its  native  conformation  (conformational 

epitope). The epitope may also involve a covalent modification, such as a phosphate 

group  or  a  linked  oligosaccharide  (glycoprotein).  By  IHC  staining  methods,  the 

subcellular  localization of specific proteins and to a  limited extent, the detection of 

quantitative  changes of protein expression may be  studied. However,  the method 

does not provide information relating to protein interactions. [236] 


It  is  common  to  fix  tissue  sections  in  order  to  preserve  good‐quality 

morphology  and  prevent  autolysis.  Fixation  is  absolutely  required  when  soluble 

molecules are being detected, to prevent diffusion and displacement of components. 

Fixation  using  formaldehydes  is  a  conventional method,  resulting  in  formation  of 

cross‐links  between  proteins  via  amino  groups.  However,  such  fixation  often 

modifies  the  tertiary  (and  quaternary)  structures  of  proteins  and  destroys  the 

immunogenic regions, rendering the proteins unrecognized by Abs. Short fixation in 

paraformaldehyde  (PFA) solution  is commonly used on  frozen  tissues, as  it creates 

only limited amount of cross‐linking, and is partially reversible. An alternative means 

is  to use coagulating  fixatives,  such as ethanol, methanol or acetone. They do not 

form  cross‐linking,  but  rather  precipitate  the  proteins,  leading  to  partial 

denaturation.  There  is  no  fixation method which  suits  all  epitopes,  but  it  always 

depends  on  the  properties  of  the  antigen  and  the  Ab,  and  the  optimal  fixation 

Page 20: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

20 |

approach needs to be tested on each Ab  individually. Some antigens are extremely 

vulnerable  to  any  fixation  methods,  leaving  no  choice  but  to  detect  the  tissue 

sections in their native state. [105, 236, 237] 


To make the Ab‐antigen reaction visible in tissue sections, a selection of 

immunohistochemical detection methods are available. The primary antibody may 

be  directly  visualized  if  covalently  labeled  with  a  reporter  molecule,  such  as 

fluorescein.  However,  the  indirect  detection  method,  which  utilizes  a  labeled 

secondary Ab raised against the host animal used to produce the primary Ab, offers 

several advantages over  the direct method,  including higher  sensitivity,  specificity, 

and more versatile use of the primary Ab. Indirect  immunofluorescence allows high 

sensitivity,  and use of double  staining methods  to  study  co‐localization of distinct 

proteins,  when  labels  with  different  absorption  and  emission  wavelengths 

maximums are used. High resolution is achieved through confocal microscopy. [105, 



A more  robust method, which  is  often  advantageous  in  diagnostics, 

involves  the  use  of  enzyme‐linked  secondary  Abs.  The  enzyme,  most  often  a 

peroxidase  or  alkaline  phosphatase,  catalyses  the  reaction  between  a  specific 

substrate and a chromogen to produce a coloured precipitate at the Ab binding site. 

The most widely  used  peroxidase  substrate  is  3,3´diaminobenzidine  (DAB), which 

results  in  brown  deposit,  insoluble  in  organic  solvents.  The  sensitivity  of  enzyme‐

based  detection  methods  can  be  increased  with  several  techniques,  including 

branching  polymer  molecules  carrying  multiple  enzymes  (summarized  in  [236]). 

Double staining, with distinct colored end products, may also be applied when  the 

antigens reside in distinct cell types or structures. 


IHC may be used  to evaluate muscle pathology  in  various  cases.  The 

classical  method  is  the  sarcolemmal  staining  with  dystrophin  antibodies:  in 

Duchenne muscular dystrophy the sarcolemmal labeling is nearly or completely lost, 

whereas  in Becker  type  the  finding  is often  intermediate  [6]. Also accumulation of 

proteins  in specific  localizations, such as rimmed vacuoles or ribonuclear  inclusions, 

Page 21: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 21

may  be  studied. When  assessing  quantitative  changes,  using  an  internal  control, 

which shows the overall preservation of the sample, is mandatory. For example, for 

the detection of muscle  sarcolemmal  integrity, beta‐spectrin  staining  is often used 

[71].  The  IHC  results  should  always  be  interpreted  with  caution;  in  addition  to 

adequate controls, one should be aware of the handling and storage history of the 

sample.  It  should  also  be  noted  that  there  are  differences  between  stainings 

performed in different laboratories, even though the same protocols may be used. Western blotting 


Proteins in a given sample, such as tissue or cells, can be solubilized, denatured and 

separated  electrophoretically.  The most  common method  used  is  sodium  dodecyl 

sulfate  ‐  polyacrylamide  gel  electrophoresis  (SDS‐PAGE),  described  by  Laemmli  in 

1970  [148], which  allows  the  separation  of  proteins  according  to  their  size.  The 

proteins may be transferred from gel to a membrane for detection with antibodies, 

with  the  Western  blotting  (WB)  method  [46].  When  assessing  total  protein 

expression, Western blotting  is considered a more quatitative method compared to 

IHC. However, the ability to  identify protein  localization  in the sample  is  lost, which 

may  in  some  cases  be  detrimental  to  interpretation.  When  possible,  IHC  and 

Western  blotting  should  be  used  in  parallel,  because  they  provide  information 

complementary to each other. 


4.3. The muscle 


Muscle  tissue  is  required  for  generating mechanical  force,  which  enables  a  vast 

amount  of  bodily  functions,  including  locomotion, maintaining  posture,  breathing, 

heartbeat and digestion, among others. There are three main classes of muscle: (1) 

skeletal and (2) heart muscle, both of which are striated,  in addition to (3) smooth, 

non‐striated muscle  (Figure  1). Only  skeletal muscles  are  voluntary,  and  they  are 

used for locomotion. The extrafusal (skeletal muscle) fibers are innervated by axons 

of the alpha motor neurons,  large  lower motoneurons with their cell bodies  in the 

Page 22: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

22 |

brainstem and spinal cord. Heart muscle contraction  is under autonomous nervous 

control, as is smooth muscle. [71, 131] 


The  cardiac  muscle  cells,  termed  cardiomyocytes,  are  branched 

cylinder‐shaped,  mononuclear  cells.  They  are  joined  end‐to‐end  by  intercalated 

discs, specialized structures which stabilize cell adhesion, anchor actin filaments, and 

allow  signal  transduction  to  spread  from  cell  to  cell  via  gap  junctions,  leading  to 

synchronous  muscle  contraction.  The  cardiomyocytes  have  a  similar  sarcomeric 

organization  of  contractile  proteins  to  skeletal muscle,  with  some  differences  in 

cellular architecture to fulfill the special functional needs of the cardiac muscle. [131] 


The spindle‐shaped smooth muscle cells are found as sheets or bundles 

in  the  walls  of  internal  organs,  such  as  blood  vessels,  ureters,  uterus,  and  the 

respiratory and gastrointestinal tracts. In smooth muscle the contractile proteins are 

not organized in sarcomeres. [1] 






Figure 1. Schematic pictures of (A) skeletal muscle, with syncytial and multinucleated fibers, (B) cardiac muscle, showing the intercalated discs, and (C) smooth muscle. Both cardiac and smooth muscle fibers have only one, centrally located nucleus. (Adapted from Human Anatomy, 2nd edition by Dee Silverthorn. Used by permission of the copyright holder Pearson Education, Inc.)

Page 23: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 23

The  human  body  contains more  than  300  different  skeletal muscles, 

which  differ  in  size  and  shape  and  biochemical  properties,  depending  on  their 

function.  Those  close  to  the  trunk  are  called  proximal muscles  (e.g.  quadriceps, 

biceps brachii), and those distant from the trunk are called distal muscles (e.g. small 

muscles  in hands and  feet but also  lower  leg and  forearm such as  tibialis anterior, 

brachioradialis). [191] 


Skeletal  muscle  energy  metabolism  relies  on  phosphorylated 

metabolites, glycogen and  fat:  the myocytes store glucose  in  the  form of glycogen 

which  can  be metabolized  by  glycogenolysis  and  glycolysis  during  exercise,  under 

anaerobic conditions, resulting in lactic acid formation. In aerobic exercise, oxidative 

phosphorylation  generates  the  phosphorylated  metabolites  phosphocreatine  and 

ATP  needed,  and  in  long  duration  (over  30  minutes)  lipid  droplets  via  lipolytic 

cascades  are  used  to  generate ATP  also  through  oxidative  phosphorylation  (beta‐

oxidation). [101] 


4.3.1. The muscle structure 


The skeletal muscle  fiber  is a single cell, which can be up to several centimeters  in 

length, depending on the muscle. Each of the muscle fibers is surrounded by a basal 

lamina,  which  acts  as  the  interface  to  the  connective  tissue  surrounding  them, 

termed  the  endomysium  (Figure  2).  Bundles  of  muscle  fibers  form  fascicles 

enveloped by the perimysium, which is rich in blood vessels. The muscle is composed 

of bundles of  fascicles, which are ultimately enclosed  in a strong connective  tissue 

sheath epimysium, the muscle fascia. Most skeletal muscles are attached to tendons 

in  a  specialized  structure  called  the  myotendinous  junction,  which  in  turn  are 

connected to the bones. [71] 


Page 24: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

24 |


Figure 2. The structure of the muscle. (The figure was produced using Servier Medical Art at  



During development, axons of myelinated motor nerves, which are of 

two types, fast and slow,  invade the skeletal muscle where they branch. The axons 

lose  their myelin sheaths before  forming nerve  terminals  in grooves of  the muscle 

fiber, an  invagination of sarcolemma, a synapse called the neuromuscular  junction. 

Each adult muscle fiber is innervated by a single motor nerve. A motor unit is defined 

as a single parent axon and all the fibers  it  innervates with  its branches. Depending 

on  the need  for  fine  control,  a motor unit  consists of  just  a  few  fibres or  several 

hundred fibres. [76] 


The muscle  spindles,  present  in  all  skeletal muscles  except  for  facial 

muscles, are specialized structures with intrafusal fibers innervated by gamma motor 

neurons. They serve to sense muscle stretch and tone, conveying the information to 

the  central  nervous  system  (CNS)  via  sensory  nerves,  hence  coordinating muscle 

activity [71]. 

Page 25: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 25

4.3.2. Skeletal myogenesis 


All  striated muscle  is  derived  from  the mesoderm,  the  primary  embryonic  tissue 

layer between ectoderm  and endoderm  [75]. The mesodermal  tissue  gives  rise  to 

specific  lineages of progenitor cells, which develop  into specialized skeletal muscles 

and other tissues such as heart, skin, bones, blood vessels and blood [75]. The group 

of embryonic tissues which develops into skeletal muscles is called the myotome. It 

divides  into epaxial and hypaxial myotome, developing  into axial and  limb muscles, 

respectively  [68].  Cell  fate  specification  is  a  genetically  regulated,  hierarchical 

process  which  relies  on  spatial  and  temporal  expression  of  specific  regulatory 

proteins, complex regulatory networks and molecular cascades. 


The myogenic  regulatory  factors  (MRFs) Myf5, MyoD, myogenin  and 

MRF4  form a conserved group of basic helix‐loop‐helix  (bHLH) transcription  factors 

highly  specific  for  skeletal  muscle  [3].  The  early  markers  Myf5  and  MyoD  are 

expressed  in  the  paraxial  mesoderm,  where  they  control  (partially  redundantly) 

muscle  progenitor  specification.  Their  transcriptional  activation  is  controlled  by 

developmental signals [36]. 


To enable differentiation into myocytes, the cells need to undergo G1‐

specific cell‐cycle withdrawal [208]. During the process of differentiation, myogenin 

and MRF4 are activated, with MEF2C and together these transcription factors induce 

the  expression  of muscle  genes  encoding  the  contractile  and membrane  proteins 

[74]. Myf5 expression is ceased in differentiating myocytes, while MyoD, the “master 

regulator”, maintains expression in newly formed myocytes [286]. 


The MADS domain  family of  transcription  factors,  (myocyte enhancer 

factor‐2, MEF2), are encoded by four genes, MEF2A‐D. They function in cooperation 

with MRFs  to modify  their actions  in driving muscle and  fiber  type  specific genes, 

including those encoding contractile proteins [179, 189, 229]. 


Page 26: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

26 |

Both MRFs and the MEF2 family are phosphoproteins, and their activity 

and  association  with  each  other  and  several  co‐factors  are  regulated  by  protein 

kinase driven phosphorylation state  [75, 179]. Combinatorial associations of MRFs, 

the  MEF2‐family,  and  several  co‐factors  (growth  factors)  drive  the  temporally 

controlled and coordinated transcription of muscle genes [202]. 


In  skeletal  myogenesis,  the  myoblasts  proliferate  and  fuse  to  form 

primary myotubes. Post‐mitotic myoblasts  then  continue  to  fuse with  the primary 

myotubes,  giving  rise  to  secondary  myotubes.  These  elongated,  multinucleated 

cyncytia then mature  into muscle fibers, also called myocytes. The process  involves 

dramatic changes in the organization of the cell membrane and the filament system, 

as  well  as  development  of  the  highly  specified  contractile  apparatus, 

myofibrillogenesis. [259] 


4.3.3. The satellite cells 


Once fused, the myonuclei lose their ability to proliferate. Much of the 

adult  muscle  regeneration  capacity  relies  on  satellite  cells,  which  are  quiescent 

progenitor cells  located between the sarcolemma and the basal  lamina of a muscle 

fiber  [100,  178].  A  second  pool  of  interstitial  stem  cells,  displaying  broader 

differentiation capacity also exists in muscle [31]. When regeneration is required, for 

example  after.  injury  or  overuse,  the  satellite  cells  are  activated  to  proliferate.  A 

subset of the newly  formed myoblasts  fuse  into the existing myocytes, while some 

remain  in  the  satellite  cell  position  for  later  use. Despite  this,  the  number  of  the 

satellite cells usually declines with age [252]. Quiescent satellite cells can be revealed 

by their morphology and position, especially with electron microscopy.  In addition, 

they express a number of protein markers, which can be used for their identification 

using  immunohistochemistry; however,  few have proven  to be  specific  to  satellite 

cells, such as the paired‐box transcription factor Pax7 [241, 269, 327]. 

Page 27: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 27

4.3.4. Fiber types 


Skeletal  muscle  fibers  display  different  biochemical  and  physiological  profiles, 

depending on  the  intrinsic properties of  the  specific muscle, developmental  stage, 

age, exercise, and disease. See Table 1  for a  summary of  the  skeletal muscle  fiber 

types. Slow and fast fibers differ in performance, reflecting differential expression of 

enzymes  involved  in energy metabolism. Slow‐twitch  type 1  fibers, and  fast‐twitch 

type 2A fibers use oxidative phosphorylation for generating ATP, and are suited for 

endurance,  whereas  the  ultra‐fast  type  2B  fibers  rely  mostly  on  glycolytic 

metabolism, displaying fast maximal performance, but are subject to fatigue. Type I 

fibers  are  rich  in myoglobin, which  gives  them  the  typical  red  color, whereas  fast 

type fibers are referred to as white muscle fibers (in the absence of myoglobin). [71, 



Table 1. Adult muscle fiber types in human. 

Fiber type (by ATPase method)

1 (slow)

2A (fast)

2B (ultra fast)

2C (mixed)

Not separated

Energy metabolism aerobic aerobic glycolytic aerobic mixed

MyHC isoform I (beta/slow) IIa IIx hybrids of I/IIa hybrids of





The classification of fiber type is most often based on the properties of 

the  ATPase  domain  of  the  myosin  heavy  chain  (MyHC)  molecule.  Enzyme 

histochemical  ATPase  assay,  based  on  the  differential  pH  sensitivity  of  the MyHC 

ATPases,  has  been  used  for  decades  as  the  routine  method  for  fiber  type 

differentiation [71, 248]. However, the  immunohistochemical detection of different 

MyHC isoforms has proved to be as qualified, or, in some cases, even more efficient 

tool  in  fiber  type  differentiation  (Figure  3)  [233].  The  classical  division  into  fast 

glycolytic and slow oxidative fibers can be further subdivided into several categories. 

The  three most  common  fiber  types  in normal human  skeletal muscles are  type 1 

fibers  expressing  MyHC‐beta/slow  (encoded  by  MYH7  gene),  type  2A  fibers 

expressing MyHC‐IIa (MYH2) and type 2B fibers expressing MyHC‐IIx (MYH1). It may 

Page 28: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

28 |

be confusing that the human skeletal muscle fibers do not express MyHC isoform IIb, 

despite  the  fiber  type  is  designated  as  2B.  The  isoform  IIb,  encoded  by MYH4,  is 

expressed  in 2B  fibers of  small mammals,  such as mouse,  rat and  rabbit.  In heart 

muscle,  MyHC‐beta/slow,  MyHC‐alpha  (MYH6)  and  MyHC‐7B  (MYH7B)  are 

expressed, the  latter two being absent  in skeletal muscles. Hybrid fibers expressing 

two  or more MyHC  isoforms  are  common  in myopathies,  sometimes  presenting 

typical  patterns  of  fiber  type  transitions.  Hybrid  fibers  co‐expressing  MyHC‐

beta/slow  and  IIa  are  designated  as  type  2C  fibers  by  ATPase  staining  [71]. 

Expression  of  atypical  MyHC  isoforms  is  sometimes  encountered  in  injured  or 

dystrophic  muscle.  Reprogrammed  atrophic  or  regenerating  fibers  frequently 

express perinatal/neonatal MyHC‐pn  (MYH8), whilst  regenerating,  severely  injured 

fibers  in  dystrophic  muscles  typically  show  expression  of  MyHC‐emb  (MYH3). 

Additional MyHC  isoforms exist, showing very  restricted muscle‐specific expression 

patterns  [249]  (summarized  in  Table  2.  of  original  publication  III).  Most  human 

muscles are  composed of a variably mixed population of  slow and  fast  fibers. The 

proportions correlate with the function of a given muscle. 

 Fiber type distributions in disease 


Basophilic  fibers, which  appear bluish  in H&E  stain due  to high  sarcoplasmic RNA 

content,  are  usually  considered  regenerating  fibers.  They  often  show  swollen  or 

“vesicular”  nuclei,  and may  coexpress  beta/slow  and  IIa myosins,  in  addition  to 

perinatal/neonatal MyHC‐pn [71]. 

Figure 3. Immunohistochemical fiber typing using double staining. 2A fibers appear red; 2B fibers blue; 1 fibers brown; and hybrid fibers expressing myosins IIa and IIx appear pink. (Picture kindly provided by Olayinka Raheem, University of Tampere.) 

Page 29: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 29

Nuclear  clumps  are  characterized  as  atrophic  fibers  with  clustered 

nuclei and with a very scarce amount of sarcoplasm left. Although present in chronic 

dystrophies, including limb‐girdle muscular dystrophies (LGMD), they are considered 

a hallmark of prolonged neurogenic atrophy [71].  


Variation in fiber size is one of the most common myopathic findings. In 

most  cases,  a  random pattern of  atrophy  and hypertrophy  is  seen,  affecting both 

fiber types equally. Grouping of atrophic fibers is typical of neurogenic pathology, as 

a  result  of  reinnervation  of  the  denervated  fibers with  sprouts  of  a  fast  or  slow 

motor  nerve.  Selective  fiber  type  1  atrophy  is  encountered  in  DM1  [106]  and 

congenital myopathies,  termed  congenital  fiber  type disportion  [71]. On  the other 

hand,  fiber type 2 atrophy  is usually considered a non‐specific  finding, occurring  in 

variable myopathic conditions. Known causes of fast fiber atrophy are muscle disuse 

and corticosteroid therapy [71]. In most cases, either both fast fiber subtypes 2A and 

2B  are  affected,  or  predominantly  2B  fibers.  There  is  one  exception,  a  recently 

described human disease with mild generalized muscle weakness, where a total loss 

of type 2A fibers was discovered, due to compound heterozygous mutations  in the 

MYH2  gene  [281].  Fiber  type  1  predominance  may  be  a  common  feature  in 

congenital myopathies, whereas  fiber  type  2  predominance  is  sometimes  seen  in 

motor neuron diseases [71]. 


4.3.5. The skeletal muscle fiber 


Skeletal muscle cells, or myocytes, are enveloped by the sarcolemma, composed of 

the plasma membrane and the basal lamina [83]. The multiple, elongated nuclei are 

scattered along the  fiber  length,  located  just beneath the sarcolemma. The muscle 

fiber has a highly specialized inner structure, dominated by the contractile units, the 

sarcomeres,  forming  the  myofibrils.  The  cytoplasm,  or  sarcoplasm,  contains  an 

elaborate membrane system, including the extensive sarcoplamic reticulum (SR), and 

invaginations of  the  (electrically excitable) plasma membrane,  the  transverse  (T)  ‐

tubular system (Figure 4). At the junction site between the sarcomeric thick filament 

A‐band and  thin  filament  I‐band  (I/Ajunction)  the SR  forms membranous  sacks, or 

Page 30: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

30 |

terminal cisternae, which  juxtapose  to a T‐tubule  [82]. This  triad structure,  formed 

by  two  terminal  cisternae  flanking  one  T‐tubule,  allows  the  rapid  progression  of 

depolarization  in  the  SR,  initiating Ca2+  release needed  for  the muscle  contraction 

(see  below). Mitochondria  are  present  in  large  numbers  between  the myofibrils, 

near the  I‐bands, together with granules of glycogen. The sarcoplasm also contains 

ribosomes,  both  subsarcolemmal/perinuclear  and  between myofibrils  [111];  lipid 

droplets;  the  Golgi  apparatus;  and  a  cytoskeleton  of  microtubules,  intermediate 

filaments (such as desmin, syncoilin, desmuslin and actin) [32, 131]. 





Figure 4. Schematic picture of the excitable membrane system. The triad structure is constituted  of  a  T‐tubule  surrounded  by  terminal  cisternae  of  the  sarcoplasmic reticulum, at  the  level of sarcomeric A/I  junction. M = M‐line.  (Drawing  taken  from Unit 2, Medical Curriculum, McGIll University, CA, with permission of C. R. Morales. The drawing was originally conceived by Y. Clermont and subsequently modified by Molson Medical.)  


The  dystrophin‐associated  glycoprotein  (DAG)  complex  on  the 

sarcolemma  provides  a  structural  link  between  the  cytoskeleton  and  the 

extracellular  matrix,  and  stabilizes  the  sarcolemma  against  mechanical  stress.  In 

Page 31: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 31

addition,  the  complex  organizes  receptors  and  ion  channels  on  the  sarcolemma. 

Dystrophin  is  located on  the sarcoplasmic side, where  it anchors  the DAG complex 

via  β‐dystroglycan  to  F‐actin  and  sarcomeres  (Figure  5).  The  other  DAG  complex 

constituents  include  α‐  and  β‐dystroglycans  (DG),  the  membrane‐embedded 

sarcoglycans (α, β, γ, δ, and ε), sarcospan and the dystrobrevin‐syntrophins complex 

(Figure  5),  as  well  as  the  neuronal  nitric  oxide  synthase  (nNOS),  an  enzyme 

synthesizing the signaling molecule nitric oxide (NO) (not shown). 





Figure  5.  The DAG‐complex  on  the  sarcolemma,  and  its  linkage  to  the myofibrils. (Adapted  with  permission  from  “Histology  and  Cell  Biology:  an  introduction  to pathology” by A. Kierszenbaum, p. 208, Elsevier 2007.)  


The  costameres  of  the  sarcolemma  serve  as  anchoring  points  to  the 

sarcomeres  in  the  peripheral  myofibrils,  which  is  crucial  to  enable  coordinated 

contraction of adjacent myofibrils, and to avoid mechanical ruptures during muscle 

Page 32: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

32 |

contractions. Desmin  intermediate  filaments, cross‐linked  to each other by plectin, 

extend  from  costameres  to  myofibrils,  surrounding  them  at  the  level  of  Z‐discs 

(Figure  5). Other  costameric  constituents  include  at  least  vinculin,  talin,  spectrin, 

ankyrin,  synemin,  and  β1‐integrin  [49,  97].  The heat  shock protein  αB‐crystallin  is 

associated with desmin, protecting it from stress‐induced damage [131, 305]. 


4.3.6. The sarcomere 


The  sarcomere  forms  the  structural  basis  of  muscle  contraction.  Its  striated 

appearance is created by regularly aligned sarcomeres in a row, the myofibrils, with 

specific  regions  showing  differential  electron  densities  under  microscopic 

examination  (sarcomere  structure  is  outlined  in  Figure  6).  The  sarcomere  is 

composed of the thick filament A‐band, with dense M‐band  in the middle, and thin 

filament  I‐band, with a very electron dense Z‐disc  in  the middle  [71]. The M‐band 

shows  a  fine  structure  with  three  to  five  thin  lines,  composed  of  non‐myosin 

proteins. Fast fibers shows three lines (M1, M4 and M4´), slow fibers show four lines 

(M4, M4´, M6 and M6´), and intermediate fibers show all five lines [61]. One human 

skeletal muscle sarcomere extends from Z‐disc to Z‐disc, being 2.0 ‐ 3.0 µm in length 

at rest depending on the muscle. The A band has a fixed length of 1.5 – 1.6 µm, while 

the  flexible  I  band  region  extends  during  muscle  contraction.  Large  muscles 

generating much  force  have  longer  sarcomeres  and  a  greater  ability  to  shorten 

during  contraction.  The  A‐band  is  composed  of  a  hexagonal  lattice  of  myosin 

filaments,  tertiary  aggregates  of  a  polar molecule  consisting  of  two  heavy  chains 

(MyHC)  and  two  light  chains  (MYL).  The myosin molecule has  two  globular heads 

with  neck  regions  continuing  into  one  coiled‐coil  rod  and  tail  region.  The MyHC 

globular head has an ATPase domain and it binds actin, the major constituent of the 

thin filament. Myosin molecules are aligned in the thick filament in the way that the 

rod and tail domains interact tail‐to‐tail in the M‐band, and the globular heads point 

to opposite directions,  forming  the dense A‐band  [61]. The H‐zone, para‐central of 

the M‐band,  is devoid of myosin heavy  chain heads, and  is  rich  in  creatine kinase 

(CK)  enzyme,  necessary  to  maintain  steady  levels  of  ATP  during  contraction:  it 

hydrolyses  creatine  phosphate  to  generate  ATP  where  it  is  needed  near  the 

Page 33: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 33

myofibrillar  ATPase.  Elevated  serum  CK  levels  can  be  used  as marker  for muscle 

damage  and  various  myopathies,  caused  by  leaky  sarcolemma  of  the  damaged 

myocytes [71]. 


The thin  filament  is mainly composed of  filamentous actin,  formed by 

globular G‐actin  subunits, which attach head‐to‐tail  forming a polar double helical 

structure, with pointed (minus) ends and barbed (plus) ends, the latter inserting into 

the  Z‐disc.  The  grooves  of  the  helix  accommodate  the  troponin‐tropomyosin 

complex, troponins T, I and C, the latter of which binds Ca2+. [61] 






Figure 6. (Top) schematic presentation of the major structural components of the sarcomere. (Bottom) electron micrograph of the corresponding ultrastructure, showing mitochondria between the myofibrils. (Reproduced from Ottenheijm et al. Respiratory Research 2008 [214] with permission of BioMed Central.)  

Page 34: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

34 |

In addition  to  serving as an anchoring point  to actin  filaments,  the Z‐

disc  binds  several  proteins  via  another  major  constituent,  alpha‐actinin  (ACTN). 

ACTN binds, among others, telethonin/T‐cap, myotilin, myozenin, γ‐filamin, vinculin, 

the Z‐disc alternatively spliced PDZ‐containing protein  (ZASP) and obscurin  [14, 61, 



Other important sarcomeric proteins include the third filament system 

constituent  titin,  and  nebulin  being  part  of  the  thin  filament  in  skeletal muscles 

[218].  A  single  titin molecule  extends  from  the  Z‐disc  to M‐line,  and  serves  as  a 

molecular  ruler  for  sarcomeric  assembly,  contributes  to  passive  tension  during 

stretching, and functions as a signaling molecule through  its multiple  ligand binding 

sites, including calpain3, and a kinase domain near the C‐terminus in the M‐line [147, 



4.3.7. Muscle contraction 


The excitation‐contraction cycle refers to the chain of events where the sarcolemma 

depolarization  leads to mechanical activation of the myofibrils to contract [22]. It  is 

initiated when a motor neuron action potential reaches the neuromuscular junction. 

The  presynaptic  button  contains  vesicles  filled  with  the  neurotransmitter 

acetylcholine (ACh), which is released to the primary synaptic cleft in response to an 

action  potential.  ACh  binds  to  specific  receptors  in  the  postsynaptic membrane, 

which in turn undergo a conformational change forming a channel for net Na+ influx. 

As a result of this  local depolarization, the major sodium channels open,  leading to 

rapid  depolarization  in  the  T‐tubule  system,  which  activates  the  L‐type  voltage 

sensitive  Ca2+  channel  dihydropyridine  receptor  (DHPR)  once  the  depolarization 

reaches  the  terminal cisternae of  the T‐tubules  [22]. Consequently, via mechanical 

coupling, activated DHPR induces a conformational change in the ryanodine receptor 

(RYR) located in the adjacent SR membrane (of the triad) [231]. In turn, the activated 

RYR  rapidly  releases  Ca2+  from  the  intra‐SR  stores  to  the  sarcoplasm,  where  it 

diffuses  to  the  sarcomeres  and  binds  troponin  C,  and  starts  the  final  part  of  EC‐

coupling, the myofibrillar contraction [247]. 

Page 35: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 35



Figure 7. Muscle contraction.  (A) The sarcomeric  I band shortens as the thin  (actin) filaments slide past the thick (myosin) filaments during muscle contraction. (B) ATP‐driven conformational change  in the myosin head forces the actin filament to move towards  the  “center”  of  the  sarcomere.  (The  figure  was  produced  using  Servier Medical Art at  


Binding of Ca2+ induces a conformational change in troponin C, which in 

turn allosterically regulates the troponin‐tropomyosin complex, resulting in exposure 

of  the myosin‐binding  site on  the  actin  filament. When  the  transient  cross bridge 

between actin and myosin is formed, the myosin ATPase hydrolyses ATP to induce a 

conformational change of the globular head, which mechanistically pushes the actin 

filament forward approximately 10 nm at each stroke. As a result of several cycles, 

the myosin and actin filaments slide past each other, resulting  in shortening of the 

sarcomeric I‐band and hence, myofibrillar contraction (Figure 7). Withdrawal of Ca2+ 

from the sarcoplasm ceases the muscle contraction. [247] 


4.3.8. Role of Ca2+ in muscle contraction 


The  calcium  ion  is  the  main  mediator  of  muscle  contraction.  Regulation  of  its 

concentration  and distribution  is  crucial  to proper physiological  functioning of  the 

muscle.  The major  Ca2+  regulating  proteins  in  skeletal muscle  include  RYR1  and 

DHPR, forming the voltage‐sensitive Ca2+ release complex, the Ca2+ reuptake SERCA 

ATPases  in  the SR membrane and  the Ca2+  storage protein calsequestrin  in  the SR 

lumen [247]. 


Page 36: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

36 | The ryanodine receptors 


Three genes encode the sarcoplamic reticulum (SR) Ca2+ release channel ryanodine 

receptor, showing tissue‐specific pattern of expression. RYR1 is the major isoform in 

skeletal muscle, whereas RYR2 is mainly expressed in cardiac muscle and brain, and 

RYR3  is  a minor  isoform  in  brain  [91]. Moreover,  RYR1  expression  undergoes  a 

developmental switch from a fetal isoform, lacking exons 70 and 83 [ASI(‐) and ASII(‐

)],  to  an  adult  isoform  containing both exons postnatally  [91, 225].  In DM1, RYR1 

exon 70 is aberrantly spliced, resulting in the ASI(‐) isoform [134]. The ASI domain is 

part of  the RYR1  inhibitory domain  [132]. Functional  studies using myotubes have 

indicated  that  the  adult  ASI(+)  isoform  shows  reduced  RYR1  channel  activity  in 

comparison  to  the  fetal  isoform  [134].  In  parallel with  this,  the  expression  of  the 

fetal  ASI(‐)  isoform  increased  open  probability,  and  resulted  in  enhanced  E‐C 

coupling  [133]. Mutations  in RYR1  cause malignant hyperthermia and  central  core 

disease [163]. The SERCA family of Ca2+ re‐uptake channels 


The  sarcoplasmic/endoplasmic  reticulum  Ca2+  reuptake  pump  SERCA  family 

members  are  also encoded by  three homologous  genes, which  go  through  tissue‐

dependent and developmentally regulated alternative splicing in their 3´ termini [44, 

166]. SERCA1  isoform SERCA1a  (ATP2A1A), which  includes the differentially spliced 

exon 22, is mainly expressed in adult fast fibers. In immature muscle and myotubes, 

the  embryonic  SERCA1b  isoform  predominates,  lacking  exon  22  [39,  40].  The 

functional difference between the developmental and adult isoforms is not currently 

known.  SERCA2a  (ATP2A2A) predominates  in adult  slow muscle  fibers and  cardiac 

muscle [330]. 


SERCA1  activity  is  inhibited  by  a  small  regulatory  protein,  sarcolipin, 

presumably  by  decreasing  its  affinity  for  Ca2+  [205].  Similarly,  phospholamban 

modulates SERCA2 activity [275]. 

Page 37: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 37

Mutations  in  SERCA1  are  the  cause  of  Brody  disease,  which  presents  impaired 

muscle relaxation [128, 206]. The triad and calsequestrin 


Efficient E‐C coupling requires stable and functional triad structures. Triadin (TRDN) 

is  an  integral  junctional  SR membrane  protein  and  a  central  structural  protein  in 

triads,  as  is  junctin  [23].  Associated  junctophilin  (JPH1)  facilitates  the  interaction 

between DHPR and RYR [93]. 


Calsequestrin  (CASQ)  is  the major Ca2+ binding protein  in  the muscle 

sarcoplasmic reticulum (SR), with high capacity and low affinity for the Ca2+ ion [24]. 

CASQ  in  striated muscle  is  encoded  by  two  different  genes.  CASQ1  encodes  the 

skeletal/fast isoform expressed in both fast and slow fibers, whereas CASQ2 encodes 

the cardiac/slow form, which is the minor isoform in skeletal slow fibers [29, 62]. 


  CASQ has binding sites for TRDN, junctin and RYR, and it recruits Ca2+ to 

the  junctional membrane,  in  the vicinity of RYR, keeping  the  free  [Ca2+]  low  in SR. 

Also  TRDN  binds  to  calsequestrin  with  its  highly  charged  lumenal  domain  [137]. 

Instead of serving as a passive Ca2+ storage protein, CASQ modifies the  function of 

RYR  in  concert with  TRDN  and  junctin,  in  a  [Ca2+]  dependent manner  [23,  318]. 

CASQ1 has an inhibitory effect on RYR1 under physiological conditions ([Ca2+] 1mM). 

When  luminal  Ca2+  increases,  CASQ1  forms  a  supercompacted  polymer,  losing  its 

interaction with  triadin  and  junctin. There  is evidence  indicating  that  the  fast  and 

slow isoforms of CASQ regulate RYR isoforms in different ways in heart and skeletal 

muscles. Similarly, CASQ1 and CASQ2 may well have distinct effects on RYR1 in fast‐

twitch and slow‐twitch muscles [216, 317]. 


4.3.9. Role of Ca2+ in muscle signaling 


In  addition  to  regulating muscle  contraction,  Ca2+  is  also  an  important  signaling 

molecule [26, 222]. Many myogenic transcription factors,  including the members of 

Page 38: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

38 |

the MEF2 and nuclear factor of activated T‐cell (NFAT) families, respond to multiple 

Ca2+‐regulated signals [47, 179]. 


In  addition  to  regulating  muscle  development,  the  MEF2  family  of 

transcription  factors has  important  roles  in adult muscle. MEF2C promotes a  slow 

fiber phenotype, and also has a crucial  role  in maintaining  sarcomeric  integrity, as 

the expression of several muscle structural genes  is dependent on  it  [229]. MEF2A 

has been shown to promote a fast fiber phenotype, by increasing the activity of the 

MYH2  (MyHC‐IIa) promoter  [2];  in addition, MEF2A may  increase the expression of 

neonatal myosin (MyHC‐pn) [240]. 


Fiber  type  plasticity  in  adult muscle  is mainly  affected  by  contractile 

activity  and  nerve  stimuli.  The  amplitude  and  duration  of  the  [Ca2+]  transients 

determine which  fiber  type specific  transcriptional programs are activated. Several 

mechanisms  mediate  this  activation,  including  the  calcineurin  (Ca2+/calmodulin‐

dependent  protein  Ser/Thr  phosphatase)  and  CaMK  (Ca2+/calmodulin‐dependent 

kinases) signaling pathways [196]. 


The major  downstream  effectors  of  calcineurin  are members  of  the 

NFAT family of transcription factors [47]. Dephosphorylation of NFATs by calcineurin 

induces  their  activation  and  nuclear  translocation.  Calcineurin  has  been  strongly 

implicated  in establishing and maintaining the slow fiber phenotype [47, 196, 272], 

but may also mediate fast fiber‐specific transformations [2]. Different combinations 

of activated NFAT family members are capable of inducing distinct MYH genes [47]. 

In addition, calcineurin  is a modulator of skeletal muscle hypertrophy of both slow 

and fast fibers [183]. 


The  resting  Ca2+  gradient  between  the  extracellular  space  and 

sarcoplasm is huge, 1000:1. Free Ca2+ is toxic to cells, and its strict regulation is very 

important. Elevated  cytoplasmic Ca2+  concentrations have been  shown  in  cultured 

DM1  myotubes  [117],  suggested  to  be  due  to  abnormal  Ca2+  influx  through 

(nifedipine‐sensitive)  L‐type  Ca2+  channels  under  resting  conditions.  Ca2+  is  also 

Page 39: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 39

believed  to  play  a  significant  role  in  dystrophinopathies  and  other  dystrophies 

caused by deficient DAG‐complex.  In  these disorders  loss of  sarcolemmal  integrity 

leads to  leaking of Ca2+  inside the cells, causing damage and eventually muscle cell 

necrosis [71]. 


4.3.10. The muscle biopsy 


In order  to prevent degradation, muscle biopsies are  immediately  snap  frozen,  for 

example  in  liquid nitrogen‐cooled  isopentane, which results  in rapid freezing of the 

specimen without considerable formation of ice crystals. For histochemical staining, 

the tissue  is embedded  in supporting material  (“tissue glue”) prior to  freezing, and 

sectioned on slides using a cryostat microtome [71]. Frozen material is suitable for a 

variety of analyses,  including enzyme histochemistry,  immunohistochemistry  (IHC); 

in situ ‐hybridization (ISH); as well as RNA and protein extraction. 


For diagnostic purposes, a multitude of histochemical  staining can be 

performed. Only  the most common staining approaches are described here, which 

are usually the most informative in any given myopathy. Haematoxylin & eosin (HE) 

is the most widely used staining to reveal general tissue morphology. Haematoxylin 

stains the acidic (basofilic) molecules, such as the nucleic acids blue, also cytoplasm 

of  regenerating  fibers  (“basofilic  fibers”) appear blue due  to  large amount of RNA 

molecules. Eosin stains muscle  fibers and connective  tissue  red‐pink. The modified 

Gomori  trichrome  method  [77]  stains  the  mitochondria  red,  resulting  in  darker 

staining of the slow oxidative fibers, and reveals the presence of nemaline rods and 

rimmed  vacuoles, both  red  (Figure 8). The enzyme histochemical  stainings  for  the 

mitochondrial  oxidative  enzymes  Cytochrome  C‐oxidase  (COX)  and  succinate 

dehydrogenase  (SDH) are often combined, where COX‐negative  fibers appear blue, 

and the COX‐positive fibers brown. The reduced nicotinamide adenine dinucleotide 

dehydrogenase  –tetrazolium  reductase  (NADH‐TR)  staining  also  resolves  the 

localization  of  mitochondria,  the  sarcoplasmic  reticulum  (SR)  is  revealed,  and 

distortions in the myofibrillar structure are visible [71]. The ATPase method, which is 

based on  the different pH optimums of  the ATPase domains  in  the distinct myosin 

Page 40: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

40 |

heavy  chain  isoforms  [248],  has  served  as  the  standard  method  for  fiber  type 

differentiation  [71].  However,  immunohistochemical methods  offer  a more  rapid 

and  reliable  means  for  fiber  type  differentiation,  and  the  role  of  MyHC  IHC  is 

increasing in many laboratories [71, 233]. 





 4.4. The muscular dystrophies  


The muscular  dystrophies  (MDs)  are  a  heterogeneous  group  of  genetic  disorders 

caused by progressive loss of muscle cells, resulting in muscle weakness and wasting. 

They show considerable variation in clinical manifestation and severity [127]. 


Table 2 shows a simplified classification of the neuromuscular diseases. 

They  can  be  divided  into  1) myopathies,  which  are  the  primary  diseases  of  the 

muscle  fiber, 2) myasthenias, caused by defects of  the  the neuromuscular  junction 

and  3)  neurogenic  disorders,  caused  by  nerve  disease  or  injury.  The  disease 

etiologies in different MDs are divergent, although they all result in variable extents 

of death of the muscle cells. An  interesting general feature particular to the MDs  is 

that  usually  the  involvement  of  different  skeletal  muscles  is  selective,  and  the 

pattern is rather typical of the specific disease. This is important because it indicates 

that  some muscles  are  able  to  escape  the  effects  of  the mutation,  reflecting  the 

biochemical and molecular diversity of the different muscles. [127] 

Figure 8. Gomori trichrome staining showing granular degenerative changes corresponding to minirods (arrows) in atrophic muscle fibers of a patient with progressive muscular dystrophy of unknown cause. 

Page 41: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 41

  Cardiomyopathies affect primarily  the heart muscle. However, certain 

skeletal  muscular  dystrophies,  such  as  dystrophinopathies,  are  sometimes 

accompanied  with  cardiomyopathy.  In  myotonic  dystrophies  cardiac  arrhythmias 

and  conduction defects  are encountered  to  variable extent, being more  severe  in 



The myotonic dystrophies, the object of this research, are major forms 

of muscular dystrophy. Myotonia means delayed muscle  relaxation after voluntary 

contraction,  which  typically  manifests  as  painless  muscle  stiffness.  The  major 

primary  myotonic  disorders  include  the  nondystrophic  skeletal  muscle 

channelopathies and the myotonic dystrophies DM1 and DM2. The channelopathies 

are caused in most cases by mutations in the chloride channel (CLCN1; e.g. myotonia 

congenita)  or  the  sodium  channel  (SCN4A;  paramyotonia  congenita,  periodic 

paralysis) encoding genes [250]. The myotonic dystrophies are classified as muscular 

dystrophies, even though they differ from the other myotonic disorders by showing 

unique variability in clinical presentation, and multisystemic involvement. 


The prevalence of the neuromuscular disorders altogether in Finland is 

estimated  to  be  200/105,  comprising more  than  10,000  patients  [299].  The most 

common genetic myopathies  in Finland are  the  tibial muscular dystrophy  (TMD), a 

distal myopathy which belongs  to  the Finnish disease heritage  (approximately 500 

confirmed, symptomatic patients, plus an equal number of still undiagnosed patients 

are estimated), and the myotonic dystrophies DM1 and DM2  (see chapter 



4.4.1. Repeat expansions and disease 


The myotonic dystrophies belong to the group of microsatellite repeat 

expansions, which  are  the  cause of  almost 20 neurological diseases,  including  the 

first identified Fragile X syndrome [86] and Kennedy´s diasease (or spinal and bulbar 

muscular  atrophy,  SBMA)  [146],  Huntington´s  disease,  oculopharyngeal myotonic 

dystrophy, and a variety of spinocerebellar ataxias (SCA) [42, 211]. 

Page 42: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

42 |

Table 2. Classification of neuromuscular diseases. 

Myopathies Gene(s) Muscular dystrophies Myotonic dystrophy type 1 DMPK Myotonic dystrophy type 2 ZNF9 Duchenne muscular dystrophy (DMD) DMD Becker muscular dystrophy (BMD) DMD Limb-girdle muscular dystrophies (LGMD) > 20 genes Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) D4Z4

deletion in 4q35

Emery-Dreifuss muscular dystrophies (EDMDs) EMD, LMNA, SYNE1/2

Distal myopathies several E.g. Tibial muscular dystrophy (TMD) TTN Congenital muscular dystrophies (CMD) several Oculopharyngeal muscular dystrophies (OPM,


Ion channelopathies Chloride channelopathies CLCN1 Sodium channelopathies SCN4A Inflammatory myopathies Mitochondrial myopathies Congenital myopathies several Metabolic myopathies Secondary myopathies (endocrinologic, toxic and amyloid myopathies) Myasthenias Myasthenia gravis Autoimmune diseases of the NMJ Congenital myasthenic syndromes Genes encoding synaptic proteins several Neurogenic disorders

Motoneuron diseases Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) FALS genes Spinal muscular atrophy (SMA), recessive SMN1 SMA with severe respiratory distress (SMARD) IGHMBP2 Spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) AR Charcot-Marie-Tooth-disease > 35 genes Amyloid neuropathies TTR, GNS Inflammatory and toxic neuropathies  

Page 43: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 43

The majority of the mutations consist of repetitive trinucleotide sequences, the only 

exceptions being DM2 with  a  (CCTG)n  tetranucleotide,  and  SCA10 with  a  (ATTCT)n 

pentanucleotide  repeat  expansion.  Different  pathomechanisms  underlie  these 

diaseases; depending on several cis‐ and trans‐acting factors, they may cause protein 

loss‐of‐function  (e.g.  Fragile  X  syndrome),  protein  gain‐of‐function  (e.g. Kennedy´s 

disease), or an RNA‐gain‐of‐function, which  is the case  in the myotonic dystrophies 

DM1 and DM2, Fragile X‐associated  tremor ataxia  syndrome  (FXTAS), and possibly 

also  in SCA8, SCA10 and SCA12.  In  these  latter conditions,  the mutation  resides  in 

noncoding areas, which are transcribed into pre‐mRNA but not translated. 


4.4.2. The myotonic dystrophies DM1 and DM2 History and prevalence 


Myotonic dystrophies type 1  (DM1) and type 2  (DM2) comprise the most common 

form of muscular dystrophy affecting adults. They are dominantly inherited diseases 

caused  by microsatellite  repeat  expansions, with  clinical  and molecular  parallels. 

DM1 was first described more than 100 years ago and its prevalence (12/105) is fairly 

stable  in  European  and  North  American  populations  [10,  106],  even  though 

considerable  regional  variation  occurs,  probably  due  to  a  founder  effect  [329].  In 

accordance with this, there are approximately 600 patients with symptomatic DM1 

in Finland. 


Before the DM2 mutation was  identified, families with DM but  lacking 

the DM1 mutation were reported under different denominations: proximal myotonic 

myopathy (PROMM) was first used by Ricker and colleagues [242, 243], followed by 

several  reports  on  European  and  North  American  families  with  similar  clinical 

features  [115,  180,  195,  257,  260,  277].  A  family  in  Finland  was  reported  with 

proximal myotonic dystrophy (PDM), presenting with more severe proximal muscle 

wasting,  but  less myotonic  features  [300].  In  1998,  a  large Minnesota  family was 

described  as  having myotonic  dystrophy  type  2  (DM2),  with  proximal  and  distal 

Page 44: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

44 |

(hand) muscle weakness, when the disease was mapped to chromosome 3q21 [65, 

239]. The DM2 mutation was subsequently found in 2001 [158]. 


In contrast to DM1, DM2 prevalence  is not well established, due to  its 

later  identification,  late age of onset, milder  clinical picture, and huge variation  in 

severity  and  symptoms  [15,  301,  302].  Similar  to  DM1,  DM2  occurs  mostly  in 

populations of European descent [18, 157, 302], although a single Japanese patient 

has been described with a distinct haplotype [251]. The minimum prevalence of DM2 

was estimated to be 1/105 in European population [301], but it has since been shown 

to be much higher. In central Finland, a prevalence of 16/105 has been established by 

clinical  ascertainment  (Udd  et  al.  unpublished  results),  and  a  recent  study  in  the 

Finnish population determines the frequency of the DM2 mutation at a surprisingly 

high level of 53/105 in the general population (Suominen et al. unpublished results). 

To date, DM2 has not been reported in sub‐Saharan populations. 


  Despite  vast  clinical  variability,  the  myotonic  dystrophies  show  less 

genetic heterogeneity  than was earlier  considered. Most  families  first  reported  to 

lack DM2  locus  linkage were subsequently shown to have  the DM2 mutation  [142, 

322]  and  one  candidate  family  with  frontotemporal  dementia  reported  for  a 

potential DM3 locus on chromosome 15 was later found with a VCP mutation [152]. DM1 and DM2 mutations 


The  DM1  mutation  was  identified  in  1992  as  an  expanded  trinucleotide  (CTG)n 

repeat track in the 3´ untranslated (UTR) region of the dystrophia myotonica protein 

kinase  coding  gene  (DMPK;  OMIM  *605377)  [41,  85,  167].  In  DM1  patients  the 

repeat  sizes  range  from 50 – 4,000  (150 – 12,000 bp), whereas normal  individuals 

have 5 – 37 repeats. Repeat  lengths of 38 – 49 are considered a premutation allele 

pool,  showing decreased  stability  [9,  266].  The DM1 mutation  length predicts  the 

clinical  outcome  to  some  extent:  classical  DM1  100  –  1,000  repeats;  congenital 

>2,000 repeats [9, 266]. 


Page 45: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 45

The mutation causing DM2 was  identified  in 2001  in the first  intron of 

the  zinc  finger  9  (ZNF9)  protein  coding  gene  (ZNF9;  OMIM  *116955)  [158].  The 

mutation turned out to be an uninterrupted repeat expansion of the tetranucleotide 

(CCTG)n,  which  is  part  of  the  complex  polymorphic  repeat  motif 

(TG)n(TCTG)n(CCTG)n(NCTG)n(CCTG)n  [18, 158]. The normal alleles  contain  less  than 

30  copies  of  the  (CCTG)  repeat  [158], while  the  range  of  expansion  sizes  in DM2 

patients is huge; the smallest reported mutations vary between (CCTG)55‐75 [17, 158], 

and  the  largest  expansions  have  been measured  to  be  approximately  (CCTG)11,000 

[158]. The mean repeat length is approximately 5,000, however, 10,000 repeats are 

commonly  encountered  [17,  157].  The  uninterrupted  (CCTG)n  repeat  tract  is  less 

stable  than  the normal  interrupted  form,  and  losing  the  interrupting  sequences  is 

thought to predispose to the mutation. Because of the extreme somatic  instability, 

the  threshold  size of  the disease‐causing mutation  is under debate, however,  it  is 

likely  to  be  between  repeat  sizes  (CCTG)30‐75.  Bachinski  et  al.  have  reported  large 

uninterrupted  alleles  (CCTG)22‐33  in  European  population,  which  show  elevated 

instability, strongly suggesting that they represent the DM2 premutation allele pool, 

with  crude  estimation  of  premutation  allele  frequency  between  0.1  –  0.6  [17]. 

Interestingly,  large  uninterrupted  (premutation)  alleles,  showing  increased 

instability, are more frequent in African Americans of sub‐Saharan origin [17]. 


Both  DM1  and  DM2 mutations  consist  of  long  uninterrupted  repeat 

tracks, which are thermodynamically less stable than normal alleles, showing a more 

complex pattern with  interrupting sequences. The  tendency of a “dynamic” repeat 

tract  to  contract  or  expand  during  replication  depends  on  the  primary  sequence, 

which  determines  its  capacity  to  form  secondary  hairpin  structures,  the  distance 

from  the  replication origin,  the  flanking  sequences, and  the genomic  location  [42, 

273]. Only the TG‐element contributes to hypervariability in interrupted alleles [17]. 

In other words, only uninterrupted alleles showed expansive variability in the (CCTG) 



Both DM1 and DM2 expansion mutations show mitotic instability, with 

variation  in  different  tissues  and  cell  types,  causing  somatic mosaicism  [151,  190, 

Page 46: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

46 |

303, 325]. The DM1 and DM2 mutations show a tendency to grow longer during the 

patient´s lifetime [158, 326]. However, there is a difference between the two DMs in 

intergenerational passage of the mutation: the DM1 mutation tends to get larger in 

successive  generations,  resulting  in  increased  severity  and  earlier  onset,  a 

phenomenon  known  as  anticipation  [11,  12,  13,  104,  151], whereas  in DM2,  the 

mutation  usually  contracts when  passed  to  the  next  generation,  being  shorter  in 

children [66]. This may explain some of the distinct features of DM2 phenotype, such 

as the missing congenital form of the disease, the later onset of symptoms, and the 

lack of anticipation [301], even though some  implications of anticipation have been 

postulated  in some  families  [143, 264]. There  is a gender bias  in the tendency of a 

repeat  tract  to  expand  or  contract  between  generations  in DM1,  as  the  (CTG)DM1 

repeat more often contracts after paternal transmission, and very  large expansions 

are usually encountered following maternal transmission. Interestingly, the mutation 

length does not seem to correlate with the age of onset and phenotypic severity for 

DM2 [18, 66, 158], in contrast to DM1 [102, 160]. However, it should be noted that 

somatic variation is extensive, and the measured mutation repeat lengths are usually 

derived from peripheral blood  leucocytes. The repeat  lengths  in target tissues such 

as muscle are shown to be much larger in DM1 [5, 288]. 


Fine  mapping  using  microsatellite  and  SNP  markers  showed 

conservation of a single common haplotype  in a widespread DM2 patient cohort of 

European descent. This data  indicates a  single  founder DM2 mutation dating back 

4,000 – 12,000 years ago (approximately 200 ‐ 540 generations) [18]. 


Primates (gorilla and chimpanzee) have slightly different repeat motifs 

in  intron 1  in ZNF9 still  including the CCTG motif, whereas rodents (mouse and rat) 

do not contain the CCTG repeat element at all [157, 158]. The normal function(s) of 

the  evolutionarily  conserved  noncoding  repeat  tract  in  the  DM2  locus  is  not 

currently known. 

Page 47: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 47 Symptoms 


Both DM1 and DM2 are progressive multisystemic disorders with both shared and 

distinct clinical features and pathomechanisms. The core symptoms that express to 

varying degrees  in DM2  include proximal muscle weakness, muscle pain, myotonia, 

posterior subcapsular  iridescent cataracts, tremors, cardiac conduction defects, and 

endocrinological  disturbances  such  as  increased  insulin  resistance  and  male 

hypogonadism. Laboratory findings  include elevated creatine kinase (CK), hypo  IgG, 

positive autoimmune serology and elevated liver enzyme γ‐glutamyl transferase [66, 

290,  301]. Many  of  the  clinical manifestations  are  similar  in  classical  adult  onset 

DM1,  although  with  clearly  distinct  features  including more  severe  weakness  of 

distal  and  facial muscles  (including  ptosis),  leading  to  dysphagia,  and  respiratory 

deficiency.  The  congenital  DM1  form  and  the  early  childhood  onset  form  with 

mental retardation are not observed  in DM2 [106, 298] (see Table 1.  in publication 

III, p. 467, for a summary of clinical features in DM1 and DM2.) However, the clinical 

phenotype  is widely variable  in both  forms, and even more so  in the case of DM2. 

DM2 may manifest with only a few symptoms, very late in the 7th or 8th decade and 

there are no mandatory features common to all patients. There is also wide variation 

in  symptoms  between  different DM2  families  and  among  individuals  in  the  same 

family  [194, 195, 243]. DM2 patients have normal  life expectancy and  they do not 

usually  need  help with  daily  activities,  until  after  age  60,  unless  they  suffer  from 

extensive pain. Musculoskeletal/myalgic pain may be the most disabling, or even the 

only symptom in DM2 [15, 95]. In addition, several less frequent symptoms, or those 

typical of a specific family, include excessive sweating and frontal balding [65], male 

hypogonadism  [300],  and myotonia  induced  by  pregnancy  [203].  Sudden  cardiac 

deaths are rare but may account for DM2‐associated mortality [267]. Recently, it was 

reported that DM2 patients suffer much more frequently from autoimmune diseases 

than  normal  population,  but  such  bias  was  not  associated  with  DM1  [290].  In 

contrast to DM1, no significant increase in complications associated with the use of 

anesthesia has been encountered in DM2 [135, 319]. 


Page 48: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

48 |

In magnetic resonance studies, brain white and grey matter changes, as 

well as  cerebral atrophy have been  reported  to be  similar but  less pronounced  in 

DM2  compared  to  DM1.  However,  these  structural  abnormalities  have  no  clear 

functional correlation, as severe cognitive impairment or extensive sleepiness is not 

encountered with DM2 patients, in contrast to DM1 [129, 140, 188, 306]. However, 

some  CNS  changes  including  avoidant  personality  trait  [181]  and  impairment  of 

nonverbal episodic memory, which was linked to specific cerebral structural changes 

[315] have been described also in DM2. Muscle histopathology 


Muscle  histopathologies  for  DM1  and  DM2  share  some  general  common  chronic 

myopathic  features,  such  as  the  high  number  of  central  nuclei  and  fiber  size 

variation, which were initially reported to be quite similar (Figure 9) [242, 287]. The 

muscle  pathology  is  progressive,  with  end‐stage  pathology  showing  severe 

reductions  in  fiber number and  size accompanied with  fatty and connective  tissue 

replacement in the most severely affected muscles [65, 106]. In DM1, ring fibers and 

sarcoplasmic  masses  are  more  frequent,  and  type  1  fibers  are  generally  more 

affected [106]. 


In general, muscle wasting in DM2 is less prominent, and in accordance 

with  this,  severe  muscle  fiber  loss  is  not  usually  encountered.  Muscle  biopsies 

typically  demonstrate mild  to moderate myopathic  changes,  in  addition  to more 

severe fatty replacement and fibrosis starting  in the  interfascicular space; observed 

only  in  proximal  muscles  of  older  patients  with  considerable  muscle  weakness 

(Figure  9D).  Small  angulated  fibers  and  atrophic  nuclear  clump  fibers,  similar  to 

those in neurogenic atrophy, are frequently found [66]. 

Page 49: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 49

No clear correlation has been observed between the pattern of muscle 

histopathological  findings  and  the  clinical muscle  phenotype;  including myotonia, 

cramps, weakness and myalgia, or  the order of onset of  symptoms  [268]. Electron 

microscopic  studies  have  not  revealed  any  specific  changes  [243],  even  the 

ribonuclear inclusions showed no distinct structure in EM [301]. 





Figure 9. Panel showing muscle histopathological findings in DM1 (A, B) and DM2 (C, D).  Cryosections  were  stained  with  Hematoxylin  &  Eosin.  Fiber  size  variation  is present in all specimens, as are nuclear clump fibers (black arrows), and internalized nuclei (white arrows). (A) DM1 VL muscle showing relatively mild pathology; (B) DM1 TA muscle  showing  severe  end  stage  pathology, with  prominent  fibrosis  (Fib)  and fatty degeneration (F). (C) DM2 VL muscle with early changes, including marked fiber size variation and abundant nuclear clumps.  (B), Blood vessels.  (D) DM2 VL muscle with  late pathology and muscle weakness, some  fatty  replacement  is seen  (F), and remnants of a necrotic fiber (N). Note marked hypertrophy of the spared fibers. 


Page 50: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

50 | Diagnostics 


The gold standard for DM1 and DM2 diagnostics  is mutation verification by genetic 

testing as  is  seen  for all genetic diseases with  identified mutations.  In  the  case of 

DM1,  the  symptoms  and  family  history  are  often  clear  and  distinctive  enough  to 

make a clinical diagnosis, and the mutation can be confirmed with direct PCR across 

the mutation locus (< 200 CTG‐repeats), or with Southern analysis for repeats larger 

than 100  repeats  [9, 41, 167]. However,  for DM2,  the  symptoms  show  such great 

variability  that  a  clinical  diagnosis  is  most  often  difficult  to  achieve.  Also  the 

molecular  diagnosis  is more  challenging  in  DM2  due  to  the  extremely  large  size 

(mean approximately 5,000 CCTG repeats) and extensive somatic instability [18, 66]. 

Standard molecular  genetic methods,  such  as  Southern  analysis  and  PCR,  are  not 

sufficient  for  definite  mutation  verification.  Hence,  developing  reliable  and 

standardized  genetic  tests  for  the  mutation  confirmation  was  challenging.  A 

recommended  three‐step  method  for  DM2  mutation  testing  [301]  can  achieve 

unequivocal  verification  of  the mutation:  (I)  A  conventional  PCR  assay  across  the 

mutation locus using probes binding to mutation flanking sequences can be used for 

mutation  exclusion.  In  all  DM2  patients,  a  single  PCR  product  representing  the 

normal  allele  can  be  identified  because  the  DNA  polymerase  fails  to  amplify  the 

mutant allele due to its length and stable secondary structures. Two differently sized 

normal alleles exclude DM2 [158]. Due to the fact that approximately 10 % of normal 

population carry, by chance, alleles of exactly similar lengths, this method produces 

a large number of false positives. (II) The sensitivity of a genomic Southern analysis is 

70‐80%,  resulting  in  high  rate  of  false  negatives  [66].  (III)  Repeat‐primed  PCR‐

methods (RP‐PCR), using an internal probe with hanging tail, offer a powerful tool for 

DM2  mutation  verification,  with  99%  accuracy  [66].  Several  alternative,  highly 

specific  and  sensitive methods have been developed  in  addition  to  the RP‐PCR. A 

modified Southern method using field‐inversion electrophoresis (FIGE) is particularly 

efficient  in  determining  the mutation  length,  in  addition  to  qualitative mutation 

verification [18];  likewise high sensitivity (reported 98%) for mutation  identification 

can be achieved using pulsed‐field gel electrophoresis [119]. Other novel Southern‐

based methods have been developed, for example utilizing HCl‐treatment of gels for 

Page 51: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 51

more  efficient  transfer  of mutant DNA  onto  a  blotting membrane  [51],  or  repeat 

expansion‐specific  locked  nucleic  acid  probes,  in  combination  with  rolling  circle 

amplification  of  short  expansions,  for  increased  detection  sensitivity  [199,  232]. 

Additional methods developed for the DM2 mutation verification include long‐range 

PCR, [34] and a tetraplet‐primed PCR [52]. 


The  combination  of  Southern  analysis  and  one  of  the  “third  step” 

methods  should  verify  the  DM2 mutation  unequivocally  [232].  Currently,  several 

European  laboratories use either modified Southern‐ or RP‐PCR‐based methods  for 

DM2 mutation  verification,  and  exchange  DNA  samples when  needed  for  quality 

control purposes [302]. 


Interestingly,  it  has  been  reported  that  currently  diagnosed  DM2 

patients  co‐segregate  a  heterozygous  recessive  CLCN1 mutation more  often  than 

control population  (5% versus 1.6%),  indicating a  selection bias  to DM2 molecular 

diagnostics with these patients [280]. No such bias was observed in DM1 patients. 


  In  the  reported  family  studies,  the penetration of DM2 mutation was 

100%  [15, 300]. However,  these  families were  selected  for  inclusion  in  the  linkage 

studies  and  represent  the most  prominent  clinical manifestations  of  DM2.  Later 

experience has  shown  that  in many  families with very  late onset  symptoms  in  the 

probands,  the  very  old  parents  have  not  necessarily  been  identified  to  have 

neuromuscular or other symptoms related to DM2. When asked for symptoms in the 

family  the  response  will  thus  frequently  be  negative,  even  if  later  work‐up may 

identify some proximal muscle weakness or cataracts difficult to separate from aging 

(Udd et al., unpublished results). Pathomechanisms  

The  main  molecular  pathomechanism  underlying  the  myotonic  dystrophies  is 

dominant RNA gain‐of‐function [64, 153, 158, 173]. The expansion mutation, (CCTG)n 

in DM2 and  (CTG)n  in DM1,  is  transcribed but not  translated, and  the mutant RNA 

Page 52: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

52 |

itself  is necessary and  sufficient  to  induce  the molecular events  leading  to  clinical 

symptoms. The mutant repeat RNA species are retained  in the nucleus, where they 

aggregate  and  sequester RNA‐binding  proteins,  forming  the  ribonuclear  inclusions 

typical of DM1 and DM2  [158, 283]. According  to  the present body of knowledge, 

the mutant RNA exerts  its  toxic effect by disturbing  the distribution and  function, 

and  hence  the  equilibrium  between  the  two  antagonistic  splicing  factors, MBNL1 

(muscleblind‐like  1)  and  CUGBP1  (CUG‐binding  protein  1),  resulting  in  aberrant 

mRNA  splicing  and  translation  [153].  According  to  recent  reports,  there  are 

additional, MBNL/CUGBP1‐independent  pathomechanisms,  involving  dysregulation 

of splicing, transcription, translation, and protein turnover [114, 124, 254, 296, 308]. 

The key pathomechanisms in DM are summarized in Figure 10. 



Figure 10. Key pathomechanisms in myotonic dystrophies. 


Page 53: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 53

MBNL  and  CUGBP1  both  act  as  splicing  regulators,  often  promoting 

opposite splicing events in their mutual target genes, although their binding sites are 

distinct [110, 124]. Both regulate multiple alternative splicing events. The important 

downstream effect of the dysregulation of these two antagonistic splicing factors  is 

the aberrant splicing  in myotonic dystrophies, resulting  in  inappropriate embryonic 

splicing pattern, which is considered one of the main causes of direct symptoms. The 

aberrant  splicing events  identified  in DMs are  summarized  in Table 3. Of  these, at 

least chloride channel 1  (CLC1) has been  linked  to myotonia  [53, 172, 320];  insulin 

receptor (INSR) to insulin resistance [262]; and cardiac troponin T (TNNT2) to cardiac 

problems [224]. The muscleblind proteins 


The Drosophila muscleblind gene encodes a zinc  finger motif‐containing homeobox 

protein  required  for  terminal differentiation of muscle and eye  [8, 25].  In human, 

three genes (MBNL1, MBNL2, and MBNL3) encode the muscleblind‐like proteins, of 

which MBNL1 is the major isoform expressed in skeletal and heart muscle [78]. 


MBNL2  is  ubiquitously  expressed,  while  MBNL3  is  only  found  in 

placenta. MBNL1 binds to dsRNA hairpin structure, and its binding is proportional to 

the size of the expanded repeat [187]. All MBNL isoforms are capable of binding the 

nuclear  foci  [78],  and  are  able  to  cause  alternative  splicing  of  TNNT2  and  INSR 

minigenes  [110].  However,  only MBNL1  has  been  consistently  implicated  in  DM 

pathophysiology  [156],  whilst  MBNL2  may  play  some  role  [103].  In  fact,  a 

comparative study of HSALR and Mbnl1 –knockout mice  indicated that majority  (up 

to 80%) of  the abnormal  splicing  could be due  to decreased Mbnl1  levels  [70].  In 

normal  postnatal  development,  MBNL1  is  predominantly  translocated  from 

cytoplasm  to  nucleus  [156],  where  it  controls  the  temporally  regulated 

transcriptional switch from embryonic to adult isoforms, through alternative splicing 

of certain exons [156]. 


Page 54: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

54 |

Table 3. Abnormally spliced genes in myotonic dystrophies. Protein Gene Splice event Tissue DM1 DM2 Ref Cardiac troponin T (TNNT2) TNNT2 Exon 5 retention Heart muscle x [224]

Insulin receptor (IR) INSR Exon 11 exclusion Sk muscle x [262]

Insulin receptor (IR) INSR Exon 11 exclusion Sk muscle x [263]

Tau (MAPT) MAPT Exon 2 exclusion Brain x [271]

Tau (MAPT) MAPT Exons 2/10 exclusion Brain x [121]

Tau (MAPT) MAPT Exon 6c exclusion/exon 6d

retention Brain x [154]

Tau (MAPT) MAPT Exons 2/3 exclusion Brain x x [177]

Chloride channel 1 CLCN1 Exon 7a retention Sk muscle x x [53, 172]

Chloride channel 1 CLCN1 Intron 2 retention Sk muscle x x [53, 172]

Myotubularin-related protein 1 (MTMR1)

MTMR1 Exons 2.1/2.3

exclusion Sk/heart muscle x [43]

Fast sk troponin T (fTnT) TNNT3 Fetal (F) exon inclusion Sk muscle x [126]

Fast sk troponin T (fTnT) TNNT3 Fetal (F) exon inclusion Sk muscle x x [255]

N-methyl-D-Asp receptor (NMDAR1)

NMDAR1 Exon 5 retention Brain x [121]

Amyloid precurson protein (APP)

APP Exon 7 exclusion Brain x [121]

Ryanodine receptor 1 (RYR1) RYR1 Exon 70 exclusion Sk muscle x [134]

SERCA1 Ca2+ ATPase ATP2A1 Exon 22 exclusion Sk muscle x [134]

SERCA2 Ca2+ ATPase ATP2A2 Intron 19 retention Sk muscle x [134]

ZASP LDB3 Exon 7 inclusion Sk muscle x x [156]

ZASP LDB3 Exon 7 inclusion Heart muscle x [170]

Titin (TTN) TTN Exons Zr4/Zr5/Mex5 retention Sk muscle x x [156]

Calpain3 (CAPN3) CAPN3 Exon 16 exclusion Sk muscle x x [156]

GFAT1 GFAT1 Exon 10 exclusion Sk muscle x [156]

MBNL1 MBNL1 Exon 7 retention Sk muscle x x [156]

Dystrophin (DYS) DMD Exons 71/78 exclusion Sk/heart muscle x [200]

Alpha-dystrobrevin (DTNA) DTNA Exons 11A/12 retention Sk/heart muscle x [201]

Ankyrin-2 ANK2 Exon 21 exclusion Sk muscle x [210]

F-actin capping protein beta CAPZB Exon 8 exclusion Sk muscle x [210]

Zinc finger protein 9 (ZNF9) ZNF9 Intron 1/3 partial retention Sk muscle x [234]

Page 55: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 55

The binding sites for MBNL1 or CUGBP1  in some mRNA species are known, and the 

molecular effect on splicing already discovered. For example, MBNL1 binds to TNNT2 

intron upstream of exon 5 and blocks access of the splicing factor U2AF65 promoting 

skipping  of  TNNT2  exon  5  [110].  In  DM1  and  DM2,  the  concentration  of  soluble 

nuclear MBNL1  is  reduced due  to  its  sequestration  in  ribonuclear  foci,  resulting  in 

loss‐of‐function and  incomplete  switch  to adult  isoforms  [156].  Interestingly, most 

aberrant  splicing  events  described  in  DMs  involve  the  expression  of  fetal  or 

embryonic isoforms. CUGBP1 


Specifically  in  DM1,  an  additional  feature  of  CUGBP1  protein  up‐regulation  is 

observed  [262, 297]. CUGBP1 belongs to the  family of CELF  (CUGBP and ETR‐3  like 

factors)  proteins. Under  normal  conditions, CUGBP1  is  upregulated  during muscle 

differentiation, where  it has  regulatory  functions on both pre‐mRNA  splicing  [295] 

and  translation  [296].  In  DM1,  the  steady‐state  CUGBP1  protein  levels  are  also 

elevated  in  adult  muscle,  due  to  protein  kinase  C  (PKC)‐mediated 

hyperphosphorylation, which  increases  the  half‐life  of  CUGBP1  [145],  resulting  in 

increased  activity. However,  the exact mechanism of  this  activation  is not  known. 

Also other kinases are known to phosphorylate CUGBP1, such as Akt kinase at Ser28 

[253],  and  cyclin  D3/cdk4/6  at  Ser302  [294].  Developmentally  regulated 

phosphorylation of the different sites in CUGBP1 directs its affinity to different target 

mRNA species. 


  Unlike MBNL1,  CUGBP1  specifically  binds  ssRNA,  and  it  does  not  co‐

localize with the ribonuclear foci, even though there is evidence that it binds to the 

stem  of  RNA  hairpin  structures  in  DM1  [182].  However,  it  is  increased  in  both 

nucleus and cytoplasm  in DM1, where  it associates predominantly with the soluble 

fraction  of  the mutant  (CUG)n  transcript  [297].  Interestingly,  only mouse models 

expressing the expanded (CTG)n repeat within  its native genetic context, the DMPK 

3´‐UTR,  show  CUGBP1  upregulation,  suggesting  that  the  mutation  flanking 

sequences have a  critical  role  in CUGBP1 activation  [210].  In agreement with  this, 

Page 56: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

56 |

CUGBP1 shows no dysregulation  in animal models, which express expanded  (CTG)n 

from  an  unrelated  sequence  [173],  or  in DM2, with  one  exception: CUGBP1‐eIF2‐

complex was found to be  increased  in DM2 patient myoblasts, and to  interact with 

(CCUG) repeats [254]. 


CUGBP1 was first implicated in splicing dysregulation of TNNT2 in DM1 

[224].  It has been  linked  to numerous splicing events since.  In addition  to splicing, 

CUGBP1 has other  functions  involved  in  translation  regulation  and mRNA  stability 

[296,  297].  CUGBP1  is  required  for  proper myocyte  differentiation  [295]: MEF2A 

(myogenic enhancer  factor 2A)  and p21  are  translational  targets of CUGBP1  [295, 

296].  By  increasing  their  translation,  and  subsequent  elevation  of  other  proteins, 

such as myogenin, CUGBP1 may  inhibit myogenesis and delay muscle development 

in DM1  [296]. CUGBP1 may also  stabilize  its  target mRNA  species by binding AREs 

(AU‐rich elements), or mediate mRNA decay of short‐lived transcripts by interaction 

with GU‐rich elements [192, 308, 331]. Role of DMPK in DM1 


Soon  after  the  discovery  of  the  DM1 mutation,  decreased  levels  of  both  DMPK 

mRNA and protein were reported in muscle of DM1 patients, suggesting that DMPK 

is directly involved in DM1 pathophysiology [84]. Accordingly, knockout mice lacking 

Dmpk  show  progressive  late‐onset  myopathy  [84],  and  heart  conduction 

abnormalities  [27].  In DM1,  the repeat expansion  is  incompletely cleaved  from  the 

DMPK pre‐mRNA, leading to both viable and aberrant DMPK mRNA species. A  large 

proportion of the (CUG)DM1‐containing mutant transcript is retained in the nucleus as 

the  ribonuclear  foci  [63];  however,  it  is  also  to  some  extent  exported  from  the 

nucleus  to  the cytoplasm  [283, 297]. Defects  in  the posttranslational processing of 

the mutant DMPK transcript, and its nuclear retention as a constituent of the nuclear 

foci,  cause  lower DMPK protein  levels and hence, haploinsufficiency  in DM1  [141] 




Page 57: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 57 Role of ZNF9 in DM2 


Originally,  the  role of ZNF9  in DM2 pathogenesis was  thought  to be  less  relevant, 

based on studies with cell culture models, which failed to  indicate any effect of the 

(CCTG)DM2  expansion  on  ZNF9  mRNA  or  protein  expression  [37,  175].  However, 

recently accumulating data  indicates that these models may have been  insufficient 

for such conclusions. Chen et al. (2007) reported that Znf9 haploinsufficiency in Znf+/‐ 

mice produces a multiorgan phenotype reminiscent of myotonic dystrophy, including 

muscle weakness,  cataracts, myotonic  discharges,  and  cardiac  conduction  defects 

[55]. Subsequently, reduction of ZNF9 protein was reported  in DM2 myoblasts and 

muscle biopsies  [114, 219]. Later,  it was shown  that both ZNF9 mRNA and protein 

are reduced in DM2, and that the mechanism underlying this is the impaired splicing 

of  ZNF9,  due  to  the mutant  (CCUG)DM2  sequence  in  the  first  intron.  In  the  same 

study, altered subcellular localization of ZNF9 in DM2 muscle was reported [234]. 


ZNF9 is expressed in a variety of tissues, most abundantly in heart and 

skeletal muscle  [158].  ZNF9  contains  seven  zinc‐finger  (CCHC) motifs  common  to 

transcription  factors  and  ribosomal  proteins,  and  its  protein  structure  is  highly 

conserved, suggestive of an important biological role [81, 312]. Znf9‐/‐ knockout mice 

are  embryonic  lethal  due  to  defective  forebrain  development  [56].  ZNF9  binds  to 

several  gene  regulatory elements  [80, 185, 235],  and  it has been  suggested  to be 

involved  in  a  variety  of  transcription  and  splicing  events.  However,  accumulating 

evidence is pointing to translation as the major regulatory role for ZNF9: it has been 

shown  to  regulate both  cap‐dependent  and  cap‐independent  translation  initiation 

[96,  220],  as  well  as  internal  ribosome  entry  site  sequence  (IRES)  –mediated 

translation,  the  activation of which was  reduced  in DM2  [256].  Importantly,  ZNF9 

binds  to  terminal  oligo‐pyrimidine  tract  (TOP)  containing mRNAs,  including  those 

encoding  ribosomal  proteins  and  elongation  factors.  This  has  been  specifically 

indicated in DM2 pathomechanisms, as down‐regulation of ZNF9 reduces the global 

protein synthesis in DM2 [114]. 



Page 58: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

58 | The nuclear foci 


Despite the nuclear foci being a characteristic finding in myotonic dystrophies, there 

is evidence  that  the  ribonuclear  inclusions are neither  toxic nor mandatory  for  the 

disease  pathogenesis.  They  could  even  be  protective,  as  a  mouse  model 

overexpressing the normal DMPK 3´ UTR mRNA, containing (CTG)5, developed many 

of  the core  features  seen  in DM1,  including myotonia, cardiac conduction defects, 

and  defective  splicing  [168].  This  is  in  agreement  with  a  Drosophila model  with 

nuclear  foci  formation  but  no  phenotype  [112];  the  same  study  suggested  that 

MBNL1 may,  in  fact, stabilize  the CTG‐repeat secondary structures, and hence,  the 

nuclear foci [112]. Nuclear foci in DM2 muscle cells are generally larger compared to 

foci in DM1, possibly due to larger repeats in DM2 and/or more abundant expression 

of ZNF9 versus DMPK [171]. Neighboring genes 


Neighboring  genes  may  well  modify  pathophysiology  in  DMs,  which  further 

complicates  the molecular  pathomechanisms  and  clinical  outcome.  Six5  knockout 

mice develop cataracts, even  in the heterozygous state (although without a muscle 

phenotype)  [261]. Haploinsufficiency  of  SIX5  and DMWD  have  been  implicated  in 

some DM1 patients, which may be due  either  to  transcriptional defects, or  failed 

nuclear export of the transcripts [4, 136, 139, 289]. 


It  has  been  suggested  that  the  CTG  repeat  affects  the  chromatin 

structure at the mutation locus (3´), making it more condensed and less accessible to 

nucleases [213]. Subsequently, it was shown that this affects the transcription of the 

neighboring genes [136, 289]. Other pathomechanisms 


Another pathomechanism suggested in DM2 involves protein turnover; the catalytic 

core subunits of the proteasome were identified as (CCUG)‐interacting proteins, and 

Page 59: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 59

inhibition of protein degradation, or  increased stability of short‐lived proteins, was 

observed in DM2 myoblasts [254]. 


Myogenic differentiation has been shown to be defective  in DM1: the 

satellite  cells  are  able  to  proliferate  normally,  but  they  show  delay  in  fusion  and 

differentiation  [88].  A  role  of  CUGBP1  has  been  implicated,  as  it  impairs  the 

transcriptional  activation  of myogenic markers  necessary  for  differentiation  [219, 

295].  In  congenital DM1,  the  satellite  cells  are defective  also  in proliferation  [90], 

whereas in DM2, no abnormalities in myogenic program or satellite cells have been 

described [50, 219]. Animal models 


Several mouse models have been developed which display features of DM1, some of 

the most  important ones are described below.  Interestingly, none of the models so 

far have reproduced the multisystem disease completely. This may be due to several 

reasons,  including  the  mutation  length  and  level  of  expression,  whether  the 

mutation  is  expressed  from  its  native  genetic  context,  or  from  an  unrelated 

localization,  the  genetic  background  of  the  model  animal  species,  and  variation 

between  different  strains.  In  addition,  there  is  less  somatic  and  intergenerational 

instability  of  long  repeat  tracts  in  mouse.  DM2  mouse  models  have  not  been 

reported as yet. 


Transgenic  mice  have  been  developed  to  carry  human  actin‐gene 

modified to include a short repeat (CTG)5 or a long repeat (CTG)250, called HSASR and 

HSALR, respectively [173]. The transgene was selectively expressed in skeletal muscle, 

and the HSALR mice displayed aberrant splicing events similar to DM1 with developed 

myotonia  and  mild  histopathological  alterations  of  the  skeletal  muscle,  but  not 

weakness and wasting. 


A French group generated a transgenic mouse carrying a large (>45 kD) 

human genomic  fragment  containing DMPK with more  than 300 CTG  repeats, and 

Page 60: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

60 |

also  the  neighboring  genes  DMWD  and  SIX5  [273].  The  repeat  expansion  in  this 

model  showed both  somatic and  intergenerational  instability, although  the  rate of 

instability is generally lower in mice. The phenotypes were variable between strains 

and also between individual mice in the same strain. Importantly, the mouse strains 

with a phenotype showed myopathic changes, atrophy and myotonia, and findings in 

the brain suggested similar tau pathology as encountered in DM1 patients [274]. 


Because of the well established role of MBNL1  in DM pathogenesis, a 

MBNL1 knockout mouse was developed [126]. It showed a very similar phenotype as 

the  HSALR  model,  including  splicing  abnormalities,  myotonia  and  mild  muscle 

pathology  [126].  CUGBP1  overexpressing  mouse  models  presented  with  delayed 

skeletal  muscle  differentiation  and  muscular  dystrophy,  with  translational 

dysregulation [296], in addition to aberrant splicing in both heart and skeletal muscle 



Subsequently,  an  adeno‐associated  virus  2  (AAV2)‐vector  mediated 

inducible  mouse  model  was  described,  harbouring  a  longer  (CTG)960  repeat, 

corresponding  to  its  native  locus  in  the  3´UTR  of DMPK  [210].  The  construct was 

expressed selectively in skeletal muscle. In addition to replicating the myotonia and 

abnormal  splicing  of  the  HSALR  and  MBNL1  ko,  this  (CTG)960  mouse  displayed 

upregulation  of  CUGBP1  protein.  The mice  displayed  severe muscle wasting  and 

weakness, along with dystrophic changes  in muscle histopathology  [210]. A mouse 

model  (EpA960/MCM) expressing a similar  inducible  (CTG)960 cassette, specifically  in 

heart,  fully  recapitulated  the  heart  phenotype  in  DM1,  including  arrhythmias, 

cardiomyopathy, and systolic/diastolic dysfunction, with a key molecular pathology 

of nuclear foci formation and aberrant splicing [310]. 


Drosophila  models  for  DM1  indicated  that  longer  expansions  are 

needed  for  pathological  effects  in  fly;  a model  expressing  (CTG)162  from  human 

DMPK 3´‐UTR did develop ribonuclear foci, but no disease phenotype [112], whereas 

expressing  sole  interrupted  (CTG)480 without DMPK  flanking  sequences  resulted  in 

foci formation, muscle wasting and eye phenotype [67]. 

Page 61: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 61 Management and gene therapy 


There  is no cure  for myotonic dystrophies, however medication and physiotherapy 

may relieve some of the symptoms. Cardiorespiratory disorders account for 70% of 

the mortality in DM1, emphasizing the need for active monitoring and interventions 

at some stage of the disease. Even though malignant cardiac arrhythmias are more 

rare  in DM2,  it has been  suggested  that annual ECG  should be also performed on 

DM2 patients  [302].  Early  insertion of pacemakers  in DM1 patients  could prevent 

some of the sudden deaths due to arrhythmia. Respiratory complications and apnea 

in  DM1  may  require  non‐invasive  ventilation,  and  daytime  sleepiness  may  be 

relieved  using  CNS  stimulant  drugs  [164,  298].  These  measures  are  usually  not 

needed for DM2 patients. 


Cataracts  may  require  surgical  removal.  Gastrointestinal  symptoms, 

such  as  abdominal  pain,  dysphagia,  vomiting  and  diarrhoea,  are  common  in DM1 

patients,  and may  also  occur  in DM2  patients  [245,  246,  291,  292].  Some  of  the 

symptoms can be relieved medically, however, there  is no treatment for dysphagia 

in DM1 except  for parenteral  feeding  [298]. Myalgic pains  in DM2 do not  respond 

well to conventional analgesics. 


There  have  been  some  reports  concerning  the  treatment  of muscle 

wasting  in DM1, that suggest  insulin‐like growth factor 1 (IGF1) therapy to  improve 

insulin insensitivity in DM1 myoblasts [87]. Treatment with creatine may moderately 

improve muscle  strength  in DM2 patients, but not  in DM1 patients  [265]. Training 

does not  relieve muscle  symptoms  in DMs, but moderate exercise  is not harmful, 

and  it may have other beneficial effects on patients  [309]. Myotonia  is often not a 

major complaint, however, DM1 patients may be treated with mexiletine [161]. 


  The  continued  search  for  molecular  pathomechanisms  in  myotonic 

dystrophies has enabled the development of gene and molecular therapy strategies 

at  several  levels.  These  include  (I)  elimination  of  the  expanded  C/CUG  RNAs;  (II) 

preventing harmful protein binding  to  the mutant RNA;  (III)  reversing  the aberrant 

Page 62: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

62 |

splicing  events  [320];  (IV)  forcing  nuclear  export  of  the  mutant  RNA;  (V) 

overexpression  of  MBNL1  [125];  (VI)  restoring  normal  CUGBP1  levels  by  PKC 

dephosphorylation  [311]. Most attention has been directed  to  strategies designed 

for  specific  targeting of  the  toxic expanded RNA  [197]. Silencing of mutant  (CUG)n 

RNA can be achieved by several methods. Using ribozymes or artificial trans‐splicing 

molecules, 3´part of the mutant transcript can be exchanged to reduce the number 

of  CTG  repeats  [54,  226].  Antisense  strategies  inducing  degradation  of  mutant 

transcripts  have  been  applied  by  introducing  complementary  antisense  RNA 

molecules  directed  against  DMPK  3´UTR.  This  resulted  in  partial  reduction  of 

pathological  effects  in  DM1  patient  myoblasts  [89].  Antisense  oligonucleotides 

(AONs), which  induce  the  degradation  of  the DNA‐RNA  hybrid  by  RNase H  [144], 

have  been  used  successfully  in  both  patient myoblasts  and  two  different mouse 

models for DM1 [198]. RNA  interference pathways have also been utilized  in order 

to eliminate  the  formation of hairpin  structures  in mutant RNA,  reminiscent of A‐

form  RNA.  Trials  using  synthetic  RNA  oligos  and  lentiviral  vector‐delivered  short 

hairpin RNA  targeting sequences resulted  in reduction of mutant DMPK  transcripts 

[150]. Another approach to avoid the pathological effects of the mutant repeat RNA 

is  to  inhibit  detrimental  protein  binding  to  the  hairpin  structures  formed  by 

(C/CUG)n. Use of morpholino‐type AONs, which bind to and inhibit activity of, but do 

not  induce  degradation  of  the  target  RNA  [279],  resulted  in  release  of  MBNL1 

protein from the expanded (CUG)n, and subsequent restoration of aberrant splicing 

in HSALR mice  [321].  Recently,  a  group  of  small molecules,  including  pentamidine 

[313] have been described, which release MBNL1 from (C/CUG) repeats [7, 94, 313]. 


Several  studies  on DM1 mouse models  suggest  that  the  pathological 

effects  are  reversible  [106,  143]  [311,  320],  which  makes  development  of  gene 

therapies  that may  be  clinically  useful,  very  important.  In  addition  to  overcoming 

harmful  side‐effects,  developing  an  efficient  means  for  delivering  the  active 

compounds  to  the  target  tissues, which  are  versatile  in  DMs,  continues  to  be  a 

challenge in DM molecular therapy. 

Page 63: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 63



At the beginning of this study, the DM2 mutation had just been discovered, and tools 

for  accurate  mutation  verification  were  not  widely  available.  In  addition,  using 

routine  muscle  histopathological  methods,  the  muscle  histopathology  of  DM2 

showed mostly non‐specific, mild myopathic findings, similar to DM1, which offered 

no  possibility  for  differential  diagnostics.  The  principal  goal  of  this  work  was  to 

develop  new  methods  for  DM2  diagnostic  purposes  utilizing  muscle  biopsies 

frequently  taken  from patients with undefined muscular  symptoms.  In  the  second 

part of the study, the differences in mRNA and protein expression between DM1 and 

DM2  were  assessed  in  order  to  resolve  the  specific  pathways  involved  in  the 

molecular  pathology  of  the myotonic  dystrophies,  with  special  emphasis  on  the 

differences between the two similar but distinct diseases. 


 The specific objectives in this study were:  

1. To improve differential diagnostics of DM2 by  

a. identifying  specific  differences  in  the  muscle  histopathology,  for 

screening of patients for eventual mutation verification 

b. developing  an  accurate  DM2  mutation  verification  method  using 

muscle biopsy material 


2. To gain understanding of the defective molecular pathways underlying DM2 

muscle pathology by 

a. studying expression of muscle‐specific proteins using standard methods 

b. studying mRNA expression of muscle‐specific genes using microarrays, 

and differential splicing using splice variant analysis 

Page 64: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

64 |



6.1. Patients and samples 


Sixty‐two DM2 patients participated in this study (publications I‐IV). The majority of 

them were Finnish (37) and the remaining patients originated from North America, 

France, Spain, and Italy. All Finnish DM2 skeletal muscles used were vastus  lateralis 

(VL),  whereas  the  foreign  cohort  consisted  mostly  of  biceps  brachii  and  deltoid 

muscle biopsies. 


Thirty DM1 patients from various countries and ethnic origins (Swedish, 

French, North American, Spanish, and Finnish) served as controls. The muscles used 

were tibialis anterior  (TA), VL, biceps brachii and deltoid. Disease controls, with AR 

congenital myotonia (CLCN1‐channelopathy) patient (I), TMD, BMD and DMD (III, IV) 

were also included. In addition, more than 20 muscle biopsies from healthy controls 

from Finland and North America were used. 


In experiments where DM1  samples were  analyzed  to  assess  specific 

differences in comparison to DM2, muscle biopsies matched by age, sex, muscle site, 

and stage of pathology were preferably used. Both muscle biopsy and blood samples 

were obtained from all patients and control individuals in this study. 


6.1.1. Consent and ethics committee permissions 


The  majority  of  the  DM2  biopsies  had  previously  been  taken  for 

diagnostic purposes. Enrollment of patients was approved by the  local  institutional 

review boards, and the muscle biopsies and blood samples were used  in this study 

only after informed consent from the patients. 




Page 65: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 65

6.1.2. Patients included in the histopathological study (I) 


Nine biopsies  from DM2 patients were  included  as  follows:  Finnish VL  (3),  French 

deltoid (3), and  Italian biceps (3). Biopsies from age‐matched French DM1 patients, 

VL  (3),  deltoid  (3),  biceps  (2), with mild  pathology,  and  one  recessive  congenital 

myotonia patient with a homozygous mutation in the CLCN1 gene served as controls. 


6.1.3. Patients included in the study of new diagnostic methods (II) 


Altogether 13 Finnish DM2 patients with previous molecular genetic diagnosis, and a 

cohort  of  patients  with  an  undefined  (at  the  time  of  the  study)  neuromuscular 

disorder (n = 31) served as subjects. Additionally, four healthy individuals, and three 

DM1 patients were used as (negative) controls in CISH and FISH. 


6.1.4. Patients included in the studies of sarcomeric and Ca2+ handling proteins and 

mRNA expression (III, IV) 


We used two distinct sample sets for the protein (set 1) and mRNA (set 2) expression 

studies.  In  set  1  (publication  III),  20  DM2  and  9  DM1  patients  were  included, 

together with 2 healthy individuals and 1 TMD‐patient. Set 2 (III) was used for mRNA 

expression profiling  and  splice  variant  analysis  and  consisted of  20 DM2,  10 DM1 

patients and 6 healthy controls. In publication IV, the same samples were used, with 

additional DM1  (n = 2)  and healthy  controls  (n = 12)  in  set 1, and neuromuscular 

disease controls with TMD (n = 1), BMD (n = 3) and DMD (n = 3) in set 2. 


6.1.5.  Patients  with  neuromuscular  diseases  included  in  the  study  of  protein 

expression in the highly atrophic fibers (U) 


The same DM2 patients as  in set 1 (III) were used for a broader protein expression 

study in muscle samples by immunohistochemistry, including an additional 9 Finnish 

patients with neurogenic disorders as disease controls: Charcot‐Marie‐Tooth disease 

Page 66: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

66 |

(1); amyotrophic lateral sclerosis (2); familial amyotrophic lateral sclerosis (3); lower 

motor neuron syndrome (2); spinal and bulbar muscular atrophy (1). 


6.2. Methods  

The  methods  used  in  this  study  are  summarized  in  Table  4.  The  methods  are 

described briefly herein; for details, please see the corresponding article where full 

descriptions of methods can be  found.  In addition, Table 5 summarizes all primary 

antibodies used in this study. 




Table 4. Methods used in this study. 

Method  Study 

Immunohistochemistry  I, III, IV 

Immunofluorescence  III, IV 

Enzyme histochemistry  I 

Muscle morphometry  I 

Bright and dark field microscopy  I‐IV 

Chromogenic in situ hybridization  II 

Fiber‐FISH  II 

PCR‐based allele sizing  II 

Repeat‐primed (RP‐)PCR  II 

Field‐inversion gel electrophoresis  II 

Western blotting  III, IV 

Microarray expression profiling  III, IV 

Splice variant analysis  III, IV 

Confocal microscopy  IV 


Page 67: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 67

Table 5. Primary antibodies used in this study. 

Antibody Gene Protein Clone Supplier Ref. WB-MHCf MYH2

(/MYH1) MyHC-IIa(/x) WB-MHCf NC [73]

A4.74 MYH2 MyHC-IIa A4.74 DSHB [316] MHCf(ast) MYH2

(/MYH1) MyHC-IIa(/x) MY-32 SA [107]

MHCs(low) MYH7 MyHC-beta/slow NOQ7.5.4D SA [69] MHC-beta MYH7 MyHC-beta/slow WB-MHCs NC -

MHCd MYH3 MyHC-emb RNMy2/9D2 NC [73] MHCn MYH8 MyHC-pn WB-MHCn NC [73]

SERCA-1 ATP2A1 SERCA1 VE121G9 RDI [204] SERCA2 ATP2A2 SERCA2 goat pAb SCB [184]

TropT TNNT3 fTnT T1/61 NC [30] NCAM NCAM1 NCAM-1 UJ13A DAKO [217] nNOS NOS1 NOS1 NOS-B1 SA [230] Bcl-2 BCL2 BCL2 124 DAKO [223]

Cleaved Casp-3 CASP3 CASP3 5A1 CS [118] Dystrophin C-

term. DMD DYS rabbit pAb NM


Myogenin MYOG Myogenin F12B SA [215] Vimentin VIM Vimentin 3B4 DAKO [33]

ZASP LDB3 ZASP mouse pAb G. F. [79] RyR RYR1/2 RYR1/2* 34C NB [123]

DHPR alpha-1 CACNA1S DHPR 1A NB [193] Triadin TRDN TRDN (pAb) SCB -

Junctophilin JPH1 JPH1 (pAb) ABN - CASQ1 N-16 CASQ1 CASQ1 goat pAb SCB -

CASQ2 CASQ2 CASQ2 rabbit pAb ABC [159] Calcineurin PPP3CA CaN CN-A1 SA [207]

NFATc3 NFATC3 NFATC3 mouse pAb ABN - Pax7 PAX7 PAX7 Pax7 DSHB [130]

Alpha-actinin ACTN2/3 ACTN2/3 EA-53 SA -

NC, Novocastra Laboratories, Newcastle Upon Tyne, UK; DSHB, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Iowa City, IA, USA; SA, Sigma‐Aldrich, Saint Louis, MO, USA; RDI, RDI Division of Fitzgerald Industries Intl, North Acton, MA, USA; SCB, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA.; DAKO, Glostrup, Denmark; CS, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA; NM, NeoMarkers, Thermo Fisher Scientific, Inc., Fremont, CA, USA; G. F., ZASP mouse pAb was a generous gift from Dr. Georgine Faulkner, Trieste, Italy; NB, Novus Biologicals, Inc., Littleton, CA, USA; ABN, Abnova Corporation, Taipei, Taiwan; ABC, Abcam, Cambridge, UK. pAb, polyclonal antibody. *The RYR antibody is reported to recognize RYR1 and RYR2; however, we conclude that this antibody detects mainly the dominant RYR1 isoform in skeletal muscle, based on expression data and the immunohistochemical findings: localization to the SR junctional membranes with DHPR, and higher signal in the fast fibers. 

In order  to  to  verify  that  each antibody  recognizes  its  intended  target,  they have been carefully tested  in  immunohistochemistry and/or Western blotting using healthy control muscle material, and compared the obtained results with the information provided by the Ab manufacturer and  literature. We have  confirmed  that  subcellular distribution  (IHC) and molecular weight (WB) are in concordance with published data of each protein. 

Page 68: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

68 |

6.2.1.  Immunohistochemistry  (I,  III,  IV),  immunofluorescence  (III,  IV)  and microscopy (I‐IV)  

All muscle biopsies used  in  this  study were  snap  frozen  in  isopentane cooled with 

liquid nitrogen, and  stored at  ‐80°C –  ‐135°C until use. Either 6 or 10  μm  sections 

were cut on glass slides using a cryomicrotome, and the sections were stored frozen 

at ‐80°C.  


  For DAB  immunohistochemistry,  either  BenchMark  (Ventana Medical 

Systems,  Tucson,  AZ,  USA)  or  TechMate  (DakoCytomation,  Glostrup,  Denmark) 

automated  immunostainer was used, according  to  the manufacturer´s  instructions. 

Immunofluorescent  stainings  were  performed  manually  using  the  following 

procedure. The sections were fixed in 4% PFA for 10 min, at room temperature (RT), 

or in methanol at ‐20°C for 2 min. The sections were then permeabilized using 0.2% 

Triton‐X‐100, and blocked with 1% bovine serum albumin (BSA). The Ab incubations 

were performed at RT for 1 – 2 h. The slides were rinsed with PBS, and mounted in 

mounting medium  containing  an  anti‐fade  agent.  The  slides were  viewed under  a 

light microscope,  or  using  a  Zeiss  LSM  510  confocal microscope  (Carl  Zeiss,  Inc., 

Göttingen, Germany). 


6.2.2. Enzyme histochemistry (I) 


The  ATPase  staining  used  for  fiber  type  differentiation  was  performed  by  pre‐

incubating the slides in either alkaline Barbital‐Na (pH 10.4), or acidic Ba‐acetate (pH 

4.3/pH 4.6). After rinsing the slides, ATP solution was added, followed by a substrate 

solution. Counterstaining with Herovici was performed, and the slides were mounted 

in HistoMountTM. [71] 


6.2.3. Muscle morphometry (I) 


Randomly  selected  regions  on muscle  sections  stained with  ATPase  or MyHC‐IHC 

were  analyzed  by measuring  the  “smallest  diameter”  [71].  Approximately  500  – 

Page 69: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 69

5,000 fibers were measured in each specimen, and the data was analyzed using the 

Microcal Origin software (Microcal Software  Inc., Northampton, MA, USA). Atrophy 

and hypertrophy factors were calculated, and metahistograms were generated. 


6.2.4. Chromogenic in situ‐hybridization (II) 


Frozen muscle biopsy sections were prepared as  in 2.1.  In addition, some formalin‐

fixed  (12 – 24 h), paraffin‐embedded  sections were used. Digoxigenin end‐labeled 

sense  (CCTG)8  and  antisense  (CAGG)8  probes  (synthesized  by  Sigma‐Genosys, 

Cambridge, UK) complementary to the DM2 mutation were allowed to hybridize to 

the  target overnight at 37°C. The next day,  the  slides were  rinsed with 1 x SSC at 

45°C, and endogenous peroxidase was quenched using H2O2 in methanol. The bound 

probe was  visualized  using  Zymed  Spot‐Light  CISH  Polymer  Detection  kit  (Zymed 

Laboratories, San Francisco, CA, USA), according to the manufacturer´s  instructions. 

The  slides  were  counterstained  with  Gill  II  hematoxylin  and  mounted  in 

HistoMountTM solution. For the paraffin‐embedded sections, a similar procedure was 

applied, with  two  additional  steps  in  the  beginning  of  the  procedure:  Spot‐Light 

enzyme  pretreatment was  used,  followed  by  heating  in HIER  pretreatment  buffer 

(both from Zymed).  


6.2.5. Fiber‐FISH (II) 


Peripheral blood  lymphocytes were used  to prepare extended DNA  fibers on glass 

microscope  slides. The  same digoxigenin‐labeled  sense and antisense probes were 

used  for  the  mutation  detection  as  in  2.4.  In  addition,  BAC  clone  RP11‐814L21 

(AC022944; BACPAC Resource Center) was nick  translation  labeled with biotin 16‐

dUTP (Roche Diagnostics GmbH), in order to detect the mutation flanking sequences. 

The  the  RP11‐probe  was  denatured  at  90°C  for  5  min,  after  which  the 

(CCTG)8/(CAGG)8  probes  were  added,  and  the  hybridization  mix  was  applied  on 

slides. The hybridization was allowed to take place for 48 h at 37°C. The biotinylated 

RP11‐probe was detected using TRITC‐conjugated avidin D followed by biotinylated 

goat anti‐avidin D and another layer of TRITC‐conjugated avidin (Vector Laboratories, 

Page 70: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

70 |

Burlingame,  CA,  USA),  in  order  to  increase  detection  sensitivity.  Mouse  anti‐

digoxigenin (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) was used to detect the bound 

(CCTG)8/CAGG)8 probes, followed by  immunofluorescent detection with anti‐mouse 

fluorescein. The slides were mounted  in mounting medium containing an anti‐fade 

agent. The mutation length was measured using the centromeric portion of the BAC 

814L21 for calibration, which is known to be approximately 155 kb in length. 


6.2.6. PCR‐based allele sizing (II) 


The DM2 mutation  locus was  amplified  by  polymerase  chain  reaction  (PCR)  using 

genomic DNA derived from blood leucocytes and primers CL3N58‐D F/R, which bind 

to  the  mutation  flanking  sequences  [158].  The  resulting  PRC‐products  were 

separated by one of the following methods. 1) 32P –dCTP labeled PCR‐products were 

separated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and detected from the gel 

using autoradiography. 2) Fluorescently  (Cy‐)  labeled PCR‐products were separated 

by  electrophoresis  on  an  ALFexpress  Automated  DNA  Sequencer  (Amersham 

Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), and the bands were analyzed using AlleleLinks 

1.0  software  (Amersham).  3)  Fluorescently  (FAM‐)  labeled  PCR‐products  were 

separated using capillary electrophoresis on an ABI 3100 Genetic Analyzer, and the 

results were analyzed using  the  instrument´s  software  (Applied Biosystems, Foster 

City, CA, USA).  


6.2.7. Repeat‐primed PCR (RP‐PCR) (II) 


A similar forward primer as in 2.6., but with an additional 5´ tail (5´‐GTTTCTT‐3´), was 

used  for  RP‐PCR,  together  with  a  reverse  primer  consisting  of  (CAGG)5  and  an 

universal  tail  sequence.  Genomic  DNA  was  used  for  amplification  of  the  DM2 

mutation  locus,  and  the  resulting  PCR  products  were  analyzed  using  capillary 

electrophoresis, ABI 3100 and Genotyper software (Applied Biosystems). 




Page 71: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 71

6.2.8. Field‐inversion gel electrophoresis (FIGE) (II) 


Field‐inversion gel electrophoresis  is a modified Southern blot analysis, particularly 

suitable for detecting long repeat tracts. Genomic DNA was digested with EcoRI, and 

the digested samples were separated  in agarose gels on the FIGE Mapper  (Bio‐Rad 

Laboratories,  Hercules,  CA,  USA).  The  samples  were  blotted  on  membranes  for 

detection with a 32P‐labeled probe recognizing the DM2 repeat expansion sequence, 

and the membranes were analyzed using autogradiography. 


6.2.9. Western blotting (III, IV) 


Frozen muscle biopsies were used for Western blotting (WB) sample preparation by 

mechanical  homogenization  in  20  –  40  fold  (mg/µl)  volume  of  sample  buffer 

containing  a  reducing  agent  (beta‐mercaptoethanol)  and  sodium dodecyl  sulphate 

(SDS) for polypeptide linearization, after which the samples were heated at 95°C for 

5 min. Alternatively,  to preserve and solubilize  the  fragile membrane proteins,  the 

muscle  biopsies  were  sonicated  4  x  5  sec  in  lysis  buffer  containing  a  protease 

inhibitors  mix  (Complete;  Sigma‐Aldrich,  Saint  Louis,  MO,  USA),  before  adding 

sample  buffer,  and  heating  at  35°C  for  15  min.  Usually  5  –  20  µl  of  samples, 

depending on the protein to be detected, were separated electrophoretically using 

SDS‐PAGE gels, and  transferred onto PVDF membranes  for detection. Primary and 

secondary  Ab  incubations  were  performed  for  1  –  2  h  at  RT,  and  enhanced 

chemiluminescence (ECL) was used for the detection of bands. The obtained bands 

were most often normalized to the Coomassie brilliant blue stained MyHC bands  in 

gels  after  blotting.  Alternatively,  ECL‐detected  beta‐actin  or  alpha‐tubulin  bands 

were sometimes used. 


6.2.10. Microarray expression profiling (III, IV) 


Frozen muscle  biopsies were  homogenized,  and  the  total  RNA was  extracted  and 

purified with  RNeasy  kit  (Qiagen, Valencia,  CA, USA). Using  the  RNA  as  template, 

cDNA  was  synthesized  using  the  Superscript  II  system  (GIBCO/BRL).  In  vitro 

Page 72: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

72 |

transcription  labeling  was  performed  with  biotinylated  UTP  and  CTP  (Enzo 

Diagnostics, Farmingdale, NY, USA), and the labeled, amplified cRNA was fragmented 

before  applying  on  the  whole  human  genome  expression  array  U133Plus  2.0 

GeneChip  (Affymetrix,  Santa  Clara,  CA,  USA).  After  hybridization,  the  chips  were 

scanned according to the manufacturer´s protocol, and data analysis was performed 

using the DChip software package (DNA‐Chip Analyzer). 


6.2.11. Splice variant analysis (III, IV) 


cDNA derived from muscle biopsies was also used for splice variant analysis (SVA). In 

order  to  estimate  the  proportions  of  different  splice  isoforms  in  each  sample, 

reverse transcriptase‐PCR (RT‐PCR) was performed with fluorescently (FAM‐) labeled 

universal  primer.  Specific  primers  for  the  exons  flanking  the  alternatively  spliced 

exon were used. The RT‐PCR products were separated and analyzed using capillary 

electrophoresis and ABI 3100 sequencer, and the resultant peak heights were added 

together  to obtain  the  total  signal. Student´s  t‐test was used  to  test  the  statistical 

significance of the results. 

Page 73: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 73



7.1. Histopathology and protein expression in DM2 (I, III, IV, U) 


Nine DM2 muscle biopsies originating from three European countries and obtained 

from three different muscles (VL, deltoid, biceps brachii) showed rather non‐specific 

myopathic  changes  when  stained  with  routine  histopathological  procedures  (HE, 

Gomori´s  trichrome  and NADH):  increased  fiber  size  variation,  including  scattered 

round or thin atrophic fibers, internal nuclei, and nuclear clump fibers (Table 6). The 

findings  were  consistent  with  previously  reported  findings  [243,  287].  However, 

nuclear clump fibers, with and without pyknotic nuclei, occurred in most biopsies in 

high numbers, also  in clinically asymptomatic muscles.  Infrequent  findings  included 

increased connective tissue and fat replacement, necrotic fibers, moth‐eaten fibers, 

rimmed  vacuoles  and  ragged  red  fibers. On  the  other  hand,  ring  fibers,  targetoid 

fibers, and sarcoplasmic masses, more common in DM1, were extremely rare. 


  When  the  enzyme  histochemical  ATPase method was  used  for  fiber 

type  differentiation,  the  previously  reported  fiber  type  1  predominance  [66] was 

observed  in  many  DM2  specimens,  particularly  in  VL  muscles.  However,  when 

immunohistochemistry was applied, using an antibody against the fast myosin heavy 

chain, numerous very atrophic fibers (diameter ≤ 6 µm) were revealed (Figure 11A). 

They were mostly scattered, without grouping, as in neurogenic atrophy. In contrast 

to the nuclear clump fibers, the smallest population simply showed sarcolemma and 

a  scarce  amount  of  sarcoplasm with  or without  nuclei.  ATPase  staining was  not 

sensitive enough to visualize the majority of these very small diameter fibers (Figure 

11C).  IHC using an Ab against type 1 (slow) fibers did neither recognize such highly 

atrophic fibers, nor the nuclear clumps, confirming them solely as fast type in DM2. 

Subsequently, we verified that these mini‐fibers  in DM2 represent the fast subtype 

2A (III) [233]. The presence of type 2B fibers (expressing MyHC‐IIx) in DM2 was also 

confirmed, as well as an  increased number of 2C hybrid fibers expressing both  fast 

(MyHC‐IIa) and slow  (MyHC‐I) myosin heavy chain  isoforms  [233]. Even though  the 

Page 74: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

74 |

presence of the very small fast fibers is a typical feature of DM2, it is not specific as 

they can also occur in congenital myopathies, although without nuclear clumps. Fast 

fiber  type  atrophy may  also  be  encountered  in  cortisone‐induced myopathy  and 

myasthenias. [71]. However, to our knowledge, selective atrophy of this degree in a 

subpopulation of type 2A fibers has not been reported  in any other muscle disease 

apart from DM2. Its relevance is further implicated by the fact that it provides a clear 

distinction to fiber atrophy in DM1. 


Table 6. Summary of muscle histopathology in DM1 and DM2. 


Fiber size variation +++ +++

Internal nuclei +++ +++

More in type 1 fibers in DM1, more in type 2 fibers in DM2

Type 1 fiber atrophya + to ++ -

Type 2 fiber atrophya + ++(+)

Type 2 fiber hypertrophy

- +

Nuclear clump fibers early

- ++

Nuclear clump fibers late

+ +++

Very atrophic fibers (diameter ≤ 6 μm)

(+) Type 1 and 2

+++ Type 2 only

In DM1 only at advanced stage

Necrotic fibers + (+)

Ring fibers ++(+) +

Sarcoplasmic masses ++(+) (+)

Targetoid fibers ++ (+)

Moth-eaten fibers (+)

Swirled sarcomeres (+)

Small group atrophy + - At advanced stage only

Fibrosis +++ ++ Late pathology only

Fatty replacement +++ ++ Late pathology only

Rimmed vacuoles (+) (+)

Ragged-red fibers (+) (+)

COX-negative fibers (+) (+)

Finding present +++,  in >75% of biopsies; ++,  in 25‐50% of biopsies; +  in 10‐24 % of biopsies; (+) occasional finding, or restricted to few families; ‐ absent aas indicated by atrophy factor 

Page 75: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 75


Figure 11. Serial  sections of a VL muscle, DM2 patient, man, age 38.  (A, B) Brown immunolabeling  is  DAB;  blue  is  modified  hematoxylin  counterstain.  (A)  IHC  with MHCfast Ab reveals characteristic high number of very atrophic fibers (black arrows), which are exclusively of type 2, as MHCslow Ab, in (B), does not recognize them. (C) ATPase staining at pH 10,4, which stains  large  type 2  fibers  in dark brown,  fails  to detect  the small  fibers.  (D) ATPase at pH 4,3 stains  type 1  fibers dark brown. Note one  necrotic  fiber  (white  arrow), which  expresses  both  fast  and  slow myosins  as revealed by IHC.  


  In  order  to  analyze  the  distribution  of  fast  and  slow  fiber  types  in 

myotonic dystrophies, we performed morphometric analyses, on 9 DM2 and 8 DM1 

muscle  biopsies,  immunostained  for  fast  and  slow  myosin  isoforms.  The  “lesser 

diameter” of each fiber was measured [71]. The results of approximately 500 – 5000 

fibers  in each sample were normalized to the mean diameters of each muscle type 

analyzed  (60  µm  in  VL,  50  µm  in  deltoid  and  biceps  [228]).  The  results  were 

presented  in metahistograms, and atrophy and hypertrophy  factors  in each group 

were calculated [71]. The findings clearly indicated preferential fiber type 2 atrophy 

in all DM2 specimens,  in contrast to DM1, where marked fiber type 1 atrophy was 

encountered with minor  fiber  type 2 atrophy occurring at advanced  stages  (Figure 

12).  It  should be noted  that  a  subpopulation of  type 2  fibers was hypertrophic  in 

DM2  Biceps  brachii muscle.  In  addition,  atrophy  of  type  1  fibers  occurs  in  DM2, 

Page 76: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

76 |

however, to lesser extent: the percentage of atrophic type 1 fibers is lower than that 

of type 2 fibers (I). 


  Interestingly,  the  presence  of  the  very  atrophic  fibers  in  DM2  may 

explain the previously reported  fiber type 1 predominance, which according to our 

study  is not a true  finding. The normal  fiber type distribution  in each muscle  [122] 

was  restored when  the  very  small  fibers,  visualized  in  IHC  but missed  in  ATPase 

staining, were  included  in  the  count.  The  reason why  a  subpopulation of  type 2A 

fibers undergoes severe atrophy in DM2 has not been clarified. 






7.1.1. The atrophy of type II fibers in DM2 (I) 


It  was  only  after  we  used  the  immunohistochemical  method  for  fiber  type 

differentiation in the muscle sections, that the preferential fiber type 2 atrophy was 

fully recognized  in DM2 [307], even though the possibility of  it had been suggested 

previously [21]. Schoser et al. later confirmed the finding with a larger set of samples 



Figure 12. A representative metahistogram, showing marked type 2 fiber atrophy, and, on the other hand, slight type 2 fiber hypertrophy in DM2 patients. Note the bimodal fast fiber distribution. (710 fast and 635 slow fibers in Biceps were measured in three Italian DM2 patients. Figure kindly provided by Dr. Guillaume Bassez.) 

Page 77: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 77

In  this  thesis work,  the concept of very/highly atrophic  fibers  is used. 

They are characteristic for DM2 where they appear very early in the disease course, 

even  in  clinically unaffected muscles. Morphologically,  they  fall  into  at  least  three 

categories:  (1) nuclear clump  fibers,  (2) other extremely small  fibers  (≤ 6 µm) with 

very little cytoplasm and none to few nuclei (in the plane of sectioning), and (3) very 

thin, angulated  fibers. Most of these  fibers are round and scattered. They seem to 

represent a unique pool, because they form a distinct population apart from regular 

type 2A fibers (Figure 12). They may be encountered in DM1, but only in later stages 

of  pathology,  less  numerous  compared  to DM2,  and  in DM1  they most  often  co‐

express slow MyHC. 


It  is  not  clear  if  the  nuclear  clumps  and  other  very  atrophic  fibers 

represent  distinct  populations.  Examination  of  longitudinal  sections  suggests  that 

they  may  represent  a  single  population  of  fibers,  which  show  differential 

morphology depending on the number of nuclei trapped inside the slim fibers at the 

plane of sectioning (Figure 13). 



Figure  13.  DM2  muscle.  (A)  immunofluorescent  staining  (MyHC‐II)  showing  two highly atrophic fibers. One of them is devoid of nuclei (arrow 1), whereas the another (arrow 2) is filled with nuclei, shown as black here due to lack of nuclear counterstain. (B) DAB staining (MyHC‐II) of a highly atrophic type 2 fiber (arrows) filled with nuclei (blue). The twisty fibers appear fragmented in the 6 µm longitudinal sections.  


The nuclear clump fibers  in DM2 are morphologically  indistinguishable 

from  those  seen  in  neurogenic  atrophy,  where  they  form  as  an  end  product  of 

denervation  atrophy  in  the  absence  of  re‐innervation.  However,  in  neurogenic 

conditions the nuclei may be pyknotic whereas this feature may be absent in nuclear 

Page 78: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

78 |

clump fibers in DM2. However, no primary neurogenic involvement has been shown 

in myotonic dystrophies, which is supported by the lack of fiber type grouping. 


7.1.2. Protein expression in highly atrophic fibers (III, U) 


We carried out  further studies on protein expression  in DM2 and DM1 muscles  to 

identify  possible  differences  between  them,  which  could  lead  to  better 

understanding of  their differential muscle and  fiber  type  involvement.  In addition, 

due  to  the  presence  of  nuclear  clump  fibers  in myotonic  dystrophies,  similar  to 

neurogenic atrophy, we also  included a group of patients with various neurogenic 

disorders. The results of immunohistochemical analysis of the very atrophic fibers in 

DM2, DM1 and neurogenic atrophy are summarized in Table 7 and Figures 14‐16. 


Altogether, we characterized the expression of 24 proteins, which are 

involved  in muscle  contraction  and  Ca2+  handling,  regeneration,  denervation,  and 

apoptosis,  by  immunohistochemistry.  A  subset  of  the  proteins  show  preferential 

expression in type 2 fibers as described below. 


Myosin heavy chain  (MyHC)‐encoding genes  (MYH1,  ‐2,  ‐3,  ‐7 and  ‐8) 

are differentially regulated  in fast and slow fibers, and during muscle development. 

The  expression  of  MyHC‐IIa  isoforms  in  the  highly  atrophic  fibers  of  DM2  was 

confirmed  with  three  different  monoclonal  antibodies  raised  against  fast  type 

myosin heavy  chains  (Table 5), however, only  the  results obtained with MHCf are 

shown. As a new finding, we showed that the population of very small fibers in DM1 

co‐expressed  myosins  fast  IIa  and  beta/slow,  in  contrast  to  DM2,  where  they 

expressed  only  type  IIa.  In  neurogenic  atrophies,  virtually  all  small  atrophic  fibers 

expressed MyHC‐IIa,  showing moderate  to high  co‐expression of MyHC‐beta/slow. 

The MyHC‐pn  is widely  used  as  a marker  of  regeneration,  but  is  not  exclusive  to 

regenerating fibers [71]. There was high expression of the MyHC‐pn isoform in very 

atrophic fibers in all groups. Since the majority of very atrophic fibers in progressive 

neurogenic atrophy without any regeneration activity express MyHC‐pn, this may be 

turned on and expressed also by other mechanisms than regeneration. MyHC‐emb 

Page 79: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 79

positive  fibers  were  absent  in  most  biopsies,  showing  expression  in  a  few  DM 

biopsies only, with advanced muscle pathology. This observation  is congruent with 

its reported expression mostly in small basophilic regenerating fibers having survived 

severe injury, in muscular dystrophies and other necrotic myopathies [71]. A similar 

finding  was  observed  with  the  transcription  factor  myogenin  (MYOG),  and  the 

intermediate filament protein vimentin (VIM), which appear early during myogenesis 

and serve as regeneration markers in muscular dystrophies [71, 209]. 


Neural  cell  adhesion  molecule  (NCAM1)  has  distinct  roles  in 

myogenesis,  synaptogenesis,  and  synaptic  maintenance  [60].  It  is  transiently  re‐

expressed after denervation and during  re‐innervation, decreasing progressively as 

regeneration  proceeds  [324]. Hence,  it  has  been  a  candidate marker  for  recently 

occurred  denervation  atrophy  [71].  Interestingly, we  found  that  one  third  of  the 

atrophic fibers in DM2 abundantly expressed NCAM1, outnumbering the small fibers 

in  DM1,  and  even  more  intriguingly,  the  severely  atrophic  fibers  in  neurogenic 

atrophies. In fact, the pattern of NCAM1 expression was different in the latter group, 

showing positive signal more frequently in intermediate ‐ large fibers, which was not 

encountered  in  any  specimens  in  myotonic  dystrophies.  The  usage  of  NCAM1 

expression as a marker of neurogenic atrophies thus seems to be very limited. 


Because  we  were  preoccupied  with  the  question  of  why  the  highly 

atrophic type 2 fibers persist  in the DM2 muscle, we  investigated the expression of 

the  oncoprotein  BCL2  (BCL2)  in  the muscle  biopsies. Apoptosis  is  required  during 

normal  tissue  remodeling, development and  regeneration. BCL2  inhibits  cells  from 

entering apoptosis, but it also has a distinct effect on cell cycle [59]. There are rather 

controversial  reports  on  the  role  of  apoptosis  in  muscular  dystrophies  [285]; 

however, it seems not to be generally involved as a pathomechanism, at least not in 

myotonic  dystrophies  [186].  In  order  to  verify  this we  used  an  Ab  raised  against 

activated  Caspase‐3  (CASP3),  a  cysteine  protease  playing  a  key  role  in  executing 

apoptosis  in many cell types, and a commonly used marker  for apoptosis  [258]. To 

our surprise, the majority of the very atrophic fibers in DM2 expressed BCL2. 


Page 80: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

80 |

Table 7. Protein expression in highly atrophic fibers a by IHC. 

Protein Gene DM2 DM1 NA

MyHC-IIa MYH2 +++ ++ ++

MyHC-beta MYH7 (+) ++ ++

MyHC-pn MYH8 +++ +++ ++

MyHC-emb MYH3 (+) (+) -

SERCA1 ATP2A1 +++ +++ +++

fTnT TNNT3 +++ ++ +++

NCAM NCAM1 ++ + +

nNOS NOS1 + n/a n/a

BCL2 BCL2 +++ + ++

Caspase-3 CASP3 (+) n/a n/a

Dystrophin DYS ++ n/a n/a

Myogenin MYOG (+) (+) (+)

Vimentin VIM (+) + (+) aThe population of very atrophic fibers (≤ 6 µm in diameter) and nuclear clump fibers, not expected to be functional. NA, neurogenic atrophy; n/a, not assessed. Protein expression: +++, in >75% of highly atrophic fibers; ++, in 30‐74%; +, in 1‐15%; (+), in <1%; ‐, absent. The results indicate the proportion of the highly atrophic fibers expressing the given antigen in DM2 (n = 20), DM1 (n = 5), and NA (n = 9).  


In contrast, in DM1 BCL2 immunoreactivity was present in only one biopsy, in which 

approximately 5% of the very small fibers were positive. In neurogenic atrophies, 

BCL2 positive fibers were moderately frequent, albeit with a lot of dispersion among 

the samples (range 1‐100% positive cells). Caspase‐3 was not detected in DM2 

biopsies, supporting the prevailing concept of apoptosis not playing a major role. 

However, the combined high BCL2 expression and absent Caspase‐3 could offer a 

partial explanation to the persistence of the very atrophic, non‐functional type 2A 

fibers in DM2: the anti‐apoptotic BCL2 might prevent the cells from entering 

Page 81: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 81


Figure 14. Immunohistochemical panel showing key findings in DM2. Upper panel (I): (A) H&E; (B) MyHC‐IIa/x; (C) MyHC‐beta/slow; (D) MHCd; (E) NCAM1; (F) SERCA1; (G) fTnT;  (H)  DYS;  (I)  nNOS.  Lower  panel  (II):  (A1,2) MyHC‐IIa/x;  (B1,2) MHCn;  (C1,2) BCL2, showing the mutually exclusive staining of MyHC‐pn and BCL2. (A‐G) and (A1‐C2) DAB immunohistochemistry; (H, I) immunofluorescence with (H) Alexa 488 and (I) Alexa 564 labeled secondary antibodies. 

Page 82: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

82 |

 Figure  15.  Panel  showing  key  immunohistochemical  findings  in  DM1  (DAB).  (A) MyHC‐IIa/x; (B) MyHC‐beta/slow; (C) MHCpn; (D) MHCd; (E) NCAM1; (F) BCL2. 

 Figure 16. Panel  showing key  immunohistochemical  findings  in neurogenic atrophy (DAB).  (A) MyHC‐IIa/x;  (B) MyHC‐beta/slow;  (C) MHCpn;  (D) MHCd;  (E) NCAM1;  (F) BCL2.  

Page 83: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 83

apoptosis.  Another  interesting  finding  in DM2 was  revealed when  serial  sections, 

stained  for MHC‐pn  and  BCL2,  were  examined. Mutually  exclusive  expression  of 

these markers was often observed  (Figure 14, panel  II). We do not have a  specific 

explanation to this finding at the moment. 


We  also  observed  reduced  sarcolemmal  labeling  of  dystrophin  and 

neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in the very atrophic fibers in DM2 (Figures 14H 

and  14I).  Reduction  of  nNOS  was  prominent,  and  present  also  in  a  subset  of 

large/regular fibers. These findings, although not reported with DM2 before, may be 

non‐specific  given  that  several  sarcolemmal  proteins  are  reported  to  show  low 

immunoreactivity  in MyHC‐pn  positive,  small  atrophic  fibers  [71]. However,  nNOS 

has been suggested to affect excitation‐contraction coupling, its activity is regulated 

by  Ca2+/calmodulin,  and  its  dysregulation  has  been  implicated  in  some muscular 

dystrophies, which makes it an interesting targer for further investigation in DMs. 


We  also  studied  two  proteins  preferentially  expressed  in,  but  not 

restricted to  fast type 2  fibers: the  fast skeletal muscle troponin T  (fTnT/TNNT3), a 

sarcomeric thin filament component, and the Ca2+ ATPase SERCA1 (ATP2A1), both of 

which  are  involved  in  regulation  of  muscle  contraction  [40,  328].  SERCA1  was 

expressed  in  a majority of  the  atrophic  fibers  in  all  groups, whereas  fTnT  showed 

moderate to high expression in atrophic fibers in DM2 and DM1, and high expression 

in neurogenic atrophies. Unfortunately, even though not strictly  following the  fast‐

slow fiber distribution, neither of these proteins were differentially expressed in very 

atophic and regular type 2 fibers, thus giving no further  insight  into the question of 

why a subpopulation of type 2A fibers are subject to severe atrophy in DM2. 


It  should  be  noted  that  the  neurogenic  atrophies  was  the  most 

heterogeneous group, relative to MyHC‐pn, NCAM‐1 and BCL2 expression in the very 

small,  atrophic  fibers,  showing  more  dispersion  in  results  and  greater  standard 

deviation values. This is understandable because of their divergent etiologies. 

Page 84: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

84 |

7.1.3. Using fiber type II atrophy as a predictive factor for DM2 diagnosis 


The  highly  atrophic  type  2  fibers  appear  very  early  in  DM2  muscle  pathology, 

whereas  in DM1,  they  occur  only  later with  severe  general muscle  pathology.  In 

addition, as an important distinctive feature, the very atrophic fibers in DM1 express 

both slow and  fast MyHC  isoforms. Hence,  the early appearance of highly atrophic 

type 2 fibers, with or without nuclear clumps, can very well be used as a diagnostic 

tool, for screening of patients for molecular diagnostic testing. This finding has been 

successfully used for this purpose in Finland for almost a decade, resulting in several 

DM2 diagnoses  in patients, who otherwise  lacked key features of the disease, such 

as myotonia  (Udd, personal  communication).  The number of  internalized nuclei  is 

greater  in type 2 fibers  in DM2, and  in type 1 fibers  in DM1, further reinforcing the 

observation that the distinct fiber populations are differentially affected in DM1 and 

DM2  [20, 227].  In France,  the combination of atrophy and central nuclei  in  type 2 

fibers was found to predict DM2 even more efficiently [20]. 


7.1.4. Satellite cells (U) 


Defective  differentiation  in  primary myoblast  cultures  derived  from  satellite  cells 

have been reported with DM1 [88]. Similar findings have not been observed in DM2 

[219]. However, repeatedly in our DM2 cell cultures, myoblast proliferation after 4‐5 

passages has been limited even if differentiation seemed to be normal (Vihola et al. 

unpublished results). 


Pax7  is  considered  an  appropriate  protein marker  and  expressed  in 

quiescent  skeletal  muscle  satellite  cells  [241],  the  number  of  which  has  been 

reported  to  decline with  age  [252].  Consequently,  as  a  separate  experiment,  the 

number of  skeletal muscle  satellite  cells  in DM2  (n = 4), DM1  (n = 5), neurogenic 

atrophy (n = 4), and healthy control (n = 1) biopsies was assessed. Approximately 200 

fibers were  included per biopsy, counting all fibers  in randomly selected fields. The 

number of Pax7 positive cells  in satellite cell position was proportioned to the total 

Page 85: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 85

number of fibers; the results are indicated as the number of Pax7+ cells (in satellite 

cell position) per 100 muscle fibers counted (Table 8 and Figure 17). 



Table 8. Relative abundance of Pax7+ cells. 

C  7 

DM1  20 

DM2  25 

NA  20 

NA, neurogenic atrophy; C, healthy control 

Figure 17. Pax7 staining (DAB IHC) in DM2 muscle showing several satellite cells (black arrows) and nuclear clumps (N, white arrows). 



Other  Pax7+  cells  were  present  within  the  interstitial  space  of  the 

biopsies examined, which are  likely to represent a distinct pool of progenitor cells. 

These were not included in the number of satellite cells. The results indicate that the 

number of spindle‐shaped, Pax7+ cells  in satellite cell positions was  increased  in all 

disease  groups,  compared  to  control  biopsy. We  observed  the  highest  number of 

Pax7+  cells  in  DM2.  The  reported  proportion  of  satellite  cells  in  human muscle 

normally varies between 3‐6% of all muscle fiber nuclei [252], which is in accordance 

with our control muscle. The number of satellite cells is affected by age and muscle 

type  [31].  The  increase  of  satellite  cells  in DM2, DM1  and  neurogenic  atrophy  is 

probably caused by basic attempts to regenerate in response to muscle injury. These 

results  agree  with  previous  reports  of  DM2  and  DM1  that  indicated  unaffected 

satellite cell proliferation [88, 219]. 

Page 86: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

86 |

7.1.5. Expression of Ca2+ handling proteins in DM (IV) 


Because  several  genes  encoding  proteins  involved  in  Ca2+  handling  showed 

dysregulation  at  the mRNA  expression  level  for  both DM1  and DM2  (see  chapter,  we  analyzed  a  subset  of  them  for  protein  expression,  using 

immunohistochemistry and Western blotting. The analyzed proteins were  selected 

due  to  their central  roles  in Ca2+  release  (RYR1, DHPR, TRDN,  JPH1) and  re‐uptake 

(SERCA1,  SERCA2);  Ca2+  storage  (CASQ1,  CASQ2);  and  Ca2+‐dependent  signaling 

(PPP3CA, NFATC3). The results are summarized in Table 9. 


RYR1 and CASQ2 were clearly reduced by IHC for DM2, but WB failed to 

reproduce  the  finding,  showing  no  statistically  significant  difference  between  the 

groups  (Normal, DM1 and DM2). However, CASQ2 did show a trend towards being 

decreased in DM1 and DM2, but high variability between samples in all groups gave 

p‐values < 0.05. DM1  samples  showed a  similar  finding  for RYR1 and CASQ2, with 

additional  reduction  in DHPR  and  JPH1  staining. DHPR  showed  no  change  in WB, 

whereas  JPH1 was  significantly  reduced  in DMs  as  a  group. Notably,  total protein 

levels of RYR1 and SERCA1, both of which show aberrant splicing in DM, showed no 

dysregulation  in WB. We do not have a definitive explanation  for  the discrepancy 

between  IHC and WB  for RYR1 and CASQ2. However, both show  fiber‐type specific 

expression  (RYR1 shows higher expression  in  fast  fibers and CASQ2  in slow  fibers), 

which makes quantitative WB difficult to  interpret.  In addition, both accumulate  in 

the non‐functional highly atrophic fibers in DMs, which may contribute to the result. 


Seven  of  the  ten  proteins  analyzed  showed  up‐regulation  of  total 

mRNA level (Table 9). However, only four of them were dysregulated at total protein 

level,  including  SERCA2,  TRDN,  JPH1  and  calcineurin.  Furthermore,  none  of  the 

protein expression profiles were  completely  in accordance with mRNA expression, 

with  ATP2A2  and  JPH1  showing  reduced  total  protein  amounts  in  DM,  whereas 

TRDN  and  calcineurin  were  comparatively  increased  in  DM2  versus  DM1.  The 

observed contradiction between mRNA and protein expression is probably caused by 

translational block or dysregulation of mRNA processing  in DMs [114, 254, 256], or 

Page 87: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 87

other, yet unidentified regulatory events.  It  is worth noting that mRNA  levels alone 

are often not sufficient to predict the steady‐state protein levels, and therefore the 

changes  in mRNA  expression  should  be  validated  at  protein  level  to  be  able  to 

evaluate the true physiological relevance of the findings. 


The reduced expression of the Ca2+ release complex constituents, RYR1 

and  CASQ2  in  both DMs,  and  also  JPH1  in DM1  by  IHC may  constitute  the most 

relevant findings in this part of the investigation, as it may affect muscle contraction. 

This finding also emphasizes the need for using several methods in parallel, in order 

to obtain  information of expression at multiple  levels,  including mRNA and protein 

expression, and the subcellular localization of proteins. 



Table 9. Expression of Ca2+ handling proteins in DM1 and DM2. 

Protein  IHC  WB  EP 

  DM1  DM2     

RYR1  ↓  ↓  ‐  ‐ 

DHPR  ↓  ‐  ‐  ‐ 

SERCA1  ‐  ‐  ‐  ↑ 

SERCA2  na  ‐  N > DM2  ↑ 

CASQ1  na  ‐  ‐  ↑ 

CASQ2  ↓  ↓  ‐  ↑ 

TRDN  na  ‐  DM2 > DM1  ↑ 

JPH1  ↓  ‐  N > DM  ↑ 

Calcineurin  na  ‐  DM2 > DM1  ↑ 

NFATC3  na  na  DM2 > DM1  ‐ 

IHC, immunohistochemistry; WB, western blotting; EP, mRNA in expression profiling; ‐, no change; ↑, increased; ↓, decreased; na, not assessed 

Page 88: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

88 |

7.2.  Molecular  genetic  tools  for  DM2  mutation  identification  and  size 

determination (II) 


7.2.1. PCR‐based allele‐sizing (II) 


All  the PCR‐based  allele‐sizing methods, using primers  in mutation‐flanking exons, 

were consistent in showing only a single allele in all DM2 patients at the ZNF9 locus. 

However, the PCR methods using fluorescent detection, automated laser fluorescent 

(ALF) DNA analysis (Cy5‐label) and capillary electrophoresis (FAM‐label), were able to 

detect  alleles  differing  by  only  2  bp, which were  usually missed  by  conventional 

PAGE using 32P‐dCTP‐labeling. 


7.2.2. RP‐PCR and FIGE (II) 


RP‐PCR and FIGE methods both identified all 12 known DM2 patients in group 1, and 

14 new DM2 mutations in cohort 2 with previously undefined muscular disorders (II). 


7.2.3. In situ –hybridization (II) 


Due  to  the huge  size,  repeat nature, and  somatic  instability of  the DM2 mutation, 

conventional molecular  genetic methods  are  insufficient  for  its  identification  [18, 

66]. When the DM2 mutation was  identified  in 2001, and for some years following, 

there  was  no  reliable  genetic  testing  widely  available.  The  development  of  an 

accurate genetic test for DM2 mutation verification based on muscle biopsy material 

was thus pursued here; bearing in mind that conventional methodology and imaging, 

available  in  any medical  laboratory  or  pathology  department  could  be  employed. 

Furthermore,  it was considered that this approach should be able to determine the 

DM2 mutation expansion size, which had continued  to prove extremely difficult  to 



To  meet  these  requirements,  two  novel  in  situ‐hybridization  (ISH) 

methods  were  developed  for  the  direct  visualization  of  the  DM2  mutation  in 

Page 89: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 89

genomic  DNA:  chromogenic  ISH  (CISH)  on  muscle  biopsies,  and  fiber‐FISH  on 

extended DNA  fibers derived  from peripheral blood  lymphocytes. The  former was 

found  suitable  for  routine  molecular  diagnostics,  and  the  latter  was  especially 

efficient for estimating the mutation size. 


The  DM2  mutation  detection  in  the  two  methods  was  based  on 

digoxigenin  end‐labeled  oligonucleotide  sense probes  [(CCTG)8]. Antisense  (CAG)10 

probes had previously been used for showing the accumulated mutant mRNA in the 

ribonuclear inclusions in DM1 [283] and (CAGG)8 in DM2 [158]; however, using signal 

amplification methods, polymer amplification  technique  in CISH, and  two  layers of 

fluorescent labels in fiber‐FISH, we were able to increase the sensitivity and directly 

visualize the mutation. 


In  order  to  validate  the  new  ISH  methods;  to  investigate  the 

concordance  between  the  high‐accuracy methods  RP‐PCR  and  FIGE;  and  between 

three  different  PCR‐based  allele  sizing methods  for  primary  screening,  a  blinded 

study  involving  four  laboratories was performed.  Two  sets of  samples were used: 

previously confirmed DM2‐patients (n = 12), and a cohort of patients with undefined 

neuromuscular disorder, with biased selection towards myotonia symptoms (n = 31). CISH (II) 


When the sense (CCTG)8 probe was used for hybridization, the chromogenic in situ‐

hybridization method successfully identified the DM2 mutations directly as a single‐

spot  signal per nucleus  in all  known DM2 patients´  frozen muscle biopsies  (Figure 

18D). Similarly,  the  same 14 novel DM2 mutations  in group 2, as determined with 

RP‐PCR and FIGE, were readily  identified by CISH.  In contrast, CISH  failed to detect 

the genomic mutation directly  in paraffin‐embedded specimens  (n = 9), most  likely 

due  to  loss  of  sensitivity  during  the  long  fixation  and  embedding  procedure. 

However, the ribonuclear  inclusions were  identified with the antisense probe  in all 

DM2 specimens, including the paraffin sections. Frozen muscle samples from healthy 

Page 90: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

90 |

individuals  and  DM1  patients  remained  negative  with  both  sense  and  antisense 

probes, confirming the specificity of the protocol.  


  This method  provides  an  improvement  in  specificity  compared  to  a 

previously  described  FISH‐method,  where  the  (CAG)10  antisense  probe,  directed 

against the DM1 mutant transcript, detected the ribonuclear  foci  in both DM1 and 

DM2  [174].  In  theory,  by  lowering  the  stringency  conditions  in  the  hybridization, 

similar  (CCTG/CTG)n or  related expansions could be screened. However, such  trials 

have been unsuccessful so far. 


Molecular  genetic  testing,  based  on  genomic  DNA  derived  from 

peripheral blood,  is  currently  the  standard diagnostic method. However,  the CISH 

method we developed here was used in Finland as a primary diagnostic method for 5 

years  (2003  –  2007),  during which  time  105  patients were  confirmed  with  DM2 

mutation. At the same time, an RP‐PCR test was being optimized, and used side by 

side  with  CISH.  As  quality  control  of  DM2  mutation  verification,  all  single‐allele 

samples  determined  to  be  negative with  RP‐PCR/CISH were  sent  to  Prof.  Krahe´s 

laboratory in Houston, Texas for FIGE analysis. In 8 years, only 1 false negative result 

was obtained with CISH, in a patient carrying a very short expansion of (CCTG)55 (Udd 

et al. unpublished results). Also RP‐PCR has produced 1 false negative result among 

180 DM2 patients in 8 years, signifying 99 % sensitivity for both methods. The exact 

limit  for CISH sensitivity  is not known. The very short expansions,  like  (CCTG)55, do 

not necessarily  form ribonuclear  foci, resulting  in negative outcome with antisense 

probe as well.  It has been reported with DM1 that ≤ 100 CTG repeats do not  form 

detectebale foci with FISH [35]. 


CISH method is still valid as a research and diagnostic tool. For patients 

with  inconclusive first results with RP‐PCR and clinical features of DM2, CISH  is still 

applied  as  part  of  the  diagnostic  setting.  In  addition,  since  CISH  is  capable  of 

detecting accumulated mutant RNA  in paraffin‐embedded  tissues,  this method can 

and has been used for retrospective studies on several kinds of tissue, as old as 17 

years  [19].  CISH  has  certain  advantages  over  FISH  in  some  situations.  Performing 

Page 91: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 91

FISH on paraffin‐embedded specimens  is challenging because of strong background 

fluorescence due to the procedure. Old surgical specimens taken  for other reasons 

are usually formaldehyde‐fixed, paraffin‐embedded and stored at room temperature 

for decades. Even  in such specimens, the RNA  in ribonuclear  inclusions has proven 






Figure 18. showing the in situ ‐hybridization findings in DM2. (A) Fiber‐FISH: the DM2 expansion mutation  is  revealed by binding of  the  sense  (CCTG)8 probe  (fluorescein, green), while the flanking sequences are visualized by 814L21 (TRITC, red). (B) Muscle biopsy with macrophage  invasion  in a necrotic  fiber. Accumulated RNA  is visualized (dark  brown)  using  antisense  (CAGG)8  probe.  (C)  Fibroblast  nuclei  showing ribonuclear foci with (CAGG)8 probe. (D) Myonuclei in section detected with the sense probe,  revealing one  spot per nucleus,  corresponding  to  the mutation.  (E) Nuclear clump fiber detected with antisense probe, showing accumulated mutant RNA. 

Page 92: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

92 | Fiber‐FISH (II) 


In  fiber‐FISH,  co‐hybridization  of  the  oligonucteotide  probe  (CCTG)8/(CAGG)8,  and 

the BAC‐clone 814L21 covering the DM2  locus, hence flanking the repeat mutation, 

resulted  in  visualization of  the mutation directly  in  its  locus  in  all 5 DM2 patients 

analyzed from groups 1 and 2 (Figure 18A). The hybridization signals for both sense 

and antisense oligonucleotide probes were always localized to a gap at the telomeric 

end of the BAC814L21 signal. The mutation size measurements were performed by 

using  the centromeric 115 kb portion of  the 814L21  for calibration. The estimated 

mutation lengths in the Finnish patients, obtained with this method varied between 

2.4  kb  and  23.6  kb within  the whole  group, while  the mean  size of  all mutations 

measured  was  approximately  10  kb,  which  was  slightly  smaller  compared  to 

estimations done with FIGE. The extreme variation observed between the individual 

DNA‐molecules measured may  be  largely  explained  by  an  intrinsic  feature  of  the 

DM2 mutation: the profound somatic instability and mosaicism. 


The Finnish patients all had an expansion mutation approximately 17‐

19  kb  in  size,  as  estimated  by  FIGE  that  apparently was more  sensitive  for  larger 

expansions.  In  addition,  an  Italian  DM2  patient with  a  relatively  short  expansion 

mutation (approximately 4 kb) was used to test the sensitivity of the method, with a 

positive result, hence establishing the sensitivity boundary to (CCTG)1000 so far. 


Fluorescent  in situ hybridization (FISH) offers an alternative means for 

the  repeat  length  measurement,  when  performed  on  single  extended  DNA 

molecules  (fiber‐FISH).  However,  it  requires  highly  specialized  methodology  and 

equipment  for  analysis,  thus  PCR‐based  Southern modifications  such  as  FIGE  and 

others have remained the major methods applied for size estimation [18, 34, 51, 66, 

119, 199]. 

Page 93: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 93

7.3. Splice variant analysis (III, IV) 


Splice variant analysis (SVA) for detecting aberrant splicing events of TNNT3 (fTnT), 

LDB3  (ZASP), RYR1  (RYR1) and ATP2A1  (SERCA1) was performed using RT‐PCR and 

cDNA prepared from total muscle RNA. The primers were designed to have binding 

sites either  in exons  flanking  the differentially  spliced exon, or  in  the differentially 

spliced exon itself.  


  TNNT3  encodes  the  sarcomeric  thin  filament‐associated  troponin 

complex  subunit  T,  involved  in  the  execution  of muscle  contraction.  The  TNNT3 

gene,  expressed  predominantly  in  fast  type  2  fibers,  shows  extensive 

developmentally  regulated  differential  splicing  [328].  The  fetal  (F)  exon,  located 

between exons 8a and 9a, is included in the two fetal mRNA isoforms (A, 225 bp and 

D,  188  bp).  Three  adult  isoforms  are  expressed  in  skeletal  muscle  [328].  In 

agreement  with  this,  we  detected  3  isoforms  both  at  mRNA  and  protein 

(approximately 30 kD) levels, expressed in relatively equal amounts in all samples. In 

DM1 and DM2  samples,  two additional  isoforms,  corresponding  to A and D, were 

identified at  the mRNA  level,  the  isoform A being dominant  (Figure 19). When  the 

proteins were  analyzed using WB  the presence of  a  fourth,  slightly  larger  isoform 

corresponding  to  the  fetal  isoform A, was  recognized  in 60% of  the DM2  samples. 

This  fetal  isoform was not present  at  the protein  level  in healthy  control or DM1 

samples, suggesting that it may have a greater role in DM2 pathogenesis compared 

to DM1. 


  The  roles  of  the  Z‐disc  alternatively  spliced  PDZ‐domain  containing 

protein (ZASP) are not fully elucidated. It interacts with α‐actinin, and is localized to 

the sarcomeric Z‐disc of both skeletal and cardiac muscles  [14]. Mutations  in LDB3 

cause  diverse  muscular  disorders,  including  dilated  cardiomyopathy  [304]  and 

myofibrillar myopathy [99, 270]. Two LDB3 exons (4a and 7) show tissue‐dependent 

expression patterns with predominant expression in the heart muscle [113], and the 

mutations causing skeletal myopathies are found in exon 6. 


Page 94: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

94 |





  When  analyzing  ZASP  expression  by WB, we  observed  two  bands  of 

MWs  approximately 32  and 78  kD  in healthy  controls,  corresponding  to  the  short 

and long skeletal muscle isoforms previously reported [113]. In all DM2 patients and 

most  DM1  patients  analyzed,  an  additional  band  of  approximately  95  kD  was 

detected, which was more pronounced in DM2 patient samples. Altogether four RP‐

PCR assays were designed to identify the larger ZASP isoform at the mRNA level. The 

results revealed the presence of a long cardiac isoform, including both exons 4a and 

7,  in DM1 and DM2 skeletal muscle biopsies. Quantitative analysis showed that the 

relative proportion of both cardiac exons was greater in DM2 compared to DM1. The 

retention  of  exon  7  has  previously  been  reported  for  both DM1  and DM2  at  the 

mRNA  level [156, 165]. A novel DM specific  isoform encompassing both exon 7 and 

4a was demonstrated. Furthermore, the presence of DM specific abnormal protein 

products appeared to be greater in DM2, although also evident for DM1 samples. 


The Ca2+  release  channel RYR1  is also expressed preferentially  in  fast 

muscle  fibers,  and  alternative  splicing  of  its  two  exons,  70  and  83,  is  under 

developmental regulation [91, 225]. SVA showed the exclusion of the RYR1 exon 70 

in DM2 samples, giving rise to the ASI(‐) isoform, lacking part the inhibitory domain, 

as previously reported only for DM1 [133, 134]. In this study, the difference between 

Figure 19. Distribution of TNNT3 isoforms.  Proportions of the different TNNT3 mRNA isoforms detected in DM1, DM2 and controls. The fetal isoform A (225 bp; green) is increased in DM1, and even more pronounced in DM2. (DMx, non‐DM1/DM2 muscular dystrophy; N, normal/healthy control) 

Page 95: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 95

DM1  and  healthy  controls  was  not  statistically  significant,  probably  due  to  high 

variability  among  samples,  and  small  number  of  DM1  samples  (n  =  3)  analyzed. 

Unfortunately,  the  RYR1  protein  was  too  large  (565  kD)  for  distinguishing  the 

isoforms by WB. Therefore, we  failed  to  show  the presence of  the aberrant RYR1 

isoform at protein level. 


  SERCA1  ATPase  Ca2+  reuptake  pump  shows,  similarly  to  RYR1, 

preferential  expression  in  fast  muscle  fibers.  ATP2A1  contains  an  alternatively 

spliced exon 22, which  is present  in the adult  isoform, but excluded  from the  fetal 

isoform  [39].  With  RP‐PCR,  we  confirmed  the  presence  of  the  fetal  isoform 

(ATP2A1B) in skeletal muscle of DM1 patients [134], and, as a novel finding, in DM2 

patients  as  well.  ATP2A1  also  showed  a  greater  relative  proportion  of  the  fetal 

isoform  in DM2 patients  compared  to DM1. As SERCA1  is also  large  (110 kD),  the 

exclusion  of  a  single  exon  could  not  be  demonstrated  by WB,  due  to  the  limited 

resolution of the method. 


In summary, SVA showed that the expression of fetal  isoforms of four 

genes (TNNT3, LDB3, RYR1 and ATP2A1) were increased in both DM1 and DM2, and 

that  the  relative  proportions  of  the  immature  forms  were  even  higher  in  DM2 

patient  muscle  (even  though  a  statistically  significant  difference  could  not  be 

confirmed for RYR1, possibly due to small samples number). The splicing of all these 

four  genes  is  regulated  by  MBNL1,  and  given  that  MBNL1  has  been  shown  to 

accumulate more  heavily  in  the  ribonuclear  inclusions  of DM2  compared  to DM1 

[156], we suggest that MBNL1  loss‐of‐function may play a greater role  in DM2 than 

in  DM1.  In  case  of  the  sarcomeric  proteins  fTnT  (TNNT3)  and  ZASP  (LDB3),  the 

corresponding  fetal protein  levels were also  increased, showing prominent steady‐

state protein  levels  in muscle. This  strengthens our hypothesis  that  these  changes 

may  have  biological  and  pathological  relevance. Because of  (dys)regulation  at  the 

level of translation and protein degradation, the mRNA expression of a given gene or 

isoform  alone  does  not  necessarily  indicate  the  presence  of  the  corresponding 

protein product. The developmental protein isoforms of RYR1 and SERCA1 could be 

indicated, for example, by raising isoform‐specific antibodies. 

Page 96: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

96 |

The  findings  concerning  fTNT,  RYR1  and  SERCA1  were  particularly 

interesting, as  their expression  is concentrated  in  the  fast  fibers.  In addition, all of 

them  show  relatively  high  expression  in  the  population  of  very  atrophic  fibers  in 

DM2  and DM1. However,  the  impact  of  the  highly  atrophic  fibers  on mRNA  and 

protein expression results obtained with expression profiling, splice variant analysis, 

and Western blotting is not known. The methods used in this study were not able to 

show whether the very atrophic fibers expressed relatively different proportions of 

the  fetal  isoforms compared to the regular,  functional  fibers. Thus, the question of 

why  a  particular  subpopulation  of  type  2  fibers  is  susceptible  to  atrophy  remains 

unsolved.  A  method  capable  of  analyzing  mRNA  and  protein  expression  in  the 

atrophic fibers separately would be warranted, such as laser micro‐dissection. 


Reports  on  aberrant  splicing  in DM1  and DM2  patients  demonstrate 

extreme  variation between  samples.  In mouse models  such  variation  is often  less 

prominent, due to more homogenous genetic background [134]. In a conclusion, the 

significance of aberrant splicing is expected to be highly variable between individual 



Although extensive aberrant splicing has been identified in DM, recent 

research  indicated  that  it  is  not  a  completely  DM‐specific  pathomechanism.  In  a 

study  of  Mbnl1‐deficient  and  CUGBP1‐overexpressing  mouse  models,  up  to 

approximately 50% of aberrant splicing events were found to be caused by neither 

Mbln1 nor CUGBP1 [124]. Similarly, Bachinski et al. (2010) showed that the abnormal 

splicing of MEF2A and MEF2C was not  restricted  to DM, but was also observed  in 

other muscular dystrophies [16]. 


7.4. Expression profiling (III, IV) 


In  order  to  investigate  mRNA  expression  in  myotonic  dystrophies,  a  global 

expression profliling was performed using Affymetrix U133 Plus2.0 chips and muscle 

biopsies  from  healthy  control  individuals  and  DM1  and  DM2  patients.  Instead  of 

profiling the entire set of genes on the array, a  list of 327 probe sets comprising a 

Page 97: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 97

muscle‐specific  gene  array  was  generated.  Subsequently,  a  second  list  of  2,490 

probe  sets was  created,  consisting  of  genes  involved  in Ca2+  regulation,  and  their 

expression was  analyzed  in DM. The entire  gene expression data  can be  found  at (GEO series numbers GSE7014). 


7.4.1. Muscle‐specific gene array (III) 


Comparing DM1 and DM2 patients  to controls, 11% of  the probe  sets covering 28 

unique genes showed differential regulation. In the supervised two‐way hierarchical 

cluster analysis, where DM1 and DM1 patients  clustered  together,  the majority of 

the dysregulated genes (86%) showed increased mRNA expression in DMs compared 

to  controls.  Three  genes  showed  differential  regulation  between  DM1  and  DM2: 

CAMKK2 (downregulated in DM2), CALML6 and MEF2C (both upregulated in DM2). 


Cluster  analysis  revealed  four  major  gene  groups:  one  group  with 

down‐regulated genes, and  three groups with up‐regulation. Group 1  consisted of 

four  down‐regulated  genes.  In  groups  2  and  3,  the MYH  genes  (ten  altogether) 

showed  over‐expression  at  the  mRNA  level.  The  group  4  included  several 

transcription factor encoding genes, as well as genes encoding for proteins involved 

in Ca2+ handling. 


Interestingly,  the MEF2  family  of  transcriptional  effectors  of  diverse 

Ca2+  signaling pathways  [179]  showed major dysregulation. One  isoform of MEF2B 

was down‐regulated, whereas MEF2A and MEF2C, as well as  the homebox protein 

SIX1 were up‐regulated in both DM1 and DM2. A few differences were seen between 

DM1 and DM2, including higher up‐regulation of NFATC4 and one MEF2C isoform in 

DM2. NFATC4  has  been  shown  to  drive MyHC‐2B  expression  (the  rat  homolog  of 

human MYH4) [47]. SIX 1 is implicated in establishing and maintaining the fast fiber 

phenotype [98], similarly to MEF2A [2, 3]. MEF2C, on the other hand, plays an

Page 98: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

98 |


Figure 20. LDB3 exon‐specific microarray. The heatmap shows  inclusion of the  fetal exons 4a (red arrow on left) and 7 (red arrow on right) in DM1 and DM2 (4a also in non‐DM disease controls, DMx), but not  in healthy controls (Normal). (Figure kindly provided from Prof. Ralf Krahe, Dr. Linda L. Bachinski and Dr. Keith Baggerly, all from the University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, TX, USA.)   


important  role  in  adult muscle,  as  it  drives  the  transcription  of  several  structural 

genes,  including  those  encoding  sarcomeric  proteins  [229].  As  a  conclusion,  the 

extensive  dysregulation  of  the  myogenic  transcription  factors  may  be  of  major 

importance in DM pathology, as they regulate several downstream effector genes. 

LDB3  was  not  among  the  genes  showing  dysregulation  at  the  total 

mRNA level in the first analyzed set of sarcomeric and other muscle‐specific protein 

encoding genes. However,  in a separate expression profiling experiment, the exon‐

specific expression  array,  a novel  aberrant  splice event was  identified  for  LDB3  in 

DMs,  the  inclusion  of  fetal  exon  4a  (Figure  20).  This  aberrant  splice  variant was 

further validated using SVA and WB (Results 7.3.).

Page 99: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 99

7.4.2. Ca2+ gene array (IV)  

Several genes encoding Ca2+ handling proteins were among the dysregulated genes 

in  the  first EP analysis of muscle‐specific genes. When  Ingenuity Pathway Analysis 

was performed on all genes showing dysregulation in the the entire EP data set, Ca2+ 

signaling was identified as the single most significant canonical pathway (Sirito et al., 

unpublished  results).  To  investigate  the  expression  of  these  genes  in  DMs,  we 

generated a  second  list of 2,490 probe  sets  (1,039 unique genes)  involved  in Ca2+ 

metabolism.  Of  them,  200  (8%)  probe  sets were  dysregulated  in  DM1  and  DM2 

compared to controls. Of the dysregulated probe sets 82% showed increased mRNA 

expression in DMs. When the 200 dysregulated probe sets were compared between 

DM1  and DM2, 21 of  them,  representing 16 unique  genes,  showed differences  in 

mRNA expression. 


The  expression of  a  subset of  the dysregulated  genes playing pivotal 

roles in muscle Ca2+ metabolism was studied at the protein level (Table 9). Many of 

the genes  involved  in  regulating  the Ca2+  release  from SR showed up‐regulation  in 

both DMs,  including TRDN  (triadin), ASPH  (junctin),  JPH1  (junctophilin), CASQ1 and 

CASQ2 (Table 9). The Ca2+ re‐uptake channel encoding genes ATP2A1 (SERCA1) and 

ATP2A2  (SERCA2) showed up‐regulation  in both DM1 and DM2. Of  these, ATP2A2, 

TRDN abd JPH1 showed differential expression between DM1 and DM2, with higher 

expression in DM1. 


Similar  to aberrant splicing, dysregulation at  the  level of  transcription 

may also be a more common phenomenon  in muscular dystrophies than previously 

estimated. An extensive study comparing total mRNA expression by EP in HSALR and 

Clc1‐deficient mice  suggested  that  a  significant  proportion  of  the  transcriptional 

dysregulation could be  induced by unspecific secondary changes, such as myotonia 

[212].  In  the  same  study, dysregulation of  several genes  involved  in Ca2+  signaling 

was reported, similar to our results. Given the central role of Ca2+ in muscle signaling 

and  contraction,  its  strict  regulation  is  highly  important,  and  the  aberrant  gene 

expression  reported  herein  may  well  be  significant  for  DM  pathophysiology. 

Page 100: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

100 |

However, the expression should be also validated at protein level. A high‐throughput 

method,  such  as  protein  expression  array, would  be more  suitable  for  large‐scale 

quantification. When analyzing  single proteins  in detail, however,  the  IHC and WB 

methods represent a good basic set of tools. 

Page 101: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 101



Our recent epidemiological work suggests that DM2 is far more common than DM1, 

at  least  in  Finland.  Despite  adequate  attention  to  the  search  for  and molecular 

testing of DM2  in many  centers  in Finland,  it  is obvious  that  the  large majority of 

patients  are  still  not  identified.  We  are  currently  aware  of  approximately  300 

patients  in  Finland,  whereas  the  number  of  symptomatic  patients  based  on  the 

mutation  frequency  in  the population should be more  than 1000. This discrepancy 

may be explained  in part by the fact that the mean clinical phenotype  is much  less 

severe  than  the phenotype  for DM2  reported  thus  far. Many patients may have a 

very late onset of symptoms, after age 60 or 70, when symptoms of myalgia and/or 

mild proximal weakness are  taken  for normal aging and do not necessarily  lead  to 

neuromuscular  examinations.  Furthermore,  whether  the  DM2  mutation  in  all 

circumstances is 100% penetrant is not fully settled. 


In  light of these facts, the diagnosis of DM2  is an enormous challenge 

for  the  clinician.  However,  there  is  a  clear  rationale  as  to why  DM2  diagnostics 

should  be  enhanced.  DM2  patients may  present  with  severe  cardiac  conduction 

defects, with risk of sudden cardiac death, thus a cardiac surveillance similar to DM1 

patients  is  recommended.  DM2  patients  are  frequently  misdiagnosed  as  having 

polymyositis,  unexplained  hepatopathy,  chest  pain,  fibromyalgia,  and  other 

conditions,  which  may  lead  to  extended  immunosuppressive  treatments  or 

unnecessary  liver  biopsy. Myalgic  pains  may  be  disabling,  sometimes  leading  to 

incapacity  for  work,  which  may  cause  socio‐economical  problems.  Many  of  the 

known  DM2  patients  in  Finland  had  long  histories  of  seeking  medical  help  and 

advice, before reaching final diagnosis by DM2 genetic testing. The definite diagnosis 

in  these  cases  is  a  therapeutic  relief,  explaining  the  enigmatic  symptoms  and 

correcting the management of the patient. 


  Major issues persist concerning the need for a better understanding of 

the disease pathogenesis in DMs. The mutations are of course the sole cause of the 

Page 102: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

102 |

diseases, but which of  the downstream effects of  the mutations  contribute  to  the 

pathology,  is  less  clear.  For  a  while  the  toxic  mutant  RNA,  accumulating  as 

ribonuclear  foci  sequestering  proteins  needed  for  proper  alternative  splicing, 

seemed  to have clarified  the molecular basis of disease. However, nuclear  foci are 

not mandatory  for  the disease, and  there are also other  shortcomings  in  trying  to 

explain  all  the  pathology  through  this  mechanism.  MBNL1  is  more  heavily 

sequestered  in DM2 nuclear  foci,  rendering  the  soluble MBNL1  fraction  smaller  in 

DM2. This would be expected to  lead to a more severe muscle phenotype  in DM2, 

including myotonia based on greater CLC‐1 splicing abnormality in DM2 compared to 

DM1, but this is not the case. On the contrary, myotonia is much less severe and can 

be absent even in EMGs of DM2 patients, indicating other mechanisms in addition to 

MBNL1 sequestration are of importance. The appearance of these large ribonuclear 

foci in all cell types very early at developmental stages is also in some disagreement 

with the late onset of disease in DM2. 


There  is  no  conclusive  evidence  of  CUGBP1  involvement  in  DM2 

pathology, although  it apparently plays a role  in DM1. The cause of congenital and 

early onset forms  in DM1 and the  lack of these  in DM2 have no definite molecular 

explanation as yet. 


The muscle wasting, considered  to be  the major cause of disability  in 

DM1  and  DM2  is  not  very well  understood  either.  Even  though we  have  shown 

abnormal splicing of sarcomeric protein coding genes,  it  is far from clear that these 

abnormalities  form  the  major  cause  of  progressive  muscle  loss.  The  distinctive 

histopathological  difference  between  DM1  and  DM2,  the  presence  of  the  highly 

atrophic type 2 fibers early in DM2, remains unsolved. In this study, we did not find 

any conclusive explanation to the question of why a subpopulation of  fast type 2A 

fibers is preferentially vulnerable in DM2. 


The new exciting findings of abnormal translation and protein turnover 

in DMs are of major  interest and require further  investigation. With more research 

done,  it becomes clearer  that  the DM mutations seem  to affect a  large number of 

Page 103: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 103

molecular pathways more  globally within  the muscle  cell. On  the other hand,  if a 

therapeutic cure  to abolish  the dominant gain‐of‐function of  the mutant  transcript 

can  be  achieved,  these  known  and  unknown  downstream  effects  should  also  be 


Page 104: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

104 |



This  thesis  work  was  carried  out  at  the  Folkhälsan  Institute  of  Genetics,  the 

Department of Medical Genetics, University of Helsinki, and Vaasa Central Hospital, 

Department of Pathology, during  the  years  2002  –  2011.  The  former  and present 

heads  of  the  departments,  professors  Anna‐Elina  Lehesjoki  and  Päivi  Peltomäki, 

Docent  Irma  Järvelä,  as  well  as  Gustav  Granroth  and  Kalle  Salo  are  thanked  for 

providing excellent  facilities and working environments  for scientific research.  I am 

especially grateful  to Anna‐Elina  Lehesjoki  for  signing numerous  recommendations 

for grant applications, Irma Järvelä for serving as the custodian, and Gustav Granroth 

and Kalle Salo for their flexibility and positive attitude towards biomedical research. 


The  following  foundations are warmly  thanked  for  funding  this  thesis 

project:  the  Emil  Aaltonen  Foundation,  the  Biomedicum  Helsinki  Foundation,  the 

Folkhälsan Research Foundation, the Helsinki University Research Funds, the Liv och 

Hälsa  Foundation,  the  Paulo  Foundation  and  the  Vaasa  Central  Hospital  District 

Research Funds.  In addition,  the Academy of Finland, Association Française Contre 

les  Myopathies,  the  Helsinki  University  Chancellor´s  Travel  Grants,  the  Juselius 

Foundation  and  the  Oskar  Öflund  Foundation  are  acknowledged  for  financially 

supporting  my  participation  in  international  congresses,  and  the  neuromuscular 

research projects in general. 


It has been a privilege to work for many years in the research group of 

my  supervisor,  Professor  Bjarne  Udd,  whose  truly  enthusiastic  attitude  towards 

science  has  served  as  a  constant motivating  power  over  the  years. Bjarne  has  an 

incredible  capability  to  pull  the  strings  regardless  of  the  ever  growing  number  of 

projects  he  is  involved  in,  not  to  mention  the  vast  amount  of  knowledge  he 

possesses in the field of neuromuscular diseases. In addition, he is the one to remind 

us of the fundamental reason what we are doing this research for: the patients. 


I own my gratitude  to all my co‐authors  for  their contributions  in  the 

original publications: performing  laboratory experiments, providing patient samples 

and  helping  to  prepare  the manuscripts.  Especially,  Professor  Ralf  Krahe  and  his 

research  group  in  Houston,  Texas  are  thanked  for  introducing  a  completely  new 

world of expression profiling,  and  for  their  indispensable  scientific  contribution  to 

the shared publications. Professor Hannu Kalimo  is particularly  thanked  for  fruitful 

discussions which significantly improved the readability of the publication III. 


Page 105: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 105

The external reviewers of the thesis manuscript, Docent Katarina Pelin 

and  Professor  Caroline  Sewry  are  thanked  for  their  constructive  and  useful 

comments on the thesis manuscript. 


I would like to thank the Vaasa Central Hospital and the Department of 

Pathology, where  the  first  part  of  this  study was  carried  out. Marcus  Svartbäck, 

Edmond Nushi, Margaretha Pada, Ulla Frejman, Tiina Högström, Camilla Österman, 

Tiina  Tammenpää,  Anette  Wikberg,  Maikki  Mäki  and  of  course  Raimo  Brax  are 

thanked  for  creating  a  pleasant  working  atmosphere  despite  the  sometimes 

depressing work items. I truly enjoyed working at VKS. 


The Udd neuromuscular group co‐workers are warmly thanked: Jaakko 

Sarparanta for  invaluable help with  image processing during the preparation of this 

thesis, as well as for serving as an endless source for ideas and answers concerning, 

well,  any  questions;  Marjut  Ritala  and  Helena  Luque  for  excellent  technical 

assistance and positive attitude; pH Jonson for PC‐support, and for always being so 

kind  and  helpful.  Also,  thanks  to  my  other  neuromuscular  group‐mates,  Peter 

Hackman,  Merja  Soininen,  Mark  Screen,  Sara  Hollo,  Anni  Riihiaho,  Jeanette 

Holmlund‐Hampf  and  all  the  former members  of  the  group  at  FIG.  The  Tampere 

division:  Yinka  Raheem,  Tiina  Suominen,  Sanna  Huovinen,  Sini  Penttilä,  Satu 

Luhtasela,  Henna‐Riikka  Koskinen  and  all  the  others,  warm  thanks  for  scientific 

collaboration and cheerful travel company. Huge thanks to you all! 


My  long‐term  C305b  (“tarkkis”)  roommates  Saara  Tegelberg,  Hanna 

Västinsalo and Maria Kousi are  thanked  for  sharing  the ups and downs of being a 

Ph.D.  student,  assistance  in  various  practical  scientific  issues,  but most  of  all,  for 

friendship and off‐science discussions concerning everyday life, sometimes very odd 

issues,  and  everything  in  between. Without  Hanna  I would  not  be  able  to  track 

myself  in  IMDb! Warm  thanks also  to  the more  recent member of  the gang, Kaisa 

Kettunen, and  the  former  inhabitants: Anna‐Kaisa Anttonen and  Juha  Isosomppi:  it 

has  been  a  pleasure  to  share  an  office with  you.  In  addition,  I  own my warmest 

gratitude to all the people at the Folkhälsan Institute of Genetics, past and present, 

for on‐ and off‐science discussions, company during lunch and coffee breaks, and for 

creating a  cheerful atmosphere at FIG all  these years: Mervi Kuronen, Vilma‐Lotta 

Lehtokari, Anni Laari, Maria Sandbacka, Anne Saarinen (special thanks for last minute 

advice  and  support!),  Otto  Manninen,  Ann‐Liz  Träskelin,  Mubashir  Hanif,  Tarja 

Joensuu,  Outi  Kopra,  Anne  Polvi,  Inken  Körber,  Olesya  Okuneva,  Paula  Hakala, 

Marilotta  Turunen  (thanks  for  help  with  cell  lines!),  Hanna  Hellgren  and  Teija 

Toivonen.  Warm  thanks  also  to  the  former  FIG  co‐workers  Eija  Siintola,  Kirsi 

Alakurtti,  Reetta  Vainionpää,  Kati  Donner,  Nina  Aula,  Riikka  Hämäläinen,  Hanne 

Ahola, Laura Mustaniemi, Jukka Kallijärvi and Liina Nevalaita. 

Page 106: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

106 |


Jaana  Welin‐Haapamäki,  Marjatta  Valkama,  Aila  Riikonen,  Sinikka 

Lindh,  Stephan  Keskinen  and Madeleine  Avellan  are  thanked  for  helping with  all 

those little practical things over the years. 


A huge thanks to all my “old” (no offence!) friends – Heli, Burse, Maarit, 

Itu, Leila and Eve,  for bringing all the good things  in my  life over the past years –  I 

would not be me without you. 


Finally,  I would  like  to  thank my  parents  Pirjo  and  Tapio  for  always 

letting me  choose my own path, and  supporting me  in my decisions. Without  the 

empathy, care and babysitting help of “mummi” this would not have been possible. 

A very special person in my life has been my grandmother Aune, who was almost like 

a  second mom  in my  childhood. My  younger  sister  and  brother,  Eeva  and Matti, 

thanks  for  being  there  always when  needed,  regardless  of  the  distance.  Leena  is 

thanked for friendship, sharing the ups and downs of being a mom, and the honor of 

being  Laura´s  godmother.  Also,  my  warmest  thanks  to  my  relatives‐in‐law:  my 

mother‐in‐law Raili, for everything that you have done for us; Ulla, Emma and Carla; 

Antti and Elina – I have always enjoyed your cheerful company during the holidays. 

My husband Pekka is thanked for running the everyday life with me, and sometimes 

for me,  thus making  the  finalizing of  this  long project possible. And of  course  for 

building  the  house we  live  in. My  precious  daughter  Veera,  you  are my  greatest 

achievement, the funniest person in the world, and the best reminder of what really 

is important in life. 


Thank you! 



Klaukkala, March 2011 


Page 107: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 107



1. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts J, Watson JD. Molecular biology of the cell. Garland Publishing 1994, London, UK. 

2. Allen DL, Leinwand LA. Intracellular calcium and myosin isoform transitions. Calcineurin and calcium‐calmodulin kinase pathways regulate preferential activation of the IIa myosin heavy chain promoter. J Biol Chem 2002; 277(47): 45323‐30.  

3. Allen DL, Weber JN, Sycuro LK, Leinwand LA. Myocyte enhancer factor‐2 and serum response factor binding elements regulate fast myosin heavy chain transcription in vivo. J Biol Chem 2005; 280(17): 17126‐34.  

4. Alwazzan M, Newman E, Hamshere MG, Brook JD. Myotonic dystrophy is associated with a reduced level of RNA from the DMWD allele adjacent to the expanded repeat. Hum Mol Genet 1999; 8(8): 1491‐7.  

5. Anvret M, Ahlberg G, Grandell U, Hedberg B, Johnson K, Edstrom L. Larger expansions of the CTG repeat in muscle compared to lymphocytes from patients with myotonic dystrophy. Hum Mol Genet 1993; 2(9): 1397‐400.  

6. Arahata K, Hoffman EP, Kunkel LM, Ishiura S, Tsukahara T, Ishihara T, Sunohara N, Nonaka I, Ozawa E, Sugita H. Dystrophin diagnosis: Comparison of dystrophin abnormalities by immunofluorescence and immunoblot analyses. Proc Natl Acad Sci U S A 1989; 86(18): 7154‐8.  

7. Arambula JF, Ramisetty SR, Baranger AM, Zimmerman SC. A simple ligand that selectively targets CUG trinucleotide repeats and inhibits MBNL protein binding. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106(38): 16068‐73.  

8. Artero R, Prokop A, Paricio N, Begemann G, Pueyo I, Mlodzik M, Perez‐Alonso M, Baylies MK. The muscleblind gene participates in the organization of Z‐bands and epidermal attachments of drosophila muscles and is regulated by Dmef2. Dev Biol 1998; 195(2): 131‐43.  

9. Ashizawa T, Baiget M. New nomenclature and DNA testing guidelines for myotonic dystrophy type 1 (DM1). the international myotonic dystrophy consortium (IDMC). Neurology 2000; 54(6): 1218‐21.  

10. Ashizawa T, Epstein HF. Ethnic distribution of myotonic dystrophy gene. Lancet 1991; 338(8767): 642‐3.  

11. Ashizawa T, Dunne CJ, Dubel JR, Perryman MB, Epstein HF, Boerwinkle E, Hejtmancik JF. Anticipation in myotonic dystrophy. I. Statistical verification based on clinical and haplotype findings Neurology 1992; 42(10): 1871‐7.  

12. Ashizawa T, Anvret M, Baiget M, Barcelo JM, Brunner H, Cobo AM, Dallapiccola B, Fenwick RG,Jr, Grandell U, Harley H. Characteristics of intergenerational contractions of the CTG repeat in myotonic dystrophy. Am J Hum Genet 1994; 54(3): 414‐23.  

13. Ashizawa T, Dubel JR, Dunne PW, Dunne CJ, Fu YH, Pizzuti A, Caskey CT, Boerwinkle E, Perryman MB, Epstein HF. Anticipation in myotonic dystrophy. II. Complex relationships between clinical findings and structure of the GCT repeat. Neurology 1992; 42(10): 1877‐83.  

14. Au Y, Atkinson RA, Guerrini R, Kelly G, Joseph C, Martin SR, Muskett FW, Pallavicini A, Faulkner G, Pastore A. Solution structure of ZASP PDZ domain; implications for sarcomere ultrastructure and enigma family redundancy. Structure (Camb) 2004; 12(4): 611‐22.  

15. Auvinen S, Suominen T, Hannonen P, Bachinski LL, Krahe R, Udd B. Myotonic dystrophy type 2 found in two of sixty‐three persons diagnosed as having fibromyalgia. Arthritis Rheum 2008; 58(11): 3627‐31.  

Page 108: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

108 |

16. Bachinski LL, Sirito M, Bohme M, Baggerly KA, Udd B, Krahe R. Altered MEF2 isoforms in myotonic dystrophy and other neuromuscular disorders. Muscle Nerve 2010; 42: 856‐63. 

17. Bachinski LL, Czernuszewicz T, Ramagli LS, Suominen T, Shriver MD, Udd B, Siciliano MJ, Krahe R. Premutation allele pool in myotonic dystrophy type 2. Neurology 2009; 72(6): 490‐7.  

18. Bachinski LL, Udd B, Meola G, Sansone V, Bassez G, Eymard B, Thornton CA, Moxley RT, Harper PS, Rogers MT, Jurkat‐Rott K, Lehmann‐Horn F, Wieser T, Gamez J, Navarro C, Bottani A, Kohler A, Shriver MD, Sallinen R, Wessman M, Zhang S, Wright FA, Krahe R. Confirmation of the type 2 myotonic dystrophy (CCTG)n expansion mutation in patients with proximal myotonic myopathy/proximal myotonic dystrophy of different european origins: A single shared haplotype indicates an ancestral founder effect. Am J Hum Genet 2003; 73(4): 835‐48.  

19. Bassez G, Radvanyi H, Chapoy E, Authier FJ, Eymard B, Gherardi R. Assessment of in situ hybridization feasibility and efficiency for molecular diagnosis of myotonic dystrophy type 2 (DM2). Myology 2005; (Abstract ): 215.  

20. Bassez G, Chapoy E, Bastuji‐Garin S, Radvanyi‐Hoffman H, Authier FJ, Pellissier JF, Eymard B, Gherardi RK. Type 2 myotonic dystrophy can be predicted by the combination of type 2 muscle fiber central nucleation and scattered atrophy. J Neuropathol Exp Neurol 2008; 67(4): 319‐25.  

21. Bassez G, Attarian S, Laforet P, Azulay JP, Rouche A, Ferrer X, Urtizberea JA, Pellissier JF, Duboc D, Fardeau M, Pouget J, Eymard B. Proximal myotonial myopathy (PROMM): Clinical and histology study. Rev Neurol (Paris) 2001; 157(2): 209‐18.  

22. Beam KG, Horowicz P. Exitation‐contraction coupling in skeletal muscle. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 257‐80. 

23. Beard NA, Wei L, Dulhunty AF. Ca(2+) signaling in striated muscle: The elusive roles of triadin, junctin, and calsequestrin. Eur Biophys J 2009; 39(1): 27‐36.  

24. Beard NA, Laver DR, Dulhunty AF. Calsequestrin and the calcium release channel of skeletal and cardiac muscle. Prog Biophys Mol Biol 2004; 85(1): 33‐69.  

25. Begemann G, Paricio N, Artero R, Kiss I, Perez‐Alonso M, Mlodzik M. Muscleblind, a gene required for photoreceptor differentiation in drosophila, encodes novel nuclear Cys3His‐type zinc‐finger‐containing proteins. Development 1997; 124(21): 4321‐31. 

26. Berchtold MW, Brinkmeier H, Muntener M. Calcium ion in skeletal muscle: Its crucial role for muscle function, plasticity, and disease. Physiol Rev 2000; 80: 1215‐65. 

27. Berul CI, Maguire CT, Aronovitz MJ, Greenwood J, Miller C, Gehrmann J, Housman D, Mendelsohn ME, Reddy S. DMPK dosage alterations result in atrioventricular conduction abnormalities in a mouse myotonic dystrophy model. J Clin Invest 1999; 103(4): R1‐7.  

28. Bhargava A, Fuentes FF. Mutational dynamics of microsatellites. Mol Biotechnol 2010; 44(3): 250‐66.  

29. Biral D, Volpe P, Damiani E, Margreth A. Coexistence of two calsequestrin isoforms in rabbit slow‐twitch skeletal muscle fibers. FEBS Lett 1992; 299(2): 175‐8.  

30. Bird IM, Dhoot GK, Wilkinson JM. Identification of multiple variants of fast muscle troponin T in the chicken using monoclonal antibodies. Eur J Biochem 1985; 150(3): 517‐25.  

31. Bischoff R, Franzini‐Armstrong C. Satellite and stem cells in muscle regeneration. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004,USA: p. 66‐86.  

32. Blake DJ, Martin‐Rendon E. Intermediate filaments and the function of the dystrophin‐protein complex. Trends Cardiovasc Med 2002; 12(5): 224‐8.  

33. Bohn W, Wiegers W, Beuttenmuller M, Traub P. Species‐specific recognition patterns of monoclonal antibodies directed against vimentin. Exp Cell Res 1992; 201(1): 1‐7.  

Page 109: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 109

34. Bonifazi E, Vallo L, Giardina E, Botta A, Novelli G. A long PCR‐based molecular protocol for detecting normal and expanded ZNF9 alleles in myotonic dystrophy type 2. Diagn Mol Pathol 2004; 13(3): 164‐6.  

35. Bonifazi E, Gullotta F, Vallo L, Iraci R, Nardone AM, Brunetti E, Botta A, Novelli G. Use of RNA fluorescence in situ hybridization in the prenatal molecular diagnosis of myotonic dystrophy type I. Clin Chem 2006; 52(2): 319‐22.  

36. Borycki AG, Emerson CP,Jr. Multiple tissue interactions and signal transduction pathways control somite myogenesis. Curr Top Dev Biol 2000; 48: 165‐224.  

37. Botta A, Caldarola S, Vallo L, Bonifazi E, Fruci D, Gullotta F, Massa R, Novelli G, Loreni F. Effect of the [CCTG]n repeat expansion on ZNF9 expression in myotonic dystrophy type II (DM2). Biochim Biophys Acta 2006; 1762(3): 329‐34.  

38. Branden C, Tooze J. Introduction to protein structure. Garland Publishing, Inc. 1999, NY, USA. 

39. Brandl CJ, deLeon S, Martin DR, MacLennan DH. Adult forms of the Ca2+ATPase of sarcoplasmic reticulum. expression in developing skeletal muscle. J Biol Chem 1987; 262(8): 3768‐74.  

40. Brandl CJ, Green NM, Korczak B, MacLennan DH. Two Ca2+ ATPase genes: Homologies and mechanistic implications of deduced amino acid sequences. Cell 1986; 44(4): 597‐607.  

41. Brook JD, McCurrach ME, Harley HG, Buckler AJ, Church D, Aburatani H, Hunter K, Stanton VP, Thirion JP, Hudson T. Molecular basis of myotonic dystrophy: Expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3' end of a transcript encoding a protein kinase family member. Cell 1992; 68(4): 799‐808.  

42. Brouwer JR, Willemsen R, Oostra BA. Microsatellite repeat instability and neurological disease. Bioessays 2009; 31(1): 71‐83.  

43. Buj‐Bello A, Furling D, Tronchere H, Laporte J, Lerouge T, Butler‐Browne GS, Mandel JL. Muscle‐specific alternative splicing of myotubularin‐related 1 gene is impaired in DM1 muscle cells. Hum Mol Genet 2002; 11(19): 2297‐307.  

44. Burk SE, Lytton J, MacLennan DH, Shull GE. cDNA cloning, functional expression, and mRNA tissue distribution of a third organellar Ca2+ pump. J Biol Chem 1989; 264(31): 18561‐8.  

45. Burke HB. Discovering patterns in microarray data. Mol Diagn 2000; 5(4): 349‐57.  46. Burnette WN. "Western blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium 

dodecyl sulfate‐‐polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem 1981; 112(2): 195‐203.  

47. Calabria E, Ciciliot S, Moretti I, Garcia M, Picard A, Dyar KA, Pallafacchina G, Tothova J, Schiaffino S, Murgia M. NFAT isoforms control activity‐dependent muscle fiber type specification. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106(32): 13335‐40.  

48. Calarco JA, Saltzman AL, Ip JY, Blencowe BJ. Technologies for the global discovery and analysis of alternative splicing. Adv Exp Med Biol 2007; 623: 64‐84.  

49. Capetanaki Y, Bloch RJ, Kouloumenta A, Mavroidis M, Psarras S. Muscle intermediate filaments and their links to membranes and membranous organelles. Exp Cell Res 2007; 313(10): 2063‐76.  

50. Cardani R, Baldassa S, Botta A, Rinaldi F, Novelli G, Mancinelli E, Meola G. Ribonuclear inclusions and MBNL1 nuclear sequestration do not affect myoblast differentiation but alter gene splicing in myotonic dystrophy type 2. Neuromuscul Disord 2009; 19(5): 335‐43.  

51. Carson NL. Analysis of repetitive regions in myotonic dystrophy type 1 and 2. Curr Protoc Hum Genet 2009; Chapter 9: Unit 9.6.  

Page 110: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

110 |

52. Catalli C, Morgante A, Iraci R, Rinaldi F, Botta A, Novelli G. Validation of sensitivity and specificity of tetraplet‐primed PCR (TP‐PCR) in the molecular diagnosis of myotonic dystrophy type 2 (DM2). J Mol Diagn 2010; 12(5): 601‐6.  

53. Charlet‐B N, Savkur RS, Singh G, Philips AV, Grice EA, Cooper TA. Loss of the muscle‐specific chloride channel in type 1 myotonic dystrophy due to misregulated alternative splicing. Mol Cell 2002; 10(1): 45‐53.  

54. Chen HY, Kathirvel P, Yee WC, Lai PS. Correction of dystrophia myotonica type 1 pre‐mRNA transcripts by artificial trans‐splicing. Gene Ther 2009; 16(2): 211‐7.  

55. Chen W, Wang Y, Abe Y, Cheney L, Udd B, Li YP. Haploinsuffciency for Znf9 in Znf9+/‐ mice is associated with multiorgan abnormalities resembling myotonic dystrophy. J Mol Biol 2007; 368(1): 8‐17.  

56. Chen W, Liang Y, Deng W, Shimizu K, Ashique AM, Li E, Li YP. The zinc‐finger protein CNBP is required for forebrain formation in the mouse. Development 2003; 130(7): 1367‐79.  

57. Coons AH. The development of immunohistochemistry. Ann N Y Acad Sci 1971; 177: 5‐9.  58. Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Immunological properties of an antibody containing a 

fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med 1941; 47: 200‐2.  59. Cory S, Huang DC, Adams JM. The bcl‐2 family: Roles in cell survival and oncogenesis. 

Oncogene 2003; 22(53): 8590‐607.  60. Covault J, Sanes JR. Distribution of N‐CAM in synaptic and extrasynaptic portions of 

developing and adult skeletal muscle. J Cell Biol 1986; 102(3): 716‐30.  61. Craig RW, Padron R. Molecular structure of the sarcomere. In: Engel AG, Franzini‐

Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 129‐66.  62. Damiani E, Margreth A. Characterization study of the ryanodine receptor and of 

calsequestrin isoforms of mammalian skeletal muscles in relation to fibre types. J Muscle Res Cell Motil 1994; 15(2): 86‐101.  

63. Davis BM, McCurrach ME, Taneja KL, Singer RH, Housman DE. Expansion of a CUG trinucleotide repeat in the 3' untranslated region of myotonic dystrophy protein kinase transcripts results in nuclear retention of transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A 1997; 94(14): 7388‐93.  

64. Day JW, Ranum LP. RNA pathogenesis of the myotonic dystrophies. Neuromuscul Disord 2005; 15(1): 5‐16.  

65. Day JW, Roelofs R, Leroy B, Pech I, Benzow K, Ranum LP. Clinical and genetic characteristics of a five‐generation family with a novel form of myotonic dystrophy (DM2). Neuromuscul Disord 1999; 9(1): 19‐27.  

66. Day JW, Ricker K, Jacobsen JF, Rasmussen LJ, Dick KA, Kress W, Schneider C, Koch MC, Beilman GJ, Harrison AR, Dalton JC, Ranum LP. Myotonic dystrophy type 2: Molecular, diagnostic and clinical spectrum. Neurology 2003; 60(4): 657‐64.  

67. de Haro M, Al‐Ramahi I, De Gouyon B, Ukani L, Rosa A, Faustino NA, Ashizawa T, Cooper TA, Botas J. MBNL1 and CUGBP1 modify expanded CUG‐induced toxicity in a drosophila model of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet 2006; 15(13): 2138‐45.  

68. Deries M, Schweitzer R, Duxson MJ. Developmental fate of the mammalian myotome. Dev Dyn 2010; 239(11): 2898‐910.  

69. Draeger A, Weeds AG, Fitzsimons RB. Primary, secondary and tertiary myotubes in developing skeletal muscle: A new approach to the analysis of human myogenesis. J Neurol Sci 1987; 81(1): 19‐43.  

70. Du H, Cline MS, Osborne RJ, Tuttle DL, Clark TA, Donohue JP, Hall MP, Shiue L, Swanson MS, Thornton CA, Ares M,Jr. Aberrant alternative splicing and extracellular matrix gene expression in mouse models of myotonic dystrophy. Nat Struct Mol Biol 2010; 17(2): 187‐93.  

71. Dubowitz V, Sewry CA. Muscle biopsy ‐ A practical approach. Saunders Elsevier 2007, UK.  

Page 111: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 111

72. Early P, Rogers J, Davis M, Calame K, Bond M, Wall R, Hood L. Two mRNAs can be produced from a single immunoglobulin mu gene by alternative RNA processing pathways. Cell 1980; 20(2): 313‐9.  

73. Ecob‐Prince M, Hill M, Brown W. Immunocytochemical demonstration of myosin heavy chain expression in human muscle. J Neurol Sci 1989; 91(1‐2): 71‐8.  

74. Edmondson DG, Lyons GE, Martin JF, Olson EN. Mef2 gene expression marks the cardiac and skeletal muscle lineages during mouse embryogenesis. Development 1994; 120(5): 1251‐63.  

75. Emerson CP, Hauschka SD. Embryonic origins of skeletal muscles. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 3‐44.  

76. Engel AG. The neuromuscular junction. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 325‐72.  

77. Engel WK, Cunningham GG. Rapid examination of muscle tissue: an improved trichrome method for fresh‐frozen biopsy sections. Neurology 1963; 13: 919‐23.  

78. Fardaei M, Rogers MT, Thorpe HM, Larkin K, Hamshere MG, Harper PS, Brook JD. Three proteins, MBNL, MBLL and MBXL, co‐localize in vivo with nuclear foci of expanded‐repeat transcripts in DM1 and DM2 cells. Hum Mol Genet 2002; 11(7): 805‐14.  

79. Faulkner G, Pallavicini A, Formentin E, Comelli A, Ievolella C, Trevisan S, Bortoletto G, Scannapieco P, Salamon M, Mouly V, Valle G, Lanfranchi G. ZASP: A new Z‐band alternatively spliced PDZ‐motif protein. J Cell Biol 1999; 146(2): 465‐75.  

80. Flink IL, Morkin E. Alternatively processed isoforms of cellular nucleic acid‐binding protein interact with a suppressor region of the human beta‐myosin heavy chain gene. J Biol Chem 1995; 270(12): 6959‐65.  

81. Flink IL, Blitz I, Morkin E. Characterization of cellular nucleic acid binding protein from xenopus laevis: Expression in all three germ layers during early development. Dev Dyn 1998; 211(2): 123‐30.  

82. Franzini‐Armstrong C. The membrane systems of muscle cells. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 232‐56.  

83. Franzini‐Armstrong C, Horwitz AR. The cytoskeleton: Maintenance of muscle fiber integrity. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA. p. 443‐54.  

84. Fu YH, Friedman DL, Richards S, Pearlman JA, Gibbs RA, Pizzuti A, Ashizawa T, Perryman MB, Scarlato G, Fenwick RG,Jr. Decreased expression of myotonin‐protein kinase messenger RNA and protein in adult form of myotonic dystrophy. Science 1993; 260(5105): 235‐8.  

85. Fu YH, Pizzuti A, Fenwick RG,Jr, King J, Rajnarayan S, Dunne PW, Dubel J, Nasser GA, Ashizawa T, de Jong P. An unstable triplet repeat in a gene related to myotonic muscular dystrophy. Science 1992; 255(5049): 1256‐8.  

86. Fu YH, Kuhl DP, Pizzuti A, Pieretti M, Sutcliffe JS, Richards S, Verkerk AJ, Holden JJ, Fenwick RG,Jr, Warren ST. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: Resolution of the Sherman paradox. Cell 1991; 67(6): 1047‐58.  

87. Furling D, Marette A, Puymirat J. Insulin‐like growth factor I circumvents defective insulin action in human myotonic dystrophy skeletal muscle cells. Endocrinology 1999; 140(9): 4244‐50.  

88. Furling D, Lemieux D, Taneja K, Puymirat J. Decreased levels of myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) and delayed differentiation in human myotonic dystrophy myoblasts. Neuromuscul Disord 2001; 11(8): 728‐35.  

89. Furling D, Doucet G, Langlois MA, Timchenko L, Belanger E, Cossette L, Puymirat J. Viral vector producing antisense RNA restores myotonic dystrophy myoblast functions. Gene Ther 2003; 10(9): 795‐802.  

Page 112: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

112 |

90. Furling D, Coiffier L, Mouly V, Barbet JP, St Guily JL, Taneja K, Gourdon G, Junien C, Butler‐Browne GS. Defective satellite cells in congenital myotonic dystrophy. Hum Mol Genet 2001; 10(19): 2079‐87.  

91. Futatsugi A, Kuwajima G, Mikoshiba K. Tissue‐specific and developmentally regulated alternative splicing in mouse skeletal muscle ryanodine receptor mRNA. Biochem J 1995; 305(Pt 2): 373‐8.  

92. Gall JG, Pardue ML. Formation and detection of RNA‐DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A 1969; 63(2): 378‐83.  

93. Garbino A, van Oort RJ, Dixit SS, Landstrom AP, Ackerman MJ, Wehrens XH. Molecular evolution of the junctophilin gene family. Physiol Genomics 2009; 37(3): 175‐86.  

94. Gareiss PC, Sobczak K, McNaughton BR, Palde PB, Thornton CA, Miller BL. Dynamic combinatorial selection of molecules capable of inhibiting the (CUG) repeat RNA‐MBNL1 interaction in vitro: Discovery of lead compounds targeting myotonic dystrophy (DM1). J Am Chem Soc 2008; 130(48): 16254‐61.  

95. George A, Schneider‐Gold C, Zier S, Reiners K, Sommer C. Musculoskeletal pain in patients with myotonic dystrophy type 2. Arch Neurol 2004; 61(12): 1938‐42.  

96. Gerbasi VR, Link AJ. The myotonic dystrophy type 2 protein ZNF9 is part of an ITAF complex that promotes cap‐independent translation. Mol Cell Proteomics 2007; 6(6): 1049‐58.  

97. Green KJ, Böhringer M, Gocken T, Jones JCR. ScienceDirect ‐ advances in protein chemistry: Intermediate filament associated proteins. 2005; 2011(2/16/2011). 

98. Grifone R, Laclef C, Spitz F, Lopez S, Demignon J, Guidotti JE, Kawakami K, Xu PX, Kelly R, Petrof BJ, Daegelen D, Concordet JP, Maire P. Six1 and Eya1 expression can reprogram adult muscle from the slow‐twitch phenotype into the fast‐twitch phenotype. Mol Cell Biol 2004; 24(14): 6253‐67.  

99. Griggs R, Vihola A, Hackman P, Talvinen K, Haravuori H, Faulkner G, Eymard B, Richard I, Selcen D, Engel A, Carpen O, Udd B. Zaspopathy in a large classic late‐onset distal myopathy family. Brain 2007; 130(Pt 6): 1477‐84.  

100. Grounds MD, White JD, Rosenthal N, Bogoyevitch MA. The role of stem cells in skeletal and cardiac muscle repair. J Histochem Cytochem 2002; 50(5): 589‐610.  

101. Haller RG, Vissing J. Functional evaluation of metabolic myopathies. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 665‐80.  

102. Hamshere MG, Harley H, Harper P, Brook JD, Brookfield JF. Myotonic dystrophy: The correlation of (CTG) repeat length in leucocytes with age at onset is significant only for patients with small expansions. J Med Genet 1999; 36(1): 59‐61.  

103. Hao M, Akrami K, Wei K, De Diego C, Che N, Ku JH, Tidball J, Graves MC, Shieh PB, Chen F. Muscleblind‐like 2 (Mbnl2) ‐deficient mice as a model for myotonic dystrophy. Dev Dyn 2008; 237(2): 403‐10.  

104. Harley HG, Rundle SA, Reardon W, Myring J, Crow S, Brook JD, Harper PS, Shaw DJ. Unstable DNA sequence in myotonic dystrophy. Lancet 1992; 339(8802): 1125‐8.  

105. Harlow E, Lane D. Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory 1988, NY, USA. 

106. Harper PS. Myotonic dystrophy. Saunders 2001, London. 107. Havenith MG, Visser R, Schrijvers‐van Schendel JM, Bosman FT. Muscle fiber typing in 

routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry 1990; 93(5): 497‐9.  

108. Hess KR, Zhang W, Baggerly KA, Stivers DN, Coombes KR. Microarrays: Handling the deluge of data and extracting reliable information. Trends Biotechnol 2001; 19(11): 463‐8.  

Page 113: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 113

109. Ho TH, Bundman D, Armstrong DL, Cooper TA. Transgenic mice expressing CUG‐BP1 reproduce splicing mis‐regulation observed in myotonic dystrophy. Hum Mol Genet 2005; 14(11): 1539‐47.  

110. Ho TH, Charlet‐B N, Poulos MG, Singh G, Swanson MS, Cooper TA. Muscleblind proteins regulate alternative splicing. EMBO J 2004; 23(15): 3103‐12.  

111. Horne Z, Hesketh J. Immunological localization of ribosomes in striated rat muscle. Evidence for myofibrillar association and ontological changes in the subsarcolemmal myofibrillar distribution. Biochem J 1990; 268(1): 231‐6.  

112. Houseley JM, Wang Z, Brock GJ, Soloway J, Artero R, Perez‐Alonso M, O'Dell KM, Monckton DG. Myotonic dystrophy associated expanded CUG repeat muscleblind positive ribonuclear foci are not toxic to drosophila. Hum Mol Genet 2005; 14(6): 873‐83.  

113. Huang C, Zhou Q, Liang P, Hollander MS, Sheikh F, Li X, Greaser M, Shelton GD, Evans S, Chen J. Characterization and in vivo functional analysis of splice variants of cypher. J Biol Chem 2003; 278(9): 7360‐5.  

114. Huichalaf C, Schoser B, Schneider‐Gold C, Jin B, Sarkar P, Timchenko L. Reduction of the rate of protein translation in patients with myotonic dystrophy 2. J Neurosci 2009; 29(28): 9042‐9.  

115. Hund E, Jansen O, Koch MC, Ricker K, Fogel W, Niedermaier N, Otto M, Kuhn E, Meinck HM. Proximal myotonic myopathy with MRI white matter abnormalities of the brain. Neurology 1997; 48(1): 33‐7.  

116. International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 2004; 431(7011): 931‐45.  

117. Jacobs AE, Benders AA, Oosterhof A, Veerkamp JH, van Mier P, Wevers RA, Joosten EM. The calcium homeostasis and the membrane potential of cultured muscle cells from patients with myotonic dystrophy. Biochim Biophys Acta 1990; 1096(1): 14‐9.  

118. Jakob S, Corazza N, Diamantis E, Kappeler A, Brunner T. Detection of apoptosis in vivo using antibodies against caspase‐induced neo‐epitopes. Methods 2008; 44(3): 255‐61.  

119. Jakubiczka S, Vielhaber S, Kress W, Kupferling P, Reuner U, Kunath B, Wieacker P. Improvement of the diagnostic procedure in proximal myotonic myopathy/myotonic dystrophy type 2. Neurogenetics 2004; 5(1): 55‐9.  

120. Jasinska A, Michlewski G, de Mezer M, Sobczak K, Kozlowski P, Napierala M, Krzyzosiak WJ. Structures of trinucleotide repeats in human transcripts and their functional implications. Nucleic Acids Res 2003; 31(19): 5463‐8.  

121. Jiang H, Mankodi A, Swanson MS, Moxley RT, Thornton CA. Myotonic dystrophy type 1 is associated with nuclear foci of mutant RNA, sequestration of muscleblind proteins and deregulated alternative splicing in neurons. Hum Mol Genet 2004; 13(24): 3079‐88.  

122. Johnson MA, Polgar J, Weightman D, Appleton D. Data on the distribution of fibre types in thirty‐six human muscles. An autopsy study. J Neurol Sci 1973; 18(1): 111‐29.  

123. Jones PP, Jiang D, Bolstad J, Hunt DJ, Zhang L, Demaurex N, Chen SR. Endoplasmic reticulum Ca2+ measurements reveal that the cardiac ryanodine receptor mutations linked to cardiac arrhythmia and sudden death alter the threshold for store‐overload‐induced Ca2+ release. Biochem J 2008; 412(1): 171‐8.  

124. Kalsotra A, Xiao X, Ward AJ, Castle JC, Johnson JM, Burge CB, Cooper TA. A postnatal switch of CELF and MBNL proteins reprograms alternative splicing in the developing heart. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105(51): 20333‐8.  

125. Kanadia RN, Shin J, Yuan Y, Beattie SG, Wheeler TM, Thornton CA, Swanson MS. Reversal of RNA missplicing and myotonia after muscleblind overexpression in a mouse poly(CUG) model for myotonic dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(31): 11748‐53.  

Page 114: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

114 |

126. Kanadia RN, Johnstone KA, Mankodi A, Lungu C, Thornton CA, Esson D, Timmers AM, Hauswirth WW, Swanson MS. A muscleblind knockout model for myotonic dystrophy. Science 2003; 302(5652): 1978‐80.  

127. Karpati G, Hilton‐Jones D, Bushby K, Griggs RC. Disorders of voluntary muscle. Cambridge University Press 2010, Cambridge, UK. 

128. Karpati G, Charuk J, Carpenter S, Jablecki C, Holland P. Myopathy caused by a deficiency of Ca2+‐adenosine triphosphatase in sarcoplasmic reticulum (brody's disease). Ann Neurol 1986; 20(1): 38‐49.  

129. Kassubek J, Juengling FD, Hoffmann S, Rosenbohm A, Kurt A, Jurkat‐Rott K, Steinbach P, Wolf M, Ludolph AC, Lehmann‐Horn F, Lerche H, Weber YG. Quantification of brain atrophy in patients with myotonic dystrophy and proximal myotonic myopathy: A controlled 3‐dimensional magnetic resonance imaging study. Neurosci Lett 2003; 348(2): 73‐6.  

130. Kawakami A, Kimura‐Kawakami M, Nomura T, Fujisawa H. Distributions of PAX6 and PAX7 proteins suggest their involvement in both early and late phases of chick brain development. Mech Dev 1997; 66(1‐2): 119‐30.  

131. Kierszenbaum A. Histology and cell biology: An introduction to pathology. Mosby Elsevier 2007, PA, USA. 

132. Kimura T, Pace SM, Wei L, Beard NA, Dirksen RT, Dulhunty AF. A variably spliced region in the type 1 ryanodine receptor may participate in an inter‐domain interaction. Biochem J 2007; 401(1): 317‐24.  

133. Kimura T, Lueck JD, Harvey PJ, Pace SM, Ikemoto N, Casarotto MG, Dirksen RT, Dulhunty AF. Alternative splicing of RyR1 alters the efficacy of skeletal EC coupling. Cell Calcium 2009; 45(3): 264‐74.  

134. Kimura T, Nakamori M, Lueck JD, Pouliquin P, Aoike F, Fujimura H, Dirksen RT, Takahashi MP, Dulhunty AF, Sakoda S. Altered mRNA splicing of the skeletal muscle ryanodine receptor and sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+‐ATPase in myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet 2005; 14(15): 2189‐200.  

135. Kirzinger L, Schmidt A, Kornblum C, Schneider‐Gold C, Kress W, Schoser B. Side effects of anesthesia in DM2 as compared to DM1: A comparative retrospective study. Eur J Neurol 2010; 17(6): 842‐5.  

136. Klesert TR, Otten AD, Bird TD, Tapscott SJ. Trinucleotide repeat expansion at the myotonic dystrophy locus reduces expression of DMAHP. Nat Genet 1997; 16(4): 402‐6.  

137. Kobayashi YM, Alseikhan BA, Jones LR. Localization and characterization of the calsequestrin‐binding domain of triadin 1. evidence for a charged beta‐strand in mediating the protein‐protein interaction. J Biol Chem 2000; 275(23): 17639‐46.  

138. Kohler G, Milstein C. Derivation of specific antibody‐producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur J Immunol 1976; 6(7): 511‐9.  

139. Korade‐Mirnics Z, Tarleton J, Servidei S, Casey RR, Gennarelli M, Pegoraro E, Angelini C, Hoffman EP. Myotonic dystrophy: Tissue‐specific effect of somatic CTG expansions on allele‐specific DMAHP/SIX5 expression. Hum Mol Genet 1999; 8(6): 1017‐23.  

140. Kornblum C, Reul J, Kress W, Grothe C, Amanatidis N, Klockgether T, Schroder R. Cranial magnetic resonance imaging in genetically proven myotonic dystrophy type 1 and 2. J Neurol 2004; 251(6): 710‐4.  

141. Krahe R, Ashizawa T, Abbruzzese C, Roeder E, Carango P, Giacanelli M, Funanage VL, Siciliano MJ. Effect of myotonic dystrophy trinucleotide repeat expansion on DMPK transcription and processing. Genomics 1995; 28(1): 1‐14.  

142. Kress W, Mueller‐Myhsok B, Ricker K, Schneider C, Koch MC, Toyka KV, Mueller CR, Grimm T. Proof of genetic heterogeneity in the proximal myotonic myopathy syndrome (PROMM) and its relationship to myotonic dystrophy type 2 (DM2). Neuromuscul Disord 2000; 10(7): 478‐80.  

Page 115: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 115

143. Kruse B, Wohrle D, Steinbach P, Gal A. Does proximal myotonic myopathy show anticipation? Hum Mutat 2008; 29(8): E100‐2.  

144. Kurreck J. Antisense technologies. Improvement through novel chemical modifications. Eur J Biochem 2003; 270(8): 1628‐44.  

145. Kuyumcu‐Martinez NM, Wang GS, Cooper TA. Increased steady‐state levels of CUGBP1 in myotonic dystrophy 1 are due to PKC‐mediated hyperphosphorylation. Mol Cell 2007; 28(1): 68‐78.  

146. La Spada AR, Wilson EM, Lubahn DB, Harding AE, Fischbeck KH. Androgen receptor gene mutations in X‐linked spinal and bulbar muscular atrophy. Nature 1991; 352(6330): 77‐9.  

147. Labeit S, Kolmerer B. Titins: Giant proteins in charge of muscle ultrastructure and elasticity. Science 1995; 270(5234): 293‐6.  

148. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227(5259): 680‐5.  

149. Lange S, Xiang F, Yakovenko A, Vihola A, Hackman P, Rostkova E, Kristensen J, Brandmeier B, Franzen G, Hedberg B, Gunnarsson LG, Hughes SM, Marchand S, Sejersen T, Richard I, Edstrom L, Ehler E, Udd B, Gautel M. The kinase domain of titin controls muscle gene expression and protein turnover. Science 2005; 308(5728): 1599‐603.  

150. Langlois MA, Boniface C, Wang G, Alluin J, Salvaterra PM, Puymirat J, Rossi JJ, Lee NS. Cytoplasmic and nuclear retained DMPK mRNAs are targets for RNA interference in myotonic dystrophy cells. J Biol Chem 2005; 280(17): 16949‐54.  

151. Lavedan C, Hofmann‐Radvanyi H, Shelbourne P, Rabes JP, Duros C, Savoy D, Dehaupas I, Luce S, Johnson K, Junien C. Myotonic dystrophy: Size‐ and sex‐dependent dynamics of CTG meiotic instability, and somatic mosaicism. Am J Hum Genet 1993; 52(5): 875‐83.  

152. Le Ber I, Martinez M, Campion D, Laquerriere A, Betard C, Bassez G, Girard C, Saugier‐Veber P, Raux G, Sergeant N, Magnier P, Maisonobe T, Eymard B, Duyckaerts C, Delacourte A, Frebourg T, Hannequin D. A non‐DM1, non‐DM2 multisystem myotonic disorder with frontotemporal dementia: Phenotype and suggestive mapping of the DM3 locus to chromosome 15q21‐24. Brain 2004; 127(Pt 9): 1979‐92.  

153. Lee JE, Cooper TA. Pathogenic mechanisms of myotonic dystrophy. Biochem Soc Trans 2009; 37(Pt 6): 1281‐6.  

154. Leroy O, Wang J, Maurage CA, Parent M, Cooper T, Buee L, Sergeant N, Andreadis A, Caillet‐Boudin ML. Brain‐specific change in alternative splicing of tau exon 6 in myotonic dystrophy type 1. Biochim Biophys Acta 2006; 1762(4): 460‐7.  

155. Lewin B. Genes VII. Oxford University Press and Cell Press 2000, NY, USA. 156. Lin X, Miller JW, Mankodi A, Kanadia RN, Yuan Y, Moxley RT, Swanson MS, Thornton 

CA. Failure of MBNL1‐dependent post‐natal splicing transitions in myotonic dystrophy. Hum Mol Genet 2006; 15(13): 2087‐97.  

157. Liquori CL, Ikeda Y, Weatherspoon M, Ricker K, Schoser BG, Dalton JC, Day JW, Ranum LP. Myotonic dystrophy type 2: Human founder haplotype and evolutionary conservation of the repeat tract. Am J Hum Genet 2003; 73(4): 849‐62.  

158. Liquori CL, Ricker K, Moseley ML, Jacobsen JF, Kress W, Naylor SL, Day JW, Ranum LP. Myotonic dystrophy type 2 caused by a CCTG expansion in intron 1 of ZNF9. Science 2001; 293(5531): 864‐7.  

159. Liu J, Fu JD, Siu CW, Li RA. Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell‐derived cardiomyocytes: Insights for driven maturation. Stem Cells 2007; 25(12): 3038‐44.  

Page 116: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

116 |

160. Logigian EL, Moxley RT,4th, Blood CL, Barbieri CA, Martens WB, Wiegner AW, Thornton CA, Moxley RT,3rd. Leukocyte CTG repeat length correlates with severity of myotonia in myotonic dystrophy type 1. Neurology 2004; 62(7): 1081‐9.  

161. Logigian EL, Martens WB, Moxley RT,4th, McDermott MP, Dilek N, Wiegner AW, Pearson AT, Barbieri CA, Annis CL, Thornton CA, Moxley RT,3rd. Mexiletine is an effective antimyotonia treatment in myotonic dystrophy type 1. Neurology 2010; 74(18): 1441‐8.  

162. Luke S, Shepelsky M. FISH: Recent advances and diagnostic aspects. Cell Vis 1998; 5(1): 49‐53.  

163. Lyfenko AD, Goonasekera SA, Dirksen RT. Dynamic alterations in myoplasmic Ca2+ in malignant hyperthermia and central core disease. Biochem Biophys Res Commun 2004; 322(4): 1256‐66.  

164. MacDonald JR, Hill JD, Tarnopolsky MA. Modafinil reduces excessive somnolence and enhances mood in patients with myotonic dystrophy. Neurology 2002; 59(12): 1876‐80.  

165. Machuca‐Tzili L, Thorpe H, Robinson TE, Sewry C, Brook JD. Flies deficient in muscleblind protein model features of myotonic dystrophy with altered splice forms of Z‐band associated transcripts. Hum Genet 2006; 120(4): 487‐99.  

166. MacLennan DH, Rice WJ, Green NM. The mechanism of Ca2+ transport by sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+‐ATPases. J Biol Chem 1997; 272(46): 28815‐8.  

167. Mahadevan M, Tsilfidis C, Sabourin L, Shutler G, Amemiya C, Jansen G, Neville C, Narang M, Barcelo J, O'Hoy K. Myotonic dystrophy mutation: An unstable CTG repeat in the 3' untranslated region of the gene. Science 1992; 255(5049): 1253‐5.  

168. Mahadevan MS, Yadava RS, Yu Q, Balijepalli S, Frenzel‐McCardell CD, Bourne TD, Phillips LH. Reversible model of RNA toxicity and cardiac conduction defects in myotonic dystrophy. Nat Genet 2006; 38(9): 1066‐70.  

169. Mancini N, Carletti S, Perotti M, Canducci F, Mammarella M, Sampaolo M, Burioni R. Phage display for the production of human monoclonal antibodies against human pathogens. New Microbiol 2004; 27(4): 315‐28.  

170. Mankodi A, Lin X, Blaxall BC, Swanson MS, Thornton CA. Nuclear RNA foci in the heart in myotonic dystrophy. Circ Res 2005; 97(11): 1152‐5.  

171. Mankodi A, Teng‐Umnuay P, Krym M, Henderson D, Swanson M, Thornton CA. Ribonuclear inclusions in skeletal muscle in myotonic dystrophy types 1 and 2. Ann Neurol 2003; 54(6): 760‐8.  

172. Mankodi A, Takahashi MP, Jiang H, Beck CL, Bowers WJ, Moxley RT, Cannon SC, Thornton CA. Expanded CUG repeats trigger aberrant splicing of ClC‐1 chloride channel pre‐mRNA and hyperexcitability of skeletal muscle in myotonic dystrophy. Mol Cell 2002; 10(1): 35‐44.  

173. Mankodi A, Logigian E, Callahan L, McClain C, White R, Henderson D, Krym M, Thornton CA. Myotonic dystrophy in transgenic mice expressing an expanded CUG repeat. Science 2000; 289(5485): 1769‐73.  

174. Mankodi A, Urbinati CR, Yuan QP, Moxley RT, Sansone V, Krym M, Henderson D, Schalling M, Swanson MS, Thornton CA. Muscleblind localizes to nuclear foci of aberrant RNA in myotonic dystrophy types 1 and 2. Hum Mol Genet 2001; 10(19): 2165‐70.  

175. Margolis JM, Schoser BG, Moseley ML, Day JW, Ranum LP. DM2 intronic expansions: Evidence for CCUG accumulation without flanking sequence or effects on ZNF9 mRNA processing or protein expression. Hum Mol Genet 2006; 15(11): 1808‐15.  

176. Matlin AJ, Clark F, Smith CW. Understanding alternative splicing: Towards a cellular code. Nat Rev Mol Cell Biol 2005; 6(5): 386‐98.  

Page 117: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 117

177. Maurage CA, Udd B, Ruchoux MM, Vermersch P, Kalimo H, Krahe R, Delacourte A, Sergeant N. Similar brain tau pathology in DM2/PROMM and DM1/Steinert disease. Neurology 2005; 65(10): 1636‐8.  

178. Mauro A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol 1961; 9: 493‐5.  179. McKinsey TA, Zhang CL, Olson EN. MEF2: A calcium‐dependent regulator of cell 

division, differentiation and death. Trends Biochem Sci 2002; 27(1): 40‐7.  180. Meola G, Sansone V, Radice S, Skradski S, Ptacek L. A family with an unusual myotonic 

and myopathic phenotype and no CTG expansion (proximal myotonic myopathy syndrome): A challenge for future molecular studies. Neuromuscul Disord 1996; 6(3): 143‐50.  

181. Meola G, Sansone V, Perani D, Scarone S, Cappa S, Dragoni C, Cattaneo E, Cotelli M, Gobbo C, Fazio F, Siciliano G, Mancuso M, Vitelli E, Zhang S, Krahe R, Moxley RT. Executive dysfunction and avoidant personality trait in myotonic dystrophy type 1 (DM‐1) and in proximal myotonic myopathy (PROMM/DM‐2). Neuromuscul Disord 2003; 13(10): 813‐21.  

182. Michalowski S, Miller JW, Urbinati CR, Paliouras M, Swanson MS, Griffith J. Visualization of double‐stranded RNAs from the myotonic dystrophy protein kinase gene and interactions with CUG‐binding protein. Nucleic Acids Res 1999; 27(17): 3534‐42.  

183. Michel RN, Dunn SE, Chin ER. Calcineurin and skeletal muscle growth. Proc Nutr Soc 2004; 63(2): 341‐9.  

184. Micheletti R, Palazzo F, Barassi P, Giacalone G, Ferrandi M, Schiavone A, Moro B, Parodi O, Ferrari P, Bianchi G. Istaroxime, a stimulator of sarcoplasmic reticulum calcium adenosine triphosphatase isoform 2a activity, as a novel therapeutic approach to heart failure. Am J Cardiol 2007; 99(2A): 24A‐32A.  

185. Michelotti EF, Tomonaga T, Krutzsch H, Levens D. Cellular nucleic acid binding protein regulates the CT element of the human c‐myc protooncogene. J Biol Chem 1995; 270(16): 9494‐9.  

186. Migheli A, Mongini T, Doriguzzi C, Chiado‐Piat L, Piva R, Ugo I, Palmucci L. Muscle apoptosis in humans occurs in normal and denervated muscle, but not in myotonic dystrophy, dystrophinopathies or inflammatory disease. Neurogenetics 1997; 1(2): 81‐7.  

187. Miller JW, Urbinati CR, Teng‐Umnuay P, Stenberg MG, Byrne BJ, Thornton CA, Swanson MS. Recruitment of human muscleblind proteins to (CUG)(n) expansions associated with myotonic dystrophy. EMBO J 2000; 19(17): 4439‐48.  

188. Minnerop M, Luders E, Specht K, Ruhlmann J, Schneider‐Gold C, Schroder R, Thompson PM, Toga AW, Klockgether T, Kornblum C. Grey and white matter loss along cerebral midline structures in myotonic dystrophy type 2. J Neurol 2008; 255(12): 1904‐9.  

189. Molkentin JD, Firulli AB, Black BL, Martin JF, Hustad CM, Copeland N, Jenkins N, Lyons G, Olson EN. MEF2B is a potent transactivator expressed in early myogenic lineages. Mol Cell Biol 1996; 16(7): 3814‐24.  

190. Monckton DG, Wong LJ, Ashizawa T, Caskey CT. Somatic mosaicism, germline expansions, germline reversions and intergenerational reductions in myotonic dystrophy males: Small pool PCR analyses. Hum Mol Genet 1995; 4(1): 1‐8.  

191. Moore KL, Agur AM, Dalley AF. Essential clinical anatomy ‐ international edition. Lippincott Williams & Wilkins 2010, USA. 

192. Moraes KC, Wilusz CJ, Wilusz J. CUG‐BP binds to RNA substrates and recruits PARN deadenylase. RNA 2006; 12(6): 1084‐91.  

193. Morton ME, Froehner SC. Monoclonal antibody identifies a 200‐kDa subunit of the dihydropyridine‐sensitive calcium channel. J Biol Chem 1987; 262(25): 11904‐7.  

Page 118: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

118 |

194. Moxley RT,3rd. Proximal myotonic myopathy: Mini‐review of a recently delineated clinical disorder. Neuromuscul Disord 1996; 6(2): 87‐93.  

195. Moxley RT,3rd, Udd B, Ricker K. 54th ENMC international workshop: PROMM (proximal myotonic myopathies) and other proximal myotonic syndromes. 10‐12th October 1997, Naarden, the Netherlands. Neuromuscul Disord 1998; 8(7): 508‐18.  

196. Mu X, Brown LD, Liu Y, Schneider MF. Roles of the calcineurin and CaMK signaling pathways in fast‐to‐slow fiber type transformation of cultured adult mouse skeletal muscle fibers. Physiol Genomics 2007; 30(3): 300‐12.  

197. Mulders SA, van Engelen BG, Wieringa B, Wansink DG. Molecular therapy in myotonic dystrophy: Focus on RNA gain‐of‐function. Hum Mol Genet 2010; 19(R1): R90‐7.  

198. Mulders SA, van den Broek WJ, Wheeler TM, Croes HJ, van Kuik‐Romeijn P, de Kimpe SJ, Furling D, Platenburg GJ, Gourdon G, Thornton CA, Wieringa B, Wansink DG. Triplet‐repeat oligonucleotide‐mediated reversal of RNA toxicity in myotonic dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106(33): 13915‐20.  

199. Nakamori M, Sobczak K, Moxley RT,3rd, Thornton CA. Scaled‐down genetic analysis of myotonic dystrophy type 1 and type 2. Neuromuscul Disord 2009; 19(11): 759‐62.  

200. Nakamori M, Kimura T, Fujimura H, Takahashi MP, Sakoda S. Altered mRNA splicing of dystrophin in type 1 myotonic dystrophy. Muscle Nerve 2007; 36(2): 251‐7.  

201. Nakamori M, Kimura T, Kubota T, Matsumura T, Sumi H, Fujimura H, Takahashi MP, Sakoda S. Aberrantly spliced alpha‐dystrobrevin alters alpha‐syntrophin binding in myotonic dystrophy type 1. Neurology 2008; 70(9): 677‐85.  

202. Naya FJ, Olson E. MEF2: A transcriptional target for signaling pathways controlling skeletal muscle growth and differentiation. Curr Opin Cell Biol 1999; 11(6): 683‐8.  

203. Newman B, Meola G, O'Donovan DG, Schapira AH, Kingston H. Proximal myotonic myopathy (PROMM) presenting as myotonia during pregnancy. Neuromuscul Disord 1999; 9(3): 144‐9.  

204. Nguyen T, Rubinstein NA, Vijayasarathy C, Rome LC, Kaiser LR, Shrager JB, Levine S. Effect of chronic obstructive pulmonary disease on calcium pump ATPase expression in human diaphragm. J Appl Physiol 2005; 98(6): 2004‐10.  

205. Odermatt A, Becker S, Khanna VK, Kurzydlowski K, Leisner E, Pette D, MacLennan DH. Sarcolipin regulates the activity of SERCA1, the fast‐twitch skeletal muscle sarcoplasmic reticulum Ca2+‐ATPase. J Biol Chem 1998; 273(20): 12360‐9.  

206. Odermatt A, Taschner PE, Khanna VK, Busch HF, Karpati G, Jablecki CK. Mutations in the gene‐encoding SERCA1, the fast‐twitch skeletal muscle sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, are associated with Brody disease. Nat Genet 1996; 14: 191‐4. 

207. Oishi Y, Ogata T, Ohira Y, Taniguchi K, Roy RR. Calcineurin and heat shock protein 72 in functionally overloaded rat plantaris muscle. Biochem Biophys Res Commun 2005; 330(3): 706‐13.  

208. Okazaki K, Holtzer H. Myogenesis: Fusion, myosin synthesis, and the mitotic cycle. Proc Natl Acad Sci U S A 1966; 56(5): 1484‐90.  

209. Olive M, Martinez‐Matos JA, Pirretas P, Povedano M, Navarro C, Ferrer I. Expression of myogenic regulatory factors (MRFs) in human neuromuscular disorders. Neuropathol Appl Neurobiol 1997; 23(6): 475‐82.  

210. Orengo JP, Chambon P, Metzger D, Mosier DR, Snipes GJ, Cooper TA. Expanded CTG repeats within the DMPK 3' UTR causes severe skeletal muscle wasting in an inducible mouse model for myotonic dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 2008; 105(7): 2646‐51.  

211. Orr HT, Zoghbi HY. Trinucleotide repeat disorders. Annu Rev Neurosci 2007; 30: 575‐621.  

212. Osborne RJ, Lin X, Welle S, Sobczak K, O'Rourke JR, Swanson MS, Thornton CA. Transcriptional and post‐transcriptional impact of toxic RNA in myotonic dystrophy. Hum Mol Genet 2009; 18(8): 1471‐81.  

Page 119: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 119

213. Otten AD, Tapscott SJ. Triplet repeat expansion in myotonic dystrophy alters the adjacent chromatin structure. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92(12): 5465‐9.  

214. Ottenheijm CA, Heunks LM, Dekhuijzen RP. Diaphragm adaptations in patients with COPD. Respir Res 2008; 9: 12.  

215. Ozasa S, Kimura S, Ito K, Ueno H, Ikezawa M, Matsukura M, Yoshioka K, Araki K, Yamamura KI, Abe K, Niwa H, Miike T. Efficient conversion of ES cells into myogenic lineage using the gene‐inducible system. Biochem Biophys Res Commun 2007; 357(4): 957‐63.  

216. Park H, Park IY, Kim E, Youn B, Fields K, Dunker AK, Kang C. Comparing skeletal and cardiac calsequestrin structures and their calcium binding: A proposed mechanism for coupled calcium binding and protein polymerization. J Biol Chem 2004; 279(17): 18026‐33.  

217. Patel K, Rossell RJ, Bourne S, Moore SE, Walsh FS, Kemshead JT. Monoclonal antibody UJ13A recognizes the neural cell adhesion molecule (NCAM). Int J Cancer 1989; 44(6): 1062‐8.  

218. Pelin K, Wallgren‐Pettersson C. Nebulin‐‐a giant chameleon. Adv Exp Med Biol 2008; 642: 28‐39.  

219. Pelletier R, Hamel F, Beaulieu D, Patry L, Haineault C, Tarnopolsky M, Schoser B, Puymirat J. Absence of a differentiation defect in muscle satellite cells from DM2 patients. Neurobiol Dis 2009; 36(1): 181‐90.  

220. Pellizzoni L, Lotti F, Maras B, Pierandrei‐Amaldi P. Cellular nucleic acid binding protein binds a conserved region of the 5' UTR of Xenopus laevis ribosomal protein mRNAs. J Mol Biol 1997; 267(2): 264‐75.  

221. Penault‐Llorca F, Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Osamura RY, Ruschoff J, van de Vijver M. Emerging technologies for assessing HER2 amplification. Am J Clin Pathol 2009; 132(4): 539‐48.  

222. Petersen OH, Michalak M, Verkhratsky A. Calcium signalling: Past, present and future. Cell Calcium 2005; 38: 161‐9. 

223. Pezzella F, Tse AG, Cordell JL, Pulford KA, Gatter KC, Mason DY. Expression of the bcl‐2 oncogene protein is not specific for the 14;18 chromosomal translocation. Am J Pathol 1990; 137(2): 225‐32.  

224. Philips AV, Timchenko LT, Cooper TA. Disruption of splicing regulated by a CUG‐binding protein in myotonic dystrophy. Science 1998; 280(5364): 737‐41.  

225. Phillips MS, Fujii J, Khanna VK, DeLeon S, Yokobata K, de Jong PJ, MacLennan DH. The structural organization of the human skeletal muscle ryanodine receptor (RYR1) gene. Genomics 1996; 34(1): 24‐41.  

226. Phylactou LA, Darrah C, Wood MJ. Ribozyme‐mediated trans‐splicing of a trinucleotide repeat. Nat Genet 1998; 18(4): 378‐81.  

227. Pisani V, Panico MB, Terracciano C, Bonifazi E, Meola G, Novelli G, Bernardi G, Angelini C, Massa R. Preferential central nucleation of type 2 myofibers is an invariable feature of myotonic dystrophy type 2. Muscle Nerve 2008; 38(5): 1405‐11.  

228. Polgar J, Johnson MA, Weightman D, Appleton D. Data on fibre size in thirty‐six human muscles, an autopsy study. J Neurol Sci 1973; 19(3): 307‐18.  

229. Potthoff MJ, Arnold MA, McAnally J, Richardson JA, Bassel‐Duby R, Olson EN. Regulation of skeletal muscle sarcomere integrity and postnatal muscle function by Mef2c. Mol Cell Biol 2007; 27(23): 8143‐51.  

230. Powers‐Martin K, Phillips JK, Biancardi VC, Stern JE. Heterogeneous distribution of basal cyclic guanosine monophosphate within distinct neuronal populations in the hypothalamic paraventricular nucleus. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2008; 295(4): R1341‐50.  

Page 120: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

120 |

231. Proenza C, O'Brien J, Nakai J, Mukherjee S, Allen PD, Beam KG. Identification of a region of RyR1 that participates in allosteric coupling with the alpha(1S) (ca(V)1.1) II‐III loop. J Biol Chem 2002; 277(8): 6530‐5.  

232. Radvansky J, Kadasi L. The expanding world of myotonic dystrophies: How can they be detected? Genet Test Mol Biomarkers 2010; 14(6): 733‐41.  

233. Raheem O, Huovinen S, Suominen T, Haapasalo H, Udd B. Novel myosin heavy chain immunohistochemical double staining developed for the routine diagnostic separation of I, IIA and IIX fibers. Acta Neuropathol 2010; 119(4): 495‐500.  

234. Raheem O, Olufemi SE, Bachinski LL, Vihola A, Sirito M, Holmlund‐Hampf J, Haapasalo H, Li YP, Udd B, Krahe R. Mutant (CCTG)n expansion causes abnormal expression of zinc finger protein 9 in myotonic dystrophy type 2. Am J Pathol 2010; 177(6):3025‐36.  

235. Rajavashisth TB, Taylor AK, Andalibi A, Svenson KL, Lusis AJ. Identification of a zinc finger protein that binds to the sterol regulatory element. Science 1989; 245(4918): 640‐3.  

236. Ramos‐Vara JA. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol 2005; 42(4): 405‐26.  

237. Rantala I, Lounatmaa K. Biologinen valomikroskopia. Helsinki University Press 1998, Helsinki, Finland. 

238. Ranum LP, Cooper TA. RNA‐mediated neuromuscular disorders. Annu Rev Neurosci 2006; 29: 259‐77.  

239. Ranum LP, Rasmussen PF, Benzow KA, Koob MD, Day JW. Genetic mapping of a second myotonic dystrophy locus. Nat Genet 1998; 19(2): 196‐8.  

240. Rauch C, Loughna PT. Static stretch promotes MEF2A nuclear translocation and expression of neonatal myosin heavy chain in C2C12 myocytes in a calcineurin‐ and p38‐dependent manner. Am J Physiol Cell Physiol 2005; 288(3): C593‐605.  

241. Relaix F, Rocancourt D, Mansouri A, Buckingham M. A Pax3/Pax7‐dependent population of skeletal muscle progenitor cells. Nature 2005; 435(7044): 948‐53.  

242. Ricker K, Koch MC, Lehmann‐Horn F, Pongratz D, Otto M, Heine R, Moxley RT,3rd. Proximal myotonic myopathy: A new dominant disorder with myotonia, muscle weakness, and cataracts. Neurology 1994; 44(8): 1448‐52.  

243. Ricker K, Koch MC, Lehmann‐Horn F, Pongratz D, Speich N, Reiners K, Schneider C, Moxley RT,3rd. Proximal myotonic myopathy. clinical features of a multisystem disorder similar to myotonic dystrophy. Arch Neurol 1995; 52(1): 25‐31.  

244. Roitt IM, Delves PI. Essential immunology. Blackwell Science 2001, London, UK. 245. Ronnblom A, Forsberg H, Danielsson A. Gastrointestinal symptoms in myotonic 

dystrophy. Scand J Gastroenterol 1996; 31(7): 654‐7.  246. Ronnblom A, Andersson S, Hellstrom PM, Danielsson A. Gastric emptying in myotonic 

dystrophy. Eur J Clin Invest 2002; 32(8): 570‐4.  247. Rossi AE, Dirksen RT. Sarcoplasmic reticulum: The dynamic calcium governor of muscle. 

Muscle Nerve 2006; 33(6): 715‐31.  248. Round JM, Matthews Y, Jones DA. A quick, simple and reliable histochemical method 

for ATPase in human muscle preparations. Histochem J 1980; 12(6): 707‐10.  249. Rubinstein NA, Kelly AM. The diversity of muscle fiber types and its origin during 

development. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 87‐103.  

250. Ryan AM, Matthews E, Hanna MG. Skeletal‐muscle channelopathies: Periodic paralysis and nondystrophic myotonias. Curr Opin Neurol 2007; 20(5): 558‐63.  

251. Saito T, Amakusa Y, Kimura T, Yahara O, Aizawa H, Ikeda Y, Day JW, Ranum LP, Ohno K, Matsuura T. Myotonic dystrophy type 2 in japan: Ancestral origin distinct from Caucasian families. Neurogenetics 2008; 9(1): 61‐3.  

Page 121: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 121

252. Sajko S, Kubinova L, Cvetko E, Kreft M, Wernig A, Erzen I. Frequency of M‐cadherin‐stained satellite cells declines in human muscles during aging. J Histochem Cytochem 2004; 52(2): 179‐85.  

253. Salisbury E, Sakai K, Schoser B, Huichalaf C, Schneider‐Gold C, Nguyen H, Wang GL, Albrecht JH, Timchenko LT. Ectopic expression of cyclin D3 corrects differentiation of DM1 myoblasts through activation of RNA CUG‐binding protein, CUGBP1. Exp Cell Res 2008; 314(11‐12): 2266‐78.  

254. Salisbury E, Schoser B, Schneider‐Gold C, Wang GL, Huichalaf C, Jin B, Sirito M, Sarkar P, Krahe R, Timchenko NA, Timchenko LT. Expression of RNA CCUG repeats dysregulates translation and degradation of proteins in myotonic dystrophy 2 patients. Am J Pathol 2009; 175(2): 748‐62.  

255. Salvatori S, Furlan S, Fanin M, Picard A, Pastorello E, Romeo V, Trevisan CP, Angelini C. Comparative transcriptional and biochemical studies in muscle of myotonic dystrophies (DM1 and DM2). Neurol Sci 2009; 30(3): 185‐92.  

256. Sammons MA, Antons AK, Bendjennat M, Udd B, Krahe R, Link AJ. ZNF9 activation of IRES‐mediated translation of the human ODC mRNA is decreased in myotonic dystrophy type 2. PLoS One 2010; 5(2): e9301.  

257. Sander HW, Tavoulareas GP, Chokroverty S. Heat‐sensitive myotonia in proximal myotonic myopathy. Neurology 1996; 47(4): 956‐62.  

258. Sandri M, El Meslemani AH, Sandri C, Schjerling P, Vissing K, Andersen JL, Rossini K, Carraro U, Angelini C. Caspase 3 expression correlates with skeletal muscle apoptosis in duchenne and facioscapulo human muscular dystrophy. A potential target for pharmacological treatment? J Neuropathol Exp Neurol 2001; 60(3): 302‐12.  

259. Sanger JW, Sanger JM, Franzini‐Armstrong C. Assembly of the skeletal muscle cell. In: Engel AG, Franzini‐Armstrong C, editors. Myology. McGraw‐Hill 2004, USA: p. 45‐65.  

260. Sansone V, Griggs RC, Moxley RT,3rd. Hypothyroidism unmasking proximal myotonic myopathy. Neuromuscul Disord 2000; 10(3): 165‐72.  

261. Sarkar PS, Appukuttan B, Han J, Ito Y, Ai C, Tsai W, Chai Y, Stout JT, Reddy S. Heterozygous loss of Six5 in mice is sufficient to cause ocular cataracts. Nat Genet 2000; 25(1): 110‐4.  

262. Savkur RS, Philips AV, Cooper TA. Aberrant regulation of insulin receptor alternative splicing is associated with insulin resistance in myotonic dystrophy. Nat Genet 2001; 29(1): 40‐7.  

263. Savkur RS, Philips AV, Cooper TA, Dalton JC, Moseley ML, Ranum LP, Day JW. Insulin receptor splicing alteration in myotonic dystrophy type 2. Am J Hum Genet 2004; 74(6): 1309‐13.  

264. Schneider C, Ziegler A, Ricker K, Grimm T, Kress W, Reimers CD, Meinck H, Reiners K, Toyka KV. Proximal myotonic myopathy: Evidence for anticipation in families with linkage to chromosome 3q. Neurology 2000; 55(3): 383‐8.  

265. Schneider‐Gold C, Beck M, Wessig C, George A, Kele H, Reiners K, Toyka KV. Creatine monohydrate in DM2/PROMM: A double‐blind placebo‐controlled clinical study. Neurology 2003; 60(3): 500‐2.  

266. Schoser B, Timchenko L. Myotonic dystrophies 1 and 2: Complex diseases with complex mechanisms. Curr Genomics 2010; 11(2): 77‐90.  

267. Schoser BG, Ricker K, Schneider‐Gold C, Hengstenberg C, Durre J, Bultmann B, Kress W, Day JW, Ranum LP. Sudden cardiac death in myotonic dystrophy type 2. Neurology 2004; 63(12): 2402‐4.  

268. Schoser BG, Schneider‐Gold C, Kress W, Goebel HH, Reilich P, Koch MC, Pongratz DE, Toyka KV, Lochmuller H, Ricker K. Muscle pathology in 57 patients with myotonic dystrophy type 2. Muscle Nerve 2004; 29(2): 275‐81.  

Page 122: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

122 |

269. Seale P, Ishibashi J, Scime A, Rudnicki MA. Pax7 is necessary and sufficient for the myogenic specification of CD45+:Sca1+ stem cells from injured muscle. PLoS Biol 2004; 2(5): E130.  

270. Selcen D, Engel AG. Mutations in ZASP define a novel form of muscular dystrophy in humans. Ann Neurol 2005; 57(2): 269‐76.  

271. Sergeant N, Sablonniere B, Schraen‐Maschke S, Ghestem A, Maurage CA, Wattez A, Vermersch P, Delacourte A. Dysregulation of human brain microtubule‐associated tau mRNA maturation in myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet 2001; 10(19): 2143‐55.  

272. Serrano AL, Murgia M, Pallafacchina G, Calabria E, Coniglio P, Lomo T, Schiaffino S. Calcineurin controls nerve activity‐dependent specification of slow skeletal muscle fibers but not muscle growth. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98(23): 13108‐13.  

273. Seznec H, Lia‐Baldini AS, Duros C, Fouquet C, Lacroix C, Hofmann‐Radvanyi H, Junien C, Gourdon G. Transgenic mice carrying large human genomic sequences with expanded CTG repeat mimic closely the DM CTG repeat intergenerational and somatic instability. Hum Mol Genet 2000; 9(8): 1185‐94.  

274. Seznec H, Agbulut O, Sergeant N, Savouret C, Ghestem A, Tabti N, Willer JC, Ourth L, Duros C, Brisson E, Fouquet C, Butler‐Browne G, Delacourte A, Junien C, Gourdon G. Mice transgenic for the human myotonic dystrophy region with expanded CTG repeats display muscular and brain abnormalities. Hum Mol Genet 2001; 10(23): 2717‐26.  

275. Simmerman HK, Jones LR. Phospholamban: Protein structure, mechanism of action, and role in cardiac function. Physiol Rev 1998; 78(4): 921‐47.  

276. Southern EM. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 1975; 98(3): 503‐17.  

277. Stoll G, von Giesen HJ, Koch MC, Arendt G, Benecke R. Proximal myotonic myopathy syndrome in the absence of trinucleotide repeat expansions. Muscle Nerve 1995; 18(7): 782‐3.  

278. Strachan T, Read AP. Human molecular genetics. BIOS Scientific Publishers Ltd, 1999, Oxford, UK. 

279. Summerton J. Morpholino antisense oligomers: The case for an RNase H‐independent structural type. Biochim Biophys Acta 1999; 1489(1): 141‐58.  

280. Suominen T, Schoser B, Raheem O, Auvinen S, Walter M, Krahe R, Lochmuller H, Kress W, Udd B. High frequency of co‐segregating CLCN1 mutations among myotonic dystrophy type 2 patients from Finland and Germany. J Neurol 2008; 255(11): 1731‐6.  

281. Tajsharghi H, Hilton‐Jones D, Raheem O, Saukkonen AM, Oldfors A, Udd B. Human disease caused by loss of fast IIa myosin heavy chain due to recessive MYH2 mutations. Brain 2010; 133(Pt 5): 1451‐9.  

282. Takada F, Vander Woude DL, Tong HQ, Thompson TG, Watkins SC, Kunkel LM, Beggs AH. Myozenin: An alpha‐actinin‐ and gamma‐filamin‐binding protein of skeletal muscle Z lines. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98(4): 1595‐600.  

283. Taneja KL, McCurrach M, Schalling M, Housman D, Singer RH. Foci of trinucleotide repeat transcripts in nuclei of myotonic dystrophy cells and tissues. J Cell Biol 1995; 128(6): 995‐1002.  

284. Terwilliger JD, Ott J. Handbook of human genetic linkage. The John Hopkins University Press 1994, Baltimore, USA.  

285. Tews DS. Muscle‐fiber apoptosis in neuromuscular diseases. Muscle Nerve 2005; 32(4): 443‐58.  

286. Thayer MJ, Tapscott SJ, Davis RL, Wright WE, Lassar AB, Weintraub H. Positive autoregulation of the myogenic determination gene MyoD1. Cell 1989; 58(2): 241‐8.  

287. Thornton CA, Griggs RC, Moxley RT,3rd. Myotonic dystrophy with no trinucleotide repeat expansion. Ann Neurol 1994; 35(3): 269‐72.  

Page 123: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 123

288. Thornton CA, Johnson K, Moxley RT,3rd. Myotonic dystrophy patients have larger CTG expansions in skeletal muscle than in leukocytes. Ann Neurol 1994; 35(1): 104‐7.  

289. Thornton CA, Wymer JP, Simmons Z, McClain C, Moxley RT,3rd. Expansion of the myotonic dystrophy CTG repeat reduces expression of the flanking DMAHP gene. Nat Genet 1997; 16(4): 407‐9.  

290. Tieleman AA, den Broeder AA, van de Logt AE, van Engelen BG. Strong association between myotonic dystrophy type 2 and autoimmune diseases. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2009; 80(11): 1293‐5.  

291. Tieleman AA, Knuijt S, van Vliet J, de Swart BJ, Ensink R, van Engelen BG. Dysphagia is present but mild in myotonic dystrophy type 2. Neuromuscul Disord 2009; 19(3): 196‐8.  

292. Tieleman AA, van Vliet J, Jansen JB, van der Kooi AJ, Borm GF, van Engelen BG. Gastrointestinal involvement is frequent in myotonic dystrophy type 2. Neuromuscul Disord 2008; 18(8): 646‐9.  

293. Tijo JH, Levan A. The chromosome number in man. Hereditas 1956; 42: 1‐6.  294. Timchenko LT, Salisbury E, Wang GL, Nguyen H, Albrecht JH, Hershey JW, Timchenko 

NA. Age‐specific CUGBP1‐eIF2 complex increases translation of CCAAT/enhancer‐binding protein beta in old liver. J Biol Chem 2006; 281(43): 32806‐19.  

295. Timchenko NA, Iakova P, Cai ZJ, Smith JR, Timchenko LT. Molecular basis for impaired muscle differentiation in myotonic dystrophy. Mol Cell Biol 2001; 21(20): 6927‐38.  

296. Timchenko NA, Patel R, Iakova P, Cai ZJ, Quan L, Timchenko LT. Overexpression of CUG triplet repeat‐binding protein, CUGBP1, in mice inhibits myogenesis. J Biol Chem 2004; 279(13): 13129‐39.  

297. Timchenko NA, Cai ZJ, Welm AL, Reddy S, Ashizawa T, Timchenko LT. RNA CUG repeats sequester CUGBP1 and alter protein levels and activity of CUGBP1. J Biol Chem 2001; 276(11): 7820‐6.  

298. Turner C, Hilton‐Jones D. The myotonic dystrophies: Diagnosis and management. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2010; 81(4): 358‐67.  

299. Udd B. Lihastautipotilaita on suomessa yli 10000. Suomen Lääkärilehti 2007; 6: 519‐22.  300. Udd B, Krahe R, Wallgren‐Pettersson C, Falck B, Kalimo H. Proximal myotonic 

dystrophy‐‐a family with autosomal dominant muscular dystrophy, cataracts, hearing loss and hypogonadism: Heterogeneity of proximal myotonic syndromes? Neuromuscul Disord 1997; 7(4): 217‐28.  

301. Udd B, Meola G, Krahe R, Thornton C, Ranum L, Day J, Bassez G, Ricker K. Report of the 115th ENMC workshop: DM2/PROMM and other myotonic dystrophies. 3rd workshop, 14‐16 February 2003, Naarden, the Netherlands. Neuromuscul Disord 2003; 13(7‐8): 589‐96.  

302. Udd B, Meola G, Krahe R, Thornton C, Ranum LP, Bassez G, Kress W, Schoser B, Moxley R. 140th ENMC international workshop: Myotonic dystrophy DM2/PROMM and other myotonic dystrophies with guidelines on management. Neuromuscul Disord 2006; 16(6): 403‐13.  

303. van den Broek WJ, Nelen MR, Wansink DG, Coerwinkel MM, te Riele H, Groenen PJ, Wieringa B. Somatic expansion behaviour of the (CTG)n repeat in myotonic dystrophy knock‐in mice is differentially affected by Msh3 and Msh6 mismatch‐repair proteins. Hum Mol Genet 2002; 11(2): 191‐8.  

304. Vatta M, Mohapatra B, Jimenez S, Sanchez X, Faulkner G, Perles Z, Sinagra G, Lin JH, Vu TM, Zhou Q, Bowles KR, Di Lenarda A, Schimmenti L, Fox M, Chrisco MA, Murphy RT, McKenna W, Elliott P, Bowles NE, Chen J, Valle G, Towbin JA. Mutations in Cypher/ZASP in patients with dilated cardiomyopathy and left ventricular non‐compaction. J Am Coll Cardiol 2003; 42(11): 2014‐27.  

Page 124: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

124 |

305. Vicart P, Caron A, Guicheney P, Li Z, Prevost MC, Faure A, Chateau D, Chapon F, Tome F, Dupret JM, Paulin D, Fardeau M. A missense mutation in the alphaB‐crystallin chaperone gene causes a desmin‐related myopathy. Nat Genet 1998; 20(1): 92‐5.  

306. Vielhaber S, Jakubiczka S, Gaul C, Schoenfeld MA, Debska‐Vielhaber G, Zierz S, Heinze HJ, Niessen HG, Kaufmann J. Brain 1H magnetic resonance spectroscopic differences in myotonic dystrophy type 2 and type 1. Muscle Nerve 2006; 34(2): 145‐52.  

307. Vihola A, Bassez G, Meola G, Zhang S, Haapasalo H, Paetau A, Mancinelli E, Rouche A, Hogrel JY, Laforet P, Maisonobe T, Pellissier JF, Krahe R, Eymard B, Udd B. Histopathological differences of myotonic dystrophy type 1 (DM1) and PROMM/DM2. Neurology 2003; 60(11): 1854‐7.  

308. Vlasova IA, Tahoe NM, Fan D, Larsson O, Rattenbacher B, Sternjohn JR, Vasdewani J, Karypis G, Reilly CS, Bitterman PB, Bohjanen PR. Conserved GU‐rich elements mediate mRNA decay by binding to CUG‐binding protein 1. Mol Cell 2008; 29(2): 263‐70.  

309. Voet NB, van der Kooi EL, Riphagen II, Lindeman E, van Engelen BG, Geurts AC. Strength training and aerobic exercise training for muscle disease. Cochrane Database Syst Rev 2010; (1): CD003907.  

310. Wang GS, Kearney DL, De Biasi M, Taffet G, Cooper TA. Elevation of RNA‐binding protein CUGBP1 is an early event in an inducible heart‐specific mouse model of myotonic dystrophy. J Clin Invest 2007; 117(10): 2802‐11.  

311. Wang GS, Kuyumcu‐Martinez MN, Sarma S, Mathur N, Wehrens XH, Cooper TA. PKC inhibition ameliorates the cardiac phenotype in a mouse model of myotonic dystrophy type 1. J Clin Invest 2009; 119(12): 3797‐806.  

312. Warden CH, Krisans SK, Purcell‐Huynh D, Leete LM, Daluiski A, Diep A, Taylor BA, Lusis AJ. Mouse cellular nucleic acid binding proteins: A highly conserved family identified by genetic mapping and sequencing. Genomics 1994; 24(1): 14‐9.  

313. Warf MB, Nakamori M, Matthys CM, Thornton CA, Berglund JA. Pentamidine reverses the splicing defects associated with myotonic dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A 2009; 106(44): 18551‐6.  

314. Watson JD, Crick FH. Genetical implications of the structure of deoxyribonucleic acid. Nature 1953; 171(4361): 964‐7.  

315. Weber YG, Roebling R, Kassubek J, Hoffmann S, Rosenbohm A, Wolf M, Steinbach P, Jurkat‐Rott K, Walter H, Reske SN, Lehmann‐Horn F, Mottaghy FM, Lerche H. Comparative analysis of brain structure, metabolism, and cognition in myotonic dystrophy 1 and 2. Neurology 2010; 74(14): 1108‐17.  

316. Webster C, Silberstein L, Hays AP, Blau HM. Fast muscle fibers are preferentially affected in Duchenne muscular dystrophy. Cell 1988; 52(4): 503‐13.  

317. Wei L, Hanna AD, Beard NA, Dulhunty AF. Unique isoform‐specific properties of calsequestrin in the heart and skeletal muscle. Cell Calcium 2009; 45(5): 474‐84.  

318. Wei L, Gallant EM, Dulhunty AF, Beard NA. Junctin and triadin each activate skeletal ryanodine receptors but junctin alone mediates functional interactions with calsequestrin. Int J Biochem Cell Biol 2009; 41(11): 2214‐24.  

319. Weingarten TN, Hofer RE, Milone M, Sprung J. Anesthesia and myotonic dystrophy type 2: A case series. Can J Anaesth 2010; 57(3): 248‐55.  

320. Wheeler TM, Lueck JD, Swanson MS, Dirksen RT, Thornton CA. Correction of ClC‐1 splicing eliminates chloride channelopathy and myotonia in mouse models of myotonic dystrophy. J Clin Invest 2007; 117(12): 3952‐7.  

321. Wheeler TM, Sobczak K, Lueck JD, Osborne RJ, Lin X, Dirksen RT, Thornton CA. Reversal of RNA dominance by displacement of protein sequestered on triplet repeat RNA. Science 2009; 325(5938): 336‐9.  

Page 125: Myotonic dystrophy type 2 (DM2) : Diagnostic methods and

| 125

322. Wieser T, Bonsch D, Eger K, Schulte‐Mattler W, Zierz S. A family with PROMM not linked to the recently mapped PROMM locus DM2. Neuromuscul Disord 2000; 10(2): 141‐3.  

323. Wiltgen M, Tilz GP. DNA microarray analysis: Principles and clinical impact. Hematology 2007; 12(4): 271‐87.  

324. Winter A, Bornemann A. NCAM, vimentin and neonatal myosin heavy chain expression in human muscle diseases. Neuropathol Appl Neurobiol 1999; 25(5): 417‐24.  

325. Wohrle D, Kennerknecht I, Wolf M, Enders H, Schwemmle S, Steinbach P. Heterogeneity of DM kinase repeat expansion in different fetal tissues and further expansion during cell proliferation in vitro: Evidence for a casual involvement of methyl‐directed DNA mismatch repair in triplet repeat stability. Hum Mol Genet 1995; 4(7): 1147‐53.  

326. Wong LJ, Ashizawa T, Monckton DG, Caskey CT, Richards CS. Somatic heterogeneity of the CTG repeat in myotonic dystrophy is age and size dependent. Am J Hum Genet 1995; 56(1): 114‐22.  

327. Wozniak AC, Kong J, Bock E, Pilipowicz O, Anderson JE. Signaling satellite‐cell activation in skeletal muscle: Markers, models, stretch, and potential alternate pathways. Muscle Nerve 2005; 31(3): 283‐300.  

328. Wu QL, Jha PK, Raychowdhury MK, Du Y, Leavis PC, Sarkar S. Isolation and characterization of human fast skeletal beta troponin T cDNA: Comparative sequence analysis of isoforms and insight into the evolution of members of a multigene family. DNA Cell Biol 1994; 13(3): 217‐33.  

329. Yotova V, Labuda D, Zietkiewicz E, Gehl D, Lovell A, Lefebvre JF, Bourgeois S, Lemieux‐Blanchard E, Labuda M, Vezina H, Houde L, Tremblay M, Toupance B, Heyer E, Hudson TJ, Laberge C. Anatomy of a founder effect: Myotonic dystrophy in northeastern Quebec. Hum Genet 2005; 117(2‐3): 177‐87.  

330. Zarain‐Herzberg A, MacLennan DH, Periasamy M. Characterization of rabbit cardiac sarco(endo)plasmic reticulum Ca2(+)‐ATPase gene. J Biol Chem 1990; 265(8): 4670‐7.  

331. Zhang L, Lee JE, Wilusz J, Wilusz CJ. The RNA‐binding protein CUGBP1 regulates stability of tumor necrosis factor mRNA in muscle cells: Implications for myotonic dystrophy. J Biol Chem 2008; 283(33): 22457‐63.