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Neue Wege in der Leberzellkultur:Die ImmobilisationstechnikMarc Wick', Hans-Gunter Koebe', Friedrich Wilhelm Schildberg'IRuhruni versitat, D-Bochum, 2Ludwig-Maximilans- Universitat, D-Munchen

ZusammenfassungUntersuchungen zum Lebermetabolismus werden an Hepatozy-tenkulturen verschiedener Spezies, meistens an Rattenrellen,durchgefiihrt. Die Aussagefahigkeit dieser Versuche ist jedocherheblich eingeschrdnkt, da nicht alle Stoffwechselvorgange inder Rattenleber automatisch auf den Menschen ubertragbarsind. Untersuchungen an humanen Leberrellen sind dahereindeutig zu bevorzugen. Ein grofies Problem bisheriger invitro Untersuchungen ist die Unfahigkeit der Kulturverfahren,die Funktionsfahigkeit der Zellen auch uber Zeitraume vonmehreren Wochen unter standardisierten Bedingungen zugarantieren. In der vorgestellen Immobilisationstechnik wirddie in vivo Architektur der Leber auf in vitro verhdlinisseiibertragen. Leberspezifische Zelleistungen konnen mit diesemVerfahren uber 50 Tage lang unter standardisierten Bedingun-gen nachgewiesen werden. Die Zellmorphologie zeigteebenfalls ein intaktes Erscheinungsbild. Dies eroffnet neuePerspektiven bei der Einsparung von Tierversuchen, da sicbdie Zellimmobilisation zusatrlich aucli zur Kryokonservierungeignet und daher ein bedarfsgerechter Einsat: humanerHepatozyten moglicb ist. Ferner lassen sicb durch die Kombi-nation mit neuen Isolationstechniken Langzeitkulturen anSchweineleberzellen aus Schlachthofpriiparaten erzielen, wasebenso zur Redurierung von Tierversuchen beitragen kann.

1 Einleitung

Zahlreiche Untersuchungen in den Berei-chen Pharmakologie/Toxikologie, Hepa-tologie, Physiologie und Biochemie wer-den an lebenden Tieren verschiedener Spe-zies durchgefuhrt (Bruni und Chang, 1991;Cai et al. 1989).Untersuchungen zum Le-bermetabolismus erfolgten bislang zumgrofiten Teil an Rattenhepatozyten(Shimaoka et aI., 1987)). Zahlreiche Stoff-wechselvorgange in der Rattenleber sindjedoch nicht direkt auf den Menschenubertragbar und daher in ihrer Aussagefa-higkeit eingeschrankt (Fabre et aI., 1990).Veranderungen in der Isolationstechnik

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Summary: New ways in hepatocyte cultures: Cell immobilisati-on technique.Hepatocyte cultures are used for a variety of investigations inthe field of toxicology, pharmacology or hepatology. Above allrodent hepatocytes are used for these experiments. But manyresults from animal hepatocytes do not correspond to humanmetabolism. Therefore in vitro studies on human hepatocyteswould be extremely useful to reduce animal experiments. Oneof the major obstacles to the ultimate success of approaches inthe past was the inability of standard culture conditions tomaintain hepatocyte viability and differentiated function overlong term periods under standardised conditions. The tech-nique of cell immobilisation mimicks the in vivo architecture ofthe liver in vitro. This culture technique not only supports liverspecific functions over a period of 50 days but also preserveshepatocyte morphology. We conclude that the immobilisationtechnique is of considerable advantage as compared to othercell cullture systems, especially in order to reduce animalexperiments. Another advantage of cell immobilisation is thepossibility of cryoconservation for repeated investigations onbatch-controlled hepatocyte cultures. In combination with newtechniques of cell isolation, it is also possible to cultureporcine hepatocytes from slaughterhouse organs. This couldalso reduce animal experiments.

Keywords: hepatocyte culture, immobilisation technique,specific functions, morphology, cryoconservation, porcinehepatocytes

ermoglichten die Gewinnung humanerLeberzellen aus Operations- oder Biopsie-praparaten (Ballet et aI., 1984) und ver-besserten damit die Interpretation der ge-wonnenen Ergebnisse.

Hochdifferenzierte Parenchymzellenstell en jedoch besondere Anforderungenan ihre Umgebung, vor allem, wenn mansie fur langere Zeitraume auf3erhalb desOrgans (in vitro) funktionsfahig erhaltenwill (Dich et aI., 1988; Dunn et a1., 1989).Die einfacher zu kultivierenden Hepatorn-Zellinien zeigen in der Regel nur ein be-grenztes und haufig verandertes Funkti-onsspektrum im Vergleich zur Primarzel-Ie (Clayton et aI., 1985).

Nach del' Einfuhrung enzymatischerGewinnungstechniken fur Hepatozytendurch Berry und Friend (1969) wurdenzunachst Suspensionskulturen ohne Erfolgerprobt: Hepatozyten zeigten darin einenfriihen Funktionsverlust und starben inner-halb weniger Stunden ab. In Monolayer-Kulturen konnten einige leberspezifischeFunktionen uber Zeitraurne bis zu zweiWochen erhalten werden (Michalopoulosund Pi tot, 1975). Modifikationen diesel'Standardkulturtechnik wie z.B. die Kokul-tivierung verschiedener nichtparenchyma-ler Zelltypen (Clement und Guguen-Guil-louzo, 1984), del' Zusatz extrazellularerMatrixkomponenten (Rojkind et aI., 1980;

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Reid und Jefferson, 19R4) oder versehie-dene Mediumzusaize verlangcrten dieUberlebenszcit der ZeJlen in vitro (Dichet al., 1988). Dureh die Etablierung derSandwich-Technik wurden erstmals stan-dardisierte Versuchsbedingungen an Rat-tenleberzellen geschaffen (Elsdale undBard, 1972; Dunn et a!., 1989). Ryan uber-trug dieses Verfahren auch auf humaneHepatozyten (Ryan et a1., 1993).

Die vorgestellten Zellkulturtechnikenerlaubten bislang jedoch keine Langzeit-kulturen humaner Hepatozyten unter stan-dardisierbaren Bedingungen oder warenzeit- und materialaufwendig. In der vor-liegenden Arbeit wird die Immobilisati-onstechnik als neues und leicht anwend-bares Ku Iturverfahren vorgestellt. MitHilfe dieses Verfahrens konnen Untersu-chungen an Leberzellen libel' einen Zeit-raum von 50 Tagen unter standardisiertenBedingungen durchgefuhrt werden.

2 Material und Methoden

Das Lebergewebe fur die Zellisolationstammte aus Operationspraparaten derChirurgischen Klinik am Klinikum GroB-hadern. Die Patienten wurden praopera-tiv gemaf den Richtlinien der Ethikkom-mission aufgeklart. Das Gewicht del' ein-zein en Leberstucke schwankte zwischenJ0 und 120 g, del' Mittelwert betrug 56,23g bei insgesamt n==93 Isolationen.

Die Transportzeit des Lebergewebes bei4°C in einer Ca2+-und Mg2+_freien Krebs-Ringer Losung (KRBI) vom Operations-saal zum Labor betrug funf Minuten.

Im Labor wurden samtliche tubulareStrukturen (Gefabe, Gallengange) derSchnittflache unter sterilen Bedingungenmittels einer Knopfkanule mit 4° kalterKRBI Losung (50 ml) fur 5 min. vorsich-tig blutfrei gespult. AnschlieBend erfolg-te die enzymatische Andauung des Gewe-bes durch Kollagenase (Gross-Bellard etal., 1973; Koebe et al., 1996) sowie dieIsolation der Zellen. Nach Befestigungvon 2-6 Teflon Kanulen (1,3 mm Durch-messer) in sichtbaren tubularen Gefals-strukturen der Schnitrflache wurde das Le-berstuck mit Ca2+- und Mg2+-freier KRBLosung bei einer Geschwindigkcit von 25mIlKani.ile/min. perfundiert. Grofsere,nicht kaniilierbare Gefase wurden abge-klemmt. In einem Rezirkulationssystemerfolgte eine 20 minutige enzymatiseheAndauung des Gewebes mit karbogeni-

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siertem KRB (versetzt mit 0,05% Kolla-genase und 5 mM CaC12). Die Leberkap-sel wurde abgelost, das restliehe Gewebezusammen mit del' Kollagenaselosung ineinem vorgewarmten Becherglas (37°C)fiir 5 min. vorsichtig geschiittelt. Die Zell-suspension wurde zweimalunter sterilenBedingungen gefiltert (210 flI11,70 flI11Po-rengrofse), mit PBS versehen und einemdrcimaligen Waschvorgang unterzogen(17 g, 5 min). Um eine rnoglichst reineHepatozytenlosung zu erzielen, erfolgteanschlieBend eine Percoll%o Gradienten-zentrifugation bei 76 g. Die Hepatozytenwurden in Kulturmedium (Dulbeecos Mo-dified Eagle Medium (DMEM), versetztmit Insulin (125 U/I), Hydroeortison(60llg/I), Penicillin (l00 kUll), Gentami-cin (100 mg/l) und fotalern Kalberserum(FCS, 5%), resuspendiert. PCS wurde demMedium nur wahrend del' ersten 24 h zu-gegeben. In einer Fuchs-Rosental-Kam-mer wurden mit Hilfe eines Trypan BlauAusschluBtests Zellvitalitat und Zellzahlbestimmt. Die mittlere Zellzahl betrug 6x 106 Zellenl g Lebergewebe, bei einerVitali tat yon 93,3% ± 1,25.

2.1 Die Immobilisationstechnik (IT)KoJlagen und lOxDMEM (10: 1) wurdenmit del' Zellsuspension in einem Verhalt-nis von 1: I vermischt; die endgultige Kol-lagenkonzentration betrug 0,75 mg/ml beieiner Zellkonzentration von 2x106 Zellen/m1. Die Zell-Kollagen-Mischung (2ml)wurde ohne Zeitverzogerung auf vorge-kuhlten Kulturschalen (8.60 mm) verteilt.Die Zelldichte lag bei 2x 105 vitalen Zel-len/cm2. Urn ein gleichmabiges Absinkendel' Zellen im Sinne einer MonoJayer-Kon-figuration zu garantieren,muBte eine Gelierungszeitvon 10 min bei Raumtem-peratur und yon weiteren10 min in einem Inkuba-tor (37°C und 5% CO,)gewahrleistet werde~.Danach konnten die Zel-len mit 2 ml Kulturmedi-um bedeckt und inkubiertwerden. Del' Medium-wechsel erfolgte bei allenKulturtechniken initialnaeh 24h, danach in 48stlindigem Abstand. Uber-stande wurden fur weite-re analytische Messungeneingefroren (-20°C).

2.2 Morphologische StudienPh ase nkon trast -Lich tmi krosko pische(L.M.) Aufnahmen wurden mit einer Ni-kon%o F3 Kamera auf einem Zeiss%oAxiovert 10 Mikroskop durchgeftihrt.

2.3 Analytische Methoden:Konjugierte und unkonjugierte Kanin-chenantikorper (spezifisch fur Humanal-bumin) wurden WI'Messung del' Albumin-sekretion mittels ELISA verwandt; Ab-sorptionsmessung bei 492 nm in einemTitertek%o Multiscan Plus Reader. Weite-re Parameter zum Nachweis leberspezifi-scher Funktionen waren Glutarnat-Pyru-vat- Transaminase sowie die Glutamat-Oxalacetat -Transam inase.

2.4 DNA-MessungDel' DNA-Gehalt del' Leberzellen wurdemit leichten Modifikationen nach del' Be-schreibung von Gross-Bellard ermittelt(Gross-Bellard et a!. 1973): Nach einemzweimaligen Waschvorgang mit PBS(37°C) wurden die Zellkulturen fur eineStunde mit Kollagenase (37°C; 0,05%)inkubiert, danach dreimal gewaschen unddas Pelletresuspendiert.

Durch Zugabe von Proteinase K (60]..lg)und SDS (0,5%) wurden die Zellen lysiert.Nach einer Inkubationszeit von 20 min.(65°C) und 4h bei 37°C wurde Puffer IIhinzugeftigt. Die DNA-Extraktion erfolgtelibel' Nacht auf einern Rotator nach Phe-nol/Tris Applikation bei 37°C.Die Uberstande wurden vorsiehtig ent-

fernt, das gleiche Volumen an Chloroform/Isoamylalkohol wurde hinzugefugt undeine erneute Extraktion fiir 30 min. bei37°C angeschlossen. Die Reextraktion del'

20°C

37°C

Zell-KollagenGemisch

Kulturschale

10 min

1-- , Matrix mit Zellen

10 minI . . '-._v -~--- -- --:!]"'! 1~;7 rigil LED?,m

Kulturmedium

Hepatozytenkultur

Abbildung 1: Schema zur Kollagenimmobilisationhumaner Hepatozyten.

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Interphasen vcrbesserte deutlich die Er-gebnisse der einzelnen DNA-Bestimmun-gen.

AbschlieBende DNA-Prazipitation ausdem Uberstand durch Ethanol (-20°C) undzwei Waschvorgange mit 70%igem Etha-nol bildeten den letzten Arbeitsschritt vorder Bestimmung des DNA-Gehalts, derbei einer Extinktion von 260/280 nm ineinem Spektrometer bestimmt wurde.

2.5 KollagengewinnungType IKolJagen wurde aus Sehnengewe-be von Rattenschwanzen nach der Metho-de Yon Elsdale (Elsdale und Bard, 1972)gewonnen. Oas Sehnengewebe wurde bei4°C iiber Nacht in einer 3%igen Essigsau-relosung geruhrt, Es folgte die Filtrationder Losung durch einen Baumwollfilter.Eine 2stiindige Zentrifugation bei 10,960g (4°C) schlof sich an. Oer Uberstandwurde mit 30% NaCI (lIS des Gesamtvo-lumens) prazipitiert und fiir weitere 30min. bei l750 g zentrifugiert (4°C). DieAuflosung der Pellets geschah nach zweiweiteren Waschvorgangen (mit 0,6% Es-sigsaure/ 5% NaCl) in 200 ml 0,6%igerEssigsaure, Nach erneutem Riihren derLosung uber Nacht schlof sich ein mehr-maliger Dialysiervorgang nut 2 Liter 1mMHC an. Nach Chloroformgabe (111000 desVolumens) und 48 stundigem Riihren desKollagens bei 4°C wurden Proben ent-nommen, Iyophilisiert und zur Konzentra-tionsbestimmung gewogen. Es lieBen sichdurchschnittlich 100 mg (± 15 g) pro Rat-tenschwanz gewinnen.

3 Ergebnisse

3.1 Funktionsparameter immoblli-sierter humaner Hepatozyten in derLangzeitkulturUrn die Eignung des Imrnobilisationsver-fahrens fur langfristige in vitro Untersu-chungen zu uberprufen, wurden humaneHepatozyten (n=o) uber einen Zeitraumyon 50 Tagen kultiviert, die Mediurniiber-stande gesammelt und bei -20° C bis zurFunktionsanalyse eingefroren.Pur aile Gruppen gaJten die gleichen Aus-gangsbedingungen:Zellzahl/Kulturschale:

4 x ]06

Zellzahl/crn2:2 X ]05

Gesamtvolurnen/Kulturschale:4rnl

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3.2 Albuminsekretion-I··~-- - ---

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3.3 GPT-Freisetzung

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iQ",f!O,6

Zrit(TlII:t)

3.4 GOT-Freisetzung

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18 22 2S soZeit (fage)

Abbildung 2: Albuminsekre-tion immobilisierter huma-ner Hepatozyten fiber einenZeitraum von 50 Tagen; n=6.1m Laufe der ersten vierTage ergeben sich erhohteSekretionsraten mit Wertenbis zu 680 ng/h/1l9 DNA,wiihrend sich fUr den Restder Beobachtungsperiodestabile Verhiiltnisse miteinem Mittelwert von 368 ±91,61 ng/h/1l9 DNA.

Abbildung 3: GPT-Freiset-zung immobilisierter huma-ner Hepatozyten fiber einenZeitraum von 50 Tagen; n=6.Hochste Mengen an GPTwerden in den ersten vierKulturtagen treigesetzt. DerSpitzenwert am zweiten Kul-turtag ergibt 1,23 mUlh/1l9DNA. Danach vollzieht sichein kontinuierlicher Abfallder Freisetzung, wobei be-reits ab dem sechsten Kul-turtag bis zum Ende stabileWerte erzlelt werden. OerMittelwert betriigt 0,258 ±0,23 mUlh/1l9 DNA.

Abbildung 4: GOT-Freiset-zung immobilisierterhumaner Hepatozyten iibereinen Zeitraum von 50Tagen; n=6.Die groBte Freisetzung vonGOT wird ebenfalls in denersten beiden Kulturtagenfestgestellt (7,18 mUlh/1l9DNA), wiihrend sich fUr denRest der Kulturperiodestabile Werte auf niedrigemNiveau einpendeln. DerMittelwert betriigt 1,75 ± 1,4mUlh!llg DNA.

3.5 Morphologie humaner, immobilisierter Hepatozyten im Langzeitkulturver-lauf. Lichtmikroskopische Aufnahme

Abbildung 5: Morphologiehumaner Hepatozyten nach50 Kulturtagen im Immobili-sationsverfahren (4x1 06

Zellen/Kulturschale; 200.000Zellen/cms: Gesamtvolu-men/Kulturschale:4ml);VergroBerung: 320x;Phasenkontrast-Mikroskop;die Monolayerstruktur rnltmorphologisch intaktemZellverband (Hepatozyten)ist erhalten.

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4 Diskussion

Zahlreiche Untersuchungen in den Berei-chen Pharrnakologie, Toxikologie, Hepa-tologie oder Biochernie werden an Hepa-tozytcnkulturen durchgefuhrt (Ballet et aI.,1984; Yamomoto et al., 1989). Beispiel-haft sei dabei genannt: Der Einsatz huma-ner Leberzellen zur Einsparung yon Tier-versuchen in der pharmokologischen undtoxikologischen Forschung, da unbrauch-bare Testsubstanzen bereits zu einem fru-hen Zeitpunkt ausgesondert werden kon-nen, ohne auf Tierversuche zuruckgreifenzu rnussen (Fabre et al., 1990).

Ein entscheidendes Hindernis fur ange-wandte Untersuchungen an Leberzellenwar die Unfahigkeit bisheriger Kulturtech-niken, hepatozytare Funktionen in vitrouber einen langeren Zeitraum aufrecht zuerhalten (Wick, 1995). Damit waren Un-tersuchungen an humanen Hepatozytenuber langere Zeitraumc initial unrnoglich.

Hepatozyten sind hochdifferenzierteZellen, die an in vitro Bedingungen hoheAnforderungen stellen (Dunn et aI., J 991).Alternativ eingesetzte Hepatorn-Zellinien(TumorzeJlen) zeigten zwar exzellentesWachstum in der ZeIlkultur, ihr Einsatz inder Zellkultur ware jedoch nutzlos, denndiese ZelJinien erfullen nur sehr einge-schrankt hepatozytare Funktionen (Clay-ton et al., 1985).

Mit der Einfilhrung von KollagenasedUTChBerry und Friend (1969) wurdenerstmals standardisierte Bedingungen fureine enzymatische Hepatozytenisolationgeschaffen.

Die Kultivierung von Hepatozyten be-schrankte sich anfangs auf Suspensions-kulturen, die wenige Stunden nach derZellisolation verklumpten und sehr fruhdie Produktion spezifischer Parameter ein-stell ten. Michalopoulos erprobte erstma-Jig Kollagen als geeignete Tragermatrixfur die verankerungspflichtigen Leberzel-len (Michalopoulos und Pitot, 1975). Da-bei wurden Hepatozyten auf mit Kollagenvorbeschichtete Kulturtrager aufgetragenund inkubiert. Diese Methode ermoglich-te Leberzellfunktionen uber Zeitraumevon 14 Tagen und stellt bis heute das ei-gentliche Standardkulturverfahren dar.

Das Hinzufugen yon Extrazellularma-trix (BIOMATRIX%o) ZLl Rattenhepatozy-ten ermoglichte Zellkulturen bis zu 4 Wo-chen (Rojkindet aI., 1980). Kokulturenvon Hepatozyten mit Ieberabhangigen

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Epithelzellinien verlangerten ebenfalls dieFunktionsfahigkeit der Zellen (Clementund Guguen-Guillouzo, 1984). Die Kom-bination verschiedener Mediumadditivawie z.B. Glukokortikoide, Insulin oderGlukagon (Dich et al.,1988) erbrachteebenfalls Verbesserungen hinsichtlich derLangzeitkultivierung (Yamomoto et aI.,1989).Obwohl diese Modifikationen eine Ver-

besserung des in vitro Verhaltens der He-patozyten aufzeigen konnten, ist ihre kon-tinuierliche Anwendung in der Hepatozy-tenkultur entweder material- und zeitauf-wendig oder nur eingeschrankt standardi-sierbar wie z.B. die BIOMATRIX-Gewin-nung aus zerkleinertem Lebergewebe. In-teraktionen del' verschiedenen Zellinienuntereinander bei der Kokulti vierung yonHepatozyten garantieren nicht immergleichbleibende Untersuchungsergebnis-se. Ein Uberrnaf an Hormonen im Kul-turmedium zum Erhalt der Leberzellfunk-tionen schafft unphysiologische Verhalt-nisse mit zum Teil tiefgreifenden Veran-derungen im Zellmilieu.

Eine wesentliche Verbesserung derLangzeitkultivierbarkeit von Hepatozytenkonnte durch die Einflihrung del' Sand-wich- Technik erzielt werden (Dunn et al.,1989; Dunn et al., 1991): Indem die Le-berzeJlen zunachst auf eine Kollagen-schicht aufgebracht und anschlieBend yoneiner zweiten Kollagenschicht uberdecktwerden, wird in der Zellkultur die naturli-che geometrische Anordnung der Hepa-tozyten im Leberazinus nachgebildet. Ver-schiedene Syntheseparameter, wie z.B. dieAlbuminsekretion yon Rattenhepatozyten,konnten so bis zu 4 Wochen aufrechter-halten werden. Ryan ubertrug diese Kul-turtechnik erfolgreich auch auf humaneHepatozyten (Ryan et aI., 1993).

Ein GroBteil der beschriebenen Kultur-techniken wurde an Ratten- und nicht anhumanen Hepatozyten erprobt. Es beste-hen jedoeh signifikante Unterschiede inder Zelleistung (z.B. Albuminsekretion,Verstoffwechslung von Pharmaka) zwi-schen humanen Hepatozyten und solchenaus Rattenlebern, auch unter gleichen Kul-turbedingungen.

Vor allem im HinbJick auf Alternativenzu Tierexperimenten ware es wunschens-wert, in vitro Reaktionen und eventuellauftretende Gegenreaktionen des human enLebermetabolismus auch uber langereZeitraurne beobachten ZLl konnen (Lown

und Watkins, 1991).Mit dieser Arbeit wird eine neue, leicht

durchfuhrbare Methode fur eine erfolgrei-che Langzeitkultivierung humaner Hepa-tozyten in einer geschutzten, dreidimen-sionalen Umgebung vorgestellt: die Im-mobilisationstechnik.

Die Funktion der Leberzellen in Kulturwurde an Hand bestimmter Parameter

untersucht: der Albuminsekretion sowieder Freisetzung von GPT und GOT. Wieaus den Abbildungen 2-4 ersichtlich, un-terstiitzte das Immobilisationsverfahrendie ausgewahlten Funktionen der Leber-zelle uber den kompletten Beobachtungs-zeitraum von 50 Tagen.

Unter in vitro Bedingungen stieg dieGesamtproduktion vonAlbumin wahrenddel' ersten drei Kulturtage rasch an (sieheAbbildung 2) und erreichte schnell einGleichgewicht in der Produktionsrate, dasdann bis zum Kulturende stabil blieb. Diemittlere Sekretionsrate wurde mit 368 ±91,61 ng/h/mg gemessen.

Die Transaminasen, Glutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT) und Glutamat-Oxalacetat-Transaminase (GOT) solltenAufschliisse uber mogliche Zellschadi-gungen im Kulturverlauf geben. Unter invivo Bedingungen werden hochste Werteu.a. bei schweren Leberzellnekrosen fest-gestellt.

In dies em Versuch (Abbi ldungen 3 und4) zeigte sich, daB die Konzentrationenvon freigesetztem GPT wie auch von GOTwahrend der ersten zwei Kulturtage amhochsten waren (Spitzenwert bei GPT:1,23 mU/h/flg DNA; Spitzenwert beiGOT: 7,18 mU/h/)Jg DNA) und im weite-ren Kulturverlauf schnell auf niedrigeWerte abfielen. Dieser Sachverhalt konn-te durch die aggressiven enzymatischenIsolationsschritte bedingt sein, wobei VOl'

allem in den ersten 3-4 Kulturtagen eingewisser Zellverlust entsteht, bis dann ein"steady state" erreicht ist, del' bis zumKulturende gehalten werden kann. Des-halb scheint es im Hinblick auf eine ver-laBliehe Standardisierung der Methodikund vor allem angesichts einer Reprodu-zierbarkeit der Ergebnisse sinnvoll, Un-tersuchungen an Leberzellkulturen niehtvor dem dritten Kulturtag durchzufuhren;dadurch vermeidet man eine Stoning die-ser adaptiven Phase durch aufiere Einflus-se. Leider werden in der Praxis die mei-sten Untersuchungen an Hepatozytenschon wenige Stunden nach der Zelliso-

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WICKET AL.

lation begonnen und bereits nach 3-5 Ta-gen abgeschlossen (Reese und Byard,1981; Strom et a!., 1982). In einem direk-ten Verglcich zwischen Standardkulturver-fahren und immobilisierten Hepatozytenaus Operationspraparaten wurden bereitsdie wesentlichen Vorteile dieses neuenVerfahrens beschrieben (Koebe et al.,1994).Die Zellmorphologie wurde nach 50

Tagen lichtmikroskopisch beobachtet.Abbildung 5 demonstriert das rnorpholo-gische Erscheinungsbild yon immobili-sierten humanen Hepatozyten nach 50Kulturtagen. Die Zellen behielten ihrecharakteristische polygonale Form, bilde-ten einen konfluierenden Monolayer undzeigten kein Uberwachsen durch andereZelltypen wie z.B. Fibroblasten. Leberty-pische Kennzeichen wie z.B. ein abgerun-deter Zellkern, fein granuliertes Zytoplas-ma und durchgehende interzellulare Kon-takte sprechen dabei fur eine intakte Zell-morphologie auch nach 50 Tagen.

Mit dem vorgestellten Immobi-lisationssystem zur Zellkulti vie-rung soil die dreidimensionale invivo Architektur der Leberzelle so-weit als moglich in vitro imitiertwerden. Durch die Immobilisierungder Hepatozyten konnen aile Kon-taktflachen der Zellen (apikale undbas ale) mit der sie umgebenden ex-trazellularen Matrix in Verbindungtreten. Die Hepatozyten sind alsoin einerTyp I Kollagen Matrix ver-ankert (immobilisiert), die eine zel-lulare Strukturierung im Sinne ei-nes Monolayers wie auch die Aus-bildung interzellularer Kontakte(z.B. die Ausbildung yon Galleka-nalchen) nach dem Isolationsvor-gang erlaubt.

Obwohl die Zellen innerhalb ei-ner Kollagenmatrix kultiviert wer-den, sind wichtige Stoffwechsel-und Transportvorgange durch die-se "Barriere" nicht behindert.

Andere Methoden der Immobili -sation, wie z.B. die "microencap-sulation" (Cai et al., 1989) werdenebenfalls fur in vitro Untersuchun-gen hepatozytarer Funktionen ge-nutzt. In der zur Verfugung stehen-den Literatur erzieltcn diese Immo-bilisationsverfahren jedoch nochkeine befriedigenden Ergebnisse inBezug auf das Langzeitkulturver-

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halten humaner Hepatozyten. In diesenAnwendungen konnen die Zellen keineMonolayerkonfiguration ausbilden, wasaber nach unseren Erfahrungen vor allemin der Langzeitkultur unerlalslich ist. Zu-satzlich kann die morphologische Ent-wicklung dieser ZelJen unter Kulturbedin-gungen nicht verfolgt werden.

Im Vergleich zum Sandwich- Verfahrenzeichnet sich die Zellimmobilisationhauptsachlich durch die wesentlich einfa-chere Handhabung aus, was die Kontami-nationsgefahr fur die Zellen verringert(Koebe et aI., 1994). Fiir weitere Anwen-dungen yon Leberzellen als Bausteine ei-nes extrakorporalen Organersatzes wurdean einem Bioreaktormodell die wesentlichhohere Stabilitat der immobilisierten Zel-len gegeniiber "Sandwich-Zellen" nach-gewiesen (Koebe et a!., 1994). Die Ver-doppelung der Zellzahl durch eine "Sand-wich-Immobilisation", d.h. zwei Lagenimmobilisierten Zellen ubereinander,konnte die Zelleistung (gemessen an der

Produktion leberspezifischer Parameter)jedoch nicht verbessern (Wick et aI.,1996).Um alternativ auf einen ausreichenden

Zellpool zuriickgreifen zu konnen, wurdeder Versuch einer Zellisolation aus Lei-chenleberzellen untemommen. Die erziel-te Zellvitalitat yon unter 20% konnte je-doch nicht mit den Vergleichswerten ausOl-Praparaten standhalten (Wick, 1995).Aus den gewonnenen Erfahrungen konn-te das Zellisolationsverfahren derart mo-difiziert werden, daB die Zellisolation yonSchweineleberzellen aus Schlachthofpra-paraten ermoglicht wurde (Koebe et al.,1995a; Koebe et aI., 1995b; Koebe undSchildberg, 1996).

Zusammenfassend kann festgestelltwerden, daB mit dem Immobilisationsver-fahren Leberzellen (unabhangig yon derSpezies) auch tiber einen langeren Zeit-raum unter standardisierten Bedingungenkultiviert und untersucht werden konnen.Dies eroffnet neue Wege in der Einspa-

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rung von Tierversuchen. Zusatzliche Ex-perimente zeigten, daB auch pharmakolo-gische Untersuchungen an diesem Modellcrfolgreich durchgefuhrt werden konnten(Koebe et aI., j 994; Pahernik et al., 1995).

Bei aller Euphoric darf jedoch nichtunterschlagen werden, daf trotz del' neu-artigen Kulturtechnik die Verfiigbarkeitvon geeignetem Spendermaterial (mei-stens aus Of'-Praparaten) als limitierenderFaktor angesehen werden mull: Operatio-nen an del' Leber werden nur an speziel-len Zentren durchgefiihrt, und nichtjedesLeberstuck ist gleich gut zur Isolation ge-eignet. So wird die Immobilisation huma-ner Hepatozyten wenigen Zentren vorbe-halten sein. Hepatozyten konnen in dieserKulturform jedoch erfolgreich kryokon-serviert werden. Damit besteht die Mog-lichkeit fur den bedarfsgerechten Einsatzder Zellkultur oder die Bevorratung vonKulturen identischer Herkunft, urn beigezielten Fragestellungen auf einen "hu-manen Hepatozytenpool" zuriickgreifenzu konnen.

Fiir Fragestellungen in der experimen-tell en Chirurgie zur Entwicklung einesextrakorporalen Leberersatzes kann durchdie Zellisolation aus Schlachthofleberzel-len auf einen unlimitierten Zellvorrat zu-riickgegriffen werden.

Literatur

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KorrespondenzadresseDr.med. Marc WickBerufsgenossenschaftliche Kliniken.Bergmannsheil"Chirurgische Klinik und PoliklinikBurkle-de-la-Camp Platz ID-44789 Bochum

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