nghỀ cÁ sÔng cỬu long - vienthuysan2.org.vn

TAÏP CHÍ

NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG

Số 05/2015___________

VIỆN NGHIÊN CỨU NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 2

Giấy phép xuất bảnsố 47/GP-BTTTT

cấp ngày 8/2/2013Xuất bản hàng quý

HỘI ĐỒNG BIÊN TẬP:

Tổng biên tập:TS. NGUYỄN VĂN HẢO

Phó tổng biên tập:TS. NGUYỄN VĂN SÁNG

TS. PHẠM CỬ THIỆN

Thư ký tòa soạn:ThS. HOÀNG THỊ THỦY TIÊN

CÁC ỦY VIÊN:* TS. LÊ HỒNG PHƯỚC* TS. TRỊNH QUỐC TRỌNG* ThS. NGUYỄN VĂN TRỌNG* TS. NGUYỄN VĂN NGUYỆN* TS. VŨ ANH TUẤN* TS. NGUYỄN THỊ NGỌC TĨNH* TS. ĐẶNG TỐ VÂN CẦM* ThS. NGUYỄN NHỨT* ThS. NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO

Trình bày: Nguyễn Hữu Khiêm

Tòa Soạn:Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2116 Nguyễn Đình Chiểu, Q.1, TP.HCM ĐT: 08 3829 9592 Fax: 08 3822 6807 Email: ria2@ mard.gov.vn

In tại: Công ty In Liên Tường 240/59-61-63 Nguyễn Văn Luông Quận 6, TP. HCM

MỤC LỤC Trang

Đánh giá đa dạng di truyền các quần thể tôm sú bố mẹ (Penaeus monodon) và nguồn vật liệu ban đầu cho chương trình chọn giống theo tính trạng tăng trưởng.

Assessment of genetic diversity in different founder and initial populations of tiger shrimp (Penaeus monodon) for selection programs on growth rate.

BÙI THỊ LIÊN HÀ, TRẦN NGUYỄN ÁI HẰNG, NGUYỄN VĂN HẢO

3 - 16

Kết quả ban đầu sinh sản cá trà sóc (Probarbus jullieni Sauvage, 1880).

Premilinary results of induced spawning of Probarbus jullieni Sauvage, 1880.

THI THANH VINH, PHẠM CỬ THIỆN

17 - 28

Sử dụng tảo Isochrysis galbana làm thức ăn cho ấu trùng nghêu Meretrix lyrata.

Condensed microalgae Isochrysis galbana as feed for spat of clam Meretrix lyrata.

ĐẶNG TỐ VÂN CẦM, VÕ MINH SƠN

29 - 37

Kết quả phân lập Schizochytrium mangrove giàu lipid phục vụ cho nuôi trồng thủy sản.

Results of isolation of Schizochytrium mangrove with high lipid for aquaculture.

VÕ MINH SƠN,VƯƠNG THỊ HỒNG HẠNH

38 - 52

Đánh giá chất lượng nước trong hệ thống tuần hoàn nuôi cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) thương phẩm quy mô pilot ngoài trời.

Evaluating water quality in outdoor pilot recirculating aquaculture system for intensive striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) culture.

NGUYỄN HỒNG QUÂN, NGUYỄN NHỨT, NGUYỄN VĂN HUỲNH, LÊ NGỌC HẠNH,

NGUYỄN VĂN HẢO

53 - 64

Nâng cao năng suất và tính bền vững của tôm nuôi trong hệ thống canh tác tôm lúa ở xã Hòa Mỹ, huyện Cái Nước, tỉnh Cà Mau.

Improve productivity and sustainability of shrimp farming in rice-shrimp system in Hoa My, Cai Nuoc, Camau.

LÊ HỮU HIỆP, NGUYỄN VĂN HẢO, NGUYỄN CÔNG THÀNH,

LƯU ĐỨC ĐIỀN, TRƯƠNG MINH LEL, HOÀNG THỊ THỦY TIÊN

65 - 74

Sàng lọc các dòng nấm men mang gen VP28 thích hợp để sản xuất tolerine phòng bệnh đốm trắng trên tôm nuôi.

Screening suitable pichia pastoris strains carried VP28 gene to produce Tolerine against white spot disease in shrimp.

NGÔ THỊ NGỌC THỦY, ĐẶNG THỊ TRÀ MY

75 - 86

Khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất.

Investigation, isolation and selection of the most updated and virulent strains of Edwardsiella ictaluri.

LÊ HỒNG PHƯỚC, NGUYỄN THỊ HIỀN, NGUYỄN

HỒNG LỘC, VÕ HỒNG PHƯỢNG, TRỊNH QUỐC TRỌNG

87 - 96

Xác định độ tiêu hóa biểu kiến của một số nguyên liệu làm thức ăn cho cá giò (Rachycentron canadum) giống.

Assessment of apparent digestibility coefficients of ingredients for feed development for cobia (Rachycentron canadum) juvenile.

TRẦN QUỐC BÌNH, VŨ ANH TUẤN, LÊ HỮU HIỆP, NGUYỄN THUÝ AN

97 - 105

Xác định thành phần môi trường dinh dưỡng và các điều kiện nuôi cấy bề mặt tạo sinh khối chứa phytase có hoạt lực cao từ Aspergilus niger YD.

Study on medium composition and conditions of semi-solid fermentation synthesize high activity phytase from Aspergilus niger YD.

PHẠM DUY HẢI, NGUYỄN VĂN NGUYỆN, HOÀNG THỊ HỒNG

THƠM, TRẦN THỊ LỆ TRINH

106 - 115

Kiểm chứng mô hình tương quan giữa độ tiêu hóa protein in vivo và in vitro trên thức ăn tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei).

Validation of regression models between in vitro and in vivo protein digestibility of feeds for white leg shrimp (Litopenaeus vannamei).

NGUYỄN THỊ LAN CHI, LÊ THỊ LÂM

116 - 130

Khảo sát nguồn phụ phẩm cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và nghiên cứu phương pháp xử lí để làm nguyên liệu sản xuất bột peptide.

Study on treatment tra catfish by-products (Pangasianodon hypophthalmus) to produce peptide.

NGUYỄN THỊ HƯƠNG THẢO, ĐINH THỊ MẾN, NGUYỄN THỊ MỸ

THUẬN, VÕ ĐÌNH LỆ TÂM

131 - 142

3TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015


1 Phòng Sinh Học Thực Nghiệm, Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 * Email: [email protected] 2 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.

Đánh giá Đa dẠng di TRUYỀn các QUẦn ThỂ Tôm sú bỐ mẸ (Penaeus monodon) VÀ ngUỒn VẬT liỆU ban ĐẦU cho chương

TRình chỌn giỐng Theo Tính TRẠng Tăng TRưỞngBùi Thị Liên Hà1*, Trần Nguyễn Ái Hằng1, Lê Thị Hoài Oanh1, Nguyễn Văn Hảo2

TÓM TẮTĐánh giá đa dạng di truyền của nguồn vật liệu khởi đầu của chương trình chọn giống tăng trưởng trên đối tượng tôm sú (Penaeus monodon) được Viện NCNTTS 2 thực hiện nhằm hạn chế suy giảm biến dị di truyền, loại bỏ các yếu tố cạnh tranh sinh tồn của từng cá thể trong các điều kiện chọn lọc; đồng thời hỗ trợ hoặc dự đoán giá trị trong các tính toán phối cặp gia đình. Với tổng số 29 cặp microsatellite tham khảo từ các tác giả công bố được sàng lọc cho việc phân tích đa dạng di truyền. Đa dạng di truyền của bốn quần thể bố mẹ tôm sú được khảo sát trên 15 cặp microsatellite có chỉ số đa dạng tốt nhất và sử dụng 10 microsatellite cặp trong số 15 cặp microsatellite này phục vụ phân tích đa dạng di truyền đàn mẫu tôm sú đàn con thuộc 16 phép phối từ bốn quần thể tôm sú bố mẹ ban đầu (Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Nội địa và Gia hóa nhập nội).

Từ khóa: Penaeus monodon, đa dạng di truyền, microsatellite, chương trình chọn giống.

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Tôm sú (Penaeus monodon) là một trong những loài giáp xác có giá trị kinh tế quan trọng nhất trên thế giới và cũng là loài đang được khai thác và nuôi trồng chủ đạo tại Việt Nam. Tại Việt Nam, tính đến cuối tháng 11/2013, giá trị xuất khẩu tôm 10 tháng năm 2013 đạt gần 2,5 tỷ USD, tăng gần 32,7% so với cùng kỳ năm 2012, chiếm 44% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản của cả nước (http://www.fistenet.gov.vn/). Ngoài ra, nghiên cứu đa dạng di truyền tôm sú không chỉ quan trọng về mặt kinh tế mà còn quan trọng cả về mặt phân bố và nguồn gốc con giống. Nguyên nhân là loài này phân bố rộng ở biển Ấn Độ Dương và Thái Bình Dương, một đặc điểm rất thích hợp để phân tích, đánh giá đa

dạng di truyền quần thể của sinh vật sống trong môi trường nước biển (Pan và ctv., 2004).

Tôm sú bố mẹ hiện nay chủ yếu đánh bắt từ tự nhiên, kết quả đàn tôm bố mẹ được di cư bị động đến các quốc gia có có ngành nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh, đặc biệt là các nước Đông Nam Á và Úc. Những bố mẹ nhập ngoại này đem đến rất nhiều hệ lụy như lây truyền mầm bệnh, hủy hoại tài nguyên, phá hủy đa dạng sinh học. Hơn nữa, việc đánh bắt bố mẹ từ tự nhiên này đã gây áp lực rất lớn cho sự cân bằng sinh thái do nguồn tôm này ngày càng cạn kiệt. Ngoài ra, việc dùng tôm bố mẹ tự nhiên mang theo nguy cơ lây lan các mầm bệnh virus nguy hiểm (đặc biệt virus đốm trắng WSSV, virus đầu vàng YHV, virus gây còi MBV) qua

4 TẠP CHÍ NGHỀ CÁ SÔNG CỬU LONG - SỐ 5 - THÁNG 6/2015


tôm giống làm bùng phát dịch bệnh gây chết tôm nuôi hàng loạt... Đây là những thách thức lớn trong nỗ lực phát triển bền vững ngành công nghiệp nuôi tôm của Việt Nam nói riêng và thế giới nói chung. Nhằm chủ động con giống gia hóa, có tốc độ tăng trưởng nhanh và sạch bệnh thì giải pháp chọn giống nâng cao tốc độ tăng trưởng kết hợp sản xuất con giống sạch bệnh là giải pháp giải quyết triệt để vấn đề về chất lượng con giống.

Yếu tố khó khăn nhất trong việc hình thành ban đầu của một chương trình chọn giống là phải tập hợp được một quần thể mang nhiều nguồn vật liệu có chất lượng di truyền tốt nhất. Thêm vào đó, việc thiết kế để có sự phối hợp nguồn gốc vật liệu và chất lượng di truyền của các quần thể ban đầu đóng vai trò lớn trong sự thành công của chương trình chọn giống. Phân tích đa dạng di truyền vật liệu ban đầu của quần đàn chọn giống là yếu tố quyết định mức độ cải thiện di truyền, tạo nguồn vật liệu quỹ gien đa dạng. Trong chương trình chọn giống tính trạng tăng trưởng trên tôm sú, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II đã thu thập được bốn quần đàn tôm sú bố mẹ khác nhau có nguồn gốc từ: Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Nội địa và Gia hóa nhập nội để tạo quần thể ban đầu. Như các bước của các chương trình chọn giống trước đây được thực hiện tại Viện NCNTTS 2, song song với các thiết kế lai phối gia đình, đề tài sử dụng các chỉ thị microsatellite phân tích đánh giá đa dạng di truyền của bốn quần thể bố mẹ tham gia sinh sản ban đầu và cũng phân tích chất lượng di truyền của đàn con của bốn quần thể bố mẹ này sau phối ghép.

Mục đích nghiên cứu:

Phân tích đánh giá đa dạng di truyền

bốn quần thể tôm sú bố mẹ ban đầu tham gia sinh sản cho đề tài “Ứng dụng di truyền số lượng và di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm sú theo tính trạng tăng trưởng” và thế hệ đàn con của các quần thể này.

Nội dung đề tài:

• Phân tích đa dạng di truyền của các quần thể tôm sú bố mẹ thu thập ban đầu,

• Phân tích đa dạng di truyền nguồn vật liệu ban đầu (G0) cho chương trình chọn giống theo tính trạng tăng trưởng.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 1. Vật liệu sinh học

Tổng số lượng mẫu tôm bố mẹ nhập nội cho chương trình được thu và tách chiết DNA, chọn ra được 137 mẫu (50 tôm bố và 87 tôm mẹ) trong đó nhóm tôm từ Ấn Độ Dương gọi tắt là A (30 mẫu), Thái Bình Dương gọi tắt là T (31 mẫu), Gia hóa gọi tắt là G (36 mẫu) và nhóm tôm Nội địa gọi tắt là N (40 mẫu). Mẫu chân bơi hoặc cuống mắt được bảo quản trong cồn 70oC và được cung cấp và chuyển về Phòng thí nghiệm Di truyền Phân tử - Phòng Sinh học Thực nghiệm từ chương trình chọn giống Tôm sú thuộc đề tài “Ứng dụng di truyền số lượng và di truyền phân tử để tạo vật liệu ban đầu cho chọn giống tôm sú theo tính trạng tăng trưởng” chọn giống tại Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ (TTQGGHSNB).

2.2. Phương pháp

29 cặp mồi microsatellite được sử dụng để đánh giá mức độ đa dạng di truyền, chọn ra 15 cặp microsatellite hoạt động tốt để phân tích đa dạng di truyền các quần thể tôm bố mẹ ban đầu,



chọn tiếp tục 10 cặp microsatellite trong 15 cặp microsatellite để phân tích đa dạng di truyền đàn con. Ký hiệu các mồi microsatellite được sử dụng chữ viết tắt tên tác giả bài báo tham khảo: L (PMMS2D2-L1, PMMS4CA-L2, PMMS7HG-L3, PMMS8A2-L4, PMMS16-L5, PMMS6-L6: Li và ctv., 2007, Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations); P (AY500855-P1, AY500858-P2, AY500860-P3, AY500862-P4, AY500866-P5, AY500869-P6, AY500875-P7, Pan và ctv., 2004); W (DTLPM103- W1, DTLPM109- W2, DTLPM110-W3, DTLPM136-W4, DTLPM402-W5, DTLPM313-W6, DTLPm101-W7, DTLPm120F-W8, DTLPm217-W9, DTLPm308-W10: Wuthi và ctv., 2003) và X (TUZXPm2.41-X1, TUZXPm4.82 –X2, TUZXPm4.45 –X3:Xu và ctv., 1999).

Tách chiết DNA: tách DNA của 200 mẫu (50 mẫu/nhóm tôm x 04 nhóm) và 414 mẫu (06 con/gia đình x 69 gia đình) từ 16 phép phối.

Xác định allele của microsatellite bằng máy điện di mao quản Qiagen (The QIAxcel DNA Screening Kit). Điện di tách allele tiến hành trong đĩa mẫu 96 giếng, 0,2 ml/giếng; mỗi giếng có chứa 2μl sản phẩm PCR, 28μl dung

dịch đệm formamide, 0,25μl thang chuẩn (60bp-400bp) và một giọt dầu. Các alleles được ghi và so sánh với thang ADN chuẩn, đồng thời so sánh với allele của mẫu chạy ở lần trước. Số liệu phân tích biến dị di truyền được phân tích trên phần mềm GenePop 3.2 (Raymond và Rousset, 1995) và Cervus, Fstat 3.1. Phân tích số liệu: Đánh giá đa dạng di truyền (genetic diversity) của các quần đàn: số lượng allele, tần số allele, allele đặc trưng (private allele), mức độ dị hợp tử (heterozygosity), allelic richness (Ar), hệ số FIS, phân bố allele của các loci microsatellite theo quy luật Hardy-Weinberg, sai khác di truyền (genetic differentiation) giữa các quần đàn: ước tính các giá trị F.

III. KẾT QUẢ

3.1. Kết quả chọn lọc các các cặp mồi Microsatellite

Dựa vào kết quả khảo sát, chọn ra được 29 cặp mồi microsatellite có sản phẩm khuếch đại tốt. Sử dụng 29 cặp mồi này để phân tích mồi đa hình trên 28 mẫu DNA tôm ngẫu nhiên, từ đó đánh giá hiệu suất PCR và số alen của từng cặp mồi để sàng lọc và chọn ra các cặp mồi cho hiệu suất PCR cao nhất, đồng thời có số alen cao thể hiện tính đa hình để tiến hành chạy PCR đồng loạt để phân tích biến dị di truyền của các quần thể tôm.



Bảng 1. Hiệu suất PCR và số alen của 29 cặp mồi microsatellite trên 28 mẫu DNA tôm sú.

Tên mồi

Tổng số mẫu có sản phẩm PCR

Hiệu suất PCR (%)

Số alen

Tên mồi

Tổng số mẫu có sản phẩm PCR

Hiệu suất PCR (%) Số alen

W1 23 82,14 3 P5 25 89,28 5

W2 24 85,71 5 P6 23 82,14 5

W3 22 78,57 5 P7 28 100 4

W4 25 92,28 4 L1 26 92,86 5

W5 24 85,71 2 L2 22 78,57 5

W6 26 92,86 3 L3 25 89,28 4

P1 27 96,43 5 L4 25 89,28 5

P2 28 100 5 L5 23 82,14 5

P3 22 78,57 5 L6 23 82,14 2

P4 25 89,28 5 W7 24 81,12 3

W8 22 79,21 4 W9 25 94,23 5

W10 28 92,1 4 X1 22 79,03 2

X2 21 78,12 3 N2 26 93,03 4

X3 24 80,01 2 N1 27 93,2 4

P8 22 80,01 2

Kết quả tổng kết có thể thấy hiệu suất PCR của 29 cặp mồi microsatelle tương đối đồng đều và ổn định, dao động trong khoảng 78-100%. Trong đó có các cặp mồi microsatellite W6, P1, P2, P7, L1,W9, W10, N1, N2 có hiệu PCR cao nhất, dao động từ 92-100%. Các cặp mồi còn lại có hiệu suất PCR thấp hơn nhưng hiệu suất PCR vẫn nằm trong khoảng cao, dao động từ 78-89%. Từ kết quả trên có thể kết luận rằng việc tối ưu các yếu tố như nhiệt độ bắt cặp của mồi, nồng độ MgCl2, nồng độ DNA đã giúp hiệu suất PCR được tăng cao, đồng thời phản ứng PCR được ổn định.

Kết quả ban đầu cũng cho thấy số alen của từng cặp mồi microsatellite dao động không lớn, dao động từ 2- 6 alen. Số alen cao thể hiện tính đa hình của cặp mồi microsatellite.

Các cặp mồi microsatellite được chọn để đánh giá biến dị di truyền cho các quần thể đòi hỏi các cặp mồi đó phải có tính đa hình cao (các cặp mồi có từ 5 alen trở lên). Vì vậy các cặp mồi microsatellite P1, P2, W2, W3, W9, P4, P5, P7, L1, L4, N1, N2 là phù hợp cho việc phân tích đánh giá biến dị di truyền của quần thể. Tuy nhiên, trong phân tích di truyền nếu xuất hiện quá nhiều null alen sẽ ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Vì vậy ngoài tính đa hình cao thì hiệu suất PCR của các cặp mồi cũng ảnh hưởng tới kết quả phân tích di truyền. Do đó, chọn thêm 3 cặp mồi vừa có tính đa hình (có 4 alen trở lên) vừa đạt hiệu suất PCR lớn như các cặp mồi: W10, W4, L3. Như vậy tổng có 15 cặp mồi được sử dụng để phân tích, đánh giá biến dị di truyền của bốn nhóm tôm sú Ấn Độ Dương,Thái Bình



Dương, Gia Hoá và Nội Địa nhằm cung cấp cơ sở khoa học cho chương trình chọn giống tôm sú quốc gia.

3.2 Khảo sát đa dạng di truyền của bốn quần thể tôm sú bố mẹ

3.2.1 Thông tin đa dạng di truyền Thông tin đa dạng di truyền được đánh giá

qua các chỉ số như: số lượng allele (A), kích

Bảng 2. Thông tin đa dạng di truyền chung của 4 quần thể tôm sú bố mẹ được khảo sát trên 15 cặp microsatellie

Locus A S (bp) r G Ho He PIC HWE test FIS

P1 4 264-382 4 8 0,300 0,715 0,664 *** 0,552

P2 3 285-393 3 6 0,557 0,639 0,559 NS 0,142

W2 4 216-406 3,9 6 0,477 0,711 0,653 *** 0,284

W10 4 316-492 4 8 0,523 0,738 0,686 *** 0,232

P4 3 222-364 3 6 0,556 0,629 0,548 NS 0,108

P5 3 282-382 2,9 5 0,446 0,612 0,527 NS 0,240

P7 4 178-286 3,9 7 0,512 0,677 0,625 *** 0,241

L1 3 270-328 3 6 0,465 0,663 0,586 *** 0,270

L3 3 275-330 3 3 0,496 0,650 0,573 *** 0,223

L4 4 251-331 3,9 7 0,412 0,687 0,624 *** 0,404

W4 4 441-533 3,9 4 0,210 0,715 0,659 *** 0,696

W3 2 502-606 2 3 0,176 0,490 0,369 *** 0,647

N1 3 185-235 3 3 0,405 0,644 0,564 *** 0,378

N2 3 180-230 3 3 0,395 0,641 0,562 *** 0,393

W9 2 227-275 2 3 0,203 0,502 0,375 *** 0,618

TB 0,407 0,633 0,357

thước của allele (S), tần số của mỗi allele (P), số lượng kiểu gene (G), kiểu gene dị hợp lý thuyết (He) và thực tế (Ho), xác xuất của độ lệch có ý nghĩa theo Hardy-Weinberg (P), PIC thông tin đa hình (Polymorphic Information Content –PIC), I, D và sai số số lượng locus (r), FIS, FIT và FST. Các chỉ số trên được trình bày ở các bảng sau:

Kết quả thông tin đa dạng di truyền của bốn nhóm tôm bố mẹ đạt được nghiên cứu này như sau: tổng số lượng alen (A) là 49 alen trong số 15 cặp microsatellite khảo sát, đa số các primer có số lượng alen từ 3-4 alen; kích thước của các alen (S) tập trung chủ yếu ở kích thước từ 200-

300bp, chỉ có hai mồi microsatellite có phạm vi kích thước 400-600bp là W3 và W4; số lượng kiểu gien (G) trong khoảng trung bình là 6 kiểu gien, cao nhất là 8 kiểu gien được tìm thấy ở hai cặp mồi P1 và W10. Kết quả này cũng tương tự kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả Nahavandi



và ctv., (2011), các cặp microsatellite khảo sát đa dạng di truyền của hai nhóm mẫu tôm sú nuôi và tôm sú tự nhiên ở Malaysia có số lượng alen cũng trong khoảng 3-5 alen.

Thông tin đa hình PIC thể hiện năng lực đánh giá đa dạng di truyền của từng locus. Chỉ số thông tin đa hình càng cao thì locus đó có nhiều tiềm năng trong việc phân biệt sự khác biệt của từng các thể hay giữa các quần thể với nhau. Ví dụ, chỉ số của PIC trong nghiên cứu này của nhóm loci: P1, W2, W10, P7, L4, W4 có giá trị tốt trong khi đó chỉ số PIC của hai loci: W3, W9 là kém nhất.

Cân bằng Hardy-Weinberg (HWE): độ lệch từ phân phối cân bằng HWE của một quần thể cho thấy trạng thái di truyền liên quan đến sự phối ghép các cá thể có thể ở trạng thái giao phối ngẫu nhiên hay xu thế giao phối dưới áp lực của chọn lọc. Trong kết quả đạt được thì chỉ có ba cặp mồi P2, P4 và P5 là phân phối tuân theo cân bằng HWE. Các cặp mồi còn lại thì lệch khỏi cân bằng HWE do chỉ số kiểu gien dị hợp tử quan sát thấp hơn chỉ số kiểu gien dị hợp tử mong đợi. Nguyên nhân được tìm thấy có thể là do quá nhiều cá thể mang kiểu gien đồng hợp tử. Điều này rất cần thiết để có chiến lược phối ghép, trao đổi tôm bố mẹ giữa các trại giống với nhau để giảm thiểu rủi ro suy giảm vật liệu di truyền do cận huyết. Quần thể có dấu hiệu cận huyết khi có dấu hiệu tăng chỉ số kiểu gien đồng hợp tử, ở một số loài tôm điều này dẫn tới khả năng suy giảm sức tăng trưởng, tỷ lệ sống và sức sinh sản (Goyard và ctv., 2008).

Theo bảng 2 thì kết quả hệ số dị hợp tử quan sát trong nghiên cứu này có giá trị trung bình trên tất cả các cặp microsatellite là 0,407 thấp hơn so với hệ số dị hợp tử mong đợi là 0,633. Kết quả này cũng tương tự các nghiên cứu gần đây, cho thấy hiện trạng chung về biến dị di truyền của tôm sú đang có xu thế suy giảm (Nahavandi và ctv., 2011; Sekar và ctv., 2014) và rất cần thiết

việc quản lý theo phả hệ để giảm thiểu hiện tượng phối ghép các cá thể có chung huyết thống.Khi phân tích tổng thể các tham số đa dạng di truyền chỉ trên ba quần đàn tôm sú bố mẹ (Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội địa) thì các giá trị khác biệt không có ý nghĩa với kết quả phân tích chung bốn quần thể. Trong đó giá trị đa dạng gien của ba nhóm tôm bố mẹ Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội địa tương đối đều nhau và lần lượt là 0,645; 0,649 và 0,640.

Trong nghiên cứu phân tích từ bốn nhóm quần thể bố mẹ ban đầu, chỉ số FIS trung bình khoảng 0,353 ±0,19, chỉ số này tương đối cao. Chỉ có hai cặp microsatellite P2 và W10 có chỉ số FIS ~0,12; hai cặp microsatellite này có thể sử dụng cho nghiên cứu sâu hơn. Như vậy trong bốn nhóm mẫu tôm bố mẹ khảo sát rất cần phải tiến hành chọn lọc phối ghép theo phả hệ để giảm thiểu nguy cơ thoái hóa do giao phối cận huyết. Ở một số nghiên cứu biến dị di truyền, hiện tượng suy giảm đa dạng di truyền hay dư thừa của kiểu gien đồng hợp tử cũng có thể là kết quả của quần thể bố mẹ tham gia sinh sản ban đầu quá thấp (Wolfus và ctv., 1997; Dunham và ctv., 2000). Vì vậy, công tác quản lý con giống rất cần được chú trọng việc bổ sung thêm nguồn biến dị di truyền mới vào quần thể gốc ban đầu. Khi phân tích số liệu chỉ trên ba quần thể Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội địa thì giá trị cận huyết FIS của ba quần thể lần lượt là 0,374; 0,398 và 0,338. Mặc dù giá trị này nằm trong giới hạn cảnh báo, tuy nhiên trong phạm vi của đề tài thì vật liệu di truyền của nhóm Nội địa là tương đối tốt nhất, có thể mẫu thu được từ nhiều vùng và nhiều thời điểm khác nhau để đóng góp vật liệu trong quá trình hình thành quần thể ban đầu.

3.2.2 Biến động di truyền bên trong từng quần thể tôm sú bố mẹ

Đa dạng gien hay biến động hệ số dị hợp tử mong đợi (Gene diversity)



Đa dạng gien, hay còn gọi là dị hợp tử mong đợi, là một thông số thường được sử dụng để mô tả mức độ biến dị di truyền được áp dụng trong các lĩnh vực đa dạng di truyền của quần thể. Đa dạng gien được sử dụng để định lượng và đánh giá tỷ lệ các cá thể có kiểu gien dị hợp tử trong quần thể theo giả định của định luật cân bằng Hardy-Weinberg (Driscoll và ctv., 2002; Hoelzel và ctv., 2002), phát hiện quần thể giao phối (Li và

Horvitz, 1953), đo lường liên kết disequilibrium (Sabatti và Risch, 2002), và thử nghiệm cho ảnh hưởng của chọn lọc tự nhiên (Depaulis và Veuille, 1998; Sabeti và ctv., 2002)… Trong một số nghiên cứu di truyền quần thể, các tác giả đã tìm thấy một mối quan hệ tuyến tính chặt chẽ giữa sự đa dạng gien và khoảng cách di truyền (Nei và Roychoudhury 1974; Ramachandran ctv., 2008, DeGiorgio và Rosenberg, 2009).

Bảng 3. Thông tin đa dạng gien trên 15 cặp microsatellite

Loci A G T N

P1 0,759 0,636 0,737 0,615

P2 0,627 0,615 0,651 0,654

W2 0,618 0,493 0,682 0,744

W10 0,670 0,649 0,613 0,720

P4 0,631 0,596 0,657 0,647

P5 0,625 0,610 0,598 0,570

P7 0,749 0,567 0,707 0,676

L1 0,650 0,623 0,651 0,650

L3 0,662 0,593 0,665 0,644

L4 0,655 0,710 0,729 0,638

W4 0,676 0,708 0,748 0,732

W3 0,512 0,398 0,472 0,509

N1 0,661 0,640 0,667 0,651

N2 0,665 0,640 0,649 0,647

W9 0,514 0,511 0,511 0,504

0,645±0,067 0,599±0,081 0,649±0,077 0,640±0,07



Đa dạng kiểu gien (Genotype diversity)Số kiểu gien trung bình của cả bốn nhóm

mẫu tương đối đồng đều 4,5 – 5 kiểu gien so với giá trị kiểu gien mong đợi là 7,2. Ba trong số bốn nhóm mẫu tôm bố mẹ có đến 5 cặp mồi có kiểu gien có số lượng cá thể mang gien dị hợp tử > 50%: nhóm mẫu Ấn Độ Dương, Nội địa và Gia hoá nhập nội. Tuy nhiên, giá trị trung bình của đa dạng kiểu gien của nhóm Thái Bình Dương là cao nhất. Trong kết quả, có ghi nhận về sự suy giảm số kiểu gien, điều này có thể xem xét thêm khả năng mất kiểu gien do quá trình phân tích chưa đạt được khả năng phân ly sản phẩm khuếch đại cao nên làm mất đi một số alen.

Sự sai khác di truyền

Sự sai khác di truyền giữa các quần đàn mẫu được ước lượng theo giá trị FST. Theo Nei (1978), FST nếu < 0,05 được cho là sai khác nhỏ; 0,05<FST<0,15: là giá trị sai khác trung bình, FST>0,15 là sai khác lớn. FST cung cấp những hiểu biết quan trọng vào quá trình tiến hóa tác động đến cấu trúc di truyền bên trong và giữa các quần thể với nhau. Sự khác biệt di truyền chung cho các quần đàn mẫu trong trường hợp này tương đối thấp biến động trong giá trị 0,05.

Bảng 4. Thông tin về sai khác di truyền của 4 nhóm mẫu tôm sú bố mẹ

FST/Pvalue Pop A Pop G Pop T Pop N

Pop A 0 0,0555/0,00833* 0,0048/0,3833NS 0,0172/0,1916NS

Pop G 0,0555 0 0,0494/0,00833* 0,0488/0,00833*

Pop T 0,0048 0,0494 0 0,0164/0,1333NS

Pop N 0,0172 0,0488 0,0164 0

*: Mức ý nghĩa sau khi hiệu chuẩn với Bonferroni p < 0,00833, NS: không khác biệt có ý nghĩa.

Theo kết quả này, nhóm mẫu Gia hoá có sự sai khác di truyền có mức ý nghĩa (p < 0,00833) với các nhóm mẫu còn lại, cụ thể là nhóm Gia hoá có mức độ sai khác di truyền 5,6% so với nhóm Ấn Độ Dương; 4,9% so với nhóm Thái Bình Dương và 4,8% so với nhóm còn lại, tôm nội địa. Tuy nhiên sự sai khác này là không lớn FST< 0,05.

3.3. Khảo sát đa dạng di truyền của vật liệu ban đầu G0 - 16 tổ hợp tôm sú đàn con

Đa dạng gien hay biến động hệ số dị hợp tử mong đợi (Gene diversity)

Đa dạng di truyền của 16 nhóm tôm sú đàn con từ 4 nhóm mẫu tôm sú bố mẹ ban đầu được phân tích tương tự như ở phân tích của 4 nhóm mẫu tôm sú bố mẹ. Kết quả ghi nhận về các giá trị về đa dạng gien, đa dạng kiểu gien và sai khác di truyền của 16 tổ hợp tôm sú đàn con được ghi nhận trên các thông tin sau:



Bảng 5. Đa dạng gien của 16 tổ hợp tôm sú đàn con

Loci AA AT AN AG NN NA NG NT TT TA TN TG GG GA GT GN

P1 0,65 0,66 0,74 0,53 0,63 0,63 0,62 0,59 0,72 0,73 0,3 0,53 0,53 0,11 0,57 0,3

P2 0,59 0,56 0,57 0,32 0,55 0,3 0,34 0,67 0,48 0,12 0,26 0,52 0,64 0,69 0,23 0,16

W2 0,8 0,74 0,75 0,71 0,67 0,61 0,74 0,73 0,72 0,55 0,59 0,52 0,67 0,73 0,78 0,69

W10 0,62 0,74 0,63 0,76 0,72 0,61 0,71 0,48 0,54 0,69 0,66 0,72 0,57 0,59 0,72 0,75

P4 0,30 0,47 0,62 0,47 0,59 0,43 0,5 0,66 0,68 0,63 0,64 0,65 0 0,53 0 0

P5 0,66 0,56 0,73 0,64 0,59 0,51 0,6 0,63 0,57 0,59 0,68 0,56 0,3 0,58 0,5 0,52

P7 0,66 0,48 0,57 0,44 0,48 0,54 0,56 0,40 0,47 0,24 0,43 0,47 0,48 0,53 0,47 0,41

L1 0,59 0,59 0,51 0,54 0,48 0,48 0,46 0,58 0,59 0,32 0,51 0,32 0,34 0,45 0,46 0,3

L3 0,65 0,5 0,63 0,58 0,65 0,55 0,57 0,50 0,60 0,59 0,67 0,56 0 0,56 0,54 0,58

L4 0,16 0,52 0,38 0,51 0,14 0,31 0,61 0,07 0,49 0,69 0,48 0,63 0,3 0,61 0,55 0,62

TB 0,57 0,58 0,62 0,55 0,55 0,49 0,57 0,53 0,59 0,52 0,52 0,55 0,38 0,54 0,48 0,43

nhóm con mẹ của Ấn Độ Dương, Nội Địa và Thái Bình Dương cũng nằm trong mức sai khác nhỏ < 15%. Tuy nhiên, nhóm phép phối thuần của mẹ và bố Gia Hoá thì chỉ số sai khác di truyền của nó với các phép phối khác khá cao từ 20-33%. Các phép phối còn lại có nguồn gốc từ con mẹ Gia Hóa cũng có chỉ số sai khác di truyền với các phép phối khác là cao >15%.

Trên kết quả khảo sát bằng các mồi microsatellite trong nghiên cứu này trên 69 gia đình tôm sú đàn con của 16 tổ hợp phối ghép từ bốn đàn tôm bố mẹ cho thấy vật liệu di truyền của nhóm tôm có nguồn gốc Gia hóa tương đối kém đa dạng vật liệu di truyền hơn các nhóm khác. Hiện tượng kém đa dạng di truyền có nguy cơ xảy ra trong những chương trình chọn giống hàng loạt vì xu hướng chọn giống theo kiểu hình hay chọn giống theo định hướng ưa chuộng của nhà chọn giống dẫn đến vật liệu di truyền mất đi tính đa dạng.

Thông số đa dạng gien của 16 tổ hợp tôm sú đàn con cũng giao động trong khoảng 0,55; trong đó 4 tổ hợp phối của nhóm mẫu Gia hóa có chỉ số đa dạng gien thấp hơn, trung bình khoảng 0,45.

Đa dạng kiểu gien (Genotype diversity)

Số kiểu gien trung bình của bốn nhóm mẫu của phép phối mà con mẹ có nguồn gốc Ấn Độ Dương có giá trị cao nhất. Ngược lại, giá trị kiểu gien trung bình của bốn nhóm mẫu của phép phối mà con mẹ có nguồn gốc Gia Hoá có giá trị thấp nhất. Đồng thời, các phép phối của con mẹ Ấn Độ Dương cũng có nhiều kiểu gien có số lượng cá thể mang gien dị hợp tử > 50%.

Sai khác di truyền

Sai khác di truyền của16 tổ hợp tôm sú đàn con được liệt kê theo bảng 5. Hầu hết các phép phối đều có giá trị khác biệt với nhau, FST của các phép phối có cùng mẹ có giá trị sai khác di truyền < 15%. Giá trị FST của các phép phối



IV. THẢO LUẬN

4.1 Khảo sát đa dạng di truyền của bốn quần thể tôm sú bố mẹ

Trong nghiên cứu này, chỉ số FIS trung bình khoảng 0,353 ±0,19, chỉ số này tương đối cao. Chỉ có hai cặp microsatellite P2 và W10 có chỉ sốFIS ~0,12, hai cặp microsatellite này có thể sử dụng cho nghiên cứu sâu hơn. Như vậy trong bốn nhóm mẫu tôm bố mẹ khảo sát rất cần phải tiến hành chọn lọc phối ghép theo phả hệ để giảm thiểu nguy cơ thoái hóa do giao phối cận huyết. Ở một số nghiên cứu biến dị di truyền, hiện tượng suy giảm đa dạng di truyền hay dư thừa của kiểu gien đồng hợp tử cũng có thể là kết quả của quần thể bố mẹ tham gia sinh sản ban đầu quá thấp (Wolfus và ctv., 1997; Dunham và ctv., 2000). Vì vậy, công tác quản lý con giống rất cần được chú trọng việc bổ sung thêm nguồn biến dị di truyền mới vào quần thể gốc ban đầu.

Giá trị đa dạng gien của các quần thể khảo sát nằm trong khoảng 0,599 – 0,649. Ở ba nhóm mẫu Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội địa giá trị này tương đối đều nhau và ở mức cao ~ 0,645. Chỉ có nhóm mẫu Gia hóa có chỉ số đa dạng gien thấp nhất là 0,599. Thêm vào đó, các giá trị này tương đối ít giao động trong nội bộ quần thể của các quần thể Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội địa ở các cặp microsatellite. Trong khi đó, giá trị đa dạng gien có sự biến động lớn trong quần thể Gia hóa: 0,398 – 0,710.

4.2. Khảo sát đa dạng di truyền của 16 tổ hợp tôm sú đàn con

Nghiên cứu này có điều đáng quan tâm là, giá trị đa dạng gien thay đổi tùy thuộc vào sự

phối ghép con mẹ với con bố có xuất xứ khác nhau. Ví dụ, ở các phép phối nội dòng Ấn Độ Dương - Ấn Độ Dương (AA) giá trị này đạt 0,57 nhưng khi phối ngoại dòng có con mẹ Ấn Độ Dương với con bố Nội địa (AN) thì chỉ số này đạt giá trị cao nhất 0,62. Tuy nhiên nếu, con mẹ thuộc nhóm Nội địa phội ghép với con bố Ấn Độ Dương (NA) thì giá trị này giảm còn 0,49. Thêm vào đó, gần như các phép phối của tôm mẹ có xuất xứ từ nhóm Gia hóa đều có giá trị đa dạng gien là kém nhất. Nhưng nếu sử dụng con bố có xuất xứ là tôm Gia hóa phối với các nhóm tôm mẹ khác thì giá trị đa dạng gien được cải thiện (AG: 0,55; NG: 0,57 và TG: 0,55).

Sự khác biệt di truyền này cũng tương đối thấp giữa 3 nhóm tôm nội dòng có xuất xứ Ấn Độ Dương, Nội Địa và Thái Bình Dương. Ví dụ: AA và NN có giá trị FST = 0,0805; AA và TT có giá trị FST = 0,0931; NN và TT có giá trị FST = 0,0695. Tuy nhiên, nhóm phép phối thuần của mẹ và bố Gia Hoá thì chỉ số sai khác di truyền của nó với các phép phối khác khá cao từ 0,20-0,33. Ví dụ GG –AA có giá trị FST = 0,3246; GG – NN có giá trị FST = 0,2766; GG – TT có giá trị FST = 0,2106. Điều đáng quan tâm ở đây là, phép phối nội dòng GG hầu như khác biệt không có ý nghĩa với các phép phối có con mẹ cùng máu G (GG-GA, GG-GT, GG-GN, GA-GT và GA-GN).

Ngoài ra có một số tổ hợp các phép phối có giá trị di truyền khác biệt không có ý nghĩa cần tránh trong khi thực hiện chương trình chọn giống này như: NN-NA, NN-NG, NT-TT, TA-GN, NG-GN, TA-GN và TN-GA.



Bản

g 6.

Đa

dạng

kiể

u gi

en 1

6 tổ

hợp

tôm

sú đ

àn c

on*:

Mức

ý n

ghĩa

sau

khi h

iệu

chuẩ

n vớ

i Bon

ferr

oni p

< 0

,000

42, N

S: k

hông

khá

c bi

ệt c

ó ý

nghĩ

a.



Trên kết quả khảo sát bằng các mồi microsatellite trong nghiên cứu này trên 69 gia đình tôm sú đàn con của 16 tổ hợp phối ghép từ bốn đàn tôm bố mẹ cho thấy vật liệu di truyền của nhóm tôm có nguồn gốc Gia hóa tương đối kém đa dạng vật liệu di truyền hơn các nhóm khác. Kết hợp với kết quả đánh giá kiểu hình thì nghiên cứu cho thấy nếu kết hợp tôm sú bố Gia hóa với tôm mẹ từ ba nguồn khác như Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội địa thì kết quả di truyền sẽ được cải thiện.

V. KẾT LUẬN

5.1 Đa dạng di truyền của bốn quần đàn tôm sú bố mẹ

Thông tin đa dạng di truyền tương đối đều nhau ở cả bốn nhóm mẫu tôm sú bố mẹ Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương, Nội địa và Gia hóa. Có sự sai khác di truyền của nhóm Gia hóa với ba nhóm còn lại, tuy nhiên giá trị này không lớn với FST biến động trong giá trị 0,05 và sự

suy giảm số kiểu gien cũng được tìm thấy trong nghiên cứu này.

5.2 Đa dạng di truyền của 16 tổ hợp tôm sú đàn con

Giá trị đa dạng di truyền của nhóm tôm sú đàn con được phối ghép từ con mẹ có nguồn gốc Gia hóa là thấp nhất và sự sai khác di truyền của nhóm tôm này cũng khá cao so với các nhóm tôm sú đàn con được phối ghép từ ba nhóm tôm mẹ của Ấn Độ Dương, Thái Bình Dương và Nội Địa.

LỜI CÁM ƠN

Nhóm thực hiện đề tài xin chân thành cám ơn đến Vụ KHCN&MT-Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II, Chủ nhiệm đề tài và các bạn đồng nghiệp của Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam Bộ và các thành viên đề tài đã tận tình định hướng kịp thời, đóng góp ý kiến hữu ích để đề tài có kết quả tốt đẹp.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu Tiếng Việt

Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục.

Nguyễn Thanh Phương, Thạch Thanh và Trương Trọng Nghĩa, 1999. Cải thiện và nâng cao hiệu quả sản xuất giống tôm sú (Penaeus monodon) trong hệ thống lọc sinh học. Trích trong Tuyển tập công trình nghiên cứu Khoa Học, Nông Nghiệp phần II, trang 185-190.

Nguyễn Thành Tâm, Phạm Thanh Liêm, 2012. So sánh sự đa dạng di truyền giữa tôm càng xanh Việt Nam và tôm càng xanh Trung Quốc sử dụng phương pháp Microsatellite và RAPD.

Tài liệu Tiếng Anh

Brooker, A.L., Benzie, J.A.H., Blair, D., Versini, J.-J., 2000. Population structure of the giant tiger prawn Penaeus monodonin Australian waters, determined using microsatellite markers.Mar. Biol. 136, 149–157.

Gjedrem, T., 2005. Selection and Breeding Programs in Aquaculture, Springer ISBN-10 1-4020-3341-9.364p.

Hansen, L.P., Windsor, M.L., Youngson, A.F., 1997. Interactions between salmon culture and wild stocks of Atlantic salmon: The scientific and management issues. ICES Journal of Marine Science 54, 963–1225



Hartl, DL, Clark, A.G., 1997. Principles of Population Genetics. 3rd ed., Sinauer Associates Inc., Sunderland, Massachusets. ISBN: 0-87893-306-9.

Jeremy, J., Agresti, S.S., Avner, C., Supawadee, P., Eric, M., Hallerman, N.U., Gideon, H., Graham, A.E., Gall, B.M., 2000. Breeding new strains of tilapia: development of an artificial center of origin and linkage map based on AFLP and microsatellite loci. Aquaculture 185, 43–56.

Li, Y., Wongprasert, K., Shekhar, M., Ryan, J., Dierens, L., Meadows, J., Preston, N. P., Coman, G. J., & Lyons, R. E., 2007. Development of two microsatellite multiplex systems for black tiger shrimp Penaeus monodon and its application in genetic diversity study for two populations.Aquaculture 266, 279–288.

Pan, Y.-W., Chou, H.-H., You, E.-M., Yu, H.-T., 2004. Isolation andcharacterization of 23 polymorphic microsatellite markers fordiversity and stock analysis in tiger shrimp (Penaeus monodon). Mol. Ecol. Notes 4, 345–347.

Wuthisuthimethavee, S., Lumubol, P., Vanavichit, A., Tragoonrung, S., 2003. Development of microsatellite markers in black tigershrimp (Penaeus monodonFabricius). Aquaculture 224, 39–50.

Xu, Z., Dhar, A.K., Wyrzykowski, J., Alcivar-Warren, A., 1999. Identification of abundant and informative microsatellites fromshrimp (Penaeus monodon). Anim. Genet. 30, 150–156.



1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2. * Email: [email protected] 2 Research Institute for Aquaculture No 2.

assessmenT oF geneTic diVeRsiTY in diFFeRenT FoUndeR andiniTial PoPUlaTions oF TigeR shRimP (Penaeus monodon)

FoR selecTion PRogRams on gRoWTh RaTe

Bui Thi Lien Ha1*, Tran Nguyen Ai Hang1, Le Thi Hoai Oanh1, Nguyen Van Hao2

ABSTRACTAssessing genetic diversity in the initial broodstocks of selection program for growth traits of black tiger shrimp (Penaeus monodon) conducting by the Research Institute for Aquaculture No. 2 – Ho Chi Minh city – Vietnam is to reduce genetic variation loss, to minimize of ignoring competitive factors among individuals at actual selective conditions, and to support predicting mating strategy in family-based genetic selection programs. 29 polymorphic microsatellite markers specified-for tiger shrimp (Penaeus monodon) common published were used to examine genetic variation. Genetic diversity of 4 different founder broodstocks (Indian Ocean, Pacific Ocean, Vietnamese sea and Import Domestication) was evaluated by 15 best microsatellite in term of diversity index while their offspring – initial population was evaluated by 10 of those 15 microsatellite.

Keywords: Penaeus monodon, genetic variety, microsatellite, selective breeding program.

Người phản biện: TS. Nguyễn Văn Sáng

Ngày nhận bài: 29/5/2015

Ngày thông qua phản biện: 10/6/2015

Ngày duyệt đăng: 15/6/2015



KẾT QUẢ ban ĐẦU sinh sẢn nhÂn TẠo cá TRÀ sÓc (Probarbus jullieni sauvage, 1880)

Thi Thanh Vinh1* và Phạm Cử Thiện2

TÓM TẮTCá trà sóc (Probarbus jullieni Sauvage, 1880) được ghi vào sách đỏ về động vật bị đe dọa ở mức độ nguy cấp. Cá được thu thập từ tự nhiên vào nuôi lưu giữ trong ao vào năm 2005. Năm 2011 bắt đầu nghiên cứu cho cá sinh sản. Nuôi vỗ trong ao đất tỷ lệ thành thục đạt 60,3% khi nuôi bằng thức ăn viên và chất bổ sung (dầu mực, vitamin và khoáng). Khi nuôi vỗ bằng thức ăn viên, thịt ốc bươu và chất bổ sung (dầu mực, vitamin và khoáng) tỷ lệ thành thục tăng lên 64,6%. Cá trà sóc thành thục từ tháng 10 năm trước đến tháng 1 năm sau, mùa vụ cá sinh sản tập trung trong tháng 11 và 12. Độ tuổi thành thục lần đầu của cá trà sóc đực ở tuổi 4+, cá cái 5+. Hệ số thành thục cá cái đạt 7,2-7,8%, sức sinh sản tương đối đạt 23.810 trứng/kg cá cái và sức sinh sản tuyệt đối đạt 102.387 trứng/cá cái (cá có trọng lượng 4,3 kg). Khi thành thục, trứng có đường kính 2,05 ± 0,16 mm. Dùng LH-RHa + DOM + não thùy hoặc HCG + não thùy kích thích cá cái rụng trứng đạt trên 50%. Tỷ lệ trứng thụ tinh đạt cao nhất là 59,2%, tỷ lệ nở 13,9% và tỷ lệ sống cá bột là 71%. Ương cá trà sóc 20-25 ngày trong bể ở mật độ 500 con/m2, 1.000 con/m2 và 1.500 con/m2 đạt tỷ lệ sống lần lượt là 65,5%, 63,5 % và 55 %. Ương cá trà sóc trong ao đất 60 ngày tuổi tăng trưởng trung bình đạt 0,13 g/ngày, trọng lượng trung bình 5,33 g/con.

Từ khóa: Probarbus jullieni, sinh sản nhân tạo, kích dục tố, ương cá giống, tỷ lệ sống.

1 Trung tâm Quốc gia Giống Thủy sản Nước ngọt Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected] 2 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.

I. GIỚI THIỆU

Cá trà sóc có tên khoa học là Probarbus jul-lieni Sauvage, 1880. Ba loài thuộc giống Pro-barbus (P. jullieni; P. labeaminor; Probarbus spp) đều được ghi vào sách đỏ của IUCN về động vật bị đe dọa. Kể từ năm 2000, P. Jullieni được phân hạng nâng lên mức độ nguy cấp và đã được ghi trong phụ lục 1 của Công ước buôn bán quốc tế những loài hoang dã có nguy cơ (CITES). Hiện chúng là một trong những loài cá quý của sông Mekong và là loài “Đầu tàu” của khu vực (Mattson và ctv., 2002).

Cá trà sóc là đối tượng có nguy cơ tuyệt chủng lớn trong danh sách ban hành của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn năm 2008.

Về góc độ bảo tồn, cá trà sóc đang được chú trọng và là một trong những nguồn gen được bảo tồn lưu giữ tại Trung tâm Quốc gia Giống thủy sản nước ngọt Nam bộ.

Trên thế giới, cá trà sóc được kích thích sinh sản nhằm mục đích nghiên cứu và phục hồi nguồn lợi. Ở Việt nam, cá trà sóc chưa được kích thích sinh sản nên không có con giống phục vụ nghiên cứu cũng như nghề nuôi. Nghiên cứu sinh sản là phương pháp góp phần bảo vệ cá trà sóc tuyệt chủng và làm đa dạng sinh học giống loài cá nước ngọt Nam bộ, tiến đến tạo ra con giống chủ động phục vụ cho nghề nuôi.



Nghiên cứu nhằm thực hiện 02 mục tiêu: • Sinh sản nhân tạo cá trà sóc thành công và

xây dụng quy trình sản xuất giống• Bảo vệ loài cá trà sóc khỏi nguy cơ tuyệt

chủng, khai thác và phát triển nguồn gen phục vụ nuôi trồng thủy sảnĐể thực hiện được những mục tiêu này nuôi

vỗ cá bố mẹ thành thục trong ao và kích thích cá bố mẹ sinh sản nhân tạo đã được nghiên cứu.

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thời gian và địa điểm

- Địa điểm: nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm Quốc gia Giống thủy sản Nước ngọt Nam bộ, xã An Thái Trung, huyện Cái Bè, tỉnh Tiền Giang.

- Thời gian: từ tháng 9 năm 2011 đến tháng 2 năm 2015.

2.2. Vật liệu

Đàn cá nghiên cứu gồm có 102 con được thu gom từ tự nhiên về nuôi lưu giữ trong ao tại Trung tâm Quốc gia Giống thủy sản Nước ngọt Nam bộ.

Vật liệu phục vụ sinh sản: chất kích thích cá sinh sản (HCG, não thùy, LH-RHa, DOM), nước cất, ống kim tiêm, lưới bắt cá, bể cá đẻ, bể ấp trứng cá, khay, thau, vợt, vv.... Hóa chất: formol, dung dịch Bouin, dung dịch Davidson, cồn 96%, thuốc gây mê (Ethylen glycol mon-phenyl ether), dung dịch đẳng trương (Ringer Lactate Aguettant) nồng độ NaCl 0,6%, v.v…. Dụng cụ dùng kiểm tra môi trường: máy đo ôxy hiệu 315i, máy đo pH nước hiệu 315i (Đức sản xuất), máy đo NH3 cầm tay, nhiệt kế thủy ngân.

2.3. Phương pháp nghiên cứu2.3.1. Nuôi vỗ cá bố mẹBố trí ao nuôi- Đàn cá bố mẹ được chọn nuôi có tuổi ≥ 4

tuổi, trọng lượng 2,9-6,7 kg/con. Mật độ nuôi vỗ

1 con/50 m2 ao. Thời gian nuôi vỗ cá bố mẹ từ tháng 4 - 12 hàng năm.

- Ao nuôi vỗ cá bố mẹ: ao đất có diện tích 5.000 m2, sâu 1,5- 2,0m, ao được chia làm 2 phần bằng nhau và bố trí nuôi theo 2 nghiệm thức khác nhau về thành phần thức ăn.

Thí nghiệm 1 (TN1):

Cho cá ăn thức ăn viên công nghiệp có thành phần đạm 40%, béo 8%. Từ tháng 4 - 8 nuôi vỗ tích cực cho cá ăn 3 – 4% trọng lượng thân, tháng 9 trở đi nuôi vỗ thành thục, cho cá ăn thức ăn viên 1 – 2% trọng lượng thân, bổ sung dầu mực (3% tổng lượng thức ăn viên) và premix (0,5% tổng lượng thức ăn viên).

Thí nghiệm 2 (TN2):

Cho cá ăn với liều lượng và thành phần như thí nghiệm 1, ngoài ra còn cho thêm thịt ốc bươu bằng 20 % tổng lượng thức ăn cho cá.

Cả 2 thí nghiệm đều cho cá ăn 2 lần trong ngày vào lúc 8 giờ sáng và 5 giờ chiều, buổi chiều lượng thức ăn chiếm 2/3 tổng lượng thức ăn trong ngày.

Chăm sóc, quản lý cá bố mẹThường xuyên theo dõi hoạt động sống,

hoạt động bắt mồi của cá. Kiểm tra ngoại ký sinh trùng ký sinh trên thân và mang định kỳ mỗi tháng (kiểm tra từ 5-7 cá thể) kết hợp ng-hiên cứu sinh học. Từ tháng 6-8, kiểm tra nội ký sinh trong thịt (3-6 cá thể). Khi phát hiện cá nhiễm ký sinh tùy mức độ cảm nhiễm có kế hoạch xử lý kịp thời.

Theo dõi môi trường nước ao nuôiTrong thời gian nuôi vỗ nước ao được

thay 2 lần/tháng. Lượng nước thay bằng 20 - 30% lượng nước ao, đến giai đoạn nuôi vỗ thành thục thì vận hành thêm máy bơm vào ban đêm từ 5 giờ chiều đến 6 giờ sáng để tạo dòng chảy bổ sung ôxy và kích thích cá thành thục nhanh hơn.



Các chỉ tiêu môi trường nước: Nhiệt độ, oxy hòa tan, pH được kiểm tra mỗi ngày 2 lần lúc 6 giờ sáng và 2 giờ chiều, NH3 và NO2 mỗi tuần kiểm tra 1 ngày (2 lần/ngày lúc 6 giờ sáng và 2 giờ chiều). Thông qua kết quả đo đạc, kịp thời điều chỉnh các chỉ tiêu môi trường nước trong giới hạn cho phép để nuôi vỗ cá bố mẹ.

2.3.2. Kích thích cá bố mẹ sinh sản2.3.2.1. Chọn cá sinh sản- Cá cái: Dựa vào giai đoạn thành thục của

tế bào trứng, độ đồng đều của tế bào trứng, mức độ lệch của nhân tế bào trứng, kích thước của trứng và màu sắc của trứng và kết hợp kiểm tra ngoại hính như: bụng to, độ căng và mềm của bụng để đánh giá mức độ thành thục của cá cái.

- Cá đực chọn tham gia sinh sản bằng phương pháp vuốt nhẹ lườn bụng về lỗ sinh dục và có tinh dịch chảy ra. Nếu tinh sánh đặc có màu trắng đục là cá thành thục tốt.

2.3.2.2. Kích thích cá sinh sản- Kích thích cá sinh sản 2 đợt, mỗi đợt 1 - 2

cặp cá bố mẹ. Cá bố mẹ sau khi kiểm tra đạt yêu cầu về độ chín muồi sinh dục, cá được tiêm một số chất kích thích sinh sản (KTSS) gồm: HCG, LH-RHa + DOM và não thùy thể (PG) để thăm dò hiệu ứng của việc phối hợp chất KTSS đến quá trình rụng trứng và ảnh hưởng của chúng đến các chỉ tiêu: tỷ lệ cá rụng trứng, tỷ lệ trứng thụ tinh, tỷ lệ trứng nở và tỷ lệ sống cá bột.

Cá cái: Áp dụng 2 nghiệm thức phối hợp chất KTSS bằng cách tiêm 2 lần cách nhau 7 - 8 giờ.

+ Nghiệm thức 1 (LH-RHa + DOM + PG): Lần 1 tiêm 0,5 mg PG/kg, lần 2 tiêm 100 µg LH-RHa + 10 - 15 mg DOM/kg.

+ Nghiệm thức 2 (HCG + PG): Lần 1 tiêm 0,5 mg PG/kg, lần 2 tiêm 2.000 IU HCG/kg.

Cá đực: Tiêm 1 lần cùng với thời gian tiêm lần 2 ở cá cái với cùng loại chất KTSS bằng ½ liều tiêm cá cái.

Sau thời gian tiêm quyết định 6 giờ, tiến hành kiểm tra cá cái, nếu cá rụng trứng thì vuốt trứng và áp dụng phương pháp gieo tinh nhân tạo.

2.3.2.3. Thụ tinh và ấp trứngThụ tinh:

+ Tinh không để lẫn với nước, pha loãng 10 lần với nước muối sinh lý (0,9%) sau đó bảo quản ở nhiệt độ 4 - 50C để hạn chế tinh trùng vận động và kéo dài tuổi thọ của tinh trùng.

+ Trứng được thu vào thau nhựa không để lẫn với nước. Cho dung dịch tinh pha loãng vào trứng chứa trong thau với liều 1 ml dung dịch tinh/10g trứng, dùng lông vũ khuấy đều vài giây rồi cho nước sạch vào từ từ để tinh trùng vận động và thụ tinh với trứng.

Ấp trứng: Trứng sau khi thụ tinh được ấp trong bình Weiss 6 lít được thay đổi nước liên tục. Mật độ trứng ấp 30.000 trứng/lít. Số trứng được định lượng bằng phương pháp trọng lượng.

2.3.3. Ương cá giống2.3.3.1. Ương cá bột đến cá hương 21 ngày

tuổi trên bểChuẩn bị dụng cụ và nướcBể ương được ngâm trong dung dịch

chlorine (nồng độ 100 ppm) trong 1 giờ, sau đó phơi trong nắng 1 ngày và giữ trong mát 3 ngày. Nước được xử lý bằng chlorine (nồng độ 100 ppm) sục khí liên tục trong 3 ngày. Cho nước đã được xử lý vào bể đủ 100 lít, đặt bể trong nhà có lưới che để ổn định nhiệt độ và chắn giữ địch hại xâm nhập, mỗi bể được lắp 1 viên đá bọt cỡ trung bình để sủi khí nhẹ vừa đủ.

Thả cá bộtThí nghiệm 3 mật độ khác nhau: 500; 1.000

và 1.500 con/m3. Môi trường trong bể giữ cá bột và trong bể ương cá tương tự nhau. Cá bột 3 ngày tuổi có chiều dài 1,1 mm. Cá bột được thả lúc trời mát.



Quản lý chăm sóc

Trong 10 ngày đầu cho cá ăn 3 lần/ngày, 7 giờ sáng cho cá ăn Moina (hoặc Artemia) và thức ăn bột mịn, 2 giờ chiều cho cá ăn Moina (hoặc Artemia) và lòng đỏ trứng, 8 giờ tối cho cá ăn Moina (hoặc Artemia) và thức ăn bột mịn. Ngày thứ 11 trở đi cho cá ăn 2 lần/ngày. Moina (hoặc Artemia) cho vào bể ương đạt mật độ ≥ 2 con /ml, lòng đỏ trứng cho ăn với liều 10 g/bể/ngày và thức ăn bột mịn 100 g/bể/ngày trong 10 ngày đầu, những ngày tiếp theo chỉ cho ăn thức ăn viên mảnh theo khả năng sử dụng của cá. Theo dõi môi trường nước: Nhiệt độ và pH được kiểm tra mỗi ngày 2 lần lúc 6 giờ sáng và 2 giờ chiều, DO và NH3-N mỗi tuần kiểm tra 2 lần trong ngày (lúc 6 giờ sáng và 2 giờ chiều). Nước được cấp mỗi ngày để bù lượng nước mất đi, 10 ngày thay 70% lượng nước trong bể từ nguồn nước đã xử lý.

Kiểm tra tăng trưởng về trọng lượng và chiều dài 10 ngày/lần cùng thời điểm thay nước. Mỗi nhóm mật độ nuôi thu 3 mẫu từ 10 – 30 con/mẫu.

Thu hoạch

Sau 20 ngày thu hoạch toàn bộ 27 bể ương. Tính tỷ lệ sống và tăng trưởng cho mỗi bể riêng biệt. Cá thu hoạch xong được chuyển xuống ao đất ngay để ương giai đoạn tiếp theo lên cá giống.

2.3.3.2. Ương cá hương đến cá giống 35 ngày tuổi trong ao đất

Chuẩn bị ao ương

Tát cạn ao, xử lý thuốc diệt cua, ốc là ký chủ mang mầm bệnh, bón vôi Ca(OH)2 với liều 8 kg/100 m2, phơi nắng 2 - 3 ngày. Cho nước vào qua lưới lọc đến khi độ sâu mực nước đạt 1,2 m.

Thả cá

Cá hương 21 ngày tuổi, trọng lượng trung bình 0,1 – 0,15 g/con, chiều dài 2,0 – 2,9 mm/con. Mật độ thả 50 con/m 2 ao. Cá bột được thả lúc trời mát.

Quản lý chăm sóc

Cho cá ăn 2 lần trong ngày lúc 7 - 8 giờ sáng và 4 - 5 giờ chiều. Khẩu phần cho cá ăn bằng 10% trọng lượng thân. Theo dõi môi trường nước: Nhiệt độ và pH được kiểm tra mỗi ngày 2 lần lúc 6 giờ sáng và 2 giờ chiều, DO và NH3-N mỗi tuần kiểm tra 2 lần trong ngày (lúc 6 giờ sáng và 2 giờ chiều). Nước được cấp đủ độ sâu trước khi thả cá và được cấp bổ sung khi độ sâu nước giảm. Kiểm tra tăng trưởng về trọng lượng và chiều dài 10 ngày/lần, mỗi lần thu 30 mẫu.

Thu hoạch

Sau 40 ngày thu hoạch toàn bộ. Tính tỷ lệ sống và tăng trưởng.

III. KẾT QUẢ

3.1. Nuôi vỗ cá bố mẹ thành thục

3.1.1. Biến động các yếu tố môi trường nước trong quá trình nuôi vỗ

Trong thời gian nuôi vỗ định kỳ kiểm tra môi trường nước thông qua đo đạt (Bảng 1). Giá trị pH đo được trong suốt thời gian nuôi biến động không lớn và trung bình buổi sáng 7,5±0,2, buổi chiều 8,3±0,1 thích hợp cho sự phát triển và thành thục của cá. DO trung bình trong ao vào buổi sáng 4,14±0,46 mg/l, buổi chiều 6,33±0,33 mg/l. NH3-N trong ao nuôi vỗ trung bình ≤ 1 mg/lít là hoàn toàn thích hợp cho cá nuôi.



Bảng 1: Các yếu tố môi trường nước trung bình các tháng nuôi vỗ

Tháng nuôi

Nhiệt độ (0C) pH DO (mg/l) NH3 (mg/l) NO2 (mg/l)

Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều

5 29,0 31,6 7,4 8,2 4,1 6,1 0,09 0,12 0,13 0,13

6 28,7 31,1 7,6 8,4 3,4 6,4 0,08 0,08 0,13 0,13

7 28,7 31,1 7,6 8,2 3,9 7,1 0,09 0,08 0,15 0,10

8 28,6 31,5 7,4 8,1 4,1 6,2 0,06 0,06 0,13 0,10

9 28,2 30,4 7,3 8,2 4,6 6,2 0,08 0,09 0,12 0,12

10 29,2 31,9 7,9 8,5 4,9 6,2 0,10 0,13 0,13 0,15

11 29,1 31,4 7,5 8,3 4,5 6,2 0,11 0,17 0,10 0,08

TB 28,8 31,3 7,5 8,3 4,1 6,3 0,09 0,10 0,13 0,11

±0,4 ±0,5 ±0,2 ±0,1 ±0,5 ±0,3 ±0,02 ±0,04 ±0,01 ±0,02

3.1.2. Sự thành thục sinh dục của cá

Mùa vụ thành thục

Mùa vụ thành thục của cá trà sóc (Hình 1) cho thấy từ khi nuôi vỗ tháng 4 đến tháng 8, buồng trứng cá cái chỉ nằm ở giai đoạn II. Tháng 9 có 12,5% số cá cái có buồng trứng phát triển đến đầu giai đoạn III (noãn bào phase 4), tháng 10 có 41,4% buồng trứng phát triển đến giai đoạn III-IV và tăng lên 55,5% vào tháng 11. Cá có buồng trứng phát triển đến giai đoạn III-IV cao nhất vào tháng 12 là 61,3% và giảm dần đến tháng 1 năm sau còn 34,5%. Đến tháng 2 không còn cá có tuyến sinh dục giai đoạn III-IV, tất cả cá cái tuyến sinh dục trở về giai đoạn II và kết thúc mùa vụ cá thành thục. Đánh giá thành thục theo tế bào trứng: chưa có noãn hoàng (chưa thành thục) và có noãn hoàng (thành thục).

Hình 1. Sự thành thục cá cái qua các tháng

+ Tuổi và trọng lượng thành thục lần đầuCá đực thành thục lần đầu có trọng lượng ≥

3,2 kg/ con và cá cái là ≥ 4,3 kg/con. Tuổi thành thục lần đầu là 4+ đối với cá đực và 5+ đối với cá cái.

Bảng 2: Tuổi và trọng lượng cá trà sóc thành thục

Tuổi thành thục lần đầu

(năm)

Trọng lượng thành thục lần đầu (kg) Nguồn

Cá đực Cá cái Cá đực Cá cái

4+ 5+ ≥ 3,2 ≥ 4,3Nhóm

nghiên cứu

5+ 5+ 2-7 5-10Rodrarung và Jensiri-sak (1990)



+ Tỉ lệ cá thành thụcBảng 3: Tỷ lệ cá trà sóc thành thục

NămNT1 (thức ăn viên và

chất bổ sung)NT2 (thức ăn viên, thức ăn tươi

và chất bổ sung)

2013

Cá cái thành thục (%) 27,8 37,0Cá đực thành thục (%) 50,0 71,4Cá cái và đực thành thục (%)

38,9b 54,2b

2014

Cá cái thành thục (%) 65,0 66,7Cá đực thành thục (%) 55,6 62,5Cá cái & đực thành thục (%)

60,3a 64,6a

Ghi chú: Cá cái thành thục tuyến sinh dục giai đoạn III trở lên (có noãn hoàng), cá đực thành thục vuốt có tinh chảy ra.

+ Hệ số thành thục Bảng 4: Hệ số thành thục cá trà sóc cái

Giai đoạn tuyến sinh dục Hệ số thành thục (%) Trọng lượng cá (kg)

III 0,46 - 0,76 3,2 - 3,7

IV 7,2 - 7,8 4,3-4,5

+ Sức sinh sản (SSS) tương đối và tuyệt đốiBảng 5: Sức sinh sản cá trà sóc và một số loài cá khác

Loài cáSSS tương đối

(trứng/kg cá cái)SSS tuyệt đối (trứng/cá cái)

Trọng lượng (kg)

Nguồn

Cá trà sóc

Cá hô

Cá cóc

23.810

21.056

64.670

102.387

1.059.118

149.980

4,3

18,6

2,7

Nhóm nghiên cứu

Huỳnh Hữu Ngãi (2006)

Phạm Văn Khánh (2004)

3.2. Kích thích cá sinh sản

Cho cá sinh sản nhân tạo bằng phương pháp vuốt trứng. Tỷ lệ cá rụng trứng ở hai nghiệm thức ≥50%, tỷ lệ thụ tinh và nở ở nghiệm thức 2 cao hơn nghiệm thức 1 và có ý nghĩa thống kê. Ở nhiệt độ nước ổn định từ 27-290C quá trình phát triển phôi của trứng kéo dài 38-47 giờ.

Hình 2: Thu trứng cá cái



3.3. Ương cá giống

Tăng trưởng cá giống được trình bày trong Hình 3.

Hình 3: Tăng trưởng về trọng lượng theo thời gian

Bảng 6: Tăng trưởng cá hương

Nghiệm thức 500 con/m3 Nghiệm thức 1.000 con/m3 Nghiệm thức 1.500 con/m3

Trọng lượng (g)

Chiều dài (cm)


Chiều dài (cm)


Chiều dài (cm)

0,15a ± 0,02 2,29 ± 0,15 0,13a±0,02 2,12±0,18 0,10b±0,03 2,01±0,21

Bảng 7: Tỷ lệ sống cá hương

Nghiệm thức 500 con/m3 Nghiệm thức 1.000 con/m3 Nghiệm thức 1.500 con/m3

65,5a ± 8,9 63,5a ± 9,7 55,0a ± 10,2

Theo bảng 6, tăng trưởng của cá tỷ lệ

nghịch với mật độ, ở mật độ 500 và 1.000

con/m3 không có sự khác biệt về thống kê

(p>0,05), nhưng lại có sự khác biệt về thống

kê ở mật độ 1.500 con/m3 với hai mật độ

còn lại (p<0,05).

Tỷ lệ sống cá tăng lên khi mật độ ương giảm xuống (Bảng 7). Mật độ ương 1.000 con/m3 có tỷ lệ sống cao nhất là 63,5% và mật độ 1.500 con/m3 có tỷ lệ sống thấp nhất là 55 %, nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05).

Hình 4: Cá trà sóc giống 65 ngày tuổi

Ương cá trà sóc trong ao, tỷ lệ sống đạt từ 60,4 - 89%. Tỷ lệ sống đạt khá cao so với một số loài cá bản địa khác.

IV. THẢO LUẬN

4.1. Nuôi vỗ cá bố mẹ thành thục4.1.1. Biến động các yếu tố môi trường

nước trong quá trình nuôi vỗTheo Trương Quốc Phú (2003), pH thích

hợp cho các loài cá nuôi là 6,5-9, giá trị pH trong suốt thời gian nuôi nằm trong khoảng thích hợp (Bảng 1).

Hàm lượng ôxy hòa tan (DO) là yếu tố rất quan trọng trong ao nuôi vỗ cá bố mẹ, DO



trong ao nuôi thấp không những tác động đến hoạt động sống của cá mà còn ảnh hưởng đến sự thành thục sinh dục. Theo Nguyễn Văn Kiểm (2004), DO trong nước thích hợp cho thành thục cá bố mẹ là 3-4 mg/lít. Sự biến động DO sáng và chiều do sự tiêu thụ ôxy vào ban đêm của thực vật thủy sinh từ quá trình hô hấp, ban ngày DO tăng lên nhờ quá trình quang hợp của thực vật thủy sinh thải ra ôxy. Sự biến động DO trong ao nuôi không nhiều có thể do ao có mặt thoáng tương đối rộng và gió nhiều nên mặt ao luôn có sóng nhỏ giúp oxy hòa tan vào nước nhiều hơn. Ngoài ra, trong ao có bố trí hệ thống phun nước liên tục ban đêm để tăng lượng oxy hòa tan vào nước. Vì vậy hàm lượng oxy hòa tan trong nước ao nuôi vỗ luôn đảm bảo cho sự sống và thành thục tốt của cá.

Môi trường nước có nhiều vật chất hữu cơ sẽ làm NO2 cao do biến đổi theo chu trình chuyển hoá Nitơ. Đạm là thành phần dinh dưỡng giúp sinh vật thuỷ sinh vật phát triển, khi đạm tồn tại ở dạng NO2 cao trong nước không thích hợp và ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ sống, sinh trưởng đối với thủy sinh vật. NO2 được xem là một loại khí độc ảnh hưởng rất lớn đến đời sống của thủy sinh vật. Có những nhân tố sau đây ảnh hưởng đến độ độc của nitrite gồm pH, hàm lượng oxy hòa tan, kích cỡ cá, tình trạng dinh dưỡng,… (Dương Nhật Long, 2013). Kết quả khảo sát và phân tích NO2 trong ao nuôi luôn < 0,2 mg/lít, đây là giới hạn rất thích hợp cho môi trường nuôi vỗ cá bố mẹ. Theo Trương Quốc Phú (2005), NO2< 0,5 mg/lít là phù hợp cho cá.

Hàm lượng NH3-N được sinh ra trong ao chủ yếu do sự phân hủy chất thải ra từ cá, thức ăn thừa và xác tảo chết. Những thành phần này bổ sung rất nhiều muối dinh dưỡng cho ao nuôi, nhưng đồng thời cũng tạo ra nhiều khí độc (trong đó có NH3). Theo Trương Quốc Phú (2005), trong ao hàm lượng NH3-N> 1 mg/lít là không thích hợp cho các loài cá nuôi. Theo

Nguyễn Đình Trung (2002), khi tổng NH3 lên đến 0,5 ppm cần phải thay nước để giảm lượng chất hữu cơ trong ao. Giá trị NH3-N có tăng lên theo thời gian nuôi là do sự tích tụ và phân hủy thức ăn thừa, chất thải từ cá, xác tảo chết,… trong ao càng nhiều theo thời gian nuôi. Sự biến động NH3-N không lớn và trong giới hạn cho phép nuôi cá.

4.1.2. Sự thành thục sinh dục của cá So với mùa vụ sinh sản các loài cá khác

ở ĐBSCL, cá trà sóc thành thục muộn hơn và khoảng thời gian thành thục ngắn.Trong cùng điều kiện nhân tạo kết quả nghiên cứu của Thi Thanh Vinh (2012, 2013) và kết quả nghiên cứu của Rodrarung và Ensirisak (1990) cá trà sóc đực có tuổi thành thục lần đầu khác nhau, nhưng trọng lượng gần bằng nhau. Trong khi đó ở cá cái tuổi và trọng lượng thành thục lần đầu theo chiều ngược lại. Hai kết quả nghiên cứu trên không nói đến nguồn gốc và điều kiện sống của cá nên có thể là nguyên nhân ảnh hưởng đến sự khác nhau về tuổi và trọng lượng thành thục lần đầu.

Tỉ lệ cá trà sóc cái và đực thành thục đạt trên 55% (Hình 1). Năm 2013, cá cái có tỷ lệ thành thục thấp hơn cá đực, năm 2014 cái lại có tỷ lệ thành thục thấp hơn cá đực. Có thể tuổi thành thục lần đầu cá đực thấp hơn cá cái nên năm 2013 phần lớn cá đực đạt tuổi thành thục lần đầu. Điều này cũng phù hợp với một số tác giả đã nhận định. Thành phần thức ăn nuôi vỗ ảnh hưởng đến tỷ lệ cá thành thục. Khi nuôi vỗ cá bố mẹ cho ăn cùng khẩu phần thức ăn nhưng thành phần khác nhau sẽ cho tỷ lệ cá thành thục khác nhau. Thịt ốc được thay thế trong thành phần thức ăn nuôi vỗ cho thấy có sự khác biệt về tỷ lệ thành thục giữa 2 nghiệm thức, nhưng lại không có ý nghĩa về thống kê. Amatyakul (1995) phân tích dạ dày ở cá trà sóc kích thước 80 cm có nhiều ốc, hai mảnh vỏ, ông cho rằng đây là loài cá ăn tạp với thức ăn ưa thích là động



vật thân mềm. Vì vậy ốc là thành phần thức ăn rất cần cho nhu cầu dinh dưỡng cá bố mẹ và có ý ảnh hưởng đến tỷ lệ cá thành thục.

Cá bố mẹ được tập hợp có kích thước khác nhau nên trong đàn có một số cá chưa đạt tuổi và trọng lượng thành thục lần đầu (>4 tuổi). Một số cá vừa đạt tuổi và trọng lượng thành thục lần đầu (>4 tuổi), tuyến sinh dục phát triển đến giai đoạn III và dừng lại, nên hệ số thành thục rất thấp (0,46-0,75%). Một số cá đạt tuổi và trọng lượng thành thục lần đầu (>5 tuổi),tuyến sinh dục phát triển đến giai đoạn IV, hệ số thành thục cao hơn(7,2-7,8%). Cũng gần giống những kết quả nghiên cứu khác. Theo Rodrarung và Jensirisak (1990) cá trà sóc thành thục >5 tuổi, khi đó cá đực có trọng lượng 2-7 kg và cá cái trọng lượng 5-10 kg/con.

Sức sinh sản tuyệt đối cá trà sóc từ 68.230-102.387 trứng/cá cái. Trong cùng điều kiện sống, cá trà sóc có sức sinh sản khác nhau ở những cá thể có trọng lượng và tuổi khác nhau. Sức sinh sản thể hiện đặc điểm sinh sản của giống loài, tùy đặc điểm sinh học từng loài cá mà sức sinh sản cao hoặc thấp, thường ở những cá sinh sản không chăm sóc con thì sức sinh sản tuyệt đối cao hơn cá sinh sản chăm sóc, giữ con khi cùng trọng lượng. Về sức sinh sản tương đối cá trà sóc cao hơn cá hô không nhiều nhưng thấp hơn nhiều so với cá cóc.

4.2. Kích thích cá sinh sản

Đến nay chưa tìm thấy dấu hiệu nào để phân biệt cá trà sóc đực và cá cái rõ ràng. Đến mùa sinh sản có thể phân biệt cá đực và cá cái như sau: Cá đực thân thon và dài, lỗ sinh dục nhỏ, đường dẫn ống sinh dục nông và hẹp, vuốt ở lườn bụng có tinh chảy ra. Cá cái bụng to, lỗ sinh dục lớn, đường dẫn ống sinh dục sâu và rộng. Cá thành thục dùng que lấy được tế bào trứng.

Vẫn chưa có tài liệu nào nói về ảnh hưởng môi trường đến quá trình phát triển phôi của

trứng. Theo Cacot (2008), nghiên cứu trứng cá trà sóc nở sau thời gian thụ tinh 42 giờ ở nhiệt độ nước 22-28°C. Nhiệt độ là yếu tố môi trường cần thiết đối với đời sống thuỷ sinh vật vì cá là động vật biến nhiệt. Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến các quá trình sống của cá như: quá trình trao đổi chất, hô hấp, sinh trưởng, cường độ bắt mồi, vv…

pH là một trong những yếu tố ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đối với động vật thủy sản. Đối với cá việc tăng hay giảm pH sẽ làm thay đổi độ thẩm thấu của tế bào không có lợi cho cá và ảnh hưởng đến sinh trưởng, tỷ lệ sống, sinh sản và dinh dưỡng. Cá sống trong môi trường pH quá thấp hay quá cao đều sẽ làm chậm sự phát dục, hoặc làm cho cá không đẻ hay đẻ ít. Trương Quốc Phú (2003) nhận định pH thích hợp cho các loài cá nuôi là 6,5-9. Các giá trị pH đo được trong suốt thời gian ương biến động pH không lớn, trung bình buổi sáng 7,7±0,1, buổi chiều 8,1±0,12 ở chỉ số pH như trên là thích hợp cho sự phát triển của cá.

4.3. Ương cá giống

Hàm lượng ôxy hòa tan (DO) là yếu tố rất quan trọng trong ao nuôi, DO trong ao nuôi thấp không những tác động đến hoạt động sống của cá mà còn ảnh hưởng đến sự thành thục sinh dục. Theo Nguyễn Văn Kiểm (2005), DO trong nước thích hợp cho các loài cá nuôi từ 3-4 mg/lít. DO nước buổi sáng và chiều trong ao ương từ 6,7-7,9 mg/l là rất tốt để cho cá hương phát triển.

Cá trà sóc ương 40 ngày tuổi (tính từ cá hương) tăng trưởng nhanh dần theo thời gian, từ ngày thứ 20 đến ngày thứ 40 cá tăng trưởng nhanh hơn. Trọng lượng trung bình qua 2 đợt ương khi thu hoạch là 5,4 g/con và 5,6 g/con. Sự khác nhau về trọng lượng cá thu hoạch không khác biệt có ý nghĩa thống kê.

Cá trà sóc ương trong ao được gây thức ăn tự nhiên (Moina) và cung cấp đủ thức ăn công



nghiệp (42% đạm) nên không chỉ cá lớn nhanh mà tỷ lệ sống cũng đạt cao (>50%). Tỷ lệ sống cá trà sóc cũng giống như cá cóc là 50,0-58,1% (Phạm Văn Khánh, 2004), cá hô 54,8% (Huỳnh Hữu Ngãi, 2008).

V. KẾT LUẬN

5.1. Kết luận

- Tuổi ảnh hưởng đến sự thành thục của cá. Chọn cá bố mẹ nuôi vỗ nên chọn cá đực tuổi 4+ trọng lượng ≥2,9 kg, cá cái tuổi 5+, trọng lượng ≥4,3 kg. Nuôi vỗ trong ao mùa vụ cá thành thục từ tháng 9 đến tháng 1 năm sau. Tỷ lệ cá thành thục đạt cao nhất từ tháng 11-12, khoảng thời gian này cũng là thời điểm cá sinh sản.

- Nuôi vỗ cá bố mẹ bằng thức ăn viên công nghiệp (40% đạm và 8% béo) và khoáng (0,5% tổng thức ăn) và dầu mực (3% tổng thức ăn) có bổ sung thịt ốc bươu (20% tổng thức ăn). Cá bố mẹ thành thục đạt 64,6% và tốt hơn nuôi vỗ không có thịt ốc bươu.

- Chọn cá cái sinh sản có đường kính trứng >2 mm. Cá cái thành thục được kích thích bằng 0,5 mg PG và 100 µg LH-RHa + 10 mg DOM /

kg cho tỷ kệ cá rụng trứng cao hơn dùng 0,5 mg PG và 2.000 IU HCG/kg.

- Buồng trứng cá cái ở giai đoạn IV có hệ số thành thục 7,2%, sức sinh sản tương đối và tuyệt đối đạt cao nhất là 23.810 trứng/kg cá cái và 102.387 trứng/cá cái (cá trọng lượng 4.300g).

- Ương cá trà sóc 20 ngày trong bể mật độ ương 1.000 con/m3 cho ăn tổ hợp thức ăn (Moi-na + lòng đỏ trứng gà + thức ăn bột mịn) là thích hợp nhất. Ương cá trà sóc từ hương 25 ngày tuổi lên giống 60 ngày tuổi trong ao ở mật độ 50 con/m3, tỷ lệ sống đạt 60,4-88,9%, trọng lượng 5,4-5,6 g/con.

5.2 Đề xuất

- Nghiên cứu thêm các yếu tố dinh dưỡng (thức ăn theo giai đoạn nuôi) và môi trường (thủy lý hóa, dòng chảy) ảnh hưởng đến sự thành thục cá bố mẹ nhằm nâng cao các chỉ số sinh sản của cá như tỷ lệ thành thục, hệ số thành thục và sức sinh sản để xây dựng qui trình nuôi vỗ cá bố mẹ hoàn thiện hơn.

- Cần nghiên cứu thêm các thí nghiệm ương cá hương lên cá giống ở nhiều mật độ và thức ăn khác nhau để xây dựng được quy trình ương cá trà sóc hoàn chỉnh hơn.

TÀI LIỆU THAM KHẢOTài liệu tiếng Việt

Công ty trách nhiệm hữu hạn Tây nguyên, 2009. Đánh giá các loài (loài bản địa và các loài khác) gắn với nhu cầu sản xuất trong tương lai nhằm đa dạng giống loài thủy sản ở tỉnh Đắk Lắk, 95 trang.

Dương Nhật Long, 2013. Nghiên cứu kỹ thuật sản xuất giống nhân tạo cá heo (Botiamodesta bleeker, 1865) ở tỉnh An Giang, 87 trang.

Đặng Văn Trường, Hoàng Quang Bảo, Phạm Đình Khôi và Thi Thanh Vinh, 2005. Sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá mè hôi (Osteochilus melanop-leurus). Tuyển tập Nghề cá sông Cửu long. Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, NXB Nông nghiệp, 544 trang.

Hoàng Quang Bảo, Phạm Đình Khôi, Thi Thanh Vinh và Đặng Văn Trường, 2005. Sinh sản nhân tạo cá chài (Leptobarbus hoevenii). Tuyển tập Nghề cá sông Cửu Long. Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2. NXB Nông nghiệp, 544 trang.

Huỳnh Hữu Ngãi, 2006. Thuần dưỡng, tái tạo và phát triển cá hô (Catlotcarpio siamensis). Báo cáo khoa học - Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản 2, 30 trang.

Pravdin, I.F., 1963. Hướng dẫn nghiên cứu cá. NXB Khoa học và kỹ thuật Hà Nội. Phạm Thị Minh Gi-ang dịch, 276 trang.

Mai Đình Yên, Nguyễn Văn Trọng, Nguyễn Văn Thiện, Lê Hoàng Yến, Hứa Bạch Loan, 1992. Định loại



các loài cá nước ngọt Nam Bộ, Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật, Hà Nội, 350 trang.

MRC, 2005. Phân bố và sinh thái một số loài cá sông quan trọng ở hạ lưu sông Mekong,120 trang.

Nguyễn Đình Trung, 2002. Giáo trình Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi thủy sản. Đại học Nha Trang, 102 trang.

Nguyễn Minh Thành và Nguyễn Văn Kiểm, 2009. Cơ sở Khoa học và kỹ thuật sản xuất giống cá. NXB Nông nghiệp TPHCM, 215 trang.

Nguyễn Văn Kiểm, 2005. Giáo trình Kỹ thuật sản xuất giống. Trường Đại học Cần Thơ, 23 trang.

Phạm Văn Khánh, Đặng Văn Trường, Thi Thanh Vinh, Phạm Đình Khôi, Nguyễn Thị Rô, Nguyễn Thị Hồng Vân và Nguyễn Tường Anh, 2004. Sinh sản nhân tạo cá cóc (Cyclocheilichthys enoplos, Bleecker, 1850). Tuyển tập nghề cá sông Cửu long, Nhà xuất bản Nông nghiệp, 143 trang.

Trương Quốc Phú, 2003. Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi cá nước ngọt. NXB nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, 177 trang.

Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1982. Định loại cá nước ngọt. Đại Học Cần Thơ, 361 trang.

Thi Thanh Vinh, Đặng Văn Trường, Hoàng Quang Bảo và Phạm Đình Khôi, 2005. Kết quả sinh sản nhân tạo và ương nuôi cá duồng (Cirrhinus microlepis). Tuyển tập Nghề cá sông Cửu Long. Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2. NXB Nông nghiệp, 544 trang.

Thi Thanh Vinh, 2008. Một số đặc điểm sinh học và bước đầu sinh sản nhân tạo cá hô. Luận văn tốt nghiệp cao học. Trường Đại học Cần thơ, 59 trang.

Thi Thanh Vinh, 2011. Bảo tồn, lưu giữ nguồn gien và giống thủy sản nước ngọt. Báo cáo tổng kết đề tài năm Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2, 22 trang.

Thi Thanh Vinh, 2012. Bảo tồn, lưu giữ nguồn gien và giồng thủy sản nước ngọt. Báo cáo tổng kết đề tài năm Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2, 21 trang.

Tài liệu tiếng nước ngoài

Cacot, P., 2008. Domestication of the indigenous fish species in Laos, CIRAD-Aquaculture Unit and NAFRI-LARReC project.Activity report 15 Jan 08. Trial on the reproduction of the carp Pa-eun Probarbus jullieni with fish breeders collected from the Mekong River at the Don Kho Island (Dec. 07), 45 p.

Mattson, N.S., Buakhamvongsa, K., Sukumasavin, N., Tuan, N., Vibol, O., 2002. Cambodia Mekong gi-ant fish species: on their management and biology. MRC Technical Paper No. 3, Mekong River Com-mission, Phnom Penh. pp. 29. ISSN: 1683-1489.

Rainboth, W.J., 1996. Fishes of the Cambodian Me-kong. FAO Species Indentification Field Guide For Fisheries Purpose . Roma, FAO, 265, 49 p.

Rodrarung, D., Janesirisak, S., 1990. Induced spawning of earthen pond reared Jullien carp. In: Annual Report 1990, pp. 114-117.

Nongkai Inland Fisheries Station. Udonthani Inland Fisheries Development Center, Inland Fisheries Division, Department of Fisheries, Ministry of Agriculture and Cooperatives, Nongkai, Thailand.

Sukumasvavin, N., 2006. Studies on breeding and ge-netic diversity of an endangered cyprinids of the Mêkông river, seven - line barb probarbus jullieni. Tohoku university, 179 p.

Fishbase, 2015.http://fishbase.org/Summary/speciesSum-mary.php?ID=5422&gienusname= Probarbus&spe-ciesname= jullieni. Probarbus jullieni, http://www.fishbase.org (truy cập ngày 01/02/2015).



PRemilinaRY ResUlTs oF indUced sPaWning oF Probarbus jullieni sauvage, 1880

Thi Thanh Vinh1*, Pham Cu Thien2

ABSTRACTProbarbus jullieni is one of the critically endangered fish species recorded in the red book. The research fish was collected from the natural water bodies and cultured in the earthen ponds in 2005. The study on induced spawning started in 2011. Broodstock matured at 60.3% when conditioning in the earthen pond by feeding on pelleted feed and the supplements such as squid oil, vitamin and mineral. The matured rate reached 64.6% when adding snail flesh into the feed formula during broodstock conditioning. Probarbus jullieni matured in the period of October to January and the main spawning season was in November and December. The first maturation was at the age of 4+ for male and 5+ for female. The mature index of female was at 7.2-7.8%, the relative fecundity was 23,810 eggs/ kg and the absolute fecundity was 102,387 eggs (the weight of female was 4.3kg). The diameter of egg reached 2.05± 0.16 mm. The spawning rate was over 50% when injecting LH-RHa+DOM+ PG or HCG+PG. The highest fertilization rate was 59.2%, hatchling rate at 13.9% and the survival rate of fry at 71.0%. Nursing of Probarbus jullieni in 20-25 days in the cement tank at the density of 500, 1,000 and 1,500 inds/m2 got the survival rate at 65.5%, 63.5% and 55.0%, respectively. Nursing Probarbus jullieni in 60 days in the earthen pond had the average growth rate at 0.13g/day and the average weight at 5.33g/fish.

Keywords: Probarbus jullieni, induced spawning, gonadotropin hormone, nursing, survival rate.





1 National Breeding Center for Southern Freshwater Aquaculture – Research Institute for Aquaculture No2. * Email: [email protected] 2 Research Institute for Aquaculture No 2.



sỬ dỤng TẢo Isochrysis galbana cô ĐẶclÀm ThỨc ăn cho ẤU TRÙng nghÊU Meretrix lyrata

Đặng Tố Vân Cầm1*, Võ Minh Sơn2

TÓM TẮTTảo cô đặc Isochrysis galbana ở dạng nhão và lỏng đậm đặc được nghiên cứu làm thức ăn thay thế vi tảo tươi tương ứng cho ấu trùng nghêu Meretrix lyrata giai đoạn trôi nổi. Ấu trùng được ương trong các bể composite hình trụ, dung tích 120 lít. Thức ăn là hỗn hợp hai loài vi tảo Isochrysis gal-bana và Nannochloropsis oculata theo tỷ lệ bằng nhau. Vi tảo I. galbana cô đặc ở dạng nhão hoặc lỏng đậm đặc, sản phẩm khoa học của đề tài làm thí nghiệm so với dạng tươi hoặc dạng nhão, sản phẩm thương mại làm đối chứng. Hai thông số kích thước và tỷ lệ sống của ấu trùng được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của thức ăn lên sự phát triển của ấu trùng. Ấu trùng nghêu 10 ngày tuổi khi cho ăn bằng tảo I. galbana dạng nhão-thí nghiệm có kích thước trung bình (209,7±2,4 µm) cao khác biệt so với tảo tươi (201,7±2,1 µm), khi cho ăn bằng tảo I. galbana dạng lỏng-thí nghiệm (205,3±2,3 µm) và dạng nhão-đối chứng (203,3±1,7 µm) có kích thước cao hơn so với tảo tươi, nhưng sự khác biệt không mang ý nghĩa thống kê (p>0,05). Tỷ lệ sống của ấu trùng nghêu 10 ngày tuổi khi cho ăn tảo I. galbana dạng nhão-thí nghiệm (22,5±1,4%), dạng lỏng-thí nghiệm (29,2±2,8%), hay dạng nhão-đối chứng (24,5±1,5%) không khác biệt có ý nghĩa so với tảo tươi (23,6±1,7%). Tảo cô đặc I. galbana, sản phẩm của nghiên cứu này, có thể làm thức ăn thay thế vi tảo tươi tương ứng trong ương ấu trùng nghêu giai đoạn trôi nổi.

Từ khóa: Isochrysis galbana, Meretrix lyrata, tảo cô đặc dạng nhão, tảo cô đặc dạng lỏng.

1 Trung tâm Quốc gia Giống Hải sản Nam bộ - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected] 2 Phòng Sinh học thực nghiệm - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.

I. MỞ ĐẦU

Isochrysis galbana là một trong những loài vi tảo biển có hàm lượng chất dinh dưỡng cao, giàu axit béo thiết yếu, rất tốt để làm thức ăn cho ấu trùng các loài nhuyễn thể. Tế bào I. gal-bana chứa hàm lượng DHA rất cao, cao hơn nhiều loài tảo khác, chiếm khoảng 1/4 tổng hàm lượng acid béo và một lượng nhỏ EPA, cụ thể 5,53 µg DHA/mg trọng lượng ướt và 0,24 µg EPA/mg trọng lượng ướt (Volkman và ctv., 1989) là thức ăn chính cho ấu trùng nhuyễn thể và ấu trùng một số loài tôm cá biển (Wikfors và Patterson, 1994). Tuy nhiên, việc sử dụng vi tảo tươi nói chung trong nuôi trồng thủy sản gây ra nhiều hạn chế, do công nghệ nuôi chủ yếu theo

phương pháp truyền thống như ở nước ta hiện nay thường không đảm bảo về mặt số lượng và chất lượng. Khả năng bị tạp nhiễm, biến động trong nhân nuôi vi tảo dẫn đến rủi ro không đáp ứng đủ và kịp thời cho nhu cầu sản xuất. Hơn nữa, I. galbana là một trong những loài vi tảo rất khó nuôi, trên thế giới dù công nghệ nuôi tiên tiến nhưng theo Takeyama và ctv., cho đến năm 1996 loài này vẫn chưa được sử dụng phổ biến do khó khăn trong công nghệ nuôi.

Ở nước ta trong những năm gần đây, nuôi vi tảo tiếp cận công nghệ nuôi hiện đại trên thế giới, hệ thống photobioreactor, đặc biệt kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi, thu sinh khối vi tảo Nannochlorop-



sis oculata & Isochrysis galbana phục vụ sản xuất giống hải sản” đã đưa công nghệ nuôi vi tảo lên một tầm cao mới. Tuy nhiên công nghệ vẫn chưa được áp dụng rộng đến các cơ sở sản xuất giống, vì vậy sinh khối vi tảo tươi nói chung và I. galbana nói riêng vẫn đang còn là vấn đề nan giải cho các cơ sở sản xuất giống nhuyễn thể. Sản phẩm tảo cô đặc có hàm lượng carbohydrate thấp hơn, hàm lượng protein cao hơn so với tảo tươi tương ứng, sử dụng tảo cô đặc thay thế cho vi tảo tươi là điều có thể. Giá trị dinh dưỡng của tảo cô đặc của các loài tảo khác nhau đã được đánh giá thông qua ấu trùng và hậu ấu trùng hàu trong các nghiên cứu của nhiều tác giả (Heasman và ctv., 2000; Robert và ctv., 2001) với kết quả đầy hứa hẹn. Việc có thể thay thế tảo tươi bằng sản phẩm cô đặc tương ứng trong ương ấu trùng nhuyễn thể có ý nghĩa quan trọng. Khi nuôi vỗ tu hài mẹ và ương nuôi ấu trùng sử dụng tảo tươi Chlorella, Isochrysis, Chaetoceros, Chroomonas salina. Một trong những hạn chế của việc dùng tảo tươi là khó đảm bảo nguồn cung cấp ổn định vì nuôi sinh khối tảo phụ thuộc nhiều vào thời tiết, hiện tượng tảo tàn lụi đồng loạt vẫn thường xuyên xảy ra ở các trại sản xuất giống mà chưa có biện pháp khắc phục hiệu quả (Trần Thế Mưu, 2010). Sự cố này đã gây thiếu thức ăn nghiêm trọng cho tu hài mẹ và ấu trùng trong các trại sản xuất giống (Trần Thế Mưu và Vũ Văn Sáng, 2013.)

Sản phẩm tảo cô đặc trong nước chưa được sản xuất, sản phẩm thương mại chưa được nhập khẩu chính thức, có thể do thời hạn sử dụng của sản phẩm ngắn, giá thành cao. Kết quả đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi, thu sinh khối vi tảo Nannochloropsis oculata & Isochrysis gal-bana phục vụ sản xuất giống hải sản” triển khai 2011-2013, đã tạo ra được sản phẩm tảo cô đặc hai loài N. oculata và I. galbana ở dạng nhão và lỏng đậm đặc.

Xuất phát từ nhu cầu của vi tảo I. galba-na trong sản xuất giống nhuyễn thể, từ việc nghiên cứu ứng dụng sản phẩm tảo cô đặc sản xuất trong nướcthay thế vi tảo tươi tương ứng, nghiên cứu đã được thực hiện. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm so sánh việc sử dụng vi tảo tươi và cô đặc loài I. galbana, sản xuất theo quy trình công nghệ của Đề tài nêu trên, lên sự phát triển của ấu trùng nghêu giai đoạn trôi nổi. Kết quả nghiên cứu nhằm đáp ứng nhu cầu con giống ngày càng cao của các đối tượng hải sản có giá trị kinh tế cao.


2.1. Nghêu Meretrix lyrata.

Nghêu bố mẹ Meretrix lyrata có nguồn gốc từ Bình Đại, Bến Tre; cho đẻ để thu ấu trùng cho bố trí thí nghiệm.

Phương pháp kích thích sinh sản: Nghêu bố mẹ thành thục được vệ sinh sạch sẽ bằng nước ngọt sau đó được chuyển vào bể cho sinh sản, con đực và cái được bố trí vào trong cùng một bể. Cho sinh sản bằng phương pháp sốc nhiệt. Cụ thể như sau: nghêu bố mẹ được phơi trong bóng mát trong 5 giờ. Nghêu bố mẹ cũng được giữ khô ở bàn đẻ qua một đêm, sau đó nước được cấp vào sáng hôm sau để kích thích sinh sản. Trứng thụ tinh trong vòng 30 phút, 5 giờ sau khi trứng được thụ tinh, chúng được thu lại bằng lưới lọc kích thước 30 μm, sau đó được chuyển vào bể ương với mật độ 10 ấu trùng/ml. Bằng cách lọc, trứng thụ tinh sẽ được rửa nhằm loại bỏ tạp chất và tinh trùng bám ở ngoài bể mặt trứng. Tạp chất và tinh trùng dư thừa có thể làm ô nhiễm môi trường do chúng giàu protein. Khoảng 24 giờ sau khi thụ tinh, khi ấu trùng chuyển sang giai đoạn đỉnh vỏ thẳng (giai đoạn chữ “D”), chúng được lọc qua lưới 50 μm và chuyển vào bể ương thí nghiệm.



2.2. Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm bao gồm 4 nghiệm thức khác nhau về các dạng của vi tảo I. galbana sử dụng, mỗi nghiệm thức được lặp lại 5 lần (20 bể nuôi, Hình 1).

• Nghiệm thức 1: dạng tươi• Nghiệm thức 2: dạng nhão, sản phẩm thương

mại của Reed Mariculture, Campbell, California, viết tắt là “Nhão ĐC”.

• Nghiệm thức 3: dạng nhão, sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi, thu sinh khối vi tảo N. oculata & I. galbana phục vụ sản xuất giống hải sản” thuộc chương trình CNSH Nông nghiệp, Thủy sản của Bộ NN

& PTNT, viết tắt là “Nhão ĐT”.• Nghiệm thức 4: dạng lỏng đậm đặc, sản

phẩm của đề tài, viết tắt là “Lỏng ĐT”.

Sử dụng sản phẩm dạng nhão và lỏng đậm đặc loài I. galbana của đề tài có thời gian bảo quản sau 2 tuần vào thời điểm bắt đầu thí nghiệm. Loài Nannochloropsis oculata sử dụng ở dạng tươi cho tất cả các nghiệm thức.

Bố trí thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên, NT1 bao gồm các bể 1, 12, 13, 14, 20; NT2 bao gồm các bể 3, 5, 9, 11, 19; NT3 bao gồm các bể 4, 6, 8, 10, 16; NT4 bao gồm các bể 2, 7, 15, 17, 18.

Hình 1. Bể ương ấu trùng

2.3. Phương pháp ươngNước ươngNước sử dụng để ương ấu trùng là

nước biển được pha loãng bằng nước máy để điều chỉnh về độ mặn 23‰, xử lý diệt trùng bằng calcium hypochlorite Ca(OCl)2 nồng độ 30 ppm và sục khí cho đến khi hết Ca(OCl)2.

Bể ươngThí nghiệm được tiến hành trong 20 bể

composite hình trụ, đáy chóp, màu xám, đặt trong nhà, dung tích bể 120 l, dung tích nuôi 100 l. Mật độ ấu trùng được bố trí 10 con.ml-1.

Thức ăn và cho ănChuẩn bị thức ăn: Tảo tươi I. galbana ở

cuối pha tăng trưởng, xác định mật độ trước



khi sử dụng làm thức ăn cho ấu trùng (sử dụng buồng đếm Neubauer, đếm dưới KHV có độ phóng đại 400 lần). Thể tích tảo sử dụng được tính theo công thức: V (lít) = [Mật độ tảo duy trì trong bể nuôi x Thể tích nước nuôi (lít)]/Mật độ tảo sử dụng.

Tảo cô đặc dạng nhão, sản phẩm thương mại có mật độ 3,9 tỷ tb.ml-1; tảo cô đặc dạng nhão, sản phẩm của đề tài có mật độ 4 tỷ

tb.ml-1; tảo cô đặc dạng lỏng, sản phẩm của đề tài có mật độ 0,4 tỷ tb.ml-1. Tính toán lượng tảo cô đặc sử dụng, cho vào nước 23‰ đã qua xử lý, sục khí mạnh trong thời gian 5-10 phút, lọc qua vợt có mắc lưới 30 µm, pha thêm với nước 23‰ đã qua xử lý cho bằng thể tích tảo tươi sử dụng ở đối chứng trước khi cho vào bể ương ấu trùng.

Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng (%) của sản phẩm tảo cô đặc I. galbana sau thời gian bảo quản 5 tuần.

Dạng nhão Dạng lỏng Tảo tươi Nhão ĐCLipid 1,49 0,41 0,03 1,72

Protein 2,82 0,60 0,01 3,16

Carbohydrate 1,38 0,20 0,68 1,73

Tro 5,60 3,81 3,41 8,05Độ ẩm 88,71 94,98 95,87 85,34

Thức ăn cho ấu trùng bơi tự do và ấu trùng sống đáy được sử dụng bởi hỗn hợp 2 loài tảo I. galbana, N. oculata. Tỷ lệ cho ấu trùng ăn được duy trì với mật độ 100 ngàn tb.ml-1 hỗn hợp 2 loài tảo kể trên với tỉ lệ 1:1 ở tất cả các nghiệm thức. Tần suất cho ăn được điều chỉnh 3 giờ.lần-

1 vào lúc 6, 9, 12, 15, 18 và 21 giờ trong ngày. Sau 8 đến 10 ngày ấu trùng sẽ chuyển sang giai đoạn sống đáy.

Chăm sócBể được sục khí liên tục, nước trong bể

ương được thay 100%/lần theo định kỳ 2 ngày/lần. Trong quá trình thay nước, ấu trùng đồng thời được lọc và rửa bằng việc sử dụng rây lọc và chuyển lại bể ương sau khi rửa. Quá trình lọc và rửa ấu trùng được tiến hành trong nước, tránh tình trạng ấu trùng bị va đập gây dập vỡ.

Trong suốt quá trình ương, các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ được theo dõi 2 lần.ngày-1 theo định kỳ 2 ngày.lần-1; ammonia và nitric theo định kỳ 5 ngày.lần-1.

2.4. Thu thập và xử lý số liệu

Chất lượng nước bể ương: đo nhiệt độ và pH bằng máy đo đa chỉ tiêu YSI Model 556MPS. Ammonia tổng số (TAN, bao gồm NH3 và NH4

+) và nitric đo bằng test kit Sera (Germany) bằng cách lọc lấy 10-20 ml bằng giấy lọc 0,45 µm.

Đo kích thước ấu trùng: đo vào buổi sáng theo định kỳ 2 ngày.lần-1 bằng cách lấy ngẫu nhiên 30 ấu trùng ở mỗi nghiệm thức, cố định bằng formol 10%, tiến hành đo kích thước về chiều dài ấu trùng (Hình 2) bằng trắc vi thị kính dưới KHV BX51 (Nhật Bản).

Hình 2. Đo kích thước chiều dài ấu trùng chữ D

Chiều dài



Tỷ lệ sống: được tính sau 10 ngày tuổi, lúc ấu trùng nghêu đáp đáy.

Tỷ lệ sống (%) = 100 x (tổng số ấu trùng nghêu đáp đáy/tổng số ấu trùng bố trí).

Xử lý số liệuSử dụng phân tích One-Way ANOVA và

phép thử Duncan (SPSS version 18.0) để phân tích số liệu về tăng trưởng kích thước và tỉ lệ sống. Số liệu về tỷ lệ sống được chuyển sang giá trị arsin trước khi phân tích thống kê.

III. KẾT QUẢ

3.1. Chất lượng nước bể ương

Trong suốt quá trình ương, nhiệt độ trung bình dao động từ 26,8ºC đến 28,2ºC, pH từ 7,5-8,6, ammonia tổng số duy trì <0,5 ppm, nitric <0,5 ppm. Các thông số môi trường nằm trong khoảng tối ưu cho ương ấu trùng nghêu. Nghêu M. lyrata là loài thân mềm nhiệt đới, chúng có thể phát triển trong điều kiện có sự biến động mạnh về các điều kiện môi trường như độ mặn dao động trong khoảng 10-30 ppt, nhiệt độ nước từ 22-31ºC (Thiết và Kumar, 2008).

3.2. Ấu trùng

Tăng trưởng về kích thướcTừ kết quả tăng trưởng của nghêu ở Bảng

2 cho thấy kích thước của nghêu ở nghiệm thức cho ăn tảo “Nhão ĐT” tăng cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với khi dùng “Tảo tươi” sau 10 ngày. Kết quả tăng trưởng kích thước ở các nghiệm thức dao động từ 201,7-209,7 µm. Kết quả này phù hợp với kết quả ương nghêu trong nghiên cứu dùng thức ăn là tảo tươi kết hợp 3 loài tảo I. galbana, N. oculata và Chaetoceros sp. cho kích thước ấu trùng khoảng 180-200 µm của Thiết và Ku-mar (2008).

Tăng trưởng về kích thước của ấu trùng nghêu khi cho ăn bằng tảo “Nhão ĐT” (209,7±2,4µm) tăng cao khác biệt có ý nghĩa so với “Tảo tươi” (201,7±2,1 µm). Tuy nhiên, kích thước của ấu trùng nghêu khi cho ăn “Lỏng ĐT” và “Nhão ĐC” tăng khác biệt không có ý nghĩa với khi dùng tảo tươi sau 10 ngày tuổi.

Bảng 2. Kích thước (µm) của ấu trùng nghêu theo ngày tuổi khi sử dụng các dạng tảo I. galbana khác nhau.

Nghiệm thức Ngày tuổi0 2 4 6 8 10

“Tảo tươi” 59,2±4,8 102,3±2,9b 155,7±2,0ab 161,3±2,9b 181,3±1,8b 201,7±2,1b

“Nhão ĐT” 59,2±4,8 92,2±2,5c 151,7±2,4b 161,0±2,3b 185,7±1,8ab 209,7±2,4a

“Lỏng ĐT” 59,2±4,8 110,3±1,5a 159,3±2,0a 174,3±3,4a 188,7±2,2a 205,3±2,3ab

“Nhão ĐC” 59,2±4,8 90,3±2,5c 153,0±1,9b 172,3±2,4a 187,3±2,1a 203,3±1,7b

Số liệu trong bảng là giá trị TB±SD (n=30). Giá trị có cùng chữ cái viết lên trên trong cùng một cột thể hiện sự sai khác không có ý nghĩa (p>0,05).

Tỷ lệ sốngTừ kết quả đồ thị 1 cho thấy tỷ lệ sống của

ấu trùng nghêu ở nghiệm thức “Lỏng ĐT” cao khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với “Nhão ĐT” và không khác biệt với các nghiệm thức “Tảo

tươi” và “Nhão ĐC” sau 10 ngày ương. Tuy nhiên tỷ lệ sống của ấu trùng nghêu ở nghiệm thức “Nhão ĐT” và “Nhão ĐC” tăng khác biệt không có ý nghĩa so với “Tảo tươi”.



Đồ thị 1. Tỷ lệ sống của ấu trùng nghêu khi sử dụng các dạng tảo I. galbana khác nhau sau 10 ngày tuổi.

sự phát triển của ấu trùng nghêu trong nghiên cứu này.

Kích thước và tỷ lệ sống của ấu trùng nghêu giai đoạn trôi nổi đạt được trong nghiên cứu này không có sự khác biệt khi sử dụng tảo cô đặc loài I. galbana ở cả hai dạng nhão và lỏng đậm đặc so với tảo tươi tương ứng. Kết quả này phù hợp với một số nghiên cứu trước đây của các tác giả McCausland và ctv., (1999) khi thử nghiệm sản phẩm tảo cô đặc hai loài Pavlova lutheri và I. galbana trên ấu trùng hàu đá châu Úc (Saccostrea glomerata) và sản phẩm tảo cô đặc hai loài Chatoceros calcitrans và Skeletonema costatum trên hậu ấu trùng hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas); Robert và ctv., (2001) khi thử nghiệm sản phẩm tảo cô đặc loài T. suecica trên ấu trùng hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas); Knuckey và ctv., (2006) khi thử nghiệm sản phẩm tảo cô đặc loài Thalassiosira pseudonana cũng trên hậu ấu trùng hàu Thái Bình Dương (Crassostrea gigas). Hay kết quả ương ấu trùng khi sử dụng tảo cô

Như vậy, tỷ lệ sống của ấu trùng nghêu khi cho ăn “Nhão ĐT” (22,5±1,4%) hay “Lỏng ĐT” (29,2±2,8%), “Nhão ĐC” (24,5±1,5%) không khác biệt có ý nghĩa so với khi cho ăn bằng “Tảo tươi” (23,6±1,7%). Sản phẩm I. galbana dạng nhão hay lỏng của đề tài phù hợp cho ương ấu trùng nghêu giai đoạn trôi nổi đến bám đáy.

IV. THẢO LUẬN

Sản phẩm tảo cô đặc loài I. galbana sản xuất trong nước, được sử dụng trong nghiên cứu này có mật độ 4 tỷ tb.ml-1 dạng nhão và 0,4 tỷ tb.ml-1 dạng lỏng, có thời gian bảo quản sau 2 tuần lúc bắt đầu thử nghiệm. Chất lượng sản phẩm sau thời gian bảo quản 5 tuần đạt tỷ lệ sống (81±2)%, mùi bình thường, không nhiễm khuẩn hay ở mức độ rất thấp (vài khuẩn lạc), mức độ kết dính tế bào <10%, thành phần dinh dưỡng như đã được trình bày ở bảng 1 (Đặng Tố Vân Cầm và ctv., 2014). Giá trị dinh dưỡng của sản phẩm tảo cô đặc loài I. galbanasản xuất trong nước được khẳng định thông qua



đặc đạt gần bằng so với tảo tươi như Heasman và ctv., (2000) ương ấu trùng tôm ương bằng tảo cô đặc loài P. lutheri và C. calcitrans hoặc S. costatum cho tốc độ phát triển đạt 85-90% so với tảo tươi tương ứng; Đặng Tố Vân Cầm và ctv., (2014) nuôi sinh khối luân trùng bằng tảo cô đặc loài N. oculata, dạng lỏng cho kết quả không khác biệt tảo tươi, dạng nhão cho kết quả đạt 80% so với tảo tươi.

Một số nghiên cứu cho kết quả ương không khác biệt khi sử dụng sản phẩm tảo cô đặc và tảo tươi tương ứng, nhưng chỉ khi khôngthay thế hoàn toàn tảo tươi bằng sản phẩm tảo cô đặc, như nghiên cứu củaBrown và Robert, (2002) ương ấu trùng hàu bằng C. calcitrans, Chaetoceros sp. cho kết quả không khác biệt khi thay thế 80% tảo tươi bằng sản phẩm cô đặc, hoặc kết quả ương tùy thuộc vào thời gian bảo quản của sản phẩm tảo cô đặc như ương ấu trùng hàu Thái Bình Dương Crassostrea gigas bằng sản phẩm tảo cô đặc loài P. lutheri, I. galbana và C. calcitranscho tốc độ phát triển ấu trùng tốt hơn tảo tươi tương ứng khi sản phẩm sau thời gian bảo quản 1-2 tuần, nhưng kết quả ngược lại khi sản phẩm sau thời gian bảo quản 4 tuần (Ponis và ctv., 2003).

Sản phẩm tảo cô đặc I. galbana thử nghiệm trong nghiên cứu này thay thế hoàn toàn tảo tươi, có thời gian bảo quản sau 2 tuần kể tử lúc bắt đầu thử nghiệm, cho kết quả không khác biệt tảo tươi.

V. KẾT LUẬN

1. Kích thước của ấu trùng nghêu sau 10 ngày tuổi khi sử dụng tảo cô đặc I. galbana dạng nhão (209,7±2,4 µm) cao hơn tảo tươi (201,7±2,1 µm), dạng lỏng đậm đặc cho kích thước không khác biệt (205,3±2,3 µm).

2. Tỷ lệ sống của ấu trùng nghêu khi sử dụng tảo cô đặc I. galbana dạng nhão là (22,5±1,4%) và dạng lỏng đậm đặc (29,2±2,8%) không khác biệt so với tảo tươi (23,6±1,7%).

3. Tảo cô đặc I. galbana, sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi, thu sinh khối vi tảo N. Oculata & I. galbana phục vụ sản xuất giống hải sản” thuộc chương trình CNSH Nông nghiệp, Thủy sản của Bộ NN & PTNT, sau thời gian bảo quản 2-4 tuần, thay thế được vi tảo tươi tương ứng trong ương ấu trùng nghêu giai đoạn trôi nổi đếm đáp đáy.

LỜI CẢM ƠN

Nghiên cứu được thực hiện từ kinh phí đề tài “Nghiên cứu công nghệ nuôi, thu sinh khối vi tảo I. galbana, N. oculata phục vụ sản xuất giống hải sản”, thuộc chương trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp, Thủy sản của Bộ NN & PTNT. Tác giả chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2, Trung tâm Quốc gia giống hải sản Nam bộ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu thành công.




Đặng Tố Vân Cầm, 2014. Sử dụng tảo cô đặc

Nannochloropsis oculata làm thức ăn cho luân trùng Brachionus plicatilis. Báo cáo tổng kết đề tài cấp Bộ, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn.

Đặng Tố Vân Cầm, Đặng Thị Nguyên Nhàn, 2014. Sử dụng tảo cô đặc Nannochloropsis oculata làm thức ăn cho luân trùng Brachionus plicatilis. Tạp chíNghề cá sông Cửu Long 4, 62-72.

Thiết, C.C., Kumar, M.S., 2008. Tài liệu về kỹ thuật sản xuất giống ngao Bến Tre (Meretrix lyrata Sower-by, 1851). Phân viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản Bắc Trung Bộ (ARSINC). Viện Nghiên cứu và Phát triển Nam Australia (SARDI).

Trần Thế Mưu, 2010. Hoàn thiện công nghệ sản xuất giống và nuôi thương phẩm tu hài (Lutraria philippinarum). Báo cáo tổng kết dự án cấp Nhà nước, Bộ Khoa học Công nghệ và Môi trường.

Trần Thế Mưu, Vũ Văn Sáng, 2013. Ảnh hưởng của thức ăn đến tỷ lệ thành thục của tu hài mẹ và tỷ lệ sống của ấu trùng (Lutraria philippinarum). Tạp chí Khoa học và Phát triển 1, 24-29.

Tài liệu tiếng Anh

Brown, M., Robert, R., 2002. Preparation and assessment of microalgal concentrates as feeds for larval and juvenile Pacific oyster (Crassostrea gigas). Aquaculture 207, 289-309.

D’Souza, F.M.L., Knuckey, R.M., Hohmann, S., Pendrey, R.C., 2002.Flocculated microalgae concentrates as diets for larvae of the tiger prawn Penaeus monodon Fabricius. Aquacult.Nutr. 8, 113-120.

D’Souza, F.M.L., Lecossois, D., Heasman, M.P., Diemar, J.A., Jackson, C.J., Pendrey, R.C., 2000. Evaluation of centrifuged microalgae concentrates

as diets for Penaeus monodon Fabricius larvae. Aquacult. Res. 31, 661-670.

Heasman, M., Diemar, J., O’Connor, W., Sushames, T., Foulkes, L., 2000. Development of extended shelf-life micro-algae concentrate diets harvested by centrifugation for bivalve mollusks - A summary. Aquacult. Res. 31, 637-659.

Knuckey, R.M., Brown, M.R., Robert R., Frampton D.M.F., 2006. Production of microalgal concentrates by flocculation and their assessment as aquaculture feeds. Aquacult. Eng. 35, 300-313.

McCausland, M.A., Brown, M.R., Barrett, S.M., Diemar, J.A., Heasman, M.P., 1999. Evaluation of live and pasted microalgae as supplementary food for juvenile Pacific oysters (Crassostrea gigas). Aquacult. Res. 174, 323-342.

Ponis, E., Robert, R., Parisi, G., 2003. Nutritional value of fresh and concentrated algal diets for larval and juvenile Pacific oysters (Crassostrea gigas). Aquaculture 221, 491-505.

Robert, R., Parisi, G., Rodolfi, L., Poli, B.M., Tre-dici, M.R., 2001. Use of fresh and preserved Tetraselmis suecica for feeding Crassostrea gigas larvae. Aquaculture 192, 333-346.

Takeyama, H., Iwamoto, K., Hata, S., Takano, H., Matsunaga, T., 1996. DHA enrichment of rotifers: A simple two-step culture using the unicellular algae Chlorella regularis and Isochrysis galbana. J. Mar. Biotechnol. 3, 244-247.

Volkman, J.K., Jeffrey, S.W., Nichols, P.D., Rogers, G.I., Garland, C.D., 1989. Fatty acid and lipid composition of 10 species of microalgae used in mariculture. J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 128, 219-240.

Wikfors, G.H., Patterson, G.W., 1994. Differences in strains of Isochrysis of importance to Mariculture. Aquaculture 123, 127-135.



condensed micRoalgae Isochrysis galbanaas Feed FoR sPaT oF clam Meretrix lyrata

Dang To Van Cam1*, Vo Minh Son2

ABSTRACTCondensed microalgae Isochrysis galbana in paste and concentrated forms were studied as feed for spat of clam Meretrix lyrata during veliger stage, replaced to fresh one. Spat are reared in composite cylinder tanks, volume of 120 litres. Mix of microalgae Isochrysis galbana and Nanno chloropsis oculata is used as feed at equal ratio. Microalgae I. galbana is in different forms such as paste or concentrated-experimental product, comparing with fresh or paste-commercial product as control. Parametters such as size and survival are used to evaluate the effect of feed on larval development. Ten-day-old spat used I. galbana in paste form-experiment as feed had everage size (209,7±2,4µm)higher than those from fresh one (201,7±2,1µm), used concentrated form-experiment and paste form-control as feed had everage size (205,3±2,3µm and 203,3±1,7µm) also higher than those from fresh one, but the differences is not significant (p>0,05). The survival in paste form-experiment (22,5±1,4%), concentrated form-experiment (29,2±2,8%), paste form-control (24,5±1,5%) was not significant different comparing to those from fresh one (23,6±1,7%). In conclusion, condensed mi-croalgae I. galbana-experimental product are able to replaced for fresh one as feed for larviculture of clam during veliger stage.

Keywords: Meretrix lyrata, Isochrysis galbana, concentrated microgalgae, paste microalgae.

Người phản biện: ThS. Nguyễn Đức Minh




1 National Breeding Center for Southern Marine Aquaculture, Research Institute for Aquaculture No.2. * Email: [email protected] 2 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2.



1 Phòng Sinh Học Thực Nghiệm – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2. * Email: [email protected]

KẾT QUẢ PhÂn lẬP Schizochytrium mangRoVe giÀU liPid PhỤc VỤ cho nUôi TRỒng ThỦY sẢn

Võ Minh Sơn1*, Vương Thị Hồng Hạnh1

TÓM TẮTAcid béo không no cao phân tử (PUFA) là nguồn dưỡng chất thiết yếu cho động vật thủy sản, giúp tăng trưởng, tăng tỉ lệ sống và sinh sản, cải thiện hệ số thức ăn. Do những hạn chế cung cấp PUFA từ động vật và thực vật, nhiều nghiên cứu tìm kiếm nguồn nguyên liệu cung cấp PUFA từ vi sinh vật và vi tảo. Trong đó vi tảo biển dị dưỡng (hay nấm biển) là nguồn nguyên liệu cung cấp acid béo không no đầy tiềm năng. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành phân lập và sàng lọc một số loài tảo biển dị dưỡng từ lá cây Đước và cây Mắm ở huyện Cần Giờ và Năm Căn có tích lũy lipid cao và đồng thời khảo sát môi trường dinh dưỡng, điều kiện môi trường nuôi cấy. Kết quả phân lập được loài Schizochytrium mangrove ĐCM có khả năng tích lũy lipid tổng số 26,65%. Tảo S. mangrovei ĐCM phát triển thích hợp ở pH 5-6, nồng độ muối 25-30‰, nồng độ đường 50-60 g.l-1, nguồn nitơ thích hợp bao gồm peptone, cao nấm men và monosodium glutamate.

Từ khoá: PUFA, Schizochytrium, tảo dị dương.

I. MỞ ĐẦU

Acid béo không no cao phân tử (PUFA) đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc màng tế bào, phát triển hệ thần kinh cho trẻ sơ sinh và phòng ngừa một số bệnh về tim mạch (Sijtsma và Swaaf, 2004). Đối với động vật thủy sản, PUFA giúp phát triển tuyến sinh dục, tăng chất lượng trứng và cá bột, tăng tỉ lệ sống và tăng trưởng (Kanazawa và ctv., 1979; Watanabe, 1993; Watanabe và Vassallo-Agius, 2003).

Nguồn cung cấp PUFA như docosahexaenoic acid (DHA) và eicosapentaenoic acid (EPA), chủ yếu từ các loài cá biển như cá trích, cá thu, cá mòi, cá hồi (Gunstone, 1996). Dầu cá được ứng dụng phổ biến trong thực phẩm và dược phẩm, tuy nhiên dầu cá có nhiều khuyết điểm như chất lượng phụ thuộc vào từng loài cá, mùa vụ, vi trí đánh bắt, sự nhiễm tạp của dầu cá do

môi trường ô nhiễm, mùi và vị khó chịu. Ngoài ra dầu cá còn chứa hỗn hợp các loại acid béo, do đó việc tách DHA hay EPA cho giá thành rất cao (Sijtsma và Swaaf, 2004).

Để đáp ứng nhu cầu sử dụng PUFA ngày càng cao, nhiều nghiên cứu tìm những nguồn cung cấp PUFA cao từ vi sinh vật thay thế cho dầu cá và thực vật. Dầu vi sinh vật (microbial oil) hay dầu đơn bào (single-cell oil – SCO) là bao gồm các vi sinh vật như vi khuẩn, vi tảo quang dưỡng và dị dưỡng có khả năng tổng hợp PUFA khi được nuôi cấy trong hệ thống lên men (Sijtsma và Swaaf, 2004). PUFA được tổng hợp từ Vibrio sp. nước mặn và nước ngọt đạt 10,7% (Ando và ctv., 1992; Ringø và ctv., 1992), Bacterium đạt 16% (Akimoto và ctv., 1990); vi nấm Mortierella alpina S-4 đạt 23,6% (Shinmen và ctv., 1992), Saprolegnia parasitica



đạt 3,9% (Kendrick và Ratledge, 1992); từ vi tảo biển quang dưỡng như Isochrysis galbana đạt 6,7% (Alonso và ctv., 1992), Nannochloropsis oculata đạt 12,9% (Chini Zittelli và ctv., 1999); và nhóm vi tảo biển dị dưỡng (Thraustochytrid và labyrinthulid) có khả năng tích lũy HUFA cao như tảo Crypthecodinium cohnii đạt 30% (Kyle và Gladue, 1991), tảo Schizochitryum sp. đạt 35-40% (Yokochi và ctv., 1998) và Thraustochytrium aureum ATCC 34304 đạt khoảng 50% (Bajpai và ctv., 1991). Hiện nay, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm tới nhóm vi sinh vật thuộc nhóm tảo biển hay nấm biển dị dưỡng, bởi chúng có khả năng sinh trưởng nhanh, sinh khối cao, tích lũy acid béo mạch dài đa nối đôi cao (Barclay, 1992).

Thraustochytrid là sinh vật đơn bào nước mặn (marine protist) hay vi sinh vật giống nấm (fungi-like microbe), hay còn gọi là tảo biển dị dưỡng (marine heterotrophic) được xếp vào lớp Labryinthulomycetes, ngành Heterokontophyta, giới Chromista, bao gồm các giống Thraustochytrium, Aplanochytrium, Japonochytrium, Ulkenia, và Schizochytrium. Thraustochytrid thường gặp ở vùng cửa sông, vùng rừng ngập mặn, kiểu dinh dưỡng hoại sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ và trầm tích (Kamlangdee và Fan, 2003). Nhóm Thraustochytrid có khả năng sử dụng đa dạng các nguồn carbon và nitrogen (Goldstein, 1963), tiết ra enzyme ngoại bào cellulase, amylase (Raghu-kumar, 2002) và ngoài ra còn tích lũy carotenoid (Carmona và ctv., 2003).

Sinh khối tảo Schizochytrium sp. khô hay tươi được sử dụng dùng làm thức ăn trực tiếp cho ấu trùng tôm hay làm giàu thông qua luân trùng và Artemia. Tảo Schizochytrium sp. có nhiều ưu điểm thích hợp cho việc ương nuôi ấu trùng tôm như kích thước nhỏ hơn 50μm, chứa

hàm lượng sterol cao cần thiết cho sự phát triển của tôm, tích lũy HUFA (ω-3 và ω-6), protein, carbonhydrate, sắc tố và vitamin. Các yếu tố dinh dưỡng này giúp cho ấu trùng tôm phát triển nhanh, tỉ lệ sống cao, tôm post khỏe mạnh (Barclay, 2006). Tảo Schizochytrium sp. còn được sử dụng làm giàu luân trùng và Artemia giúp cho ấu trùng cá biển phát triển tốt và bổ sung EPA và DHA cho cá bố mẹ giúp tăng cường chất lượng trứng và tinh trùng (Castillo và ctv., 2009; Harel và ctv., 2002).


2.1 Vật liệuMẫu lá Đước (Rhizophora apiculata

Blume, thuộc họ Đước Rhizophoraceae) và lá Mắm (Avicennia sp. Vierrh, thuộc họ Cỏ roi ngựa Verbenaceae) đang trong giai đoạn phân hủy tại các rừng ngập mặn thuộc xã Tam Hiệp, huyện Cần Giờ, thành phố Hồ Chi Minh và huyện Năm Căn, tỉnh Cà Mau.

Môi trường phân lập đã được cải tiến có kí hiệu GPYc (Hồng và ctv., 2008) bao gồm: glucose (20 g/l), cao nấm men (4 g/l), agar (16 g/l) và nước biển có độ mặn 25‰. Môi trường sau khi hấp tiệt trùng, đợi nguội, bổ sung thêm kháng sinh, bao gồm Streptomiceine 50000 IU/ml (0,1%), Peniciline 50000 IU/ml (0,1%) và Ampiciline 50000 IU/ml (0,1%).

Môi trường lỏng sau khi phân lập (Hồng và ctv., 2008), vi tảo được nuôi cấy trên môi trường cơ bản M1 cải tiến, có thành phần glucose (30 g/l), cao nấm men (10 g/l) và nước biển có độ mặn 25‰. Hấp tiệt trùng 121oC, 1 atm, trong 15 phút trước khi sử dụng.

Hóa chất Nile Red/DMSO (Sigma) dùng nhuộm lipid.



2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lâpVi tảo Schizochytrium được phân lập theo

phương pháp của Yokochi và ctv., (1998). Các mẫu lá Đước và lá Mắm được rửa bằng nước biển đã khử trùng, sau đó đặt lá vào đĩa petri vô trùng có chứa nước biển 25‰, dùng tăm bông cạo nhẹ trên mặt lá. Sau đó dịch của lá được ly tâm 2000rpm, 4ºC trong 10 phút. Loại bỏ dịch treo, phần còn lại được pha loãng bậc 10 trong nước biển. Mỗi nồng độ pha loãng trải trên 3 đĩa thạch GPYc. Các đĩa này ủ ở nhiệt độ 28ºC, trong tối, khoảng 3-5 ngày tiến hành quan sát trên kính hiển vi. Các tế bào tảo Schi-zochytrium có dạng hình tròn, có nhiều tế bào trong 1 nang, hay có các bào tử di động. Chọn khuẩn lạc tảo Schizochytrium và cấy chuyền nhiều lần qua đĩa thạch có chứa môi trường GPYc có bổ sung kháng sinh cho đến khi thu được khuẩn lạc thuần.

2.2.2 Định tính lipid bằng phương pháp nhuộm với Nile Red

Bằng phương pháp nhuộm lipid với Nile Red để tìm ra được những chủng vi tảo có chứa hạt lipid nhiều hay ít. Phương pháp tiến hành theo mô tả của AAT Bioquest®, Inc. (2012) được tóm tắt như sau Dung dịch Nile Red/DMSO và đệm PBS có nồng độ 200 –1000 nM, bảo quản ở -20ºC và tránh ánh sáng. Thu sinh khối tảo bằng cách ly tâm 6000 rpm dịch tế bào trong 10 phút ở 4ºC, sao cho mật độ tế bào đạt khoảng 1-5×105 (cfu.ml-1). Sau ly tâm, thu cặn, bổ sung 500 μl dung dịch nhuộm và giữ ở nhiệt độ phòng trong 5-10 phút, tránh ánh sáng. Sau đó loại bỏ dung dịch nhuộm bằng cách ly tâm và rửa lại sinh khối bằng đệm PBS. Sau khi nhuộm, tiến hành quan sát ngay bằng kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng khoảng 552-636 nm. Tại bước sóng này, hạt lipid trong tế bào được nhuộm sẽ bắt màu vàng cam sáng trên nền tế bào màu đen.

2.2.3 Định lượng lipid tổng số Sau khi định tính lipid, tiến hành nuôi cấy

các chủng trong erlen 500 ml có chứa 250 ml môi trường M1 trong 4 ngày ở 28oC và lắc 200 rpm. Sau 4 ngày nuôi cấy, sinh khối được thu bằng cách ly tâm dịch tế bào 6.000 rpm ở 4oC trong 10 phút. Bỏ dịch, cặn được cấp đông qua đêm trong tủ -80ºC. Sau đó, tiến hành đông khô nhằm thu sinh khối khô. Đo lipid tổng bằng phương pháp Folch, tại phòng Phân tích chất lượng thực phẩm và dinh dưỡng thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch – Viện nghiên cứu Nuôi trồng thủy sản II. Sau khi định lượng được sinh khối khô của chủng nào có hàm lượng lipid cao nhất, chọn chủng đó để tiến hành định danh hình thái và làm đối tượng nghiên cứu cho những khảo sát tiếp theo.

2.2.4 Định danh tảo bằng hình thái Quan sát hình thái tế bào tảo theo mô tả của

Raghu-Kumar (1988) để định danh chủng tảo phân lập. Khuẩn lạc tảo thuần được cấy trên môi trường M1 lỏng và và quan sát liên tục hình thái tế bào qua các giai đoạn phát triển bằng kính hiển vi Quang học BX51 (Olympus, Nhật Bản) có độ phóng đại 100x.

2.2.5 Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới sự tăng trưởng

+ Khảo sát môi trường cơ bản và đường cong tăng trưởng

Khảo sát tăng trưởng của tảo trên các môi trường cơ bản nhằm chọn ra môi trường thích hợp cho nhân giống. Các môi trường khảo sát được chuẩn bị theo mô tả của các nghiên cứu trước đó nhưng được cố định nồng độ đường, nitơ và nồng độ muối. Các môi trường bao gồm M1 (Hồng và ctv., 2008), môi trường M2 (Hon-da và ctv., 1998) và M3 (Wu và ctv., 2005) được mô tả trong Bảng 1. Chuẩn bị mỗi môi trường 50 ml trong erlen 100 ml, mỗi môi trường lặp



log. Nuôi cấy lỏng lắc 200 rpm ở 28oC trong 5 ngày. Theo dõi mật độ tế bào hàng ngày bằng cách đếm tế bào với buồng đếm hồng cầu và cân trọng lượng khô tế bào sau khi lọc ở cùng thể tích, sau đó sấy ở 105oC trong 2 giờ.

lại 3 lần. Các môi trường hấp tiệt trùng 121oC, 1atm trong 15 phút trước khi sử dụng. Riêng đối với môi trường M2, các thành phần vitami-ne sẽ được bổ sung sau khi hấp và làm nguội. Giống được hoạt hóa trong môi trường lỏng M1 và được cấy vào các bình với cùng mật độ là 5,3

Bảng 1. Thành phần của các môi trường cơ bản

Thành phần Môi trường M1 Môi trường M2 Môi trường M3

Glucose (g.l-1) 20 20 20

Cao nấm men (g.l-1) 4 4 4

NaCl (g.l-1) 25 25 25

Monosodium glutamate (g.l-1) - 2 -

KH2PO4 (g.l-1) - 0,1 1

(NH4)2SO4 (g.l-1) - 0,2 -

MgSO4. 7H2O (g.l-1) - - 5

CaCl2 (g.l-1) - - 0,2

KCl (g.l-1) - - 1

Vitamine B1 - 0,1 µg/L -

Vitamine B12 - 0,01 µg/L -

Vitamine H - 2 µg/ml -

+ Khảo sát đường cong tăng trưởng

Chủng tảo đuợc hoạt hóa trong môi trường cơ bản 4 ngày, sau đó cấy chuyền vào môi trường cơ bản tối ưu với mật độ ban đầu là 5,3 log. Nuôi lỏng lắc 200 rpm ở 280C trong 14 ngày. Theo dõi sự thay đổi của mật độ tế bào (MĐTB), trọng lượng khô (TLK) và kích thước tế bào (KTTB) mỗi ngày.

+ Khảo sát pH

Sử dụng môi trường cơ bản thích hợp để làm môi trường cho khảo sát pH. Các thành phần môi trường được cố định, chỉ thay đổi nồng độ pH của các nghiệm thức. Các nghiệm thức được chuẩn bị trong các bình erlen 100 ml chứa 50 ml môi trường khảo sát. Khảo sát ở các giá trị pH 5; 6; 7; 8 và 9. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chủng khảo sát được hoạt hóa trên môi trường M1 và được cấy vào mỗi bình với cùng

một mật ban đầu là 5,3 log. Nuôi lỏng lắc 200 rpm trong 5 ngày ở 28oC. Theo dõi mật độ tế bào hàng ngày và cân trọng lượng khô.

+ Khảo sát sảnh hưởng của nồng độ muối, glucose, nguồn nitrogen lên sự tăng trưởng tế bào

Sử dụng môi trường cơ bản thích hợp để làm môi trường cho khảo sát các nồng độ muối 10, 15, 20; 25 và 30‰; nồng độ glucose: 20; 30; 40; 50 và 60 g/l; Khảo sát ở các nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ: cao nấm men 4 (g/l), peptone 4 (g/l), monosodium glutamate 1 (g/l), NaNO3 1 (g/l) và NH4Cl 1 (g/l). Các nghiệm thức được chuẩn bị trong các bình erlen 100 ml chứa 50 ml môi trường khảo sát. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Chủng khảo sát được cấy vào mỗi bình với cùng một mật ban đầu là 5,3 log. Nuôi lỏng lắc 200 rpm trong 5 ngày ở 28oC. Theo dõi mật độ và cân trọng lượng khô.



+ Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tối ưu lên sự phát triển của chủng tảo phân lâp

Môi trường cơ bản thích hợp ở trên được sử dụng làm môi trường khảo sát trong thí nghiệm này. Các thành phần khác của môi trường đều được cố định, chỉ thay đổi các giá trị pH, nồng độ muối, nồng độ đường và nguồn nitơ thích hợp đã được xác định từ các khảo sát ở trên. Thí nghiệm được chuẩn bị trong bình erlen 500 ml chứa 250 ml môi trường với 3 lần lặp lại. Chủng khảo sát được cấy chuyển vào các bình môi trường có mật độ 5,3 log. Tiến hành thí nghiệm trong 5 ngày ở 280C và lắc 200 rpm. Theo dõi mật độ tế bào hàng bằng cách đếm với buồng đếm hồng cầu, cân trọng lượng khô tế bào sau khi lọc ở cùng thể tích, sau đó sấy ở 105oC trong 2 giờ và đo kích thước tế bào. Kết quả được sử dụng để dựng lại đường cong tăng trưởng cho chủng đang khảo sát.

2.2.6 Xử lý số liệu Sử dụng phân tích ANOVA một yếu tố để

phân tích số liệu. Khi bảng ANOVA xác định sự khác biệt có ý nghĩa giữa các nhóm, phép so sánh multiple comparision test (Tukey’s) được sử dụng để so sánh sự khác biệt có ý nghĩa có ý nghĩa thống kê (p<0,05) giữa các nghiệm thức bằng phần mềm SPSS version 13.0 (SPSS Inc., 1989-2004). Trước khi phân tích, số liệu số mũ được chuyển sang dạng log10.

III. KẾT QUẢ

3.1. Phân lập và định danh

40 mẫu lá Mắm và lá Đước được thu nhận từ huyện Cần Giờ (Hồ Chí Minh) và huyện Năm Căn (Cà Mau) được dùng làm nguyên liệu cho phân lập các chủng tảo dị dưỡng. Kết quả được tóm tắt trong Bảng 2.

Bảng 2. Kết quả phân lập các chủng vi tảo từ huyện Cần Giờ (Hồ Chí Minh) và huyện Năm Căn (Cà Mau)

Địa điểm thu mẫuNồng độ

muối (‰)Số mẫu lá Số khuẩn lạc

Huyện Cần Giờ

Mẫu lá Đước 25 10 0

Mẫu lá Mắm (MCG) 25 10 1

Huyện Năm Căn

Mẫu lá Đước (ĐCM) 35 10 1

Mẫu lá Mắm 35 10 0

Hai khuẩn lạc phân lập được kí hiệu bằng chữ viết tắt của tên cây và địa điểm lấy mẫu là MCG (Mắm Cần Giờ) và ĐCM (Đước Cà Mau). Hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào của 2 chủng ĐCM và MCG được thể hiện trong Hình 1.

Hình 1 thể hiện hình ảnh khuẩn lạc của chủng ĐCM (a) và MCG (c) sau 4 ngày nuôi cấy trên môi trường thạch GPYc ở 28 oC. Hình 1 (b) và (d) thể hiện các tế bào của 2 chủng ĐCM (b) và MCG (d) sau 4 ngày nuôi lắc 200 rpm trong môi trường lỏng M1 ở 28 oC.

c

d

Hình 1. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng ĐCM (a, b) và MCG (c, d)

(Kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100X).



Khuẩn lạc ĐCM (a) có đặc điểm tròn, màu trắng đục, nhám, tâm nhăn và lồi, viền bóng và đều. Tế bào ĐCM (b) khi trưởng thành tạo thành nang bào tử, hình tròn có đường kính khoảng từ 3,0 – 14,0 µm, bên trong nang có chứa nhiều bào tử hình cầu nhỏ. Khuẩn lạc của chủng MCG (c) có hình tròn, màu vàng, nhám, viền bóng và đều. Tế bào MCG (d) khi trưởng thành tạo thành nang bào tử, hình tròn, bên trong chứa nhiều nang nhỏ và mỗi nang chứa nhiều bào tử có hình cầu.

3.2. Chọn lọc chủng tích lũy lipid cao nhất

3.2.1. Định tính lipid bằng phương pháp nhuộm với Nile Red

Sau khi nhuộm và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 552 – 632 nm cho thấy tế bào của cả 2 chủng MCG và ĐCM đều bắt màu vàng cam sáng (Hình 2). Điều này chứng tỏ 2 chủng đều tích trữ lipid.

(a) (b)

Hình 2. Tế bào chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang (40X) ở bước sóng 552 - 632 nm sau khi được nhuộm với Nile Red, MCG (a) và ĐCM (b).

3.2.2. Định lượng lipid tổng sốKết quả định luợng lipid được thể hiện ở

Bảng 3. Các chủng trên được nuôi cấy trong môi trường lỏng M1 (chỉ có các thành phần cơ bản) ở 28 oC trong 4 ngày để thu sinh khối. Theo kết quả trong Bảng 3, chủng ĐCM có tỷ lệ phần trăm lipid tổng (26,65%) cao hơn gấp ba lần so với mẫu MCG (8,62%).

Bảng 3. Kết quả định lượng lipid tổng

Tên mẫu

Trạng thái mẫu

Khối lượng mẫu

(g TLK)

Hàm lượng lipid tổng (%)

MCGMẫu đông khô màu vàng nhạt

3,12 8,62

ĐCMMẫu đông khô màu vàng nhạt

3,81 26,65



3.2.3. Định danh bằng hình thái chủng vi tảo được chọn

Chủng ĐCM được hoạt hóa và cấy chuyển sang môi trường M3. Theo dõi liên tục hình thái tế bào. Trong Hình 3a, nang tế bào truởng thành chứa nhiều bào tử. Sau 6 giờ, nang tế bào trưởng thành phóng thích động bào tử (Hình 3b), động bào tử có hai tiêm mao. Mỗi động bào tử phát

triển thành tế bào sinh dưỡng (Hình 3c). Hình d, e, và f, tế bào nhị phân liên tục tạo thành cụm tế bào có 2, 4 và 8 tế bào).

Dựa theo khoá phân loại giống Schizochytrium của Raghu-Kumar (1988) cho thấy chủng ĐCM có đặc tính và hình thái giống tảo Schizochytrium mangrovei Raghu-Kumar.

Hình 3. Sự phát triển hình thái tế bào của chủng ĐCM được quan sát bằng kính hiển vi quang học (độ phóng đại 100X)



3.2.4. Khảo sát các yếu tố môi trường ảnh hưởng tới sự tăng trưởng của tảo

3.2.4.1. Khảo sát môi trường cơ bản và đường cong tăng trưởng

Thí nghiệm này tiến hành khảo sát 3 môi trường cơ bản M1, M2, M3 (thành phần được nêu trong Bảng 1), chủng Schizochytrium mangrovei ĐCM được hoạt hóa, sau đó cấy chuyển vào môi trường với mật độ ban đầu là 5,3 (log). Kết quả thí nghiệm cho thấy, mật độ tế bào (MĐTB) và trọng lượng khô (TLK) của

chủng S. mangrovei ĐCM khi nuôi trên môi trường M1 (MĐTB: 7,46 ± 0,04 log; TLK: 8,39 ± 0,42 mg/ml) và môi trường M3 (MĐTB: 7,53 ± 0,05 log; TLK: 11,89 ± 0,23 mg/ml) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với môi trường M2 (mật độ: 7,05 ± 0,11 log; TLK: 1,47 ± 0,11 mg/ml). Trong đó, TLK của tảo được nuôi trong môi trường M3 cao nhất và khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với môi trường M1 và M2. Kết quả thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 4.

Bảng 4. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên 3 môi trường trong 5 ngày

Môi trườngMật độ tế bào (log cfu/ml)

Trọng lượng khô (mg/ml)

M1 7,46 ± 0,04a 8,39 ± 0,42B

M2 7,05 ± 0,11b 1,47 ± 0,11C

M3 7,53 ± 0,05a 11,89 ± 0,23A

Sự thay đổi mật độ, trọng lượng khô và kích thước tế bào khi nuôi trên môi trường M3 cho thấy (Hình 4) MĐTB ban đầu (5,30 ± 0,06 log) tăng rất nhanh từ ngày đầu tiên (7,74 ± 0,03 log) và ổn định cho đến ngày thứ 10 (7,78 ± 0,03 log). Từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 14 (7,54 ± 0,05 log) MĐTB bắt đầu giảm nhẹ. Trong khi đó, TLK của tế bào tương ứng với mật độ ban đầu chỉ đạt 0,02 ± 0,01 (mg/ml) đã bắt đầu tăng mạnh đến ngày thứ 3 (9,68 ± 0,02 mg/ml) và duy trì ổn định đến ngày thứ 10 (9,41 ± 0,34 mg/ml). Từ ngày thứ 10 thì giảm dần đến ngày thứ 14 (8,48 ± 0,35 mg/ml). KTTB từ môi trường hoạt hóa ban đầu có kích thước lớn 14,1 (µm). Sau 1 ngày giảm mạnh còn 6,3µm do quá trình phóng thích bào tử hàng loạt, các bào tử được giải phóng ban đầu có kích thước nhỏ sau đó phát triển kích

thước tăng dần đến ngày thứ 10 (12,29 µm). Từ ngày 10 đến ngày 14 (10,87 µm) KTTB giảm dần. Điều này có thể lý giải là do tế bào trưởng thành phóng thích bào tử nên kích thước trung bình giảm dần.

Hình 4. Diễn biến sự thay đổi của mật độ tế bào, trọng lượng khô và kích thước tế bào của

chủng S. mangrovei ĐCM sau khi nuôi 14 ngày trên môi trường M3.



3.2.4.2. Ảnh hưởng các yếu tố môi trường lên tăng trưởng

+ Khảo sát ảnh hưởng của pH

Chủng S. mangrovei ĐCM có khả năng phát triển trên môi trường pH từ 5 – 9. MĐTB ở các pH 5 (7,19 ± 0,02 log), pH 6 (7,21 ± 0,01

log) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với các môi trường có pH 7, 8, 9. Đối với chỉ tiêu TLK, ở pH 6 (3,24 ± 0,10 log) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với các môi trường có pH còn lại. Tóm lại, tảo S. mangrovei ĐCM phát triển tốt nhất ở pH 6 (Hình 5).

Hình 5. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên các môi trường có pH khác nhau sau 5 ngày.

+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối

Chủng S. mangrovei ĐCM có khả phát triển ở các nồng độ muối từ 10‰ đến 30‰. MĐTB ở các nồng độ muối khác nhau khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05). Tuy nhiên,

TLK của tảo S. mangrovei ĐCM khi nuôi ở các nồng độ muối 25‰ (11,23 ± 1,25 mg/ml) và 30‰ (11,83 ± 0,15 mg/ml) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với các nồng độ muối khác (Hình 6).

Hình 6. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên các môi trường có nồng độ muối khác nhau sau 5 ngày.



+ Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose

Chủng S. mangrovei ĐCM đều có khả năng phát triển tốt ở các nồng độ đường từ 20 - 60 g/l (Hình 7). MĐTB ở nồng độ đường 60 g/l (7,54 ± 0,11 log) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với nồng độ 30 g/l (7,31 ± 0,10 log). MĐTB ở các nồng độ 20 g/l (7,46 ± 0,35 log), 30 g/l (7,31 ± 0,10 log), 40 g/l (7,43 ±

0,09 log) và 50 g/l (7,39 ± 0,08 log) khác biệt không có ý nghĩa (p > 0,05). TLK ở nồng độ glucose 60 g/l (22,57 ± 0,31 mg/ml) cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với những nồng độ còn lại. TLK ở nồng độ glucose 50 g/l và 60 g/l khác biệt khng có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Do vậy, trong thí nghiệm khảo sát môi trường TU của đề tài, sử dụng nồng độ glucose 50 g/l.

Hình 7. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo S. mangrovei ĐCM được nuôi trên các môi trường có nồng độ glucose khác nhau sau 5 ngày.

Theo báo cáo của Wu và ctv., (2005) cho thấy, nồng độ glucose thích hợp nhất cho sự phát triển của chủng Schizochytrium sp. S31 là trong khoảng 20 – 40 g/l. Còn trong báo cáo của Hồng và ctv., (2007) cho thấy, đối với chủng Schizochytrium PQ6 và PQ7, nồng độ glucose thích hợp trong khoảng 60 – 90 g/l. Trong nghiên cứu này cho thấy nồng độ 50g/l được cho là thích hợp cho tăng sinh khối và mật độ tế bào tảo S. mangrovei ĐCM.

+ Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn nitơ

Chủng S. mangrovei ĐCM có khả năng phát triển được trong môi trường chứa các nguồn

nitơ khác nhau. Xét về TLK, giữa các nguồn nitơ không có sự khác biệt về mặt thống kê (p > 0,05). Xét về MĐTB có sự khác biệt rõ rệt. Cao nấm men (7,46 ± 0,04 log) và peptone (7,63 ± 0,10 log) có MĐTB cao khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với các môi trường chứa các nguồn nitơ khác. Môi trường chứa NH4Cl (6,31 ± 0,03 log) có MĐTB thấp nhất khác biệt có ý nghĩa (p < 0,05) so với các nguồn nitơ còn lại. Vậy tảo S. mangrovei ĐCM có khả năng sử dụng các nguồn nitrogen theo thứ tự: peptone, cao nấm men (yeast extract), monosodium glutamate, NaNO3, NH4Cl.



Hình 8. Mật độ tế bào và trọng lượng khô của tảo Schizochytrium ĐCM được nuôi trên các môi trường có nguồn nitơ khác nhau sau 5 ngày.

+ Đánh giá ảnh hưởng của môi trường tối ưu

Dựa trên môi trường cơ bản M3 và đồng thời thay đổi các giá trị pH, nồng độ muối và đường, nguồn nitơ thông qua các kết quả khảo sát trên

chọn ra nồng độ tối ưu như sau: Môi trường tối ưu (MTTU) bao gồm: glucose (50g/l), cao nấm men (4g/l), monosodium glutamate (1g/l), NaCl (25g/l), CaCl2 (0,2g/l), KCl (1g/l), KH2PO4 (1g/l), MgSO4.7H2O (5g/l) và pH 6.

Hình 9. Mật độ tế bào, trọng lượng khô và kích thước tế bào của chủng S. mangrovei ĐCM sau khi nuôi 14 ngày trên môi trường MTTU.

Theo dõi sự phát triển hàng ngày của chủng Schizochytrium ĐCM trong các môi trường chứa các nguồn nitơ khác nhau cho thấy, tế bào trong các môi trường chứa cao nấm men, peptone và monosodium glutamate đều phát triển tốt về mật độ, trọng lượng khô và kích thước tế bào.

Trong khi đó, ở môi trường chứa NH4Cl, tế bào phát triển không bình thường, kích thước tế bào nhỏ và trọng lượng khô thấp. Ở môi trường có chứa NaNO3 quan sát thấy, kích thước của tế bào lớn và trọng lượng tế bào cao nhưng ngược lại mật độ tế bào thấp.



Kết quả khảo sát trên MTTU cho thấy MĐTB ban đầu là 5,30 ± 0,06 log sau 1 ngày đã đạt trạng thái cân bằng 7,65 ± 0,06 log. Duy trì trạng thái cân bằng từ ngày thứ nhất (7,65 ± 0,06 log) đến ngày thứ 14 (7,55 ± 0,01 log). Trong khi đó, TLK ở ngày 0 (0,02 ± 0,01 mg/ml) vẫn tăng mạnh đến ngày thứ 6 (19,03 ± 0,42 mg/ml) sau đó duy trì cân bằng tới ngày thứ 10 (18,62 ± 0,39 mg/ml). Từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 14 (17 ± 0,78 mg/ml) bắt đầu giảm nhẹ. KTTB ở ngày 0 là 14,1 µm, sau 1 ngày giảm mạnh còn 5,1 µm. Từ ngày 1 (5,1 µm) cho đến ngày thứ 4 (12,5 µm) tăng mạnh, sau đó tăng chậm đến ngày thứ 14 (14,31 µm).

Kết quả trên cho thấy trên MTTU, chủng S. mangrovei ĐCM đã đạt mật độ cực đại và kích thước tế bào tương đương khi nuôi trên môi trường cơ bản M3. Tuy nhiên trọng lượng khô tăng gấp hơn 2 lần (M3: 9,68mg/ml, MTTU: 19,15 mg/ml).

IV. THẢO LUẬN

Leaño và ctv., (2003) phân lập được chủng Schizochytrium mangrovei (IAo-1 and IXm-6), và Schizochytrium sp. BSn-1 có hàm lượng lipid tổng số 16%-39%. Wu và ctv., (2005) khảo sát khả năng tích luỹ lipid tổng số của chủng Schizochytrium sp. S31 (ATCC 20888) đạt 40% trọng lượng khô. Ở Việt Nam, chủng tảo Schizochytrium PQ6 và PQ7 được phân lập từ lá Đước ở vùng biển Phú Quốc có khả năng tích luỹ lipid tổng số đạt 38%-41% trọng lượng khô (Hồng và ctv., 2008). Trong nghiên cứu này chúng tôi phân lập được chủng tảo ĐCM có khả năng tích luỹ lipid tổng số đạt 26,7% trọng lượng khô khi nuôi trên môi trường cơ bản. Do đó chủng ĐCM có tiềm năng tích lũy lipid cao

khi nuôi môi trường tối ưu.

Theo nghiên cứu của Barclay (2006) đã chỉ ra rằng, chi Schizochytrium phát triển tốt trong môi trường có pH từ 6,0 – 8,5 nhưng tùy theo từng loài sẽ có khoảng pH tối ưu riêng cho sự phát triển tế bào và tích lũy lipid của loài đó. Theo kết quả thí nghiệm có thể thấy, đối với chủng S. mangrovei ĐCM, có khả năng phát triển tốt trên môi trường có tính acid (pH = 5 và pH = 6).

Theo báo cáo của Barclay (2006) đã chỉ ra rằng chi Schizochytrium có khả năng sống trong môi trường có nồng độ muối dưới 75‰ nhưng tốt hơn nếu nồng độ muối nhỏ hơn 50‰ và tốt nhất là ở 25‰. Schizochytrium N-2 được phân lập từ những lá già của cây Đước (Kandelia candel) tại Hong Kong, có khả năng phát triển trên môi trường có độ mặn từ 0 – 30 ‰ và độ mặn tối ưu cho sự phát triển dao động từ 20 – 30 ‰ (Kamlangdee và Fan, 2003). Theo Leaño và ctv., (2003) thử nghiệm điều kiện nuôi cấy các chủng Schizochytrium mangrovei (IAo-1 và IXm-6) và chủng Schizochytrium sp. BSn-1, cho thấy chúng phát triển tốt ở độ mặn 15 – 30‰ và nhiệt độ 20 -30 oC, đạt sinh khối khô 7 mg/ml và hàm lượng lipid tổng số 16 – 39%. Kết quả thí nghiệm cho thấy, chủng Schizochytrium ĐCM cũng phát triển tốt nhất ở nồng độ muối từ 25 - 30‰. Điều này phù hợp với những nghiên cứu trước đây.

Theo báo cáo của Wu và ctv., (2005) cho thấy, nồng độ glucose thích hợp nhất cho sự phát triển của chủng Schizochytrium sp. S31 là trong khoảng 20 – 40 g/l. Còn trong báo cáo của Hồng và ctv., (2007) cho thấy, đối với chủng Schizochytrium PQ6 và PQ7, nồng độ glucose



thích hợp trong khoảng 60 – 90 g/l. Trong nghiên cứu này cho thấy nồng độ 50g/l được cho là thích hợp cho tăng sinh khối và mật độ tế bào tảo S. mangrovei ĐCM.

Theo mô tả của Wu (2005) khảo sát các nguồn nitơ khác nhau cho thấy cao nấm men (0,4%) thích hợp cho tảo Schizochytrium sp. phát triển tăng sinh khối, tích lũy lipid và DHA. Còn đối với các nguồn nitơ khác như monosodium glutamate, NH4Cl và NaNO3 thì monosodium glutamate 0,1% cho kết quả cao nhất cho quá trình tích lũy lipid và phát triển tế bào.

V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHI

5.1. Kết luận

Kết quả phân lập được chủng tảo dị dưỡng Schizochytrium mangrovei ĐCM có khả năng tích lũy lipid tổng số 26,65%. Tảo S. mangrovei ĐCM phát triển thích hợp ở pH 5-6, nồng độ muối 25-30‰, nồng độ đường 50-60 g/l, nguồn nitơ thích hợp bao gồm peptone, cao nấm men và monosodium glutamate.

5.2. Đề nghị

Cần nghiên cứu thêm các điều kiện nuôi cấy nhằm nâng cao hàm lượng lipid và HUFA.

Thử nghiệm ứng dụng tảo S.mangrovei ĐCM làm giàu luân trùng và Artemia nhằm nâng cao tỉ lệ sống một số ấu trùng cá biển.

Thử nghiệm dùng tảo S.mangrovei ĐCM làm thức ăn cho zoea tôm thẻ, ương nuôi động vật hai mảnh vỏ.

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn các Anh Chị ở phòng Nguồn Lợi và Khai thác thủy sản nội địa (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II) đã giúp thu mẫu. Tôi chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo phòng Sinh học Thực nghiệm và Viện Nghiên Cứu NTTS II đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất cho tôi thực hiện nghiên cứu này. Xin cảm ơn các bạn sinh viên trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ đã cùng tôi nghiên cứu đề tài này.

TÀI LIỆU THAM KHẢOAkimoto, M., Ishii, T., Yamagaki, K., Ohtaguchi, K.,

Koide, K., and Yazawa, K., 1990. Production of eicosapentaenoic acid by a bacterium isolated from mackerel intestines. Journal of the American Oil Chemists’ Society 67, 911-915.

Alonso, D. L., Grima, E. M., Pérez, J. A. S., Sánchez, J. L. G., and Camacho, F. G., 1992. Isolation of clones of Isochrysis galbana rich in eicosapentaenoic acid. Aquaculture 102, 363-371.

Ando, S., Nakajima, K., and Hatano, M., 1992. Incorporation of n-3 polyunsaturated fatty acids into phospholipids of a marine bacterium Vibrio sp. cultivated with sardine oil. Journal of Fermentation and Bioengineering 73, 169-171.

Bajpai, P., Bajpai, P., and Ward, O., 1991. Production of docosahexaenoic acid by Thraustochytrium aureum. Applied Microbiology and Biotechnology 35, 706-710.

Barclay, W. R., 1992. Process for the heterotrophic production of microbial products with high concentrations of omega-3 highly unsaturated fatty acids. U.S. Patent 5, 130, 242.

Barclay, W. R., 2006. Schizochytrium and Thraustochytrium strains for producing high concentrations of omega-3 unsaturated fatty acids, Martek Biosciences Corporation, United States Patent 7,022,512 B2.

Carmona, M. L., Naganuma, T., and Yamaoka, Y., 2003. Identification by HPLC-MS of carotenoids of the Thraustochytrium CHN-1 strain isolated from the Seto Inland Sea. Biosci Biotechnol Biochem 67, 884-8.

Chini Zittelli, G., Lavista, F., Bastianini, A., Rodolfi, L., Vincenzini, M., and Tredici, M. R., 1999. Production of eicosapentaenoic acid by Nannochloropsis sp. cultures in outdoor tubular



photobioreactors. Journal of Biotechnology 70, 299-312.

Goldstein, S., 1963. Development and nutrition of new species of Thraustochytrium. American Journal of Botany 50, 271-279.

Gunstone, F. D., 1996. Fatty acid and lipid chemistry. Blackie Academic, London.

Honda, D., Yokochi, T., Nakahara, T., Erata, M., and Higashihara, T., 1998. Schizochytrium limacinum sp. nov., a new thraustochytrid from a mangrove area in the west Pacific Ocean. Mycological Research 102, 439-448.

Hồng, Đ. D., Anh, H. L., and Thu, N. T. H., 2008. Phân lập được vi tảo biển dị dưỡng Schizochytrium giàu DHA ở vùng biển huyện đảo Phú Quốc. Tạp chí sinh học 30, 50-55.

Hồng, Đ. D., Hiền, H. M., Hưng, N. Đ., Nam, H. S., Anh, H. L., Thu, N. H., and Chi, Đ. K., 2007. Nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp DHA từ các loài vi tảo biển dị dưỡng mới Labyrinthula, Schizochytrium và ứng dụng. Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ 45, 144-154.

Kamlangdee, N., and Fan, K. W., 2003. Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp. isolated from mangrove. Songklanakarin J. Sci. Technol. 25, 643-650.

Kanazawa, A., Teshima, S., and Endo, M., 1979. Requirements of prawn Penaeus japonicus for essential fatty acids. Memories of the Faculty of Fisheries of Kagoshima University 28, 27-33.

Kendrick, A., and Ratledge, C., 1992. Lipids of selected molds grown for production of n-3 and n-6 polyunsaturated fatty acids. Lipids 27, 15-20.

Kyle, D. J., and Gladue, R. M., 1991. Eicosapentaenoic acids and methods for their production. International Patent Application, Patent Cooperation Treaty Publication WO 91/14427, October 3, 1991.

Leaño, E. M., Gapasin, R. S. J., Polohan, B., and Vrijmoed, L. L. P., 2003. Growth and fatty acid production of thraustochytrids from Panay

mangroves, Philippines. Fungal Diversity 12, 111-122.

Product Technical Information Sheet, 2012. Nile Red *UltraPure Grade*, AAT Bioquest®, Inc., US.

Raghu-Kumar, S., 1988. Schizochytrium mangrovei sp. now., a Thraustochytrid from mangroves in India. Trails. Br. My col. Soc. 90, 627-631.

Raghu-kumar, S., 2002. Ecology of the marine protists, the Labyrinthulomycetes (Thraustochytrids and Labyrinthulids). European Journal of Protistology 38, 127-145.

Ringø, E., Jøstensen, J., and Olsen, R., 1992. Production of eicosapentaenoic acid by freshwater Vibrio. Lipids 27, 564-566.

Shinmen, Y., Kawashima, H., Shimizu, S., and Yamada, H., 1992. Concentration of eicosapentaenoic acid and docosahexaenoic acid in an arachidonic acid-producing fungus, Mortierella alpina 1S-4, grown with fish oil. Applied Microbiology and Biotechnology 38, 301-304.

Sijtsma, L., and Swaaf, M. E., 2004. Biotechnological production and applications of the ω-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid. Applied Microbiology and Biotechnology 64, 146-153.

Watanabe, T., 1993. Importance of docosahexaenoic acid in marine larval fish. Journal of the World Aquaculture Society 24, 152-161.

Watanabe, T., and Vassallo-Agius, R., 2003. Broodstock nutrition research on marine finfish in Japan. Aquaculture 227, 35-61.

Wu, S.-T., Yu, S.-T., and Lin, L.-P. (2005). Effect of culture conditions on docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp. S31. Process Biochemistry 40, 3103-3108.

Yokochi, T., Honda, D., Higashihara, T., and Nakahara, T., 1998. Optimization of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium limacinum SR21. Applied Microbiology and Biotechnology 49, 72-76.



ResUlTs oF isolaTion oF Schizochytrium mangRoVe WiTh high liPid FoR aQUacUlTURe

Vo Minh Son1*, Vuong Thi Hong Hanh1

ABSTRACTPUFA is essential nutrient for aquatic animal, promoting growth, increasing survival rate and repro-ductivity, improving FCR. Because PUFA/HUFA supplying source is limitated from animals and plants, many scientist are looking for PUFA/HUFA supplying from micro-bacteria and microalgae in which heterotrophic microalgae (or marine fungi) have ability to stimulate high unsaturated fatty acid. This research, heterotrophic microalgae were isolated from leaf of mangrove in Can Gio and Nam Can province and evaluation of culture condition. The result showned that Schizochitryum mangrove ĐCM had ability to stimulate 26,65% total lipid. S. mangrove ĐCM was culture in the medium with pH 5-6, salinity 25-30%0, 50-60 g/l glucose, and nitrogen source is from peptone, yeast extract, and monosodium glutamate.

Keywords: HUFA, Schizochytrium, heterotrophic microalgae.

Người phản biện: TS. Đặng Tố Vân Cầm




1 Department of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2. * Email: [email protected]



Đánh giá chẤT lưỢng nưỚc TRong hỆ ThỐng TUẦn hoÀn nUôi cá TRa (Pangasianodon hypophthalmus) Thương PhẨm

QUY mô PiloT ngoÀi TRỜiNguyễn Hồng Quân1*, Nguyễn Nhứt1, Nguyễn Văn Huỳnh1, Lê Ngọc Hạnh1, Nguyễn Văn Hảo2

TÓM TẮTMục tiêu của nghiên cứu nhằm xác định và đánh giá sự biến động chất lượng nước trong hệ thống tuần hoàn nuôi cá tra thâm canh ngoài trời. Hệ thống nuôi tuần hoàn ngoài trời quy mô pilot được thiết kế bao gồm 01 hệ thống lọc sinh học, 01 hệ thống lọc chất thải rắn và ao nuôi cá. Tất cả được lắp đặt trong cùng một ao nuôi sử dụng hệ thống khí cho cung cấp khí hòa tan và bơm nước trong thí nghiệm. Mật độ thả cá 133 con/m2 với trọng lượng cá giống trung bình 16,1 g/con. Trong suốt quá trình nuôi sử dụng loại thức ăn viên có hàm lượng protein từ 28-30%. Sau 260 ngày nuôi, cá thu hoạch đạt trọng lượng trung bình 810 g/con, đạt chất lượng xuất khẩu, tỷ lệ sống 81% và hệ số chuyển đổi thức ăn 1,6. Chất lượng nước ao nuôi trong suốt chu kỳ nuôi ổn định và thích hợp cho cá tra phát triển. Hiệu quả sử dụng nước (600 l/kg cá) thấp hơn 7-9 lần so với ao nuôi truyền thống. Khả năng phát thải nitrogen và phosphorus thấp hơn ao nuôi bằng công nghệ truyền thống 7-10 lần. Sự thành công của mô hình sẽ mở ra cho nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL một công nghệ nuôi mới hạn chế thay nước và giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

Từ khóa: cá tra, môi trường, nước, tuần hoàn, airlift.

1 Phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected] 2 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.


Cá tra là ngành hàng xuất khẩu chủ lực chiếm hơn 25% tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam. Sản lượng cá tra của Việt Nam năm 2015 được dự báo vẫn giữ ở mức 1,1 đến 1,2 triệu tấn theo số liệu của Tổng cục thủy sản. Bộ Nông nghiệp dự đoán giá trị cá tra xuất khẩu năm 2015 sẽ đạt 1,75 đến 1,85 tỉ USD. Theo báo cáo của VASEP, trong 11 tháng đầu năm 2014, cá tra xuất khẩu đạt giá trị 1,6 tỉ USD ( FAO, 2015). Cá tra là loài cá da trơn rất dễ nuôi với mật độ cao trong điều kiện chất lượng nước không quá nghiêm ngặt như các loài nuôi thủy sản khác. Tổng diện tích nuôi 5.400 ha, năng suất nuôi thông thường có thể đạt từ 70-500

tấn/ha với nhiều mô hình nuôi khác nhau (Phan Thanh Lam và ctv., 2009).

Với ao nuôi cá tra truyền thống, người nuôi tận dụng tối đa quỹ đất, sử dụng lượng thức ăn quá lớn, dẫn đến một lượng chất thải và bùn đáy từ nguồn thức ăn dư thừa, phân và các chất bài tiết của cá được xả vào môi trường, làm cho môi trường nuôi bị ô nhiễm. Việc thải bỏ chất thải không được quản lý và kiểm soát chặt chẽ, trong điều kiện cơ sở hạ tầng của vùng nuôi không được quy hoạch và đảm bảo thì chất thải từ vùng nuôi sẽ gây ô nhiễm thủy vực xung quanh và cơ hội lây lan bệnh tật. Theo Nguyễn Nhứt và ctv., (2013) hiệu suất sử dụng nước trong ao nuôi cá tra thương phẩm là 7.400 l/kg. Lượng bùn sinh



ra 19,7 l/ kg cá thương phẩm. Ước tính ao nuôi có diện tích 1 ha với năng suất nuôi 422 tấn/vụ, thải ra môi trường nước COD (99,06 tấn/ha/vụ và bùn 8.333 m3/ha/vụ), nitrogen (12,87 tấn/ha/vụ từ nước và bùn thải) và phosphorus (3,1 tấn/ha/vụ từ nước và bùn thải).

Để giải quyết vấn đề bảo vệ môi trường, hạn chế tác động từ bên ngoài, biện pháp duy nhất là làm sao để chất thải từ các vùng nuôi thâm canh đều phải được xử lý. Làm sao tạo ra những mô hình nuôi bền vững và thân thiện với môi trường, đảm bảo có những sản phẩm

sạch, chất lượng cao nhưng không gây ô nhiễm môi trường. Mô hình nuôi tuần hoàn RAS được xem là công nghệ tiên tiến nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước, tăng hiệu suất sử dụng nguồn nước cho hệ thống nuôi. Năm 2013, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 đã thực hiện đề tài khoa học nuôi cá tra thương phẩm bằng hệ thống tuần hoàn nuôi quy mô pilot ngoài trời. Nghiên cứu này nhằm đánh giá chất lượng nước trong hệ thống tuần hoàn nuôi cá tra thương phẩm.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Mô tả hệ thống nuôi và nguyên lý hoạt động

Hình 1. Cấu tạo của hệ thống nuôi RAS cho cá tra nuôi thương phẩm

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung Tâm Giống Quốc Gia Thủy Sản Nước Ngọt Nam Bộ, Cái Bè – Tiền Giang

Hệ thống tuần hoàn bao gồm một ao nuôi xi măng hình vuông diện tích 196 m2, độ sâu 1,96 m, bao gồm một bể lắng xử lý chất thải rắn diện tích 70 m2 và hệ thống lọc sinh học sử dụng giá thể bám vi sinh diện tích đặc hiệu 800 m2/m3,

thể tích lồng sinh học 25 m3, vật thể bám vi sinh chiếm 60% thể tích lồng sinh học (14m3) được lắp đặt giữa ao và hai góc ao (Hình 1). Hệ thống cung cấp khí, hệ thống airlift tạo dòng nước li tâm gom bùn, hệ thống airlift bơm phân thải vào bể lắng.

Nguyên lý hoạt động: nước ao nuôi chứa chất thải lỏng và chất thải rắn, chất thải lỏng



được hệ thống lọc sinh học khử ammonia và nitrite qua quá trình nitrate hóa. Quá trình nitrate hóa làm giảm pH và độ kiềm. Chất thải rắn được hệ thống airlift cung cấp oxy cho ao tạo dòng chảy li tâm gom vào hố thu phân giữa ao. Chất thải rắn được hệ thống airlift bơm sang bể lắng, tại bể lắng phân lắng và tích tụ dưới nền đáy sau đó thực hiện quá trình khử nitrate sử dụng nguồn carbon hữu cơ từ phân cá. Quá trình khử nitrate tăng pH và độ kiềm. Nước từ bể lắng được làm sạch chất thải rắn, tăng pH và độ kiềm chảy trở về ao nuôi.

2.2. Phương pháp nuôiCá giống được vận chuyển về và thuần

dưỡng để xử lý bệnh ký sinh trùng trước khi thả. Cá giống thả có trọng lượng trung bình 16,1g/con và tổng số lượng 26.000 con. Mật độ thả nuôi 71 con/m3. Sử dụng thức ăn thương mại của công ty Dehues với hàm lượng protein 28-30%. Lượng cho ăn theo nhu cầu của cá, sử dụng phương pháp cho ăn bằng tay 4-6 lần/ngày.

2.3. Phương pháp vận hành Giai đoạn 1 tính từ ngày nuôi 1 đến ngày

nuôi 90. Sử dụng 1 máy thổi khí 8 m3/phút, 7 m3 hạt lọc sinh học, không thay nước.

Giai đoạn 2 tính từ ngày nuôi 91 đến ngày nuôi 180. Sử dụng 2 máy thổi khí 8 m3/phút, 14

m3 hạt lọc sinh học, tăng vận tốc bơm lắng bùn, dựa theo chất lượng môi trường nước tiến hành thay nước từ 30-50% và tiến hành hút bùn trong hệ thống lắng.

Giai đoạn 3 tính từ ngày nuôi 181 đến ngày nuôi 260. Sử dụng thêm 1 máy kết hợp sục khí và tạo dòng nước chảy công suất 3 kw/giờ, tiến hành thay nước hàng ngày.

2.4. Phương pháp đo và phân tích chỉ tiêu môi trường

Hàng ngày đo trực tiếp tại ao các thông số oxy hòa tan, pH, độ trong, nhiệt độ 2 lần/ngày 6 và 14 giờ bằng máy cầm tay đa chỉ tiêu HANNA -Hi 9384. Các chỉ tiêu ammonia tổng, nitrite, nitrate, kiềm tổng, H2S, độ trong, TSS, chlorophyll-a, carbonic, COD và BOD5 được đo định kỳ 7 ngày/lần theo phương pháp chuẩn của APHA (2005).

2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm Excel sắp xếp mô tả biểu đồ, tính toán giá trị các chỉ tiêu môi trường, các số liệu liên quan đến số lượng và chất lượng bùn, tính toán giá trị trung bình số liệu về tăng trưởng cá, tổng thức ăn, tổng khối lượng cá và nước.

III. KẾT QUẢ 3.1. Chất lượng nước hàng ngày3.1.1. Biến động pH và nhiệt độ nước

Hình 2. Biến động pH (bên trái) và biến động nhiệt độ (bên phải) trong ao nuôi tuần hoàn.



Tại Hình 2 cho thấy trong giai đoạn 1 pH nước ao nuôi giảm dần và có sự biến động sáng-chiều. Giai đoạn 2 và 3 pH hầu như không có sự biến động và được duy trì = 7 cho tới hết chu kỳ nuôi. Quan trắc nhiệt độ nước cho thấy nhiệt độ dao động 28-33oC thích hợp cho cá tra sinh trưởng và phát triển.

3.1.2. Biến động oxy hoà tan và độ trongKết quả thể hiện ở Hình 3, oxy hòa tan duy

trì trong khoảng dao động từ 1,8 - 8,2 mg/l trong suốt thời gian nuôi. Độ trong nước ao nuôi có xu thế giảm dần và biến động lớn ở đầu vụ nuôi. Độ trong trung bình nước ao nuôi giai đoạn 1 là 74 cm, ở giai đoạn 2 là 54 cm và giai đoạn 3 là 35 cm.

Hình 3. Biến động oxy hòa tan (bên trái), biến động độ trong (bên phải) trong ao nuôi tuần hoàn3.2. Chất lượng nước hàng tuần3.2.1. Biến động độ kiềm và tổng ammonia

Hình 4. Biến động độ kiềm (bên trái) và tổng ammonia (bên phải) trong ao nuôi tuần hoàn

Kết quả biểu diễn ở Hình 4 độ kiềm nước ao nuôi có biến động và biên độ dao động lớn. Độ kiềm trong nước ao nuôi của hệ thống RAS kết hợp với bể khử nitrate duy trì độ kiềm 43 -140 mg CaCO3/l (trung bình 85,6 mg CaCO3/l). Giá trị độ kiềm lớn nhất 140 mg/l

ngày nuôi 125, giá trị độ kiềm nhỏ nhất 43 mg/l ngày nuôi 151. Hàm lượng tổng ammonia trong tăng dần trong giai đoạn 1, biến động lớn trong giai đoạn 2 và giảm dần trong giai đoạn 3. Hàm lượng ammonia cao nhất ghi nhận được đạt 26,3 mg/l.



Biến động NO2-N:

Hình 5. Biến động nitrite-nitrogen (bên trái), nitrate nitrogen (bên phải) trong ao nuôi tuần hoàn

thấy nitrate nitrogen là thông số có sự biến động lớn trong ao nuôi tuần hoàn. Trong suốt vụ nuôi, nitrate hầu như tích lũy >30 mg/l.

Kết quả thể hiện ở hình 5, nitrite có xu thế tích lũy chậm trong ao nuôi và giảm dần vào cuối vụ nuôi. Hàm lượng nitrite cao nhất đạt 4,7mg/l vào cuối giai đoạn 2. Kết quả cũng cho

3.2.2. Biến động phosphorus

Hình 6. Biến động PO4-(bên trái) và total phosphorus (bên phải) trong ao nuôi tuần hoàn

Trong suốt vụ nuôi, PO4- tích lũy dần trong ao nuôi, hàm lượng PO4- tích lũy cao nhất 9,6 mg/l. PO4-biến động trong giai đoạn 2 và đầu giai đoạn 3 và cuối giai đoạn 3 hàm lượng PO4- giảm dần. Kết quả cũng cho thấy hàm lượng

tổng phospho tích lũy trong ao nuôi trong giai đoạn 1, biến động lớn trong giai đoạn 2 và giảm dần ở giai đoạn 3. Giá trị hàm lượng tổng phosphor cao nhất 24,7 mg/l ngày nuôi 194.



3.3. Biến động COD và BOD5

Hình 7. Biến động COD (trái) và biến động BOD5 (phải) trong ao nuôi tuần hoàn

thực tiễn giải pháp quyết định duy trì pH = 7 có lợi trong việc khống chế khí ammoniac khi tổng ammonia cao trong hệ thống nuôi tích lũy được ứng dụng trong hoạt động RAS (Ep Eding và ctv., 2006). Chính vì thế, đề tài duy trì ngưỡng pH này là giải pháp tối ưu nhất để thực hiện. So sánh với ao nuôi truyền thống thì pH trong hệ thống RAS cao và ổn định hơn. Trong ao nuôi truyền thống pH buổi sáng thấp hơn 7 trong suốt vụ nuôi và sau 3 tháng nuôi pH sáng chiều nằm trong ngưỡng 6-6,5 (Nguyễn Nhứt, 2014)

Biên độ nhiệt biến thiên thấp < 30C/ ngày không ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của cá nuôi dù độ sâu mực nước 1,96 m thấp. Với kết quả này cho thấy nhiệt độ của các vụ nuôi trong năm tối ưu cho việc hoạt động hệ thống lọc sinh học và hệ thống khử nitrate kết hợp (Timmons, 2002). Đây là một lợi thế mạnh khi ứng dụng công nghệ nuôi RAS tại vùng nhiệt đới luôn đạt ngưỡng nhiệt độ thích hợp cho hệ vi sinh thực hiện quá trình nitrate hóa và khử nitrate mà ở các nước cận hàn đới và hàn đới cần phải cung cấp lượng nhiệt để duy trì hoạt động của hệ thống lọc sinh học và cho cá phát triển, gây tốn kém về công trình xây dựng và năng lượng ổn nhiệt và giữ nhiệt (Ep Eding và ctv., 2006).

Hàm lượng COD được ghi nhận trong suốt vụ nuôi và thể hiện trên Hình 7. Nhìn chung, hàm lượng COD trong ao nuôi thích hợp cho cá tra thương phẩm phát triển. Hàm lượng COD cao nhất trong chu kỳ nuôi 33,7 mg/l. Kết quả cũng cho thấy, hàm lượng BOD5 tích lũy trong ao nuôi, giá trị BOD5 tích lũy cao nhất 45,73 mg/l. Cuối vụ nuôi hàm lượng BOD5 có xu thế giảm dần.

IV. THẢO LUẬN

pH nước ở giai đoạn 1 trong ao nuôi có xu thế biến động theo hướng giảm dần do quá trình nitrate hóa diễn ra mạnh mẽ, khử kiềm mạnh cùng với ammonia làm giải phóng H+. Trong giai đoạn này pH giữa sáng chiều có sự chênh lệch là do sự hiện diện của tảo can thiệp vào quá trình biến động. Giai đoạn 2 và giai đoạn 3 pH giữa sáng và chiều không thể hiện sự khác biệt do tảo không xuất hiện trong hệ thống nuôi, quá trình khử nitrate sinh ra lượng kiềm ổn định bù lại và giúp pH nước có xu hướng tăng dần duy trì pH =7. Tuy nhiên, duy trì ở mức pH = 7, vi khuẩn nitrosomonas sp và nitrobacter sp đóng vai trò chủ đạo khử ammonia và nitrite trong hệ thống tuần hoàn có ảnh hưởng chỉ đạt ở mức gần tối ưu phát triển (Timmons, 2002). Trong



Giai đoạn 1, nước ao ít ô nhiễm, oxy thể hiện cao và giảm dần theo thời gian nuôi. Theo các nghiên cứu trước đây cho thấy để khử hoàn toàn ammonia trong hệ thống lọc tuần hoàn, oxy đóng vai trò quan trọng bậc nhất, để khử 1 g ammonia cần lượng oxy hòa tan cung cấp cho quá trình nitrate hóa khoảng 4,57 g O2 (Timmons, 2002). Cuối giai đoạn 1 hàm lượng O2 giảm mạnh, đạt 2,1 mg/l vào ngày nuôi 90, quá trình khử nitrate xảy ra nhưng ở mức thấp gây tích lũy ammonia và nitrite. Giai đoạn 2, cho thấy xu thế nồng độ oxy hòa tan giảm dần theo chu kỳ nuôi do sinh khối cá, thức ăn cho ăn nhiều, tích lũy hữu cơ cao gây tiêu tốn oxy hòa tan mạnh. Trong giai đoạn 2 bổ sung lượng khí cung cấp cho hoạt động lọc sinh học khi hữu cơ tăng nhưng không thể đạt được nồng độ tối đa cho hệ thống lọc sinh học cục bộ ≥ 4 mg/l, làm giảm khả năng khử ammonia và nitrite kết quả dẫn đến sự tích lũy ammonia và nitrite trong hệ thống. Giai đoạn 3, oxy hòa tan tăng nhẹ ở cuối chu kỳ nuôi là do tăng cường cung cấp oxy và kết hợp thay nước trong thí nghiệm khử mùi hôi “ bùn” cho cá nuôi. So sánh với ao nuôi truyền thống, hàm lượng O2 trong trong ao nuôi hệ thống RAS ổn định hơn. Ao nuôi hệ thống RAS hàm lượng O2 buổi sáng cao hơn ao nuôi truyền thống, và thấp hơn vào buổi chiều

Độ trong của nước ở giai đoạn 1, trong hệ thống có xu thế giảm dần theo chu kỳ nuôi. Nguyên nhân tạo ra độ trong thấp chủ yếu là TSS cao, màu lignin từ thức ăn tích lũy trong nước và mật độ vi tảo. Ngày nuôi 16-17 độ trong giảm thấp do sự phát triển mạnh mẽ của vi tảo. Tuy nhiên mật độ vi tảo chỉ xuất hiện ở giai đoạn nuôi ban đầu, giai đoạn cuối tảo không đóng vai trò lớn quyết định độ đục của nước. Cuối giai đoạn 1 độ trong giảm dần cho hàm lượng TSS tăng cao trong ao nuôi. Giai đoạn 2, độ trong của nước thay đổi đột ngột sau khi tiến hành thay nước do hàm lượng TSS thấp16,5

mg/l của nước cấp. Với việc tích lũy TSS cao trong ao nuôi, trong giai đoạn 2 độ trong trung bình trong ao nuôi là 37 cm. Độ trong của ao nuôi cá tra theo phương pháp truyền thống cũng cho thấy dao động từ 20 -40 cm . Giai đoạn 3, tiến hành thay nước hàng ngày với lượng nước thay tăng dần làm giảm hàm lượng TSS trong ao nuôi, tăng độ trong. Việc thay nước liên tục khiến độ trong nước ao nuôi ổn định trong cuối chu kỳ nuôi.

Độ kiềm trong hệ thống nuôi biến thiên khác nhau theo từng giai đoạn. Giai đoạn 1, ngày nuôi 1 thêm 42 kg CaCO3 vào hệ thống làm tăng độ kiềm. Trong những ngày nuôi đầu tiên lượng thức ăn ít, hàm lượng NH3 trong ao nuôi thấp, quá trình nitrate hóa diễn ra yếu không có nhiều tác động tới việc giảm độ kiềm. Vì vậy từ ngày nuôi 1 – 32 độ kiềm tăng dần rồi ổn định tại 100 mg/l. Từ ngày nuôi 33, lượng thức ăn tăng, lượng NH3 tăng dẫn tới quá trình nitrate hóa xảy ra mạnh mẽ làm giảm độ kiềm. Do lượng bùn tích lũy ít, quá trình khử nitrate diễn ra yếu nên độ kiềm có xu thế giảm trong cuối giai đoạn 1. Giai đoạn 2, độ kiềm trong hệ thống có biến động và biên độ dao động lớn. Giá trị độ kiềm lớn nhất 140 mg/l ngày nuôi 125, hàm lượng DO thấp, quá trình khử nitrate xảy ra mạnh mẽ do lượng bùn tích lũy nhiều. Giá trị độ kiềm nhỏ nhất 43 mg/l ngày nuôi 151. Do trước đó thu hoạch triệt để lượng bùn tích lũy trong hệ thống lắng bùn, quá trình khử nitrate yếu dẫn tới quá trình nitrate hóa làm giảm mạnh độ kiềm trong hệ thống. Giai đoạn 2 độ kiềm có biên độ dao động lớn do thực hiện việc thu hoạch bùn và thay nước. Giai đoạn 3, độ kiềm có xu thế tăng lên do quá trình khử nitrate xảy ra mạnh mẽ. Quá trình nitrate hóa diễn ra yếu do việc tiến hành thay nước làm giảm hàm lượng NH3, tiêu tốn ít độ kiềm. Việc thay nước thay hàng ngày và lượng thức ăn giảm làm độ kiềm có xu thế giảm về gần giá trị độ kiềm của nước cấp. Nghiên cứu cho



thấy khử 1 mole ammonia tiêu tốn lượng kiềm dưới dạng HCO3 1,98 mole (Timmons, 2002). Do quá trình khử nitrate sinh OH-, chính sản phẩm phụ này cân bằng pH trong ao nuôi RAS kết hợp với bể xử lý bùn. Chính vì thế trong thí nghiệm này chi phí tiêu tốn lượng vôi tăng độ kiềm để khử ammonia và điều chỉnh rất thấp với thực tiễn 10 g CaCO3/kg cá. Khi so sánh với hệ thống RAS không kết hợp với bể xử lý khử nitrate tiêu tốn 250 g NaHCO3/kg cá sản xuất (Timmons, 2002). Với mô hình thực tiễn ứng dụng vôi thương mại CaCO3 và với lượng ít hơn 25 lần về khối lượng và giảm chi phí khoảng 200 lần theo giá trị. Rõ ràng chi phí nâng kiềm cho RAS thấp trong thí nghiệm này và hữu ích cho sản xuất đại trà thực hiện mô hình ao lớn, đây là một bước tiến lớn trong sản xuất.

Ammonia tổng cộng trong hệ thống biến động theo thời gian nuôi. Giai đoạn 1 ammonia tổng thể hiện không đáng kể. Lượng thức ăn ít, lượng phân thải và chất bài tiết ít dẫn đến lượng ammonia sinh ra thấp. Hệ thống lọc sinh học hoạt động mạnh do hàm lượng DO cao làm giảm lượng ammonia sinh ra trong ao nuôi. Giai đoạn 2 hàm lượng tổng ammonia có biên độ dao động lớn và thay đổi đột ngột. Hàm lượng tổng ammonia ghi nhận được tại thời điểm cá bỏ ăn là 34 mg/l, thời điểm cá ăn lại tổng ammonia 22 mg/l với pH 7, nhiệt độ 31-32⁰C. Ghi nhận này mang ý nghĩa quan trọng trong quá trình vận hành hệ thống. Trong giai đoạn này, R-TAN được xác định thấp 0,25g TAN/m2/ngày so với tiêu chuẩn 0,5 – 1,5 gTAN/m2/ngày (Timmons, 2002). Giai đoạn 3, hàm lượng tổng ammonia tích lũy trong thời gian đầu. Khi thay nước hàng ngày và lượng nước thay tăng lên hàm lượng ammonia trong ao nuôi giảm dần. Đồng thời việc thay nước hàng ngày cũng làm tăng hàm lượng oxy hòa tan, giảm TSS trong nước, tăng cường khả năng khử ammonia của hệ thống lọc. Việc tăng cường thêm máy sục khí và đảo nước

trong giai đoạn 3 cũng góp phần giải phóng thêm lượng ammonia.

Nitrite nitrogen trực tiếp ảnh hưởng đến sức khỏe của cá nuôi, là một sản phẩm trong quá trình hoạt động của hệ thống biofilter. Giai đoạn 1, nitrite tăng cao trong 2 tuần đầu tiên, nguyên nhân do hàm lượng DO cung cấp cho hệ thống lọc thấp. Nitrite có xu thế tích lũy trong RAS khi hàm lượng oxy thấp hạn chế chuyển hóa nitrite thành nitrate của quá trình nitrate hóa (Timmons,2002). Tăng cường hàm lượng DO trong hệ thống lọc là biện pháp chiến lược trong việc giảm hàm lượng nitrite. Giai đoạn 2 nitrite tích lũy chậm tuy nhiên có những thời điểm nitrite tăng cao đột ngột. Tại thời điểm cá bỏ ăn hàm lượng nitrite ghi nhận được 5,4 mg/l, thời điểm cá ăn lại hàm lượng nitrite < 3 mg/l. Nước cấp có hàm lượng nitrite thấp 0,02 mg/l nên việc thay nước là một giải pháp giải quyết tức thời khi hàm lượng nitrite cao. Việc quản lý nitrite trong hệ thống RAS đã có quy chuẩn đối với cá nuôi là sử dụng NaCl = 20 x nồng độ nitrite trong ao hạn chế tính độc trực tiếp lên hệ tuần hoàn máu của cá được áp dụng cho tất cả các đối tượng cá nuôi. Giai đoạn 3, hàm lượng nitrite giảm dần do quá trình thay nước hàng ngày và lượng nước thay lớn với hàm lượng nitrite trong nước cấp thấp. Đồng thời việc thay nước hàng ngày làm lượng DO trong hệ thống lọc duy trì >4 mg/l cũng là yếu tố quyết định đến hiệu quả khử nitrite trong quá trình nitrate hóa của hệ thống lọc.

Nitrate nitrogenlà sản phẩm cuối cùng của quá trình phản ứng nitrate hóa trong biofilter.Nitrate nitrogen cũng là nguồn dinh dưỡng cho nhóm vi sinh vật yếm khí thực hiện quá trình khử nitrate tạo sản phẩm cuối cùng là khí nitrogen. Thông thường nồng độ nitrate trong nước đối với loài cá da trơn ≥ 150 mg/l có thể ảnh hưởng đến tăng trưởng của cá nuôi (Eding và ctv., 2006). Vai trò lớn của nitrate xuất hiện



cao trong hệ thống RAS + khử nitrate khống chế phát thải H2S và ứng dụng hệ thống khử nitrate để tiêu hủy carbon hữu cơ trong bùn và giảm nitrate mang lại sự cân bằng nitrate trong hệ thống. Giai đoạn 1 hàm lượng nitrate tích lũy trong ao do quá trình nitrate hóa tại hệ thống lọc và giảm đi do quá trình khử nitrate tại hệ thống lắng bùn. Quá trình nitrate hóa xảy ra tích lũy nitrate cao hơn so với quá trình nitrate hóa giảm đi. Hàm lượng nitrate tăng lên rồi giảm xuống nhưng vẫn có xu thế tăng lên. Giai đoạn 2 hàm lượng nitrate biến động nhiều do việc thu hoạch bùn cũng như tiến hành thay nước với hàm lượng nitrate 1,13 mg/l trong nước cấp. Thu hoạch bùn một cách triệt để dẫn đến phản úng khử nitrate hóa xảy ra yếu, mất cân bằng cục bộ giữa hai quá trình nitrate hóa và khử nitrate hóa. Giai đoạn 3, do thu hoạch bùn tại hệ thống lắng làm mất cân bằng hai quá trình nitrate hóa và khử nitrate tiến hành thay 30-50% nước hàng ngày, nhưng hàm lượng nitrate vẫn tăng. Nguyên nhân do lượng thức ăn lớn, DO cao khiến quá trình nitrate hóa diễn ra mạnh. Sau đó hàm lượng nitrate có xu thế giảm dần do lượng nước thay hàng ngày tăng dần, từ 116% đến 225% và 340%.

Hàm lượng orthophosphorus biến thiên theo từng giai đoạn nuôi khác nhau. Giai đoạn 1, hàm lượng vi tảo giảm dần nên nhu cầu PO4-P cho quá trình quang hợp giảm dần. Lượng thức ăn tăng, lượng phân thải hàng ngày tăng, chất hữu cơ bị phân hủy tăng và hệ thống không thay nước nên hàm lượng phosphate được tích lũy trong nước cao dần trong quá trình nuôi. PO4-P sẽ được vi sinh vật tự dưỡng hấp thụ khi quá trình hiếu khí xảy ra mạnh. Giai đoạn 2, hàm lượng PO4-P có xu thế giảm dần sau những ngày thay nước liên tục vì hàm lượng PO4-P trong nước cấp là 0,03mg/l. Từ cuối giai đoạn 1 hàm lượng vi tảo xuống thấp và có thể bỏ qua sự hấp thu PO4-P cho quá trình quang hợp của vi

tảo. Từ ngày nuôi 148 đến ngày nuôi 165, tổng lượng nước thay là 660 m3, chiếm 116% thể tích hệ thống nuôi và hàm lượng PO4-P tích lũy cao nhất 9,6 mg/l. Việc thay nước thường xuyên sẽ làm chậm lại quá trình tích lũy PO4-P trong ao nuôi.Giai đoạn 3, từ ngày nuôi 181 – 200 vẫn có sự tích lũy PO4-P do thay nước không thường xuyên và lượng nước thay ít, từ 30% - 116%. Sau đó hàm lượng PO4-P giảm dần do tiến hành thay nước hàng ngày và lượng nước thay tăng lên từ 116% - 340%. Xét về nồng độ dao động 0,01 - 9,6 mg/L không cao hơn so với ao nuôi truyền thống dù ít thay nước hơn nhiều lần được ghi nhận.

Tương tự, hàm lượng tổng phosphorus ở giai đoạn 1 tích lũy nhưng không có biến động lớn trong ao nuôi hệ thống theo thời gian nuôi. Trong điều kiện yếm khí vi khuẩn tác động đến các axit béo bay hơi có sẵn trong nước giải phóng phosphorus. Giai đoạn 2 diễn ra nhiều cải tiến, lắp đặt trong hệ thống, thay nước và thu hoạch bùn thường xuyên. Vì vậy trong giai đoạn 2, TP có nhiều biến động, tăng giảm đột ngột. Thu hoạch bùn khiến quá trình yếm khí giải phóng phosphorus tại ngăn lắng bùn diễn ra yếu nên sau khi thu hoạch bùn hàm lượng TP trong ao nuôi tăng cao. Thay nước làm giảm lượng chất hữu cơ, giảm TP trong nước ao nuôi. Đồng thời lượng bùn tích lũy nhiều, điều kiện yếm khí tốt lượng phosphorus giải phóng tại ao lắng bùn cao là nguyên nhân dẫn đến sự thụt giảm hàm lượng TP. Giai đoạn 3, TP giảm dần do tiến hành thay nước hàng ngày và lượng nước thay tăng dần, lượng chất hữu cơ giảm, phosphorus được xả trôi ra ngoài môi trường ao nuôi. Nguồn nước cấp với hàm lượng TP thấp chiếm 1,6% so với 96,7% sinh ra từ thức ăn làm giảm hàm lượng TP trong nước ao nuôi.

Việc xác định hàm lượng COD và BOD5 trong hệ thống RAS nhằm đánh giá khả năng



và mức độ ô nhiễm chất hữu cơ trong nước. Khi so sánh với ao nuôi truyền thống (Nguyễn Nhứt, 2014) thì hàm lượng những yếu tố này tương đương dù không thay nước nhưng nhờ sự giúp đỡ của hệ thống lọc sinh học thực hiện quá trình khoáng hóa nitrogen và khử carbon hữu cơ theo hai cơ chế oxy hóa trực tiếp và quá trình hấp thụ của vi sinh vật. Giai đoạn 1, hàm lượng COD có xu thế tăng dần trong ao nuôi. Theo thời gian nuôi, lượng thức ăn và lượng phân bài tiết tăng đồng thời không thay nước nên hàm lượng COD trong ao nuôi có xu thế tích lũy tăng dần.Giai đoạn 2, hàm lượng COD cao nhất trong chu kỳ nuôi 33,7 mg/l. Biện pháp khắc phục là thay nước nhằm giảm lượng chất hữu cơ trong ao nuôi. Đồng thời tăng vận tốc bơm bùn nhằm lắng đọng các hợp chất hữu cơ tại hệ thống xử lý bùn. Giai đoạn 3, thay nước hàng ngày và lượng nước thay tăng dần khiến hàm lượng COD giảm dần. COD nước cấp 5,9 mg/l, thấp hơn nhiều so với COD ao nuôi. Nhìn chung hàm lượng COD trong hệ thống thích hợp trong cho cá tra thương phẩm phát triển. Chỉ số BOD5 chỉ ra lượng oxy mà vi sinh vật tiêu thụ trong phản ứng oxy hóa các chất hữu cơ trong nước. Giai đoạn 1 không thay nước nên lượng chất hữu cơ tích lũy trong ao nuôi. Càng về cuối giai đoạn 1 khi lượng thức ăn tăng lên, hàm lượng BOD5 tăng lên một cách nhanh chóng. Giai đoạn 2, từ ngày nuôi 91 – 122 tiến hành thay nước 30-50% nhưng không thường xuyên nên BOD5 tiếp tục tăng trong ao nuôi. Đỉnh điểm BOD5 cao nhất 45,73 mg/l tại ngày nuôi 108.

Việc thay nước thường xuyên và tăng vận tốc bơm bùn làm BOD5 giảm dần. Giai đoạn 3, việc thay nước hàng ngày và lượng nước thay tăng dần là nguyên nhân chính lượng chất hữu cơ trong ao giảm mạnh dẫn đến BOD5 giảm dần trong ao.

V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

5.1. Kết luậnChất lượng nước trong ao nuôi hệ thống tuần

hoàn bảo đảm cho sự sinh trưởng và phát triển của cá tra nuôi thương phẩm. Tuy nhiên, sự biến thiên theo từng giai đoạn nuôi không ổn định. Lượng ô nhiễm nitrogen và phosphorus thải ra từ hệ thống ao nuôi tuần hoàn không đáng kể. Sự thành công của mô hình sẽ mở ra cho nghề nuôi cá tra một công nghệ nuôi mới hạn chế thay nước và giảm thiểu ô nhiễm môi trường.

5.2. Đề xuất

Để cải thiện và ổn định chất lượng nước ở các giai đoạn cuối trong hệ thống nuôi tuần hoàn cần phải có giải pháp cung cấp và duy trì nồng độ oxy hòa tan cho hệ thống lọc biofilter thích hợp hơn. Xây dựng và ứng dụng ao nuôi tuần hoàn ở mô hình sản xuất thực tiễn.

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành nghiên cứu này, chúng tôi nhận được sự tài trợ từ Bộ Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn, sự giúp đỡ từ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 cùng các chuyên gia của trường Đại học Wageningen- Hà Lan. Nhân đây, cho phép chúng tôi gởi lời cảm ơn chân thành đến sự giúp đỡ quý báu đó.




Tài liệu tiếng Việt

Nguyễn Nhứt, Lê Ngọc Hạnh, Nguyễn Văn Hảo, 2013. Ước tính phát thải của ao nuôi cá (Pangasianodon hypophthalmus) thâm canh ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí nghề cá sông Cửu Long số 1, trang 20-29.

Nguyễn Nhứt, Nguyễn Văn Hảo, Nguyễn Hồng Quân, Lê Ngọc Hạnh, Nguyễn Văn Huỳnh, Johan Ver-reth , Marc Vedergem , Roel Bosma, 2014. Báo cáo tổng kết kết quả khoa học công nghệ đề tài ”Nghiên cứu xây dựng công nghệ nuôi cá tra (Pangasianodon hypophalmus) thâm canh bằng hệ thống tuần hoàn đảm bảo an toàn sinh học và không gây ô nhiễm môi trường, trang 76-79.


Eding, E.H., Kamstra, A., Verreth, J.A.J., Huisman, E.A., and Klapwijk, A., 2006. Design and operation of nitrifying trickling filters in

recirculating aquaculture: A review. Aquaculture Engineering, 34: 234-260.

Phan, L.T., Bui, M.T., Nguyen, T.T.T., Googley, G.J., Ingram, B.A., Nguyen, H.V, Nguyen, P.t., De Silva, S.S., 2009. Current status of farming practices of striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus in Mekong Delta, Vietnam. Aquaculture 296, 227–236.

FAO, Globefish Reports - Pangasius - March 2015, pp.1.

Timmons, M.B., Ebeling, J.M., Wheaton, F.W., summerfelt, S.T., Vinci, B.J., 2002. Recirculating aquaculture systems, 2nd edition. NRAC Publication, vol01-02.

Thierry, J., 2011. Design and performance of recirculating aquaculture system. Thesis of master degree in Wageningen University.

Marc, V., 2011. Recirculating aquaculture system lecture note in Wageningen university, the Netherlands, pp. 5-14.



eValUaTing WaTeR QUaliTY in oUTdooR PiloT ReciRcUlaTing aQUacUlTURe sYsTem FoR inTensiVe sTRiPed caTFish

(Pangasianodon hypophthalmus) cUlTURe

Nguyen Hong Quan1*, Nguyen Nhut1, Nguyen Van Huynh1, Le Ngoc Hanh1, Nguyen Van Hao2

ABSTRACT The aims of this study are monitoring and evaluation of water quality dynamic in an outdoor re-circulating aquaculture system (RAS) for striped catfish culture. The RAS comprises a biofilter, a septic tank and fish pond, which locate in one pond. Using airlift system provides oxygen and water pumping in experiment. Stocking density was 133 inds/m2 with average of 16.1 g/ind during 260 days of culture. The commercial standard feed was used for experiment with protein 28 -30%. After 260 days of culture, fish reached market size and acceptable export quality. The average of market size was 810g/ind, survival rate of 81% and feed conversion rate around 1.6. Water quality in ponds throughout the production cycle is stable and suitable for fish. Estimated water consump-tion was about 600 l/kg fish produced, which was 7-9 times lower than that of traditional pond. The waste production as discharged nitrogen and phosphorus was about 7-10 times lower than that of traditional pond. This successful model will createa new culture model for striped catfish industry in Mekong delta, which reduces water exchange and environment pollution.

Keywords: striped catfish, environment, water, RAS, airlift.

Người phản biện: Ths. Nguyễn Đinh Hùng




1 Division of Experimental Biology, Research Institute for Aquaculture No 2. * Email: [email protected] 2 Research Institute for Aquaculture No 2.



nÂng cao năng sUẤT VÀ Tính bỀn VỮng cỦa Tôm nUôi TRong hỆ ThỐng canh Tác Tôm lúa Ở XÃ hÒa mỸ,

hUYỆn cái nưỚc, TỈnh cÀ maU

Lê Hữu Hiệp1*, Nguyễn Văn Hảo2, Nguyễn Công Thành1, Lưu Đức Điền3, Trương Minh Lel1, Hoàng Thị Thủy Tiên2

TÓM TẮTMô hình nuôi tôm quảng canh kết hợp với trồng lúa chiếm diện tích tương đối lớn ở Cà Mau. Đặc điểm của mô hình này là thả tôm mật độ thưa, diện tích rộng nên bà con chỉ áp dụng biện pháp kỹ thuật ở mức độ thấp. Mặc dù các rủi ro đối với vụ nuôi giảm thấp do các hệ thống nuôi có mức độ thâm canh thấp, vẫn còn có một số vấn đề gặp phải: dịch bệnh, ao không giữ nước và năng suất thấp. Vì vậy, hệ thống canh tác lúa-tôm đã trở nên ngày càng khó khăn trong quản lý, dẫn đến ảnh hưởng đến sinh kế của người nông dân. Nghiên cứu này nhằm đánh giá các biện pháp kỹ thuật như gia cố bờ bao, thiết kế lại đồng ruộng, ao ương, chuyển giao một số kỹ thuật nuôi tôm đến hiệu quả của mô hình tôm- lúa. Kết quả cho thấy, các biện pháp kỹ thuật đã có đóng góp tích cực vào sản lượng tôm của mô hình khi so sánh với các hộ đối chứng.

Từ khóa: Tôm lúa, mô hình, tỷ lệ sống, thiết kế, ao ương.

1 Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected] 2 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. 3 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.

I. MỞ ĐẦU

Trong các mô hình nuôi thủy sản ở Cà Mau, mô hình nuôi tôm quảng canh kết hợp với trồng lúa chiếm diện tích tương đối lớn. Đến năm 2013, diện tích nuôi trồng thủy sản này đạt gần 40 ngàn ha, chiếm 15% tổng diện tích nuôi tôm của tỉnh (Sở NN&PTNT CM, 2014). Các huyện có nuôi tôm-lúa kết hợp là Thới Bình, Phú Tân, Cái Nước, Đầm Dơi. Năng suất tôm bình quân của mô hình từ 200 - 250 kg/ha/năm. Đặc điểm của mô hình này là thả tôm mật độ thưa vào mùa khô, và trồng lúa vào mùa mưa. Trung bình 1 tháng bà con thả từ 1-2 đợt tôm, mật độ từ 1-3 con/m2 và thu tỉa khi tôm đạt kích cỡ thu hoạch. Mô hình sản xuất lại có vốn đầu tư thấp, ít rủi ro, vừa bền vững, rất phù hợp với trình độ, điều

kiện kinh tế, đất đai của đa số người nông dân. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, do giá tôm khá cao, trong khi giá lúa lại thấp, giá trị mang lại của con tôm gấp nhiều lần so với cây lúa nên nhiều hộ đã ưu tiên nuôi tôm hơn trồng lúa. Việc rửa mặn không triệt để do còn tôm trong ruộng, nên độ mặn trong ruộng vẫn còn khá cao và ảnh hưởng tiêu cực đến vụ lúa. Từ những phỏng vấn, quan sát cho thấy, nếu vụ lúa năm trước thất bại thì năng suất vụ tôm tiếp theo cũng giảm mạnh do không đủ thức ăn cho tôm, khi tôm thu ở năm sau thấp thì các nông hộ tiếp tục thả thêm tôm vào ruộng nhưng vì không đủ thức ăn nên tôm tiếp tục thất thu, lúc này việc trồng lúa trở nên khó khăn hơn rất nhiều do độ mặn trong đất cao và nông hộ không đủ khả năng đầu tư chuẩn bị



đất trồng lúa, vụ tôm tiếp theo sẽ lại thấp hơn năm trước. Đây như vòng luẩn quẩn người nông dân không thể thoát ra nếu không có giải pháp để giải quyết tranh chấp giữa con tôm và cây lúa. Một hệ thống nuôi với ruộng quảng canh cải tiến nuôi tôm vào mùa khô, trồng lúa vào mùa mưa và ao nuôi tôm bán thâm canh bậc thấp có lẽ là giải pháp cho vấn đề.

Để tiếp tục phát huy lợi thế của mô hình tôm – lúa và hỗ trợ bà con nông dân nuôi tôm bán công nghiệp, dự án SMCN/2010/083 quan tâm đầu tư cải tạo ao đầm, đê bao chắc chắn giữ được mức nước theo yêu cầu kỹ thuật, hỗ trợ con giống qua kiểm tra chất lượng, quản lý chặt chẽ môi trường ao nuôi, mật độ thả các đối tượng hợp lý, nhằm giảm rủi ro, tăng thu nhập trên cùng đơn vị diện tích.

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUMô hình này được thực hiện từ tháng

1/2014 đến tháng 12/2014 tại ấp Thị Tường, xã Hòa Mỹ, huyện Cái Nước, tỉnh Cà Mau. Mô hình được chia làm hai nhóm thực nghiệm và đối chứng, mỗi nhóm thực hiện gồm 6 nông hộ.

2.1 Thiết kế thí nghiệmThử nghiệm trên ruộng lúaĐối với ao (Quảng canh cải tiến) QCCT:

Nghiên cứu hỗ trợ sáu hộ thử nghiệm gia cố bờ

bao để ao giảm thất thoát nước, mở rộng ao lắng để trữ nước cho ao nuôi, diệt khuẩn, diệt tạp trước khi thả tôm để nâng cao tỷ lệ sống của tôm. Các hộ đối chứng làm theo kinh nghiệm của các hộ này, theo đó phần lớn chỉ có diệt tạp trước khi thả tôm (Bảng 1).

Bảng 1. Thiết kế thí nghiệm

Hạng mụcNhóm thử

nghiệmNhóm đối

chứng

Gia cố bờ bao Có Không

Mở rộng ao lắng

Có Không

Diệt tạp Có Có, không

Diệt khuẩn Có Không

Đối với ao ương và ao nuôi bán thâm canh bậc thấp: Dự án hỗ trợ con giống, thức ăn và kỹ thuật nuôi. Mật độ tôm ao nuôi được khuyến cáo ở mức 15 con/m2 đối với tôm sú và 30 con/m2 đối với tôm thẻ.

2.2 Hệ thống công trình nuôiHệ thống mô hình đối chứng: Hệ thống được

thiết kế theo canh tác tôm-lúa truyền thống trong mô hình quảng canh cải tiến (QCCT) (Hình 1). Hệ thống gồm bờ bao, mương, trảng và cống cấp thoát nước.

Hình 1. Hệ thống nuôi QCCT truyền thống



Hệ thống mô hình thực nghiệm gồm: 1 ao nuôi BTC, 1 ao ương tôm giống, ao nuôi QCCT, ao lắng, cống cấp thoát nước (Hình 2).

Hình 2. Hệ thống nuôi BTC và QCCT được thiết kế mới2.3. Kích thước, diện tích các ao nuôiTùy theo hiện trạng diện tích và cấu trúc đất của các nông hộ, hệ thống nuôi như Bảng 2.

Bảng 2. Kích thước và diện tích các nông hộ nhóm thực nghiệm

Nông hộ Ao lắng (m2) Ao ương (m2) Ao BTC (m2) Ao QCCT (m2)Tổng diện tích mặt nước nuôi

(m2)

M1 800 1.600 3.000 17.000 22.400

M2 1.000 1.600 3.000 20.000 25.600

M3 1.000 2.000 2.300 38.000 43.300

M4 800 3.000 3.000 35.000 41.800

M5 1.000 2.000 3.500 22.000 28.500

M6 1.000 2.000 3.000 25.000 31.000

Bảng 3. Kích thước và diện tích các mô hình nuôi đối chứng

Nông hộ Ao QCCT (m2)C1 20.500C2 17.000C3 28.000C4 21.000C5 16.000C6 20.000

2.4 Bố trí thả giống và mật độ thả

Đối với ao QCCT ở mô hình thực nghiệm: Tôm giống thả 3 lần/vụ, trong đó có 2 lần thả trực tiếp tôm giốngvới mật độ là 2 con/m2 và 1 lần thả tôm ương (từ ao ương) mật độ 1 con/m2. Cả 6 mô hình đối chứng thả 3 lần/vụ, mật độ tôm giống thả mỗi lần là 2 con/m2. Đối với ao nuôi BTC: Tất cả 6 mô hình thả tôm sú lần 1 với cùng mật độ là 12 con/m2, và 3 mô hình M1, M2, và M4 thả tôm thẻ lần 2 với mật độ lần lượt là 40, 75 và 50 con/m2.



2.5 Phương pháp cải tạo ao và chuẩn bị nước trước thả giống

- Dọn vệ sinh quanh ao, gia cố bờ bao bằng cơ giới.

- Diệt cá tạp bằng dây thuốc cá.- Phơi ao, thời gian phơi từ 5-10 ngày tùy

kiều kiện từng aoChuẩn bị nước ao QCCT

- Nước được lấy vào ao qua lưới mành. - Mức nước trên trảng từ 0,2-0,4 mét và ở

mương từ 1,2-1,4 mét.- Sau 3-5 ngày bón phân gây màu nước màu

(DAP hoặc NPK) với liều lượng 1-2 kg/1.000 m3 cho đến khi độ trong đạt khoảng 30-40 cm.

2.6. Chọn tôm giống và thả giống

Tất cả 12 mô hình đều chọn tôm giống như nhau. Tôm giống được chọn lựa đạt tiêu chuẩn ngành và được đánh giá chất lượng thông qua cảm quan và kiểm tra mô học tại Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải không mang một số bệnh nguy hiểm thường gặp như bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh còi và bệnh gan tụy. Tôm được thả vào sáng sớm. Trước khi thả ra môi trường nước, bao tôm được thả trôi nổi trên mặt nước từ 15-30 phút để cân bằng nhiệt độ sau đó mới thả tôm ra.

2.7. Thu thập số liệuCác yếu tố môi trường: pH, oxy hòa tan

đượctheo dõi lúc 6 giờ sáng và 14 giờ chiều; 3 ngày/lần trong ao nuôi BTC và ao QCCT. Các yếu tố này được được đo bằng máy đo điện cực Aqua-D. Độ mặn, nhiệt độ được theo dõi hàng ngày bằng logger và chỉ theo dõi ở ao nuôi QCCT.

Độ kiềm được đo định kỳ 10 ngày/lần bằng testkit trong ao nuôi BTC.

Số lượng tôm, cua thu hoạch và thả giống của nông hộ được thu thập bằng cách gửi nông hộ một quyển nhật ký để ghi chép, sau đó cán

bộ dự án sẽ đến từng nhà để thu thập các số liệu này mỗi tuần.

2.8. Phương pháp thu hoạchSử dụng phương pháp thu tỉa để thu tôm

đạt kích cỡ thương phẩm trong ao nuôi QCCT. Dụng cụ thu tỉa là các lú thưa đặt trong mương. Đến cuối vụ đặt lú có mắt lưới nhỏ ở cống và tháo nước để thu toàn bộ. Đối với ao nuôi BTC thì thu hoạch một lần.

2.9. Phương pháp xử lý số liệu và đánh giá các chỉ tiêu thu hoạch từ các mô hình

- Sử dụng phần mền Excel để tính toán các giá trị trung bình, độ lệch chuẩn và vẽ đồ thị.

- Đánh giá tỷ lệ sống của tôm: Thông qua số lượng giống thả và số lượng thu hoạch được.

Tỷ lệ sống = {Số lượng tôm thu hoạch (con) /Số lượng tôm thả nuôi (con)}* 100

- Hệ số chuyển đổi thức ăn: FCR= {Lượng thức ăn sử dụng (kg)/ Lượng

tôm thu hoạch (kg)}*100- Năng suất quy đổi tôm các mô hình: P

(kg/ha)P = {Sản lượng tôm thu (kg)/diện tích (ha)}

III. KẾT QUẢ3.1 Kết quả theo dõi các yếu tố môi

trường ao nuôi QCCT ở hai mô hình

3.1.1 Nhiệt độSự biến động về nhiêt độ trong ruộng được

thể hiện ở Hình 3. Nhiệt độ trung bình ở hai nhóm thử nghiệm và đối chứng không có sự khác biệt. Nhiệt độ trung bình trong ao cao nhất là ở tháng 4 (330C), sau đó giảm dần khi mùa mưa đến rồi tăng lại vào tháng 8 khi giai đoạn chuẩn bị ruộng để gieo xạ lúa. Chênh lệch nhiệt độ vào ban ngày và ban đêm trong ruộng rất rõ rệt, đặc biệt ở trên trảng với mực nước trung bình là 20 cm (Hình 4).



Hình 3. Nhiệt độ trung bình trong ao quảng canh cải tiến

Hình 4. Biến động nhiệt độ trong ao vào giữa mùa khô3.1.2 Oxy hòa tan Hàm lượng oxy hòa tan rất cao (7 mg/l) vào buổi chiều tuy nhiên lại rất thấp vào sáng sớm (1-2

mg/l) ở cả hai nhóm nghiên cứu (Hình 5,6).

Hình 5. Oxy hòa tan buổi sáng và chiều trong ao QCCT



Hình 6. Biến động hàm lượng oxy hòa tan trong ao vào giữa mùa khô

3.1.3 Độ mặn Độ mặn trong các ao của hai nhóm nghiên

cứu giảm dần từ tháng 4 khi mùa mưa đến (Hình 7).

Hình 7. Diễn biến độ mặn trong ao quảng canh

3.2 Các yếu tố môi trường ao nuôi BTC bậc thấp

Nhìn chung, điều kiện môi trường ao nuôi thuận lợi cho sự phát triển bình thường của tôm. Các ao có độ sâu trung bình là 1,1 m nên nhiệt độ, pH dao động trong ngày không lớn. Tuy nhiên, độ kiềm ở một số mô hình cao (trên 150 mg CaCO3/l).

Bảng 4. Các yếu tố môi trường ao nuôi BTC

Yếu tốMô hình

M1 M3

Oxy hòa tan (mg/l) 4,3–7,2 3,8-8,13

pH 7,67-7,86 7,71-8,79

Kiềm (mg CaCO3/l) 150 100-180

3.3 Ao ương

Tỷ lệ sống của tôm đạt 19-29% sau 60 ngày với kích cỡ 2-3 g/tôm

3.4 Tôm thu hoạch ao bán thâm canh

Tỷ lệ sống của các ao dao động từ từ 41-87,6%. Hệ số thức ăn dao động từ 1,06 - 1,44.

Bảng 5. Sản lượng tôm thu hoạch, tỷ lệ sống, FCR ở các ao nuôi BTC

Nông hộ

Tôm nuôi

Thu hoạch (kg)

Tỷ lệ sống (%)

FCR

M3 Tôm sú 532 41,2 1,44

M1 Tôm thẻ 1.100 87,6 1,06

3.5 Năng suất tôm từ ao QCCT

Sản lượng tôm thu hoạch của các nông hộ tương đối thấp, từ 43-136 kg/ha, trung bình ở các hộ thử nghiệm là 90 kg/ha và ở các hộ đối chứng là 81 kg/ha. Tỷ lệ sống của tôm trong ruộng đạt 1,5-6%. Kích cỡ tôm thu hoạch dao động từ 16,6- 41,6 g tùy vào nông hộ.



Bảng 6. Sản lượng tôm thu hoạch ở hai mô hình

Nhóm Tôm (kg) Tỷ lệ sống (%) Cua (kg)Năng suất tôm

(kg/ha)

Thực nghiệm

M1 189 6,0 82 111M2 157 3,0 18 79M3 299 4,5 200 85M4 341 4,4 440 90M5 182 3,5 180 91M6 139 2,9 136 82

Đối chứng

C1 149 3,2 120 73C2 73 1,5 96 43C3 152 3,9 0 54C4 219 5,4 60 104C5 125 4,8 0 78C6 272 4,0 101 136

mô hình thử nghiệm thấp hơn so với mô hình đối chứng do bờ bao ở mô hình thử nghiệm đã được gia cố nên giữ nước tốt, ít bị rò rỉ sang ao lân cận. Duy trì mực nước cao trên trảng sẽ góp phần giảm tác động của nhiệt độ cao mùa khô, từ đó giảm stress đối với tôm, giúp tôm gia tăng thời gian bắt mồi (Wyban và ctv., 1995). Nhiệt độ cao trong nước ao ở tháng 5-6 cũng trùng khớp với hiện tượng tôm ốp thân, không lột xác được. Nguyên nhân có lẽ bắt nguồn từ việc tôm không tìm đủ thức ăn cho nhu cầu duy trì.

Hàm lượng oxy hòa tan thấp vào sáng sớm trong các mô hình cũng là một trở ngại lớn để nâng cao tỷ lệ sốngcũng như tăng trưởng của tôm (Rosas và ctv., 1997). Chỉ số này thường thấp dưới 1 mg/l ở đáy ao. Hiện tượng oxy hòa tan thấp kéo dài trong vụ nuôi mặc dù không gây chết cho tôm trong điều kiện ao quảng canh nhưng sẽ kìm hãm tăng trưởng của tôm và tôm dễ bị nhiễm bệnh hơn (Allan & Maguire, 1991). Biến động nhiệt độ lớn, hàm lượng oxy hòa tan thấp vào buổi sớm dường như là bản chất của hệ thống nuôi quảng canh.

3.6 Tổng sản lượng tôm trong mỗi mô hình

Tổng sản lượng tôm thu trên một đơn vị diện tích ở mô hình thực nghiệm cao hơn nhiều so với mô hình đối chứng (3.760 kg/ha so với 101 kg/ha). Bảng 7. Năng suất tôm ở hai nông hộ điển hình

của mỗi mô hình

Nhóm Tôm (kg/ha)

Đối chứng 101

Thực nghiệm 3.760

IV. THẢO LUẬN

Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến tăng trưởng của tôm (Wyban và ctv., 1995). Nhiệt độ nước ban ngày ở trảng cao, từ 32-340C, đặc biệt trong giai đoạn từ giữa tháng 4 đến đầu tháng 6. Nhiệt độ nước ở trong mương trong cùng thời gian cũng trên 330C, ảnh hưởng đến việc bắt mồi của tôm vào ban ngày khi khoảng nhiệt độ phù hợp cho tăng trưởng bình thường của tôm 29-320C (Chen, 1999; Deering, 1995). Nhiệt độ trung bình ở



Năng suất tôm trung bình trong cả hai mô hình trong nghiên cứu này tương đối thấp (81-90 kg/ha) so với những công bố trước đây, 250-300 kg/ha (Sở NN&PTNT Cà Mau, 2014; Thiều Lư, 2010). Tỷ lệ sống của tôm khá thấp ở cả hai mô hình. Ở các hộ thử nghiệm đã có đê bao chắc chắn giữ được mức nước theo yêu cầu kỹ thuật, sên vét mương sâu hơn, con giống qua kiểm tra chất lượng, quản lý chặt chẽ môi trường ao nuôi, mật độ thả các đối tượng hợp lý, cũng như việc đưa tôm từ ao ương có kích cỡ lớn ra ruộng ở các mô hình thử nghiệm nhưng kết quả không khả quan hơn so với các hộ đối chứng. Bên cạnh môi trường khắc nghiệt thì nguyên nhân của năng suất thấp có lẽ là ruộng đã nghèo thức ăn tự nhiên do không trồng lúa được trong vài năm trở lại đây. Hiện tượng tôm ốp thân, mềm vỏ phần nào nói lên việc thiếu thức ăn trong ao. Thông thường việc thả con giống có kích cỡ lớn mang lại tỷ lệ sống cao (83-94%) do khả năng bắt mồi và chống chọi với cua, cá trong ao tốt hơn tôm post (Minh, 2003). Vì vậy các giải pháp kỹ thuật sẽ chưa thuyết phục nếu không có giải pháp về cải thiện thức ăn tự nhiên trong ao. Ở đây chúng tôi muốn nhấn mạnh lợi ích to lớn của việc trồng lúa trong mô hình quảng canh cải tiến.

Việc chuyển đổi một phần diện tích tôm-lúa thành ao nuôi bán thâm canh cho thấy mang lại lợi ích gấp nhiều lần trên một đơn vị diện tích.

Với sự hỗ trợ về kỹ thuật nuôi, quản lý ao, con giống chất lượng cộng với sự nỗ lực của các hộ thử nghiệm sẽ là nền tảng vững chắc để người nông dân vươn lên làm chủ kỹ thuật nuôi từ đó nâng cao thu nhập từ ao nuôi của mình. Mặc dù vẫn còn có hộ chưa thành công nhưng với 4/6 hộ nhóm thực nghiệm có thu hoạch nên bà con đều rất tin tưởng vào kỹ thuật nuôi nắm bắt được từ dự án để từ đó có thể độc lập canh tác khi dự án kết thúc.

Các số liệu về sản lượng tôm thu hoạch, số lượng tôm thả giông trong nghiên cứu này được thu thập khá công phu bằng việc thường xuyên tiếp xúc với người nông dân (mỗi tuần). Nên các số liệu này là rất cập nhật và chính xác với thực tế ở nông hộ ở mô hình quảng canh cải tiến.

VI. KẾT LUẬN

Kết quả cho thấy, các biện pháp kỹ thuật đã có đóng góp tích cực vào sản lượng tôm của mô hình khi so sánh với các hộ đối chứng.Việc thiết kế thêm ao mới để ương hoặc nuôi bán thâm canh là cần thiết để góp phần cải thiện năng suất, sản lượng tôm của mô hình tôm lúa.

LỜI CẢM ƠNNhóm tác giả chân thành cám ơn sự hỗ trợ

tài chính từ dự án SMCN/2010/083 do Cơ quan Nghiên Cứu Nông Nghiệp Úc ở nước ngoài, ACIAR,tài trợ.





Sở Nông nghiệp và Phát triển nông Cà Mau, 2014. Báo cáo kết quả thực hiện kế hoạch năm 2013 và kế hoạch phát triển nông nghiệp, nông thôn năm 2014 tỉnh Cà Mau.

Thiều Lư, Trình Trung Phi, Nguyễn Công Thành, Đỗ Văn Hoàng, Ngô Minh Lý, Trần Quốc Binh, Nguyễn Trọng Nghĩa, 2010. Nghiên cứu một số giải pháp phát triển bền vững các mô hình nuôi tôm trên vùng chuyển đổi tại huyện Đầm Dơi, tỉnh Cà Mau. Báo cáo khoa học, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. 103 trang


Allan, G.L., Maguire, G. B., 1991. Lethal levels of low dissolved oxygen and effects of short-term oxygen stress on subsequent growth of juvenile (Penaeus monodon). Aquaculture 94(1), 27-37.

Chen, H.Y., & Chen, Y.L., 1999. Temperature preferendum of postlarval black tiger shrimp (Penaeus monodon). Marine and freshwater research 50(1), 67-70.

Clayton, H., 2003. Rice–shrimp farming in the Mekong Delta: biophysical and socioeconomic issues (No. 113920). Australian Centre for International Agricultural Research.

Deering, M.J., Fielder, D.R., & Hewitt, D.R., 1995. Effects of temperature on growth and protein assimilation in juvenile leader prawns Penaeus monodon. Journal of the World Aquaculture Society 26(4), 465-468.

Rosas, C., Sánchez, A., Díaz-Iglesia, E., Brito, R., Martinez, E., & Soto, L.A., 1997. Critical dissolved oxygen level to and Penaeus schmitti postlarvae (PL10–18) exposed to salinity changes. Aquaculture 152 (1), 259-272.

Truong Hoang Minh, Christopher J. Jackson, Tran Thi Tuyet Hoa, Le Boa Ngoc, Nigel Preston and Nguyen Thanh Phuong. 2003. Growth and survival of Penaeus monodon in relation to the physical condition in the rice-shrimp culture system in the Mekong Delta. In Rice–shrimp farming in the Mekong Delta: biophysical and socioeconomic issuesIn Rice–shrimp farming in the Mekong Delta: biophysical and socioeconomic issues. Editted by Preston, K and Clayton, H. 2003. Technical report ACIAR Project

Wyban, J., Walsh, W.A., & Godin, D.M., 1995. Temperature effects on growth, feeding rate and feed conversion of the Pacific white shrimp (Penaeus vannamei). Aquaculture 138(1–4), 267-279.



imPRoVe PRodUcTiViTY and sUsTainabiliTYoF shRimP FaRming in Rice-shRimP sYsTem

in hoa mY, cai nUoc, camaULe Huu Hiep1*, Nguyen Van Hao2, Nguyen Cong Thanh1, Luu Duc Dien3, Truong Minh Lel1,

Hoang Thi Thuy Tien2

ABSTRACTThe rice- shrimp culture system accounts for a relatively large area in Ca Mau. This model is char-acterized by low stocking density, large area, low level of culture technique. Although the risk is low due to reduced intensification, there are still a number of problems encountered such as dis-ease, maintain water level and low production. Therefore, rice-shrimp culture system has become increasingly difficult to manage, leading to impacts on farmer’s livelihoods. This study aimed to evaluate the technical measures such as reinforce embankment, redesign fields, nursery pond, high quality stocking, transfer shrimp culture technques. The results show that technical measures have a positive contribution to the production of shrimp in the trial model when compared with the control households.

Keywords: Rice-shrimp, trial model, survival rate, design, nursery pond.





1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research,Research Institute for Aquaculture No 2. * Email:[email protected] 2 Research Institute for Aquaculture No 2. 3 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2.



sÀng lỌc các dÒng nẤm men mang gen VP28 Thích hỢP ĐỂ sẢn XUẤT ToleRine PhÒng bỆnh ĐỐm TRẮng TRÊn Tôm nUôi

Ngô Thị Ngọc Thủy1*, Đặng Thị Trà My1

TÓM TẮTViệc sử dụng tế bào nấm men Pichia pastoris làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp đã được nghiên cứu và sản xuất nhiều loại vaccine phòng bệnh cho động vật có xương sống nhưng được vận dụng hạn chế trong nghiên cứu bệnh thủy sản nói chung và bệnh tôm nói riêng. Nghiên cứu này tiến hành sàng lọc 150 chủng nấm men Pichia pastoris có mang gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus đốm trắng nhằm tạo nguyên liệu cho sản xuất toreline phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. Các chủng nấm men được chọn lọc dựa trên kiểu hình (Mut+), số lượng bản sao gen mục tiêu, khả năng biểu hiện protein và tốc độ sinh trưởng. Quá trình sàng lọc đã chọn được 125 chủng mang kiểu hình Mut+, 82 chủng có mang 14-16 bản sao của gene VP28-His trong genome và 8 chủng có khả năng biểu hiện protein tốt. Trong 8 chủng chọn lọc, chủng 11 cho tốc độ sinh trưởng nhanh, đạt mật độ tế bào cao nhất (3,92x109 tế bào/ml) và lượng protein VP28 nhiều nhất sau 84 giờ kích thích biểu hiện. Chủng này được dùng làm nguyên liệu để điều chế toreline phòng bệnh đốm trắng trong các nghiên cứu tiếp theo.

Từ khóa: VP28, Pichia pastoris, bệnh đốm trăng.

1 Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected]


Virus gây bệnh đốm trắng là loại virus gây bệnh nghiêm trọng và phổ biến ở tôm nuôi. Bệnh này là nguyên nhân chủ yếu gây ra những tổn hại kinh tế lớn đối với ngành công nghiệp nuôi tôm trên toàn thế giới. Gần đây, nhiều loại vaccine phòng bệnh đốm trắng đã được nghiên cứu như vaccine bất hoạt, vaccine nhược độc (Namikoshi et al., 2004; Singh et al., 2005) hoặc vaccine tái tổ hợp dùng để tiêm cho tôm (Namikoshi et al., 2004; Rout et al., 2007; Witteveldt et al., 2004b). Những loại vaccine này có một số nhược điểm như có yếu tố rủi do tiềm tàng khi vaccine nhược độc trở thành có độc lực, hay cần bổ sung thêm chất bổ trợ hoặc phải đưa vào vật chủ vài lần bằng đường

tiêm. Việc dùng vaccine bằng cách tiêm ngoài việc yêu cầu nhiều công lao động, dễ gây stress cho vật chủ, có thể tạo ổ viêm tại vị trí tiêm, nó còn không thích hợp trong điều kiện thực tế nuôi tôm khi số lượng vật chủ thường lớn và rất mẫn cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường. Vì vậy, việc nghiên cứu vaccine tái tổ hợp và quản lý bằng phương pháp cho ăn đã được trú trọng nhiều hơn, đặc biệt là các protein hay DNA vaccine chế tạo từ gen VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên các hệ thống biểu hiện khác nhau (Caipang et al., 2008; Fu et al., 2011; Kim et al., 2007; Kumar et al., 2008; Ning et al., 2011; Musthaq and Jimmy,2011; Satoh et al.; Witteveldt et al., 2004a; Witteveldt et al., 2004b; Witteveldt et al., 2006).



Trong thực tế, có 4 hệ thống biểu hiện sự sống: tế bào vi khuẩn, nấm men, tế bào côn trùng và các hệ thống biểu hiện bằng tế bào động vật có vú và tế bào thực vật đã được nghiên cứu sử dụng để sản xuất vaccine (Hansson et al., 2000). Việc sử dụng tế bào nấm men để điều chế protein vaccine tái tổ hợp phòng bệnh cho người và gia súc đã được ứng dụng rộng rãi do nấm men kết hợp được những ưu điểm của sinh vật đơn bào và sinh vật có nhân điển hình. Ví dụ như các ưu điểm của việc sản xuất protein tái tổ hợp từ tế bào nấm men Pichia pastoris bao gồm: sinh trưởng nhanh, cho mật độ tế bào lớn, san xuất ra nhiều protein, không bị tạp nhiễm với nội độc tố và thể thực khuẩn, dễ thao tác di truyền, không là vật mang các tác nhân gây bệnh cho người,… (Eda và Pinar, 2012; Li et al., 2007). Theo Balamurugan et al., (2007) đã cho thấy, hiệu suất biểu hiện protein trên tế bào nấm men P. pastoris cao gấp 10-100 lần so với trên tế bào E. coli. Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào nấm men làm hệ thống biểu hiện để sản xuất vaccine phòng bệnh đốm trắngcòn hạn chế và vaccine nàycòn chưa được thử nghiệm trên tôm (Jha et al., 2007; Jha et al., 2006a; Jha et al., 2006b; Mavichak et al., 2010; Sarathi et al., 2008).

Nghiên cứu này tiến hành nhằm chọn lọc được dòng nấm men thích hợp làm nguyên liệu để điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi. Đây là nghiên cứu thuộc đề tài cấp Bộ: "Bước đầu nghiên cứu, sản xuất tolerine có khả năng hạn chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long" thực hiện năm 2013-2015.


2.1. Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu chính là 150 chủng nấm men Pichia pastoris GS115 (Invitrogen) mang plasmid pPIC9K-VP28 (Invitrogen) và

03 chủng đối chứng (chủng nấm men GS115 mang plasmid pPICK9K rỗng). Các chủng nấm men này được hình thành từ 03 đợt hóa biến nạp pPICK9K-VP28 vào tế bào nấm men của đề tài cấp Bộ “Bước đầu nghiên cứu, sản xuất tolerin có khả năng hạn chế lây lan của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú nuôi thương phẩm ở Đồng bằng sông Cửu Long». Bên cạnh đó, nghiên cứu còn sử dụng một số loại trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử và nuôi cấy nấm men như máy luân nhiệt, máy quang phổ so màu, tủ ấm lắc, máy ly tâm, bộ điện di đứng, môi trường Yeast extract Peptone Dextrose (YPD), YPD- Agar, YPD- Geneticin, Minimal dextrose (MD), Minimal methanol (MM),...

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Chọn lọc dòng nấm men có kiểu hình Mut+

153 chủng P. pastoris pPIC9K-VP28 nghiên cứu sẽ được cấy 3 đợt (50 chủng thí nghiệm và 01 chủng đối chứng/đợt) lần lượt trên các môi trường MM, và MD ở 280C trong 2-3 ngày để kiểm tra khả năng sử dụng methanol. Các chủng Mut+ và MutS được phân biệt dựa vào mức độ tăng sinh của nấm men: Mut+ tăng trưởng bình thường trên cả hai môi trường MM và MD; trong khi đó, MutS chỉ tăng trưởng trên môi trường MD mà không hoặc tăng trưởng rất yếu trên môi trường MM. Các chủng có khả năng mọc tốt trên cả 2 môi trường sẽ được chọn cho nghiên cứu tiếp theo.

2.2.2. Chọn lọc dòng P. pastoris mang nhiều gen bản sao của gen mục tiêu

Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 đã chọn lọc theo 2 phương pháp trên sẽ được cấy chuyển sang môi trường YPD-Agar có bổ sung Geneticin (G418) nồng độ 0,25 mg/l; và 4 mg/ml. So sánh khả năng phát triển của các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 trên 2 môi trường này. Theo lý thuyết, dòng nấm men có khả năng mọc trên môi



trường có 0,25 mg G418 có và 4 mg G148 lần lượt có 01 và 14-16 copy gene VP28-His.

2.2.3. Chọn lọc dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp protein VP28

• Xác định dong nấm men có khả năng sinh tổng hợp protein VP28Các dòng P. pastoris pPIC9K-VP28 và đối

chứng P. pastoris pPIC9K được biểu hiện trên môi trường nuôi cấy sinh khối Buffered glycerol- complex medium (BMGY) và kích thích 2% methanol trên môi trường Buffered methanol- complex medium (BMMY) trong 72 giờ. Quy trình biểu hiện như sau: Các khuẩn lạc đơn P. pastoris pPIC9K-VP28 được tăng sinh trong 100 ml môi trường BMGY ở 280C, 250 vòng.phút-1 cho đến khi OD600 2-6. Sau đó dịch được ly tâm thu sinh khối và huyền phù trong môi trường BMMY và đo OD600 dịch đạt 1,0. Tiếp theo dịch chứa chủng được kích thích sẽ thêm methanol 100% để đạt nồng độ 2% và đem lắc ở 280C, 250 vòng.phút-1. Sau 24 giờ nuôi cấy các erlen chứa dịch được thêm methanol để đạt nồng độ cuối 2%. Sự hiện diện của protein VP28 trong xác tế bào được kiểm tra bằng SDS-PAGE và khẳng định lại bằng phương pháp Western blot với kháng thể đặc hiệu VP28 (Invitrogen, Mỹ).

Phương pháp phân tích SDS-PAGE và Western blot: Tế bào nấm men P. pastoris pPIC9K-VP28 được ly trích protein tổng số bằng cách bổ sung NaOH 0,4 M ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 – 10 phút. Sau đó dung dịch được ly tâm 14.000 vòng.phút-1 trong 1 phút để thu cặn tủa. Huyền phù cặn trong 50 µl dung dịch đệm tải mẫu (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ± 0,2; 100 mMdithiotreitol; 2% w/v SDS; 0.1% w/v bromophenol blue and 10% v/vglycerol) rồi đun sôi hỗn hợp ở 1000C trong 3 phút; cuối cùng ly tâm lấy 5-12 µl dịch nổi để điện di SDS – PAGE gel và nhuộm Coomassie Blue R-50. Để phân tích Western blot, protein đã phân tách trên bản gel SDS-PAGE được chuyển qua màng

nitrocellulose bằng máy chuyển màng semi dry với cường độ dòng điện 1mA/cm2 trong 2 giờ. Sau đó, màng được giữ ở 4°C trong dung dịch 5% (w/v) sữa gầy hòa tan trong dung dịch đệm TBS (10 mM Tris-HCl,pH 8,0 ± 0,2, 150 mM NaCl) có 0,05% Tween. Màng được rửa 03 lần bằng dung dịch TBS-T; rồi được ủ với kháng thể sơ cấp - kháng thể đa dòng kháng thỏ đặc hiệu cho protein VP28 (Genesis, #GB-10006) - trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với tỷ lệ pha loãng 1:1.000 trong 2 giờ trên máy lắc ở nhiệt độ phòng. Sau đó, màng lai được rửa 3 lần bằng TSB-T và ủ với kháng thể thứ cấp - kháng thể thỏ kháng His (Santa Cruz, #sc-803) trong 10 ml TBS/T 5% sữa gầy với tỷ lệ pha loãng 1/500 qua đêm ở 4oC. Cuối cùng, màng lai được rửa 3 lần trong TBS-T và được hiện màu bằng hỗn hợp 3,76 ml TBS/T với một phần tư viên DAB 10 mg cùng 3 µl H2O2 30% cho đến khi xuất hiện vạch protein quan tâm với độ đậm mong muốn.

• Xác định chủng nấm men cho sinh khối tốt nhấtCác chủng nấm men – kết quả chọn lọc

theo các phương pháp trên –được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường BMGY và kích thích biểu hiện protein trên môi trường BMMY trong điều kiện nồng độ methanol 2%, nhiệt độ nuôi cấy 280C và tốc độ lắc ở 150 và 250 vòng.phút-1. Mỗi chủng được nuôi cấy trong 03 erlen 500 ml khác nhau. Tốc độ sinh trưởng của các dòng nấm men được xác định bằng cách lấy 1 ml mẫu theo thời gian nuôi cấy (0, 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ) pha loãng theo cơ số 10 và cấy trang trên môi trường YPD-Agar.

• Xác định lượng protein VP28Tất cả các chủng nấm men được chọn lọc sẽ

được nuôi cấy tăng sinh trên môi trường BMGY và kích thích biểu hiện protein trên môi trường BMMY trong điều kiện nồng độ methanol 2%, nhiệt độ nuôi cấy 280C và tốc độ lắc ở 250 vòng.



phút-1. Tại 84 giờ sau kích thích biểu hiện, các chủng được thu mẫu, các mẫu thu được cân sinh khối (xác tế bào) sao cho khối lượng xác tế bào là tương đương. Các mẫu này được phân tích sự hiện diện của protein VP28 bằng phương pháp SDS-PAGE và Western-Blot, xác định độ lớn của các vạch thể hiện protein tương ứng để chọn chủng nghiên cứu tiếp theo. Sau đó, khả năng sinh protein VP28 theo thời gian của 1 chủng được chọn cũng được xác định bằng cách phân tích Western-Blot của xác tế bào trong 1 ml

dung dịch nuôi cấy theo thời gian (0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 giờ).

III. KẾT QUẢ 3.1. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris

GS115 có kiểu hình Mut+

153 khuẩn lạc được được dùng để kiểm tra kiểu hình bằng cách nuôi cấy lần lượt trên môi trường MM, MD ở 280C trong 3 ngày. Sau ba ngày nuôi cấy, thu được 125 khuẩn lạc mọc tốt trên môi trường có và không có bổ sung methanol (Bảng 1).

Bảng 1: Kết quả kiểm tra tốc độ tăng trưởng trên môi trường chứa methanol

TT Tên nhóm thí nghiệmNấm men kiểm tra

(chủng)Chủng mọc tốt trên 2 môi trường

(chủng)

1 2 (pPICK9K-VP28) 50 42

2 ĐC 2 (pPICK-9K) 1 0

3 3 (pPICK9K-VP28) 50 45

4 ĐC 3 (pPICK9K) 1 0

5 7 (pPICK9K-VP28) 50 38

6 ĐC 7 (pPICK9K) 1 0

Theo tính toán lý thuyết cấu trúc pPICK9K-VP28 được biến nạp vào nấm men sẽ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp vật chất di truyền giữa cấu trúc gen AOX1 của vector pPIC9K với AOX1 ở genome của nấm men, có thể tạo thành 2 dạng kiểu hình nấm men Mut+ và Muts. Ở kiểu hình Mut+, gen AOX1 tự nhiên của nấm men còn nguyên vẹn nên nó có thể phát triển mạnh trên môi trường có methanol do biến dưỡng methanol tốt. Ngược lại, ở kiểu hình Muts gen AOX1 bị bất hoạt làm nấm men phát triển kém trên môi trường có methanol.

3.2. Kết quả chọn lọc các dòng P. pastoris GS115 mang nhiều bản sao gen mục tiêu

Quá trình sàng lọc dòng P. pastoris có mang nhiều bản sao gen mục tiêu được thực hiện bằng cách cấy chuyển 125 khuẩn lạc sang môi trường YDP-Agar có bổ sung G418 ở các nồng độ 0,25 mg/l và 4 mg/l. Kết quả sàng lọc đã xác định được 113/125 khuẩn lạc có khả năng kháng Geneticin 418 ở nồng độ 0,25 mg/l và 82/125 khuẩn lạc có khả năng kháng G418 ở nồng độ 4 mg/l. Theo lý thuyết, 82 khuẩn lạc này có chứa 14-16 copy gene VP28-His trong genome và chúng được sử dụng để kiểm tra khả năng biểu hiện protein VP28.



Bảng 2: Kết quả sàng lọc các dòng nấm men trên môi trường có bổ sung Geneticin G418

TTTên nhóm thí

nghiệmSố khuẩn lạc

kiểm traSố khuẩn lạc kháng

0,25 mg G418/lSố khuẩn lạc kháng 4 mg

G418/l

1 2 (pPICK9K-VP28) 42 40 26

2 ĐC 2 (pPICK9K) 1 0 0

3 3 (pPICK9K-VP28) 45 42 28

4 ĐC 3 (pPICK9K) 1 0 0

5 7 (pPICK9K-VP28) 38 31 26

6 ĐC 7 (pPICK9K) 1 0 0

3.3. Kết quả chọn lọc dòng nấm men có khả năng sinh tổng hợp protein VP28• Khả năng sinh tổng hợp protein VP28

Hình 1: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 bằng SDS-PAGE (A) và Western-Blot (B)M1: Thang protein opti protein marker G252 ; M2: Thang protein Bio basic BSM0671ĐC, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143: chủng nấm men đối chứng, 11, 15, 32, 42, 57, 60, 143

82 chủng nấm men mang pPIC9K-VP28 đã qua sàng lọc và 1 chủng nấm men mang pPICK9K rỗng (đối chứng âm) được cảm ứng biểu hiện protein trên môi trường nuôi cấy sinh khối BMGY và kích thích methanol 2% trên môi trường BMMY trong 72 giờ. Sự hiện diện của protein VP28 trong xác tế bào và dịch nuôi cấy được phân tích bằng kỹ thuật SDS-PAGE và Western Blot với kháng thể đặc hiệu của VP28. Kết quả biểu hiện protein đã xác định được 55 chủng có sự hiện diện của protein VP28 bằng kỹ thuật Western Blot. Tuy nhiên, chỉ có 8 chủng: (3 chủng của nhóm 2 (1, 11, 42); 2 chủng của nhóm 3 (57, 100) và 03 chủng của nhóm 7 (126, 143, 147) cho vạch rõ ràng ở

kích thước khoảng 30 KDa bằng cả hai phương pháp phân tích SDS-PAGE và Western Blot (Hình 1); các chủng này được dùng để nghiên cứu tiếp theo.

• Xác định sinh khối của các dong nấm men

8 chủng nấm men đã qua sàng lọc và 1 chủng đối chứng được tiến hành nuôi cấy, kích thích biểu hiện protein bằng methanol 2% ở nhiệt độ 280C và tốc độ lắc 150 vòng/phút. Kết quả cho thấy, tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm men nghiên cứu khác nhau. Chủng 11 có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế bào nấm men cao nhất ở 108 giờ sau kích thích biểu hiện bằng methanol 2% (2,99*109tế bào/



Hình 2: Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm men ở tốc độ lắc 150 vòng/phút

ml), sau đó là chủng 57 (2,59*109tế bào/ml). Các chủng còn lại có tốc độ sinh trưởng chậm hơn – thời gian cho sinh khối tối đa lâu hơn – 120 giờ cho chủng 1, 132 giờ cho chủng 42, chủng 126, chủng 143; 157 giờ cho chủng 147,

và 168 giờ cho chủng 120 (Hình 2). Bên cạnh đó, mật độ tế bào nấm men thu được trong 1 ml môi trường nuôi cấy tại thời điểm sinh trưởng cao nhất của các chủng này cũng thấp hơn giá trị đạt được của chủng 11 ở 108 giờ (P<0,05).

Khi được kích thích biểu hiện protein ở tốc độ lắc cao hơn (250 vòng.phút-1), hầu hết các dòng nấm men có tốc độ sinh trưởng nhanh hơn và cho sinh khối lớn hơn (Bảng 3).

Cụ thể, tại 84 giờ sau kích thích, tất cả các chủng nghiên cứu đều cho mật độ lớn hơn 109tế bào/ml (Hình 3). Đặc biệt, chủng 11 cho sinh khối lớn nhất 3,92*109 tb/ml. Chủng 11 được chọn làm chủng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Bảng 3: Mức độ tăng trưởng tối đa của các dòng nấm men theo tốc độ lắc

Chủngnấm men

Tốc độ lắc 150 vòng/phút Tốc độ lắc 250 vòng/phút

Thời gian Mật độ (tế bào/ml) Thời gian Mật độ (tế bào/ml)

1 120 1,87*109 120 2,68*109

11 108 2,99*109 84 3,92*109

42 132 1,90*109 84 2,36*109

57 108 2,59*109 96 2,75*109

120 168 2,00*109 108 2,13*109

126 132 2,39*109 120 2,68*109

143 132 1,96*109 120 2,14*109

147 120 1,77*109 108 2,01*109



Hình 3: Tốc độ sinh trưởng của các dòng nấm men ở tốc độ lắc 250 vòng.phút-1

3.4. Khả năng sinh protein của các dòng tế bào nấm men chọn lọc

Kết quả phân tích protein trong cùng một lượng xác nấm men ở 9 mẫu chọn lọc cho thấy các chủng đều có khả năng biểu hiện protein VP28 – đều cho 1 vạch rõ ở kích thước khoảng 30 kDatrên bản gel SDS-PAGE

và Western blot (Hình 4). Kích thước vạch protein của chủng nấm men không khác nhau rõ rệt trên bản gel SDS-PAGE; song vạch thể hiện protein VP28 được quan sát thấy rõ ở các chủng 11, 42 và 147 trên bản gel Western-blot. Từ kết quả này, chủng 11 được chọn để nghiên cứu tiếp theo.

Hình 4: Phân tích sự hiện diện của protein VP28 trong 9 chủng nấm men chọn lọcM1: Thang protein Bio basic BSM0671; M2: PageRuler #26619ĐC, 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147: chủng đối chứng, chủng 1, 11, 42, 57, 120, 126, 143, 147

25kDa35kDa



Lượng protein VP28 được chủng 11 biểu hiện theo thời gian được xác định theo thời gian sau kích thích biểu hiện: 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72 và 84 giờ. Kết quả cho thấy lượng protein VP28 được tạo ra tăng dần theo thời gian kích thích; lượng protein cao nhất đạt tại 84 giờ (Hình 5).

Hình 5: Sự hiện diện của protein VP28 theo thời gian trong xác tế bào nấm men chủng 11

M: Thang PageRuler #26619ĐC: chủng đối chứng ở 84 giờ 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 chủng 11 ở các giờ 0, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 sau biểu hiện

IV. THẢO LUẬN

Việc sử dụng tế bào nấm men để sản xuất vaccine phòng bệnh cho động vật trên cạn đã được nghiên cứu rộng rãi như bệnh Gumboro trên gà (infectious bursal disease), dịch tiêu chảy cấp trên lợn (porcine epidemic diarrhea), bệnh sốt lợn cổ điển (classical swine fever), bệnh do virus viêm gan B trên người,…(Eda Celik và Pinar Calik, 2012; Rabert et al., 2013; Shin và Yoo, 2013); tuy nhiên ứng dụng này còn chưa được sử dụng nhiều trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là trong việc chế tạo vaccine phòng bệnh cho tôm nuôi. Hiện nay, mới chỉ có hai nhóm nghiên cứu sử dụng tế bào nấm men P. pastoris để dòng hóa gen mã hóa protein vỏ: VP19, VP28, VP26 (Jha et al., 2007; Jha et al., 2006a; Wang, 2009), VP37 (Liu et al., 2006), và protein PmRab7 – a shrimp WSSV-binding protein - (Jupatanakul et al., 2010) trong phòng bệnh đốm trắng cho crayfish và tôm nuôi.

Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protein vỏ VP 28 đã được dòng hóa vào tế bào nấm men và việc sàng lọc 150 chủng nấm men từ 03 đợt dòng hóa khác nhau đã cho 9 chủng có biểu hiện protein VP28 tốt trong tế bào. Chín chủng này đều cho vạch protein đặc hiệu cho VP28 ở khoảng 30 kDa trên bản gel SDS-PAGE và Western-blot. Kết quả này tương tự như kết quả của Wang (2009) khi tác giả đã xác định được vạch khoảng 30 kDa trên bản gel của các dòng nấm men P.pastoris có chứa gen mã hóa protein vỏ VP28. Trong khi đó Jha et al., (2007) lại xác định được vạch ở vị trí 35 kDa trên bản gel phân tách protein của SDS-PAGE và Western-blot. Sự khác biệt về giá trị trọng lượng thực của protein (28 kDa) và giá trị được xác định (30 kDa, hoặc 35 kDa) có thể do việc gắn thêm các nucleotide mã hóa các axit amin của histaq hoặc do quá trình đường hóa (glycosylation) hay phospo hóa (phosphorylation) – những hiện tượng thường gặp khi sử dụng tế bào nấm men làm hệ thống biểu hiện.

Kết quả biểu hiện protein của các chủng nấm men chọn lọc đã cho thấy chủng 11 có tốc độ sinh trưởng nhanh nhất, cho mật độ tế bào lớn trong thời gian ngắn. Cụ thể, ở điều kiện 280C, nồng độ methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 vòng.phút-1, chủng nấm men 11, nuôi cấy trong erlen 500 ml đạt mật độ tế bào tối đa tại 84 giờ sau kích thích biểu hiện. Trong các trường hợp nuôi cấy trong nồi lên men ở tốc độ khuấy tương tự (250 vòng/phút), tốc độ sinh trưởng của nấm men nhanh hơn, đạt mật độ tế bào tối đa ở 72 giờ (Asada et al., 2011; Cai et al., 2014). Trong phần lớn các nghiên cứu về tốc độ sinh trưởng của nấm men, tốc độ sinh trưởng của nấm men được tính toán dựa trên giá trị OD600 của dung dịch nuôi cấy theo thời gian; trong nghiên cứu này giá trị OD600 của các chủng cũng được xác định (không trình bày trong bài) nhưng không tìm thấy sự sai khác giữa các chủng nghiên cứu,



vì vậy tốc độ tăng trưởng được xác định bằng cách đếm trực tiếp khuẩn lạc nấm men thông qua phương pháp trang đĩa dịch nuôi cấy ở các nồng độ pha loãng khác nhau. Hơn thế nữa, phần lớn các tài liệu đều xác định việc tăng trưởng của chủng nấm men sau dòng hóa trong điều kiện sử dụng nồi lên men trong khi nghiên cưu này được tiến hành trên erlen 500 ml nên một số yếu tố môi trường như pH, nồng độ methanol, hàm lượng oxy… không được kiểm soát chặt chẽ, do đó có thể làm ảnh hưởng đến mật độ tế bào cũng như làm giảm khả năng biểu hiện protein của dòng nấm men. Đó có thể là các lý do khiến mật độ tế bào nấm men cao nhất mà nghiên cứu này tìm được (3,92x109 tế bào/ml) khác với mật độ nấm men ở các nghiên cứu khác – như 2,4 x 109 tế bào/ml với chủng nấm men chứa gen quy định protein CHRM2 (Asada et al., 2011).

Theo các nhà nghiên cứu, ngoài tốc độ lắc, nhiều yếu tố khác nữa có thể ảnh hưởng đến việc biểu hiện protein ở nấm men P. pastoris như pH, nhiệt độ, nồng độ methanol, thành phần trung

bình hoặc các chất phụ gia (axit casamino, sorbitol, EDTA),… (Peng et al., 2011; Rabert et al., 2013; Shi et al., 2003). Song, trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, các nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố này đến khả năng lên men của chủng nấm men chọn lọc còn chưa được thực hiện.

KẾT LUẬNChủng nấm men P. pastoris GS115 số 11

có tốc độ sinh trưởng nhanh cho 3,92x109 tế bào/ml sau 84 giờ kích thích biểu hiện ở điều kiện lên men trong bình lắc ở 280C, nồng độ methanol bổ sung 2%, tốc độ lắc 250 vòng/phút đã được chọn lọc từ 150 chủng nấm men sau dòng hóa. Đây cũng là chủng có khả năng biểu hiện protein VP28 tốt nhất – kết quả chạy điện di phân tách protein trên SDS-PAGE và kết quả phân tích Western-blot bằng kháng thể đặc hiệu của VP28 cho vạch rõ ở khoảng 30 kDa. Chủng này được chọn làm nguyên liệu điều chế vaccine/tolerine phòng bệnh đốm trắng cho tôm nuôi.


Asada, H., Uemura, T., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Shimamura, T., Tsujimoto, H., Ito, K., Sugawara, T., Nakane, T., Nomura, N., Murata, T., Haga, T., Iwata, S., Kobayashi, T., 2011. Evaluation of the Pichia pastoris expression system for the production of GPCRs for structural analysis. Microbial Cell Factories 10.

Balamurugan, V., Reddy, G.R., Suryanarayana, V.V.S., 2007. Pichia pastoris: A notable heterologous expression system for the production offoreign proteins—Vaccines Indian J. Biotechnol. 6, 175-186

Cai, F., Li, T., Xie, Y., He, X., 2014. Expression of functional single-chain variable domain fragment (scFv) antibody against Metolcarb in Pichia pastoris. Annals of Microbiology 64, 589-597.

Caipang, C.M.A., Verjan, N., Ooi, E.L., Kondo, H., Hirono, I., Aoki, T., Kiyono, H., Yuki, Y., 2008. Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus) japonicus from white spot syndrome disease after oral administration of recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis. Fish & Shellfish Immunology 25, 315-320.

Eda Celik, Pinar Calik, 2012. Production of recombinant proteins by yeast cells. Biotechnology Advances 30, 1108-1118.

Fu, L.L., Wang, Y.B., Wu, Z.C., Li, W.F., 2011. In vivo assessment for oral delivery of Bacillus subtilis harboring a viral protein (VP28) against white spot syndrome virus in Litopenaeus vannamei. Aquaculture 322, 33-38.



Hansson, M., Nygren, P., Stahl, S., 2000. Design and production of recombinant sub-unit vaccines. Biotechnology and Applied Biochemistry 32, 95-107.

Jha, R.K., Xu, Z.R., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, W.F., Shen, J., 2007. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant oral vaccine expressed in Pichia pastoris. Fish & Shellfish Immunology 22, 295-307.

Jha, R.K., Xu, Z.R., Pandey, A., 2006a. Protection of Procambarus clarkii against white spot syndrome virus using recombinant subunit injection vaccine expressed in Pichia pastoris. Fisheries Science 72, 1011-1019.

Jha, R.K., Xu, Z.R., Shen, J., Bai, S.J., Sun, J.Y., Li, W.F., 2006b. The efficacy of recombinant vaccines against white spot syndrome virus in Procambarus clarkii. Immunology Letters 105, 68-76.

Jupatanakul, N., Wannapapho, W., Eurwilaichitr, L., Flegel, T.W., Sritunyalucksana, K., 2010. Cloning and expression of recombinant shrimp PmRab7 (a virus-binding protein) in Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 76, 1-6.

Kim, C.S., Kosuke, Z., Nam, Y.K., Kim, S.K., Kim, K.H., 2007. Protection of shrimp (Penaeus chinensis) against white spot syndrome virus (WSSV) challenge by double-stranded RNA. Fish & Shellfish Immunology 23, 242-246.

Kumar, S.R., Ahamed, V.P.I., Sarathi, M., Basha, A.N., Hameed, A.S.S., 2008. Immunological responses of Penaeus monodon to DNA vaccine and its efficacy to protect shrimp against white spot syndrome virus (WSSV). Fish & Shellfish Immunology 24, 467-478.

Li, P., Anumanthan, A., Gao, X.G., Ilangovan, K., Suzara, V.V., Duzgunes, N., Renugopalakrishnan, V., 2007. Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol 142, 105-124.

Liu, Q.H., Huang, J., Han, W.J., Liang, Y., Lu, C.L., Wang, Q.Y., 2006. Expression, purification and characterization of WSSV-VP37 in Pichia pastoris. Aquaculture 258, 55-62.

Mavichak, R., Takano, T., Kondo, H., Hirono, I., Wada, S., Hatai, K., Inagawa, H., Takahashi, Y., Yoshimura, T., Kiyono, H., Yuki, Y., Aoki, T., 2010. The effect of liposome-coated recombinant protein VP28 against white spot syndrome virus in kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicus. Journal of Fish Diseases 33, 69-74.

Namikoshi, A., Wu, J.L., Yamashita, T., Nishizawa, T., Nishioka, T., Arimoto, M., Muroga, K., 2004. Vaccination trials with Penaeus japonicus to induce resistance to white spot syndrome virus. Aquaculture 229, 25-35.

Ning, D., Leng, X., Li, Q., Xu, W., 2011. Surface-displayed VP28 on Bacillus subtilis spores induce protection against white spot syndrome virus in crayfish by oral administration. J. Appl. Microbiol. 111, 1327-1336.

Peng, H., Liu, H.P., Chen, B., Hao, H., Wang, K.J., 2011. Optimized production of scygonadin in Pichia pastoris and analysis of its antimicrobial and antiviral activities. Protein Expr. Purif. 82, 37-44.

Rabert, C., Weinacker, D., Pessoa Jr, A., FarÃas, J.G., 2013. Recombinants proteins for industrial uses: Utilization of Pichia pastoris expression system. Braz. J. Microbiol. 44, 351-356.

Rout, N., Kumar, S., Jaganmohan, S., Murugan, V., 2007. DNA vaccines encoding viral envelope proteins confer protective immunity against WSSV in black tiger shrimp. Vaccine 25, 2778-2786.

Musthaq S Syed, Jimmy Kwang., 2011. Oral Vaccination of Baculovirus-Expressed VP28 Displays Enhanced Protection against White Spot Syndrome Virus in Penaeus monodon. PLoS ONE 6.

Sarathi, M., Simon, M.C., Venkatesan, C., Hameed, A.S.S., 2008. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Marine Biotechnology 10, 242-249.

Satoh, J., Kim, H.J., Matsui, T., Nishizawa, T., Optimization of WSSV rVP Expression in E.



coli Cells and Minimum Dose of rVPs for Oral Vaccination in Kuruma Shrimp. Fish Pathology 45, 169-174.

Shi, X., Karkut, T., Chamankhah, M., Alting-Mees, M., Hemmingsen, S.M., Hegedus, D., 2003. Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody (scFv) gene in Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 28, 321-330.

Shin, M.K., Yoo, H.S., 2013. Animal vaccines based on orally presented yeast recombinants. Vaccine 31, 4287-4292.

Singh, I.S.B., Manjusha, M., Pai, S.S., Philip, R., 2005. Fenneropenaeus indicus is protected from white spot disease by oral administration of inactivated white spot syndrome virus. Diseases of Aquatic Organisms 66, 265-270.

Wang, L., 2009. Cloning of Envelope Protein Genes vp26 and vp28 of Shrimp White Spot Syndrome

Virus (WSSV) and the Expressions in Pichia Pastoris. Master’s thesis, Jimei University. China.

Witteveldt, J., Cifuentes, C.C., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2004a. Protection of Penaeus monodon against white spot syndrome virus by oral vaccination. Journal of Virology 78, 2057-2061.

Witteveldt, J., Vlak, J.A., Van Hulten, M.C.W., 2004b. Protection of penaeus monodon against white spot syndrome virus using a WSSV subunit vaccine. Fish & Shellfish Immunology 16, 571-579.

Witteveldt, J., Vlak, J.M., van Hulten, M.C.W., 2006. Increased tolerance of Litopenaeus vannamei to white spot syndrome virus (WSSV) infection after oral application of the viral envelope protein VP28. Diseases of Aquatic Organisms 70, 167-170.



1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research,Research Institute for Aquaculture No 2. * Email: [email protected]

scReening sUiTable Pichia PasToRis sTRains caRRied VP28 gene To PRodUce ToleRine againsT WhiTe sPoT disease in shRimP

Ngo Thi Ngoc Thuy1*, Dang Thi Tra My1

ABSTRACTThe use of Pichia pastoris as the expression system to produce recombinant proteins for disease prevention in inverterbrate has been published widely; however, it has been limited used in aqua-culture, especially in preventation of shrimp diseases. This study is aimed to find a suitable strain from 150 strains of P. pastoris carrying pPick9K-VP28 vectors to produce tolerine against white spot disease in shrimp. Those strains were screened based on the phenotype (Mut+), copy number of VP 28 gene, the ability to express VP28 protein and growth rate of yeast strains. The selection process figured 125 strains of phenotype Mut+, in which, 82 strains have got 14-16 copy gene of VP28-His in genome. Further screening showed that recombinant VP28 protein was well expressed in 8 P.pastoris strains; the expressing protein was given a clear specific band of about 30kDa on SDS-PAGE gel and Western-blot cellulose membrane. Finally, one strain – strain 11 – revealed quick growth with the highest cell density of 3.92 x 109cfu/ml at 84 hours post stimulation and ef-fectively expressed rVP28 the protein was selected to produce tolerine against white spot disease in future studies.

Keywords: VP28, Pichia pastoris, White spot disease.

Người phản biện: TS. Lê Hồng Phước






1 Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản Khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected] 2 Trung tâm Quốc gia giống thủy sản nước ngọt khu vực Nam bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2.

KhẢo sáT, PhÂn lẬP VÀ lỰa chỌn chỦng Vi KhUẨn Edwardsiella ictaluri cÓ ĐỘc lỰc mẠnh VÀ mỚi nhẤT.

Lê Hồng Phước1*, Nguyễn Thị Hiền1, Nguyễn Hồng Lộc1, Võ Hồng Phượng1, Trịnh Quốc Trọng2

TÓM TẮTTừ 50 mẫu cá có biểu hiện bệnh gan thận mủ thu được ở các tỉnh ĐBSCL từ tháng 03/2010 đến tháng 05/2013, nhóm nghiên cứu đã phân lập được bốn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri I, II, III, IV có khả năng gây bệnh thực nghiệm trên cá tra. Qua khảo sát độc lực của bốn chủng vi khuẩn, chủng Edwardsiella ictaluri I và IV có độc lực cao gấp đôi so với 2 chủng còn lại với LD50 khoảng 2x104 CFU/0,2 ml/cá. Với liều tiêm 106 CFU/cá, cá bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm, chủng E. ictaluri I gây chết sớm nhất và cho tỉ lệ chết cao nhất (99%) so với các chủng vi khuẩn còn lại. Chủng III có tỉ lệ chết thấp nhất. Ở liều tiêm 105 CFU/cá, cá chết bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi tiêm và tập trung nhiều nhất vào các ngày 3, 4 & 5 sau khi tiêm. So với các chủng vi khuẩn khác thì chủng I cho tỷ lệ chết cao nhất (85%) và sớm nhất. Ở liều tiêm thấp nhất 104 CFU/cá, cá bắt đầu chết vào ngày thứ 4 và chết tập trung từ ngày 4-6 sau khi tiêm. Trong số các chủng vi khuẩn thử nghiệm có chủng IV cho tỷ lệ chết cao nhất (50%) và chủng I gây chết sớm hơn so với các chủng còn lại. Kết quả này cho thấy, vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra gồm nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhau tuy nhiên sự khác biệt này là không đáng kể.

Từ khóa: vi khuẩn, gây nhiễm, tiêm.


Trong những năm gần đây, ngoài việc mở rộng diện tích nuôi trồng thủy sản thì việc đa dạng hóa các đối tượng nuôi cũng được quan tâm đáng kể. Nhiều đối tượng nuôi thích ứng với các vùng địa lý khác nhau đã được nghiên cứu và phát triển. Trong đó, cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) được xem là đối tượng nuôi chủ lực của cả nước và tập trung phát triển nuôi chủ yếu ở khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. Với điều kiện thích hợp, một số tỉnh đã và đang có diện tích và sản lượng cá tra khá lớn như Đồng Tháp, Tiền Giang, Bến Tre, An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long và Hậu Giang. Tuy nhiên,

tình hình nuôi cá tra vẫn gặp nhiều khó khăn do các vấn đề về dịch bệnh cũng như về giá cả và thị trường tiêu thụ. Nghiên cứu cho thấy, ở cá tra thường xuất hiện các loại bệnh như gan thận mủ, xuất huyết, phù đầu, trắng gan, trắng mang và ký sinh trùng. Trong đó, bệnh gan thận mủ được xem là một trong những bệnh thường xuất hiện và nguy hiểm nhất. Theo báo cáo của Cục Thú Y, trong năm 2013 các loại dịch bệnh trên cá tra đã xảy ra tại 71 xã thuộc 21 huyện của 6 tỉnh nuôi cá tra tập trung ở ĐBSCL với tổng diện tích ao cá có cá nhiễm bệnh là 732,1 ha trong đó bệnh gan thận mủ chiếm tỷ lệ cao nhất (48%). Bệnh gan thận mủ trên cá tra đã được



xác định là do tác nhân vi khuẩn E. ictaluri (Crumlish và ctv., 2002) gây ra. Loài vi khuẩn này thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacte-riaceae. E. Ictaluri, phần lớn được biết đến như là tác nhân gây bệnh xuất huyết nội tạng (En-teric septicaemia of catfish- ESC) trên cá nheo (Ictalurus punctatus) ở Mỹ (OIE, 2006). Cho đến nay, các nghiên cứu liên quan đến tác nhân này trên cá tra này rất được quan tâm như các nghiên cứu về đặc tính sinh hóa, di truyền, dịch tễ và độc lực. Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát, phân lập và lựa chọn chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri có độc lực mạnh và mới nhất, với mục tiêu là tìm ra những chủng E. ictaluri có độc lực cao làm tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn như sản xuất vắc-xin hay nghiên cứu chọn giống cá tra kháng bệnh gan thận mủ.


2.1. Vật liệu

2.1.1 Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập E. ictaluri

Mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập vi khuẩn là gan, thận cá tra bệnh gan thận mủ, cá bệnh được thu làm nhiều đợt từ tháng 03/2010 đến 05/2013 (Bảng 1)

Bảng 1. Thông tin mẫu bệnh phẩm dùng để phân lập E. ictaluri

Đợt thu Thời gian Số lượng

mẫu Cỡ cá Địa điểm

Đợt 1 03/201014 20-25 g An

Giang16 >40 g

Đợt 2 05/2012 6 20-25 g Bến Tre

Đợt 3 01/2013 10 20-25 g Tiền Giang

Đợt 4 05/2013 4 25-30 g Tiền Giang

2.1.2 Cá tra thí nghiệm

Cá tra thí nghiệm có trọng lượng từ 20 đến 25 g/con. Cá thí nghiệm khỏe mạnh, không bị nhiễm vi khuẩn E. ictaluri. Cá được chuyển về phòng thí nghiệm ướt thuần dưỡng trong 2-3 tuần. Sau đó, cá được chuyển vào bể kính từ 7-10 ngày, kiểm tra sự hiện diện của E. ictaluri ở gan, thận, lách cá trên môi trường thạch máu trước khi tiến hành thí nghiệm.

2.1.3 Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn

Môi trường dùng để phân lập vi khuẩn là môi trường thạch máu cơ bản có bổ sung 5% máu cừu. Các môi trường khác dùng để tăng sinh vi khuẩn bao gồm môi trường Brain Heart Infusion Broth (BHIB) hoặc Nutrient Broth (NB). Môi trường thạch được chuẩn bị bằng cách dùng môi trường lỏng thêm vào 15 g Agar cho mỗi lít môi trường.

2.1.4 Hóa chất khác

Cồn 70%, cồn 90%, dung dịch đệm pH 7, nước muối 0,85% NaCl, thuốc tím, Chlorine, dung dịch Formaline (Merck) để bất hoạt vi khuẩn, thuốc gây mê cho cá EGME - C2H10O2 (Merck, Đức),…

2.1.5 Dụng cụ thí nghiệm

Máy trộn mẫu, máy quang phổ đo OD, tủ ấm, tủ cấy vi sinh, tủ lắc ổn nhiệt, tủ mát 40C, tủ lạnh âm 20oC, âm 70oC, máy ly tâm lạnh, cân điện tử, kim tiêm 1ml, kim tiêm tự động, ống nghiệm, eppendorf, đĩa petri, bể composite 1m3, bể kính (80 lít).


2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Thu mẫu cá tra có biểu hiện bệnh tích điển hình của bệnh gan thận mủ (đốm trắng mủ trên gan - thận). Tiến hành thu mẫu cá bệnh khi dịch bệnh bùng phát và thu tối thiểu 3-5 mẫu/ao, thu cá bệnh nặng sắp chết hoặc cá sống nhưng có



dấu hiệu lâm sàng điển hình. Thu các mẫu cơ quan nội tạng cá, cho vào eppendorf trong điều kiện vô trùng và bảo quản lạnh (4oC). Mẫu thu chuyển đến phòng thí nghiệm càng sớm càng tốt để tiến hành phân lập và định danh.

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy, phân lập và định danh vi khuẩn

Dùng các môi trường: Blood agar, Brain-Heart Infusion Agar để phân lập vi khuẩn. Sử dụng test kit API 20E để test sinh hóa và định danh vi khuẩn theo khóa phân loại Bergey (1996). Ngoài ra còn xác định E. ictaluri bằng phương pháp PCR. Sử dụng cặp mồi EiFd-1 (5’- GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC-3’), EiRs-1 (5’- GAACGCTATTAACGCTCACACC-3’) để khuếch đại đoạn trình tự dài 407 bp thuộc gen 16S rRNA, đặc hiệu cho loài vi khuẩn E. ictaluri (Panangala và ctv., 2007).

2.2.3 Phương pháp tách nucleic acid của vi khuẩn

Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cho vào 1ml nước cất vô trùng, hòa đều, ly tâm 10 phút với tốc độ 13.000 g, bỏ dịch nổi. Cặn được huyền phù với 500 µl dịch đệm ly trích DNA (50 mM Tris, pH 8; 1 mM EDTA, pH 8; 500 mM NaCl; 1% SDS và 10 µg/ml Proteinase K), ủ ở 100°C trong 10 phút, để nguội sau đó ly tâm 13.000 g trong 5 phút. Tủa dịch nổi bằng 2 thể tích cồn tuyệt đối, ly tâm ở 13.000 g trong 10 phút thu tủa DNA. Loại bỏ dịch nổi và để tủa DNA khô tự nhiên, hòa tan tủa DNA bằng nước cất vô trùng và giữ ở -20°C.

2.2.4 Phương pháp xác định LD50

Xác định mật độ vi khuẩn tương đối của canh trùng gốc thông qua giá trị OD550nm và đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Tiến hành pha loãng canh trùng gốc này để được dãy mật độ vi khuẩn sao cho khi tiêm vào cá với các liều 104, 105, 106 CFU/0,2 ml/cá. Mỗi nồng độ tiêm cho 20 cá. Theo dõi tỷ

lệ sống chết trong mỗi nồng độ pha loãng rồi tính liều LD50 theo Reed-Muench (1938).

2.2.5 Phương pháp gây bệnh thực nghiệm

Chuẩn bị vi khuẩn: Vi khuẩn E.ictaluri được lấy từ ống giữ giống (âm 70°C) và cấy trên môi trường thạch máu (BA) ủ ở nhiệt độ 28°C trong thời gian 24 giờ sau đó tiếp tục đưa vi khuẩn này vào môi trường BHIB (pH 7, nhiệt độ 28°C nuôi lắc 200 vòng/phút) với mật độ 103 CFU/ml tăng sinh trong thời gian 24 giờ và sau đó đo mật độ OD550nm xác định mật độ tế bào trước khi công vào cá tra với liều 0,2 ml dịch vi khuẩn/cá.

Gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp tiêm: Gây mê cá thí nghiệm bằng EGME (Ethylene Glycol Monophenyl Ether, Merck) 0,2 ppt (1 ml EGME trong 5 lít nước) trong 3-5 phút. Sử dụng kim tiêm bán tự động (Socorex) với chiều dài mũi kim tiêm 4 mm được dùng cho cá 10-40 g để đảm bảo an toàn cho cá thí nghiệm. Mũi kim tiêm đi vào xoang bụng cá ở vị trí giữa hai vây bụng cá tra và chếch một góc 45°.

2.2.6 Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn

Tại các thời điểm thu mẫu kiểm tra OD550nm, canh khuẩn cũng được pha loãng theo hệ số 10 và tiến hành cấy trên đĩa thạch để xác định mật độ vi khuẩn. Sau khi pha loãng dùng micropipette hút 0,1 ml cho vào đĩa thạch NA. Tương ứng với mỗi độ pha loãng cấy 2 đĩa. Dùng que cấy chang đều canh khuẩn trên mặt thạch sau đó cho vào tủ ấm 28ºC và tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc sau 36h nuôi cấy, tính mật độ vi khuẩn theo công thức:

A (tế bào/ml) = (a + b)/2 x 10 x DTrong đó: A là mật độ vi khuẩn (tế bào/ml)a, b là số khuẩn lạc mọc trên đĩa 1 và đĩa 2

ứng với độ pha loãng đã được xác định.D = độ pha loãng



2.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát độc lực của vi khuẩn

Mục đích của thí nghiệm này là để so sánh độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập được . Thí nghiệm được bố trí trên bể kính. Mỗi bể kính chứa 20 cá có trọng lượng trung bình là 20 g. Cá thí nghiệm được tiêm canh khuẩn với liều 104, 105 và 106 CFU/0,2 ml/cá. Cá đối chứng được tiêm với nước muối sinh lý. Mỗi nghiệm thức thí nghiệm được lập lai 3 lần. Sau khi tiêm, cá được bố trí vào các bể kính và cho nhịn đói trong vòng 6 giờ. Sau đó, cá được cho ăn bình thường. Theo dõi cá chết hàng ngày sau khi tiêm và kết thúc thí nghiệm sau 2 tuần.

Thu mẫu cá chết ở mỗi bể vào các ngày cá chết tập trung, thu ngẫu nhiên mỗi cá/bể cho phân tích vi khuẩn kiểm tra tác nhân gây bệnh.

III. KẾT QUẢ3.1. Kết quả phân lập, định danh vi

khuẩn từ mẫu cá tra bệnh Kết quả phân lập E. ictaluri qua 4 đợt thu

mẫu thu được 04 chủng E. ictaluri I, II, III và IV. Kết quả kiểm tra sinh hóa từ 4 chủng vi khuẩn này được trình bày ở bảng 2. Các chủng E. ictaluri này đều gây tan huyết trên môi trường thạch máu, khuẩn lạc nhìn rõ sau 36-48 giờ cấy trên đĩa thạch (Hình 1) và khi nhuộm Gram cho thấy vi khuẩn có dạng trực khuẩn Gram âm.

Bảng 2. Kết quả kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn E. ictaluri

Phản ứngChủng vi khuẩn

E. ictaluri I E. ictaluri II E. ictaluri III E. ictaluri IVONPG + + + -ADH - - - -LDC - + + +ODC - - - -CIT + + + dH2S - - - -URE - - - -TDA - - - -VP + + + d

GEL + + + -GLU + + + +MAN - d d -INO - - - -SOR - - - -RHA - - - -SAC - d d -MEL + - - -AMY - d d -ARA + d d -NIT + + + -O/F +/+ +/+ +/+ +/+LAC + + + +NO3 + + + +

ESCULIN + + + -

Ghi chú: (-): âm tính, (+) dương tính, d: dương tính không rõ.



Hình 1. Các chủng vi khuẩn E. ictaluri I, II, II, IV trên môi trường thạch máu

Kết quả kiểm tra bằng PCR 16S rRNA của E. ictaluri (Panangala và cvt., 2007) cho thấy cả 4 chủng E. ictaluri cho sản phẩm khuếch đại có kích thước 407 bp, tương ứng với chủng chuẩn E. ictaluri LMG7860 (Hình 2).

Hình 2. Điện di sản phẩm PCR. M: DNA 100bp plus (ABM, Canada), chứng âm (-) sử

dụng nước cất, chứng dương (+) DNA vi khuẩn E. ictaluri LMG7860 (Đại học Ghent, Bỉ)

3.2. Kết quả khảo sát độc lực của các chủng vi khuẩn E. ictaluri

Ở thí nghiệm này, với liều tiêm 106 CFU/cá, cá bắt đầu chết sau 2 ngày tiêm. Chủng E. ictaluri I cho tỷ lệ chết sớm nhất và cao nhất so với các chủng vi khuẩn còn lại (Đồ thị 1). Chủng E. ictaluri III cho tỉ lệ chết thấp có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với các chủng còn lại (phương pháp Ducan).

Ở liều tiêm 105 CFU/cá cho tỷ lệ chết chậm hơn, cá chết bắt đầu từ ngày thứ 3 sau khi tiêm và tập trung nhiều nhất vào các ngày 3, 4 & 5 sau khi tiêm. So với các chủng vi khuẩn khác thì chủng I cho tỷ lệ chết cao nhất và sớm nhất so với các chủng còn lại (Đồ thị 2), tuy nhiên không khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) khi sử dụng phương pháp thống kê Duncan.

Đồ thị 1. Tỷ lệ chết cộng đồn trên cá tra sau khi gây nhiễm với 04 chủng Edwardsiella ictaluri liều 106 CFU/cá




Ở liều gây nhiễm 104 CFU/cá, cá bắt đầu chết vào ngày thứ 4 và chết tập trung từ ngày 4-6 sau khi tiêm. Trong số các chủng vi khuẩn thử nghiệm có chủng IV cho tỷ lệ chết cao nhất (50%) so với các chủng còn lại và chủng I cho tỷ lệ chết sớm hơn so với các chủng còn lại. Tỉ

lệ chết giữa các chủng E. ictaluri cũng không cho khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) khi dùng so sánh Duncan (Đồ thị 3).

Kết quả kiểm tra LD50 của các chủng vi khuẩn thử nghiệm cho thấy độc lực nằm trong khoảng 1,9-3,8 x104 (CFU/0,2 ml/cá) (Bảng 3).




Bảng 3. Giá trị LD50 của các chủng E. ictaluri

Chủng vi khuẩn LD50

Edwardsiella ictaluri I 1,9 x104 (CFU/0,2 ml/cá)

Edwardsiella ictaluri II 3,8 x104 (CFU/0,2 ml/cá)

Edwardsiella ictaluri III 3,4 x104 (CFU/0,2 ml/cá)

Edwardsiella ictaluri IV 2 x104 (CFU/0,2 ml/cá)

Ngoài ra, khi kiểm tra cá chết sau khi gây bệnh thực nghiệm bằng cách thu ngẫu nhiên mỗi bể một con để cấy vi khuẩn từ thận cá lên môi trường BA, kết quả sau 48 giờ cấy ủ ở 30°C chỉ có thuần một loại vi khuẩn E. ictaluri với kiểu tan huyết đặc trưng trên BA.

IV. THẢO LUẬN

Theo mô tả của Austin (2007), E. ictaluri có thể được phân lập từ thận, gan, lách, não và các vết thương trên da hay cơ của cá trên môi trường BHIA, thạch máu hay môi trường chọn lọc đối với E. ictaluri (EIM). Sau khi ủ ở 26°C trong 48 giờ, các khuẩn lạc của E. ictaluri có dạng tròn bóng, đường kính khoảng 2 mm, hơi cong, vành đầy đặn và không có sắc tố. Khi kiểm tra các đặc tính sinh hóa thì E. Ictaluri được xác đinh là vi khuẩn Gram âm, hình que, lên men và di chuyển bằng lông mao. E. Ictaluri có khả năng sản xuất các enzyme như catala-se, P-galactosidase, lysine và ornithine decar-boxylase nhưng không tạo H2S, indole, oxida-se hay phenylalanine deaminase (Waltman và ctv., 1986). Qua phân tích 119 chủng E. ictaluri thu trong suốt 7 năm ở các bang của Mỹ, cho thấy các chủng này có độ tương đồng về đặc tính sinh hóa rất cao. Tất cả các chủng đều có khả năng phân hủy chondroitin sulfate, là thành phần chính của sụn, đây có thể là một yếu tố gây độc quan trọng trong việc hình thành nên tổn thương lỗ trên đầu đặc trưng của cá bệnh

(Waltman và ctv., 1986; Cooper và ctv., 1996). Sự khác biệt về kiểu gene của 20 chủng E. ic-taluri, 19 chủng thu từ cá nheo Mỹ và 1 chủng thu từ cá trê (Clarias batrachus) ở Thái Lan có đặc tính sinh hóa giống nhau, xác định bằng kỹ thuật arbitrary primed PCR (AP-PCR) kết hợp với mồi phát hiện vùng bảo tồn nằm trong vùng lặp lại của vi khuẩn đường ruột (ERIC II) cho thấy vi khuẩn này gồm 4 nhóm dưới loài (Ba-der và ctv., 1998). Trong nghiên cứu này, cả bốn chủng mà chúng tôi phân lập đươc đều cho phản ứng dương tính với Citrate và VP. Kết quả này tương ứng với nghiên cứu của Thy và ctv., 2008 khi phân lập E. ictaluri từ cá tra Việt Nam ở 5 tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long và Bến Tre nhưng lại khác với mô tả của Hawke (1979) (Citrate và VP âm tính với E. ictaluri). Ngoài ra, bốn chủng E. ictaluri phân lập được cũng cho phản ứng dương tính với Lysine, âm tính với Arginine giống với các đặc tính của E. ictaluri mà Hawke (1979) mô tả. Cũng theo Hawke các phản ứng đường hầu hết là âm tính. Tuy nhiên, trong nghiên cứu này, một vài chủng cho dương tính nhẹ với amylase, arabinose và manitol. Sự khác biệt về một vài phản ứng sinh hóa này có thể là do sự khác biệt về các chủng vi khuẩn được phân lập từ các vùng địa lý khác nhau và sự biến chủng của vi khuẩn trong quá trình gây bệnh.

Ngoài ra, nghiên cứu này đã gây bệnh thành công trên cá tra bằng 04 chủng E. ictaluri I, II, III, IV đã phân lập được. Cá được gây bệnh có biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngoài tự nhiên như màu sắc cá nhợt nhạt, mắt lồi, đôi khi xuất huyết bên ngoài cơ thể ở các gốc vây, quanh mắt, miệng, đuôi, hậu môn. Bên trong cơ thể có vô số đốm trắng với kích thước khác nhau từ 1-3 mm xuất hiện đầu tiên trên thận, sau đó đến lách và gan.

Qua khảo sát về độc lực của 4 chủng E. ictaluri phân lập được có thể thấy rằng vi



khuẩn gây bệnh gan thận mủ trên cá tra gồm nhiều chủng có độc lực cao thấp khác nhau, tuy nhiên sự khác biệt này là không đáng kể. Nếu xét về thời gian thì chủng E. ictaluri I gây chết cá sớm hơn các chủng còn lại (cá bắt đầu chết từ ngày thứ 2 sau khi tiêm vi khuẩn) và nếu xét về LD50 thì chủng này cũng có giá trị thấp nhất mặc dù sự khác biệt với các chủng khác không có ý nghĩa thống kê (1,9 x104 CFU/0,2 ml/cá). Theo giá trị LD50, hai chủng E. ictaluri I và IV có độc lực tương đương nhau khoảng 2x104 CFU/0.2 ml/cá và cao hơn gần hai lần so với hai chủng E. ictaluri còn lại. Kết quả này khá tương đồng với các nghiên cứu khác ở Việt Nam. Như nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., (2009) khi kiểm tra độc lực của 9 chủng vi khuẩn E. ictaluri cũng cho thấy các chủng có độc lực cao thấp khác nhau. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quốc Bình và ctv., (2010) cho thấy E. iclaturi có LD50 khoảng từ

104-105 CFU/cá. Nguyễn Hữu Thịnh và ctv., (2009) nghiên cứu gây bệnh thực nghiệm bằng phương pháp tiêm với liều tiêm từ dãy nồng độ 5,5 x103 đến 5,5 x 106 (mỗi nồng độ pha loãng 10 lần) cho tỷ lệ chết từ 93-99,3% và đối với gây bệnh bằng phương pháp ngâm cho tỷ lệ chết 66% ở liều 5,5 x 106 CFU/ml.

V. KẾT LUẬN

Trong năm 2012 và 2013 nhóm nghiên cứu đã cập nhật được 04 chủng vi khuẩn E. ictaluri I, II, III, IV từ cá tra bệnh gan thận mủ thu tại các tỉnh thuộc Đồng bằng sông Cửu long. Các chủng vi khuẩn này có khả năng gây bệnh trên cá tra với biểu hiện bệnh lý giống cá bệnh ngoài tự nhiên. Đồng thời, nhóm cũng đã xác định được độc lực của các chủng E. ictaluri này. Trong đó, chủng E. ictaluri I và IV có độc lực cao hơn gần hai lần so với hai chủng E. ictaluri II và III.



Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2009. Độc lực của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phân lập từ cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bệnh mủ gan, Hội thảo nghiên cứu tác nhân gây bệnh gan thận mủ ở cá tra 11/08/2009.

Nguyễn Quốc Bình, Nguyễn Trọng Bình, Vũ thị Thanh Hương, Dương Vân Anh, Trần Hạnh Triết, Trần Thị Thanh Xuân, Đinh Thị Cao Khánh, Võ Hy Lan Anh, Văn Xuân Thành, Trần Thị Thanh Thanh, 2010. Các hướng nghiên cứu về vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá Tra đang được triển khai tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh. Hội nghị Công Nghệ Sinh Học toàn quốc, Tp.HCM ngày 02/12/2010.

Tạp chí Thương Mại Thủy sản, số 131. Tháng 02/2013, ISSN 1859-1175

Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thị Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004, tr. 137 – 142.


Austin, B., and Austin, D.A., 2007. Bacterial Fish Pathogens: Diseases of Farmed and Wild Fish, 4th. Springer and Praxis Publishing, Chichester, UK.

Bader, J.A., Shoemaker, C.A., Klesius, P.H., Connolly, M.A., and Barbaree, J.M., 1998. Genomic subtyping of Edwardsiella ictaluri isolated from diseased channel catfish by arbitrary primed polymerase chain reaction. Journal of Aquatic Animal Health 10, 22-21.

Cooper, R.K., Shotts, E.B. and Nolan, L.K., 1996. Use of a mini-transposon to study chondroitinase activity associated with Edwardsiella ictaluri. Journal of Aquatic Animal Health 8:319-324.



Crumlish, Dung, M., Turnbull, T.J., Ngoc, N., and Ferguson, H., 2002. Identification of E. ictaruli from the diseased freshwater catfish Pangasius hypophthalmus Sauvage, cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of Fish Diseases 25: 733-736.

Hawke, J. P., McWhorter, A. C., Steigerwalt, A. G., and Brenner, D. J., 1981. Edwardsiella ictaluri sp. Nov., the causative agent of enteric septicemia of catfish. International Journal of Systematic Bacteriology 31 (4): 396-400.

Panangala, V. S., Craig, A.S., Vicky, L.V., Kevin, D., and Phillip, H.K., 2007. Multiplex-PCR for Simultaneous Detection of 3 Bacterial Fish Pathogens, Flavobacterium Columnare, Edwardsiella Ictaluri and Aeromonas hydrophila. Diseases of aquatic organisms 74(3):199–208.

Reed, M.J., and Muench, M., 1938. A simple method for estimating fifty percent endpoints. American Journal of hygiene 27: 493-497.

Thinh, N.H., Kuob, T.Y., Hung, L.T., Loc, T.H., Chen, S.C., Evensen, O., Schuurman, H.J., 2009. Combined immersion and oral vaccination of Vietnamese catfish (Pangasianodon hypophthalmus) confers protection against mortality caused by Edwardsiella ictaluri. Fish & Shellfish Immunology 27: 773-776.

Waltman, W.D., Shotts, E.B., and Hsu, T.C., 1986. Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri. Applied and Environmental Microbiology 51:101-4.



inVesTigaTion, isolaTion and selecTion oF The mosT UPdaTed and ViRUlenT sTRains oF Edwardsiella ictaluri

Le Hong Phuoc1*, Nguyen Thi Hien1, Nguyen Hong Loc1, Vo Hong Phuong1, Trinh Quoc Trong2

ABSTRACTIn this study, 4 strains of bacteria E. ictaluri, namely I, II, III and IV were isolated and characterized from 50 diseased fish samples collected from culture farms in Mekong Delta from March, 2010 to May, 2013. Through the challenge tests using those E. ictaluri strains, the same bacillary necrosis pathology was reproduced in experimental fish. Among 4 strains of E. ictaluri, strain I and II ap-pear to be the most virulent with the LD50 is approximately 2x104 CFU/0.2 ml/fish which is double the LD50 of strain II and III. At the dose of 106 CFU/fish, the experimental fish started to die in the second day post injection with the E. ictaluri I caused more than 99% mortality. In the challenge test with the dose of 105 CFU/fish, majority of the fish died after 3 days post injection. The E. ictaluri I caused 85% mortality. At the lowest dose, 104 CFU/fish, after 4 days post injection, the fish started to die. The E. ictaluri IV induced mortality the most with more than 50% of mortality. Generally, the virulence of E. ictaluri strains causing bacillary necrosis pathology in trafish might vary but not significant.

Keywords: bacteria, challenge, injection.

Người phản biện: TS. Đinh Thị Thủy




1 Southern Monitoring Center for Aquaculture Environment and Epidemic, Research Institute for Aquaculture No2. * Email: [email protected] 2 National Breeding Center for Southern Freshwater Aquaculture, Research Institute for Aquaculture No.2



1 Phân Viện Nghiên cứu Thủy sản Minh Hải, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected]

Xác ĐỊnh ĐỘ TiÊU hÓa biỂU KiẾn cỦa mỘT sỐ ngUYÊn liỆU lÀm ThỨc ăn cho cá giÒ

(Rachycentron canadum) giỐngTrần Quốc Bình1*, Vũ Anh Tuấn1, Lê Hữu Hiệp1, Nguyễn Thuý An1

TÓM TẮTBài báo này là một phần nghiên cứu sản xuất thức ăn cho cá giò thuộc đề tài mã số KC.06.15/06-10. Một thí nghiệm đã được tiến hành để xác định độ tiêu hóa biểu kiến về chất khô (DM), đạm thô (CP), chất béo thô (CF), tro, can xi, và phốt pho tổng số của các nguyên liệu làm thức ăn ở cá giò giống có trọng lượng trung bình 102,33 ± 3,14 g. Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 23/11/2008 đến 01/01/2009 gồm 13 công thức trong đó gồm một công thức đối chứng (GG1) và 12 công thức kiểm tra (GG2-GG13). Mười công thức kiểm tra (GG2-GG11) chứa 70 % nguyên liệu đối chứng và 30 % nguyên liệu kiểm tra (bột cá Chilê, bột cá Cà Mau, bột lông vũ, bột gia cầm, bột xương thịt heo, bột đậu nành nguyên hạt rang xay, bột mực, bột sò, bột tôm, bột mì). Hai công thức còn lại (GG12 và GG13) chứa 85 % nguyên liệu đối chứng và 15 % nguyên liệu kiểm tra (dầu cá, dầu mực). Crôm ôxit được thêm vào để làm chất đánh dấu với lượng 10 g/kg thức ăn ở cả công thức đối chứng và kiểm tra. Thí nghiệm có 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp có 15 con cá/bể. Cá được cho ăn 2 lần/ngày với mức tối đa trong khoảng 30 phút. Phân cá được thu bằng phương pháp vuốt phân. Trong suốt thời gian thí nghiệm các yếu tố nhiệt độ nước, pH, ôxy hoà tan và độ mặn lần lượt là 26,52 ± 0,23 (oC); 7,59 ± 0,08; 5,82 ± 0,09 (mg.l-1) và 15 ± 0,00 (‰). Đối với phần lớn nguyên liệu địa phương độ tiêu hoá chất khô là trên 70 %, đáng chú ý là bột mì, bột đậu nành nguyên hạt, bột cá Cà Mau, bột tôm. Đối với protein thô, khả năng tiêu hoá biểu kiến đạt giá trị cao nhất ở các nguyên liệu bột sò (96,9 %), bột mì (96,2 %), bột cá Chilê (95,8 %) và bột tôm (95,2 %). Cá giò sử dụng tốt chất béo thô từ bột đậu nành (98,5 %) và bột sò (97,4 %). Độ tiêu hóa tro đạt cao nhất tìm thấy ở bột sò (95,5 %) và bột tôm (89,6 %). Độ tiêu hoá của cá với can xi và phốt pho dao động từ 28,9 – 93,50 %. Kết quả nghiên cứu này có thể ứng dụng trong việc lựa chọn nguyên liệu để sản xuất thức ăn cho cá giò giống.

Từ khóa: Cá giò, Rachycentron canadum, crôm ôxit, độ tiêu hóa biểu kiến.



I. GIỚI THIỆU

Việt Nam có đường bờ biển 3.260 km trải dài từ địa đầu Móng Cái đến Hà Tiên và có tiềm năng rất lớn để phát triển các đối tượng nuôi biển, trong đó có cá giò (còn gọi là cá bớp). Ở Việt Nam, cá giò được nuôi khá phổ biến ở các tỉnh ven biển từ Bắc tới Nam như Hải Phòng, Quảng Ninh, Huế, Phú Yên, Vũng Tàu, Kiên Giang (Nguyễn Quang Huy, 2002). Bên cạnh đó, nhiều nguồn nguyên liệu địa phương ở nước ta cũng cho thấy tiềm năng rất lớn trong việc sử dụng làm thức ăn cho đối tượng nuôi thủy sản. Tuy nhiên, hiện nay còn rất ít nghiên cứu thực hiện về đánh giá khả năng tiêu hóa biểu kiến của các nguyên liệu sử dụng làm thức ăn cho cá giò (Rachycentron canadum). Các nghiên cứu này thật sự quan trọng vì đây là bước đầu tiên trong tiến trình sản xuất thức ăn (De Silva và Anderson, 1995). Độ tiêu hóa biểu kiến sẽ giúp ích trong việc chọn lựa những nguyên liệu có tính khả dụng cao cùng với chi phí thấp và giảm được lượng chất thải vào mội trường nước (Cho và Bureau, 2001). Do đó, nghiên cứu xác định khả năng tiêu hóa biểu kiến của cá giò đối với một số nguyên liệu thường sử dụng làm thức ăn là việc làm cần thiết, đóng vai trò cơ sở cho việc cung cấp thức ăn hiệu quả, tiết kiệm chi phí cho nghề nuôi cá giò ở nước ta.

Trong nghiên cứu này đã xác định độ tiêu hóa của cá giò với các nguyên liệu địa phương và một số nguyên liệu nhập ngoại tương đối phổ biến ở thị trường ở nước ta như: bột cá Chilê, bột cá Cà Mau, bột lông vũ thủy phân, bột gia cầm thủy phân, bột xương thịt heo, bột mực, bột sò, bột tôm, bột mì, bột đậu nành nguyên hạt rang xay, dầu cá và dầu mực. Các nguyên liệu trên đã được xác định độ tiêu hóa biểu kiến về chất khô, đạm thô, chất béo thô, tro, can xi và phốt pho tổng số.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thí nghiệm đã được tiến hành tại Trại Thực Nghiệm Thuỷ sản Bạc Liêu từ 23/11/2008 đến 01/01/2009.

Chuẩn bị cá giò thí nghiệm

585 cá giò giống có trọng lượng 102,33 ± 3,14 g được sử dụng. Trước khi thí nghiệm, 1.200 cá giò giống được nuôi trong giai đặt trong ao trước 50 ngày để chuẩn bị cho thí nghiệm. Cá được bắt cho vào bể xi măng và tắm với formaline 100 ppm trong 30 phút. Chỉ có những cá có kích cỡ đồng đều và khoẻ mạnh (không bị dị tật, không xây xát) mới được sử dụng. Mỗi bể được bố trí 15 con cá giò.

Hệ thống nuôi, nguồn nước và kiểm tra chất lượng nước

39 bể composite 500 L được chia thành ba khối tương ứng với ba lần lặp lại cho 12 công thức thí nghiệm với hệ thống nước bán tuần hoàn. Nước được lưu thông với tốc độ 40 L.h-1 và mực nước được giữ ở mức 300 L ở mỗi bể. Trong suốt thời gian thí nghiệm, nhiệt độ, độ mặn, pH và ôxy hoà tan được theo dõi và có giá trị lần lượt là 26,52 ± 0,23 (oC); 7,59 ± 0,08; 5,82 ± 0,09 (mg.L-1) và 15 ± 0,00 (‰).

Công thức thức ăn thí nghiệm

Mười ba công thức thức ăn được chuẩn bị bao gồm 1 công thức đối chứng (GG1) và 12 công thức kiểm tra (GG2-GG13), trong đó mười công thức kiểm tra (GG2-GG11) chứa 70 % nguyên liệu đối chứng và 30% nguyên liệu kiểm tra (1) (bột cá Chilê, bột cá Cà Mau, bột gia cầm, bột xương thịt heo, bột đậu nành nguyên hạt đã rang và xay, bột mực, bột sò, bột tôm, bột mì). Hai công thức còn lại (dầu cá và dầu mực) chứa 85 % nguyên liệu đối chứng và 15 % nguyên liệu kiểm tra (2). Crôm oxit được cho thêm vào để làm chất đánh dấu với lượng 10 g.kg-1 thức ăn ở cả công thức đối chứng và kiểm tra.



Bảng 1. Thành phần nguyên liệu của thức ăn chuẩn và thức ăn kiểm tra

Nguyên liệuPhần trăm (%)

Thức ăn chuẩn Thức ăn kiểm tra (1) Thức ăn kiểm tra (2)

Bột cá Chi lê 51,34 35,94 43,6

Bột đậu nành Ấn Độ trích ly 12,00 8,40 10,2

Bột ruốc 11,96 8,37 10,2

Bột mì 10,00 7,00 8,5

Bột bắp – kết dính 5,00 3,50 4,3

Tinh bột sắn-kết dính 2,00 1,40 1,7

Dầu mực 2,00 1,40 1,7

Di-CaP 1,00 0,70 0,9

Chất dẫn dụ FL 20 1,00 0,70 0,9

Soy Lecithin 1,00 0,70 0,9

Premix-starter (Inve) 1,00 0,70 0,9

DL- Methionine 0,40 0,28 0,3

Enzyme feed-Nanogen 0,10 0,07 0,1

Bio feed 0,10 0,07 0,1

Biomos 0,10 0,07 0,1

Crôm ôxit 1,0 1,0 1,0

Nguyên liệu kiểm tra 30 % - 29,70 -

Nguyên liệu kiểm tra 15 % - - 14,85

Các nguyên liệu kiểm tra 30 % gồm: bột cá Chi lê, bột cá Cà mau, bột lông vũ, bột gia cầm, bột xương thịt heo, bột mực, bột sò, bột tôm, bột mì, bột đâu nành nguyên hạt rang xay. Nguyên liệu kiểm tra 15 %: dầu cá, dầu mực.

Cho ăn và thu phân

Trước khi thí nghiệm, cá giò được cho ăn với thức ăn công nghiệp ngày hai lần lúc 6 giờ , và 16 giờ. Cá giò được cho ăn với thức ăn thí nghiệm trong ít nhất hai ngày trước khi thu phân.

Cá được cho ăn lúc 6 giờ và 11 giờ. Ba giờ sau khi cho ăn, phân được thu bằng cách gây mê cá bằng Ethanolphennoxyl với lượng 5 ppm rồi vuốt phân. Phân cá được vuốt góp hàng ngày và

lưu giữ trong tủ đông -20 0C đến khi đủ số lượng để phân tích (5 g trọng lượng khô).

Phân tích hóa học

Chất khô, đạm thô, chất béo thô, và tro được xác định ở Trung Tâm Công Nghệ Sau Thu Hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản 2. Thành phần crôm ôxit được xác định tại Đại học Cần Thơ. Thành phần nguyên liêu thể hiện ở Bảng 2.



Bảng 2. Thành phần sinh hóa nguyên liệu tính theo chất khô (%)

Nguyên liệu Đạm thô Chất béo thô Tro Canxi Phốt phoBột cá (Chilê) 71,5 9,2 17,2 1,8 2,3Bột cá (Cà Mau) 69,9 6,2 18,7 3,6 2,8Bột lông vũ 86,3 6,6 3,6 1,6 0,4Bột gia cầm 69,9 12,8 13,8 5,2 2,7Bột xương thịt 60,2 9,9 25,0 7,1 4,4Bột mực 48,7 13,2 16,5 5,4 0,7Bột sò 55,5 11,6 14,9 1,9 1,4Bột tôm 61,4 0,4 19,6 5,0 1,6Bột mì 13,1 2,4 0,5 0,3 0,1Bột đậu nành nguyên hạt 41,8 17,2 5,5 0,3 0,6Dầu cá - 100 - - -Dầu mực - 100 - - -

-: không xác định

Tính toán

Độ tiêu hoá biểu kiến (ADs) của nguyên liệu đối chứng và nguyên liệu kiểm tra được tính toán dựa trên phương pháp được mô tả bởi De Silva và Anderson (1995).

• AD đối với vật chất khô (ADD)

ADCD (%) = % Chất đánh dấu trong thức ăn

% Chất đánh dấu trong phân

• ADs đối với dưỡng chất hoặc năng lượng

ADDs Năng lượng hoặc dưỡng chất (%) =% Chất đánh dấu trong thức ăn

xF

% Chất đánh dấu trong phân D

F là % chất dinh dưỡng hoặc năng lượng trong phân, D là % chất dinh dưỡng hoặc năng lượng trong thức ăn.

+ Độ tiêu hoá biểu kiến ADingr (%) = ( )

−+

b

ADCxaADCxbarefcom

Trong đó:a = phần trăm chất dinh dưỡng trong thức

ăn chuẩn nhân tỷ lệ của thức ăn chuẩn (100 – i); i là tỷ lệ thực liệu đưa vào thức ăn;b = phần trăm chất dinh dưỡng trong thực

liệu nhân với tỷ lệ của thực liệu đưa vào thức ăn (i); (a + b) là phần trăm chất dinh dưỡng trong khẩu phần thức ăn hỗn hợp.

ADingr là độ tiêu hoá biểu kiến đối với nguyên liêu,

ADcom là độ tiêu hoá biểu kiến đối với thức ăn hỗn hợp,

ADref là độ tiêu hoá biểu kiến đối với thức ăn chuẩn.

Phân tích thống kêSố liệu ở dạng phần trăm được chuyển sang

dạng arsin trước khi xử lý ANOVA một nhân tố. Chỉ giá trị trung bình có sự sai khác có ý nghĩa, Tukey test được sử dụng để xác định sự khác nhau có ý nghĩa giữa các nghiệm thức. Phần mềm sử dụng là Statistica 8.0.



III. KẾT QUẢ

3.1. Khả năng tiêu hoá chất khô

Đối với phần lớn nguyên liệu địa phương độ tiêu hoá chất khô là trên 70 %, đáng chú ý là bột mì, bột đậu nành nguyên hạt, bột cá Cà Mau, bột tôm. Độ tiêu hóa chất khô biểu kiến của bột mì (94,1 %) là cao nhất và có ý nghĩa trong khi bột lông vũ (46,3 %) và và bột xương thịt (56,5 %) thì thấp nhất (p < 0,05).

3.2. Độ tiêu hóa với đạm thô

Đối với độ tiêu hoá đạm thô, khả năng tiêu hoá biểu kiến đạt giá trị cao nhất và có ý nghĩa (p < 0,05) ở các nguyên liệu bột sò (96,9 %), bột mì (96,2 %), bột cá Chilê (95,8 %) và bột tôm (95,2 %); bột cá Cà Mau (89,5 %) và bột đậu nành nguyên hạt (88,3 %) có giá trị ADC thấp hơn nhưng không khác biệt có ý nghĩa (p > 0,05). Bột lông vũ có hàm lượng protein thô cao nhất (86,3 %) nhưng khả năng tiêu hóa protein (42,8 %) thấp hơn một cách có ý nghĩa (p<0,05) so với các nguyên liệu kiểm tra.

3.3. Độ tiêu hóa chất troGiá trị ADA cao nhất được tìm thấy ở bột

sò (95,5 %) và bột tôm (89,6 %); bột mì (77,9 %), bột mực (78,8 %) và bột gia cầm (81,4 %) cũng có giá trị ADA khá cao. Giá trị ADA thấp nhất là ở bột xương thịt (25,7 %) mặc dù đây là nguyên liệu có thành phần chất tro cao nhất (25 %). Những nguyên liệu khác như bột cá Cà Mau (39,3 %), bột lông vũ (40,6 %), bột cá Chilê (54,2 %) có giá trị ADA tương đối thấp.

3.4. Độ tiêu hóa với canxiBột cá Cà Mau có độ tiêu hóa canxi cao

nhất (93,2 %) khác biệt có ý nghĩa (p<0,05) so với bột mì (82,8 %), bột cá Chilê (73,6 %), bột gia cầm(73,5 %). Bột mực (37,6 %), bột xương thịt (37,2 %), bột sò (36,8 %) có giá trị ADCa thấp nhất.

3.5. Độ tiêu hoá với phốt phoCá giò có thể hấp thu tốt phốt pho trong các

nguyên liệu bột cá Cà Mau (93,5 %), bột tôm (94,4 %), bột sò (93 %) và bột gia cầm (86,4 %) trong khi bột lông vũ thì ngược lại, cá chỉ sử dụng được chỉ 28,9 %. Các nguyên liệu khác có giá trị ADPP ở mức trung gian.

Bảng 3. Độ tiêu hóa biểu kiến của cá giò giống theo chất khô

Nguyên liệu ADDM ADP ADL ADA ADCa ADPP

Bột cá (Chilê) 74,0 ± 2,1de 95,8 ± 1,3d 68,9 ± 2,9cd 54,2 ± 2,7b 73,6 ± 6,4bc 71,0 ± 1,3bc

Bột cá (Cà Mau) 84,5 ± 1,8b 89,5 ± 1,2d 54,3 ± 1,2ab 39,3 ± 1,8ab 93,2 ± 1,2d 93,5 ± 3,1d

Bột lông vũ 46,3 ± 0,5a 42,8 ± 0,6a 50,8 ± 2,5a 40,6 ± 4,1ab 45,3 ± 3,9ab 28,9 ± 2,0a

Bột gia cầm 60,0 ± 1,5bc 75,8 ± 2,5bc 53,7 ± 1,1ab 81,4 ± 1,0de 73,5 ± 1,5bc 86,4 ± 2,9 c

Bột xương thịt 58,5 ± 2,5ab 76,1± 1,4bc 75,9 ± 1,8cde 25,7 ± 3,0a 37,2 ± 1,7a 43,4 ± 2,3ab

Bột mực 60,2 ± 3,6bc 69,3 ± 3,0b 50,3 ± 1,6a 78,8 ± 1,6cde 37,6 ± 0,7a 74,3 ± 5,3bc

Bột sò 82,3 ± 1,7ef 96,9 ± 1,2d 97,4 ± 0,8g 95,5 ± 1,3f 36,8 ± 1,9a 93,0 ± 1,5d

Bột tôm 77,6 ± 2,4def 95,2 ± 2,3d 89,1 ± 1,2f 89,6 ± 3,6ef 41,2 ± 5,1a 94,4 ± 0,8d

Bột mì 94,1 ± 1,0g 96,2 ± 2,1d 66,1 ± 6,0bc 77,9 ± 3,6cd 82,8 ± 2,5c 65,3 ± 2,5ab

Bột đậu nành nguyên hạt 71,5 ± 0,9cd 88,3 ± 2,8cd 98,5 ± 0,4g 65,9 ± 2,4bbc 61,0 ± 1,5ab 39,2 ± 1,1a

Dầu cá 76,7 ± 1,5def kxđ 79,8 ± 1,3de kxđ kxđ kxđDầu mực 82,9 ± 2,1ef kxđ 81,4 ± 1,2ef kxđ kxđ kxđ

Ghi chú: ADDM: khả năng tiêu hóa biểu kiến chất khô; ADP: Khả năng tiêu hóa protein; ADL: Khả năng tiêu hóa lipid; ADA: Khả năng tiêu hóa tro; ADCa: Khả năng tiêu hóa calcium; ADPP: Khả năng tiêu hóa phốt pho.

* Trong cùng một cột các giá trị khác nhau chữ số mũ thì khác nhau có ý nghĩa về thống kê (p < 0,05).



IV. THẢO LUẬN

Cá giò có thể sử dụng hiệu quả protein đối với hầu hết nguyên liệu kiểm tra. Kết quả này cũng tương tự như những nghiên cứu khác đã tìm thấy ở các loài cá ăn động vật ở biển với các loại nguyên liệu khác nhau như cá mú (Cromileptes altivelis) (Laining, 2003), cá chẽm (Lates calcarifer) (Glencross, 2004), cá hồng Mỹ (Sciaenops ocelatus) (Gaylord, 1996). Ở cá giò giống, khả năng tiêu hóa protein đạt trên 90 % đối với các nguyên liệu bột cá Chilê, bột cá Cà Mau và những nguồn nguyên liệu không phải bột cá như bột sò, bột tôm, bột mì và bột đậu nành nguyên hạt với thành phần protein từ 41,8-71,5 %. Đối với cá giò thịt, khả năng tiêu hóa protein thấp hơn ở cá giò giống. Đối với khả năng tiêu hóa lipid, trong thí nghiệm này chỉ số ADL ở các nguyên liệu tương đối thấp so với kết quả của Zhou (2004) tiến hành trên cá giò giống (10 g). Sự khác nhau này có lẽ do sự khác nhau về cỡ cá thí nghiệm trong hai nghiên cứu.

Phốt pho trong nguyên liệu thực vật tồn tại ở dạng phytic acid thường liên kết với inositol tạo thành phức phytate. Phức này có khả năng gắn các ion kim loại hóa trị hai (De Silva, 1995; Lê Thanh Hùng, 2008). Nhưng phytate được biết ở cá không thể sử dụng do thiếu endogenous hoặc enzyme phytase trong ruột non (Lall, 1991; trích bởi Zhou, 2004). Phytate ít bị ảnh hưởng bởi nhiệt trong quá trình xử lý nhiệt và hoạt tính của nó ở bột hạt cải và ở họ đậu thì thấp hơn so với hoạt tính phytate ở lúa mì (Pointillart, 1994; trích bởi Zhou, 2004). Nhưng độ tiêu hóa phốt pho của cá đối với bột đậu nành nguyên hạt đã rang và xay (39,2 %) thì thấp hơn so với bột mì (65,3 %) điều này có lẽ do thành phần glucosinolates cũng như thành phần phytate và phốt pho tổng số thấp hơn (Zhou, 2004). Mặc dù bột xương thịt heo có phốt pho tổng số cao nhất nhưng độ tiêu hóa phốt pho lại thấp nhất trong các nguyên liệu động vật. Kết quả này cho thấy

rằng, hàm lượng phốt pho càng thấp khả năng hấp thu của cá càng cao (Zhou, 2004) và cũng tương tự với những kết quả được báo cáo ở cá bơn (Pretta maxima) và cá hồi (Onchorynchus mytus) (Burel, 2000).

Bột cá Cà Mau có protein thô (69,9 %) gần bằng bột cá Chilê (71,5 %) và có khả năng tiêu hóa của cá giò đối với chất khô (84,5 %) cao hơn so với bột cá Chilê (74 %) và cá giò thịt cũng tương tự. Đối với protein (89,5%) hơi thấp hơn so với bột cá Chilê (95,8 %) nhưng ở cá thịt thì ngược lại. Bên cạnh đó, nguyên liệu nội địa này cũng có chỉ số AD đối với canxi và phốt pho rất cao (93 %). Bột cá Cà Mau là một nguồn nguyên liệu địa phương hoàn toàn có thể thay thế cho nguồn bột cá ngoại nhập ngày một khan hiếm. Những nghiên cứu khác trong cùng lĩnh vực đã cho thấy khác nhau trong việc sử dụng các loại bột cá trong thức ăn cá biển. Chẳng hạn như bột cá Peru có ADP 96,27 % đối với cá giò giống (Zhou, 2004); bột cá menhaden ở cá hồng Mỹ (Sciaenop ocelatus) là 95,9 % (McGoogan và Reigh, 1996) và bột cá danish có ADP 87,9 % đối với cá chẽm (Lates calcarifer) (William, 1998).

Khả năng tiêu hóa các thành phần dinh dưỡng của cá giò đối với bột lông vũ thủy phân đều thấp hơn so với các nguyên liệu còn lại. Kết quả cũng tương tự với những báo cáo của Alexix (1997) ở cá tráp (Sparus aurata). Bột lông vũ chứa protein cao (86,3 %) nhưng trong đó keratin chiếm tỷ trọng cao và thành phần amino acid không cân đối (Yu, 2007) nên độ tiêu hóa protein thấp.

So với những nguồn protein động vật không phải ở biển, bột xương thịt gia cầm có chất lượng protein và độ tiêu hóa protein gần tương tự với bột cá nhất (Yu, 2007) và trong thí nghiệm này cũng vậy. Kết quả nghiên cứu của (Zhou, 2004) có các chỉ số ADDM, ADP, ADL và ADPP lần lượt là 80,91 %; 90,90 %; 92,06 % và 62,36 %.



Bột xương thịt có giá trị ADP và ADL tương đối cao so với bột gia cầm ở cá giống, tuy nhiên giá trị ADCa và ADPP lại thấp hơn. Những giá trị ADCs thấp hơn so với số liệu được báo cáo bởi Zhou (2004), với bột xương thịt chứa 54,6 % protein thô. Cả hai cùng với bột lông vũ là những sản phẩm protein thủy phân có thể thay thế bột cá trong công thức thức ăn thương mại cho cá.

Bột sò có các giá trị ADCs rất cao, cao hơn bột cá. Chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng tiêu hóa bột sò trên các đối tượng thủy sản nhưng qua kết quả nghiên cứu này cho thấy đây là nguyên liệu có tiềm năng để sử dụng trong công thức thức ăn thủy sản.

Bột mực có độ tiêu hóa tương đối thấp so với những nguyên liệu khác nhưng có tác dụng dẫn dụ tôm cá rất mạnh do chứa tỷ lệ cao glycine và betaine (Lê Thanh Hùng, 2008). ADP trên cá tráp (Sparus aurata) là 87,1 % (Lupatsch, 1997).

Bột tôm có protein thô 61,4 % và có độ tiêu hóa tương đương với bột sò. Bột tôm là nguồn cung cấp acid béo n3, cholesterol và astaxanthin (tạo màu cho thịt và da cá) đồng thời cũng là một chất dẫn dụ tốt (Lê Thanh Hùng, 2008)

Đối với nguyên liệu kiểm tra có nguồn gốc thực vật, bột mì cho thấy rất hứa hẹn như là một nguyên liệu trong công thức thức ăn cá. Nguyên liệu này có giá trị ADCs cao đối với vật liệu khô (94,1 %), protein (96,2 %), lipid (66,1 %), chất tro (77,9 %). Những nghiên cứu khác cũng đã chứng minh giá trị ADC cao của bột mì. Chẳng hạn như trên cá tráp (Sparus

aurata) là 82 % (Lupatsch, 1997); ở cá hồng Mỹ (Sciaenops ocelatus) là 96,8 % (Gaylord và Gatlin, 1996).

Bột đậu nành nguyên hạt có giá trị ADCs ở mức trung gian đối với vật chất khô (71,5 %), protein (88,3 %) và lipid (98,5 %) ở cá giống. Không có những báo cáo trước đây về độ tiêu hóa biểu kiến của bột đậu nành ở cá giò, nguyên liệu này có ADP ở cá cam (Seriola quinqueradiata) là 83,2 % (Masumota, 1996) và ở cá chẽm (Lates calcarifer) là 84,8% (McMeniman, 2002). Vì vậy, bột đậu nành nguyên hạt, rang, xay cho thấy là nguồn protein thay thế rất hứa hẹn trong công thức thức ăn cá giò đặc biệt là chỉ số ADP rất cao.

Hầu hết thức ăn thủy sản hiện tại sử dụng dầu cá hoặc dầu mực trong công thức thức ăn bởi vì đó là nguồn cung cấp tuyệt vời acid béo chưa bão hòa, là nguồn cung cấp acid béo họ n3 với tỷ lệ acid béo n3 cao hơn n6. Mặc dù có rất nhiều hiểu biết về ADCs đối với dầu cá và dầu mực thương mại trong thức ăn của các loài cá nhưng chưa có nhiều nghiên cứu về độ tiêu hóa của hai nguồn lipid này trên cá giò. ADCs ở mức trung gian với dầu cá (79,8 %) và dầu mực (81 %) được tìm thấy trong nghiên cứu này.

V. KẾT LUẬNNghiên cứu cho thấy rằng cá giò có khả năng

sử dụng hiệu quả protein từ nguồn nguyên liệu động vật và thực vật. Bột cá Cà Mau cùng với bột xương thịt gia cầm thủy phân, bột sò, bột mì được tiêu hóa tốt ở cá giò giống, cho thấy đây là những nguồn nguyên liệu đầy triển vọng để thay thế bột cá ngoại nhập trong khẩu phần thức ăn cá giò.




Lê Thanh Hùng, 2008. Thức ăn và dinh dưỡng thuỷ sản, Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

Nguyễn Quang Huy, 2002. Tình hình sinh sản và nuôi cá giò (Rachycentron canadum). Tạp chí thủy sản số 7-2002.

Tài liệu tiếng AnhAlexis, M.N., 1997. Fish meal and fish oil replacers

in Mediterranean marine fish diets. In: A. Tacon., B. Barsureo. (Eds.), Feeding tomorrow’s fish. Proceedings of workshop of the CIHEAM net work on technology of aquaculture in the Mediterranean., CIHEAM, Zagaroza, Spain, pp. 183-204

Burel, C., Boujard, T., 2000. Digestibility of extruded peas, extruded lupin, and rapeseed meal in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and turbot (Psetta maxima). Aquaculture 188: 285- 298.

Chen H. Y., Liao, I.C., 2007. Nutritional Research and Feed Development in Cobia: Status and Prospects. In Cobia Aquaculture: Research, Development and Commercial Production. Edited by Liao I. C., and Leano E. M., 2007, 89-95.

Cho, C.Y., and Bureau, D.P., 2001. A review of diet formulation strategies and feeding system to reduce excretory and feed wastes in aquaculture. Aquaculture Research 32: 349-360.

De Silva, S.S., and Anderson,T.A., 1995. Fish Nutrition in Aquaculture. London, Chapman & Hall.

Gaylord, T. G., and Gatlin, D.M., 1996. Determination of digestibility coefficients of various feedstuffs for red drum (Sciaenops ocellatus). Aquaculture 139: 303– 314.

Glencross, B., 2004. The nutritional management of barramundi, Lates calcarifer - a review, Blackwell Publishing.

Laining, A., Rachmansyah., Ahmad, T., Williams, K., 2003. “Apparent digestibility of selected feed ingredient for humpback grouper Cromileptes altivelis.” Aquaculture 218: 529–538.

Lupatsch, I., Kissil, G.W., Sklan, D., Pfeffer, E., 1997. Apparent digestibility coefficients of feed ingredients and their predictability in compound diets for gilthead seabream Sparus aurata Aquaculture Nutrition 3: 81-89.

McMeniman, N.P., Williams, K.C., 2002. The digestion and utilization of some protein meals by barramundi (Lates calcarifer). Aquaculture (submitted).

Masumota, T., Ruchimat, T., Ito, Y., Hosokawa, H., Shimeno, S., 1996. Amino acid availability values for several protein sources for yellowtail (Seriola quinqueradiata). Aquaculture 146: 109-119.

McGoogan, B. B., and Reigh, R. C., 1996. Apparent digestibility of selected ingredients in red drum (Sciaenops ocellatus) diets. Aquaculture, 141: 233– 244.

Yu, 2007. Fishmeal replacements - Studies show rendered protein meals effective in aquafeeds. Global Aquaculture Advocate 10(05): 80-82.

Zhou, Qi-cun, Bei-Ping Tan, Kang-Sen Mai, 2004. Apparent digestibility of selected feed ingredients for juvenile cobia Rachycentron canadum. Aquaculture 214: 441-451.

William, K.C., Barlow C.G., D’Souza, F., 1998. Larval penaeid and grow-out finfish nutritional research in Australia. In: Rimmer, M.a.W., K.C (Ed.), Proceedings of ACIAR-NACA Grouper Aquaculture Workshop, Bangkok, Thailand, pp. 26-35.



assessmenT oF aPPaRenT digesTibiliTY coeFFicienTs oF ingRedienTs FoR Feed deVeloPmenT FoR cobia

(Rachycentron canadum) JUVenile

Tran Quoc Binh1*, Vu Anh Tuan1, Le Huu Hiep1, Nguyen Thuy An1

ABSTRACTThis paper is a part of the project number: KC.06.15/06-10 to determine the formulated feed for cobia. An experiment was conducted to determine apparent digestibility of juvenile cobia of 102 ± 3.14 g for dry matter (DM), crude protein (CP), crude fat (CF), ash, calcium and total phosphorus. The experiment was carried out from 23/11/2008 to 01/01/2009 including 13 treatments in which there were one reference diet (GG1) and 12 test diets (GG2-GG13). Ten test diets (GG2-GG11) contained 70% of the reference diet and 30% of test ingredients (Chilean fish meal, Ca Mau fish meal, feather meal, poultry by-product meal, pork meat and bone meal, whole roasted soybean meal, squid meal, krill meal, shrimp meal and wheat flour). Two other diets (GG12 and GG13) con-tained 85% of the reference diet and 15% of test ingredients (fish oil and squid oil). Chromic oxide was added as an inert marker at 10 g kg-1 to both the reference and the test diets. The experiment had three replicates; each replicate had fifteen fish per tank. Fish were fed twice per day at a satiation rate for an approximate period of 30 minutes. Feces were collected by a stripping method. During a course of experiment, the temperature, pH, dissolved oxygen, and salinity were 26.52 ± 0.23 (oC); 7.59 ± 0.08; 5.82 ± 0.09 (mg.l-1) and 15 ± 0.00 (‰), respectively. Apparent dry matter digestibility reached over 70 % for local ingredients, especially for wheat flour, whole roasted soybean meal, Ca Mau fish meal, shrimp meal. The high apparent digestibility for crude protein was determined for krill meal (96.9 %), wheat flour (96.2 %), Chilean fish meal (95.8 %) and shrimp meal (95.2 %). Fish utilized well crude fat from soybean meal (98.5 %) and krill meal (97.4 %). Apparent digest-ibility for ash (ADA) was high for krill meal (95.5 %) and shrimp meal (89.6%). Apparent digest-ibility for calcium and phosphorus ranged from 28.9 – 93.5 %. These apparent digestibility values will be able to select right ingredients to produce manufactured feed for juvenile cobia.

Keywords: Apparent digestibility, cobia, Rachycentron canadum, chromic oxide.





1 Minh Hai Sub-Institute for Fisheries Research, Research Institute for Aquaculture No 2. * Email: [email protected]



Xác ĐỊnh ThÀnh PhẦn môi TRưỜng dinh dưỠng VÀ các ĐiỀU KiỆn nUôi cẤY bỀ mẶT TẠo sinh KhỐi chỨa PhYTase cÓ

hoẠT lỰc cao TỪ Aspergilus niger YdPhạm Duy Hải1*, Nguyễn Văn Nguyện1, Hoàng Thị Hồng Thơm1, Trần Thị Lệ Trinh1

TÓM TẮTViệc bổ sung phytase đã được tìm thấy không những tăng tỉ lệ tăng trưởng ở những động vật có dạ dày đơn mà còn tăng hiệu quả sử dụng phosphate từ thức ăn giúp giảm mạnh sự bài tiết phosphor và giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường. Vì vậy, nội dung của nghiên cứu này nhằm tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men bán rắn sinh tổng hợp ra phytase ngoại bào từ chủng Aspergillus niger YD với mục tiêu tăng nâng suất để có hiệu quả kinh tế như một sản phẩm thương mại. Với các kết quả thực nghiệm đạt được, thành phần môi trường bao gồm: tinh bột bắp (73,00%) và bột đậu nành (24,44%), và các điều kiện lên men tối ưu như: nhiệt độ 370C, thời gian lên men là 5 ngày và độ ẩm tương đối của môi trường lên men là 70%. Với các kết quả vừa nêu trênđã lên men sinh tổng hợp phytase ngoại bào có hoạt tính là 917,40 ± 13,48 U/g.

Từ khóa: Aspergillus niger YD, phytase, nuôi cấy bề mặt.

1 Trung tâm Công nghệ Sau thu hoạch, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ sản 2. * Email: [email protected]


Ngày nay với cách tiếp cận hiện đại, việc ứng dụng công nghệ sinh học trong nuôi trồng thủy sản là hướng đi chủ đạo, mang tính khoa học và có ý nghĩa rất lớn đến việc phát triển bền vững, trong đó công nghệ enzyme được xem như là một trong những phương án thích hợp tham gia vào việc giải quyết, nâng cao hiệu quả thức ăn và giảm thiểu ô nhiễm môi trường từ hoạt động nuôi thủy sản. Vai trò của enzyme tiêu hóa như lipase, protease, amylase và phyta-se bổ sung vào thức ăn vật nuôi thủy sản đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong thực tiễn. Trong đó, bổ sung phytase trong thức ăn thủy sản ngày càng phổ biến hơn do những ưu điểm mà nó mang lại, phytase giúp tăng cường lượng phosphor hữu dụng và giảm lượng phosphor thải ra môi trường (Debnath và ctv., 2005; Greiner và Konietzny, 2006; Cao và ctv., 2007; Kumar

và ctv., 2011; Adeola và Cowieson, 2011). Hàm lượng bổ sung phytase vào khẩu phần ăn từ 250 đến 1.500 FTU/kg thường được xem là khoảng thích hợp đối với nhiều loài cá (Adeola và Cowieson, 2011). Sự thay đổi về lượng phytase bổ sung tối ưu tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: loài cá, nguồn phytase khác nhau, công thức thức ăn. Nhiều nghiên cứu bổ sung phytase vào thức ăn cho một số loài cá đã chứng minh được ảnh hưởng tích cực của enzyme phytase như đối với cá da trơn Mỹ (Robinson và ctv., 1996), cá trê phi (Van Weerd và ctv., 1999; Nwanna và ctv., 2005), cá Pangasius pangasius (Debnath và ctv., 2005), cá trê lai (Phromkunthong và ctv., 2005), cá basa. Theo Debnath và ctv., (2005), bổ sung phytase ở hàm lượng 500-1.500 FTU/kg thức ăn có thể làm tăng hàm lượng protein tích lũy trong cơ thể và tăng độ tiêu hóa một số chất khoáng của cá Pangasius pangasius. Bổ sung 250-500 FTU/



kg phytase giúp tăng hiệu quả sử dụng phosphor và hạn chế được việc bổ sung phosphor vô cơ vào thức ăn của cá da trơn Mỹ (Robinson và ctv., 1996; Li và Robinson, 1997).

Hiện nay, phytase được tổng hợp từ vi sinh vật có nhiều triển vọng hơn trong việc bổ sung vào thức ăn cho cá so với các loại phytase được tổng hợp từ các nguồn gốc khác. Bởi vì, chúng có khoảng pH tối ưu rộng, bền vững hơn với nhiệt cũng như có hoạt tính cao hơn (Cao và ctv., 2007) và sản phẩm thương mại đầu tiên của phytase được sản xuất từ loài nấm A.niger. Những nguồn thu nhận phytase từ vi sinh vật ngoài nấm mốc ra thì phytase cũng được tổng hợp từ nấm men và vi khuẩn. Trong đó, A.niger được nghiên cứu nhiều hơn cả do phytase có nguồn gốc từ A.niger hoạt tính có tính chịu nhiệt cao và hoạt tính ổn định (Kumar và ctv., 2011), đồng thời dễ lên men với phương pháp lên men bề mặt. Trong quá trình lên men sinh tổng hợp enzyme phải cung cấp đầy đủ dưỡng chất cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển, các điều kiện lên men (nhiệt độ, độ ẩm, thời gian lên men,…) và chất cảm ứng rất quan trọng quyết định hoàn toàn quá trình lên men. Khi nguồn dinh dưỡng vừa đủ nấm mốc sẽ tập trung vào tạo thành enzyme chứ không phát triển mạnh để tạo sinh khối như khi thừa dinh dưỡng. Bên cạnh đó môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh phytase thường bằng cám gạo, cám mỳ là những vật liệu có chứa chất cảm ứng cần thiết cho sự hình thành phytase. Để cảm ứng cho việc tạo thành phytase, một số cơ chất khác như bột dầu cải, lạc, hướng dương cũng là những cơ chất có phytate. Ví dụ như các nấm mốc Rhizopus oligosporus NRRL 2990, A.niger NRC 5765, A.carbonarius NRC 401121, A.ficuum và S.serevisiae đã sử dụng bột cải dầu làm cơ chất để sản xuất phytase bằng lên men bề mặt (Al-Asheh và Duvnjak,1994).

Ngoài ra, với kết quả bước đầu nghiên cứu tạo quy trình sản xuất phytase từ Aspergillus niger (A.niger) từ đề tài cấp Bộ NN&PTNT: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học giàu enzyme để bổ sung, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Văn Nguyện và ctv., 2009). Nhóm thực hiện tiến hành hoàn thiện một số thành phần môi trường và điều kiện lên men bán rắn với công suất 80 – 100 kg/mẻ nhằm nâng cao hoạt độ phytase hơn nữa để tạo ra hỗn hợp chế phẩm đa enzyme bổ sung vào thức ăn nuôi thủy sản.

II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1. Vật liệuChủng Aspergillus niger YD (A.niger YD)Chủng Aspergillus niger YD (A.niger YD)

nuôi cấy trên môi trường PDA (Potato dextrose agar) của hãng Merck ở 37oC, sau 120 giờ thu bào tử bằng cách bổ sung thêm nước có chứa 0,1% Tween 80, pha loãng đạt 2x107 bào tử/ml.

Thành phần hỗn hợp dung dịch khoáng (dùng bổ sung cho 1 kg môi trường lên men) bao gồm: KCl (2,5 g), pepton (0,9 g), MgSO47H2O (7,5 g), KH2PO4 (5,0 g), CaCl2 (10,0) hỗn hợp được hoà tan trong nước cất.

Thành phần nguyên liệu dùng làm môi trường lên men bắn rắn: cám gạo, bột khoai mì, bột đậu nành đã được trích ly dầu, bột gạo và bột bắp.

2.2. Phương pháp nghiên cứuDựa trên một phần kết quả nghiên cứu

của đề tài “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học giàu enzyme để bổ sung, nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn nuôi cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” (Nguyễn Văn Nguyện và ctv., 2009). Nhóm thực hiện tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy để thu được hoạt độ phytase cao nhất và ứng dụng quy trình nuôi cấy với quy mô 80-100 kg/mẻ.



Thí nghiệm 1 (TN1): Khảo sát môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp phytase

Trong phần khảo sát thành phần dinh

dưỡng môi trường lên men bán rắn với 5 loại cơ chất được khảo sát: bột bắp, bột khoai mì, cám gạo, bột gạo và bột đậu nành được trình bày trong bảng 1.

Bảng 1. Khảo sát các nguồn cơ chất của môi trường lên men sinh phytase

Nguồn cơ chất Lần lặp lại (n) Điều kiện lên menHoạt tính (ĐVHT/g)

Bột khoai mì

n =3

Thời gian nuôi cấy 5 ngày, nhiệt độ 300C, độ ẩm môi

trường 60%, dung dịch khoáng và pepton (2,24%) và tỉ lệ cấp

giống 25% (v/w).

Bột đậu nànhBột bắpCám gạoBột gạo

Thí nghiệm 2 (TN2): Khảo sát tỷ lệ hỗn hợp thành phần dinh dưỡng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp phytase

Khi có kết quả khảo sát thành phần cơ chất và chọn lựa được thành phần hỗn hợp cơ

chất làm môi trường lên men, tiếp tục thực hiện khảo sát các tỷ lệ hỗn hợp để chọn lựa ra tỷ lệ thích hợp nhất làm nguồn cơ chất. Cách bố trí thí nghiệm được thực hiện như trong bảng 2.

Bảng 2. Khảo sát và lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp cơ chất làm môi trường lên men

Tỷ lệ cơ chất (a:b) Lần lặp lại (n) Điều kiện lên menHoạt tính (ĐVHT/g)

TL 1:1

n =3

Thời gian nuôi cấy 5 ngày, nhiệt độ 300C, độ ẩm môi trường 60%, dung dịch

khoáng và pepton (2,24%) và tỉ lệ cấp giống 25% (v/w).

TL 2:1TL 3:1TL 4:1

TL 1:2 và TL 1:3

Thí nghiệm 3 (TN3): Khảo sát các nhiệt độ và thời gian lên men ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp phytase

Tiếp tục khảo sát điều kiện lên men với thời gian lên men từ 2-7 ngày và nhiệt độ lên men từ 30-450C.

Thí nghiệm 4: Khảo sát độ ẩm môi trường lên men sinh phytase

Khi đã có kết quả khảo sát ở các thí nghiệm trên thì tiếp tục khảo sát độ ẩm từ 55% đến 75% của môi trường lên men.

2.3. Phương pháp phân tíchPhương pháp phân tích hoạt độ phytase

: TCVN 8678:2011 (ISO 30024:2009).Màu săc, mùi vị : TCVN 1532-1993Độ ẩm : TCVN 4329 – 2007Salmonella : TCVN 4829-2001Độ tố Aflatoxin : LC/MS/MSCôn trùng sống : TCVN 1540-86Xác định tổng nấm men, nấm mốc

: TCVN 5750:1993.Ngoài ra, để xác định độ ẩm nhanh bằng

cân đo độ ẩm hồng ngoại MX-50 - Nhật Bản.



2.4. Phương pháp xử lý số liệuXử lý thống kê bằng phần mềm SPSS 15.0

và Excel 2007 để đánh giá sự khác nhau giữa các nghiệm thức (p<0,05).

III. KẾT QUẢ

3.1. Kết quả khảo sát môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp phytase

Khảo sát ở 5 nguồn cơ chất (TN1) là bột bắp, bột khoai mì, cám gạo, bột gạo và bột đậu nành. Sau 5 ngày lấy mẫu xác định hoạt tính enzyme, mỗi mẫu thí nghiệm lặp lại 3 lần, hoạt tính trung bình được trình bày ở hình 1.

Hình 1. Ảnh hưởng nguồn dưỡng chất đến hoạt độ phytase

Từ kết quả thí nghiệm cho thấy các nguồn cơ chất khảo sát đều được chủng A.niger YD sử dụng; tuy nhiên đối với bột khoai mì, cám gạo, bột gạo sinh khối cho hoạt tính enzyme không cao chỉ khoảng 38-74 (ĐVHT/g), trong đó thì cám gạo và bột gạo không có sự khác biệt về ý nghĩa thống kê (p>0,05). Đối với nguồn cơ chất là bột bắp và bột đậu nành cho hoạt tính phytase cao nhất lần lượt là: 343,54 ± 40,94 (ĐVHT/g) và 157,42 ± 4,28 (ĐVHT/g).

Qua kết quả thí nghiệm cho thấy nguồn cung cấp nguồn dưỡng chất cũng như là chất cảm ứng từ bột bắp và bột đậu nành đã cho hoạt tính phytase cao hơn, do đó dự án chọn hỗn hợp bột bắp và bột đậu nành làm nguồn cơ chất tối ưu để thu nhận sinh khối phytase từ chủng A.niger YD đang khảo sát làm các nghiên cứu tiếp theo.

3.2. Kết quả lựa chọn tỷ lệ hỗn hợp thành phần dinh dưỡng

Với phần khảo sát trên TN1 đã lựa chọn ra hỗn hợp dinh dưỡng là bột bắp và bột đậu nành làm nguồn dinh dưỡng cung cấp nguồn carbon và một phần nguồn nitơ (vì nguồn cung cấp nitơ chính cho nghiên cứu là này peptone), đồng thời cũng làm chất cảm ứng để sinh tổng hợp phytase trong môi trường lên men bán rắn với độ ẩm ban đầu là 60%. Khảo sát gồm 5 tỷ lệ thành phần hỗn hợp khác nhau và kết quả được thể hiện ở hình 2 như sau: tỷ lệ 1:1 sinh ra phytase thấp nhất (169,12 ± 9,17 ĐVHT/g), tuy nhiên với tỷ lệ bột bắp:bột đậu nành là 3:1 có khả năng sinh enzyme phytase từ chủng A.niger cao nhất (727,38 ± 17,97 ĐVHT/g), còn các tỷ lệ khác thì hoạt độ phytase nằm trong khoảng 225÷427 ĐVHT/g. Với kết quả nghiên cứu này, dự án đã chọn môi trường dinh dưỡng cho lên men bán rắn với chủng A.niger YD là hỗn hợp gồm: tỷ lệ bột bắp:bột đậu nành là 3:1, thành phần peptone và môi trường khoáng có thành phần phosphor để tăng khả năng sinh tổng hợp phytase.

+ Bột bắp: 73,32%+ Bột đậu nành: 24,44%+ Thành phần peptone và khoáng: 2,24%



Hình 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp (bột bắp: bột đậu nành) đến hoạt độ phytase

3.3. Kết quả các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp phytase

3.3.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ đến sinh tổng hợp hoạt độ enzyme phytase

Theo kết quả khảo sát ở bảng 3 cho thấy mặc dù ở các môi trường có nhiệt độ nuôi cấy khác nhau thì thời gian cho hoạt tính enzyme phytase cao nhất đều là vào ngày thứ 5. Hoạt

tính cao nhất khi nuôi cấy ở 30oC, 37oC, 40oC và 45oC lần lượt là 368,56 ± 17,52; 742,56 ± 25,01; 561,35 ± 24,86 và 465,41 ± 36,34 (ĐVHT/g). Đối với chủng A.niger YD đang khảo sát, theo kết quả nghiên cứu thời gian cho hoạt tính enzyme cao nhất là ngày thứ 5. Từ kết quả nghiên cứu, chọn ngày thứ 5 là ngày cho hoạt tính enzyme cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

Bảng 3. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sinh tổng hợp phytase

Nhiệt độ (0C)

Thời gian nuôi cấy (ngày)

2 3 4 5 6 7

Hoạt độ phytase (ĐVHT/g)

30 59,63b ± 8,08 145,86a ± 7,76 287,14b ± 15,09 368,56a ± 17,52 385,23a ± 25,02 365,42a ± 17,33

37 86,41c ± 6,61 289,42c ± 6,18 521,38c ± 36,11 742,56d ± 25,01 721,32c ± 15,95 729,14c ± 28,35

40 55,64b ± 6,60 187,42b ± 9,74 268,38ab ± 9,49 561,35c ± 24,86 601,23b ± 23,90 589,28b ± 33,58

45 42,38a ± 8,24 197,32b ± 2,60 246,84a ± 11,80 465,41b ± 36,34 412,38 a± 24,62 382,42a ± 18,40

(Ghi chú: Các giá trị với mẫu tự khác nhau trong cùng một cột là khác biệt có ý nghĩa (p< 0,05). Số liệu thể hiện là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, số lần lặp lại là 5)

Đồng thời, kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp hoạt độ enzyme phytase được thể hiện ở Hình 3 thì nhiệt độ nuôi cấy tối ưu để thu nhận phytase là 37oC, kết quả này khá hợp lý vì nhiệt độ này nằm trong

khoảng nhiệt độ tối ưu của các chủng vi sinh vật sản sinh phytase. Hơn nữa chủng A.niger YD đã được hoạt hóa ở 37oC, khi nuôi cấy ở cùng nhiệt độ này thì chủng có điều kiện thuận lợi để sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme.



Hình 3. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh tổng hợp phytase

Kết quả tương tác giữa 2 yếu tố nhiệt độ và thời gian lên men bán rắn với hỗn hợp cơ chất (bột bắp + bột đậu nành) thấy rằng tại nhiệt độ 370C và thời gian lên men 5 ngày với chủng A.niger YD khảo sát sinh tổng hợp phytase cao nhất: 742,56 ± 25,01 (ĐVHT/g).

3.3.2. Kết quả khảo sát độ ẩm của môi trường lên men đến sinh tổng phytase

Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 4, khi khảo sát 5 dãy độ ẩm từ 55% đến 75% thấy rằng độ ẩm thấp hoặc quá cao (55% hoặc 75%) thì khả năng sinh tổng hợp phytase thấp có thể do điều kiện môi trường như thế đã ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nấm mốc. Tại độ ẩm 70% thì khả năng sinh tổng hợp phytase là cao nhất (954,39 ± 34,94 ĐVHT/g).

Hình 4. Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường lên men đến hoạt độ phytase

Từ kết quả khảo sát về thành phần môi trường và điều kiện lên men bán rắn ở các mục trên dự án đã tiến hành lên men thực nghiệm với công suất là 80 kg/mẻ và kết quả hoạt độ phytase trong sinh khối đạt được 917,40 ± 13,48

(ĐVHT/g). Từ kết quả này số so với số liệu khảo sát tại phòng thí nghiệm với công suất 2 kg/mẻ thì đạt 96%, hiệu suất khi lên men thực nghiệm dạng pilot như thế là đạt.



IV. THẢO LUẬN

Trong nghiên cứu lựa chọn nguồn dinh dưỡng cung cấp nguồn cacbon phù hợp trong môi trường lên men bán rắn, theo Vats và Ba-nerjee (2002) cho rằng khi có mặt trong môi trường các đường đơn sẽ ngăn cản mạnh quá trình tổng hợp enzyme phytase sinh ra cao nhất đối với nguồn carbon là tinh bột, tuy nhiên việc thiết kế môi trường có độ dính cao là rất khó. Vì vậy sự kết hợp giữa đường đa và một đường đơn sẽ cho kết quả tốt nhất. Trong nghiên cứu của Trần Thị Tuyết và ctv., (2005) đối với chủng A.niger NRRL-363 sử dụng phương pháp lên men bề mặt, đã khảo sát bốn nguồn cơ chất khác nhau: cám gạo, bột mì, bột đậu nành và bột bắp. Kết quả là bột đậu nành và bột bắp đã cho thấy hoạt tính phytase cao nhất. Từ đó cho thấy rằng kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu đang thực hiện khi 02 nguồn cơ chất chứa phytate (bột đậu nành và bột bắp) cho hoạt tính phy-tase cao nhất đối với chủng A.niger YD. Đồng thời, nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành kết hợp giữa 02 nguồn cơ chất này để hình thành nên môi trường dinh dưỡng với tỉ lệ thích hợp và kết quả thật ngạc nhiên với tỉ lệ 3:1 (bột bắp:bột đậu nành) thì hoạt tính phytase cao nhất và cao hơn cả khi khảo sát với từng nguồn cơ chất đơn. Ngoài ra, nghiên cứu của Vats và ctv., (2004) cho thấy rằng chủng nấm A.nigervarteigham thì nguồn cacbon thích hợp nhất để sản xuất phytase lại là glucose kết hợp với tinh bột (2%). Theo Ebune và ctv., (1995) đã nghiên cứu sản xuất phyta-se từ chủng A.ficuum trên môi trường rắn có chứa bột cải dầu là chất cảm ứng. Kết quả cho thấy khi bổ sung bột cải dầu 5,2% đã làm tăng sản lượng phytase. Tổng hợp các nguồn dữ liệu từ các công trình nghiên cứu, nhóm thực hiện đã quyết định sử dụng hỗn hợp bột bắp và bột đậu nành theo tỉ lệ 3:1 là nguồn dinh

dưỡng kết hợp với thành phần hổn hợp dung dịch khoáng đã nêu trong phần vật liệu tạo thành hỗn hợp môi trường lên men sinh tổng hợp sinh khối giàu phytase.

Tuy nhiên, khi đã lựa chọn được thành phần môi trường lên men, bước tiếp theo cần phải tiến hành khảo sát lựa chọn điều kiện lên men phù hợp. Trong quá trình lên men A. niger YD sinh phytase tăng dần từ ngày thứ 3 và cao nhất vào ngày thứ 5 khác biệt có ý nghĩa so với các ngày khác. Kết quả này cũng tương tựvới kết quả của Shieh và Ware (1968) trên A. niger NRRL 3135; Vats và Banerjee (2002) trên là A.niger và Trần Thị Tuyết và ctv., (2005) đối với chủng A.niger NRRL 363 khi nuôi cấy để sản xuất phytase bằng phương pháp lên men bề mặt trên môi trường cám mì thì thời gian đạt giá trị phytase cao nhất là 5 ngày và sau 8 ngày thì enzyme bị phân hủy hoàn toàn. Vì vậy, thời gian nuôi cấy 5 ngày được xem là tối ưu để A.niger YD sinh phy-tase cao nhất và được áp dụng cho các thí ng-hiệm tiếp theo. Đồng thời, nhiệt độ cũng là điều kiện quan trọng trong quá trình lên men. Hầu hết các vi sinh vật dùng trong sản xuất phytase đều thuộc dạng ưa nhiệt trung bình ngoại trừ các nấm ưa nhiệt như Thermomyces lamiginosus (T.lamiginosus), T.thermophilus, Streptococcus thermophile (Wodzinski và Ullah, 1996). Nhiệt độ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp phytase đối với hầu hết các vi sinh vật nằm trong khoảng từ 25- 37oC (Narahara và ctv., 1982) và phù hợp với kết quả nghiên cứu tại 370C là nhiệt độ tối ưu cho A.niger YD sinh tổng hợp phytase cao nhất.

Ngoài ra, đối với lên men bán rắn, điều kiện quan trọng nhất vẫn là kiểm soát độ ẩm của môi trường lên men. Nếu độ ẩm đó phù hợp thì hệ sợi của nấm mốc sẽ phát triển nhanh chóng và sinh tổng hợp các sản phẩm mạnh (Pandey, Soccol và Mitchell, 2000). Còn nếu độ ẩm cao



hơn độ ẩm tối ưu sẽ làm giảm sự xốp của môi trường, giảm sự vận chuyển oxy và tăng cường hình thành sợi nấm khí sinh. Tương tự như vậy, độ ẩm thấp hơn độ ẩm tối ưu dẫn đến làm giảm sự hoà tan của các chất dinh dưỡng trong cơ chất rắn. Kết quả nghiên cứu độ ẩm môi trường lên men tối ưu là 70% và pH 6,5-7,0 đối với chủng A.niger YD trên hỗn hợp cơ chất (bột bắp và bột đậu nành), kết quả này tương tự với nghiên cứu của Batal và Karem (2001), độ ẩm 60-70% thì thích hợp cho A.niger sinh tổng hợp phytase và theo Vats và Banerjee (2002) pH tối ưu cho sinh tổng hợp phytase ở A.niger là 6,5.

V. KẾT LUẬN

Từ các thí nghiệm nghiên cứu tìm thành phần môi trường và điều kiện lên men bề mặt tối ưu cho sinh tổng hợp phytase từ A.niger YD này, đồng thời kết hợp kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Nguyện và ctv., (2009) đã xây dựng được quy trình lên men sinh tổng hợp phytase dạng pilot có công suất 80-100 kg/mẻ với môi trường lên men (bột bắp (73,32%), bột đậu nành (24,44%) và thành phần khoáng (2,24%), độ ẩm môi trường ban đầu (70%), nhiệt độ lên men (370C) và thời gian lên men là 5 ngày. Kết quả sinh khối giàu phytase sau khi lên men đạt 917,4 (ĐVHT/g).



Nguyễn Văn Nguyện, Phạm Duy Hải, Bạch Thị Quỳnh Mai, Nguyễn Thanh Nhãn, Nguyễn Văn Thanh, 2009. Báo cáo tổng hợp đề tài: “Nghiên cứu tạo chế phẩm sinh học giàu enzyme bổ sung nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn nuôi cá tra”, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.


Al-Asheh S., Duvnjak Z., 1994. The effect of surfactants on the phytase production and the reduction of the phytic acid content in canola meal by Aspergillus carbonarius during solid-state fermentation process. Biotechnol. Lett. 1692, pp. 183-188.

Cao, L., Wang, W., Yang, C., Yang, Y., Diana, J., Yakupitiyage, A., Luo, Z., and Li, D., 2007. Application of microbial phytase in fish feed. Enzyme and microbial technology 40 (4): 497–507.

Ebune, A., Al-Asheh, S., Duvnjak, Z., 1995. Production of phytase during solid-state fermentation using Aspergillus ficuum NRRL 3135 in canola meal. Biores. Technol. 53, pp. 7-12.

Gargova, S., Sariyska, M., 2003. Effect of culture conditions on the biosynthesis of aspergillus

niger phytase and acid phosphates. Enzyme and microbial technology 32, pp.231-235.

Han, Y.W., Gallagher, D.J., and Wilfred, A.G., 1987. Phytase production by Aspergillus ficuum on semi-solid substrate. J. Ind. Microbiol., 2, 195-200.20

Hardy, R.W., 2000. New developments in aquatic feed ingredients, and potential of enzyme supplements. In: Cruz -Suárez, L.E., Ricque-Marie, D., Tapia-Salazar, M.,

Hidayat, B.J., Eriksen, N.T., Wiebe, M.G., 2006. Acid phosphatase production by aspergillus niger m402a in continuous flow culture. Fems microbiol lett 254, pp. 324-331.

Kim, D.S., Godber, J.S., Kim, H.R., 1999. Culture condition for a new phytase- producing fungus. Biotechnology letters 21, pp. 1077-1081.

Kumar, V., Sinha, A.K., Makkar, H.P.S., De-Boeck, G., Becker, K., 2011. Phytate and phytase in fish nutrition. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition.

Li, X., Chi, Z., Liu, Z., Yan, K., Li, H., 2008. Phytase prodby a marine yeast Kodamea ohmeri BG3. A biochemistry and biotechnology 149 (2): 183–193.



Liu, B.L., Jong, C.H., Tzeng, Y.M., 1999. Effect of immonbilization on pH and thermal stability of aspergillus ficuum phytase. Enzyme and microbial technology 25, 517-521.

Nakamura, Y., Kukuhara, H., Sano, K., 2000. Secreted phytase activities of yeast, Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(4), pp. 841-844.

Narahara, H., Kodama, Y., Yoshida, T., Pichangkura, S., Ueda, R., Taguchi, H., 1982. Growth and enzyme production in a solid state fermentation culture of Aspergillus oryzae. J. Ferment Technol. 60, pp. 311-319.

Nwanna, L.C., Fagbenro, O.A.,& Adeyo, A.O., 2005. Effects of different treatments of dietary soybean meal and phytase on the growth and mineral deposition in African catfish Clarias gariepinus. Journal Of Animal And Veterinary Advance 4: 980-987.

Pandey, A., Soccol, C.R., Mitchell ,D.A., 2000a. New developments in solid state fermentation. I- bioprocesses and products. Process Biochemist. 35, pp. 1153-1169.

Pandey, A., Szakacs, G., Soccol, C.R., Rodriguez-Leon, J.A., Soccol, A.T., 2001. Production, purification and properties of microbial phytases. Bioresource Technol. 7, pp. 203-214.

Papagianni, M., Nokes, S.E., Filer, K., 2001. Submerged and solid state phytase fermentation by Aspergillus niger: effects of agitation and medium viscosity on phytase production, fungal morphology and inoculum performance. Food Technol. Biotechnol. 39(4), pp. 319-326.

Phromkunthong, W., and Gabaudan, J., 2006. Used of microbial phytase to replace inorganic phosphorus in sex-reversed red tilapia: 1 dose response. Songklanakarin J. Sci. Technol. 28 (4): 731-743.

Tran Thi Tuyet, Nguyen Duy Long, Hoang Quoc Khanh, 2005. Production of phytase by Aspergillus niger NRRL 363. Proceedings of Vietnam-Korea international symposium on Biotechnology and Bio-system engineering, pp, 39-43.

Vats, P., Banerjee, U.C., 2004. Production studies and catalytic properties of phytases. Enzyme and microbial technology 35, pp. 3-14.

Vats, P., Sahoo, D.K., Banerjee.,2004. Production of phytase (myo-Inositolhexakisphosphate Phosphohydrolase) by Aspergillus niger van Teighem in Laboratory-Scale fermenter. Biotechnol. Prog. 20, pp. 737-743.

Wodzinski, R.J., Ullah, A.H.J., 1996. Phytase. Adv. Appl. Microbiol. 42, pp. 263-303.



sTUdY on mediUm comPosiTion and condiTions oF semi-solid FeRmenTaTion sYnThesiZe high acTiViTY PhYTase FRom

Aspergilus niger Yd

Pham Duy Hai1*, Nguyen Van Nguyen1, Hoang Thi Hong Thom1, Tran Thi Le Trinh1

ABSTRACTPhytase supplementation has been found to increase not only the growth rate of monogastric ani-mals but also the efficiency of phosphate utilization in feeds, which significantly reduces phospho-rus excretion and the chances of environmental pollution. Thus, the objectives of this study were to optimize medium composition and conditions of fermentation semi-solid state for extracellular phytase by Aspergillus niger YD with the aim to increase yields to make it economical as a com-mercial product. With the experimental results achieved, medium composition include: corn starch (73%) and soybean meal (24.44%); and fermentation conditions optimum such as: temperature is 370C, fermentation time is 5 days and relative humidity of medium is 70%. With these parameters along and other parameters has been studied before, the extracellular phytase activity offermenta-tion was 917.40±13.48 U/g.

Keywords: Aspergillusniger YD, phytase, semi-solid fermentation, activity.

Người phản biện: ThS. Nguyễn Thị Hương Thảo




1 Center for Fishery Postharvest Technology, Research Institute for Aquaculture No.2 * Email:[email protected]



KiỂm chỨng mô hình Tương QUan giỮa ĐỘ TiÊU hÓa PRoTein IN VIVO VÀ IN VITRO TRÊn ThỨc ăn Tôm ThẺ

chÂn TRẮng (Litopenaeus vannamei)Nguyễn Thị Lan Chi1*, Lê Thị Lâm1

TÓM TẮTCác nhà quản lý chất lượng thức ăn thủy sản hiện đang tìm kiếm một công cụ nhằm kiểm tra độ tiêu hóa protein của thức ăn. Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đạm tiêu hóa trong thức ăn thủy sản” được thực hiện ở Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 đã bước đầu xây dựng được 6 mô hình hồi quy mô tả mối tương quan giữa độ tiêu hóa in vitro và độ tiêu hóa in vivo với hệ số tương quan khá cao (R2 > 0,9). Tuy nhiên, để đạt được hệ số tương quan này, các mô hình dự đoán phải là đường cong phi tuyến và đi qua điểm 0. Đây là giả định rất khó xảy ra trong thực tế vì không thể có mẫu cho độ tiêu hóa protein in vivo và in vitro bằng 0. Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện kiểm tra lại các mô hình này trên sáu mẫu thức ăn chế biến trong phòng thí nghiệm. Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả các mô hình dự đoán đều cho số dư dự đoán và độ chệch cao chứng tỏ các mô hình này không phù hợp để dự đoán giá trị độ tiêu hóa protein protein, cần thiết phải xây dựng lại mô hình hồi quy phù hợp, không đi qua điểm 0.

Từ khóa: độ tiêu hóa protein, phương pháp in vitro, phương pháp in vivo, thức ăn tôm thẻ chân trăng.

1 Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2. * Email: [email protected]

I. MỞ ĐẦU

Do tính tiện dụng, nhanh và chi phí thấp nên ngày nay đã có nhiều nhà khoa học trong ngành thực phẩm và thức ăn thủy sản nghiên cứu tìm cách sử dụng phương pháp in vitro nhằm dự đoán giá trị độ tiêu hóa protein in vivo của sản phẩm. Trong đó, phương pháp pepsin là phương pháp được các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực thực phẩm quan tâm nhất. Phương pháp này được sử dụng để đánh giá độ tiêu hóa protein của các nguyên liệu đạm động vật như bột cá, bột xương thịt, … và đã được chuẩn hóa thành các phương pháp tiêu chuẩn như AOAC 971.09, ISO 6655:1997, 72/199/EEC và TCVN 9129:2011. Các phương pháp này sử dụng dung dịch pepsin mạnh (0,2%) nên cho kết quả độ

tiêu hóa cao nhưng không phân biệt được chất lượng khác nhau giữa các loại bột cá (Miller et al., 2002). Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đạm tiêu hóa trong thức ăn thủy sản” đã sử dụng phương pháp AOAC 971.09 với dung dịch pepsin pha loãng (0,0002%) để xác định độ tiêu hóa pepsin. Vì theo Siccardi III (2006), có một mối tương quan tuyến tính (R2 = 0,55) giữa giá trị độ tiêu hóa protein in vivo và độ tiêu hóa pepsin khi sử dụng pepsin với nồng độ 0,0002%. Tuy nhiên, khi thực hiện xác định độ tiêu hóa protein bằng phương pháp pepsin tiêu hóa với nồng độ pepsin 0,2% thì tác giả đã không tìm thấy tương quan giữa 2 giá trị protein tiêu hóa in vivo và in vitro.



Ngoài phương pháp pepsin, đề tài còn áp dụng phương pháp pH drop và phương pháp pH stat với hệ 3 và hệ 4 ezyme. Kết quả cho thấy khi xem xét mối tương quan giữa phương pháp in vitro và phương pháp in vivo trên thức ăn tôm thẻ chân trắng, tất cả các phương pháp đều cho mối tương quan không đáng kể khi thực hiện xử lý số liệu với mô hình hồi quy tuyến tính hoặc với mô hình hồi quy phi tuyến (R2 < 0,3). Tuy nhiên, khi chuyển sang xử lý số liệu với mô hình hồi quy phi tuyến kết hợp với giả định đồ thị đi qua điểm 0 thì tất cả các phương pháp đều cho mối tương quan đáng kể (R2 > 0,9). Các mối tương quan này được mô tả bởi các phương trình hồi quy phi tuyến như hàm hữu tỷ [y = (a + bx)/(1 + cx + dx2)], hàm đa thức [y = a + bx + cx2 + dx3 hay y = a + bx + cx2] hoặc hàm mũ [y = a (1 – e-bx)]. Trong đó, phương pháp pepsin là phương pháp dự đoán độ tiêu hóa protein in vivo tốt nhất với hệ số xác định cao nhất (R2 = 0,93) (Trần Thị Lệ Trinh & Nguyễn Thị Lan Chi, 2013). Tuy nhiên, vẫn chưa thể sử dụng phương pháp này như là phương pháp chuẩn để kiểm tra độ tiêu hóa protein của thức ăn thương mại, vì giả định đi qua điểm 0 là một giả định khó chấp nhận xét về mặt sinh học. Chính vì vậy, chúng tôi đã thực hiện kiểm tra lại các mô hình này trên một số mẫu thức ăn chế biến trong phòng thí nghiệm. Việc kiểm tra được thực hiện bằng cách xác định độ tiêu hóa protein dự đoán khi thế các giá trị in vitro vào mô hình, và so sánh giá trị này với độ tiêu hóa protein xác định bằng phương pháp in vivo.


2.1. Vật liệu

Thức ăn chuẩn bị trong PTN: các mô hình tương quan được thực hiện kiểm chứng thông qua 6 mẫu thức ăn chế biến trong phòng thí nghiệm có thành phần thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành tăng dần (gồm mẫu thức ăn đối

chứng, thức ăn thay thế 20%, 40%, 60%, 80% và 100%).

Tôm thẻ chân trắng: tôm nuôi thương phẩm (trọng lượng tôm từ 8–10g/con) được thu tại Trung tâm Quốc gia giống thủy hải sản Nam Bộ, Bà Rịa Vũng Tàu (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II) sau khi kiểm tra không có mầm bệnh nguy hiểm.

Enzyme: enzyme tinh khiết hoặc hỗn hợp enzyme được chiết tách từ vi sinh vật của các hãng Himedia (Ấn Độ), Sigma-Aldrich (Mỹ) và Novozyme (Đan Mạch): Pepsin tinh khiết, hoạt độ 1:10000 (RM1251, Himedia); Trypsin từ tụy heo, loại IX-S, hoạt độ: 13.000 - 20.000 (T0303, Sigma-Aldrich); α-chymotrypsin từ tụy bò, loại II, hoạt độ: ≥ 40.000 (C4129, Sigma-Aldrich); Protease từ Streptomyces griseus, loại XIV, hoạt độ ≥ 3,5 (P5147, Sigma-Aldrich); Flavourzyme® 500 mg (Novozyme).

Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 03 năm 2014, tại phòng thí nghiệm Hóa sinh, Vi sinh và phòng thí nghiệm dinh dưỡng động vật nuôi thủy sản thuộc Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch (Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II).


2.2.1. Phương pháp chuẩn bị mẫu thức ăn có công thức được thiết lâp

Với mục đích tạo ra những thức ăn có thành phần khác nhau, chất lượng khác nhau nhằm kiểm chứng độ phù hợp của các mô hình, sáu khẩu phần được thiết lập có cùng mức đạm khoảng 40% và tỷ lệ protein thô/năng lượng (P/E) khoảng 102 mg P/Kcal gồm: khẩu phần đối chứng - TĐC, khẩu phần thay thế 20%, 40%, 60%, 80% và 100% bột cá Chi lê bằng bánh dầu đậu nành (T20, T40, T60, T80 và T100, tương ứng) (Bảng 1). Thành phần nguyên liệu tham khảo từ dự án nghiên cứu của Nguyễn Văn Nguyện (2012).



Quy trình chuẩn bị: các nguyên liệu thô được xay mịn, rây qua rây 0,5mm trước khi phối trộn. Cân các nguyên liệu khô trước (gồm bột cá, bột gan mực, bánh dầu đậu nành, wheat gluten, bột mì, dicalcium phosphate (CaHPO4), premix khoáng/vitamin, cholesterol, methionine, lysine, choline chloride, stay C, chất hấp dẫn, chống mốc, chống oxi hóa, Cr2O3), trộn đều các nguyên liệu này với nhau trong khoảng 10 phút, xay lại hỗn hợp nguyên liệu cho mịn trước khi cho lecithin và dầu gan mực vào. Tiếp tục trộn thêm 5 phút. Thêm khoảng 30% nước cất vào, nhào đều, rồi đem hấp trong 30 phút. Sau khi hấp, thêm từ

từ khoảng 25% nước cất đã được đun sôi vào; trộn đều và nhồi cho đến khi thức ăn thành một hỗn hợp đặc, sệt; nén, bóp lại thành từng cục. Sử dụng máy xay thịt (Meat mincing machine TJ12-B) để ép 02 lần cho trộn đều trước khi ép thành viên thức ăn có đường kính lỗ khuôn là 2mm. Sau đó, sấy khô ở 60oC trong 24 giờ, thỉnh thoảng mở cửa tủ sấy. Trong quá trình sấy, kiểm tra nhanh độ ẩm của viên thức ăn, nếu độ ẩm < 10% là đạt. Cuối cùng thức ăn được cắt nhỏ thành viên có kích thước khoảng 5 mm. Thức ăn được bảo quản ở -20oC cho đến khi sử dụng.

Bảng 1. Thành phần nguyên liệu của thức ăn thí nghiệmNguyên liệu (%) TĐC T20 T40 T60 T80 T100

Bột cá Chilê 65% 33,00 26,40 19,80 13,20 6,60 0,00

Bột gan mực 1,00 1,50 3,00 4,00 5,00 6,00

Bánh dầu đậu nành 45% 24,00 33,00 41,20 48,60 54,70 58,70

Wheat gluten 4,00 4,00 4,00 5,00 6,00 8,00

Bột mì 29,85 26,80 23,55 19,30 17,40 13,75

Dicalcium phosphate 2,00 2,00 2,00 3,00 3,00 6,00

Premix khoáng/vitamin* 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Dầu gan mực 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50

Lecithin 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50

Cholesterol 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10

Lysine 0,05 0,05 0,1 0,45 0,75 0,95

Methionine (Met) 0,10 0,25 0,35 0,45 0,55 0,60

Choline chloride 60% 0,65 0,65 0,65 0,65 0,65 0,65

Chất hấp dẫn** 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10

Stay C 35% 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03

Chống mốc 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10

Chống oxi hóa 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02

Cr2O3 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

* Premix khoáng/vitamin (Bauer et al., 2012): Vitamin A (500.000 UI/kg), Vitamin D3 (250.000 UI/kg), Vitamin E (5.000 mg/kg), Vitamin K3 (500 mg/kg), Vitamin B1 (1.000 mg/kg), Vitamin B2 (1.000 mg/kg), Vitamin B6 (1.000 mg/kg), Vitamin B12 (2.000 μg/kg), Niacin (2.500 mg/kg), Calcium pantothenate (4.000 mg/kg), Folic acid (500 mg/kg), Biotin (10 mg/kg), Vitamin C (10.000 mg/kg), Choline (100.000 mg/kg), Inositol (1.000 mg/kg), Selen (30 mg/kg), Săt (5.000 mg/kg), Đồng (1.000 mg/kg), Mangan (5.000 mg/kg), Kẽm (9.000 mg/kg), Cobalt (50 mg/kg), Iodine (200 mg/kg).

** Chất hấp dẫn Aquatrac do công ty GePro (Đức) cung cấp.



Bảng 2. Thành phần hóa học của các nguyên liệu chính được sử dụng tạo thức ăn thí nghiệm

Nguyên liệu Ẩm (%) Protein (%) Lipid (%) Tro (%) Xơ (%)

Bột cá Chilê 65% 7,95 ± 0,01 65,37 ± 0,52 7,17 ± 0,61 16,09 ± 0,01 0,98 ± 0,24

Bột gan mực 6,67 ± 0,01 45,16 ± 0,27 16,47 ± 0,47 7,75 ± 0,06 6,45 ± 0,55

BDĐN 45% 10,08 ± 0,14 48,80 ± 0,17 2,70 ± 0,54 6,18 ± 0,08 7,89 ± 0,07

Wheat gluten 7,84 ± 0,07 77,54 ± 0,36 0,78 ± 0,13 0,74 ± 0,25 0,38 ± 0,16

Bột mì 12,06 ± 0,06 11,23 ± 0,22 1,47 ± 0,32 0,58 ± 0,05 0,51 ± 0,11

2.2.2. Phương pháp pH drop 3 enzyme

Theo Hsu et al., (1977) và Lazo et al.,

(1998), phương pháp pH drop 3 enzyme được

thực hiện như sau: cân mẫu thức ăn và casein

sao cho mẫu chứa 6,25 mg protein. Thêm 10ml

nước cất vào các cốc, lắc đều trong 1 giờ, ở nhiệt

độ phòng. Điều chỉnh pH dung dịch về pH 8,0

bằng NaOH 0,1N. Thêm 1,0ml hỗn hợp enzyme

(1,6 mg/ml trypsin + 3,1 mg/ml chymotrypsin +

1,6 mg/ml Flavourzyme® 500MG), lắc đều, đo

lại pH sau 10 phút. Kết quả xác định độ tiêu hóa

tương đối như sau:Độ tiêu hóa protein tương đối (RPD, %)

=(-∆pH mẫu)

x 100(-∆pH casein)

2.2.3. Phương pháp pH drop 4 enzyme:

(Satterlee et al., 1979; Lazo et al., 1998)

Chuẩn bị mẫu tương tự pH drop 3 enzyme.

Sau đó, thêm 1,0 ml dung dịch A (1,6 mg/ml

trypsin + 3,1 mg/ml chymotrypsin + 1,6 mg/ml

Flavourzyme® 500MG), lắc đều trong 10 phút.

Thêm 1,0 ml dung dịch B (7,95 mg/ml protease

từ Streptomyces griseus), lắc đều và chuyển vào

bể ủ nhiệt, ủ ở 55oC trong 9 phút. Lấy cốc ra để

ở nhiệt độ phòng và ghi nhận giá trị pH sau 1

phút. Độ tiêu hóa tương đối được tính tương tự

pH drop 3 enzyme.

2.2.4. Phương pháp pH stat 3 enzyme:

(Pedersen & Eggum, 1983)

Cân mẫu thức ăn sao cho mẫu chứa 18,75

mg protein. Thêm 30 ml nước cất vào các cốc,

lắc đều trong 1 giờ, ở nhiệt độ phòng. Điều

chỉnh pH dung dịch về pH 8,0 bằng NaOH

0,1N. Thêm 3,0 ml hỗn hợp 3 enzyme (1,6

mg/ml trypsin + 3,1 mg/ml chymotrypsin +

1,6 mg/ml Flavourzyme® 500MG), lắc đều và

duy trì pH của dung dịch ở pH 8,0 bằng cách

thêm NaOH 0,1N từ máy chuẩn độ điện thế tự

động Radiometer TritraLab 865, trong 3 giờ.

Sau đó, ghi nhận lại thể tích NaOH 0,1N đã

sử dụng.

Độ thủy phân (DH, %) = BxNBx1/αx1/

MPx1/htotx100



Trong đó: B: thể tích NaOH 0,1N đã sử dụng (ml); NB: Nồng độ đương lượng của NaOH (N); 1/α: Hệ số thuỷ phân của nhóm α -amin phụ thuộc pK amin ở điều kiện nhiệt độ và pH thực nghiệm; MP: lượng protein trong phản ứng (%); 1/htot: tổng số liên kết peptide của các mẫu pro-tein khác nhau (meq/g).

Hình 1. Máy chuẩn độ điện thế tự động2.2.5. Phương pháp pH stat 4 enzyme:

(Ezquerra et al., 1997)

Thực hiện tương tự phương pháp pH stat 3 enzyme, tuy nhiên enzyme sử dụng là hỗn hợp 4 enzyme (1,6 mg/ml trypsin + 3,1 mg/ml chymo-trypsin + 1,6 mg/ml Flavourzyme® 500MG + 7,95 mg/ml protease từ Streptomyces griseus), thời gian phản ứng là 2 giờ. Kết quả xác định độ thủy phân (DH) được tính theo công thức như trong phương pháp pH stat 3 enzyme.

2.2.6. Phương pháp pepsin tiêu hóa: (Siccardi III, 2006; AOAC, 971.09)

Ban đầu mẫu được khử béo bằng cách chiết mẫu với ether dầu bằng Soxhlet.

Cân 0,5 g mẫu đã khử béo, cho vào ống máy xoay cùng với 150 ml dung dịch pepsin 0,0002% (trong HCl 0,075N). Ủ ở 45oC, tốc độ xoay: 15 vòng/phút, trong 16 giờ.

Sau khi ủ, để lắng, lọc bằng giấy lọc đã cân trọng lượng qua phễu buchner. Rửa lại 2 lần với acetone, mỗi lần 15 ml acetone.

Xác định protein thô trên cặn thu được (Protein thô của cặn không tiêu hóa).

Protein tiêu hóa (%) = 100 -

Protein thô cặn thu được x 100Protein thô của mẫu

Nếu xem xét hàm lượng Nitơ phi protein:

Protein tiêu hóa (%) = 100 -

Protein thô cặn thu được x 100

Protein thô của mẫu – (Nitơ phi protein x 6,25)

2.2.7. Quy trình nuôi thử nghiệm in vivoChọn tôm thí nghiệm có kích cỡ đồng

đều (8 – 10g), khỏe mạnh. Tôm được bố trí vào 18 bể kính có đánh số, mật độ 10 con/bể, thể tích chứa nước 70 lít, nước nuôi tôm có độ mặn 18‰. Hệ thống lọc nước chỉ được sử dụng vào ban đêm. Định kỳ một tuần thay nước một lần, thay khoảng 50% thể tích nước của bể. Thử nghiệm bao gồm 6 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần. Trước khi thí nghiệm tôm được nuôi dưỡng trong

vòng một tháng để thích nghi với môi trường, cho ăn cùng một loại thức ăn thương mại. Sau đó tập cho tôm ăn thức ăn thí nghiệm trong vòng 3 ngày rồi mới tiến hành thu phân.

Khi tiến hành thử nghiệm cho tôm ăn 03 lần/ngày, cho ăn 4 - 6% trọng lượng thân, lượng thức ăn được điều chỉnh sao cho tôm ăn hết tránh để thức ăn còn dư trong bể. Sau 30 phút cho ăn kiểm tra lại lượng thức ăn đã cho ăn. Tiến hành siphong thu phân, ngày thu phân 2 lần. Tôm được nuôi khoảng 1 tháng.



Trong thời gian thí nghiệm các chỉ tiêu môi trường như: pH, to, DO, N-NH3, N-NO2

- được theo dõi thường xuyên: pH, nhiệt độ đo mỗi ngày 1 lần; DO, N-NH3, N-NO2

- đo mỗi tuần 1 lần.

Phân thu được được bảo quản ở -20oC cho đến khi tiến hành sấy đông khô. Sau khi sấy đông khô, phân được đem xác định độ ẩm, protein thô và hàm lượng Cr2O3.

Độ tiêu hóa protein khả kiến APD (%)

= 100 -% Cr2O3thức ăn

x% Protein phân

x 100% Cr2O3phân % Protein thức ăn

2.2.8. Phương pháp phân tíchHàm lượng protein thô được xác định theo

TCVN 4328-1:2007.Hàm lượng lipid thô được xác định theo

TCVN 4331:2001. Hàm lượng tro được xác định theo TCVN

4327:2007.Độ ẩm được xác định theo TCVN

4326:2001.Hàm lượng Nitơ phi protein xác định theo

TCVN 8801:2011.Hàm lượng Cr2O3 được xác định theo

phương pháp của Furukawa & Tsukahara, 1966.Hàm lượng N-NO2

- xác định theo phương

pháp APHA 2005.4500.NO2B.

Hàm lượng N-NH3 xác định theo phương pháp APHA 2005.4500.NH3 F.

2.2.9. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để phân tích thống kê. Khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% (P < 0,05).

Để kiểm chứng các mô hình tương quan, chúng tôi đã sử dụng 6 mẫu thức ăn chế biến trong phòng thí nghiệm. Kết quả kiểm tra được đánh giá dựa trên số dư dự đoán, và độ chệch khi thế các giá trị in vitro vào mô hình và so sánh với giá trị in vivo thu nhận được. Theo Lemos et al., (2009), số dư dự đoán được tính như sau:

Số dư dự đoán = APD dự đoán từ in vitro - APD xác định từ in vivo

Độ chệch (%) =APD dự đoán từ in vitro – APD xác định từ in vivo

x 100APD xác định từ in vivo

III. KẾT QUẢ

3.1. Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng trong các mẫu thức ăn chế biến trong PTN

Kết quả phân tích thành phần dinh dưỡng của các mẫu thức ăn chế biến từ bảng 3 cho thấy hàm lượng protein không khác nhau có ý nghĩa

thống kê trong tất cả các khẩu phần. Trong khi đó, hàm lượng lipid có dao động và có khuynh hướng giảm nhẹ khi tăng phần trăm thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành. Do bánh dầu đậu nành (lipid 2,70%) có hàm lượng lipid thấp hơn so với bột cá (7,17%) nên khi tăng phần trăm bánh dầu đậu nành thì hàm lượng lipid giảm.



Bảng 3. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn chế biến trong PTN (n = 3)

TT MẫuProtein

(%, VCK)Lipid

(%, VCK)Tro

(%, VCK)Xơ

(%, VCK)Tỷ lệ Ca/P

1 TĐC 44,36a ± 0,35 5,87c ± 0,13 11,38e ± 0,02 2,46a ± 0,12 1,48

2 T20 44,00a ± 0,52 5,57bc ± 0,24 10,89d ± 0,05 3,27b ± 0,20 1,48

3 T40 44,73a ± 0,35 5,45abc ± 0,11 10,60c ± 0,02 3,98bc ± 0,34 1,52

4 T60 44,49a ± 0,73 5,52abc ± 0,29 10,61c ± 0,01 4,70cd ± 0,18 1,45

5 T80 44,54a ± 0,37 5,00ab ± 0,27 10,03b ± 0,03 5,14de ± 0,26 1,29

6 T100 44,64a ± 0,25 4,95a ± 0,09 9,39a ± 0,01 5,79e ± 0,32 1,52

* Các giá trị trong cùng một cột có ký hiệu mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)

Khi xét các thành phần khác thì thành phần tro và xơ thay đổi đáng kể. Khi tăng phần trăm thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành thì hàm lượng xơ tăng và hàm lượng tro giảm. Điều này được giải thích do bánh dầu đậu nành có hàm lượng xơ (7,89%) cao và tro (6,18%) thấp hơn so với bột cá (xơ 0,98% và tro 16,09%). Xét tỷ lệ Ca/P cho thấy, tất cả các khẩu phần đều có tỷ lệ Ca/P ≥ 1. Theo Davis et al., (1993), nếu Ca hiện diện 1% thì hàm lượng phosphor từ 0,5 – 1%, nếu là 2% thì hàm lượng phosphor 1 – 2%. Như vậy, tỷ lệ Ca/P trong các mẫu thức ăn thí nghiệm đều thỏa điều kiện tăng trưởng của tôm thẻ.

So sánh với quy định tạm thời về thức ăn tôm thẻ chân trắng (thông tư 73/2009/BNNPTNT, ngày 20/11/2009), các thành phần dinh dưỡng của các mẫu thức ăn thí nghiệm đều thỏa mãn tiêu chuẩn dành cho tôm giai đoạn từ 3 – 12,g (đây cũng là giai đoạn tôm nuôi thí nghiệm), chỉ có hàm lượng xơ của thức ăn T60, T80 và T100 là cao hơn ngưỡng cho phép (> 4%).

3.2. Độ tiêu hóa protein in vivo của thức ăn chế biến trong PTN

Trong thời gian nuôi thử nghiệm, các yếu tố môi trường đều nằm trong khoảng thuận lợi cho sự sinh trưởng của tôm, trong đó nhiệt độ từ 28,0 – 30,7oC; pH: 7,1 – 8,3; DO: 6,5 – 7,4 mg/l; N-NH3: 0,001 – 0,013 mg/l; N-NO2

-: 0,002 – 0,015 mg/l.



Kết quả cho thấy hệ số biến động (CV) khi thực hiện nuôi thử nghiệm in vivo vẫn nằm trong giới hạn cho phép (< 5%), độ biến động không cao, kết quả có thể tin cậy được. Khi xét kết quả độ tiêu hóa protein in vivo, có thể nhận thấy độ tiêu hóa protein in vivo của mẫu thức ăn đối chứng tương đối thấp (62,09 ± 2,03%). Do các mẫu thức ăn được chế biến trong điều kiện PTN, trộn bằng tay và ép bằng máy xay thịt nên có độ tiêu hóa kém hơn so với các mẫu thức ăn thương mại có cùng hàm lượng protein. Các mẫu thức ăn thương mại được sản xuất trong nhà máy với các thiết bị máy móc hiện đại, nguyên liệu được xay mịn hơn, trộn đều hơn. Ngoài ra, các mẫu thức ăn thương mại còn trải qua các giai đoạn chịu nhiệt, làm chín và nén ép, rất khác biệt so với thức ăn chế biến trong phòng thí nghiệm, cho nên các mẫu thức ăn này có độ bền cao và độ tiêu hóa protein cao hơn hẳn.

Khi tăng phần trăm thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành thì độ tiêu hóa protein in vivo giảm. Đặc biệt ở tỷ lệ 80 và 100% thì độ tiêu hóa in vivo giảm đáng kể và khác biệt có ý nghĩa so với các tỷ lệ còn lại. Năm 1990, Lim & Dominy cũng đã nghiên cứu đánh giá tỷ lệ thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành. Kết

quả cho thấy khi thay thế bột cá đến 40% thì trọng lượng tôm không khác nhau có ý nghĩa thống kê, tuy nhiên khi tăng phần trăm thay thế thì trọng lượng tôm giảm đáng kể. Trong nghiên cứu này, tác giả đã không đánh giá sự thay đổi của độ tiêu hóa protein in vivo, tuy nhiên, tác giả có khảo sát hệ số sử dụng protein (apparent net protein utilization). Kết quả cho thấy các khẩu phần thay thế đến 80% thì thay đổi không khác biệt có ý nghĩa thống kê, chỉ có khẩu phần thay thế 100% mới giảm đáng kể. Kết quả này cũng khá tương đồng với kết quả nghiên cứu của đề tài khi khẩu phần T100 có giá trị APD thấp hơn đáng kể so với các khẩu phần còn lại.

3.3. Kiểm chứng mô hình tương quanKết quả nghiên cứu từ đề tài “Nghiên cứu

xây dựng quy trình phân tích đạm tiêu hóa trong thức ăn thủy sản” cho thấy có 6 phương trình hồi quy phi tuyến có hệ số tương quan cao (Bảng 5) khi thực hiện xử lý số liệu hồi quy phi tuyến có bổ sung điểm 0, nhằm đánh giá mối tương quan giữa phương pháp in vitro và phương pháp in vivo với số liệu của 40 mẫu thức ăn thương mại (Trần Thị Lệ Trinh & Nguyễn Thị Lan Chi, 2013).

Bảng 4. Độ tiêu hóa protein in vivo của thức ăn chế biến tại PTN

Mẫu

Thức ăn Phân

APD* (%) CV (%)Cr2O3

(%, VCK)Protein thô(%, VCK)

Cr2O3

(%, VCK)Protein thô (%,

VCK)

TĐC 1,00 ± 0,02 44,36 ± 0,19 2,67 ± 0,06 45,05 ± 1,84 62,09a ± 2,03 3,28

T20 1,00 ± 0,04 44,00 ± 0,26 2,37 ± 0,19 39,84 ± 3,33 61,79a ± 1,29 2,09

T40 0,94 ± 0,15 44,73 ± 0,05 2,36 ± 0,09 43,84 ± 1,52 60,78a ± 1,58 2,59

T60 0,98 ± 0,01 44,49 ± 0,21 2,41 ± 0,15 43,64 ± 0,06 59,76ab ± 2,70 4,52

T80 1,02 ± 0,01 44,54 ± 0,25 2,32 ± 0,05 45,23 ± 0,85 55,41bc ± 0,21 0,38

T100 0,95 ± 0,01 44,64 ± 0,54 1,87 ± 0,05 40,42 ± 1,02 53,93c ± 2,19 4,06

* Các giá trị trong cùng một cột có ký hiệu mũ khác nhau thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (P < 0,05)



Bảng 5. Các phương trình tương quan giữa phương pháp in vitro và in vivo với giả thiết đi qua điểm 0

Phương pháp in vitro Phương trình hồi quy Hằng số Hệ số tương quan, R2

Pepsin y = a + bx + cx2

a = -0,20244b = 1,87624c = -0,01118

0,963

Pepsin - NPP y = a + bx + cx2

a = 0,05873b = 2,01401c = -0,01287

0,963

pH drop 3 enzyme

a = 0,00394b = 3,07784c = -0,00170d = 0,00042

0,963

pH drop 4 enzyme y = a + bx + cx2 + dx3

a = -0,00196b = 4,03978c = -0,06426d = 0,00032

0,954

pH stat 3 enzyme y = a (1 – e-bx)a= 77,85977b = 0,30111

0,953

pH stat 4 enzyme y = a (1 – e-bx)a = 79,74929b = 0,16573

0,956

Để kiểm chứng các mô hình trên, đề tài đã sử dụng 6 mẫu thức ăn chế biến trong phòng thí nghiệm. Kết quả đánh giá số dư dự đoán, độ

chệch và độ đúng khi thế các giá trị in vitro vào mô hình và so sánh với giá trị in vivo, được thể hiện trong các bảng sau:

Bảng 6. Kết quả số dư dự đoán, độ chệch và độ đúng khi kiểm chứng mô hình tương quan giữa phương pháp pepsin tiêu hóa và in vivo

MẫuĐộ tiêu hóa pepsin (%)

APD dự đoán (%)

APD xác định (%)

Số dư dự đoán

Độ chệch (%)

Độ đúng (%)

TĐC 59,11 ± 0,31 71,63 62,09 ± 2,03 9,54 15,36 115,36

T20 54,61 ± 1,73 68,91 61,79 ± 1,29 7,12 11,53 111,53

T40 59,87 ± 0,03 72,05 60,78 ± 1,58 11,27 18,54 118,54

T60 61,23 ± 2,89 72,76 59,76 ± 2,70 13,00 21,75 121,75

T80 59,21 ± 0,03 71,69 55,41 ± 0,21 16,28 29,37 129,37

T100 30,65 ± 5,00 46,80 53,93 ± 2,19 -7,13 -13,22 86,78



Bảng 7. Kết quả số dư dự đoán, độ chệch và độ đúng khi kiểm chứng mô hình tương quan giữa phương pháp pepsin tiêu hóa – NPP và in vivo

MẫuĐộ tiêu hóa pepsin (%)

APD dự đoán (%)

APD xác định (%)

Số dư dự đoán

Độ chệch (%)

Độ đúng (%)

TĐC 51,59 ± 0,37 69,71 62,09 ± 2,03 7,61 12,26 112,26

T20 47,00 ± 2,02 66,28 61,79 ± 1,29 4,49 7,27 107,27

T40 53,30 ± 0,30 70,84 60,78 ± 1,58 10,06 16,55 116,55

T60 54,99 ± 3,12 71,89 59,76 ± 2,70 12,13 20,29 120,29

T80 53,43 ± 0,30 70,93 55,41 ± 0,21 15,51 28,00 128,00

T100 19,15 ± 6,05 33,91 53,93 ± 2,19 -20,02 -37,12 62,88

Từ bảng 6 và 7 có thể nhận thấy với các khẩu phần có chứa bột cá (TĐC, T20 – T80) thì phương pháp pepsin (không tính và có tính hàm lượng NPP) cho kết quả độ tiêu hóa pepsin tương tự nhau, chỉ có khẩu phần thay thế bột cá hoàn toàn (T100) mới có độ tiêu hóa pepsin thấp. Điều này cho thấy phương pháp pepsin (không tính và có tính hàm lượng NPP) chỉ có thể phân biệt giữa thức ăn không chứa bột cá và thức ăn có chứa bột cá, chứ không thể đánh giá chất lượng giữa các khẩu phần có độ tiêu hóa khác nhau khi các khẩu phần này có chứa bột cá. Khi thế giá trị độ tiêu hóa pepsin vào

mô hình tương quan thì kết quả cho thấy số dư dự đoán tăng dần khi tăng phần trăm thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành. Tuy nhiên, khi thay thế hoàn toàn bột cá bằng bánh dầu đậu nành (T100) thì cho số dư dự đoán âm. Điều này chứng tỏ mô hình tương quan được xây dựng giữa phương pháp pepsin tiêu hóa và phương pháp in vivo chỉ phù hợp để dự đoán những thức ăn có thành phần protein có nguồn gốc động vật, khi mẫu thức ăn có thành phần protein có nguồn gốc thực vật cao thì khả năng dự đoán không còn chính xác nữa.

Bảng 8. Kết quả số dư dự đoán, độ chệch và độ đúng khi kiểm chứng mô hình tương quan giữa phương pháp pH drop 3 enzyme và in vivo

Mẫu RPD (%)APD dự đoán

(%)APD xác định

(%)Số dư dự

đoánĐộ chệch

(%)Độ đúng

(%)

TĐC 68,02 ± 2,69 74,56 62,09 ± 2,03 12,46 20,07 120,07

T20 68,44 ± 2,50 74,40 61,79 ± 1,29 12,61 20,41 120,41

T40 73,89 ± 3,76 72,33 60,78 ± 1,58 11,55 18,99 118,99

T60 67,44 ± 1,88 74,76 59,76 ± 2,70 15,00 25,10 125,10

T80 55,03 ± 6,28 78,21 55,41 ± 0,21 22,80 41,15 141,15

T100 67,40 ± 1,65 74,78 53,93 ± 2,19 20,85 38,65 138,65



Kết quả từ bảng 8 cho thấy phương pháp pH drop 3 enzyme cho độ tiêu hóa protein tương đối thay đổi không theo một khuynh hướng nào khi tăng phần trăm thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành. Khi xét số dư dự đoán cho thấy khi tăng phần trăm thay thế bánh dầu đậu nành

lên đến 60% (T60) thì số dư dự đoán bắt đầu tăng. Điều này chứng tỏ khả năng dự đoán APD của phương pháp pH drop 3 enzyme không cao, đặc biệt khi tăng phần trăm thành phần protein có nguồn gốc thực vật (thay thế từ 60% trở lên).

Bảng 9. Kết quả số dư dự đoán, độ chệch và độ đúng khi kiểm chứng mô hình tương quan giữa phương pháp pH drop 4 enzyme và in vivo

Mẫu RPD (%)APD dự đoán

(%)APD xác định

(%)Số dư dự

đoánĐộ chệch

(%)Độ đúng

(%)

TĐC 64,55 ± 1,78 79,54 62,09 ± 2,03 17,45 28,10 128,10

T20 66,89 ± 0,69 78,98 61,79 ± 1,29 17,19 27,82 127,82

T40 64,05 ± 0,92 79,66 60,78 ± 1,58 18,88 31,05 131,05

T60 67,53 ± 2,17 78,83 59,76 ± 2,70 19,07 31,91 131,91

T80 68,53 ± 1,50 78,59 55,41 ± 0,21 23,18 41,84 141,84

T100 68,72 ± 1,51 78,55 53,93 ± 2,19 24,62 45,64 145,64

Tương tự phương pháp pH drop 3 enzyme, phương pháp pH drop 4 enzyme cho số dư dự đoán cao và đặc biệt tăng khi thức ăn thay thế từ 80% bánh dầu đậu nành (Bảng 9). Như vậy,

phương pháp pH drop 4 enzyme cũng giống như phương pháp pH drop 3 enzyme có khả năng dự đoán APD không cao, nhất là khi phần trăm protein thực vật cao (thay thế từ 80% trở lên).

Bảng 10. Kết quả số dư dự đoán, độ chệch và độ đúng khi kiểm chứng mô hình tương quan giữa phương pháp pH stat 3 enzyme và in vivo

Mẫu DH (%)APD dự đoán

(%)APD xác định

(%)Số dư dự

đoánĐộ chệch

(%)Độ đúng

(%)

TĐC 7,99 ± 0,16 71,43 62,09 ± 2,03 9,33 15,03 115,03T20 7,90 ± 0,16 71,43 61,79 ± 1,29 9,63 15,59 115,59T40 6,00 ± 0,38 66,25 60,78 ± 1,58 5,47 9,00 109,00T60 6,36 ± 0,00 67,54 59,76 ± 2,70 7,77 13,01 113,01T80 6,60 ± 0,22 67,99 55,41 ± 0,21 12,58 22,70 122,70

T100 5,99 ± 0,38 66,14 53,93 ± 2,19 12,21 22,64 122,64

Bảng 10 cho thấy phương pháp pH stat 3 enzyme có khuynh hướng cho kết quả DH cao ở những khẩu phần có phần trăm bột cá cao, và ngược lại cho kết quả DH thấp ở những khẩu phần có phần trăm bột cá thấp. Số dư dự đoán từ phương pháp pH stat 3 enzyme thấp hơn so với các

phương pháp khác. Ở khẩu phần T80 và T100 số dư dự đoán cao hơn so với các khẩu phần còn lại, nhưng chênh lệch không nhiều. Điều này cho thấy phương pháp pH stat 3 enzyme có khả năng dự đoán APD ổn định hơn so với các phương pháp khác.



Bảng 11. Kết quả số dư dự đoán, độ chệch và độ đúng khi kiểm chứng mô hình tương quan giữa phương pháp pH stat 4 enzyme và in vivo

Mẫu DH (%)APD dự đoán

(%)APD xác định

(%)Số dư dự

đoánĐộ chệch

(%)Độ đúng

(%)

TĐC 14,77 ± 0,00 73,44 62,09 ± 2,03 11,35 18,28 118,28

T20 15,69 ± 0,25 74,53 61,79 ± 1,29 12,74 20,61 120,61

T40 16,29 ± 0,24 75,12 60,78 ± 1,58 14,33 23,58 123,58

T60 15,49 ± 0,25 74,43 59,76 ± 2,70 14,67 24,55 124,55

T80 13,78 ± 0,40 72,33 55,41 ± 0,21 16,92 30,53 130,53

T100 14,22 ± 0,24 73,01 53,93 ± 2,19 19,08 35,37 135,37

Giá trị DH thu nhận từ phương pháp pH stat 4 enzyme không cho thấy một khuynh hướng rõ rệt nào khi tăng phần trăm thay thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành (Bảng 11). Khi xét số dư dự đoán, kết quả cho thấy khi tăng phần trăm thay

thế bột cá bằng bánh dầu đậu nành thì số dư dự đoán tăng. Sở dĩ như vậy là do giá trị APD giảm, trong khi đó giá trị APD dự đoán thay đổi không đáng kể.

Bảng 12. Điểm trung bình của số dư dự đoán và độ chệch khi kiểm chứng mô hình

TT Phương pháp Điểm TB của số dư dự đoán Điểm TB của độ chệch

1 Pepsin 10,72 18,30

2 Pepsin-NPP 11,28 19,60

3 pH drop 3 enzyme 18,55 27,40

4 pH drop 4 enzyme 20,06 34,39

5 pH stat 3 enzyme 9,50 16,33

6 pH stat 4 enzyme 14,85 25,49

Khi thực hiện kiểm chứng, các giá trị APD dự đoán dựa trên các phương trình hồi quy phi tuyến có bổ sung điểm 0 cho số dư dự đoán (từ 9,50 – 20,06 điểm) và độ chệch (từ 16,33 – 34,39 điểm) khá cao. Trong đó, phương pháp pH stat 3 enzyme cho điểm trung bình của số dư dự đoán và độ chệch thấp nhất (9,50 và 16,33

điểm, tương ứng). Chứng tỏ phương pháp pH stat 3 enzyme có khả năng dự đoán APD ổn định hơn so với các phương pháp khác, tuy nhiên số dư dự đoán còn khá cao chứng tỏ mô hình hồi quy phi tuyến có bổ sung điểm 0 chưa phải là mô hình dự đoán tốt nhất.



Bảng 13. So sánh trung bình giữa phương pháp in vitro và in vivo

Phương pháp P(Levene test)

P(Kruskal-Wallis test)

Pepsin 0,029 0,001

Pepsin-NPP 0,006 0,001

pH drop 3 enzyme 0,001 0,000

pH drop 4 enzyme 0,000 0,000

pH stat 3 enzyme 0,026 0,000

pH stat 4 enzyme 0,000 0,000

Khi thực hiện xử lý thống kê so sánh giá trị trung bình của 2 phương pháp in vivo và in vitro, kết quả cho thấy tất cả các phương pháp đều cho kết quả APD dự đoán khác biệt có ý nghĩa thống kê so với giá trị APD in vivo (P < 0,05) (Bảng 13).

IV. THẢO LUẬNMột trong những thách thức đối với các nhà

quản lý là tìm ra một công cụ nhanh chóng và đáng tin cậy có thể dùng để dự đoán tương đối chính xác độ tiêu hóa protein của thức ăn thủy sản bày bán trên thị trường, nhằm quản lý chặt chẽ hơn tình hình chất lượng thức ăn hiện nay. Đây cũng là một nhu cầu quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất thức ăn thủy sản khi phương pháp in vitro có thể giảm đáng kể chi phí cũng như nhân công trong quá trình đánh giá nguyên liệu và thiết lập công thức thức ăn. Phương pháp in vitro mô phỏng sự tiêu hóa in vivo trên nguyên liệu đã được nhiều nhà nghiên cứu khoa học trên thế giới quan tâm và cho kết quả rất khả quan, hệ số tương quan tương đối cao. Tuy nhiên, việc ứng dụng phương pháp này vào đánh độ tiêu hóa protein của thức ăn thủy sản lại nhận được ít sự quan tâm hơn do tính chất phức tạp của thức ăn khi thức ăn là một hỗn hợp bao gồm cả protein thực vật lẫn protein động vật, trong khi đó, phương pháp in vitro chỉ cho tương quan cao khi xét đến nguồn gốc protein riêng biệt (Pedersen & Eggum, 1983). Chính vì vậy, khi thực hiện đánh

giá tương quan giữa độ tiêu hóa protein in vitro và in vivo trên 40 mẫu thức ăn tôm thẻ chân trắng thương mại, độ tương quan rất thấp (R2 < 0,3) cho tất cả các phương pháp được khảo sát (pH drop, pH stat và pepsin tiêu hóa). Ngoài hạn chế trên, 40 mẫu thức ăn thương mại được khảo sát có tính chất không quá khác biệt nhau nên các điểm trên đồ thị tương quan tập trung lại trong một nhóm giá trị làm cho hệ số tương quan của các phương trình tương quan thấp.

Khi sử dụng 6 mẫu thức ăn chế biến trong PTN để kiểm chứng mô hình tương quan thì giá trị APD của 6 mẫu thức ăn này khá thấp (từ 53,93 – 62,09%), và nằm ngoài khoảng dữ liệu của các phương trình hồi quy phi tuyến được xây dựng trên 40 mẫu thức ăn thương mại (từ 67,95 – 84,75%). Bên cạnh đó, số dư dự đoán ở tất cả các phương pháp đều khá cao (điểm trung bình ≥ 9,5). Như vậy, có thể nhận thấy các phương trình hồi quy phi tuyến này không phù hợp để xác định giá trị APD dự đoán đối với các mẫu có độ tiêu hóa biểu kiến thấp hơn khoảng dữ liệu (APD < 67,95%). Ngoài ra, khi bổ sung thêm điểm 0, tức là đã chấp nhận giả thiết khi x = 0 thì y = 0. Trong khi đó, đây là một giả thiết khó xảy ra trong thực tế, cho nên việc xây dựng các phương trình hồi quy phi tuyến đi qua điểm 0 có thể gây ra những sai số đáng kể khi dự đoán giá trị APD. Chính vì vậy, cần xây dựng lại các phương trình hồi quy mà không sử dụng điểm 0.



V. KẾT LUẬN

- Phương pháp pepsin tiêu hóa chỉ phù hợp để dự đoán độ tiêu hóa in vivo khi thức ăn có thành phần protein có nguồn gốc động vật cao, khi mẫu thức ăn có thành phần protein có nguồn gốc thực vật cao thì khả năng dự đoán không còn chính xác nữa.

- Phương pháp pH stat 3 enzyme có khả năng dự đoán độ tiêu hóa in vivo ổn định hơn so với các phương pháp in vitro khác, tuy nhiên số dư dự đoán còn khá cao chứng tỏ mô hình hồi quy phi tuyến có bổ sung điểm 0 chưa phải là mô hình dự đoán tốt nhất, cần xây dựng lại phương trình hồi quy mà không sử dụng điểm 0.


Trần Thị Lệ Trinh và Nguyễn Thị Lan Chi, 2013. Báo cáo chuyên đề “Đánh giá độ chính xác quy trình phân tích đạm tiêu hóa thông qua so sánh với kết quả nuôi thử nghiệm in vivo”. Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích đạm tiêu hóa trong thức ăn thủy sản”. Đề tài cấp Bộ, chương trình giai đoạn 2011 – 2015.

Nguyễn Văn Nguyện, 2012. Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ dự án sản xuất thực nghiệm “Hoàn thiện công nghệ sản xuất thức ăn công nghiệp cho cá tra, tôm sú và tôm càng xanh”. Dự án độc lập cấp Nhà nước, MS: DA – ĐL 2009/04.

TCVN 9129, 2011. Thức ăn chăn nuôi – Xác định hàm lượng nitơ hòa tan sau khi xử lý bằng pepsin trong axit clohydric loãng. Tiêu chuẩn quốc gia. Hà Nội.


72/199/EEC. Third Commission Directive of 27 April 1972 establishing Community methods of analysis for the official control of feedingstuffs. Consolidated Text produced by the CONSLEG system of the Office for Official Publications of the European Communities.

AOAC 971.09. Pepsin Digestibility of Animal Protein Feeds.

Ezquerra, J.M., Garcia-Carreno, F.L., Civera, R., Haard, N.F., 1997. pH-stat method to predict protein digestibility in white shrimp (Penaeus vannamei). Aquaculture. 157, 251 – 262.

Hsu, H.W., Vavak, D.L., Satterlee, L.D., Miller, G.A., 1977. A multienzyme technique for estimating

protein digestibility. Journal of Food Science. 42(5), 1269 – 1271.

ISO 6655:1997. Animal feeding stuffs - Determination of soluble nitrogen content after treatment with pepsin in dilute hydrochloric acid. International Organization for Standardization. Geneva. Switzerland.

Lazo, J. P., Romaire, R.P., Reigh, R.C., 1998. Evaluation of three in vitro enzyme assays for estimating protein digestibility in the Pacific white shrimp Penaeus vannamei. Journal of the World Aquaculture Society. 29 (4), 441 – 450.

Miller, E.L., Bimbo, A.P., Walters, D.E., Barlow, S.M., Sheridan, B., 2002. Determination of nitrogen solubility in dilute pepsin hydrochloric acid solution of fishmeal: interlaboratory study. J AOAC Int. 85(6). 1374 – 1381.

Pedersen, B., and Eggum, B.O., 1983. Prediction of protein digestibility by an in vitro enzymatic pH-stat procedure. Zeitschrift für Tierphysiologie Tierernährung und Futtermittelkunde. 49 (1-5), 265 – 277.

Satterlee, L.D., Marshall, H.F., Tennyson, J.M., 1979. Measuring protein quality. Journal of the American Oil Chemists’ Society 56 (3), 103-109.

Siccardi, III., A.J., 2006. Daily digestible protein and energy requirements for growth and maintenance of sub-adult Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei). A Dissertation for Doctor of Philosophy (Major subject: Nutrition). Texas A & M University.



ValidaTion oF RegRession models beTWeen IN VITRO and IN VIVO PRoTein digesTibiliTY oF Feeds FoR WhiTe leg shRimP

(Litopenaeus vannamei)

Nguyen Thi Lan Chi1*, Le Thi Lam1

ABSTRACTIn Vietnam, aquafeed official controllers are currently seeking a tool to determine protein digest-ibility of feed. The initial results of the project “Study on methods evaluating protein digestibility of aquafeeds” which was conducted in Research Institute for Aquaculture No. 2 were six regression models describing the relationship between in vitro and in vivo protein digestibility. These predic-tive models displayed high determination coefficients (R2 > 0,9) as they were nonlinear regression and passed through zero point. However, it is impossible to obtain a sample with no protein di-gestibility in terms of both in vitro and in vivo. Therefore, we need to validate these models by six formulated feeds processed in laboratory. The results of study indicated that the predictive capacity of all models was low since they produced high residuals and high bias. This means we need to find other regression models without zero point.

Keywords: protein digestibility, in vitro, in vivo, white leg shrimp feeds.

Người phản biện: TS. Vũ Anh Tuấn




1 Centre for Fishery Post-harvest Technology Research Institute for Aquaculture No. 2 * Email: [email protected]



KhẢo sáT ngUỒn PhỤ PhẨm cá TRa (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ nghiÊn cỨU Phương PháP XỬ lí

ĐỂ lÀm ngUYÊn liỆU sẢn XUẤT bỘT PePTide Nguyễn Thị Hương Thảo1*, Đinh Thị Mến1, Nguyễn Thị Mỹ Thuận1, Võ Đình Lệ Tâm2

TÓM TẮTPhụ phẩm quá trình chế biến cá tra được thu nhận tại các nhà máy sau khi cá được tách thịt bằng tay. Kết quả đánh giá cho thấy phụ phẩm cá tra chiếm hơn 40% nguyên liệu, chứa khoảng 10% protein và hơn 30% lipid. Việc xử lí phụ phẩm cá tra nhằm loại bỏ tối đa thành phần chất béo và vô hoạt enzyme nội tại tạo nguyên liệu sẵn sàng cho quá trình thủy phân thu nhận dịch peptide. Nghiên cứu đã khảo sát tỷ lệ nước thích hợp bổ sung vào nguyên liệu và phương pháp loại béo hiệu quả nhất. Kết quả cho thấy tỷ lệ nước bổ sung 1:1 (w:w) cho hiệu suất tách béo và thu hồi protein cao nhất. Việc ly tâm trước khi thủy phân giúp loại thêm được 10% béo, giảm tỷ lệ nhũ tương và tăng hàm lượng protein trong dịch thủy phân.

Từ khóa: peptide, corolase, phụ phẩm cá tra, ly tâm tách béo, vô hoạt enzyme.

1 Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 * Email: [email protected] 2 Trường Đại học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh


Ngày nay, phụ phẩm ngành chế biến cá đang dần được xem là một nguồn nguyên liệu tiềm năng hơn là chất thải. Tối ưu hóa việc sử dụng những thành phần này trở nên ngày càng quan trọng để cung cấp nguồn nguyên liệu cho những mục đích khác nhau. Một lượng lớn phần phụ phẩm giàu protein từ các nhà máy chế biến thủy sản bị thải bỏ mà không có những nỗ lực tận dụng. Theo Tổ chức nông lương thế giới (FAO) hàng năm có khoảng 100 triệu tấn cá được thu hoạch và khoảng 30% lượng này bị chuyển thành bột cá và thức ăn gia súc vì phẩm chất kém. Tốc độ phát triển nhanh của ngành nuôi trồng thủy sản cũng dẫn tới một lượng lớn phụ phẩm chứa những thành phần có chất lượng tốt mà vẫn có thể sử dụng cho con người.

Một trong những công cụ hữu hiệu để thu hồi protein từ phụ phẩm là thủy phân bằng enzyme. Quá trình này được dùng để cải thiện và nâng cấp những đặc tính dinh dưỡng và chức năng của protein. Mục đích chính của quá trình thủy phân phụ phẩm cá là đạt được độ thu hồi cao nhất các hợp phần có giá trị mà vẫn duy trì chất lượng. Để có thể kiểm soát hoàn toàn phản ứng enzyme thì cần phải bất hoạt enzyme nội tại trước khi thủy phân. Theo một số nghiên cứu thì nhiều enzyme nội tại đạt hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 50oC. Tại pH 7, nội tạng, gan và những phần khác có hoạt tính proteolytic cao nhất ở khoảng nhiệt độ 50 – 65oC (Shahidi & Han., 1995; Sovik & Rustad., 2005). Hầu hết những enzyme thương mại được sử dụng để thủy phân cũng hoạt động ở cùng những điều kiện này.



Việc bất hoạt từ đầu những enzyme nội tại có thể áp dụng để giảm hình thành những peptide đắng (Gildberg, 1993). Việc bất hoạt bằng nhiệt enzyme nội tại có thể dẫn tới biến tính và kết tủa protein (Mohr, 1980). Ngoài ra, biến tính protein dẫn tới việc chống lại sự tấn công của protease do phản ứng kị nước giữa các peptide hoặc phản ứng tự liên kết giữa các peptide lớn trong quá trình gia nhiệt có thể làm giảm khả năng thủy phân protein của enzyme và giảm hiệu suất thu hồi đạm cá thủy phân. Bên cạnh đó, trong trường hợp nguyên liệu tươi chứa hàm lượng quá cao lipid (10-30%) thì phức hợp protein-lipid có thể hình thành (Slizyte et al., 2004). Những phức chất này dường như cũng kháng lại khả năng phân giải proteolytic dẫn tới giảm lượng dầu tách ra và giảm hiệu suất thu hồi dịch đạm cá thủy phân. Nghiên cứu Phương pháp xử lí nguyên liệu dùng để sản xuất bột peptide được thực hiện nhằm khảo sát các ảnh hưởng của việc xử lí nhiệt ban đầu, việc bổ sung nước vào nguyên liệu trước khi thủy phân tới chất lượng cũng như hiệu suất thu hồi dịch đạm thủy phân nhằm có được phương pháp xử lí nguyên liệu thích hợp cho quá trình thu nhận peptide sau này.


2.1. Nguyên liệu:

Phụ phẩm cá Tra gồm đầu, xương sống, vây, vẩy, đuôi và mỡ bụng được lấy tại các nhà máy sản xuất phi lê cá Tra đông lạnh sau quá trình phi lê và tách nội tạng một cách thủ công. Phụ phẩm được rửa sơ bộ loại bỏ máu và tạp chất, để ráo, bảo quản trong thùng cách nhiệt với đá vảy, đưa về PTN trong vòng 5 giờ và bảo quản trong tủ đông -18oC tới khi sử dụng.

2.2. Protease:

Corolase 7089 (AB enzymes) là endopeptidase trung tính sản xuất từ vi khuẩn Bacillus subtilis, họat tính tối thiểu là 840 UHb/g, hoạt động ở pH từ 6 – 9, tối ưu ở pH 7 - 8 và nhiệt độ hoạt động tới 65oC, tối ưu ở khoảng 550C .

2.3. Đánh giá chất lượng nguyên liệu:

Nhằm lựa chọn cũng như tìm ra phương thức xử lí phù hợp phụ phẩm được đánh giá thành phần khối lượng và thành phần hóa học của từng phần cũng như của khối nguyên liệu chung.

- Thành phần khối lượng: nguyên liệu được tách từng phần gồm đầu, xương sống, vây, đuôi, mỡ bụng bằng thủ công sau đó cân khối lượng từng phần bằng cân kỹ thuật hai số lẻ. Số liệu trình bày trong phần kết quả là giá trị trung bình của 5 lần thí nghiệm.

- Thành phần hóa học được đánh giá dựa vào các chỉ tiêu sau: hàm lượng protein tổng (TCVN 4328-1:2007); độ ẩm (TCVN 4326:2001); tro (TCVN 5105-90); béo (TCVN 4331:2007); canxi (TCVN 1526-1: 2007); Phospho (TCVN 1525: 2001).

2.4. Xác định tỷ lệ nước: nguyên liệu

Nguyên liệu rã đông tự nhiên sau đó được bổ sung nước với các tỷ lệ nước:nguyên liệu là 0:1; 0,5:1; 1:1 và 1,5:1. Hỗn hợp được gia nhiệt để vô hoạt enzyme nội tại trong bể điều nhiệt ở 95oC trong 10 phút. Sau đó tiến hành thủy phân bằng enzyme Corolase 7089 với tỷ lệ E/S=0,5% ở 50oC trong 3 giờ, pH phản ứng được điều chỉnh mỗi 15 phút bằng NaOH. Hỗn hợp sau khi thủy phân được gia nhiệt ở 95oC trong 10 phút để ngừng phản ứng enzyme sau đó ly tâm ở 6,000g x 10 phút. Tách phần béo ở phía trên, phần dịch trong và phần rắn không



tan, ghi nhận khối lượng từng phần. Xác định các chỉ tiêu hiệu suất tách béo và hiệu suất thu hồi protein để chọn tỷ lệ nước bổ sung phù hợp nhất.

2.5. Khảo sát phương pháp xử lí

Sau khi chọn được tỷ lệ nước:nguyên liệu phù hợp, nhằm tách thêm phần béo ra khỏi nguyên liệu, hỗn hợp sau khi vô hoạt enzyme

nội tại được ly tâm tách béo 6.000g trong 10 phút trước khi bổ sung enzyme. Quy trình thí nghiệm được trình bày trong Hình 1. Đánh giá hiệu suất tách béo, hiệu suất thu hồi protein, hàm lượng béo và hàm lượng protein trong dịch thủy phân, hàm lượng nhũ tương và hàm lượng rắn không tan để lựa chọn phương pháp xử lí thích hợp.

2.6. Các phương pháp tính toán

Hiệu suất tách béo (%) = Khối lượng béo tách ra sau ly tâm

x 100% khối lượng nguyên liệu ban đầu

Hiệu suất thu hồi protein (%) = khối lượng protein thu được trong dịch thủy phân sau ly tâm


- Hàm lượng béo trong dịch sau thủy phân (%): phương pháp Folch.

Hàm lượng nhũ tương = Khối lượng nhũ tương thu được sau khi ly tâm


Hàm lượng rắn không tan = khối lượng chất rắn không tan thu được sau khi thủy phân bằng cách lọc, ly tâm




- Hàm lượng protein trong dịch thủy phân (%): phương pháp Lowry.

Hình 1. Quy trình nghiên cứu



2.7. Phương pháp xử lí số liệu

Phân tích phương sai ANOVA để xác định sự khác biệt của các số liệu và sai số chuẩn bằng phần mềm Statgraphics nhằm kiểm định độ tin cậy của kết quả thu được từ các thí nghiệm.

III. KẾT QUA3.1. Kết quả khảo sát tình hình sản xuất

và xử lí phụ phẩm cá Tra tại các nhà máyPhụ phẩm thải ra từ quá trình chế biến từ

cá Tra phi lê chiếm khoảng 67-70% khối lượng nguyên liệu đầu vào. Lượng phụ phẩm này thông thường bao gồm: đầu cá, xương cá, mỡ cá, bụng cá, nội tạng, thịt vụn, dè cá…

Hình 2. Quy trình tổng quát chế biến các mặt hàng từ cá Tra và các phụ phẩm

Cá tra sau khi tiếp nhận được đem đi cắt tiết và xả máu. Sau khi xả máu, cá được phi lê tách lấy hai miếng thịt hai bên. Từ công đoạn phi lê này phần phụ phẩm thải ra gồm nội tạng và bộ xương đầu, thịt bụng và mỡ. Phần phi lê tiếp tục được lạng da để tách bỏ lớp da sau đó được cắt tỉa cho đẹp rồi xử lí rửa sau đó phân loại rồi đem đi cấp đông.

Kết quả khảo sát quá trình chế biến phi lê cá Tra và ghi nhận tỷ lệ các phần phụ phẩm thải ra theo quá trình sản xuất được tính trình bày trong Bảng 1.

Để tận dụng lượng phụ phẩm các nhà máy chế biến đã có nhiều cách khác nhau để tiếp tục chế biến thu lợi nhuận. Phổ biến nhất hiện nay là chế biến bột cá và mỡ cá từ nguồn phụ phẩm.



Bảng 1. Tỷ lệ phụ phẩm thải ra trong quá trình sản xuất phi lê cá tra

STT Công đoạn Tỷ lệ (%) STT Công đoạn Tỷ lệ (%)

1 Nguyên liệu 100,00 4 Sửa phi lê

2 Phi lê Phi lê đã sửa

Trước rửa 54,00 Trước rửa 33,86

Sau rửa 53,82 Sau rửa 35,09

Đầu+xương 40,91 Mỡ 9,27

Vây 1,76 Thịt đỏ 3,55

Bao tử 0,68 Thịt vụn 2,18

Bong bóng 1,07 5 Xử lí

Mỡ vụn 0,93 Trước khi xử lí 35,09

3 Lạng da Sau xử lí 46,09

Phi lê không da 49,09 6 Đông lạnh

Da 5,09 Trước đông 46,09

Sau đông 44,71

Mỡ cá chiếm khoảng 10% so với khối lượng nguyên liệu ban đầu, phần lớn mỡ cá thải ra được sản xuất dầu mỡ, dầu biodiesel. Phế phẩm đầu, xương cá thải ra khi sản xuất phi lê chiếm khoảng 40,9% nguyên liệu. Một phần nhỏ đầu cá được các công ty làm thành mặt hàng thực phẩm gía trị gia tăng như chế biến thành các gói đầu cá nấu canh chua… Chủ yếu phần đầu, xương cá được tập trung vào các xưởng chế biến bột cá làm thức ăn gia súc hoặc tiêu thụ trực tiếp làm thức ăn tươi sống tại các bè nuôi cá Tra.

3.2. Đánh giá chất lượng phụ phẩm cá TraPhụ phẩm cá Tra được lấy mẫu từ nhà máy

chế biến bao gồm một bộ gồm đầu, xương sống, vây, đuôi và thịt bụng.

Hình 3. Phụ phẩm cá tra thu được sau khi chế biến phi lê

3.2.1. Thành phần khối lượng

Phụ phẩm cá Tra được tách riêng từng phần đem đánh giá thành phần khối lượng, kết quả trình bày trong bảng 2.

Bảng 2. Tỷ lệ các thành phần của phụ phẩm cá tra (n=15)

Thành phần Tỷ lệ (%)

Đầu 50,60 ± 1,77

Thịt bụng 16,82 ± 1,93

Xương sống 24,24 ± 0,88

Vây 3,17 ± 0,53

Đuôi 5,18 ± 0,88

Kết quả cho thấy trong khối phụ phẩm cá Tra thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất là đầu với khoảng 50% kế đến là xương sống.



3.2.2. Thành phần hóa học

Nhằm khai thác hiệu quả và chọn nguồn phụ phẩm thích hợp cho quá trình chế biến thu

hồi bột peptide, từng thành phần phụ phẩm được xác định thành phần hóa học. Kết quả được trình bày trong bảng 3 sau.

Bảng 3. Thành phần hóa học của các phần phụ phẩm cá tra

Thành phần

Protein (%vck*)

Lipid (%vck*) Tro (%vck*)Canxi

(%vck*)Phospho (%vck*)

Đầu 29,90 ± 2,08 46,90 ± 1,50 17,62 ± 6,65 3,92 ± 0,32 2,11 ± 1,01

Thịt bụng 16,88 ± 4,31 82,34 ± 8,36 0,49 ± 0,04 0,50 ± 0,01 0,10 ± 0,04

Xương sống

24,45 ± 1,14 42,71 ± 8,88 19,18 ± 3,87 3,34 ± 0,13 2,27± 0,62

Vây 37,30 ± 0,26 39,80 ± 0,39 16,08 ± 4,83 5,67 ± 1,05 2,08 ± 0,74

Đuôi 24,68 ± 3,58 53,89 ± 27,19 15,28 ± 0,92 3,53 ± 0,26 1,88 ± 0,03

* vck: vât chất khô

Kết quả cho thấy phần có hàm lượng protein cao nhất trong khối phụ phẩm là vây cá với hàm lượng protein lớn hơn 30% vck kế tiếp là đầu cá. Ngoài ra hàm lượng lipid ở tất cả các phần của khối phụ phẩm đều khá cao khoảng trên dưới 40% vck, cao nhất là phần thịt bụng có tỷ lệ chất béo theo hàm lượng chất khô trên dưới 80% vck. Do mục đích của nghiên cứu là thu nhận bột peptide sinh học nên phải tìm cách loại bỏ lượng lipid ra khỏi nguyên liệu một cách tối đa trước khi sản xuất là tốt nhất vì việc loại bỏ lipid trong quá trình chế biến sau này tốn rất nhiều hóa chất và năng lượng. Ngoài ra, theo những nghiên cứu gần đây thì lượng béo cao sẽ ảnh hưởng không tốt đến khả năng thu hồi protein do sự hình thành phức protein và lipid. Vì vậy đề tài quyết định loại bỏ phần thịt bụng ra khỏi nguyên liệu trước khi sản xuất. Thịt bụng được loại một cách thủ công bằng dao, thao tác này nhanh và dễ thao tác thực hiện. Khối nguyên liệu được xay chung và xác định thành phần hóa học, kết quả trình bày trong Bảng 4.

Bảng 4. Thành phần hóa học của phụ phẩm cá tra

Chỉ tiêuPhụ phẩm

cá traPhụ phẩm cá tra đã loại mỡ bụng

Ẩm (%) 49,71± 1,19 58,50±0,78Protein

(%)10,31± 0,80 14,06±0,14

Lipid (%) 31,70± 1,48 20,81±1,90

Tro (%) 7,43±0,37 6,57±0,65

Sau khi loại bỏ thịt bụng lượng béo trong nguyên liệu giảm từ 31,70% xuống còn 20,81% như vậy thao tác loại bỏ thịt bụng nên thực hiện khi xử lí nguyên liệu.

3.3. Kết quả nghiên cứu xử lí nguyên liệu

3.3.1. Xác định tỷ lệ nước:nguyên liệuNguyên liệu được chặt nhỏ và xay bằng

máy xay với lỗ sàng 0,5cm sau đó chia thành những phần đều nhau để thí nghiệm. Kết quả đánh giá các chỉ tiêu sau khi thủy phân nguyên liệu với các tỷ lệ nước bổ sung khác nhau được trình bày trong Bảng 5.



Bảng 5. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ nước:nguyên liệu (n=3)

Chỉ tiêu đánh giá (%)

Tỷ lệ nước:nguyên liệu

0:1 0,5:1 1:1 1,5:1

Hiệu suất tách béo 11,908 ± 5,008 19,120 ± 5,013 19,593 ± 5,646 16,589 ± 3,092

Hiệu suất thu hồi protein

1,975 ± 0,214 3,119 ± 0,405 3,319 ± 0,303 2,209 ± 0,016

Hàm lượng béo trong dịch sau thủy

phân0,970 ± 0.102 0,883 ± 0.088 0,777 ± 0,331 0,740 ± 0,078

Với tỷ lệ nước:nguyên liệu nhỏ hơn 0,5 thì hiệu suất thu hồi protein thấp nhất trong các nghiệm thức. Khi tăng hàm lượng nước lên trên 50% so với khối lượng nguyên liệu thì hiệu suất tách béo cũng như hiệu suất thu hồi protein tăng đáng kể. Tuy nhiên, khi tăng tỷ lệ nước:nguyên liệu lên 1,5:1 thì hiệu suất tách béo giảm xuống còn 16,59% và hiệu suất thu hồi protein cũng giảm. Với kết quả trên thì tỷ lệ nước:nguyên liệu thích hợp nhất cho quá trình thủy phân là 1:1.

3.3.2. Kết quả khảo sát phương pháp xử lí

Nhằm tăng khả năng tách béo, hổn hợp nguyên liệu:nước với tỷ lệ được chọn từ thí nghiệm trên là 1:1 sau khi gia nhiệt để vô hoạt enzyme nội tại được ly tâm tách một phần béo trước khi thủy phân. Kết quả đánh giá chất lượng được thể hiện trong Bảng 6.

Bảng 6. Kết quả đánh giá hai phương pháp xử lí nguyên liệu (n=3)

Chỉ tiêu đánh giá (%) Không ly tâm Ly tâm

Hiệu suất tách béo 19,593 ± 5,646 27,533 ± 0,482

Hiệu suất thu hồi protein 3,319 ± 0,303 3,654 ± 0,042

Hàm lượng béo trong dịch thủy phân 0,777 ± 0,331 0,600 ± 0,166

Hàm lượng protein trong dịch thủy phân 3,638 ± 0,723 4,303 ± 1,304

Tỷ lệ nhũ tương 20,100 ± 1,234 10,485 ± 2,345

Tỷ lệ phần rắn không tan 31,297 ± 1,581 26,842 ± 2,055

Việc ly tâm tách một phần béo trước khi thủy phân giúp loại được thêm khoảng 10% béo ra khỏi hỗn hợp, tỷ lệ nhũ tương giảm do giảm lượng chất béo trong hỗn hợp và hàm lượng rắn không tan sau khi thủy phân cũng giảm rõ rệt chứng tỏ quá trình thủy phân diễn ra triệt để hơn. Bên cạnh đó, việc hình thành nhũ tương giảm và lượng béo tách ra cao hơn khiến cho

hàm lượng protein trong dịch thu được sau thủy phân đối với trường hợp có ly tâm tách béo trước thủy phân tăng lên 19%, hàm lượng béo giảm đáng kể. Như vậy việc tách một phần béo trước khi thủy phân giúp tăng hiệu quả thủy phân, tăng hiệu suất quy trình, tăng hàm lượng protein trong dịch thủy phân góp phần giảm chi phí thu hồi sản phẩm dạng bột.



3.3.3. Đề xuất quy trình xử lí nguyên liệu

Từ các kết quả nghiên cứu, đề xuất quy trình xử lí nguyên liệu dùng để sản xuất bột peptide trình bày trong Hình 4.

Giải thích quy trình:

• Nguyên liệu phụ phẩm cá tra sau khi rã đông được xay nhỏ bằng máy xay với kích thước lỗ sàng 0,5 cm.

• Hỗn hợp nguyên liệu sau khi xay được bổ

sung nước với tỷ lệ 1:1 (w/w) và khuấy đảo đều.

• Hỗn hợp được gia nhiệt ở 95oC trong khoảng 10 phút để vô hoạt enzyme nội tại.

• Tiến hành ly tâm tách béo ở 6.000 xg trong 10 phút.

• Phần hỗn hợp sau khi ly tâm được xem như là nguyên liệu đã qua xử lí được tiếp tục thủy phân để thu dịch peptide.

Hình 4. Quy trình xử lí phụ phẩm cá tra thành nguyên liệu sản xuất bột peptide

Ly tâm tách béo ở 6.000 xg, 10 phút



IV. THẢO LUẬN

Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng béo trong phụ phẩm cá tra chiếm trên 30%. Trong nghiên cứu của Bechtel, (2003) thành phần của phụ phẩm không đầu của cá Alaska pollock chứa 0,9% béo còn ở cá Pacific cod là 0,6% béo như vậy có thể nói phụ phẩm cá tra chứa hàm lượng béo rất cao. Hàm lượng béo này có thể ảnh hưởng đến quá trình thủy phân, hiệu suất thu hồi cũng như chất lượng sản phẩm bột peptide vì vậy cần lưu ý trong khâu xử lí nguyên liệu và sản xuất để loại bỏ lượng béo này. Phần mỡ bụng vốn chứa hơn 80% chất khô là chất béo không thích hợp cho việc sản xuất peptide do đó cần loại bỏ khỏi nguồn nguyên liệu ngay từ đầu.

Với việc sử dụng nguyên phần phụ phẩm cá, có những khó khăn trong thực tế liên quan tới sự phân bố enzyme và hòa trộn ngay từ lúc bắt đầu quá trình thủy phân đặc biệt nếu không bổ sung thêm nước. Như vậy việc xay nguyên liệu và bổ sung nước là cần thiết.

Slizyte et al., (2005) đã báo cáo rằng tỷ lệ nước:nguyên liệu đóng vai trò quan trọng trong hiệu suất thu hồi protein từ phụ phẩm cá tuyết và cũng ảnh hưởng đến sự phân tách chất béo cũng như hình thành nhũ tương. Kết thúc quá trình thủy phân chất béo được phân bố trong 3 phần: dầu lỏng, nhũ tương và bã không tan. Việc hình thành nhũ tương là điều không mong muốn, việc tăng lượng nhũ tương làm giảm lượng dầu lỏng tách ra. Kết quả nghiên cứu của Slizyte et al., (2005) cho thấy việc thêm nước vào hỗn hợp làm tăng sự hình thành nhũ tương,

tăng hiệu suất thu hồi protein và làm giảm lượng dầu béo tách ra. Điều này thể hiện rõ khi tăng tỷ lệ nước:nguyên liệu lên 1,5:1 thì hiệu suất tách béo giảm xuống còn 16.59%. Việc xử lí nhiệt nguyên liệu trước khi thủy phân để vô hoạt enzyme nội tại có sẵn trong nguyên liệu và cũng làm tăng lượng dầu tách ra. Bên cạnh đó, trong trường hợp nguyên liệu tươi chứa hàm lượng quá cao lipid (10-30%) thì phức hợp protein-lipid có thể hình thành (Slizyte et al., 2004). Biến tính protein cũng làm tăng lượng bã không tan vốn chứa hàm lượng lipid cao bao gồm hàm lượng cao các phospholipids. Kết quả nghiên cứu của Slizyte et al., (2005) cho thấy không thể đạt được tất cả các chỉ tiêu chất lượng mong muốn cùng một lúc khi chỉ dùng phương pháp thủy phân như: tối đa hiệu suất tách béo lẫn đạm thủy phân, tối thiểu lượng nhũ tương và bã không tan, hàm lượng protein trong dịch thủy phân cao nhất với lượng béo thấp nhất.

V. KẾT LUÂN VÀ KIẾN NGHIPhụ phẩm quá trình chế biến cá Tra gồm

đầu, xương sống, vây, đuôi chiếm khoảng 42% nguyên liệu cá là nguồn nguyên liệu thích hợp dùng để sản xuất bột peptide. Quy trình xử lí phụ phẩm cá Tra thích hợp nhất là sau khi xay nhỏ phụ phẩm được phối trộn với nước với tỷ lệ 1:1 và vô hoạt enzyme nội tại bằng nhiệt. Hỗn hợp được tiếp tục ly tâm để tách béo. Sau khi loại béo, hỗn hợp còn lại là nguyên liệu sẵn sàng cho quá trình thủy phân thu nhận bột peptide. Nhằm đánh giá chi tiết hơn hiệu quả quá trình xử lí có thể tiếp tục đánh giá chất lượng sản phẩm bột peptide thu được.




Bechtel, P.J., 2003. Properties of different fish processing by-products from pollock, cod and salmon. Journal of Food processing preservation 27: 101-116.

Ghaly, A.E., Ramakrishnan, V.V., Brooks, M.S., Budge, S.M., Dave, D., 2013. Fish Processing wastes as a potential source of proteins, amino acids and oils: a critical review. Microbial & biochemical technology 5(4), 107-129.

Gildberg, A., 1993. Enzymatic processing of marine raw-materials. Process Biochem 28(1):1–15.

Himonides, A.T., Taylor, A.K.D., Morris, A.J., 2011. Enzymatic hydrolysis of fish using pilot plant scale systems. Food and Nutrition Sciences 2, 586-593.

Kristinsson, H.G., Rasco, B.A., 2002. Fish protein hydrolysates and their potential use in the food industry. Recent Adv Mar Biotechnol 7:157–81 (Seafood safety and human health).

Mohr, V., 1977. Fish protein concentrate production by enzymic hydrolysis. In: Adler-Nissen, et al.,

editors. Proceedings of the symposium A3 on biochemical aspects of new protein food, FEBS federation of European biochemical societies 11th meeting, vol. 44. p. 53–62.

Rodriguez, N.R., Diego, S.M., Beltran, S., Jaime, I., Sanz, Rovira, M.T.J., 2012. Supercritical fluid extraction of fish oil from fish by-products: A comparision with other extraction methods. Journal of Food Engineering 109, 238-248.

Shahidi, F., Han, X.Q., Synowiecki, J., 1995. Production and characteristics of protein hydrolysates from capelin (Mallotus villosus). Food Chem 53:285–93.

Slizyte, R., Rustad, T., Storro, I., 2005. Enzymatic hydrolysis of cod (Gadus morhua) by-products: Optimization of yield and properties of lipid and protein fractions. Process Biochemistry 40, 3680-3692.

Sovik, S.L., Rustad, T., 2005. Proteolytic activity in by-products from cod species caught at three different fishing grounds. J Agric Food Chem 53:452–8.



sTUdY on TReaTmenT TRa caTFish bY-PRodUcTs (Pangasianodon hypophthalmus) To PRodUce PePTide.

Nguyen Thi Huong Thao1*, Dinh Thi Men1, Nguyen Thi My Thuan1, Vo Dinh Le Tam2

ABSTRACT Tra catfish by-products were collected from fish processing factories immediately after filleting manually. The results showed that the by-products occupy more than 40% of raw material with content of 10% protein and 30% lipid. Treatment of by-products is to remove maximum amount of lipid and inactivate endogenous enzyme so that the material is available for the following enzymatic hydrolysis. The addition of water to the raw material and the most effective lipid extracting method were studied. Ratio of adding water was 1:1 (w:w) give the highest yield of fat removing and pro-tein recovery. The centrifugation before hydrolysis helped to remove more 10% of fat and to reduce amount of emulsion and consequently increase protein concentration in hydrolysate.

Keywords: peptide, corolase, inactivate endogenous enzyme, tra catfish by-products.

Người phản biện: ThS. Phạm Duy Hải




1 Center for Fishery Postharvest Technology, Research Institute for Aquaculture No.2 * Email: [email protected] 2 Ho Chi Minh City University of Technology

nghỀ cÁ sÔng cỬu long - vienthuysan2.org.vn

Documents