1

IN VITRO IN VITRO SEJTVONAL VIZSGSEJTVONAL VIZSGÁÁLATOK LATOK GYGYÓÓGYSZERTECHNOLGYSZERTECHNOLÓÓGIAI VONATKOZGIAI VONATKOZÁÁSAISAI

NAZNAZÁÁLIS LIS ÉÉS BS BÉÉLEPITLEPITÉÉLSEJTLSEJT MODELLEKMODELLEK

Deli MáriaMTA Szegedi Biológiai Központ

Biofizikai IntézetMolekuláris Neurobiológiai Csoport

• Sejttenyészetek a biofarmáciában• Nazális epitélsejtvonal modell• Bélepitél sejtvonal modell• Toxicitás vizsgálatok• Permeabilitás vizsgálatok• Összefoglalás

NAZNAZÁÁLIS LIS ÉÉS BS BÉÉLLEPITEPITÉÉLSEJT MODELLEKLSEJT MODELLEK

• 10-15 év egy gyógyszer kifejlesztése• 500-1000 millió USD költség

Molekula fejlesztés

2-3 év

Preklinikai fejlesztés

3-5 év

Klinikai vizsgálatok

5-10 év

molekula5,000-10,000 5 - 10

10,0001

10,000

Targetazonosítás

MolekulaMolekulaszintszintééziszis

VezVezéérr--molekulamolekulaazonosazonosííttááss

Klinikaivizsgálatok

VezVezéérr--molekulamolekula

optimalizoptimalizáállááss

A GYA GYÓÓGYSZERFEJLESZTGYSZERFEJLESZTÉÉS LS LÉÉPPÉÉSEISEI

• A klinikai vizsgálatokon egyes ígéretes molekulák mégsem váltják be a reményeket, és nem lesznek gyógyszerekfő okok– toxicitás– nem megfelelő farmakokinetikai tulajdonságok

• In vivo barrierek:– vér-agy gát– placenta – testis

Hámsejt barrierek– bőr – légutak hámja (orr, tüdő)– gasztrointesztinális felszín

IN VIVOIN VIVO BARRIEREK BARRIEREK ÉÉS GYS GYÓÓGYSZERGYSZERÁÁTJUTTJUTÁÁSS

• A gyógyszermolekulák felszívódásának, megoszlásának és természetes barriereken való átjutásának vizsgálata már a molekula fejlesztés és optimalizálás korai fázisában döntő.

• Módszerek az in vivo permeabilitás becslésére– számítógépes molekula modellezés (in silico)– anyagmegoszlás kétfázisú rendszerekben (n-oktanol/víz, liposzóma /puffer)– mesterséges membránok (PAMPA)– sejttenyészeten alapuló modellek (epitél- illetve endotélsejtek, sejtvonalak)– izolált szerveken perfúzió– állatkísérletek

• Előnyök és hátrányok– etikai szempontok: EU irányelvek, állatkísérletek kiváltása– gyorsaság, hatékonyság (automatizálás, nagy áteresztőképesség)– költségek

IN VIVOIN VIVO BARRIEREKEN VALBARRIEREKEN VALÓÓ ÁÁTJUTTJUTÁÁS BECSLS BECSLÉÉSESE

A sejttenyészetek köztes komplexitást képviselnek az állatkísérletek és az izotróplipofil fázisok között: alacsony – közepes „throughput”, ún. „added value assay”

KOMPLEXITKOMPLEXITÁÁS PIRAMISS PIRAMIS

test

szervek

sejtek

sejtmembránok

liposzómák

izotróp lipofil fázisok, pl. oktanol

2

• Sejtek és sejtvonalak kontrollált eredete – ATCC: American Type Culture Collection– ECACC: European Collection of Cell Cultures

• Standard tápfolyadék, letesztelt szérum, pontos összetételű szérum-helyettesítő

• Pontosan megadott tenyésztőfelszín – műanyag, üveg, bevont filterek

• Standard kísérleti körülmények a mérések során:– megadott sejtszám– reprodukálható sejtszám a növekedés azonos fázisaiban– reprodukálható elektromos ellenállás adatok– jellegzetes sejtmorfológia (pl. egysejtrétegek, sejtalak)– jellegzetes TJ képződés– transzporterek jellegzetes expressziója

SEJTTENYSEJTTENYÉÉSZTSZTÉÉSES MODELLEK STANDARDIZSES MODELLEK STANDARDIZÁÁLLÁÁSASA

permeabilitás méréseellenállás mérése

TENYTENYÉÉSZTSZTÉÉSES EPITSES EPITÉÉLSEJTLSEJT MODELLMODELLEKEK

Transwell filterek

epitélsejtek

• Sejttenyészetek a biofarmáciában• Nazális epitélsejtvonal modell• Bélepitél sejtvonal modell• Toxicitás vizsgálatok• Permeabilitás vizsgálatok• Összefoglalás

NAZNAZÁÁLIS LIS ÉÉS BS BÉÉLLEPITEPITÉÉLSEJT MODELLEKLSEJT MODELLEK• Helyi hatás: allergia, nátha, fertőzés

• Szisztémás gyógyszerbevitel: krízis terápia (epilepszia, migraine)

• Vakcinálás: antigének, DNS vakcinák

• Út a központi idegrendszerbe: megkerüli a vér-agy gátat

• Előnyei: gyors abszorpció (3-5 perc)a máj first-pass metabolizmusának elkerülése

• Biohasznosulás: ~ 1%: inzulin, kalcitonin~10%: morfin, sumatriptan~60%: butorphanol ~90%: fentanyl

• Forgalomban lévő szisztémás hatással rendelkező nazális készítmények: calcitonin (Novartis), desmopressin (Ferring), sumatriptan (GSK), buserelin (Sanofi-Aventis), fentanyl (Nycomed Pharma)

IINTRANAZNTRANAZÁÁLIS GYLIS GYÓÓGYSZERBEVITELGYSZERBEVITEL

TTRANSZPORTRANSZPORT AZAZ EPITEPITÉÉLIUMON KERESZTLIUMON KERESZTÜÜLLAZ AZ ORRORRÜÜREG HREG HÁÁMJMJÁÁNAK NAK ÉÉS AZ AGYS AZ AGY EREEREINEINEK K

PERMEABILITPERMEABILITÁÁSASA

2 % fluoreszcein + Evans kék, intravénásanRR: légzőhám, RO: szaglóhámBO: szaglógumó, CTX: frontális agykéreg

3

NAZNAZÁÁLIS BARRIEREKLIS BARRIEREK

• epitélsejtréteg• szaglóideget burkoló OEC sejtek

Wolburg et al., Histochem. Cell Biol., 130: 127-140, 2008

piros: claudin-5 immunfestészöld: ZO-1 immunfestés

RPMIRPMI--2650 SEJTVONAL2650 SEJTVONAL

• Humán nazális epitél sejtvonalanaplasztikus nazális septumMoore et al. 1964

• Epitélsejt tulajdonságok:

egy- vagy többsejtrétegben nő

hengeres, polarizált sejtmorfológia

mikrovillusok és mukoid bevonat

sejtközötti kapcsolatok (nyilak)

RPMIRPMI--2650 SEJTVONAL2650 SEJTVONAL

Tenyésztési körülmények: MEM+10% FBS

Sejtsűrűség a tenyészet indításakor:5 x 105 sejt/cm2

Konfluencia elérése 3-4 nap alatt

Barrier funkció:

TEER: 45 Ω x cm2

Papp FD4: 9,2 x 10-6 cm/s

piros: β-catenin immunfestéskék: sejtmag

• Sejttenyészetek a biofarmáciában• Nazális epitélsejtvonal modell• Bélepitél sejtvonal modell• Toxicitás vizsgálatok• Permeabilitás vizsgálatok• Összefoglalás

NAZNAZÁÁLIS LIS ÉÉS BS BÉÉLLEPITEPITÉÉLSEJT LSEJT MODELLEKMODELLEK

CACOCACO--2 SEJTVONAL2 SEJTVONAL

• Humán vastagbél adenocarcinomaCaco: carcinoma of colon(Fogh és mtsai., 1977)

• Epitélsejt tulajdonságok:egysejtrétegben nőhengeres, polarizált sejtmorfológiamikrovillusok apikálisanszoros zárókapcsolatok (TJ)dezmoszóma (D)interdigitáció (ID)

• Vékonybél enzimek:szukráz-izomaltázlaktázaminopeptidáz-Ndipeptidil-peptidáz IV

CACOCACO--2 SEJTVONAL 2 SEJTVONAL -- TRANSZPORTEREKTRANSZPORTEREK

• Karrier mediálta transzport (kétirányú, tápanyagok)hexóz transzport rendszerek (GLUT-1, 2, 3, 5) – glükóz, mannózaminosavak (System L, B, X) – Ala, Arg, Gln, Glu, Phefémion transzporter (DMT-1)C-vitamin transzporter (SVCT-1)

• Aktív efflux transzporterP-glikoprotein

• Receptor mediálta transzcitózisDi-tripeptid transzporter (PepT1, HPT1)

piros: ZO-1 immunfestéskék: sejtmag

4

CACOCACO--2 MODELL JELLEMZ2 MODELL JELLEMZŐŐII

• Sejtsűrűség a tenyészet indításakor: 105 sejt/cm2

• Konfluencia elérése 2-3 nap

• Stacioner állapot elérése 10-21 nap

• Sejtszám stacioner állapotban 4 x 105 sejt/cm2

• TEER 6-700 x cm2

• Papp fluoreszcein 4 x 10-7 cm/s

1. Passzív transzcelluláris, azaz sejten keresztüli transzport

2. Passzív paracelluláris, azaz sejtek közötti transzport

3. Aktív, karrier mediálta sejten keresztüli transzport

4. Transzcitózis

TRANSZPORTUTAK BTRANSZPORTUTAK BÉÉLEPITLEPITÉÉLSEJTEKENLSEJTEKEN

CACOCACO--2 2 ÉÉS S IN VIVOIN VIVO TRANSZPORTTRANSZPORT

Artursson et al., Adv Drug Deliv Rev, 2001

• Sejttenyészetek a biofarmáciában• Nazális epitélsejtvonal modell• Bélepitél sejtvonal modell• Toxicitás vizsgálatok• Permeabilitás vizsgálatok• Összefoglalás

NAZNAZÁÁLIS LIS ÉÉS BS BÉÉLLEPITEPITÉÉLSEJT LSEJT MODELLEKMODELLEK

MTT festék átalakításéletképesség mérése

Laktát-dehidrogenáz felszabadulássejtpusztulás mérése

SEJTKSEJTKÁÁROSODROSODÁÁS MS MÉÉRRÉÉSE SE

Valós idejű jelölésmentes sejtanalízis Kettős fluoreszcens sejtmagfestés

• sejtmembrán károsodás hatására az intracelluláris laktát dehidrogenáz enzim felszabadul

• (nekrotikus) sejtpusztulást mér• 100 % toxicitás: 1% Triton X 100 detergens• kolorimetriás végpont teszt (Roche kit)• abszorbancia mérése 492 nm hullámhosszon

LAKTLAKTÁÁT DEHIDROGENT DEHIDROGENÁÁZ FELSZABADULZ FELSZABADULÁÁSS

• Caco-2 egysejtréteg• tenyésztés 96-lyukú lemezen• excipiens dózis-függő toxikus hatást

mutat

5

MTT FESTMTT FESTÉÉK K ÁÁTALAKTALAKÍÍTTÁÁSS• a sárga MTT festéket enzimek a mitokondriumokban

és a sejtplazmában kék formazán kristályokká alakítják • életképességet mér• 100 % életképesség: kontroll (nem kezelt) sejtek• 100 % toxicitás: 1% Triton X 100 detergens• kolorimetriás végpont teszt• abszorbancia mérése 570 nm hullámhosszon

• Caco-2 egysejtréteg• tenyésztés 96-lyukú lemezen• excipiens dózis-függő toxikus hatást

mutat

MIKROELEKTRONIKUS SEJTMIKROELEKTRONIKUS SEJTÉÉRZRZÉÉKELKELÉÉSS

• valós idejű jelölésmentes sejtanalízis• impedancia mérés• 96-lyukú tenyésztőlemez arany elektródákkal• xCelligence (Roche) műszer• 100 % életképesség: kontroll (nem kezelt) sejtek• 100 % toxicitás: 1% Triton X 100 detergens

Control

D-1216 0,01%M-1695 0,01%

Triton X 1%D-1216 0,03%M-1695 0,03%M-1695 0,1%D-1216 0,1%

• RPMI 2650 sejtek• E-lemez • kinetika mérése• excipiens dózis-függő

toxikus hatást mutat

FLUORESZCENS SEJTMAGFESTFLUORESZCENS SEJTMAGFESTÉÉSS• morfológiai módszer• élő sejteket fluoreszcens festékkel inkubáljuk

bis-benzimid (kék) minden sejtmagot megfest ethidium homodimer-1 (piros) csak az elpusztult sejtek magját festi meg

• fotózás: fluoreszcens mikroszkóppal

• üveg fedőlemezen tenyésztett RPMI 2650 sejtek• excipiensek dózis-függő toxikus hatást mutatnak

• Sejttenyészetek a biofarmáciában• Nazális epitélsejtvonal modell• Bélepitél sejtvonal modell• Toxicitás vizsgálatok• Permeabilitás vizsgálatok• Összefoglalás

NAZNAZÁÁLIS LIS ÉÉS BS BÉÉLLEPITEPITÉÉLSEJT LSEJT MODELLEKMODELLEK

PERMEABILITPERMEABILITÁÁS MS MÉÉRRÉÉSSÉÉRE HASZNRE HASZNÁÁLT LT JELZJELZŐŐANYAGOKANYAGOK

Paracelluláris jelzőanyagok• nem lehetnek receptorok, transzporterek, enzimek

ligandjai• fluoreszcens vagy izotóp jelölés• nem jelölt ligand: HPLC, LCMS szukróz

• fluoreszcein, szukróz, mannitol (ms: 3-400 Da)• FITC-dextránok, (FITC)-inulin (ms: 4-5000 Da)

Transzendoteliális transzport markerek• albumin (nem-specifikus transzport) fluoreszcein

• bármilyen receptor ligand: peptid, protein, lipoprotein, stb.

Δt

① ②

A JELZA JELZŐŐANYAG ANYAG ÁÁTJUTTJUTÁÁSSÁÁNAK MNAK MÉÉRRÉÉSESE

“felső” kompartmentluminális vagy apikálisVL – luminális térfogat (pl. 500 µl) [C]L – luminális koncentráció (ismert)

“alsó” kompartmentabluminális vagy bazális/bazolaterálisVA – abluminális térfogat (pl. 1500 µl) [C]A – abluminális koncentráció(mért)

mérési gyakoriság• 1 időpont: pl. 60 perc vagy 120 perc• több időpont: pl. 20 – 40 – 60 perc

6

• A clearance az a luminális kompartment térfogat (ml, µl)amelyikből a jelzőanyag egységnyi idő alatt teljesen kikerül (diffúzióvagy filter-hatás következtében) az abluminális kompartmentbe

• Az in vitro modelleken végzett clearance számítás hasonlít a vese clearancekiszámításához:

clearance (ml) = [C]vizelet × vizelet térfogat[C]artéria

clearance (µl) = [C]A × VA[C]L

[C]A – abluminális jelzőanyag koncentrációVA – abluminális kamra térfogata[C]L – kezdeti luminális jelzőanyag koncentráció

CLEARANCE SZCLEARANCE SZÁÁMMÍÍTTÁÁS S ININ VITRO VITRO MODELLEKEN MODELLEKEN

050

100150200250300350400

0 20 40 60 80

Time [min]

Cle

aran

ce

• A PS kiszámításához a clearance adatokat az eltelt idő függvényében ábrázoljuk, vagyis ez nem más, mint az adott idő alatt átjutó clearance (µl/min) az adott felszínre vonatkoztatva

•Az egyenes meredekségét (átlag és standard hiba) lineáris regresszió analízissegítségével határozzuk meg

PSt – az egysejtréteg clearance értékének (összes=filter+monolayer)meredeksége

PSf – az üres filter clearanceértékének meredeksége

PS: FELSZPS: FELSZÍÍNRE SZNRE SZÁÁMMÍÍTOTT PERMEABILITTOTT PERMEABILITÁÁSS

PERMEABILITPERMEABILITÁÁSI KOEFFICIENS : SI KOEFFICIENS : PPappapp• a látszólagos permeabilitási koefficienst (Papp) a Fick törvény alapján számoljuk• a permeabilitás koncentrációtól és felszíntől független mérésére szolgál• mértékegysége cm/s• a barrieren keresztüli anyagátjutás sebességét jelöli

[C]A × VAPapp (cm/s) =

[C]L × A × Δt

VA – abluminális térfogat (cm3)A – membrán felszín (cm2)[C]L – kiindulási luminális anyag koncentráció (ng/ml)[C]A – abluminális koncentráció (ng/ml)Δt – mérés időtartama (sec)

• magas Papp érték - gyors penetráció: szabad (transzcelluláris lipid-mediált) diffúzióinflux transzport mechanizmus

• alacsony Papp érték - lassú penetráció: paracelluláris barrierefflux mechanizmus

MIT JELENT A PMIT JELENT A Pappapp ÉÉRTRTÉÉK A GYAKORLATBAN?K A GYAKORLATBAN?

1.4paracelluláris diffúzióFluoreszcein

0.5paracelluláris diffúzióLucifer yellow

0.7paracelluláris diffúzióAtenolol

2.1efflux transzportCimetidin

3.7efflux transzportVinblasztin

6.5efflux transzportDigoxin

17.3efflux transzportLoperamid

37.7efflux transzportQuinidine

39.4efflux transzportVerapamil

51.8transcellular diffusionIndomethacin

85.4transcellular diffusionKoffein

86.3transcellular diffusionAntipyrin

Papp (x10-6 cm/s)Transzport mechanizmus

Hatóanyag/jelzőanyag

Caco-2 modell

PPappapp A GYAKORLATBAN: A GYAKORLATBAN: AZ EPITAZ EPITÉÉLSEJT MODELLEK ALKALMAZLSEJT MODELLEK ALKALMAZÁÁSASA

• RPMI 2650 sejtrétegek• FITC-dextrán permeabilitás dózis-függőnövekedése excipiens

hatására

• A sejttenyészeten alapuló modellek- fontos eszközei a preklinikai gyógyszerfejlesztésének- adatokat szolgáltatnak az in vivo permeabilitás és toxicitás

becsléséhez

- a Caco-2 sejtvonal a vékonybélen, az RPMI-2650 az orr-nyálkahártyán való gyógyszerfelszívódás tenyésztéses modellje

ÖÖSSZEFOGLALSSZEFOGLALÁÁSS

Target identification

Molecule synthesis

Leadcompoundidentification

Clinical TrialPre-Clinical investigations