o lc/fluo/ms. (3d-qsrr) - paul sabatier...
TRANSCRIPT
1
UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER UFR PCA
THESE
en vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITE DE TOULOUSE
délivré par l’Université Toulouse III – Paul Sabatier
Doctorat en CHIMIE :
Spécialité: CHIMIE MACROMOLECULAIRE ET SUPRAMOLECULAIRE
Présentée et soutenue
par
Marlène LACROIX
Le 17 octobre 2007
OPTIMISATION D’UNE METHODE DE DOSAGE DE NEUROTRANSMETTEURS
PAR LE COUPLAGE LC/FLUO/MS. ETUDES THEORIQUES PAR
SPECTROMETRIE DE MASSE HAUTE RESOLUTION, MODELISATION
MOLECULAIRE ET ETUDE QUANTITATIVE DE RELATIONS STRUCTURE-TEMPS DE RETENTION (3D-QSRR)
Directeur de thèse : M. François COUDERC
Composition du jury :
M. A. Lattes Professeur de l'U.P.S., Toulouse Président M. L. Denoroy Directeur de recherche C.N.R.S, Lyon Rapporteur M. E. Forest Chercheur C.E.A., Grenoble Rapporteur M. L. Thion Docteur responsable d’unité Sanofi-Pasteur, Lyon Examinateur M. L. Debrauwer Ingénieur de recherche I.N.R.A., Toulouse Examinateur M. F. Couderc Professeur de l'U.P.S, Toulouse Directeur de thèse
Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique (I.M.R.C.P.), UMR 5623, Université Paul Sabatier-Bât 2R1-118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex 9.
2
3
On fait la science avec des faits,
comme on fait une maison avec des
pierres : mais une accumulation de
faits n'est pas plus une science qu'un
tas de pierres n'est une maison.
Henri Poincaré
4
5
Remerciements… Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse ont été réalisés au laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique (IMRCP) à l’Université Paul Sabatier de Toulouse. Je tiens à remercier les deux directrices qui se sont succédé : Isabelle Rico-Lattes et Monique Mauzac pour m’avoir accueillie dans ce laboratoire. Je souhaite remercier M. Luc Denoroy et M. Eric Forest pour avoir pris le temps de corriger ce manuscrit de thèse, M. Laurent Thion et M. Laurent Debrauwer pour avoir accepté de participer à ce jury et pour leurs remarques pertinentes et M. Armand Lattes pour avoir présidé ce jury avec dynamisme et humour. J’adresse mes remerciements à mon directeur de thèse François Couderc non seulement pour la confiance et la liberté qu’il m’a accordées mais aussi pour sa disponibilité et son soutien durant ces trois années de thèse. Vos explications en spectrométrie de masse et vos connaissances bibliographiques ont été un véritable atout pour la rédaction de ce manuscrit. Toute ma reconnaissance et ma gratitude s’adresse à Jean-Christophe Garrigues qui a suivi de près ces travaux, de la première année de thèse à la rédaction. Je te remercie pour ton humilité et tes discussions scientifiques et humaines. Une citation d’un écrivain espagnol Miguel de Unamuno décrit parfaitement le message que tu as voulu m’inculquer au cours de ces trois années : « La véritable science enseigne, par dessus
tout, à douter et à être ignorant. ». Je souhaite de tout cœur avoir retenu cette leçon pour l’avenir. Je tiens à remercier les membres de la société Waters pour leurs descriptions des colonnes chromatographiques, leurs conseils en HPLC et leur collaboration en spectrométrie de masse. Je souhaite remercier Delphine et Georges pour leurs encouragements et surtout Laurence pour sa fraicheur. Ca a été un plaisir de travailler avec toi durant ton stage de Master2. Je remercie les autres membres de l’équipe de recherche « Spectrométrie de masse, fluorescence et bioanalytique » qui m’ont permis de prendre confiance en moi. Un grand merci à toutes les personnes avec qui j’ai partagé un café, une tasse de thé ou une conversation et notamment Fernanda, Yann (uhuhuh) pour leur soutien quotidien. Non je ne t’ai pas oublié Richard, sacré gestionnaire, je tiens à te remercier pour ton amitié et tes conseils administratifs et quand tu veux on fait la course en crawl ! Un autre grand merci à la douce Elisabeth avec qui j’ai aussi partagé des longueurs de bassin et son fromage les midis ! Je remercie également Muriel Blanzat pour ces précieux conseils et ses stratégies au tarot ! Bien entendu il me serait impossible d’évoquer les fameuses parties de tarot sans citer ceux qui ont été mes co-équipiers ou mes adversaires mais néanmoins amis : Kamal, la belle Cristinich, Cosmin, Clém, Vinc…
6
Romain, encore merci pour tes conseils en synthèse et pour ton soutien avec Tamara les derniers jours avant la soutenance. Bien sûr je remercie Kouky et Elo di Soussa (Elodie Soussan) pour leur amitié et leur confiance. Vous étiez toujours présentes dans les bons moments comme dans les mauvais telles de véritables amies. C’est avec les larmes aux yeux que je remercie ma famille qui me soutient depuis toujours, mes amis de Limoges et Bab qui m’a accompagné dans cette aventure. Je vous dédicace ce manuscrit avec toute la ferveur que j’ai mis pour le rédiger. Le philosophe Alain a écrit : « Aimer, c’est trouver sa richesse hors de soi. », je vous le confirme, je possède un fabuleux trésor. ENCORE MERCI !!!
7
8
9
Résumé :
Certains acides aminés et peptides sont des neurotransmetteurs impliqués dans les
maladies neurologiques. Présents en très faible quantité dans les échantillons biologiques,
une HPLC couplée à un détecteur de fluorescence et un spectromètre de masse est utilisée
pour identifier et doser ces molécules. Les acides aminés sont marqués avec un agent
fluorogène : le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) et un nucléophile (CN-). Pour
l’analyse des peptides enképhalines, le marquage est modifié afin de faciliter l’analyse en
spectrométrie de masse : le nucléophile CN- est remplacé par un aminothiol facilement
ionisable en mode positif, le N,N-diméthylaminoéthanethiol (MeAT). Des études théoriques
en modélisation moléculaire, spectrométrie de masse haute résolution et sur l’échange
H/D ont été réalisées pour interpréter les résultats obtenus avec chaque marquage.
Mots Clés : HPLC, Spectrométrie de masse, Détection de fluorescence, NDA, Acides
aminés, Enképhalines
Abstract:
Some amino acids and peptides are neurotransmitters involved in neurological
diseases. As they are very low concentration in biological samples, HPLC coupled with a
fluorescence detector and a mass spectrometer is performed for the identification and the
quantification of these molecules. As amino acids are not fluorescent natively, they are
labelled with a fluorogenic dye: the naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde (NDA) and a
nucleophile (CN-). The labelling for the peptides (enkephalins) is slightly modified in order
to facilitate the ionisation in positive mode in mass spectrometry: the nucleophile CN- is
substituted by an aminothiol easily ionisable, the N,N-dimethylaminoethanethiol (MeAT).
Some theoretical studies are investigated in molecular modelling, high resolution mass
spectrometry and H/D exchange studies in order to explain the results obtained on each
labelling.
Keywords: HPLC, Mass spectrometry, Fluorescence detection, NDA, Amino acids,
Enképhalins
10
11
Sommaire
Introduction générale ................................................................................................................... 15
Mise au point bibliographique ................................................................................................... 19
Chapitre 1. Le système nerveux à l’échelle moléculaire : les neurotransmetteurs .. 21
A. Généralité .................................................................................... 21
I. Définitions ................................................................................. 21
1) Neurotransmetteurs ................................................................... 21
2) Neuromodulateurs et neurohormones .............................................. 22
II. Exemples de neurotransmetteurs ...................................................... 23
1) La dopamine ............................................................................ 23
2) La noradrénaline ....................................................................... 24
3) L’aspartate et le glutamate .......................................................... 25
4) L’acide gamma-amino-butyrique .................................................... 26
5) Les enképhalines ...................................................................... 26
B. Préparation des échantillons .............................................................. 29
I. Les prélèvements biologiques .......................................................... 29
II. La perfusion de type push-pull ......................................................... 30
1) La perfusion classique ................................................................ 30
2) Le système push-pull à faible débit ................................................ 30
III. La microdialyse ........................................................................ 31
1) Principe ................................................................................. 31
2) Applications ............................................................................ 32
3) Avantages et limites de la microdialyse ............................................ 33
IV. Conclusions ............................................................................. 33
C. Méthodes d’analyse et de quantification ................................................ 35
I. Les méthodes immunochimiques ....................................................... 35
II. Les techniques électrochimiques ...................................................... 36
III. Les techniques séparatives ........................................................... 37
1) Electrophorèse capillaire ............................................................. 37
2) Chromatographie liquide à haute performance ................................... 39
3) Modes de détections .................................................................. 43
IV. La spectrométrie de masse .......................................................... 47
1) Historique ............................................................................... 47
2) Principe ................................................................................. 48
3) Les sources d’ionisation .............................................................. 48
4) Les analyseurs .......................................................................... 51
5) La spectrométrie de masse tandem : MS/MS ...................................... 55
Résultats ............................................................................................................................................ 59
Chapitre 2. Analyse de neurotransmetteurs de types acides aminés ................... 61
A. Rappels sur les méthodes de marquage des acides aminés. .......................... 61
B. Etude du marquage des acides aminés avec le système NDA/CN-. .................. 65
I. Etude spectroscopique du NDA et des dérivés benzisoindoles ..................... 65
II. Cinétique de marquage des dérivés benzisoindoles ................................. 66
C. Mise au point chromatographique ........................................................ 68
I. Séparation des acides aminés et des amines biogènes ............................. 68
1) Grandeurs caractéristiques .......................................................... 68
2) Choix de l’éluant ...................................................................... 69
3) Essai de séparation .................................................................... 70
II. Optimisation de la séparation chromatographique .................................. 72
1) Séparation sur différentes colonnes ................................................ 72
2) Comparaison et choix de colonne ................................................... 78
12
III. Etude en spectrométrie de masse................................................... 79
1) Etude en mode positif ................................................................ 79
2) Etude en mode négatif ............................................................... 80
IV. Automatisation du marquage dans la boucle d’injection ........................ 82
1) Optimisation du rapport NDA/CN- ................................................... 83
2) Optimisation du temps de réaction ................................................. 84
3) Séparation des 20 amines marquées ................................................ 85
4) Limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) .......................... 87
5) Etude d’échantillons biologiques .................................................... 88
6) Conclusions ............................................................................. 91
Chapitre 3. Nouvelle méthode de marquage pour l’analyse des Enképhalines ........ 95
A. Essai avec le système NDA/CN-. .......................................................... 95
I. Etudes spectroscopiques ................................................................ 95
II. Etude en spectrométrie de masse ..................................................... 96
B. Nouvelle méthode de marquage des peptides .......................................... 98
I. Etudes spectroscopiques ................................................................ 98
II. Etudes en spectrométrie de masse ................................................... 100
III. Comparatif des différents marquages ............................................. 101
IV. Etude LC/LIF/MS ...................................................................... 101
1) Séparation des enképhalines ........................................................ 102
2) Limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ......................... 104
V. Automatisation du marquage .......................................................... 105
1) mise au point des conditions de marquage. ...................................... 105
2) limite de détection et de quantification .......................................... 107
3) Etude d’un échantillon biologique ................................................. 108
4) Conclusions ............................................................................ 109
C. Nouvelle méthode de quantification en spectrométrie de masse .................. 110
I. Principe ................................................................................... 110
II. Etude en infusion directe .............................................................. 111
III. Etude par le couplage LC/LIF/MS .................................................. 112
Chapitre 4. Etudes théoriques ............................................................... 117
A. Etude des conformations de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ................. 117
I. Etude de spectrométrie de masse des ions isobares des enképhalines marquée avec NDA/MeAT. .............................................................................. 118
1) Mesure de la masse exacte. ......................................................... 118
2) Etude de l’abondance isotopique de chaque composé. ......................... 119
3) Etude de fragmentation MS/MS ..................................................... 120
II. Modélisation moléculaire .............................................................. 125
1) Localisation des sites de protonation. ............................................. 125
2) Etudes des conformations de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT en fonction du site de protonation. ................................................................... 127
III. Etude de l’échange H/D en spectrométrie de masse............................ 131
1) Etude MS de l’échange H/D ......................................................... 132
2) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 9,04 min ................ 133
3) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 10,00 min .............. 134
B. Etude quantitative des relations structure-temps de rétention (QSRR). .......... 136
I. Principe des études QSAR, QSPR, QSRR .............................................. 136
II. Les descripteurs moléculaires ......................................................... 137
1) Les descripteurs physico-chimiques ............................................... 137
2) Les descripteurs électroniques ..................................................... 138
3) Les descripteurs topologiques ...................................................... 138
III. Les réseaux de neurones artificiels. ............................................... 140
1) Historique ............................................................................. 140
2) Principe ................................................................................ 141
13
3) Algorithme de rétropropagation .................................................... 142
IV. Méthode d’élaboration d’un réseau de neurone ................................. 143
V. Résultats .................................................................................. 144
1) Détermination des descripteurs essentiels ....................................... 144
2) Construction des réseaux de neurones prédictifs ................................ 147
3) Application de l’étude QSRR à l’arginine ......................................... 151
Conclusion générale .................................................................................................................... 153
Partie Expérimentale .................................................................................................................. 157
A. Liste des produits chimiques : ........................................................... 159
B. Protocole de marquage ................................................................... 160
I. Marquage manuel ....................................................................... 160
1) Préparation des solutions ........................................................... 160
2) Marquage des amines primaires .................................................... 160
II. Marquage automatisé dans la boucle d’injection ................................... 161
1) Préparation des solutions ........................................................... 161
2) Protocole de marquage .............................................................. 161
3) Etude des rapports NDA/CN- et NDA/MeAT et des durées d’incubation ...... 161
C. Etudes spectrométriques du marquage ................................................. 162
I. Etudes en UV-visible .................................................................... 162
II. Etudes en fluorescence ................................................................. 162
D. Conditions chromatographiques ......................................................... 162
I. Appareillage .............................................................................. 162
1) Chaîne HPLC ........................................................................... 162
2) Paramétrage des détecteurs ........................................................ 163
3) Préparation des solvants et des échantillons ..................................... 163
II. Séparation des acides aminés et amines biogènes marqués avec NDA/CN- .... 164
1) Séparation sur colonnes X-Terra RP18 (250 x 4,6 mm ; 5 µm) .................. 164
2) Séparation sur colonne monolithe RP 18e β-test (3 x 100 mm) ................. 165
3) Séparation sur colonne X-Bridge Shield RP18 (2,1 x 100 mm, 3.5 µm) ........ 165
III. Séparation des enképhalines marquées avec NDA/MeAT ....................... 166
IV. Calcul des limites de détection et de quantification ............................ 166
V. Etudes de l’échange hydrogène/deutérium ......................................... 166
E. Conditions en spectrométrie de masse ................................................. 167
I. Paramétrage ............................................................................. 167
II. Etalonnage de l’appareil ............................................................... 167
III. Mesure en injection directe ......................................................... 167
IV. Mesure en couplage LC/MS .......................................................... 167
V. Mesure de la masse exacte de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ............ 168
VI. Mesure de l’abondance isotopique relative de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ..................................................................................... 168
F. Modélisation moléculaire ................................................................. 168
I. Modélisation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT ............................. 168
II. Modélisation des acides aminés marqués avec NDA/CN- pour l’étude QSRR ... 169
Références bibliographiques .................................................................................................... 173
14
15
Introduction générale
16
17
Le cerveau est l’organe le plus complexe du corps humain. Il permet d’établir, de
coordonner, de diffuser les informations et de contrôler notre raisonnement, notre
comportement et nos émotions. Cet organe est comparable à un vaste réseau de
communication et la rupture d’une de ses branches peut entraîner des anomalies du
fonctionnement et des troubles mentaux.
De nos jours, en France, 1 homme sur 10 et 1 femme sur 5 souffriront de dépression
au cours de sa vie, 500000 cas d’épilepsie ont été recensés et les schizophrènes
représentent 1% de la population.
A ces troubles, il faut ajouter les maladies issues de la dégénérescence des
neurones telles que la maladie d’Alzheimer et de Parkinson dont 900000 et 120000
personnes sont atteintes, ce qui représente environ 7 % des personnes âgées de plus 60
ans.
Ces maladies constituent un redoutable défi pour notre société vieillissante au
rythme de vie très soutenu. Les troubles neurologiques du fait de l’allongement de
l’espérance de vie, constitueront la première cause de mortalité en France.
De nombreuses activités de recherche ont été développées dans le monde pour
comprendre ces maladies et les combattre. Le gouvernement, par exemple, a mis en place
en 2004 un « plan maladie d’Alzheimer et maladies apparentées » articulé en 10 objectifs
(source : http://www.sante.gouv.fr). Ces travaux ont démontré que ces troubles
neurologiques sont en partie associés à un excès ou une carence de certaines molécules du
système nerveux : les neurotransmetteurs.
Comprendre les mécanismes d’action et l’altération de ces molécules chez les
personnes atteintes de problèmes cérébraux est essentiel pour élaborer de nouveaux
traitements et améliorer les méthodes de prévention et de dépistage de ces affections.
Il est donc primordial de pouvoir doser dans les échantillons biologiques les
neurotransmetteurs. Ces dosages nécessitent le développement et l’utilisation de
technologies très sensibles, ayant la capacité de quantifier à l’ordre du nanomolaire.
L’objectif des travaux présentés est d’optimiser une nouvelle méthode de dosage
des neurotransmetteurs dans des échantillons biologiques en développant un marquage des
neurotransmetteurs avec un agent de fluorescence, le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde
(NDA) et en utilisant la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) couplée à la
détection de fluorescence et à la spectrométrie de masse (SM) comme technique
analytique. Ces travaux s’articuleront en cinq chapitres.
Le premier chapitre introductif est un rappel bibliographique définissant le terme
de « neurotransmetteur » et leurs implications dans les maladies biologiques. Les
18
différentes techniques d’échantillonnage de ces molécules seront exposées ainsi que les
différentes méthodes utilisées pour les analyser avec une brève description de la HPLC et
de la spectrométrie de masse.
Le second chapitre est consacré à la mise au point d’une méthode d’analyse des
neurotransmetteurs de type acides aminés en HPLC et fluorescence avec l’étude du NDA.
Ce chapitre est finalisé par le développement d’un marquage automatisé et l’étude
d’échantillons biologiques.
Dans le troisième chapitre nous nous sommes intéressés à l’analyse de molécules
plus complexes : les enképhalines. Pour ce faire, le marquage utilisé dans le deuxième
chapitre a été adapté à l’étude de ces peptides pour être à la fois compatible à la
détection de fluorescence et à la spectrométrie de masse.
Le quatrième chapitre est une interprétation théorique des résultats obtenus dans
les deux chapitres précédents. Une première partie propose une étude approfondie en
spectrométrie de masse accompagnée de la modélisation moléculaire pour analyser un
phénomène particulier observé lors de l’élution des enképhalines marquées avec le
couplage HPLC/MS. La seconde partie est une étude quantitative de relations structure
temps de rétention (QSRR) fondée sur la modélisation moléculaire et l’utilisation de
réseaux de neurones artificiels. Ces outils informatiques permettront d’établir des
comparaisons entre les colonnes chromatographiques utilisées lors de la séparation des
acides aminés.
Enfin, après une conclusion générale sur l’ensemble de ces travaux, le dernier
chapitre regroupera toutes les données expérimentales utilisées au cours de ces travaux de
thèse.
19
Mise au point bibliographique
20
21
Chapitre 1. Le système nerveux à l’échelle moléculaire : les neurotransmetteurs
A. Généralité
Le système nerveux est constitué de réseaux de neurones à travers lesquels circule
l’influx nerveux. A la fin du XIXème siècle, Cajal (Cajal S.R., 1894) affirme que le neurone
est une entité anatomique c’est-à-dire qu’il existe une contiguïté entre les neurones et
non une continuité. Apparaît alors le terme de synapse désignant la zone où a lieu la
jonction d’un neurone à un autre (Figure 1). La transmission d’informations d’un neurone
dit présynaptique à un second (postsynaptique) est assurée par des substances chimiques
appelées, neurotransmetteurs (NT). Ces neurotransmetteurs sont véhiculés par exocytose
des vésicules et captés par les récepteurs membranaires du neurone postsynaptique.
Figure 1 : Mécanisme de la transmission de l’influx nerveux
I. Définitions
1) Neurotransmetteurs
En 1936 Dale et Loewi obtiennent le Prix Nobel de Physiologie et de Médecine pour
leurs travaux sur la transmission chimique. Ils isolent le premier neurotransmetteur :
l’acétylcholine et établissent à partir de son étude, les conditions requises pour entrer
dans cette catégorie de molécule.
22
Les neurotransmetteurs doivent être localisés dans les neurones du système nerveux
central, formé par le cerveau et la moelle épinière, avec une distribution régionale
caractéristique. Ils doivent être concentrés dans l’élément présynaptique ainsi que son
système de biosynthèse. Ces derniers sont libérés lors d’une stimulation présynaptique et
présentent une identité physiologique et pharmacologique qui leur est propre. L’action du
neurotransmetteur doit être très fugace ce qui nécessite la présence d’un système
d’inactivation soit enzymatique, soit physicochimique qui arrête très rapidement son
action. A ces critères se sont ajoutés avec l’évolution des moyens de reconnaissance, la
mise en évidence de récepteurs spécifiques et l’obtention d’un changement de
perméabilité ionique de la membrane postsynaptique (Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995).
De nombreuses études ont progressivement démontré que certaines amines
biogènes, acides aminés et peptides répondaient à ces conditions ou jouaient un rôle
important dans la neurotransmission.
2) Neuromodulateurs et neurohormones
Vue la quantité de molécules ayant une action sur la médiation de l’information, les
notions de neuromodulateurs et de neurohormones ont été introduites afin d’élargir le
domaine strict de la neurotransmission.
Un neuromodulateur est par définition un messager chimique d’origine neuronale
qui ne vérifie pas un des critères cités précédemment. Il ne peut pas agir seul mais il est
capable de modifier l’action du neurotransmetteur en agissant sur des récepteurs
postsynaptiques spécifiques(Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995).
Les neurohormones sont quant à elles des substances chimiques qui cumulent
certaines propriétés des transmetteurs et des hormones.
Chaque substance chimique n’appartenant pas nécessairement à une de ces
définitions mais pouvant occuper plusieurs de ces fonctions, le terme de
« neuromédiateur » regroupe l’ensemble de ces catégories de molécules.
23
II. Exemples de neurotransmetteurs
Un grand nombre de molécules a été identifié comme neurotransmetteur, dans les
différentes régions du cerveau représentées dans la Figure 2.
Figure 2 : Coupe d'un cerveau humain et représentation de ses différentes régions.
Dans ce paragraphe seuls les systèmes faisant l’objet de nos travaux seront
brièvement décrits.
1) La dopamine
La dopamine est une catécholamine qui, avant les travaux de Carlsson (Carlsson A.
et al., 1957), était considérée seulement comme un intermédiaire métabolique de la
synthèse de la noradrénaline.
Cette catécholamine ne franchit pas la barrière hémato-encéphalique, son
métabolisme commence par la capture de la phénylalanine (Phe) et de la tyrosine (Tyr),
ses précurseurs, au niveau des terminaisons neuronales. La phénylalanine est hydroxylée
par la phénylalanine hydroxylase (PH) et devient de la tyrosine. Cette molécule est
transformée en dihydroxyphénylalanine (DOPA) grâce à l’enzyme catalytique : tyrosine
hydroxylase (TH). La DOPA subit ensuite une décarboxylation par la DOPA décarboxylase
(DDC) pour former la dopamine (Figure 3).
Les neurones dopaminergiques représentent plusieurs millions sur les dix milliards
de neurones du système nerveux central (SNC) et sont surtout présents dans la partie
mésencéphalique du SNC (Figure 2). La transmission de la dopamine entre les neurones
24
participe à de nombreuses fonctions dans ce système. Un excès ou un défaut de
concentration en dopamine entraîne de nombreuses pathologies. En effet, une
hyperactivité des transmissions de dopamine augmente la concentration de ce
neurotransmetteur dans la fente synaptique. Cet excès est alors associé à des troubles
décrits dans l’anorexie mentale ou la schizophrénie (agitation, délire,
hallucination…)(Perez-Neri I. et al., 2006). A l’opposé, un défaut de transmission de
dopamine a pour conséquence certains états dépressifs, la maladie de Parkinson
(destruction des neurones dopaminergiques)(Lemke M.R. et al., 2004), des démences de
type Alzheimer (perte de la mémoire, manque d’attention)(Cropley V.L. et al., 2006).
2) La noradrénaline
La noradrénaline est avec l’adrénaline un des plus anciens neurotransmetteurs
identifiés. Au départ, cette catécholamine n’était considérée que comme un intermédiaire
de la réaction de synthèse de l’adrénaline. C’est dans les années 40 qu’Euler démontre son
rôle de neuromodulateur dans les neurones (Von Euler U.S. et al., 1949) et Vogt le
caractérise en 1954 comme neurotransmetteur à part entière dans le système nerveux
central alors que l’adrénaline est définie comme neuromodulateur(Vogt M., 1954).
Cette molécule présente la même voie de synthèse que la dopamine qui subit une
hydroxylation dans les vésicules synaptiques catalysée par la Dopamine-β-hydroxylase
(DBH) (Figure 3).
Phe
Tyr DOPA DOP NOR
NH2
HOOC
NH2
HOOC
OH
NH2
HOOC
OH
OH
NH2
OH
OH
OH
PH TH DDC DBH
NH2
OH
OH
PH : phénylalanine hydroxylaseTH : tyrosine hydroxylaseDDC : DOPA décarboxylaseDBH : dopamine-β-hydroxylase
Figure 3 : Métabolisme de la dopamine et de la noradrénaline
Dans le système nerveux central, la noradrénaline est principalement localisée dans
les régions du pont et du bulbe du tronc cérébral (Figure 2). Un déficit de transmission de
la noradrénaline dans ces deux régions du cerveau est à l’origine des troubles de deux
maladies neurodégénératives (maladie due à la détérioration des neurones) chez l’Homme
25
(les maladies de Parkinson et d’Alzheimer) mais aussi la schizophrénie(Yamamoto K. and
Hornykiewicz O., 2004).
3) L’aspartate et le glutamate
Les acides glutamiques (Glu) et aspartiques (Asp) sont des acides aminés naturels
présentant une fonction acide carboxylique sur la chaîne latérale ; ces molécules neutres
sont en équilibre avec leurs formes zwittérioniques (Figure 4). Dans le système nerveux (à
pH ≈ 7-8), les acides glutamiques et aspartiques sont présents sous leurs formes
anioniques. Ces molécules peuvent augmenter l’activité des neurones ; elles sont
qualifiées d’acides aminés excitateurs (AAE). Curtis et ses collaborateurs (Curtis D.R. et
al., 1959) ont été les premiers à proposer ces acides aminés comme neurotransmetteurs en
1959. Ces deux molécules présentant des structures et des propriétés très voisines,
activent les mêmes récepteurs.
Glu
HOOC COOH
NH2
Asp
HOOCCOOH
NH2
Asp
HOOCCOO-
NH3+
Glu
HOOC COO-
NH3+
Aspartate
-OOCCOO-
NH3+
Glutamate
-OOC COO-
NH3+
Figure 4 : Formules développées des acides glutamiques et aspartiques sous leurs formes neutres, zwitterioniques et anioniques
Ne franchissant pas la barrière hémato-encéphalique, ils sont synthétisés dans les
terminaisons nerveuses. Le glutamate peut être obtenu à partir du glucose via le cycle de
Krebs, par la transamination de l’acide α-céto-glutarique ou par désamination de la
glutamine (Gln). L’aspartate a plusieurs origines : l’oxaloacetate, l’asparagine (Asn) mais
aussi le glutamate et la glutamine.
Ces acides aminés excitateurs sont largement distribués dans le système nerveux
central au niveau du télencéphale et principalement dans le système limbique. On les
retrouve aussi dans quelques régions de l’hippocampe, du noyau caudé-putamen, latéral et
baso-latéral (Figure 2).
Un dysfonctionnement de la neurotransmission glutamatergique (et
aspartatergique) est impliqué dans les maladies épileptiques mais aussi dans les troubles
psychiatriques tels que la schizophrénie(Perez-Neri I. et al., 2006).
26
4) L’acide gamma-amino-butyrique
L’acide γ-amino-butyrique (GABA) est l’un des neurotransmetteurs les plus
répandus dans le système nerveux central. Il intervient dans environ 30% des synapses
centrales chez les vertébrés. Il présente des propriétés inhibitrices, contrairement aux
acides aminés excitateurs il diminue l’activité nerveuse des neurones.
C’est un acide aminé de la série oméga constitué de 4 atomes de carbone et
spécifique du tissu nerveux (Figure 5).
HOOC NH2
GABA
Figure 5 : Formules développées de l'acide gama-amino-butyrique
Le précurseur du GABA est la glutamine ; cet acide aminé est transformé en acide
glutamique par la glutaminase puis décarboxylé par la GAD (glutamic acid decarboxylase).
Ce neurotransmetteur est principalement localisé dans le striatum (95% des
cellules) mais aussi au niveau du cortex cérébral, de l’hippocampe ou du thalamus (Figure
2). De fortes densités en terminaisons GABAergiques sont à noter dans la substance noire
réticulée (SNR) et le globus pallidus(Chen L. and Yung W.H., 2004).
Une déficience de transmission de ce neurotransmetteur est epileptogène, en effet,
une réduction du taux de GABA favorise l’apparition des convulsions épileptiques(Cossart
R. et al., 2005). A l’extrême une augmentation de la transmission GABAergique peut
présenter des effets sédatifs. De plus, une altération du métabolisme cérébral du GABA
peut être associée à des troubles neurologiques tels que la chorée de Huntington ou la
maladie de Parkinson (Chen L. and Yung W.H., 2004; Epelbaum J., 1995).
5) Les enképhalines
Les enképhalines sont des peptides appartenant à la famille des opiacés. Hughes et
ses collaborateurs identifièrent en 1975 dans le cerveau de porc deux pentapeptides ; la
leucine–enképhaline (Leu-Enk) et la méthionine-enképhaline (Met-Enk)(Figure 6)(Hughes J.
et al., 1975). Ces deux molécules présentent les mêmes propriétés antinociceptives
(atténuation ou suppression des sensations douloureuses) que la morphine car elles se
fixent sur les mêmes récepteurs opiacés. En effet les enképhalines, qui présentent des
structures différentes de celles des morphines classiques, adoptent dans l’espace des
conformations similaires(Gacel G. et al., 1979).
27
H2NN
NN
N
HO
O
H O
H O
H O
H
S
O
OHH2N
NN
NN
HO
O
H O
H O
H O
H O
OH
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
Leu-EnkMet-Enk
Figure 6 : Formules développées de la Méthionine-enképhaline et de la Leucine-enképhaline Dans le système nerveux central, les enképhalines sont issues de la protéolyse d’un
précurseur de haut poids moléculaire : la proenképhaline constituée de 243 acides aminés.
Elles sont distribuées de manières très hétérogènes dans le système nerveux central. Les
régions les plus concentrées sont le globus pallidus, le caudé-putamen, l’amygdale et
l’hypothalamus (Figure 2).
Outre les propriétés analgésiques de ces molécules, les enképhalines sont capables
de diminuer la vitesse de renouvellement de la noradrénaline et d’augmenter celle de la
dopamine. De part ces interactions, ces molécules sont impliquées indirectement dans les
pathologies neurologiques comme la maladie de Parkinson, d’Alzheimer, la schizophrénie
ou la dépression(Diez M. et al., 2003; Yew D.T. et al., 1999).
28
Toutes les molécules étudiées dans les chapitres suivants sont résumées dans le tableau ci-dessous : Tableau 1 : Récapitulatif des neurotransmetteurs étudiés dans les chapitres suivants.
Nom Abrév. Formule développée Localisation Maladies liées
Dopamine Dop
NH2
HO
HO
Mésencéphale
Schizophrénie Alzheimer Parkinson Dépression
Noradrénaline Nor NH2
HO
HO
OH
Rhombencéphale Schizophrénie
Alzheimer Parkinson
Acide
Aspartique Asp HOOC
COOH
NH2 Prosencéphale Schizophrénie
Epilepsie Acide
Glutamique Glu
HOOC COOH
NH2
Acide gamma-
aminobutyrique GABA HOOC NH2 Prosencéphale
Chorée de Huntington Epilepsie Parkinson
Leucine-
Enképhaline Leu-Enk
Prosencéphale
Schizophrénie Alzheimer Parkinson Dépression Méthionine-
Enképhaline Met-Enk
29
B. Préparation des échantillons
Le dosage de neurotransmetteurs dans les organismes vivants est fondamental pour
comprendre le métabolisme de ces molécules lors de dysfonctionnement de la
neurotransmission ou pour observer les effets pharmacologiques d’un médicament. Pour
cela, différentes méthodes d’échantillonnage ont été établies afin d’analyser ces
composés.
I. Les prélèvements biologiques
Dans le cerveau, des fragments de structure cérébrale ou des échantillons liquides
peuvent être prélevés post-mortem ou in vivo. En effet, le cerveau baigne dans un liquide
dit cérébrospinal (LCS) ou céphalo-rachidien (LCR). Chez l’Homme ce liquide, d’environ
150 mL de volume, est renouvelé quatre fois par jour en moyenne. Il est donc possible
d’en prélever quelques millilitres sur des sujets vivants au moyen d’une ponction lombaire.
Vu la complexité moléculaire de ces échantillons, il est nécessaire d’établir des
protocoles d’extraction précis pour analyser les neurotransmetteurs dans des conditions
expérimentales reproductibles.
Les neurotransmetteurs sont généralement extraits des composés de haut poids
moléculaire (protéines et peptides) par la technique de précipitation et de centrifugation
puis séparés des sels sur des cartouches d’extraction de phases solides (cartouches
SPE)(Shah A.J. et al., 2002). Ces méthodes peuvent être appliquées à différents types de
liquides biologiques (salive, urine, plasma…) et toutes sortes de tissus cellulaires (organe,
os…).
Les acides aminés et amines biogènes sont très abondants dans ces échantillons.
Cependant ces molécules ne proviennent pas toutes de la neurotransmission entre deux
cellules nerveuses(Shah A.J. et al., 1999), elles peuvent être issues des voies de synthèse
ou des métabolismes intracellulaires.
D’autres méthodes ont été développées pour collecter les neurotransmetteurs dans
les liquides extracellulaires afin d’étudier la transmission chimique seule et en minimisant
les pertes d’échantillons.
30
II. La perfusion de type push-pull
1) La perfusion classique
Cette technique, introduite par Gaddum en 1961 et développée par Myers en 1986
(Myers R.D., 1986), est la première utilisée pour collecter le liquide extracellulaire du
système nerveux central. Cette méthode repose sur l’écoulement d’un fluide physiologique
(liquide de Ringer) et le prélèvement du liquide extracellulaire à travers un système de
double canule dans le tissu cérébral. C’est un système ouvert où le liquide est directement
en contact avec les tissus cérébraux. Les composés présents dans le liquide extracellulaire
sont ainsi collectés par l’intermédiaire d’une canule coaxiale.
Cette technique a longtemps été utilisée comme méthode de prélèvement de
molécules extracellulaires dans différentes régions du cerveau(Myers R.D. et al., 1998).
Cependant, elle a été abandonnée au profit de la microdialyse à cause des lésions
qu’elle entraînait près des régions perfusées. Les dégâts provenaient principalement de la
taille des sondes et de leurs débits de perfusion.
Cette méthode, longtemps délaissée, connaît une profonde renaissance grâce à la
miniaturisation des procédés(Zhang X. et al., 1992).
2) Le système push-pull à faible débit
La perfusion push-pull à faible débit (nanodébit) est réintroduite en 2002 par
Shippy et ses collaborateurs(Shippy A. et al., 2002). Le principe de cette technique est
identique à celui décrit dans le paragraphe précédent. La seule différence vient de la
miniaturisation des matériaux utilisés favorisant l’infusion de débits de l’ordre du
nanolitre. Le schéma de la Figure 7 représente le montage de ce système. Une sonde push-
pull de 3 cm de long est fabriquée à partir d’une canule en acier inoxydable de dimension
50/150 µm de diamètre interne et externe et d’un capillaire en silice fondue. Ce capillaire
est relié à une pompe à vide réglée pour créer un débit de 10-50 nl/min. A l’autre
extrémité, une solution de liquide physiologique est infusée à travers un capillaire de silice
fondue via un pousse seringue.
31
Figure 7 : Montage d'un système de perfusion de type push-pull à nanodébit(Shippy A. et al., 2002).
Cette nouvelle méthode réduit la détérioration des cellules analysées, principal
inconvénient de la méthode de perfusion tout en optimisant la diffusion des molécules. En
effet des études comparatives entre la microdialyse et la perfusion push-pull ont été
réalisées sur la noradrénaline dans les tissus cérébraux. Ces études démontrent que le taux
d’extraction est identique pour les deux méthodes (Lisi T.L. et al., 2003) ainsi que les
lésions engendrées sur les échantillons lors des analyses(Myers R.D. et al., 1998). En 2005,
Kennedy et ses collaborateurs développent une puce microfluidique avec ce système de
perfusion pour collecter et analyser in vivo et en temps réel les neurotransmetteurs d’un
cerveau de rat(Cellar N.A. et al., 2005).
III. La microdialyse
1) Principe
La microdialyse, introduite par Delgado et Ungersted au début des années 70
(Delgado J.M. et al., 1972; Ungerstedt U. and Pycock C., 1974), est de loin la technique la
plus répandue pour la collecte de fluide extracellulaire. Cette méthode, à l’inverse de la
technique de perfusion push-pull est un système fermé sans contact direct avec les tissus
cérébraux. La microdialyse est constituée d’une sonde avec, à son extrémité, une
membrane de dialyse semiperméable. A l’intérieur de la sonde, s’écoule du liquide
physiologique par le biais d’une pompe, un équilibre est alors créé avec les tissus
interstitiels autour de la sonde. Les molécules présentes dans le fluide extracellulaire
27 gage SS tube
Tygon
epoxy 75/360 capillary
Syringe pump
50/150 capillary 28 gage SS tube
Collection tygon tube
Regulator and vacuum pump
epoxy
32
diffusent à travers la membrane de dialyse suivant un gradient de concentration et sont
collectées à la sortie de la sonde (Figure 8) (Bellander B.M. et al., 2004).
Figure 8 : Principe de la microdialyse. Les flèches noires représentent l’écoulement du liquide
artificiel et les flèches rouges la diffusion des molécules du liquide extracellulaire.
Des agents pharmacologiques peuvent être introduits dans le liquide de Ringer et
diffuser vers les cellules cérébrales à travers la membrane de dialyse : c’est la technique
de rétrodialyse (Elmquist W.F. and Sawchuk R.J., 1997).
2) Applications
La microdialyse a largement été utilisée dans la recherche mais aussi en clinique
dans différentes applications (Hutchinson P.J. et al., 2000; Shuaib A. and Siddiqui M.M.,
2001). Des études pharmacodynamiques et pharmacocinétiques ont pu être menées grâce à
la technique de rétrodialyse (Elmquist W.F. and Sawchuk R.J., 1997; Zhou Q. and Gallo
J.M., 2005).
Cette méthode peut s’appliquer sur de nombreux tissus humains ou animaux. Chez
l’animal (principalement des rats), en plus des tissus cérébraux, les organes tels que les
reins, le foie et le cœur ont été perfusés pour comprendre le comportement de certaines
molécules ou observer les effets d’un agent pharmacologique (De la Pena A. et al., 2000;
Richards D.A. et al., 2007). Chez l’Homme, la microdialyse a été utilisée cliniquement au
niveau sanguin (Hernandez L. and Paez X., 1997), musculaire (Arner P., 1999) et aussi au
niveau cérébral pour des soins intensifs par exemple (Bellander B.M. et al., 2004).
Infusion de liquide cérébral artificiel
Collecte de l’échantillon
Diffusion des molécules Diffusion des molécules
Peau
Membrane de dialyse Molécules du liquide extracellulaire
33
3) Avantages et limites de la microdialyse
De nombreuses applications autour de la microdialyse se sont développées ces
dernières années, de part les avantages que présente cette technique par rapport aux
méthodes de perfusions push-pull classiques décrites auparavant. En effet, la membrane
de dialyse ne permet de diffuser que des molécules de bas poids moléculaires. Cette
sélectivité empêchant la diffusion des enzymes, les substances récoltées dans le
microdialysat sont moins sujettes aux possibles dégradations enzymatiques et sont donc
plus stables pour l’analyse(Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995). Les neurotransmetteurs
présents dans l’échantillon peuvent être identifiés et dosés avec des techniques
séparatives telle que la chromatographie liquide. La microdialyse présente l’avantage
d’éviter le prélèvement de liquide cérébral et le contact direct du liquide avec les tissus,
ce qui diminue les risques de contamination des échantillons. De plus, les dégâts au niveau
des cellules, causés par l’implantation de la sonde et par le débit de perfusion sont réduits
par rapport à la perfusion push-pull classique mais similaires avec la perfusion push-pull
miniaturisée. Enfin, des agents pharmacologiques peuvent être administrés de manière
constante vers les cellules et cette technique couplée à des appareils d’analyse permet
d’étudier on-line le comportement des neurotransmetteurs vis-à-vis de ces molécules
exogènes.
La microdialyse présente toutefois quelques limitations dans certaines applications.
L’avantage de la sélectivité de la membrane peut effectivement devenir un inconvénient
lors de l’analyse de peptides. Ces composés de masse moléculaire supérieure à celle des
neurotransmetteurs classiques diffusent plus lentement à travers la membrane de dialyse
(Clough G.F., 2005). L’ordre de grandeur des sondes d’analyses (1-4mm) peut limiter les
régions implantables et notamment chez les petits animaux comme les rats. Enfin, cette
méthode a l’inconvénient d’influencer le métabolisme et de légèrement modifier les
concentrations des molécules (Meunier J.M. and Shvaloff A., 1995).
IV. Conclusions
L’utilité de ces techniques dans l’étude des neurotransmetteurs a largement été
décrite dans la littérature au cours de ces quarante dernières années. Le prélèvement
d’échantillons permet de localiser les molécules dans toutes les régions du cerveau.
Cependant les protocoles d’extraction peuvent être longs et les pertes de volumes assez
conséquentes. De plus il est difficile de déterminer la fonction de l’analyte, c’est-à-dire
s’il est extrait de la transmission chimique, de sa voie de synthèse ou de sa dégradation…
34
Les techniques de perfusion (push-pull ou microdialyse) ont été développées afin de
limiter ces problèmes d’extraction et pour analyser les molécules issues de la fente
synaptique lors de la neurotransmission. Elles ont permis d’élargir les domaines
d’application avec notamment la possibilité d’administrer des agents pharmacologiques
pour étudier les effets dynamiques ou cinétiques de ces agents sur la concentration en
neurotransmetteurs. Ces deux méthodes, par leurs avantages et leurs limitations, sont
complémentaires. La seule différence entre ces deux techniques ne repose que sur le
système d’écoulement, ouvert pour la perfusion push-pull ou fermé pour la microdialyse.
Le choix de la méthode réside donc dans le type de molécule et dans son site d’analyse. La
technique push-pull sera favorisée pour analyser des molécules à plus fort poids
moléculaire (polypeptides) et dans des petites régions du cerveau par exemple. A
l’opposé, la microdialyse, de part sa sélectivité membranaire sera préférée pour l’analyse
de neurotransmetteurs dans des tissus cérébraux riches en molécules.
35
C. Méthodes d’analyse et de quantification
Différents systèmes analytiques ont été développés afin de répondre aux exigences
des méthodes d’échantillonnage décrites antérieurement :
- Des systèmes dits « immunochimiques » fondés sur la reconnaissance spécifique
ligand - récepteur.
- Des systèmes électrochimiques utilisant le potentiel rédox spécifique des
molécules analysées.
- Des techniques séparatives basées sur les propriétés physicochimiques des
molécules (polarité, charge, masse…).
I. Les méthodes immunochimiques
Le principe de ces méthodes, introduites par Yalow et Berson en 1960, repose sur la
reconnaissance spécifique antigène-anticorps. Deux types d’approche ont été développés :
la première est fondée sur la compétition entre un antigène marqué de concentration
connue et l’antigène à doser, pour se fixer avec l’anticorps de quantité déterminée (Figure
9). La seconde, non compétitive, est constituée d’anticorps marqués en excès sur lesquels
se fixent les antigènes à doser (Zonszain F. et al., 1992).
Figure 9 : Principe du dosage immunochimique : dosage compétitif (en haut) et dosage non compétitif (en bas).
Ag à doser
Ag marqués Ac fixé s limitant
Marqueurs liés
Marqueurs libres
Ac : Anticorps Ag : Antigènes
Ac fixés en excès Ac marqués
Ag à doser
Marqueurs liés
Marqueurs libres
36
Les marqueurs d’antigènes (ou d’anticorps) peuvent être d’origine radioactive :
c’est la technique de radio-immunologie (RIA), enzymatique (méthode ELISA) ou
luminescente(Holme D.J. and Peck H., 1998).
Ces méthodes sont appliquées à l’analyse de neurotransmetteurs dans les fluides
biologiques avec de bonnes sensibilités due à sa spécificité. Cependant, la mise en œuvre
de telles méthodes est longue et l’analyse quantitative peut être délicate.
Les systèmes immunochimiques peuvent être couplés à la microdialyse pour doser
in vivo des neurotransmetteurs tels que les enképhalines (Marinelli P.W. et al., 2005), le
glutamate (Zilkha E. et al., 1995) ou l’acide gamma-aminobutyrique (Cook C.J., 1998).
II. Les techniques électrochimiques
La technique la plus couramment utilisée est la voltamétrie. C’est une méthode
polarographique basée sur la mesure du flux de courant résultant de la réduction ou de
l’oxydation des composés sous l’effet d’une différence de potentiel. Ce système est
constitué de trois électrodes :
� Une électrode de travail où a lieu la réaction d’oxydation (ou de réduction)
de l’analyte.
� Une électrode de référence qui impose un potentiel spécifique et constant à
l’électrode de travail.
� Une électrode auxiliaire (ou contre-électrode) qui assure le passage du
courant entre la mesure et la pile.
Ce système ne peut donc s’étendre qu’aux molécules oxydables. Un potentiel
électrique est appliqué à l’électrode de travail qui recueille les électrons arrachés aux
molécules. Le courant d’électrons engendré, appelé courant d’oxydation, est
proportionnel à la concentration de molécules oxydées. De plus, le potentiel appliqué à
cette oxydation est spécifique des substances analysées. C’est donc à la fois une méthode
de mesure qualitative et quantitative de composés électroactifs (Holme D.J. and Peck H.,
1998; Michael D.J. and Wightman R.M., 1999).
Le développement des électrodes à fibres de carbone et leurs miniaturisations
(≈100µm de diamètre interne) ont permis de mesurer les variations de concentration de
certains neurotransmetteurs in vivo et en temps réel, en implantant directement ces
microélectrodes dans les tissus cérébraux avec une détérioration limitée (Michael D.J. and
Wightman R.M., 1999; Robinson D.L. et al., 2003).
Malgré ces nombreux avantages, les techniques électrochimiques ont toutefois une
application restreinte car elles ne s’appliquent qu’aux molécules oxydables et à une
substance à la fois.
37
III. Les techniques séparatives
Ces techniques permettent de séparer et de doser plusieurs molécules dans un
même échantillon. Deux types d’appareillage ont principalement été développés pour
l’analyse de neurotransmetteurs : l’électrophorèse capillaire (CE) et la chromatographie
liquide haute performance (HPLC).
1) Electrophorèse capillaire
L’électrophorèse capillaire (CE) en tant que technique analytique a été introduite
par Mikkers et ses collaborateurs en 1979 (Mikkers F. et al., 1979) sur des tubes de
diamètres élevés puis par Jongerson en 1981 sur des capillaires micrométriques (Jorgenson
J.W. and Lukacs K.D., 1981). C’est un appareil constitué d'un capillaire ouvert dont les
extrémités plongent dans deux réservoirs d'électrolyte. Une différence de potentiel est
appliquée à chaque extrémité du capillaire et un détecteur est branché avant la sortie du
tube.
La séparation des composés résulte de deux mécanismes de transport,
l’électromigration et l’électro-osmose.
L’électromigration est le déplacement d’une espèce chargée lorsqu’elle est soumise
à un champ électrique. La mobilité électrophorétique de l’espèce chargée est fonction de
sa charge électrique et de sa masse. Le transport des cations s'effectue dans le sens du
champ électrique et le transport des anions dans le sens opposé (Figure 10).
Figure 10 : Représentation de la mobilité électrophorétique
L’électro-osmose résulte de l’interaction de l’écoulement de la solution avec la
silice du capillaire. Cette silice est constituée de fonction silanols qui se déprotonnent dès
pH > 2. Les cations présents dans l’électrolyte forment une double-couche avec les anions
de la paroi de la silice. Cette double couche chargée positivement et négativement
présente une différence de potentiel appelée potentiel zêta. Dès l’application du champ
électrique, les cations de la double couche se déplacent vers la cathode et entraînent les
molécules électrolytiques de l'échantillon : c'est le flux électroosmotique (Figure 11).
38
Figure 11 : Représentation du flux électro-osmotique
La migration des molécules provient de la somme des vitesses de ces deux
phénomènes. Ainsi, lorsqu’un champ électrique est appliqué, les cations se déplacent à
une vitesse correspondant à la somme des flux électrophorétiques et electro-osmotiques.
Les molécules neutres ne dépendent que du flux electro-osmotique et les anions sont plus
retenus car leur vitesse correspond à la somme des flux électro-osmotiques et des
migrations electrophorétiques opposées au champ électrique (Figure 12).
Figure 12 : Principe de la séparation en électrophorèse capillaire
Les solutés sont donc séparés en fonction de leur mobilité electrophorétique, c’est-
à-dire leur rapport charge/diamètre d’ion solvaté (Z/R). Ce principe est utilisé en
électrophorèse capillaire de zone (capillary zone electrophoresis CZE) (Taverna M. et al.,
2003). Trois autres méthodes basées sur ce principe sont principalement utilisées pour
l’analyse des neurotransmetteurs.
L’électrophorèse capillaire électrocinétique micellaire (micellar electrokinetic
capillary chromatography MEKC) qui permet de séparer les composés selon le rapport Z/R
et leur hydrophobie. Un tensio-actif, le plus couramment du dodécyle sulfate de sodium
(SDS), est ajouté à l’électrolyte pour former des micelles de mobilité électrophorétique
négative. Les molécules neutres encapsulées migrent alors avec la micelle (Terabe S. et
al., 1985).
L’électrophorèse capillaire sur gel (capillary gel electrophoresis CGE) sépare les
molécules en fonction de leur taille dans un gel constitué de polymères (Miksik I. et al.,
2006).
39
L’électrochromatographie capillaire (capillary electrochromatography CEC) combine
le principe de la chromatographie liquide (phase stationnaire) et celui de l’électrophorèse
capillaire (flux électro-osmotique). Les composés sont séparés suivant leur coefficient de
partage dans la phase stationnaire et l’électrolyte, et en fonction de leur rapport Z/R
(Eeltink S. and Kok W.T., 2006).
De part sa faible quantité de volume nécessaire à l’injection, l’électrophorèse
capillaire peut directement être couplée à la technique de microdialyse. Cette méthode
permet ainsi de suivre in vivo l’évolution d’un ou de plusieurs neurotransmetteurs. Il est
cependant nécessaire d’obtenir des électrophorégrammes avec des temps d’analyses
relativement courts (Powell P.R. and Ewing A.G., 2005).
2) Chromatographie liquide à haute performance
La chromatographie liquide à haute performance (high performance liquid
chromatography, HPLC) a été développée en 1968 par Giddings (McLaren L. et al., 1968).
Le principe de séparation repose sur l’interaction des solutés entre deux phases non
miscibles : la phase stationnaire qui est fixe et la phase mobile (Figure 13) (Caude M. and
Jardy A., 1996).
Figure 13 : Principe de la chromatographie liquide haute performance
Afin de couvrir un large domaine d’application, plusieurs modes de HPLC ont été
développés suivant le type de molécules à analyser. Les composés de masse molaire
supérieure à 10000 g/mol sont généralement séparés selon leurs tailles par la
chromatographie d’exclusion : à perméation de gel pour les molécules non polaires ou à
filtration de gel pour les espèces polaires ou ioniques. Dans le cas de petites molécules, la
chromatographie d’adsorption est principalement utilisée pour les espèces non polaires ;
les analytes, en compétition avec la phase mobile, sont adsorbés sur la surface d’un solide
(phase stationnaire). La chromatographie par échange d’ions permet de séparer des
composés ioniques ; la phase stationnaire est dans ce cas, une résine échangeuse d’ions.
Pour les espèces non ioniques et polaires telles que les neurotransmetteurs de types acides
40
aminés, la chromatographie de partage sera privilégiée (Skoog D.A. et al., 1997). C’est le
type de chromatographie liquide le plus utilisé, notamment dans les domaines
d’application en chimie pour l’industrie pharmaceutique, en biochimie, en agrochimie…
a) Principe de la chromatographie de partage
La chromatographie de partage peut être divisée en deux catégories : la
chromatographie liquide-liquide et liquide–phase greffée. Dans le premier cas, la phase
stationnaire est un solvant immobilisé par adsorption physique sur la surface du support.
Dans le cas de la chromatographie de partage liquide-phase greffée, la phase stationnaire
est généralement sous forme de billes de silices greffées (Figure 14). De part la stabilité de
cette phase, la chromatographie de partage liquide-phase greffée est la plus utilisée de
nos jours (Skoog D.A. et al., 1997).
Figure 14 : Photographie de billes de silice
La séparation des composés dépend de deux paramètres principaux : la nature de la
phase stationnaire et de la phase mobile. Les molécules peuvent, selon leurs affinités,
migrer avec la phase mobile ou être retenues par la phase stationnaire. La phase mobile,
dite éluant, est constituée d’un solvant ou d’un mélange de solvants de grandes puretés.
Selon les fonctions chimiques greffées sur la silice et la polarité de la phase mobile,
deux types de chromatographie de partage peuvent alors être distingués. Si la silice est
greffée de groupements fonctionnels polaires (CN, NH2 …), la phase mobile sera
relativement apolaire. Dans ce cas les molécules les plus polaires auront une grande
affinité avec la phase stationnaire et une faible interaction avec l’éluant : c’est la HPLC en
phase directe ou classique. Si la silice est constituée de longues chaînes alkyles de type C8
ou C18 : les composés les moins polaires seront plus retenus, de part leurs interactions
avec la phase de la colonne, que les composés plus polaires. C’est la HPLC en phase
inverse (reverse phase high performance liquid chromatography RP-HPLC).
Actuellement la HPLC en phase inverse constitue 80 % des séparations analytiques.
41
b) les phases stationnaires en phase inverse
La phase stationnaire sous forme de colonne est l’élément clé d’une bonne
séparation chromatographique. Les billes de silice qui la constituent, sont synthétisées à
partir de silanes polymérisés. Sur les fonctions silanols sont greffés des groupements
chimiques alkylés de types C18 par exemple (Figure 15).
Figure 15 : Représentation d'une bille de silice greffée
Les fonctions silanols (Si-OH) de surface ne sont toutefois pas toutes greffées, la
phase stationnaire contient plus ou moins des groupements silanols libres. Les Si-OH
résultants engendrent des interactions hydrophiles parasites, les résultats ne sont plus
dans ce cas reproductibles. Pour pallier ce problème, les Si-OH de surface sont remplacés
par des Si-O-CH3 : c’est le « end-capping ». Le taux de greffage et le processus de « end-
capping » sont donc des paramètres importants pour la résolutivité des phases
stationnaires.
A l’achat, trois grandeurs caractérisent les colonnes en plus du type de phase
greffée : la longueur, le diamètre et la granulométrie (diamètre des particules).
La longueur et le diamètre joue principalement sur la durée de la séparation, plus
la colonne est courte, plus vite les molécules sont éluées.
La taille des particules influence deux paramètres : la pression dans la colonne et
l’efficacité de la séparation. En effet, pour des longueurs de colonnes égales, les
molécules diffusent plus rapidement lorsque les particules sont plus fines. De plus la
pression dans le système augmente avec la dimunition du diamètre (Caude M. and Jardy
A., 1996).
42
c) Appareillage
Un appareil de chromatographie liquide est constitué d’un système de pompage,
d’un système d’injection et d’un détecteur (Figure 16). Le système de pompage assure
l’élution des solvants soit en mode isocratique, c’est-à-dire dans des proportions
constantes, soit sous forme de gradient (compositions variables au cours du temps). Ce
système doit répondre à un certain nombre de contraintes :
- son rendement (ratio du débit délivré par la pompe sur le débit demandé) doit
être indépendant de la nature du solvant
- le débit doit être constant et reproductible
- le mélange des différentes compositions du solvant lors de gradients doit être
reproductible et efficace
- les pompes doivent supporter des hautes pressions (400 bars environ).
Pour répondre à ces requêtes des pompes à piston permettant l’aspiration et le
refoulement des éluants ont été développées. Ces pompes présentent l’avantage de
posséder de petits volumes morts, d’atteindre des pressions élevées (jusqu’à 700 bars),
d’être adaptable à la technique du gradient et d’avoir des débits constants et
indépendants de la nature du solvant et de la pression à l’entrée de colonne (Caude M. and
Jardy A., 1995).
Figure 16 : Schéma d'un appareil basse pression de chromatographie liquide à haute performance Les composés sont généralement introduits via des injecteurs capables de supporter
les pressions élevées en tête de colonne. Pour se faire, des vannes à boucle
d’échantillonnage manuelle ou automatique avec un système de passeur, ont été mises au
point. Son fonctionnement est le suivant : l’échantillon injecté dans la boucle est entraîné
Vanne de mélange
Solvant A Solvant B
Pompe Echantillon
Colonne HPLC
Détecteur
Poubelle
Injecteur
Système d’aquisition
43
par la phase mobile en tête de colonne par rotation de la vanne. Une autre rotation
permet ensuite le rinçage de la boucle. L’injection automatique assure une meilleure
reproductibilité du volume d’injection, nécessaire à l’étalonnage externe des composés
(Caude M. and Jardy A., 1995).
d) Evolutions récentes
Au cours de ces trente dernières années, les phases stationnaires ont évolué vers
une granulométrie plus fine afin de gagner en temps d’analyse et en résolution. Les débits
d’élution ont été optimisés pour compenser les fortes pressions dues aux fines
granulométries des colonnes. Les pompes permettent alors d’éluer des solvants à des
débits de l’ordre du microlitre et du nanolitre ; les termes de microHPLC (µHPLC) et de
nanoLC sont alors utilisés.
En 2004, des pompes capables de générer de très hautes pressions ont été
développées afin d’être appliquées à des colonnes de granolumétrie de 1,7 µm. C’est la
chromatographie liquide ultra haute performance (UPLC). Cette technique permet
d’analyser des échantillons très complexes en quelques minutes avec d’excellentes
résolutions chromatographiques (Swartz M.E., 2005).
3) Modes de détections
Les détecteurs permettent de visualiser la séparation chromatographique via un
système d’acquisition informatique (Figure 16). Ils sont caractérisés par leur sélectivité,
c’est-à-dire le type de molécules qu’ils peuvent détecter, et leur sensibilité : la quantité
minimale détectable. Un détecteur à la fois sensible et universel n’existant pas, de
nombreux détecteurs basés sur différents principes ont été développés avec l’essor de ces
techniques séparatives (HPLC et CE). Ces appareils peuvent toutefois être caractérisés
selon les propriétés chimiques des analytes mis en jeu.
a) Le réfractomètre différentiel
La réfractométrie différentielle permet de mesurer en continu la différence
d’indice de réfraction entre la phase mobile et l’analyte séparé dans la colonne. La
détection dépend de la nature de l’éluant et celle du soluté, la réponse est donnée par la
relation :
R1 = Z(n-n0) Avec Z : constante caractéristique de l’appareil
n : indice de réfraction en sortie de colonne
n0 : indice de réfraction de la phase mobile
44
De part cette relation, il est nécessaire d’avoir un bruit de fond constant. Il est
donc impossible d’utiliser une élution sous forme de gradient avec ce type d’appareil. Le
réfractomètre peut détecter toutes les molécules qui ont un indice de réfraction différent
de celui de l’éluant. Cependant, il est très sensible aux variations de températures, de
débits et de pression. Les limites de détection sont donc élevées par rapport aux
détections spectroscopiques ou aux détecteurs à diffusion de la lumière (Ivanov A.R. et al.,
2000).
b) Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL)
Le principe de ce détecteur est fondé sur l’évaporation partielle des solutions en
sortie de colonne, le brouillard de particules formé avec un nébuliseur traverse un faisceau
lumineux. La lumière diffusée sous un angle déterminé est détectée par un
photomultiplicateur. Ce type de détection est donc limité à l’emploi de phases mobiles
volatiles et d’analytes moins volatils. La détection dépend de la taille des particules
diffusant la lumières. La réponse n’est pas directement proportionnelle à la quantité de
molécules injectées mais peut cependant être linéarisée sous forme logarithmique. Dans le
cas de l’analyse de neurotransmetteurs les limites de détection varient de 20mg/L à 56
mg/L selon l’acide aminé analysé (Yan D. et al., 2007).
c) Détection UV-visible
La spectrophotométrie UV-visible permet de détecter des molécules qui absorbent
dans l’UV et le visible. La réponse de ce type de détecteur est fondée sur la loi de Beer-
Lambert :
A = IT/I0= ε(λ).l.C
Avec I0 intensité optique transmise
IT intensité optique de référence
ε(λ) absorptivité molaire du soluté à la longueur d’onde λ
l longueur du trajet optique
C concentration du soluté dans l’éluant
Il existe plusieurs types de spectrophotomètres classifiables selon leur degré
d’information :
- Les spectrophotomètres où la longueur d’onde est fixée pas l’opérateur.
- Les détecteurs dont la longueur d’onde est programmable en sensibilité au
cours du temps.
45
- Les spectrophotomètres à barrette de diodes qui permettent une acquisition
en trois dimensions : absorbance-longueur d’onde-temps.
Quelques neurotransmetteurs de type acides aminés absorbent dans l’UV à de
faibles longueurs d’onde (190-300 nm) grâce à leur fonction aromatique. Les limites de
détections sont de l’ordre de du mg/L avec ce mode de détection (Petritis K. et al., 2002).
d) Détection de fluorescence
Ce type de détection possède une grande sélectivité et une sensibilité élevée. Le
principe de la fluorescence est décrit en trois étapes par le diagramme de Jablonski
(Lakowicz J.R., 1999):
- La molécule fluorescente (ou fluorochrome) absorbe des photons dans l’UV et
passe d’un état électronique fondamental (S0) à un état singulet excité (Sn).
- L’énergie absorbée (Sn) peut être dissipée sous forme de chaleur ou par des
conversions internes. Le fluorochrome perd en énergie interne et passe à un état singulet
excité plus faible (S1).
- La fluorescence est le retour de l’état excité de la molécule à son état
fondamental (S0) avec la ré-émission d’un photon.
Figure 17 : Diagramme de Jablonski décrivant le principe de la fluorescence
La sensibilité de ce type de détecteur est environ pour une même molécule mille
fois supérieure à celle de la spectrophotométrie UV. Les limites de détection pour des
neurotransmetteurs naturellement fluorescents sont de l’ordre du nanomole/L (Lapainis T.
et al., 2007).
Ces détecteurs sont équipés d’une source lumineuse, de filtres d’excitation appelés
monochromateur d’excitation, d’une cellule d’analyse et de filtres d’émission. Le principe
de fonctionnement est le suivant : la source lumineuse traverse le monochromateur à une
longueur d’onde choisie, le faisceau lumineux émergeant excite la molécule présente dans
46
la cellule et la lumière émise traverse un nouveau filtre d’émission. La lumière résultante
est intensifiée via un photomultiplicateur, le signal est enregistré sous forme de pics
(Caude M. and Jardy A., 1995).
Afin de gagner en sensibilité, la source lumineuse, qui classiquement est une lampe
à Xénon, peut être substituée par un rayonnement laser d’excitation : c’est la détection
de fluorescence induite par LASER (laser induced fluorescence, LIF). Le principe de ce
mode de détection est légèrement différent de celui des détecteurs de fluorescence
conventionnels.
Par exemple, dans le détecteur développé par le laboratoire avec la société
Picometrics, le faisceau laser transmis par une fibre optique se réfléchit sur un miroir
dichroïque et traverse un objectif. Une bille de saphir située en sortie de l’objectif
focalise, sur la fenêtre du capillaire, les rayons lumineux réfléchis. Les molécules
présentes dans le capillaire, à cet instant, sont excitées et émettent un signal fluorescent.
Les rayons collectés par la bille et l’objectif traversent le miroir dichroïque et plusieurs
filtres avant d’être intensifiés par un tube photomultiplieur (Figure 18) (Bayle C. et al.,
2006)
Figure 18 : Schéma du détecteur LIF « à bille » de Picometrics
Si l’analyte présente une longueur d’onde d’excitation maximale proche de celle du
faisceau lumineux, la sensibilité de la détection peut être accrue d’un ordre de grandeur
10000 fois supérieur à celle d’un détecteur de fluorescence à lampe au Xénon (Bayle C. et
al., 2006). Ce mode de détection peut être couplé à l’électrophorèse capillaire ou à la
Laser
Fibre optique
Capillaire
Faisceau lumineuxFenêtre du capillaire Bille de saphir
Cellule
Filtres
Miroir dichro ïque
Tube photomultiplieur
Signal fluorescent
Laser
Fibre optique
Capillaire
Faisceau lumineuxFenêtre du capillaire Bille de saphir
Cellule
Filtres
Miroir dichro ïque
Tube photomultiplieur
Signal fluorescent
47
chromatographie liquide haute performance. C’est la méthode la plus utilisée pour
analyser des peptides (Lacroix M., 2005) ou des acides aminés (Poinsot V. et al., 2005).
e) Autres détecteurs
D’autres types de détecteurs ont été développés afin d’être couplés à
l’électrophorèse capillaire ou la HPLC. Les détecteurs électrochimiques où les propriétés
oxydo-réductrices des solutés sont mises en jeu (Lisi T.L. and Sluka K.A., 2006; Psurek A.
et al., 2006). Le principe est identique à la technique d’analyse décrite dans le paragraphe
II. Dans ce cas il est nécessaire que l’éluant soit suffisamment conducteur pour assurer le
passage du courant. Afin d’augmenter la sensibilité ou la sélectivité, plusieurs électrodes
de travail peuvent être disposées en série ou en parallèle (Caude M. and Jardy A., 1995). Il
est aussi possible de coupler l’immunochimie avec le principe des méthodes RIA et ELISA à
l’électrophorèse capillaire ou la HPLC. Associés aux techniques séparatives ces modes de
détection sont très sélectifs et atteignent des sensibilités de l’ordre du mg/L.
IV. La spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse est un puissant outil analytique de part ces nombreuses
applications. Elle permet d’identifier, de quantifier des composés et d’analyser leurs
structures. Cet instrument de mesure peut être utilisé comme analyseur et être
directement couplé à la microdialyse (Jiang Y. and Lee C.S., 2001) ou être couplé comme
détecteur à des méthodes séparatives telles que la HPLC (Zhang M.Y. and Beyer C.E.,
2006) ou la CE (Mol R. et al., 2006). Ce n’est que depuis ces vingt dernières années que
cette méthode a connu son essor pour l’analyse de biomolécules.
1) Historique
L’origine de cette technique remonte au début du XXème siècle avec la découverte
des ions positifs par E. Goldstein. En 1912 le physicien J. J. Thomson obtient les spectres
de masse de O2, N2, CO, CO2, COCl2 et observe des ions négatifs, des ions à charges
multiples et des ions métastables. Il obtient pour ces travaux le prix Nobel en 1922. En
1918, A.J. Dempster construit le premier spectromètre à secteur magnétique à focalisation
en direction. Cependant les premiers instruments ne sont commercialisés qu’en 1942 par la
Consolidated Engineering Corporation pour une raffinerie pétrolière en vue d’analyser des
composés organiques.
48
2) Principe
La spectrométrie de masse permet de mesurer le rapport m/z d’une molécule avec
m la masse moléculaire monoisotopique du composé et z sa charge. Pour se faire, la
molécule est d’abord introduite, directement ou par une technique chromatographique
dans la source puis ionisée en phase gazeuse. Un ou plusieurs analyseurs séparent les ions
produits en fonction de leur rapport m/z, un détecteur compte les ions produits et
amplifie le signal qui sera traité par un système informatique. Le résultat obtenu est un
spectre de masse représentant en abscisse le rapport m/z et en ordonnée l’abondance
relative des ions formés (De Hoffmann E. et al., 1999).
3) Les sources d’ionisation
Les sources d’ionisation permettent de disperser les molécules et de les ioniser. Les
ions peuvent être de types positifs ou négatifs selon le mode d’ionisation choisi.
a) La source à impact électronique (IE)
L’impact électronique est la source la plus ancienne, elle a été inventée par A.J. Dempster
en 1918 (Dempster A.J., 1918). C’est l’une des plus courantes pour l’analyse de petites
molécules organiques. Un filament chauffé émet des électrons qui sont accélérés par une
cathode vers une anode. Lors de leur trajet, ces électrons entrent en collision avec les
molécules gazeuses introduites dans la source. Lors de leur rencontre, si l’énergie
cinétique fournie est suffisante, un électron est arraché à la molécule (M) qui devient un
ion radical de type M+.. Cet ion peut à son tour se fragmenter pour donner soit un autre
cation radicalaire (OE+.) avec une molécule neutre (N), soit un un cation (EE+) et un
nouveau radical (R.) (Figure 19). Ce type d’ionisation n’engendre que des ions positifs.
M + e- M + 2e-EE+ + R
OE + N
Met
Figure 19 : principe de l'ionisation d'une molécule par impact électronique et ses possibles fragmentations
Une variante de ce mode d’ionisation consiste à désorber l’échantillon d’un
filament de rhénium chauffé. Ce filament est introduit près du faisceau d’électron. Dans
ce cas c’est une ionisation électronique par désorption (DEI).
49
b) La source par impact chimique (IC)
Le principe de cette source est similaire à celui de l’ionisation électronique. Un gaz
réactif (R) est introduit dans la source et ionisé par impact électronique. Les ions
résultants entrent alors en collision avec les molécules neutres du gaz pour échanger un
proton. Le gaz protoné intéragit avec les molécules à analyser pour donner principalement
l’ion moléculaire de type (M+H)+ et des ions-molécules (M+R+H)+ dans le cas d’une
ionisation positive. Il est possible avec ce mode d’ionisation d’engendrer des ions négatifs.
Les gaz d’ionisation chimique les plus couramment utilisés sont le méthane, l’isobutane et
l’ammoniac. Comme pour l’impact électronique, il est possible de déposer l’échantillon
sur un filament de tungstène ou de rénhium dont la température est contrôlée : c’est
l’ionisation chimique par désorption (DCI).
Les deux modes d’ionisation décrits ci-dessus sont préférentiellement utilisés pour
être couplés à la chromatographie gazeuse sur de petites molécules volatiles car ces
techniques nécessitent un vide poussé. En revanche, les sources détaillées ci-après ont
spécialement été développées en vue d’être utilisées sur des molécules non volatiles
séparées en chromatographie liquide.
c) la désorption laser assistée par matrice (MALDI)
Développée en 1985 par Hillenkamp (Hillenkamp F. et al., 1985), c’est une méthode
efficace pour ioniser des molécules déposées sur une matrice organique, aromatique et
protique. L’échantillon mélangé à cette matrice, le plus souvent l’acide sinapique, est
cristallisé sur une surface solide appelée la cible. Ce mélange est désorbé puis ionisé par
un faisceau laser pulsé appartenant généralement au domaine des ultraviolets. Les
molécules de la matrice absorbent les photons UV qui s’ionisent après excitation. Cette
irradiation apporte une grande quantité d’énergie sur le mélange dans la phase condensée.
Un transfert de proton entre la matrice photoexcitée et l’échantillon entraîne la
désorption des ions formés (Figure 20).
50
Figure 20 : Schéma du principe de l'ionisation MALDI
Cette méthode d’ionisation conduit à la formation d’ions de types [M+nH]n+ avec n ≥
1. La plupart du temps les ions monochargés sont les plus prépondérants.
d) l’électrospray
L’ionisation par électrospray (ESI) a été introduite en 1984 par J.B. Fenn
(Whitehouse C.M. et al., 1985). Son principe est le suivant : un fort champ électrique est
appliqué à pression atmosphérique sur un liquide, issu d’un système chromatographique
par exemple, qui traverse un tube capillaire métallique. Le champ électrique intense est
obtenu par l’application d’une différence de potentiel de plusieurs kV entre le capillaire et
une contre-électrode. Sous l’effet de ce champ, une accumulation de charge sur le liquide
provoque la formation de fines gouttelettes chargées négativement ou positivement selon
le mode d’ionisation choisi. Un flux d’azote chauffé entraîne la désolvatation de l’éluant
dans les gouttelettes. Cette évaporation provoque un rétrécissement tel, que leurs
densités de charge devenant trop importantes, les forces répulsives coulombiennes
atteignent les forces de cohésion du système. Les gouttelettes explosent et libèrent des
gouttelettes de plus en plus petites jusqu’à la désorption des ions. Ces ions peuvent selon
leurs structures, porter une ou plusieurs charges, négatives ou positives.
Echantillon
Matrice :
Acide sinapique
TRANSFERT DE PROTON
DESORPTION
IRRADIATION
DESOLVATATION
51
Figure 21 : Schéma du principe de l'ionisation par électrospray en mode positif (ESI+)
Ce mode ionisation peut également être appliqué sur des molécules ne présentant
aucun site ionisable avec la formation d’adduits sodique, potassique… en mode positif ou
chlorique, acétate… en mode négatif.
Fenn et Tanaka ont reçu le prix nobel de chimie en 2002 pour l’ensemble de leurs travaux
sur le développement des méthodes de désorption par ionisation douce pour des analyses
de macromolécules biologiques par spectrométrie de masse.
4) Les analyseurs
L’analyseur permet de séparer les ions produits selon leurs rapports m/z. La
performance d’un analyseur est déterminée par trois critères de qualité (Bouchoux G. and
Sablier M., 2005) :
- la limite en masse qui est la valeur limite du rapport m/z mesurable
- la transmission déterminée par le rapport entre les ions produits dans
la source et ceux arrivant au détecteur
- la résolution, la capacité d’obtenir deux signaux distinguables pour
deux ions de rapports m/z voisins.
En général, la résolution d’un pic isolé se calcule en établissant le rapport
de la masse de ce pic sur la différence de masse minimale de 2 pics séparés avec
une vallée interpic égale à 10% de la hauteur des pics : R = m/δm.
+ 3 à 8 kV
Proton
Molécule
VERS L’ANALYSEUR
ELECTROSPRAY
Explosion des
gouttelettes CAPILLAIRE METALLIQUE
Réduction de la taille des gouttelettes
N2
N2
N2
Evaporation du solvant (M+nH)n+
Ion multichargé
POMPE
52
Comme pour les sources il existe de nombreux analyseurs, nous ne décrirons que
ceux que nous avons utilisés : les analyseurs quadripolaires (Q) et l’analyseur à temps de
vol (TOF).
a) L’analyseur quadripolaire
Décrit par Paul en 1953 (Paul W. and Steinwedel H., 1953), les analyseurs sont
constitués de quatre électrodes ayant une section hyperbolique ou cylindrique, reliées
entre elles avec une distance de 2r0 pour chaque électrode opposée (Figure 22).
Figure 22 : Schéma du principe de l'analyseur quadripolaire
Ces barres cylindriques adjacentes sont soumises au même potentiel φ0 mais de
signe opposé. Les ions pénétrant dans le quadripôle suivent l’axe des z et sont influencés
par la combinaison d’un champ alternatif quadripolaire (V) et d’une tension constante (U)
résultant des potentiels appliqués aux électrodes.
φ0 = +(U – V cos ωt) et - φ0 = -(U – V cos ωt)
Avec φ0 tension appliquée aux électrodes
ω fréquence angulaire (ω = 2πf ou f fréquence du champ RF)
La trajectoire (x, y, z) d’un ion de masse m donnée est uniforme selon l’axe z et
décrite par les équations de Mathieu, établies en 1866, selon les axes x et y (Campbell R.,
1955).
Pour être détecté cet ion doit posséder des coordonnées x et y strictement
inférieures à r0. Dans le cas contraire, les ions seront déchargés sur les électrodes et ne
seront pas détectables. Des zones de stabilités de l’ion peuvent être définies à partir des
valeurs de U et de V pour maintenir x et y inférieurs à r0. Lorsque le rapport U/V est
Potentiel U et V
ϕο = U – V cos ωt
ϕο = - U + V cos ωt
Ion stabilisé
Ion non stabilisé
Source
Détecteur
53
maintenu constant, le fonctionnement de l’appareil peut être représenté par une droite.
La résolution entre ces ions augmente avec un coefficient de droite élevé. Un balayage
suivant la droite de coefficient U/V permet de détecter successivement tous les ions m/z
dont la zone de stabilité coupe la droite de fonctionnement (Figure 23).
Figure 23 : Zone de stabilité en fonction de U et V pour des ions de différentes masses.
Si la tension continue U est nulle, la résolution devient nulle et tous les ions de
rapport m/z supérieur à la valeur imposée par V auront une trajectoire stable. Le
quadripôle est dans ce cas dit transparent et joue le rôle de focalisateur d’ion (De
Hoffmann E. et al., 1999).
Cet analyseur ne permet pas de déterminer la masse exacte d’une molécule. C’est
un appareil à basse résolution.
Paul et Steinwedel brevettent un quadripôle de type « ion trap » en 1960 (Paul W.
and Steinwedel H., 1960). Cet analyseur présente un principe similaire à celui du
quadripôle. Il est constitué d’une électrode circulaire couverte de deux calottes
sphériques. En superposant U et V, on obtient un quadripôle en trois dimensions où les ions
sont piégés sur une trajectoire formant un huit en 3D. Depuis cet analyseur a été
développé et peut déterminer des rapports m/z de 6000 et atteindre des hautes
résolutions.
b) Analyseur à temps de vol (TOF)
Les analyseurs à temps de vol ont été décrits par Wiley et Mc Laren en 1955 (Wiley
W.C. and Mc Laren I.H., 1955). Cet appareil mesure le temps que met un ion à parcourir
une certaine distance, à une tension donnée. Les ions formés dans la source sont extraits
et accélérés par un champ électrique accélérateur dans un long tube, appelé tube de vol,
libre de champ.
U
V
m1
m2
m3 m1 < m2 < m3
54
Pour un ion de masse m et de charge z, soumis à une forte tension V a une énergie
cinétique Ec (égale à l’énergie potentielle) en sortie de source de :
Ec = z.e.V
L’énergie cinétique peut aussi s’exprimer par la relation :
Ec =m.v²/2
Avec v la vitesse de l’ion soit la distance parcourue d en un instant t (v =d/t)
A partir de ces deux équations on peut écrire :
m/z = (2V/d²).t²
Or le terme (2V/d²) étant constant, le rapport m/z est proportionnel au carré du temps
de vol.
La séparation des ions ne dépend que de la vitesse acquise lors de la phase
d’accélération. Les ions de même rapport m/z sont enregistrés sous forme d’un signal
temps/intensité au niveau du détecteur.
Ces analyseurs ont par la suite été perfectionnés par l’introduction d’un réflecteur
électrique afin de corriger les problèmes de dispersion en énergie cinétique limitante en
termes de résolution. Le réflecteur est constitué d’un miroir électrostatique sur lequel un
fort champ électrique de direction opposée à celle du champ accélérateur est imposé. Le
mouvement des ions est modifié, ils mettent plus de temps pour atteindre le détecteur.
Leur dispersion d’énergie cinétique est réduite et la résolution est améliorée (Figure 24).
Figure 24 : Schéma du principe de l'analyseur TOF en mode réflectron
ma =mb =mc Eca < Ecb < Ecc
Réflectron
Source d’ionisation
Détecteur
55
Ce genre d’analyseur n’est théoriquement pas, à l’inverse du quadripôle, limité
dans les hautes masses. Mais en pratique les grosses molécules s’ionisent difficilement et
le temps de vol de ces molécules n’est pas facile à déterminer quand le rapport m/z est
élevé. C’est un instrument à haute résolution (R = 10000 environ), il est capable en
utilisant un étalon interne de déterminer des masses à 5 ppm près. Ces calculs permettent
de lever l’ambigüité sur les formules des petites molécules organiques.
5) La spectrométrie de masse tandem : MS/MS
La spectrométrie de masse tandem permet d’étudier la structure des molécules et
d’identifier de manière très spécifique certains ions. Son principe est le suivant : un ion
sélectionné par un premier analyseur se décompose spontanément (ion métastable) ou
entre en collision dans une cellule, remplie d’un gaz inerte le plus souvent de l’argon, les
fragments résultants sont ensuite étudiés par un second analyseur. La MS/MS peut être
réalisée en combinant plusieurs analyseurs de même type comme le triple quadripôle ou
de types différents, ce sont des détecteurs dits hybrides comme le Q-TOF qui est
l’association d’un quadripôle et d’un analyseur à temps de vol (Figure 25).
Figure 25 : Schéma représentant un ESI/Q-TOF Selon l’information sur la molécule désirée, il existe différents modes d’analyse
MS/MS.
SYSTEME DE POMPAGE
Réflectron
Cellule de collision Quadripôle
Spray
Arrivée de l’échantillon
Source electrospray
TOF
Accélérateur d’ions Détecteur
56
Le mode Père cherche Fils ou descendant permet d’obtenir des informations
structurales sur la molécule. Il est par exemple très utilisé pour déterminer la séquence en
acides aminés de peptides (Cai X. and Dass C., 2005). Le premier analyseur est paramétré
de façon à ne laisser passer que l’ion de rapport m/z sélectionné dans la cellule de
collision. Les fragments obtenus sont séparés et analysés dans le second analyseur. Le
spectre de masse résultant présente à la fois l’ion précurseur (ion parent) et ses fragments
(les ions fils).
Le mode ascendant ou Fils cherche Père, le premier analyseur balaie une gamme de
masse qui entre dans la cellule de collision. Le second analyseur est focalisé sur un
fragment de rapport m/z précis. Seuls les ions capables de générer le fragment sélectionné
sont détectés.
Dans le cas de la perte de neutre, les deux analyseurs balaient une gamme de
masse simultanément avec un décalage de masse constant. Les ions engendrant la perte
d’une molécule neutre correspondant au décalage de masse seront détectés (Bourcier S. et
al., 2006). Ces deux modes permettent de mettre en évidence des ions ayant des
particularités communes.
Le mode MRM (Multiple Reaction Monitoring) permet de quantifier des ions avec
une très grande sensibilité (Bourcier S. et al., 2006; Yang J.Z., 2002). Le premier analyseur
est paramétré pour sélectionner le rapport m/z à étudier. Cet ion est fragmenté dans la
cellule de collision et le second analyseur est focalisé sur un des fragments produits. Cette
méthode permet de minimiser le bruit de fond en augmentant la sélectivité de l’analyse.
57
L’analyse de neurotransmetteurs dans les milieux biologiques est donc un très
vaste domaine de recherche. On a vu que de nombreuses méthodes analytiques ont été
développées pour étudier ces molécules, chacune ayant sa propre spécificité et sa propre
sensibilité. Il n’existe donc pas de techniques plus performantes que d’autres. Cependant,
une des méthodes les plus souvent utilisées pour ce type d’analyse est le couplage d’une
technique séparative (HPLC ou CE) avec un détecteur de fluorescence ou un spectromètre
de masse haute résolution.
Afin de bénéficier des performances de chacun de ces détecteurs nous avons décidé
de développer une nouvelle méthode d’analyse de neurotransmetteur en conjuguant la
chromatographie liquide haute performance avec un détecteur de fluorescence (multi
longueur d’onde ou LIF) et un spectromètre de masse ESI/Q-TOF.
58
59
Résultats
60
61
Chapitre 2. Analyse de neurotransmetteurs de types acides aminés
Les milieux biologiques sont très riches en amines et notamment en acides aminés,
il est donc nécessaire de séparer (par chromatographie liquide, par exemple) les
neurotransmetteurs de type amino-acides des autres acides aminés.
La plupart de ces molécules ne sont pas fluorescentes. Seuls la tyrosine, le
tryptophane et les catécholamines telles que la dopamine et la noradrénaline peuvent être
détectés en fluorescence (Lapainis T. et al., 2007). Des agents de fluorescence ont été
développés afin d’augmenter la sélectivité de ces analyses. Ces agents doivent réagir
rapidement et quantitativement avec l’analyte. Les longueurs d’onde d’excitation et
d’émission résultant du marquage doivent être supérieures aux longueurs d’onde des
molécules naturellement fluorescentes.
A. Rappels sur les méthodes de marquage des acides aminés.
Les acides aminés peuvent être marqués soit sur leurs fonctions acides
carboxyliques soit sur leurs fonctions amines. La plupart des agents développés pour le
marquage de ce type de molécules réagissent avec le groupement amine (Fukushima T. et
al., 2003). En HPLC, le marquage peut être effectué avant la séparation
chromatographique : c’est un marquage dit pré-colonne. Dans ce cas, le composé résultant
doit être suffisamment stable pour conserver ces propriétés fluorescentes avant et
pendant l’injection. Si la molécule n’est pas stable, le marquage peut être réalisé juste
avant la détection. Le temps de réaction de ce marquage, dit post-colonne, doit être très
rapide pour assurer la détection en fluorescence. Le marquage pré-colonne est le plus
souvent utilisé car il présente l’avantage de faciliter la séparation chromatographique en
phase inverse. En effet les acides aminés marqués deviennent plus hydrophobes de part
l’augmentation du rapport carbone/hétéroatome, ils sont donc plus retenus sur la phase
stationnaire.
Le Tableau 2 regroupe les différents marqueurs synthétisés pour dériver les acides
aminés en pré-colonne, leurs conditions de marquage et leurs longueurs d’onde
d’excitation (λexc) et d’émission (λém). Parmi ces agents de marquage, le
fluorenylméthylchloroformate (Fmoc-Cl), le chlorure d’acridone (ARC-Cl), le chlorure de
carbazole-9-acétyle (CRA-Cl) et le chlorure de carbazole-9-propionyle (CRP-Cl) sont
nativement fluorescents, il est nécessaire d’ajouter après la dérivation un composé qui
réagira avec le marqueur en excès. Ces molécules avec le 4-fluoro-7- nitrobenzofurazane
62
(NBD-F) sont réactives avec les amines primaires et secondaires. A l’inverse le 3-(2-
furoyl)quinoline-2-carboxaldehyde (FQ), l’orthophthaldialdéhyde (OPA) et le naphtalène-
2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) ne sont pas fluorescents naturellement mais le deviennent en
présence d’un nucléophile et d’une amine : ce sont des agents dits fluorogènes.
Tableau 2 : Récapitulatif des marqueurs d’acides aminés avec leurs conditions de marquage et de détection
Nom (abréviation) Formule développée
d’un acide aminé marqué
Conditions de réaction
λexc (nm)
λém (nm) Réf
4-Fluoro-7-nitrobenzofurazane
(NBD-F)
NO
N
HN
R
COOH
NO2
pH = 8 ; 60°C ; 1 min
470 530
(Yoshihiko W. and
Kazuhiro I., 1982)
Chlorure d’acridone-chloride (ARC-Cl) N
O
O
NH
R
COOH
pH = 8,5 ; TA ; 1 min 404 430
(Fan X. et al., 1998)
Chlorure de carbazole-9-acetyle (CRA-Cl)
N
O
NHCOOH
R
pH = 8,5 ; TA ; 2 min
335 360 (Fan X. et al., 1998)
Chlorure de carbazole-9-propionyle (
CRP-Cl) NNH
COOHO
R
pH = 8,5 ; TA ; 2 min
340 365 (Fan X. et al., 1998)
Fluorenylméthylchlorofo
rmate (FMOC) O
NHCOOH
OR
pH = 8,5 ; TA ;
3 min 263 313
(Bauza T. et
al., 1995)
3-(2-furoyl)quinoline-2-carboxaldéhyde (FQ)
O
N
N
CN
COOH
R
pH = 9,3 ;
24°C ; 3 min 488 LIF
(Veledo M.T.
et al., 2005)
Orthophthaldialdéhyde (OPA)
N
SR'
COOH
R
pH = 10,5 ;
TA ; 1,5 min 350 495
(Devall A.J.
et al., 2007)
Naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde
(NDA)
N
CN
COOH
R
pH = 8,7 ; TA ;
15 min 442 480
(Siri N. et al.,
2006)
TA : Température ambiante
63
Dans la période 1992-1998, le marquage à l’OPA représentait 30 % des méthodes
utilisées pour analyser les acides aminés en HPLC (Molnar-Perl I., 1998), c’est aujourd’hui
la méthode de marquage la plus utilisée pour l’étude d’amine primaire. Cette molécule est
activée par un nucléophile, contenant un groupement SH. Les plus utilisés sont le 3-
mercapto-1-propanol, le β-mercaptoethanol, l’acide 3-mercaptopropionique et la N-acetyl-
L-cystéine (Molnar-Perl I., 2001). Le système OPA/R’SH ne réagit qu’en présence d’amines
primaires pour donner un composé isoindole fluorescent (Figure 26).
O
H
O
HH2N R N
SR'
RR'SH
++ 2 H2O
OPA Dérivé isoindole
Figure 26 : Réaction de marquage d'une amine primaire avec le système OPA/R'SH
Différents mécanismes de marquage ont été proposés pour obtenir ce dérivé
fluorescent et sont répertoriés dans une revue de P. Zuman (Zuman P., 2004). Cependant,
ce marquage présente plusieurs inconvénients :
� L’OPA est une molécule réactive avec de nombreux nucléophiles tels que les ions
hydroxydes, l’eau, les alcools, les amines et les thiols (Zuman P., 2004).
� Les dérivés isoindoles sont peu stables, les isoindoles formés peuvent réagir avec
H2O et s’oxyder en présence d’air (Stobaugh J.F. et al., 1984).
� L’OPA ne marque pas les petits peptides, son application est limitée aux petites
amines et aux acides aminés (Matuszewski B.K. et al., 1987).
La stabilité des dérivés isoindoles dépend des conditions de marquage, d’élution et de
conservation des produits (Molnar-Perl I., 2001).
Pour pallier les inconvénients de l’OPA, Carlson et ses collaborateurs ont synthétisé un
dérivé de ce marqueur (Carlson R.G. et al., 1986); le naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde
(NDA). Cette molécule contient un cycle benzénique de plus que l’OPA. Elle réagit sur les
amines primaires avec un nucléophile, le plus souvent le β-mercaptoethanol (β-Me) ou l’ion
cyanure (CN-) pour donner un dérivé benzisoindole fluorescent (Figure 27) (Oates M.D. and
Jorgenson J.W., 1989).
64
NDA Dérivé benzisoindole
O
H
O
HH2N R N
CN
RCN-
++ 2 H2O
Figure 27 : Réaction de marquage d'une amine avec le système NDA/CN-
Ces dérivés possèdent des intensités de fluorescence supérieures aux dérivés isoindoles
(Matuszewski B.K. et al., 1987) : les limites de détections avec le NDA peuvent être dix fois
supérieures à celles obtenues avec l’OPA (Roach M.C. and Harmony M.D., 1987). Manica et
ses collaborateurs ont démontré que le marquage avec l’ion cyanure permet d’obtenir des
composés fluorescents plus stable que le marquage avec le β-Me (Manica D.P. et al., 2003).
En effet, les dérivés cyano-benzisoindoles ne se dégradent pas au cours du temps alors que
les dérivés β-Me-benzisoindoles peuvent réagir avec les molécules du solvant. De plus ce
marquage est réalisable à très basse concentration en amines avec une bonne linéarité ;
Robert et ses collaborateurs ont ainsi pu marquer la dopamine et la noradrénaline à 10-9
mol/L et contrôler au cours du temps ces molécules dans des échantillons cérébraux à très
basses concentrations (Robert F. et al., 1995). Enfin le marquage au NDA présente
l’avantage de dériver les peptides en plus des acides aminés (Rammouz G. et al., 2007).
C’est la raison pour laquelle nous avons choisi de marquer les acides aminés avec le
système NDA/CN-.
65
B. Etude du marquage des acides aminés avec le système NDA/CN-.
Le marquage des acides aminés avec le système NDA/CN- est d’abord étudié en
spectrométrie UV et en fluorimétrie afin d’optimiser les conditions de marquage et de
détection.
Tous les acides aminés naturels, excepté la proline qui possède une amine
secondaire, ont fait l’objet de cette étude ainsi que l’acide 4-aminobutyrique (GABA), la
dopamine (Dop) et la noradrénaline (Nor).
I. Etude spectroscopique du NDA et des dérivés benzisoindoles
Afin de déterminer les longueurs d’onde d’excitation et d’émission optimale pour la
détection de fluorescence, nous avons dans un premier temps étudié les propriétés
d’absorbance du NDA non marqué et des acides aminés marqués avec le système NDA/CN-.
Le spectre d’absorption du NDA présente deux maxima à λ = 294 ± 2 nm et λ = 350 ± 2 nm.
Ces maxima correspondent aux transitions n → π* des fonctions aldéhydes et π → π* des
cycles conjugués (Figure 28).
Figure 28 : Spectre d'absorbance du naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) Par comparaison avec le spectre UV du NDA, les spectres d’absorption des dérivés
benzisoindoles des acides aminés excepté la lysine (Lys), du GABA, de la Nor et de la Dop
présentent deux maxima à λ = 420 ± 2 nm et λ = 442 ± 2 nm et un épaulement à λ = 400 ± 2
nm. Ces longueurs d’onde correspondent aux transitions π → π* du cycle benzisoindole
(Figure 29).
Abs
orba
nce
Longueur d’onde (nm)
66
Figure 29 : Spectres d'absorbance (à gauche) et de fluorescence (à droite) de la glycine marquée avec NDA/CN-
Le spectre de fluorescence de la glycine marquée avec NDA/CN- présente deux
longueurs d’onde d’émission maximales à λ = 455 ± 2 nm et λ = 480 ± 2 nm aux longueurs
d’onde d’excitation de 420 nm et 442 nm. L’intensité de fluorescence est légèrement
supérieure pour une excitation à 420 nm.
Notons que la lysine (Lys) présente une absorption maximale à λ = 434 ± 2 nm et λ =
462 ± 2 nm. La lysine possède deux fonctions amines primaires, deux molécules de NDA
peuvent réagir avec ces fonctions. En effet le pKa de l’amine sur la chaîne latérale de la
Lys est proche du pKa l’amine terminale (Weast R.C. et al., 1989). Au contraire, le pKa de
la fonction guanidine de l’arginine (Arg) est de 12,5 ; le marquage est dans ce cas plus
difficile.
Des études QSRR ont été réalisées dans le chapitre 4 pour confirmer les résultats sur le
marquage de l’arginine.
II. Cinétique de marquage des dérivés benzisoindoles
Ces études cinétiques permettent à la fois d’évaluer le temps nécessaire pour que
le marquage soit achevé et de déterminer si le dérivé reste stable une fois marqué. La
Figure 30 représente l’absorbance à λabs = 442 nm des dérivés benzisoindoles de l’acide
aspartique (Asp), la glycine (Gly), l’arginine (Arg) et de la dopamine (Dop) en fonction du
temps.
Abs
orba
nce
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
Longueur d’onde (nm) Longueur d’onde (nm)
λexc = 442 nm λexc = 420 nm
67
Figure 30 : Cinétique de formation des dérivés benzisoindoles
La hauteur de ces plateaux, correspondant à l’absorbance maximale des dérivés,
varie selon l’acide aminé marqué. Les temps nécessaires pour atteindre ces plateaux
diffèrent aussi pour chaque amine. Par exemple, cinq minutes de réaction sont nécessaires
pour marquer la glycine ou la dopamine alors que pour les autres acides aminés vingt
minutes au minimum sont requises pour obtenir une absorbance maximale. Les composés
restent stable environ une demi-heure à l’absorbance maximale. Nous avons choisi un
temps de réaction de 15 minutes pour la suite des analyses. Ce temps correspond à la
durée moyenne du marquage.
Le détecteur LIF disponible au laboratoire possède un laser He-Cd émettant à 442
nm. Le système de marquage NDA/CN- est donc compatible avec notre appareillage. Afin
d’être homogène entre le détecteur de fluorescence multilongueur d’onde et le détecteur
LIF, les molécules seront excitées à la longueur d’onde de 442 nm pour la suite de ces
travaux. Les acides aminés marqués seront injectés en HPLC après 15 minutes de réaction
et la longueur d’onde d’émission sera sélectionnée à λém = 480 nm.
Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Siri N. et al., 2006).
Temps (min)
Abs
orba
nce
0 20 40 60
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Asp
Gly Arg Dop
Blanc
68
C. Mise au point chromatographique
I. Séparation des acides aminés et des amines biogènes
1) Grandeurs caractéristiques
Une bonne séparation chromatographique en phase liquide nécessite :
- que les différents composés soient retenus sur la phase stationnaire,
- une résolution convenable,
- une durée d’analyse courte,
- une limite de quantification compatible avec les concentrations des
échantillons biologiques.
La séparation des acides aminés marqués et des amines biogènes sur différentes colonnes a
été évaluée à partir de deux grandeurs caractéristiques : l’efficacité de la colonne et la
résolution des pics chromatographiés.
a) efficacité d’une colonne
L’efficacité d’une colonne, dont dépend la largeur des pics, est caractérisée par
son nombre de plateaux théoriques N. Si le pic chromatographique obtenu est gaussien, N
est exprimé, pour un soluté donné, par la relation suivante :
N = 16(tr/ω)² = 5,54 (tr/δ)²
Avec ω largeur du pic à la base
δ largeur du pic à mi-hauteur
tr temps de rétention du soluté
Une colonne est d’autant plus efficace que N est élevé.
Afin de comparer des colonnes entres elles selon leurs longueurs, on définit la
hauteur équivalente de plateau théorique (HEPT ou H). Ce paramètre est exprimé par la
relation :
H = L/N
Avec L longueur de la colonne
Une colonne avec une petite HEPT est plus efficace qu’une colonne avec un HEPT
supérieure.
Cependant, ces valeurs ne sont valables qu’en élution isocratique. Lorsque les
composés sont chromatographiés avec un gradient d’élution, l’efficacité d’une colonne est
69
déterminée à partir de la capacité de pic np (Grushka E., 1970). Ce paramètre est calculé
en fonction de la durée du gradient tg et la largeur des pics à la base ω, suivant la
relation :
np = 1 + tg/ω
Plus la valeur de np est élevée meilleure est l’efficacité de la colonne.
b) résolution
La résolution RS entre deux pics est définie par la relation :
Rs = 2(tr2-tr1)/( ω2 + ω1)
Avec ω largeur des pics à la base
Ce paramètre permet de quantifier la qualité de la séparation. En effet si Rs < 0,8, les pics
ne sont pas suffisamment séparés, une séparation acceptable pour deux pics nécessite un
Rs compris entre 1 et 1,5. Si 1,4 < Rs < 1,6 la séparation est optimale par rapport au temps
d’analyse. Dans le cas où Rs > 1,6 la durée de l’analyse peut être réduite.
2) Choix de l’éluant
De nombreux protocoles de séparation des dérivés benzisoindoles sont décrits dans
la littérature (Roach M.C. and Harmony M.D., 1987; Shah A.J. et al., 1999). Ces molécules
sont souvent séparées avec un gradient constitué de solutions tampon afin d’obtenir des
temps de rétention reproductibles. Cependant le couplage à la spectrométrie de masse ne
permet pas l’utilisation de ces solutions. En effet les sels constituant le tampon
pollueraient la source electrospray et entraîneraient une perte de sensibilité considérable.
Nous avons déterminé des conditions éluantes compatibles avec l’ionisation electrospray
en se souciant de la répétabilité de la séparation. Notre choix s’est porté sur un gradient
constitué d’H20 acidifiée et d’acétonitrile, la solution acidifiée favorisant le mode positif
en electrospray et maintenant la fonction acide des molécules sous sa forme neutre (Figure
31).
N
CN
COO-
R
N
CN
COOH
RH+
Figure 31 : Equilibre des dérivés benzisoindoles en milieu acide
70
3) Essai de séparation
Le mélange, constitué de 17 acides aminés (sauf Cys, Lys et Pro) et de 3 amines
biogènes (Dop, Nor et GABA) à une concentration de 10-6 mol/L, est séparé sur une colonne
X-Terra RP18 (4.6x250 mm, 5 µm) en 34 minutes (Figure 32).
Figure 32 : Séparation chromatographique d'un mélange de dérivés benzoisoindoles à 10-6 mol/L sur une colonne RP18 X-Terra 5µm 4,6 x 250 mm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj =10 µL, D= 1mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 60 % A ; t12 = 60 % A ; t40 = 30 % A. Détecteur de fluorescence JASCO FP 1520 λexc = 442 nm et λém = 480 nm.
Chaque dérivé est identifié par la méthode des ajouts et le mélange et injecté trois
fois afin de déterminer la variation des temps de rétention (Tableau 3). La qualité de la
séparation est estimée pour chaque composé par leurs résolutions (Rs) et leurs capacités
de pics (np).
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(mV
)
Temps (min)
1
2 3
4
5 6 7
8 9 10
11
12
13
14
16 15
17
18
19
71
Tableau 3 : Résultats HPLC des dérivés benzisoindoles d'un mélange d'amines
Acides Amines tr (min) CV % sur tr np Rs*
1 His 3,95 0,54 44 2 Arg 5,25 0,75 34 1,2 3 Gln/Asn 6,90 0,47 24 1,1 4 Ser 10,38 0,20 35 2,4 5 Asp 11,18 0,15 60 0,9 6 Glu 11,99 0,14 24 0,7 7 Thr 14,15 0,42 21 1,1 8 Gly 16,35 0,70 35 1,4 9 Nor 17,06 0,56 32 0,6 10 Ala/GABA 20,53 0,22 32 2,7 11 Tyr 21,74 0,19 29 0,9 12 --- 23,06 0,16 44 1,1 13 Dop 26,03 0,02 32 2,7 14 Met 27,55 0,07 29 1,1 15 Val 29,42 0,08 76 1,9 16 Try 29,71 0,08 95 0,6 17 Phe 30,22 0,05 40 0,7 18 Leu 32,44 0,04 57 2,6 19 Ile 32,96 0,54 40 0,6
Moy 0,28 41 1,4 * Rs à la ligne n correspond à la résolution entre le nème pic et le (n-1)ème pic. 18 molécules sur les 20 injectées ont pu être séparées sur cette colonne avec une
bonne répétabilité sur les temps de rétention ; le coefficient de variation moyen est de
0,28% et une capacité de pics de l’ordre de 41. Cependant certains composés ne sont pas
séparés (Gln/Asn ; Ala/GABA) ou pas assez résolus (Rs < 0,8) : c’est notamment le cas pour
l’acide aspartique (Asp) avec l’acide glutamique (Glu). De plus, la durée d’analyse est
longue (supérieure à la demi-heure).
En conclusion, l’utilisation de l’éluant binaire H2O acidifiée / AcN permet d’obtenir
des chromatogrammes répétables au niveau des temps de rétention. La séparation
chromatographique nécessite toutefois une optimisation au niveau de la durée de l’analyse
et de la résolution des pics.
72
II. Optimisation de la séparation chromatographique
1) Séparation sur différentes colonnes
Afin d’améliorer la qualité de la séparation, nous avons testé trois colonnes avec
différentes phases stationnaires :
- une X-Terra RP18 (2,1x150 mm, 3,5 µm)
- une monolithe RP18e β-test (3 x 100 mm)
- une X-Bridge Shield RP18 (2.1 x 100 mm, 3.5 µm)
Le mélange de 20 amines marquées à 10-6 mol/L a été injecté sur chacune de ces
colonnes afin de déterminer la colonne optimale pour la suite des analyses. Chaque
séparation est discutée dans un premier temps selon leur résolution et la durée de
l’analyse. Dans un second temps les trois colonnes ont été comparées pour ce type
d’analyse en fonction de leur capacité de pic np et de leur compatibilité avec la
spectrométrie de masse au niveau du débit d’élution.
a) Séparation sur colonne X-Terra RP18 (2,1x150 mm, 3,5 µm)
La colonne X-Terra, développée par la société Waters possède le même type de
silice que celle utilisée dans le paragraphe précédent. Seul sa granulométrie et sa taille
ont été modifiées. Ces colonnes ne possèdent pas des particules de silice classiques ; les
fonctions silanols habituelles ont été remplacées par des groupements méthyles afin
d’élargir la gamme de pH de l’élution et d’homogénéiser la surface de recouvrement de la
phase stationnaire (Figure 33). Ce sont des colonnes dites hybrides. De plus sur ces
particules de silice sont greffées des chaînes C18 par l’intermédiaire d’un groupement
polaire favorisant l’élution de composés légèrement polaires (Waters Corp., 2007).
Groupement polaire
Chaîne alkyle C18
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
OO
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
OSi
O
OO O O O O O
O O O O O O O O
CH3 O CH3 OH O OH CH3 O
Si Si Si
Figure 33 : Phase stationnaire des colonnes X-Terra RP 18
73
Nous avons d’abord étudié la séparation du mélange des 20 dérivés à 10-6mol/L sur
cette colonne qui présente les mêmes caractéristiques que la colonne précédente. La
principale différence est sa granulométrie plus fine qui améliore l’efficacité d’une
séparation et permet d’écourter les temps d’analyse. Le chromatogramme obtenu avec
une optimisation des conditions éluantes est représenté sur la Figure 34.
Figure 34 : Séparation des 20 dérivés benzisoindoles à 10-6 mol/L sur la colonne X-Terra RP18 2,1x150 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 64 % A ; t9 = 64 % A ; t30 = 30 % A. Détecteur de fluorescence Waters 2475 λexc = 442 nm et λém = 480 nm.
Temps (min)
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(EU
)
74
Les résultats obtenus à partir de cette séparation sont décrits dans le tableau suivant :
Tableau 4 : Résultats obtenus sur la colonne X-Terra RP18 (2,1x150 mm, 3,5 µm) dans les conditions décrites dans la Figure 34.
Acides Amines Tr (min) CV % n p Rs*
1 His 1,70 0,65 48
2 Arg 2,05 1,63 53 0,6
3 Asn 3,49 0,43 60 2,7
4 Gln 3,75 0,51 44 0,4 5 Ser 5,19 0,43 46 2,1
6 Asp 5,68 0,46 39 0,7
7 Glu 6,72 0,60 38 1,3
8 Thr 7,50 0,53 33 0,9
9 Gly 8,60 0,51 28 1,1
10 -- 11,18 0,77 25 2,2 11 Nor 12,61 0,57 25 1,1
12 Ala/GABA 14,04 0,61 35 1,3
13 --- 14,77 0,50 51 1,0
14 Tyr 15,34 0,50 43 0,9
15 Dop 17,43 0,44 24 2,0
16 Met 19,05 0,32 33 1,4 17 Val 20,30 0,28 45 1,5
18 Try/Phe 21,26 0,23 43 1,4
19 Ile/Leu 22,75 0,20 28 1,6
Moy 0,54 38 1,3 * Rs à la ligne n correspond à la résolution entre le nème pic et le (n-1)ème pic.
17 dérivés benzisoindoles sur 20 injectés ont été séparés sur cette colonne en 23
minutes. La durée d’analyse a été écourtée de 10 minutes au détriment de la résolution
qui est le plus souvent inférieure à 1 et de la séparation (Try et Phe ne sont plus séparées).
b) Essai sur la colonne monolithe RP18e β-test (3 x 100 mm)
Les colonnes monolithes, élaborées par la société Merck, ne sont pas composées de
particules de silice mais de gel de silice polymérisé en un bloc. Le polymère formé est
alors constitué de deux types de pores (Figure 35) :
- les macropores (environ 2 µm de diamètre) qui réduisent la pression dans la
colonne et permettent de travailler à des débits plus élevés afin de diminuer la
durée d’analyse.
- les mésopores (environ 13 nm de diamètre) qui forment une structure avec
une surface active plus large, augmentent l’affinité de l’analyte pour la phase
stationnaire et donc améliorent la qualité de séparation (Merck KGaA,
2006/2007).
75
Figure 35 : Coupe microscopique (MET) d'un bloc de gel de silice
Ces colonnes permettent de travailler à haut débit et à basse pression : les durées
d’analyse sont écourtées et la résolution est augmentée (Dawson L.A. et al., 2004).
Sur cette colonne, 19 dérivés sur 20 ont été séparés en 15 minutes (Figure 36). Le
temps d’analyse est plus court qu’avec les deux colonnes précédentes.
Figure 36 : Chromatogramme des 20 dérivés benzisoindoles à 10-6 mol/L séparés sur la colonne monolithe RP18e β-test 3x100 mm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 1 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 70 % A ; t4,5 = 70 % A ; t15 = 50 % A. Détecteur de fluorescence JASCO FP 1520 λexc = 442 nm et λém = 480 nm. Cependant l’alanine migre toujours au même temps que le GABA et la résolution
moyenne reste inférieure à 1,4 (Tableau 5).
Temps (min)
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(mV
)
Mésopores 13 nm Macropores 2 µm
76
Tableau 5 : Résultats de la séparation obtenue avec la colonne monolithe RP18e β-test (3 x 100 mm)
Acides aminés tr (min) CV% n p Rs*
1 His 1,321 0,50 27 2 Arg 1,992 0,71 33 1,3 3 Asn 2,356 0,91 65 1,0 4 Gln 2,504 0,68 29 0,4 5 Ser 3,569 0,73 20 1,6 6 Asp 3,911 0,78 49 0,6 7 Glu 4,471 0,84 20 1,0 8 Thr 5,635 0,89 15 1,3 9 Gly 6,475 0,94 19 0,9 10 Nor 7,195 0,65 21 0,9 11 --- 7,844 0,54 34 1,1 12 Tyr 8,085 0,49 44 0,7 13 Ala-GABA 8,682 0,42 16 0,9 14 Met 11,138 0,13 18 2,7 15 Dop 12,258 0,07 24 1,5 16 Val 12,487 0,23 63 0,4 17 Try 12,815 0,04 26 0,8 18 Phe 13,689 0,09 18 1,2 19 Ile 14,675 0,06 25 1,3 20 Leu 14,872 0,06 22 0,3
Moy 0,49 30 1,0 * Rs à la ligne n correspond à la résolution entre le nème pic et le (n-1)ème pic.
c) Séparation sur la colonne X-BridgeTM Shield RP18 (2,1 x 100 mm,
3.5 µm)
La colonne X-Bridge, développée en 2005 par la société Waters, est équipée de la
technologie BEH (Figure 37); les fonctions silanols sont reliées entre elles par des ponts
éthyliques (CH2-CH2), les chaînes C18 sont greffées sur les particules de silices par
l’intermédiaire d’un groupement polaire comme pour la X-Terra. Ces colonnes ont la
propriété d’être très résistantes aux pH extrêmes et de fournir de meilleures
reproductibilités (Wyndham K.D. et al., 2003).
77
Figure 37 : Schéma de la technologie BEH (Waters Corp., 2007)
Les 20 dérivés benzisoindoles sont séparés en 19 min (Figure 38). Cependant la Tyr
migre à un temps de rétention très proche du GABA ; son pic chromatographique est
confondu avec le pied du pic correspondant au GABA.
Figure 38 : Séparation des 20 dérivés benzisoindoles à 10-6 mol/L sur colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 70 % A ; t20 = 30 % A. Détecteur LIF Picométrics Hd-Cd λexc = 442 nm.
Le temps d’analyse est légèrement supérieur à celui obtenu avec la colonne
monolithe au profit de la résolution qui est supérieure (Tableau 6), notamment entre l’Asp
et le Glu.
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(RF
U)
Temps (min)
78
Tableau 6 : Résultats chromatographiques obtenus avec la colonne X-Bridge Shield RP18 (2.1 x 100 mm, 3.5 µm) dans les conditions décrites dans la Figure 38
Acides Amines tr (min) CV % n p Rs*
1 His 1,31 0,13 91 2 Arg 1,69 0,32 77 1,7 3 Asn 4,63 0,63 61 10,6 4 Gln 5,02 0,47 56 1,2 5 Ser 6,75 0,49 47 4,7 6 Asp 7,29 0,53 53 1,4 7 Glu 7,94 0,34 64 2,0 8 Thr 8,81 0,31 60 2,8 9 --- 9,12 1,07 65 1,0 10 Gly 9,50 0,39 45 1,1 11 Nor 10,23 0,16 48 1,8 12 Ala 11,49 0,29 48 3,2 13 GABA 11,81 0,13 38 0,7 14 Tyr 12,29 0,11 31 0,8 15 --- 12,92 0,25 63 1,4 16 Dop 14,56 1,77 46 4,6 17 Met 15,38 0,28 48 2,0 18 Val 16,42 0,23 46 2,6 19 Try 16,65 0,26 43 0,5 20 Phe 17,29 0,26 56 1,6 21 Ile 18,54 0,22 40 3,1 22 Leu 18,63 0,24 41 0,2
Moy 0,40 53 2,3 * Rs à la ligne n correspond à la résolution entre le nème pic et le (n-1)ème pic.
2) Comparaison et choix de colonne
Les résultats obtenus avec chaque colonne ont été comparés afin de déterminer la
colonne optimale pour la séparation chromatographique des acides aminés dérivés avec le
système NDA/CN-.
Colonne : XTerra 5 µm XTerra 3,5 µm Monolithe XBridge 3,5 µm
Débit mL/min 1 0,3 1 0,3
Durée d’analyse 33 25 15 19
np moyen 41 38 30 53
Rs moyenne 1,4 1,3 1,0 2,3
D’après le tableau ci-dessus, la colonne X-Bridge est la colonne la plus efficace pour
cette séparation chromatographique, np = 53 avec une résolution moyenne de 2,3. De plus,
la durée d’analyse est relativement courte (19 min) et son débit 0,3 mL/min est
compatible avec l’interface ESI en spectrométrie de masse.
79
III. Etude en spectrométrie de masse
1) Etude en mode positif
Les acides aminés marqués sont injectés en spectrométrie de masse en mode
positif. Nous avons d’abord opté pour ce mode car l’éluant utilisé est acidifié ; la
formation de cations de type (M+H+) est favorisée.
Le chromatogramme du courant ionique total (TIC) versus le temps de rétention est
présenté ci-dessous :
Figure 39 : Séparation des dérivés benzisoindoles à 10-5 mol/L sur colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 70 % A ; t20 = 30 % A. Détection spectrométrie de masse mode ESI+. Les premiers pics correspondent aux sels de la solution tampon utilisés lors du
marquage des amines primaires. Chaque dérivé benzisoindole a été identifié avec la
sélection d’ion (Tableau 2). Seul, la Leu et l’Ile marquée n’ont pu être séparées car ces
molécules sont des isomères, elles présentent la même masse molaire et la résolution
chromatographique n’est pas suffisante en spectrométrie de masse pour les différencier.
L’ordre d’élution est identique à celui déterminé en fluorescence. Chaque dérivé
benzisoindole est représenté par son ion parent (M+H)+ et son adduit (M+Na)+ (Figure 40).
Figure 40 : Spectre de masse ESI+ de la dopamine marquée avec NDA/CN-
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
Temps (min)
Rapport m/z
Abo
ndaa
nce
rela
tive
%
100
50
0 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
80
Les intensités relatives, soit le nombre de coups par scan détectés par l’analyseur
TOF, de chaque dérivé sont indiquées dans le tableau ci-dessous avec l’aire de chaque pic
chromatographique et le rapport m/z de l’ion (M+H)+ correspondant.
Tableau 7 : Résultats des dérivés benzisoindoles à 10-5 mol/L en spectrométrie de masse en ESI+ chromatographiés dans les conditions de la Figure 39.
Acides aminés
m/z théo Tr (min) CV%
sur tr Aire CV % sur Aire
m/z exp
CV% sur m/z
Intensité relative*
CV % sur IR
1 His 331,12 1,40 0,73 27,63 6,78 331,08 0,001 210 10
2 Arg 350,16 1,76 0,56 27,78 8,11 350,12 0,002 210 9
3 Asn 308,10 4,66 0,03 20,86 6,31 308,06 0,002 178 9
4 Gln 322,12 5,04 0,22 44,16 7,02 322,08 0,001 358 9
5 Ser 281,09 6,80 0,14 14,34 4,41 281,06 0,001 115 3
6 Asp 309,09 7,14 0,10 1,24 23,40 309,04 0,001 16 31
7 Glu 323,10 7,86 0,25 6,68 1,39 323,07 0,003 57 10
8 Thr 295,11 8,86 0,12 10,50 4,32 295,07 0,001 93 4
9 Gly 251,08 9,56 0,13 12,96 3,05 251,05 0,001 124 7
10 Nor 345,12 10,21 0,04 55,22 13,20 345,09 0,001 428 7
11 Ala 265,10 11,53 0,10 19,78 6,39 265,07 0,001 170 4
12 Gaba 279,11 11,80 0,14 43,03 2,57 279,08 0,001 361 2
13 Tyr 357,12 12,09 0,13 4,81 16,08 357,08 0,002 42 12
14 Dop 329,13 14,69 0,09 51,37 7,27 329,09 0,001 423 8
15 Met 325,10 15,43 0,08 27,78 0,56 325,06 0,000 244 12
16 Val 293,13 16,47 0,08 10,53 4,27 293,09 0,001 85 3
17 Try 380,14 16,72 0,06 52,76 5,24 380,10 0,001 238 10
18 Phe 341,13 17,36 0,08 23,84 3,92 341,09 0,002 183 10
19 Ile/Leu 307,14 18,69 0,59 47,20 1,50 307,10 0,000 403 5
Moy 0,15 26,45 6,62 207 9 * L’intensité relative est calculée à partir du nombre de coups par scan obtenu en intégrant le pic à la masse m/z.
Ces molécules en mode positif sont difficilement ionisables ; l’intensité relative
moyenne est de 207 coups par acquisition pour une concentration en acides aminés de 10-5
mol/L. De part leur fonction acide carboxylique, ces molécules devraient avoir tendance à
donner majoritairement des anions de type (M-H)-.
2) Etude en mode négatif
Kebarle et Tang ont rappelé dans un article, que le flux d’ions produits dans le
spray doit être compensé par un courant d’ions de signe opposé au niveau du capillaire
81
métallique afin de garantir la fermeture de la boucle du circuit électrique (Kebarle P. and
Tang L., 1993).
Utiliser un solvant acide en mode négatif ne perturbe pas forcément la sensibilité
des ions négatifs. Les ions H3O+ du solvant sont attirés vers le champ électrique imposé
dans la source favorisant la formation des gouttelettes chargées négativement dans le
spray. De plus le pH de la solution acidifiée avec l’acide formique (pH = 3) est proche du
pKa de l’acide (pKa = 3,75), l’éluant possède donc des ions formiates (HCOO-) favorisant la
formation des anions (M-H)-.
Le chromatogramme dans ce cas est le suivant :
Figure 41 : Séparation des dérivés benzisoindoles à 10-5 mol/L sur colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 70 % A ; t20 = 30 % A. Détection spectrométrie de masse mode ESI-. Sur les spectres de masse obtenus pour chaque dérivé d’acide aminé, le pic parent
(M-H)- est accompagné de son dimère (2M-H)-, d’un adduit potassique (M+K-2H)- et d’un
fragment spécifique correspondant au cycle benzisoindole à m/z = 191,05 (Figure 42).
Figure 42 : Spectre de masse en mode négatif de la dopamine marquée avec NDA/CN-
Les résultats obtenus pour chaque acide aminé marqué démontrent que pour
l’étude des dérivés benzisoindoles, le mode négatif est plus sensible que le mode positif
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
Temps (min)
Rapport m/z
Abo
ndan
ce
rela
tive
%
100
50
0 200 400 600 800
82
(Tableau 8). En effet, l’intensité relative moyenne est de l’ordre de 1000 coups par scan
en ESI- contre 200 en ESI+.
Tableau 8 : Résultats en mode négatif des dérivés benzisoindoles obtenus dans les conditions de la Figure 41
Acides aminés
m/z théo Tr (min) CV%
sur tr Aire CV % sur Aire m/z CV%
sur m/z Intensité relative
CV % sur IR
1 His 329,10 1,42 0,00 91,89 18,43 329,08 0,001 685 19
2 Arg 348,14 1,76 0,03 75,87 9,37 348,12 0,001 621 10
3 Asn 306,08 4,64 0,18 21,22 20,58 306,07 0,001 185 27
4 Gln 320,10 5,01 0,54 48,92 24,52 320,09 0,000 435 24
5 Ser 279,07 6,77 0,38 27,04 22,16 279,06 0,001 254 26
6 Asp 307,06 7,12 0,22 2,33 44,17 307,06 0,003 34 34
7 Glu 321,08 7,80 0,32 9,95 25,39 321,07 0,001 91 25
8 Thr 293,08 8,80 0,20 30,70 32,04 293,08 0,000 295 33
9 Gly 249,06 9,50 0,11 40,51 10,70 249,06 0,001 388 15
10 Nor 343,10 10,16 0,16 500,16 5,20 343,09 0,000 4077 6
11 Ala 263,08 11,48 0,14 92,54 22,07 263,08 0,001 855 21
12 Gaba 277,09 11,74 0,13 147,26 3,92 277,09 0,001 1237 0,5
13 Tyr 355,10 12,02 0,22 10,43 38,15 355,10 0,001 102 38
14 Dop 327,11 14,66 0,11 685,49 3,97 327,11 0,000 5603 3
15 Met 323,08 15,39 0,07 106,68 20,58 323,07 0,001 1680 11
16 Val 291,11 16,45 0,03 52,11 28,43 291,10 0,000 466 28
17 Try 378,12 16,66 0,04 57,73 23,89 378,11 0,000 478 21
18 Phe 339,11 17,39 0,11 63,56 22,74 339,10 0,000 558 26
19 Ile/Leu 305,12 18,60 0,05 206,21 24,93 305,12 0,000 1780 26
Moy 0,16 119,51 21,12 1043 21
Le mode négatif sera donc préféré au mode positif pour l’analyse de ces molécules
marquées avec NDA/CN- avec ces conditions d’élution.
IV. Automatisation du marquage dans la boucle d’injection
Shah et ses collaborateurs ont développé un protocole de marquage automatisé
pour l’analyse d’acides aminés en HPLC. L’automatisation du marquage permet d’obtenir
une méthode d’analyse plus robuste et reproductible (Shah A.J. et al., 1999). Dans ces
travaux le marquage est réalisé dans un flacon et le mélange est injecté vers la colonne.
Ne disposant pas d’un injecteur automatique capable de faire le mélange dans
un autre flacon, nous avons réalisé le marquage directement dans la boucle d’injection.
83
Pour se faire, des solutions de NDA, de CN- et d’un mélange d’acide aminé ont été
préalablement préparées dans des flacons séparés. Le rapport NDA/CN- ainsi que le temps
d’incubation ont été optimisés pour obtenir les meilleures conditions de marquage.
1) Optimisation du rapport NDA/CN-
Le rapport NDA/CN- est un paramètre important lors du marquage des amines
primaires ; ces molécules n’ont pas toute la même réactivité vis-à-vis de ce rapport. Afin
d’obtenir les meilleures conditions de marquage pour chacune des molécules, l’étude du
rapport NDA/CN- est réalisée sur plusieurs amines localisées à différents temps du
gradient.
L’Arg et le Glu, le GABA et la Phe éluées respectivement en début, milieu et fin de
gradient ont été marqués avec du cyanure de concentration variable et du NDA de
concentration fixe. L’aire de chaque pic chromatographique en fonction du rapport
NDA/CN- est représentée dans la Figure 43.
Figure 43 : Etude de l'aire des pics chromatographiques de plusieurs acides aminés marqués à 10-6 mol/L en fonction du rapport NDA/CN-. Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj = 3 µL de KCN/Tampon pH = 8,7 + 3 µL de Mélange d’acide aminés à 10-6 mol/L + 4µL de NDA, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 70 % A ; t20 = 30 % A. Détecteur de fluorescence Waters 2475 λexc = 442 nm et λém = 480 nm.
Lorsque le NDA est en excès par rapport à l’ion CN-, les dérivés benzisoindoles sont
moins fluorescents. Des travaux sur la stabilité du rapport OPA/RSH ont démontré qu’un
excès d’agent fluorogène accélérait la décomposition des dérivés fluorescents (Molnar-Perl
I., 2001). Le NDA présente un comportement similaire avec l’ion nucléophile CN-.
Un pic non identifié à tr = 13,38 min apparaît quand le marquage a lieu dans la
boucle d’injection. L’aire de ce pic est aussi étudiée car selon le rapport NDA/CN-, le
chromatogramme est fortement perturbé (Figure 44).
Aire
Rapport NDA/CN -
x 107 3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0 1/10 1/5 1/2 1/1 2/1 5/1 10/1
Arg Glu Phe GABA
84
Figure 44 : Aire de l'impureté à tr = 13,38 min en fonction du rapport NDA/CN- (conditions de séparation et de détection identiques à celles de la Figure 43). Le rapport NDA/CN- optimal est de 1/1 ; dans ce cas le pic correspondant à
l’impureté (tr = 13,38 min) possède une aire peu élevée et les acides aminés réagissent
bien avec ce rapport.
2) Optimisation du temps de réaction
Le temps d’incubation est un paramètre déterminant pour l’optimisation du
marquage dans la boucle. Les acides aminés étudiés précédemment ont été marqués avec
le rapport NDA/CN- (1/1) et incubés à différents temps (Figure 45).
Figure 45 : Marquage d'amines primaires à 10-6 mol/L à différents temps d'incubation (conditions de séparation et de détection identiques à celles de la Figure 43). Le temps d’incubation après 5 min de marquage influence peu l’aire des pics
obtenus pour chaque acide aminé. Seul, l’impureté dépend de ce temps d’incubation. En
effet, plus la durée d’incubation est élevée, plus l’aire du pic correspondant à l’impureté
augmente (Figure 46).
Rapport NDA/CN -
Aire
Temps (min)
Aire
x 108
1,6
1,2
0,8
0,4
0 1/10 1/5 1/2 1/1 2/1 5/1 10/1
x 107 3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0 0 5 10 15 20 30
Arg Glu GABA Phe
85
Figure 46 : Aire du pic de l'impureté (tr = 13,38 min) en fonction du temps d'incubation (conditions de séparation et de détection identiques à celles de la Figure 43). Le temps de réaction dans la boucle d’injection est donc fixé à 5 min ; c’est le
temps nécessaire pour obtenir des dérivés marqués sans que l’impureté n’ait trop réagi et
n’écrase le chromatogramme avec une aire trop élevée.
3) Séparation des 20 amines marquées
Le mélange de 17 acides aminés et de 3 amines biogènes marqués automatiquement
dans la boucle d’injection est séparé sur la colonne X-Bridge dans les mêmes conditions
d’élution que lors du marquage manuel. Cependant, parce que les conditions d’injection
sont légèrement différentes, les temps de rétention sont modifiés par rapport à ceux
obtenus lors du marquage manuel, mais pas l’ordre d’élution. On obtient donc pour un
mélange d’amine à 10-5 mol/L le chromatogramme suivant :
Figure 47 : Chromatogramme des 20 amines marquées à 10-5 mol/L dans la boucle d'injection (conditions de séparation et de détection identiques à celles de la Figure 43).
Temps (min)
Aire
Temps (min)
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(EU
)
x 108 10
8
6
4
2
0 0 5 10 15 20 30
86
Le temps de rétention, la capacité de pics et la résolution, pour chaque amine
marquée, sont répertoriés dans le Tableau 9.
Tableau 9 : Résultats chromatographiques sur colonne XBridge avec le marquage automatisé dans la boucle d'injection selon les conditions chromatographiques et de détection identiques à celles mentionnées dans la Figure 43.
Acides aminés tr (min) CV%
sur tr Aire CV% sur aire np Rs
1 His 1,63 0,09 202766317 3,13 50
2 Arg 2,04 0,13 119388266 0,62 35 0,6
3 Asn 5,07 0,07 40543413 2,35 34 5,5
4 Gln 5,42 0,07 105294298 1,30 26 0,4
5 --- 6,80 0,08 --- --- --- 1,6
6 Ser 7,19 0,05 86135768 3,60 27 0,7
7 Asp 7,75 0,08 28593132 11,32 41 0,9
8 Glu 8,35 0,07 56355956 12,01 28 1,0
9 Thr 9,19 0,07 102477364 11,36 45 1,1
10 Gly 10,00 0,07 135804743 7,97 57 1,1
11 Nor 10,53 0,06 162738452 7,98 35 0,8
12 Ala 11,90 0,06 181439395 3,30 31 2,1
13 Gaba 12,06 0,05 212260309 4,88 28 0,3
14 Tyr 12,38 0,07 35258538 6,91 48 0,6
15 --- 13,38 0,06 --- --- --- 1,3
16 Dop 14,96 0,04 175407817 2,25 28 2,0
17 Met 15,73 0,04 127059135 1,44 28 1,0
18 Val 16,76 0,04 141081546 2,29 40 1,5
19 Try 16,96 0,03 136509338 2,71 25 0,4
20 Phe 17,62 0,03 155583305 1,08 21 0,9
21 Ile 18,82 0,03 188476562 3,40 28 1,7
22 Leu 19,00 0,02 197033511 3,65 19 0,4
Moy 0.06 4,68 34 1,2
Le marquage en ligne dans la boucle permet d’obtenir une meilleure répétabilité
des résultats au niveau des temps de rétention. Cependant ce marquage entraîne une
perte au niveau de la résolution et de l’efficacité de la colonne. Cette perte est toutefois
compensée par la répétabilité des aires dont le coefficient de variation moyen est inférieur
à 5% (Tableau 9). L’aire des pics dépend principalement des quantités de marqueurs
mélangées et du temps d’incubation. Avec l’automatisation de ce marquage l’erreur
expérimentale est considérablement diminuée.
87
4) Limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ)
La limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) sont par définition
la plus petite quantité d’analyte détectée et la plus petite quantité d’analyte pouvant être
quantifiée, avec un niveau de confiance déterminée. Il existe plusieurs méthodes pour
évaluer ces quantités minimales(Vial J. and Jardy A., 1999), la plus courante en HPLC
étant celle appliquant le rapport signal sur bruit (S/B).
La LOD et la LOQ de chaque acide aminé et catécholamine marqué ont été
déterminées par détection de fluorescence pour une gamme de concentration variant de
10-5 mol/L à 10-8 mol/L et avec un rapport S/B calculé de 3 pour la LOD et de 10 pour la
mesure de la LOQ.
Chaque droite d’étalonnage a été tracée à partir du logarithme de l’aire du pic en
fonction du logarithme de la concentration correspondante (Tableau 10).
Tableau 10 : Limite de détection des acides aminés marqués avec les paramètres des droites étalons.
Acides Aminés a CV%
sur a b CV% sur b
R² LOD (nM)
CV% sur LOD
LOQ (nM)
CV%sur LOQ
His 0,9698 1,51 13,0190 0,61 0,9976 22 3,42 61 1,87
Arg 0,9943 1,13 13,2227 0,46 0,9983 44 1,76 74 1,16
Asn 1,0027 1,21 12,9270 0,52 0,9994 32 2,31 83 1,19
Gln 1,0076 1,52 13,1873 0,65 0,9988 24 2,99 66 1,51
Ser 0,7640 2,95 11,7447 1,01 0,9945 14 8,18 54 4,4
Asp 0,8102 6,55 11,5137 2,61 0,9882 31 1,09 106 2,74
Glu 0,7277 8,35 11,3823 2,99 0,9873 16 1,97 64 8,11
Thr 1,0890 0,64 13,1487 0,27 0,9717 44 1,15 111 0,59
Gly 0,8107 0,57 12,1337 0,45 0,9930 51 1,22 97 0,57
Nor 0,7620 3,27 12,0150 1,23 0,9857 10 8,18 37 3,97
Ala 0,583 1,81 11,1000 0,56 0,9750 17 0,74 957 3,95
GABA 0,857 1,15 12,6167 0,53 0,9873 13 1,69 41 0,48
Tyr 0,7357 10,91 11,1267 3,55 0,9700 24 45,6 97 33,3
Dop 1,2000 0,93 14,2457 0,43 0,9763 34 1,73 78 1,02
Met 1,1367 4,02 13,9814 1,78 0,9854 29 7,74 69 4,24
Val 0,7177 4,53 11,7033 1,53 0,9923 37 7,30 37 7,30
Try 0,9360 3,52 12,7800 1,49 0,9537 21 7,19 62 3,81
Phe 1,0349 1,37 13,5610 0,60 0,9945 21 2,64 55 1,33
Ile 0,7927 0.51 12.1733 0.17 0.9777 56 1,07 197 0,67
Leu 0,8413 0.99 12.4600 0,42 0,9857 42 7,23 136 0,63
88
Les droites d’étalonnage sont sous la forme : Log (Aire) = a*Log (C) + b. Les limites
de détection obtenues varient de 10 à 56 nmol/L avec un coefficient de variation inférieur
à 10%. La limite de quantification est de l’ordre de 30-200 nmol/L avec un coefficient de
variation inférieur à 10%. Ces limites de quantification sont du même ordre de grandeur
que celles déterminées par Shah et ses collaborateurs (Shah A.J. et al., 1999).
Notons que la Tyr présente un coefficient de variation très élevé car le pic
chromatographique est confondu avec le pied du pic du GABA. L’intégration de ce pic est
donc faussée à cause de la mauvaise résolution entre les deux composés.
5) Etude d’échantillons biologiques
Un échantillon de microdialysat de striatum de rat anesthésié et du liquide
céphalorachidien humain ont été étudiés afin de vérifier la méthode analytique.
a) Etude d’un microdialysat
L’échantillon est directement marqué dans la boucle d’injection sans traitement
préalable. Le chromatogramme correspondant est le suivant :
Figure 48 : Chromatogramme d'un microdialysat de rat marqué avec NDA/CN- dans la boucle d'injection. Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj = 3 µL de KCN/Tampon pH = 8,7 + 3 µL de microdialysat + 4µL de NDA, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 70 % A ; t20 = 30 % A. Détecteur de fluorescence Waters 2475 λexc = 442 nm et λém = 480 nm.
Temps (min)
Inte
nist
é de
fluo
resc
ence
(E
U)
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
14,2 15,8
1
2
3
4 5
6
7
8
9 10
11
89
Les acides aminés sont déterminés à partir de leur temps de rétention. Leur
concentration est mesurée à partir de leurs aires et des droites étalons établies
précédemment. Les résultats sont répertoriés dans le tableau ci-dessous :
Tableau 11 : Acides aminés détectés dans le microdialysat.
Acides aminés Tr (min) [C] (nM)
1 Arg 2,04 ± 0,01 37 ± 1
2 Gln 5,44 ± 0,02 108 ± 0,5
3 Ser 7,20 ± 0,01 45 ± 9
4 Thr 9,21 ± 0,01 75 ± 5
5 Gly 10,07 ± 0,07 55 ± 15
6 Ala 11,90 ± 0,01 30 ± 10
7 Tyr 12,42 ± 0,05 37 ± 5
8 Dop 14,95 ± 0,02 34 ± 5
9 Val 16,77 ± 0,03 26 ± 6
10 Phe 17,61 ± 0,02 40 ± 5
11 Ile 18,83 ± 0,03 37 ± 1
11 dérivés benzisoindoles ont été détectés dans ce microdialysat. Les quantités
déterminées dans cet échantillon sont comparables avec celles décrites dans la littérature,
notamment pour la Dop (Siri N. et al., 2006). Les concentrations de ce neurotransmetteur
dans le striatum de rat varient de 5 à 40 nmol/L (Shou M. et al., 2006). Ces variations
dépendent principalement du débit de microdialyse, de la longueur de la sonde, de la
région du cerveau perfusée et de l’état de conscience des sujets (Shou M. et al., 2006).
b) Etude d’un liquide céphalorachidien
De la même façon que pour le microdialysat, un échantillon de liquide
céphalorachidien humain dilué à 1/10 est marqué directement dans la boucle d’injection,
puis les acides aminés présents sont séparés en HPLC (Figure 49).
90
Figure 49: Chromatogramme représentant la séparation d'un échantillon de liquide céphalorachidien marquée avec NDA/CN-. Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj = 3 µL de KCN/Tampon pH = 8,7 + 3 µL de microdialysat + 4µL de NDA, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 70 % A ; t20 = 30 % A. Détecteur de fluorescence Waters 2475 λexc = 442 nm et λém = 480 nm. Les résultats correspondant à ce chromatogramme sont regroupés dans le Tableau 12.
Tableau 12 : Résultats chromatographiques d'un échantillon de liquide céphalorachidien marqué avec NDA/CN-
Acides aminés Tr (min)
[C] (nM) dans LCR dilué à
1/10
[C] (µM) dans LCR
1 His 1,64 ± 0,01 129 ± 2 1,3
2 Arg 2,04 ± 0,01 183 ± 1 1,8
3 Gln 5,43 ± 0,01 457 ± 1 4,6
4 Ser 7,19 ± 0,01 207 ± 2 2,1
5 Glu 8,35 ± 0,01 137 ± 1 1,4
6 Thr 9,19 ± 0,01 270 ± 2 2,7
7 Gly 10,05 ± 0,07 175 ± 1 1,8
8 Ala 11,89 ± 0,01 226 ± 2 2,3
9 Tyr 12,42 ± 0,05 227 ± 2 2,3
10 Dop 14,96 ± 0,01 46 ± 2 0,5
11 Met 15,73 ±0,01 79 ± 1 0,8
12 Val 16,76 ± 0,01 141 ± 7 1,4
13 Phe 17,63 ± 0,01 112 ± 1 1,1
14 Ile 18,82 ± 0,01 143 ± 0,5 1,4
Temps (min)
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(EU
)
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
1
3
2
4 5
6 7
8
9 10 12
11 13
14
91
Un plus grand nombre d’acides aminés ont été détectés dans le liquide
céphalorachidien, notamment, Dop et Glu. Les concentrations dans cet échantillon sont
plus élevées, elles varient de 0,5 à 5 µmol/L sauf pour la Dop qui présente une
concentration similaire à celle mesurée dans le microdialysat. Ces concentrations sont
toutefois très inférieures à celles décrites dans la littérature pour les acides aminés (Chang
P.L. et al., 2006; Nouadje G. et al., 1995). Il est possible que l’échantillon se soit dégradé
lors de sa conservation.
La concentration de dopamine mesurée est cependant 10 fois supérieure à celle
habituellement obtenue (Kalita J. et al., 2007). D’autres analytes ont pu co-migrer avec
cette molécule, un couplage LC-MS avec préconcentration de l’échantillon permettrait de
lever l’ambiguïté sur ce composé.
6) Conclusions
La méthode de marquage automatisée nous a permis de doser des échantillons
biologiques et notamment les microdialysats en diminuant les erreurs expérimentales du
marquage. Cette méthode nécessite une faible quantité d’échantillon, il est donc possible
de coupler la microdialyse directement à l’injecteur afin de quantifier les
neurotransmetteurs in-situ. Cette technique de couplage a été développée par Bert et ses
collaborateurs en CE-LIF afin d’observer les interactions entre le Glu, l’Asp et la DOP après
l’administration d’une drogue par rétro-dialyse (Bert L. et al., 2002). Les amines résultant
de la sonde de microdialyse sont marquées avec NDA/CN- via un système composé de trois
capillaires, de deux pompes à seringue et d’un tube de polyéthylène constituant la
chambre de mélange (Bert L. et al., 1996). Une méthode d’analyse des neurotransmetteurs
in-situ a été développée pour la HPLC ; l’échantillon et le mélange NDA/CN- sont infusés
via deux pompes à seringue vers un T mélangeur où a lieu le marquage avant d’être injecté
vers la colonne (Yang C.S. et al., 1999). L’OPA et le β-MeOH sont dans ce cas infusés en
mélange, or ce mélange n’est pas stable au cours du temps (Molnar-Perl I., 2001). Utiliser
notre méthode de marquage automatisé couplée à la microdialyse simplifierait le montage
de couplage et éviterait les possibles réactions parasites dues aux mélanges
Marqueur/Nucléophile.
92
93
Dans ce deuxième chapitre, nous avons développé une méthode de quantification
des neurotransmetteurs de type acides aminés en HPLC avec un détecteur de
fluorescence. Pour se faire, le marquage de ces molécules avec le système NDA/CN- a été
automatisé dans la boucle d’injection de la chaîne chromatographique et les molécules
ont été identifiées en spectrométrie de masse en mode négatif. Des échantillons
biologiques ont été injectés afin de vérifier la compatibilité de cette méthode avec des
matrices plus compliquées.
Le second objectif est d’analyser et de quantifier des molécules plus complexes ;
des peptides, en utilisant ce type de marquage. Nous avons choisi d’étudier les
enképhalines.
94
95
Chapitre 3. Nouvelle méthode de marquage pour l’analyse des Enképhalines
Stobaugh et ses collaborateurs sont les premiers à développer une méthode
chromatographique pour l’analyse de la Leu-Enk dans les échantillons biologiques en
utilisant le marquage NDA/CN- (De Montigny P. et al., 1990; Mifune M. et al., 1989). Dans
des travaux plus récents, ils comparent deux méthodes chromatographiques pour l’analyse
et la quantification d’un modèle de peptide opioïde et deux peptides cycliques : la HPLC
couplée avec un détecteur de fluorescence avec le marquage NDA/CN- et avec la détection
en spectrométrie de masse en utilisant un triple quadripôle avec une source electrospray
en mode positif (Yang J.Z., 2002). Pour l’analyse de ce type de molécule, le couplage
HPLC/MS est la méthode la plus avantageuse car les peptides cycliques ne peuvent pas
être directement marqués ; il faut les convertir pour obtenir une amine primaire pouvant
être dérivée par NDA/CN-.
Cependant, l’analyse quantitative en spectrométrie de masse requiert un étalon
interne spécifique de la molécule, le plus souvent l’homologue deutéré de cette molécule
car il présente l’avantage de posséder les mêmes propriétés d’ionisation (Desiderio D.M.
and Zhu X., 1998). Or ce type de standard interne est très coûteux et spécifique d’un seul
type d’analyte. Le couplage HPLC/Fluorescence est donc plus avantageux lorsque plusieurs
molécules doivent être dosées dans un même échantillon.
Afin de bénéficier des avantages de chacune de ces méthodes, nous avons
développé un marquage qui permet d’être à la fois compatible avec la spectrométrie de
masse et la détection de fluorescence pour l’analyse quantitative de peptides.
A. Essai avec le système NDA/CN-.
I. Etudes spectroscopiques
La longueur d’onde d’excitation reste identique à celle du marquage avec les acides
aminés (λexc = 420 et 442 nm) et la longueur d’onde d’émission est de λém = 480 nm (Mifune
M. et al., 1989).
Afin d’optimiser le temps de réaction, une étude cinétique du marquage a été
envisagée en spectrométrie UV à la longueur d’onde de λabs = 442 nm, conformément au
laser de notre détecteur LIF (Figure 50).
96
Figure 50 : Absorbance de la Leu-Enk marquée à 10-4 mol/L avec NDA/CN- en fonction du temps à λ = 442 nm. Le temps de réaction pour obtenir un maximum en absorbance et en fluorescence
est supérieur à la demi-heure : le marquage des peptides est plus lent que celui avec les
acides aminés. Ce temps de réaction étant trop long nous avons choisi une durée de
marquage de 15 min, soit à environ 65% du maximum d’absorption.
II. Etude en spectrométrie de masse
L’étude des peptides en spectrométrie de masse est généralement réalisée en mode
positif de part leur fonction amine terminale et leurs liaisons peptidiques (Johnson R.S. et
al., 1987).
Une étude en spectrométrie de masse de la Leu-Enk à 10-5 mol/L marquée avec
NDA/CN- a été donc réalisée en mode positif (Figure 51).
Abs
orba
nce
Temps (sec)
0,14
0,12
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0 0 500 1000 1500 2000
97
Figure 51 : Spectre de masse représentant la Leu-Enk marquée à 10-5 mol/L avec NDA/CN-. Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détection spectrométrie de masse ESI+ (en haut) et ESI- (en bas).
Ce peptide une fois marqué s’ionise mal en mode positif. L’ionisation dépend
fortement des ions Na+ et K+ présents dans le milieu, les adduits sodiques et potassiques de
rapports m/z = 753,66 et m/z = 769,64 respectivement sont plus abondants que le pic
parent à m/z = 731,66. Le marquage de la Leu-Enk est étudié en mode négatif (Figure 51).
Le pic de rapport m/z = 729,53 correspondant à l’ion (M-H)- présente une meilleure
intensité relative (1000 coups par scan).
Le marquage NDA/CN- est donc plus adapté pour le mode négatif. Cependant pour
l’analyse en spectrométrie de masse, il est plus commun de travailler en mode positif et
notamment pour l’étude des fragmentations (Johnson R.S. et al., 1987). De plus, notre
idée est d’utiliser ce marquage comme étalon interne en jouant sur le nucléophile. Or CN-
ne peut être enrichi en masse que de deux unités soit 13C15N (Tracqui A. et al., 2002),
cette différence de masse n’est pas suffisante pour distinguer deux mêmes peptides de
leurs massifs isotopiques principalement fonction du nombre de carbone présents dans la
Rapport m/z
Rapport m/z
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
100
50
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900
100
50
0
710 720 730 740 750 760 780
98
molécule. Il nous faut donc un nucléophile facilement ionisable et possédant suffisamment
d’atome d’hydrogène pour être enrichi en deutérium, par exemple.
B. Nouvelle méthode de marquage des peptides
Deux types de molécules sont principalement utilisés en tant que nucléophiles pour
le marquage avec le NDA : le cyanure ou les thiols, en général le β-mercaptoéthanol (β-Me)
(Rammouz G. et al., 2007). Un thiol présentant une fonction amine non primaire
permettrait de répondre à tous les critères nécessaires pour nos travaux. Nous avons donc
choisi le N,N-diméthylaminoéthanethiol (MeAT) de formule développée suivante :
HSN
Figure 52 : Formule développé du N,N-diméthylaminoéthanethiol (MeAT)
Le marquage des enképhalines étudié avec ce nouveau nucléophile est représenté
ci-dessous :
H
O
O
H+ Enk-NH2 N
S-(CH2)2-N(CH3)2
EnkHS-(CH2)2-N(CH3)2
NDA
Figure 53 : Nouveau marquage des enképhalines avec NDA/MeAT
I. Etudes spectroscopiques
Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission du marquage au NDA varient selon
le nucléophile utilisé (Dave K. et al., 1992b), nous avons déterminé les longueurs d’onde
d’excitation et d’émission de ce nouveau marquage avec un détecteur de fluorescence
multilongueur d’onde (Figure 54).
99
Figure 54 : A. Spectre UV-visible de la Leu-Enk marquée à 10-5 mol/L avec NDA/MeAT obtenu à λém = 510 nm et B) Spectre de fluorescence de la Leu-Enk marquée à 10-5 mol/L avec NDA/MeAT à λexc = 442 nm. Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détection d’absorbance et B. Détection de fluorescence sur détecteur multilongueur d’onde Waters 2475 balayage d’excitation de 400 nm à 500 nm et balayage d’émission de 480 à 580 nm. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission de la Leu-Enk marquée avec le
système NDA/MeAT sont respectivement de 442 ± 2 nm et 510 ± 2 nm.
Une étude cinétique a été réalisée sur ce marquage afin de déterminer le temps
d’incubation nécessaire (Figure 55) pour obtenir une fluorescence optimale.
Longueur d’onde (nm)
Longueur d’onde (nm)
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(EU
) A
bsor
banc
e (E
U)
100
Figure 55 : Cinétique la Leu-Enk marquée à 10-4 mol/L avec NDA/MeAT à λabs = 442 nm. Le marquage est très rapide ; le temps de réaction est de 2 min. La molécule
marquée se dégrade au cours du temps après avoir atteint son maximum d’absorption.
II. Etudes en spectrométrie de masse
La masse monoisotopique de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT est de 808,36 Da.
Figure 56 : Spectre de masse de la Leu-Enk marquée à 10-5 mol/L avec NDA/MeAT obtenu en injection directe en ESI+. Conditions : Dilution ½ de Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT dans H2O/AcN ; O,1%HCOOH (5O/50 v/v). Conditions spectrométrie de masse : Econe = 35 V, Ecap = 3 kV Rf Lens = 40 V. En mode ESI+, la molécule donne les composés suivants : le pic parent à m/z =
809,37 et un fragment spécifique à m/z = 704,31 correspondant à la perte de la chaîne
aminothiol (MeAT).
Temps (sec)
Abs
orba
nce
Rapport m/z
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
0,08
0,06
0,04
0,02
0 0 500 1000 1500 2000
100
50
0
700 720 740 760 780 800
101
III. Comparatif des différents marquages
Les différents marquages de la Leu-Enk ont été comparés en LC/LIF/MS avec la Leu-
Enk non marquée en mode positif afin de vérifier si cette nouvelle méthode de marquage
offre une molécule plus facilement ionisable en spectrométrie de masse (Figure 57).
Figure 57 : Comparatif des différents marquages de la Leu-Enk (10-5 mol/L) en spectrométrie de masse et en détection LIF. Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Les aires des pics chromatographiques correspondant à la Leu-Enk non marquée et à
la Leu-Enk marquée avec NDA/CN- sont comparées en détection LIF et en spectrométrie de
masse avec l’aire de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT. En spectrométrie de masse le
nouveau marquage donne un dérivé benzisoindole plus facilement ionisable que la Leu-Enk
seule et que le marquage avec NDA/CN- en mode positif qui s’ionise très peu. L’intensité
relative est respectivement de 220 ± 18, 260 ± 37 et 10 ± 1 pour le marquage NDA/MeAT,
la Leu-Enk seule et le marquage NDA/CN-. Même si en détection LIF, la Leu-Enk marquée
avec NDA/MeAT est moins fluorescente que lorsqu’elle est dérivée avec NDA/CN-, ce
marquage est une bonne alternative pour la détection LIF combinée à la spectrométrie de
masse.
IV. Etude LC/LIF/MS
Aire
350
300
250
200
150
100
50
0 Leu-Enk Leu-Enk CN - Leu-Enk MeAT
Détection LIF
Détection MS
102
1) Séparation des enképhalines
a) en détection LIF
Un mélange d’enképhalines, la Leu-Enk et la Met-Enk, marquées avec NDA/MeAT
est séparé en HPLC avec la détection LIF et la spectrométrie de masse. Le
chromatogramme obtenu avec la détection LIF est représenté dans la Figure 58 pour
différentes concentrations en analyte.
Figure 58 : Séparation de la Leu-Enk et de la Met-Enk marquée avec NDA/MeAT à des concentrations variant de 10-7 mol/L à 2,5 x 10-6 mol/L. Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détection LIF Hd-Cd λexc = 442 nm. Les temps de rétention sont respectivement de 9,55 ± 0,01 et de 9,87 ± 0,01 min
pour la Met-Enk et la Leu-Enk.
b) en spectrométrie de masse
Le même mélange est analysé avec le couplage LC/MS. Le chromatogramme obtenu
avec les sélections d’ions correspondant à la Leu-Enk et à la Met-Enk marquée soit m/z =
809,36 et m/z = 827,32 présente quatre pics pour deux molécules injectées (Figure 59).
D’après les temps de rétention obtenus avec la détection LIF, les deux derniers pics à tr =
9,69 min et tr = 10,00 min correspondent respectivement à la Met-Enk et la Leu-Enk
marquée et aux propriétés fluorescentes.
Aire
(R
FU
)
Temps (min)
800
625
500
375
250
125
0 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 11,5 12
103
Figure 59 : Chromatogramme en spectrométrie de masse avec sélection d'ion à m/z = 809,36 et m/z = 827,32 correspondant à la Leu-Enk et la Met-Enk respectivement marquée à 10-5 mol/L avec NDA/MeAT. Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détection spectrométrie de masse ESI+.
Les spectres de masse de chaque pic chromatographiques sont représentés dans la
Figure 60.
Figure 60 : Spectres de masse de la Leu-Enk et de la Met-Enk marquées avec NDA/MeAT obtenus à chaque temps de rétention du chromatogramme (conditions identiques à la Figure 59). Selon ces spectres de masse, les pics à tr = 8,63 min et 9,69 min correspondent au
rapport m/z = 827,56 soit à l’ion parent de la Met-Enk marquée et les pics à tr = 9,04 min
et 10,00 min ont un rapport m/z = 809,60 soit l’ion (M+H)+ du dérivé benzisoindole de la
Leu-Enk. Ces spectres diffèrent cependant au niveau de la fragmentation dans la source.
En effet, les ions parents à tr= 8,63 et 9,04 min sont accompagnés de leurs fragments
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
Temps (min)
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
Rapport m/z Rapport m/z
Rapport m/z Rapport m/z
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
100
50
0 0 2 4 6 8 10 12 14
m/z = 809,36 et m/z = 827,32
104
spécifiques à m/z = 722,5 et m/z = 704,5 respectivement alors que les deux autres
spectres de masse ne contiennent que les ions (M+H)+. Le pic à m/z = 701,7 correspond à
une impureté présente dans le solvant.
Des études plus approfondies avec une interprétation théorique de ces
observations seront présentées dans le chapitre 4.
2) Limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ)
Les LOD et les LOQ ont été déterminées avec un rapport signal sur bruit
respectivement de 3 et 10 pour chaque molécule marquée en détection LIF et en
spectrométrie de masse pour une gamme de concentration variant de 10-5 mol/L à 10-7
mol/L. Ces résultats sont présentés dans le Tableau 13 : les droites étalons sont de la
forme Log (Aire) = a*Log (C) + b avec C la concentration molaire.
Tableau 13 : LOD et LOQ de la Leu-Enk et Met-Enk marquée avec NDA/MeAT avec la détection LIF et en spectrométrie de masse.
LIF
Peptide a CV% B CV% R² LOD nM CV% LOQ nM CV%
Met-Enk 0,6420 0,13 8,3321 0,22 0,9690 8,6 1,71 19,4 1.82
Leu-Enk 0,7990 4,24 9,2534 1,77 0,9557 14,6 13,59 28,2 10,84
SM
Peptide a CV% B CV% R² LOD nM CV% LOD nM CV%
Met-Enk 0,9830 4,17 9,608 1,40 0,9825 88,9 12,33 151,2 10,12
Leu-Enk 0,863 14,25 9,113 6,76 0,9795 66,0 21,71 120,7 13,12
Les coefficients de variation des paramètres de la doites correspondant à la Leu-Enk
sont très élevés en spectrométrie de masse. L’utilisation d’un étalon interne permettrait
de pallier ce problème (Desiderio D.M. and Zhu X., 1998). Afin de minimiser les erreurs
expérimentales lors de la réaction de dérivatisation (quantités mélangées et durée
d’incubation), ce nouveau marquage est automatisé.
105
V. Automatisation du marquage
Comme pour le marquage des acides aminés avec NDA/CN-, l’automatisation de la
nouvelle méthode de marquage dans la boucle d’injection est étudiée afin d’optimiser le
rapport NDA/MeAT et le temps d’incubation.
1) mise au point des conditions de marquage.
a) détermination du rapport NDA/MeAT
Une solution de 10-5 mol/L de Leu-Enk est marquée avec plusieurs rapports
NDA/MeAT variant de 1/20 à 10/1. Après l’analyse HPLC, l’aire du pic de la Leu-Enk
marquée pour les différents rapports NDA/MeAT, représentée dans la Figure 61, indique
que le marquage en ligne est optimisé pour un rapport NDA/MeAT de 1/10.
Figure 61 : Aire de la Leu-Enk marquée à 10-5 mol/L dans la boucle d'injection en fonction du rapports NDA/MeAT. Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj =3 µL de MeAT (concentration variant de 1,67 x 10-3 mol/L à 3,33 x 10-1 mol/L) ; 3µL de Leu-Enk à 10-5 mol/L et 4µL de NDA (1,25 x 10-2 mol/L) tinc = 1 min, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détecteur de fluorescence multilongueur d’onde Waters 2475 λexc = 442 nm et λém = 510 nm.
L’aire des pics varie peu en fonction du rapport NDA/MeAT et pour des raisons de
solubilité du MeAT, nous avons sélectionné le rapport NDA/MeAT (1/2) pour la suite de nos
travaux. On peut cependant constater que lorsque le NDA est en excès par rapport au
nucléophile MeAT, la fluorescence des dérivés benzisoindoles tend à diminuer. Le rapport
NDA/MeAT présente le même comportement que NDA/CN- et que OPA/RSH (Molnar-Perl I.,
2001).
b) Etude de la durée d’incubation
Le marquage de la Leu-Enk de concentration 10-5 mol/L dans la boucle d’injection
est réalisé à différents temps d’incubation variant de 0 à 10 minutes avec un rapport
Aire
Rapport NDA/MeAT
106
NDA/MeAT de 1/2. Après l’analyse HPLC, l’aire des pics de la Leu-Enk marquée est
représentée dans la Figure 62 pour les différents temps d’incubation.
Figure 62 : Aire de la Leu-Enk marquée dans la boucle d'injection en fonction du d'incubation. . Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj =3 µL de MeAT (3,33 x 10-2 mol/L) ; 3µL de Leu-Enk à 10-5 mol/L et 4µL de NDA (1,25 x 10-2 mol/L), tinc = 1 min à 10 min, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détecteur de fluorescence multilongueur d’onde Waters 2475 λexc = 442 nm et λém = 510 nm. Le marquage optimisé est atteint pour une durée d’incubation de 1 minute. Ce
temps de réaction est du même ordre de grandeur que celui déterminé lors de la cinétique
de marquage en absorbance (Figure 55).
Dans ces conditions, le chromatogramme obtenu avec la détection de fluorescence
pour un mélange de Leu-Enk et Met-Enk marquées à 10-5 mol/L est le suivant :
Figure 63 : Chromatogramme d'un mélange de Leu-Enk et de Met-Enk marquées à 10-5 mol/L avec NDA/MeAT dans la boucle d'injection. Conditions identiques à celles de la figure 62 avec 5, Vinj =3 µL de MeAT (3,33 x 10-2 mol/L) ; 3µL de Leu-Enk à 10-5 mol/L et 4µL de NDA (1,25 x 10-2 mol/L), tinc = 1 min. Les temps de rétention sont 9,13 ± 0,01 min pour la Met-Enk et de 9,43 ± 0,01 min
pour la Leu-Enk.
Aire
Temps (min)
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(EU
)
Temps (min)
107
2) limite de détection et de quantification
Les limites de détection et de quantification de la Leu-Enk et de la Met-Enk
marquées dans la boucle d’injection avec NDA/MeAT sont déterminées pour une gamme de
concentration de 10-7 mol/L à 5.10-5 mol/L avec un rapport signal sur bruit de 3 pour la
LOD et de 10 pour la LOQ. Les droites d’étalonnages sont obtenues à partir du logarithme
de l’aire des pics en fonction du logarithme de la concentration et sont de la forme Log
(Aire) = a *Log C + b (Tableau 14).
Tableau 14 : Limites de détection et de quantification des enképhalines marquées dans la boucle d'injection avec NDA/MeAT
Peptide a CV% B CV% R² LOD nM CV% LOQ nM CV%
Met-Enk 0,8882 3,55 11,543 1,43 0,9972 56,5 5,41 174,2 1,91
Leu-Enk 0,8339 0,70 11,538 0,27 0,9991 36,8 1,35 122,0 0,64
Les LOD sont de 56,5 nmol/L et 36,8 nmol/L pour la Met-Enk et la Leu-Enk avec un
coefficient de variation inférieur à 6% et les LOQ sont de l’ordre de 10-7 mol/L pour les
deux peptides avec un coefficient de variation de 1-2%. Ces résultats sont comparables à
ceux trouvés dans la littérature(Dave K. et al., 1992a; Mifune M. et al., 1989).
L’automatisation du marquage permet de d’obtenir des résultats avec une marge d’erreur
moins élevée que lors du marquage manuel (CV = 13,59 % pour la Leu-Enk) et une
intervention de l’expérimentateur minimisée.
108
3) Etude d’un échantillon biologique
a) Analyse d’un liquide céphalorachidien
Afin d’appliquer cette nouvelle méthode de marquage à un milieu biologique, un
échantillon de liquide céphalorachidien est injecté et marqué directement dans la boucle
d’injection avec NDA/MeAT (Figure 64).
Figure 64 : Chromatogramme d'un échantillon de liquide cérébrospinal marqué automatiquement dans la boucle d’injection avec NDA/MeAT. Conditions : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Alliance 2695, Vinj =3 µL de MeAT (3,33 x 10-2 mol/L) ; 3µL de LCR et 4µL de NDA (1,25 x 10-2 mol/L), tinc = 1 min à 10 min, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détection avec le détecteur de fluorescence multilongueur d’onde Waters 2475 λexc = 442 nm et λém = 510 nm. Cet échantillon contient les deux enképhalines marquées d’après leur temps de
rétention (tr = 9,19 ± 0,01 min et tr = 9,42 min ± 0,01 min). Une quantité de 1,16 x 10-7 ± 2
x 10-9 M a été détectée pour la Met-Enk marquée. Il existe un pic correspondant au temps
de rétention de la Leu-Enk mais l’aire de ce pic est inférieure à la quantité minimale que
nous avons choisi d’intégrer en considérant le signal du blanc : il n’est donc pas
quantifiable.
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(EU
)
Temps (min)
109
b) Analyse d’un microdialysat
Un échantillon de microdialysat est aussi étudié avec ce nouveau marquage
automatisé (Figure 65).
Figure 65 : Chromatogramme d'un microdialysat marqué dans la boucle d'injection avec NDA/MeAT. Conditions identiques à celles de la figure 64. Un pic correspondant au temps de rétention (tr = 9,12 ± 0,01 min) de la Met-Enk a
été détecté sur le chromatogramme mais n’est pas quantifiable.
4) Conclusions
La méthode de marquage en fluorescence n’est pas suffisamment sensible pour
l’analyse directe d’enképhalines contenues dans les microdialysats ou les liquides
céphalorachidiens. En effet ces échantillons présentent de nombreux composés endogènes
qui altèrent la séparation des molécules et leur détection (Figure 65). De plus, les
enképhalines peuvent être dégradées par des enzymes – des aminopeptidases - contenues
dans ces échantillons. Pour remédier à ces problèmes de dégradation, les milieux
biologiques peuvent être prétraités avant l’analyse, soit par simple chauffage afin
d’inactiver les enzymes, soit par extraction sur cartouche SPE (Huang Y. et al., 2005) ou
bien en ajoutant un composé inhibant l’activité de l’enzyme (Gandarias J.M. et al., 1997;
Stroink T. et al., 2002).
L’utilisation de la spectrométrie de masse pour quantifier ces peptides permettrait
de lever l’ambiguïté sur la molécule détectée puisque une information supplémentaire (la
masse de la molécule et ses fragments spécifiques) serait fournie en plus de son temps de
rétention.
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(EU
)
Temps (min)
110
C. Nouvelle méthode de quantification en spectrométrie de masse
Les enképhalines sont généralement dosées en spectrométrie de masse en utilisant
la méthode MRM qui nécessite un appareil équipé d’un analyseur triple-quadripolaire (Q3)
et/ou la méthode d’étalonnage interne.
Sinnaeve et ses collaborateurs ont dosé la Met-Enk et la Leu-Enk dans un liquide
céphalorachidien artificiel avec un système µHPLC-ESI-Q3. Les limites de détection et de
quantification ont été établies avec un triple quadripôle par le mode MRM (Multiple
Reaction Monitoring) équipé d’une source électrospray. Les quantités dosables sont de
l’ordre du nanomolaire (Sinnaeve B.A. et al., 2005). Cependant, les variations du rapport
signal sur bruit de la source ESI impliquent des coefficients de variations sur l’étalonnage
trop élevés. Utiliser un standard interne permet de pallier ce problème (Desiderio D.M.
and Zhu X., 1998). Ces standards internes doivent dans ce cas posséder des propriétés
physico-chimiques les plus proches possibles des analytes. Ces molécules peuvent être des
homologues de la structure, des composés de même classe chimique ou la molécule à
doser est enrichie en atomes de deutérium (De Hoffmann E. et al., 1999). Ces derniers
présentent l’inconvénient d’être spécifiques à la molécule d’intérêt et pour les étalons
isotopiques de ne pas toujours être disponibles commercialement et dans le cas contraire
d’être onéreux.
I. Principe
Tracqui et ses collaborateurs ont utilisé le marquage avec le NDA pour déterminer
le cyanure dans le sang avec le couplage LC/ESI/MS. Dans ce cas le CN- est l’ion marquée
avec le NDA en présence d’une amine primaire ; la taurine (Taurine). L’isotope du CN-, le 13C15N- marqué avec NDA/Tau est utilisé comme standard interne (Tracqui A. et al., 2002).
Nous avons développé une méthode basée sur le même principe en jouant sur le
nucléophile MeAT afin de supprimer la spécificité de la méthode d’étalonnage avec un
standard interne.
Le N,N-diméthylaminoéthanethiol (MeAT) enrichi en deutérium n’étant pas
disponible commercialement, nous avons exploité un aminothiol de masse supérieure, le
N,N-diéthylaminoéthanethiol (EtAT) composé de 2CH2 en plus soit 28 unités de différence.
111
II. Etude en infusion directe
Un mélange de Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT avec des rapports
connus est directement injecté dans le spectromètre de masse et analysé en ESI+. Les
rapports m/z de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT sont respectivement de
809,7 et de 809,7 + 28 soit 837,7 (Figure 66).
Figure 66 : Spectre de masse obtenu en infusion directe de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT avec un rapport ½. Conditions : Marquage de la Leu-Enk à 10-6 mol/L avec NDA/MeAt et NDA/EtAT, mélange dans les proportions ½ de chaque peptides marqués et dilution de ½ dans H2O/AcN ; O,1%HCOOH (5O/50 v/v) avec infusion. Conditions spectrométrie de masse : Econe = 35 V, Ecap = 3 kV Rf Lens = 40 V. Le rapport des hauteurs des pics correspondant à la Leu-Enk marquée avec le NDA
et les deux nucléophiles est mesuré pour des rapports injectés variant de 1/10 à 10/1
(Figure 67).
Figure 67 : Droite étalon de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT pour différents rapports
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
Rapport m/z
Rap
port
des
hau
teur
s E
tAT
/MeA
T
Rapport EtAT/MeAT
100
50
0 790 800 810 820 830 840 850 860
112
La droite obtenue est de la forme [H(EtAT)/H(MeAT)] = 0,9825*[EtAT/MeAT] –
0,0618 avec un coefficient de détermination R² de 0,996. Notons que le coefficient de
réponse des rapports est d’environ 1 ; les molécules possèdent les mêmes propriétés
d’ionisation. Le calibrant NDA/EtAT est donc envisageable pour la quantification des
enképhalines avec le couplage LC/MS.
III. Etude par le couplage LC/LIF/MS
Ces études ont été réalisées par le couplage LC/LIF/MS avec des rapports de Leu-
Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT variant de 1/5 à 5/1. Le chromatogramme
obtenu en détection de fluorescence présente pour chaque rapport 2 pics
chromatographiques à tr = 9,86 ± 0,01 min et tr = 10,04 ± 0,01 min correspondant à la Leu-
Enk respectivement marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT (Figure 68).
Figure 68 : Chromatogramme obtenu en détection LIF de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT pour un rapport ½. Conditions : Marquage de la Leu-Enk à 10-6 mol/L avec NDA/MeAt et NDA/EtAT, mélange dans les proportions ½. Elution : colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm, 3,5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj = 10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % ; t15 = 20 % A. Détection avec le détecteur LIF Hd-Cd λexc = 442 nm.
La droite de calibration obtenue en détection LIF est linéaire, son équation est de
la forme [A(MeAT)/A(EtAT)] = 0,3404*[MeAT/EtAT] + 0,1465 avec un coefficient de
détermination R² = 0,998.
En spectrométrie de masse, 4 pics sont représentés sur le chromatogramme
correspondant au rapport m/z = 809,5 et m/z = 827,5 dont deux pics à tr= 9,93 min et tr =
10,24 min sont détectés en fluorescence (Figure 69).
Inte
nsité
de
fluor
esce
nce
(RF
U)
Temps (min)
113
Figure 69 : Chromatogramme des ions de rapport m/z = 809,5 et m/z = 837,5 correspondant respectivement à Leu-Enk marquée NDA/MeAT et NDA/EtAT dans un rapport MeAT/EtAT ½.
Le rapport des aires de chaque pic chromatographique et des hauteurs de chaque
ion des spectres de masse correspondant a été déterminé en fonction du rapport des
molécules injectées pour les molécules aux propriétés fluorescentes. Les équations des
droites pour ces calibrations sont de y = 0,3507x + 0,0353 avec un coefficient de
détermination R² = 0,998 pour l’étalonnage à partir du rapport des hauteurs des pics des
spectres de masse (Figure 70) et de y = 0,3683x + 0,0394 avec R² = 0,999 à partir des aires
des pics du chromatogramme correspondant (Figure 71).
Figure 70 : Droites d'étalonnage du rapport des hauteurs des pics sur les spectres de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT en fonction du rapport MeAT/EtAT injecté.
Temps (min)
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
Rap
port
des
hau
teur
s M
eAT
/EtA
T
Rapports MeAT/EtAT
y = 0,3507x + 0,0353 R² = 0,998
114
Figure 71 : Droites d'étalonnage du rapport des aires des pics des chromatogrammes de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et NDA/EtAT en fonction du rapport MeAT/EtAT injecté.
Ce marquage peut donc être utilisé pour doser les enképhalines par la méthode de
l’étalon interne. Cependant les coefficients de réponse, correspondant au coefficient
directeur de la droite d’étalonnage, en LC/MS sont inférieurs à 1. Ce coefficient traduit
l’ionisation du dérivé NDA/MeAT par rapport au dérivé NDA/EtAT. Cette différence
d’ionisation peut provenir de la séparation chromatographique ; les molécules ne sont pas
éluées au même temps de rétention, les potentiels d’ionisation des amines et leurs
tensions de surface sont donc différents. Une optimisation de la méthode d’étalonnage
peut être envisagée en synthétisant un analogue deutéré du MeAT afin d’obtenir des
molécules marquées avec les mêmes propriétés chimiques. Une réaction de synthèse a été
décrite pour obtenir de tels composés à partir d’acide formique deutéré et de
formaldéhyde deutéré disponible commercialement ; c’est la réaction d’Eschweiler-Clarke
(Torchy S., 2001). Cette réaction est une N-méthylation des amines primaires, le N,N-
diméthylaminoéthanethiol deutéré peut être obtenu à partir de la cystéamine avec un
rendement quantitatif (Figure 72) (Kaluszyner A. and Galun A.B., 1961).
2
HS
N
CD3
CD3
+ CO2 + H2O2
HS
N
H
H
+ +
O
ODD
O
DD
2 2
Figure 72 : Réaction de synthèse de MeAT deutéré envisageable
Ces résultats ont fait l’objet d’un brevet (Couderc F. et al., 2005)
Rapport MeAT/EtAT
Rap
port
des
aire
s M
eAT
/EtA
T
y = 0,3683x + 0,0394 R² = 0,999
115
Dans ce chapitre 3, nous avons mis au point une nouvelle méthode de marquage des
peptides en utilisant le NDA avec un nucléophile aminothiol : le MeAT. Ce nouveau
marquage fluorescent des peptides est de ce fait compatible avec l’analyse en
spectrométrie de masse en mode positif. Une méthode de quantification originale a été
développée en utilisant les nucléophiles MeAT et EtAT, différant de 28 unités, comme
étalons internes. Cette méthode peut toutefois être améliorée par la synthèse du
nucléophile MeAT deutéré.
La méthode chromatographique peut être optimisée pour éviter le phénomène
observé sur le chromatogramme en spectrométrie de masse, soit deux molécules, de
mêmes masses, séparées pour une molécule injectée en modifiant les conditions d’élution
par exemple.
Des études théoriques proposant une interprétation de ce phénomène ont été
réalisées dans le chapitre suivant ainsi qu’une étude quantitative de relation structure-
temps de rétention (QSRR) sur la séparation des acides aminés en fonction des colonnes
utilisées.
116
117
Chapitre 4. Etudes théoriques
A. Etude des conformations de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT
Dans le chapitre précédent nous avons observé un phénomène particulier lors de
l’élution des enképhalines marquées avec NDA/MeAT en LC/MS. Pour une molécule
injectée, deux pics chromatographiques de même rapport m/z = 809,6 sont séparés en
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (Figure 73).
Figure 73 : Chromatogramme SIC de la Leu-Enk marquée à 10-5 mol/L avec NDA/MeAT à la sélection d'ion m/z = 809,6 avec les spectres de masse correspondants pour chaque pic. Conditions de séparation : Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1 % HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A. Détection spectrométrie de masse mode ESI+. Le pic à tr = 10,00 min est détecté par le détecteur de fluorescence et correspond à
la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT protonée (M+H)+ et le pic à tr = 9,04 min n’est pas
fluorescent et correspond à l’ion (M+H)+ avec son fragment spécifique à m/z = 704,5
correspondant à l’ion (M+H-MeAT)+.
Nous avons réalisé différentes études de spectrométrie de masse afin de vérifier si
les deux composés séparés sont les mêmes molécules.
Rapport m/z Rapport m/z
Temps (min)
Abo
ndan
ce
rela
tive
%
Abo
ndan
ce
rela
tive%
118
I. Etude de spectrométrie de masse des ions isobares des enképhalines marquée avec NDA/MeAT.
1) Mesure de la masse exacte.
La mesure de la masse exacte d’une molécule n’est réalisable qu’avec des appareils
haute résolution tels que le Q-TOF. La haute résolution permet de distinguer deux
molécules de masses très proches et de déterminer la composition élémentaire de chacune
d’elles. En effet plus le nombre d’atomes d’un composé organique est élevé plus il existe
de combinaisons possibles de ces atomes avec des écarts de masse très faibles.
La formule brute de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et protonée est de
C44H53N607S, la masse monoisotopique correspondante est de m/z = 809,3696 u. La masse
exacte de l’ion (M+H)+ a été mesurée pour les pics chromatographiques à tr =9,04 min et tr
= 10,00 min (Figure 74).
Figure 74 : Masse exacte des composés élués à tr = 9,04 min et tr = 10,00 min (Conditions d’élution et de détection identiques à celles de la Figure 73). Calibration à partir d’un pic d’impureté à m/z = 453,3420 et des adduits d’acide phosphorique H3PO4.
Les masses exactes mesurées avec une résolution de 10000 sont de m/z = 809,3719
et de m/z = 809,3753, l’écart de masse respectif par rapport à la masse théorique est de
2,3 mDa et de 5,7 mDa pour les pics à tr= 9,04 min et tr =10,00 min. La résolution de
l’ESI/Q-TOF disponible au laboratoire est de 10000 l’écart de masse significatif ∆m avec
une telle résolution, calculée à partir de la formule R = m/∆m, est de ∆m = 81 mDa avec m
= 809.
L’écart de masse expérimental étant dix fois inférieur à l’écart de masse significatif
de l’appareil et le faible écart de masse entre les deux composés (∆m = 5,7 – 2,3 = 3,4
mDa) permet d’affirmer que ces molécules possèdent la même formule brute.
Rapport m/z Rapport m/z
Abo
ndan
ce
rela
tive
% 100
50
0
100
50
0 700 720 740 760 780 800 810 700 720 740 760 780 800 810
119
2) Etude de l’abondance isotopique de chaque composé.
La répartition statistique des isotopes dans une molécule en spectrométrie de
masse dépend de sa composition élémentaire. Dans le cas de la Leu-Enk marquée avec
NDA/MeAT, l’abondance relative des isotopes de cette molécule dépend principalement de
ses atomes de carbone et de son atome de soufre (Tableau 15).
Tableau 15 : Isotopes des atomes constituant la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT avec leur abondance relative (De Hoffmann E. et al., 1999).
Atome Unité de masse % relatif
H D
1 100 2 0,02
C 12 100 13 1,11
N 14 100 15 0,37
O 16 100 17 0,04 18 0,20
S
32 100 33 0,79 34 4,44 36 0,02
Les abondances relatives de chacun des composés de rapport m/z = 809,6 ont été
comparées entre elles et avec un modèle isotopique théorique obtenu à partir du logiciel
de spectrométrie de masse MaxLynx 4.2 (Figure 75).
Figure 75 : Abondance isotopique relative théorique et expérimentale à tr = 9,0 min et tr = 10,0 min de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT.
Rapport m/z
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
809,6 810,6
811,6 812,7
100
80
60
40
20
0 théorique
tr = 9,0 min
tr = 10,0 min
tr = 9,0 min
tr = 10,0 min
théorique 100
100 100
53
54 ± 1
54 ± 1
20
21 ± 1
21 ± 1
5
6 ± 1
6 ± 1
120
Les deux composés de rapport m/z = 809,6 présentent la même abondance
isotopique que le modèle théorique. Ces résultats confirment ceux obtenus lors de la
mesure de la masse exacte : ces deux molécules possèdent la même formule brute.
3) Etude de fragmentation MS/MS
Le séquençage des peptides peut être déterminé en utilisant leur fragmentation en
spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Cette méthode, en plus du séquençage,
permet de différencier des acides isomères, distinguant grâce aux fragments engendrés par
exemple, la leucine de l’isoleucine (Biemann K., 1987; Johnson R.S. et al., 1987).
Les ions issus de la fragmentation d’un peptides sont généralement identifiés avec
la nomenclature mise au point par Roesptorff et Fohlman (Roespstorff P. and Fohlman J.,
1984) et affinée par Johnson et Biemann (Biemann K., 1987; Johnson R.S. et al., 1987). Les
sites de fragmentation d’un peptide peuvent être classés en deux catégories ; le clivage
peut provenir de la liaison peptidique ou être issu de la chaîne latérale de l’acide aminé.
Au niveau de la chaîne peptidique, la fragmentation peut avoir lieu au niveau de
trois types de liaisons décrits dans la Figure 76 et donne six types de fragments désignés
par les termes an, bn, cn lorsque la charge positive est fixée sur le côté N-terminal de la
molécule et xn, yn et zn lorsque la charge est du côté C-terminal. n correspond au nombre
d’acides aminés contenu dans le fragment (Biemann K., 1987).
Figure 76 : Fragmentations possibles des liaisons peptidiques avec la nomenclature des fragments proposée par Biemann (Biemann K., 1987) .
121
Le second type de fragment résulte du clivage de la chaîne latérale entre les
carbones β et γ après une fragmentation homolytique de la liaison peptidique. Ces
fragments sont respectivement désigné par dn et wn lorsque la charge positive est retenue
du côté N-terminal ou le coté C-terminal et vn lorsque le fragment résulte du clivage
complet de la chaîne latérale (Figure 77) (Johnson R.S. et al., 1987).
Figure 77 : Voie de fragmentation donnant les ions caractéristiques des chaînes latérales des acides aminés L’abondance de ce type de fragment est influencée par la localisation de la charge.
Lorsque la charge est peu localisée sur le peptide, les fragments résultant peuvent être de
type N-terminal (bn) ou C-terminal (yn) alors que lorsque la charge est localisée sur une
fonction précise du peptide les ions sont soit de types an, bn et dn si la charge est sur la
fonction N-terminale ou de types yn, vn,wn lorsque la charge est du coté acide carboxylique
(Johnson R.S. et al., 1988).
Afin de déterminer le séquençage de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT, des
études MS/MS ont été réalisées pour la réaction m/z = 809,6 → m/z = 704,5 avec des
énergies de collision variant de 15 eV à 60 eV (Figure 78).
Figure 78 : Chromatogramme MS de la Leu-Enk marquée à 10-5 mol/L avec NDA/MeAT avec sélection d’ion à m/z = 809,5 (Single ion chromatogram SIC à gauche) et chromatogramme de la réaction m/z = 809,6 et m/z = 704,5 avec Ecoll = 30eV (Single reaction chromatogram SRC à droite). Conditions de séparation : Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A.
Rapport m/z Rapport m/z
Abo
ndan
ce
rela
tive
% 100
50
0 0 5 10 15 0 5 10 15
100
50
0
122
Aucune fragmentation n’a été obtenue pour le pic à tr = 9,76 min aux différentes
énergies de collision. En revanche, à tr = 8,80 min, il y a eu fragmentation, le composé à
m/z = 809,6 donne, jusqu’à une énergie de collision de 40 eV, un fragment à m/z = 704,5
correspondant à la perte de la chaîne aminothiol (Figure 79). Ce fragment est aussi obtenu
in-source en mode MS. Le séquençage des acides aminés constituant la Leu-Enk marquée
avec NDA/MeAT est déterminé lors de l’étude MS/MS du fragment à m/z = 704,5 avec Ecoll
=25 eV (Figure 79).
Figure 79 : Spectre MS/MS obtenu pour m/z = 809,5 (à gauche) et m/z = 704,5 (à droite) avec une Ecoll = 25 eV. Conditions de séparation : Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : H2O, O,1% HCOOH/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A.
Le fragment à m/z = 704,5 correspond à la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT qui a
perdu la chaîne latérale du marquage MeAT. Ce fragment est chargé positivement sur le
cycle benzisoindole correspondant à l’entité NDA du marquage. Les fragments issus de
l’ion m/z = 704,5 par ce marquage diffèrent de ceux établi par Biemann et ses
collaborateurs.
Watson et ses collaborateurs ont décrit dans une revue une nomenclature
spécifique aux peptides dérivés et chargés (Roth K.D.W. et al., 1998) à partir de la
nomenclature usuelle en ajoutant une astérisque devant les ions an,bn,… sous-entendant le
marquage du peptide. Les structures des fragments issus de peptides marqués et chargés
et leur mécanisme de fragmentation ont fait l’objet de plusieurs débats, notamment pour
les ions *an et *bn (Figure 80).
Rapport m/z Rapport m/z
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
100
50
0
100
50
0 200 300 400 500 600 700 800 200 300 400 500 600 700 800
123
Figure 80 : Structures possibles des ions *an et *bn (Sadagopan N, 2001).
Sadagopan et Watson levèrent l’ambiguïté sur ces structures en utilisant l’échange
H/D pour déterminer les mécanismes de formation des ions engendrés par la fragmentation
de peptides chargés (Sadagopan N. and Watson J.T., 2001). Ils conclurent que
contrairement à l’ion proposé par Johnson (Johnson R.S. et al., 1988), l’ion *an est issu de
la perte d’un hydrogène de la fonction amide η et non de celui du carbone en β (Figure
80). De même pour les ions *bn l’hydrogène en α est inclus dans la structure et non
l’hydrogène η de la fonction amide. Les ions *bn ainsi ne seraient donc pas des cétènes
issus de la perte de l’hydrogène α mais de type aziridinone ou oxazalone.
Ces types d’ions ont été obtenus à la fois avec les source ESI, MALDI et FAB (fast
atom bombardement), dans tous les cas les résultats étaient comparables avec une
prédominance pour la formation d’ion de type *an lorsque la charge est fixée sur la
fonction N-terminale dérivée par un groupement cationique (Sadagopan N. and Watson
J.T., 2000).
A partir de la nomenclature proposée par Watson et ses collaborateurs, les
fragments obtenus à partir de l’ion à m/z = 704,5 ont été identifiés et sont regroupés dans
le tableau ci-après.
124
Tableau 16 : Fragments obtenus à partir de la Leu-Enk marqués avec NDA et chargé à m/z = 704,5 à tr = 9,04 min.
m/z Formule développée Formule br ute
m/z théorique Type d’ion
704,44 NC
N N N N
HO
O
H O
H O
H O
H O
OH
C40H42N5O7
704,31 704
598,38 NC
N N N NO
H O
H O
H O
H O
OH
C33H36N5O6
598,27 704 - O CH2
591,32 NC
N N N OH
HO
O
H O
H O
H O
C34H31N4O6
591,22 *b4+H2O
545,32 NC
N N N
HO
O
H O
H O
C33H29N404
545,22 *a4
426,23 N
CN N C
HO
O
H O
H O
C25H20N3O4
426,15 *b3
398,21 N
CN N
HO
O
H O
C24H20N3O3
398,15 *a3
369,19 N
CN
HO
O
HC O
C24H17N2O3
369,12 *b2
263,13 NC
N
O
HC O
C16H11N2O2
263,08 *b2-O CH2
Les ions de types *bn sont représentés sous leur forme cétène, cette structure n’est
pas la plus pertinente mais à ce jour il ne nous est pas permis de préciser avec certitude
laquelle des structures aziridinone ou oxazalone convient le mieux. Pour des raisons de
commodités nous avons donc conservé la forme cétène qui reste encore la plus
représentée dans la littérature (Roth K.D.W. et al., 1998; Sadagopan N. and Watson J.T.,
2000).
Contrairement à la Leu-Enk non marquée où les fragments majoritaires sont de
types bn et yn (Cai X. and Dass C., 2005) , les ions obtenus pour la Leu-Enk marquée avec
125
NDA/MeAT sont principalement de types *an et*bn. Les ions yn sont de types C-terminal, or
la charge est piégée sur le coté N-terminal, les ions C-terminal ne peuvent donc pas être
observés.
L’étude des fragments du pic élué à tr = 8,80 min confirme que cette molécule non
observée en détection de fluorescence correspond à la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT.
En revanche aucune fragmentation n’a été observée pour le composé à tr = 9,76 min. Or
dans ces travaux sur la Leu-Enk, Dongré et ses collaborateurs ont démontré que l’énergie
nécessaire à la fragmentation dépend de la taille du peptide, de son nombre de sites
basiques et de la localisation du proton sur ce peptide (Dongré A.R. et al., 1996). Les deux
molécules étudiées possèdent la même masse exacte et le même massif isotopique ; ils
sont donc composés du même nombre d’acides aminés et de sites basiques. En considérant
les trois paramètres, décrits par Dongré, influençant la fragmentation d’un peptide, seule
la localisation de la charge peut être différente pour ces deux composés.
En résumé, pour une molécule de Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT injectée en
LC/MS deux pics sont séparés avec la même masse ; un, observé en détection de
fluorescence et possédant l’ion (M+H)+ (m/z = 809,6) et l’autre, non fluorescent qui
présente des fragments correspondant au séquençage en acides aminés de la Leu-Enk en
plus de l’ion (M+H)+(m/z = 809,6).
A partir de ces résultats nous avons suggéré que la molécule présentait deux
conformations stables. L’éluant acide ioniserait la molécule marquée sur deux sites
différents, qui modifierait sa conformation spatiale. L’hypothèse d’obtenir deux
conformères stables pourrait expliquer la différence d’hydrophobie des molécules et donc
les deux temps de rétention observés sur le chromatogramme en spectrométrie de masse.
II. Modélisation moléculaire
1) Localisation des sites de protonation.
En mode positif, le proton peut se fixer sur plusieurs sites nucléophiles de la Leu-
Enk marquée avec NDA/MeAT : sur la fonction amine du cycle benzisoindole, sur l’amine
tertiaire du nucléophile aminothiol, sur le soufre de la fonction thioether et sur les
différentes fonctions amides de la séquence d’acides aminés (Figure 81).
126
N
S
N
NN
NN
O
H O
H O
H O
H
HO
OH
O
Figure 81 : Formule développée de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT avec les différents sites d’ionisation étudiés en modélisation moléculaire représentés en bleu.
Le coefficient de partage eau-octanol sous sa forme logarithmique (LogP) a été
calculé pour chacune des conformations (Tableau 17), les résultats obtenus démontrent
que deux types de conformations existent, une avec un LogP proche de 4 et l’autre avec
un LogP de 6,6.
Tableau 17 : Résultats de la modélisation moléculaire pour chacun des sites protonés avec leur Log P respectifs obtenus avec le serveur CLogP propre au logiciel Chemdraw Ultra 2006
Sites d’ionisation LogP calculé
Cycle Benzisoindole 4,3 Amine de l’aminothiol 6,6
Thioether 4,0 amide Leu/Phe 4,1 amide Phe/Gly 4,1 amide Gly/Gly 4,1 amide Gly/Tyr 4,6
Comme les fonctions amines sont plus basiques et de ce fait plus facilement
protonables que les fonctions amides et thioethers (Hunter E.P.L. and Lias S.G., 1998),
nous avons focalisé notre étude sur deux sites d’ionisation possibles ; l’amine tertiaire de
la chaîne aminothiol latérale et l’amine incluse dans le cycle benzisoindole (Figure 82).
N
S
Enk
N
H+
H+
Figure 82 : Sites de protonation étudiés pour la suite des travaux
Le LogP est un paramètre d’hydrophobie ; il permet de déterminer la polarité des
molécules. Or en phase inverse les molécules sont séparées en fonction de leur polarité, il
est donc possible de corréler le LogP d’une molécule avec son temps de rétention en HPLC.
127
Ainsi, la conformation avec un LogP de 4,3 correspondant à la Leu-Enk marquée avec
NDA/MeAT et protonée sur l’amine incluse dans le cycle est moins retenue que la
conformation présentant un LogP de 6,6 qui correspond à la protonation sur l’amine
tertiaire du nucléophile aminothiol. Les temps de rétention de 9,04 min et 10,00 min
corrèlent respectivement avec la Leu-Enk marquée et protonée sur le cycle benzisoindole
et sur l’amine de la chaîne latérale aminothiol.
2) Etudes des conformations de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT en fonction du site de protonation.
a) Etude des conformations de la Leu-Enk
Dans la littérature les conformations des enképhalines ont été caractérisées avec
différentes techniques telles que l’infrarouge à transformé de Fourier (FT-IR)(Takekiyo T.
et al., 2005), la spectroscopie par résonnance magnétique nucléaire (RMN) (Marcotte I. et
al., 2004), la modélisation moléculaire (Kritz Z. et al., 2001; Mitsunobu D. et al., 1987;
Vengadesan K. and Gautham N., 2004) et la spectrométrie de masse (Cai X. and Dass C.,
2005; Ustyuzhanin P. et al., 2001).
Trois conformations fondamentales ont été définies en 3D. La première est
linéaire ; elle est stabilisée par des liaisons hydrogènes intermoléculaires. La seconde
conformation est de type β-Turn caractérisée par deux liaisons hydrogènes moléculaires ;
une entre la fonction carboxyle C=O de la Tyr1 et le N-H de la Gly3 et une autre entre le
C=O de la Phe4 et le N-H de la Tyr1. La troisième conformation caractérisée par Takekiyo et
ses collaborateurs (Takekiyo T. et al., 2005) est une structure en hélice 310 avec une liaison
hydrogène entre le C=O de la Tyr1 et le N-H de la Gly3 (Figure 83).
Figure 83 : Conformations de la Leu-Enk non marquée obtenue en FT-IR avec un mélange de solvant H20/DMSO à différentes proportions (100/0 à 0/100) (Takekiyo T. et al., 2005) .
128
b) Conformation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT protonée
sur l’amine cyclique
Lorsque le proton est fixé sur l’amine incluse dans le cycle benzisoindole, la
conformation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT obtenue par modélisation
moléculaire est stabilisée par deux liaisons hydrogènes ; la première entre le C=O de la
Phe4 et le N-H de la Gly² et la seconde entre le C=O de la Gly² et le N-H de la Phe4 (Figure
84).
Figure 84 : Conformation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT protonée sur l’amine du cycle benzisoindole obtenue en modélisation moléculaire avec le logiciel Chemdraw Ultra 3D 2006 champ de force AM1 avec la représentation des liaisons hydrogènes.
Les distances de ces liaisons hydrogènes, mesurées par modélisation moléculaires
sont respectivement de 2,16 Ǻ et 2,29 Ǻ (Tableau 18). Cette conformation est donc de
type β-Turn ; répliée sur elle-même avec deux liaisons hydrogènes.
Tableau 18 : Résultats obtenus par modélisation moléculaire de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT en fonction des conformations.
Conformation a LogP ∆H°f kCal/mol a
D (C=O….H-N) Ǻ a
(2-4) b (4-2) b (1-3) b
β-turn 4,3 -1,98 2,16 2,29 -- 310-Helix 6,6 -18,6 -- -- 2,34 Extended 6,6 -18,6 -- -- --
a) Les calculs sont décrits dans la partie expérimentale. b) (X-Y) correspond à la liaison hydrogène entre le C=O du Xème acide aminé N-terminal et le N-H du
Yème acide aminé N-terminal.
Nous avons établi précédemment que cette conformation avec le proton fixé sur le
cycle benzisoindole possédait un LogP de 4,3 et correspondait au temps de rétention de
9,04 min. A ce temps de rétention, le pic observé en LC/MS n’est pas détecté en
fluorescence.
129
Des études sur la perte de fluorescence des indoles tels que le tryptophane ont
démontré que cette perte était due à un transfert d’hydrogène de la fonction amine vers
le chromophore ce qui entraîne une déficience électronique dans le cycle (Blancafort L. et
al., 2001; Lakowicz J.R., 1999). Dans le cas de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT, la
perte de la fluorescence de cette molécule peut s’expliquer par la délocalisation des
électrons du cycle benzisoindole. En effet, lorsque le proton se fixe sur l’amine lors de
l’élution acide, la molécule perd son aromaticité entraînant une déficience électronique et
n’est donc plus fluorescente.
A tr= 9,04 min, le pic observé en spectrométrie de masse fragmente dans la source
electrospray et donne un ion à m/z = 704,5 correspondant à la perte de la chaîne
aminothiol. Un mécanisme de fragmentation peut dans ce cas être proposé. Dans cette
conformation de type β-Turn, le proton fixé sur l’amine du cycle benzisoindole est proche
du soufre de la fonction thioether (3.0 Ǻ) ; un réarrangement moléculaire entraînant la
perte de l’aminothiol MeAT est donc envisageable (Figure 85).
m/z 704 M = 105
+ HS
NNLeu-Enk
m/z 809
N
S
N
H
Leu-Enk
Figure 85 : Mécanisme de fragmentation proposé entraînant la perte de MeAT dans la source ESI.
c) Conformation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT protonée
sur l’amine de MeAT
Deux conformations avec la même enthalpie de formation ont été déterminées en
modélisation moléculaire si le proton se fixe sur l’amine tertiaire de la chaîne aminothiol
(Tableau 18).
La première est stabilisée par une liaison hydrogène entre le C=O de la Tyr1 et le N-
H de la Gly3, elle est de la forme hélice 310 (Figure 86)
130
Figure 86 : Conformation de type hélice 310 de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et protonée sur l'amine de la chaîne aminothiol obtenue en modélisation moléculaire avec le logiciel Chemdraw Ultra 3D 2006 avec la représentation des liaisons hydrogènes. La deuxième conformation est linéaire sans aucune liaison hydrogène
intramoléculaire (Figure 87).
Figure 87 : Conformation linéaire de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et protonée sur la chaîne MeAT obtenue en modélisation moléculaire avec le logiciel Chemdraw Ultra 3D 2006. Dans ces cas, le proton fixé sur la chaîne aminothiol n’affecte pas l’aromaticité du
cycle benzisoindole ; la molécule est donc fluorescente. De plus, ce proton est trop éloigné
de la fonction thioether, la molécule ne peut donc pas se réarranger et fragmenter. Ces
résultats corrèlent avec ceux obtenus en LC/LIF/MS. En effet lorsque le proton est fixé sur
l’amine de la chaîne aminothiol, le LogP calculée est de 6,6, il correspond au deuxième pic
obtenus en LC/MS (tr = 10,00 min) soit à la molécule à m/z = 809,5 qui ne fragmente pas
et qui est observée avec le détecteur de fluorescence.
En résumé, nous avons proposé que le pic à tr= 9,04 min correspondait à une
conformation de type β−Turn avec le proton fixé sur le cycle benzisoindole facilitant la
perte de la chaîne MeAT et la perte de fluorescence et que le pic à tr = 10,00 min peut
être une conformation linéaire ou une hélice 310. Des études sur l’échange H/D ont été
réalisées afin de confirmer ces résultats et de déterminer la conformation du pic à tr =
10,00 min.
131
III. Etude de l’échange H/D en spectrométrie de masse.
L’échange hydrogène/deutérium (H/D) est une technique très utilisée en
spectrométrie de masse pour déterminer la structure d’une protéine, identifier les sites de
liaisons d’inhibiteurs de peptides ou protéines (Brier S. et al., 2006), étudier leurs
changements de conformation dans différents solvants(Cai X. and Dass C., 2005) , proposer
des mécanismes de fragmentation de métabolites (Liu D.Q. and Hop C.E.C.A., 2005) …
L’échange H/D peut être réalisé soit en utilisant un solvant deutéré lors de l’élution
HPLC (Lacroix M. et al., 2007) ou de l’infusion avec une pompe à seringue (Cai X. and Dass
C., 2005), soit avec un gaz isotopique (ND3 ou CH3OD) directement introduit dans la source
d’ionisation (Ustyuzhanin P. et al., 2001). Le taux d’échange des hydrogènes labiles
dépend de l’environnement interne ou externe de la molécule. Ainsi les hydrogènes
exposés vers le solvant ou le gaz deutéré peuvent être très rapidement échangés. La
cinétique de l’échange est représentée par l’équation suivante :
kch = kint,A [ H
+] + kint,B [OH-] + kint,e [H2O] kch correspond au taux d’échange H/D et kint,A , kint,B et kint,W sont les constantes de
second ordre représentant respectivement les réactions intrinsèques de catalyse acide,
basique et de l’eau. Cet échange dépend du pH ; la cinétique de l’échange atteint son
minimum lorsque le pH est de l’ordre de 2-3 à température ambiante (Englander S.W.,
2006).
A l’inverse, lorsque les hydrogènes des liaisons peptidiques sont impliqués dans des
liaisons intramoléculaires ou protégés du solvant le taux d’échange est très lent. Il existe
dans ce cas une compétition entre la cinétique de l’échange kch et la cinétique du
repliement de la molécule kcl avec cl pour l’anglais « reclosing ». Lorsque le repliement est
plus rapide que l’échange (kcl > kch), l’échange n’a lieu qu’au bout de plusieurs ouvertures
et fermetures successives de la molécule. La réaction d’ouverture, représenté par la
constante kop avec op le terme « opening », entre alors dans l’équation de la cinétique
d’échange expérimentale (Kex) suivante :
Kex = kop kch / (kop + kcl + kch) ≈ Kopkch
L’approximation (kop/kcl = Kop < 1) permet de corréler l’énergie de l’ouverture de la
molécule ∆Gop avec le taux d’échange H/D expérimental (kex) et le taux d’échange
théorique (kch) selon la formule :
∆Gop = -RT ln Kop = -RT ln (kex/kch)
132
La cinétique de l’échange des amides protégés est limitée par les paramètres
thermodynamiques et cinétiques de la réaction de transition permettant l’ouverture de la
molécule et exposant les hydrogènes vers le solvant(Englander S.W., 2006). Or ces
paramètres d’ouverture des peptides dépendent majoritairement du pH et de la
température. A pH basique et haute température les hydrogènes protégés peuvent être
échangés rapidement et la cinétique de l’échange est très lente à pH acide et basse
température.
Cai et ses collaborateurs ont caractérisé les structures des enképhalines dans
l’oxyde de deutérium (D2O) et le trifluoroéthanol (TFE). Ils ont observé que le nombre
d’hydrogènes échangés dans ces peptides dépendait du solvant utilisé. Ils ont aussi
démontré que quel que soit le solvant utilisé, le taux d’échange est très rapide (15
secondes) pour ces peptides et que le nombre d’hydrogène échangé dans la molécule
n’augmentait pas au cours du temps (Cai X. and Dass C., 2005).
Afin de confirmer l’hypothèse que les deux pics, observés en spectrométrie de
masse, correspondent à deux conformations différentes de la Leu-Enk et de déterminer ces
conformations, des études sur l’échange H/D ont été réalisées sur la Leu-Enk marquée
avec NDA/MeAT. L’eau et l’acide formique de l’éluant ont été remplacés par de l’oxyde de
deutérium (D2O) et de l’acide formique d2 (DCOOD).
1) Etude MS de l’échange H/D
La Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT possèdent six protons échangeables dans sa
structure plus un proton échangeable et ionisant lorsque la molécule est éluée avec D2O,
0,1% DCOOD (Figure 88).
N
S
N
NN
NN
O
H O
H O
H O
H
HO
OH
O
+ H+
Figure 88: Représentation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT et de ses protons labiles (en rouge)
133
Les spectres de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT obtenus avec
l’élution deutérée présentent des massifs isotopiques différents pour chaque pic
chromatographique.
Ces études H/D ont été répétées trois fois et les abondances relatives de chaque pic
du spectre de masse avec leurs coefficients de variation sont répertoriées dans le Tableau
19.
Tableau 19 : Abondance relative de chaque pic des spectres de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT obtenus avec l'élution isotopique à tr= 9,04 min et tr = 10,00 min. Conditions de séparation : Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : D2O, O,1% DCOOD/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A. Détection spectrométrie de masse mode ESI+.
Tr = 9.04 min Tr = 10.00 min
m/z Abondance relative %
C V % (n = 3)
Abondance relative %
C V % (n = 3)
812 23.7 3.5 --- --- 813 57.9 6.8 6.6 1.3 814 100.0 --- 27.2 2.7 815 73.7 5.7 69.7 3.5 816 32.0 3.0 100.0 --- 817 14.5 2.3 74.6 4.6 818 --- --- 36.8 4.8 819 --- --- 13.2 1.3 820 --- --- 3.1 0.8
2) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 9,04 min
A tr = 9,04 min le spectre de masse obtenu présente un pic majoritaire (AR = 100%)
à m/z = 814,5 ; cinq protons sur les sept possibles ont donc été échangés. Cette structure
contient deux liaisons intramoléculaires ce qui corrèle avec la conformation β-Turn établie
en modélisation moléculaire où deux liaisons hydrogènes sont impliquées (Figure 89).
134
Figure 89 : Spectre de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr =9,04 min obtenus avec la phase mobile polaire D2O, O,1% DCOOD . Conditions de séparation : Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : D2O, O,1% DCOOD/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A. Détection spectrométrie de masse mode ESI+.
De plus, le spectre de masse présente un ion à m/z = 708,5 correspondant au
fragment spécifique ayant perdu la chaîne aminothiol. Dans ce fragment quatre protons
ont été échangés ; la perte de la molécule neutre contient un atome de deutérium qui
correspond au proton de la fonction thiol de la molécule perdue. Ces résultats sont en
accord avec le mécanisme de fragmentation proposé dans la Figure 85.
3) Etude de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 10,00 min
Le second pic chromatographique à tr = 10,00 min présente un pic majoritaire (AR =
100 %) à m/z = 816,5 sur le spectre de masse correspondant. L’ensemble des 7 protons
labiles de la molécule a été échangé (Figure 90).
Rapport m/z
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
135
Figure 90 : Spectre de masse de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT à tr = 10,00 min obtenu avec avec la phase mobile polaire D2O, O,1% DCOOD. Conditions de séparation : Colonne X-Bridge Shield RP18 2.1 x 100 mm, 3.5 µm. Chaîne HPLC Dionex P680, Vinj =10 µL, D= 0,3 mL/min, Elution : A : D2O, O,1% DCOOD/ B : AcN t0 = 80 % A ; t2 = 80 % A ; t20 = 20 % A. Détection spectrométrie de masse mode ESI+. A tr = 10,00 min la molécule adopte une conformation linéaire et non la structure
hélice 310 stabilisée par une liaison hydrogène. Il a été démontré que cette conformation
hélicoïdale n’est présente que dans les solvants aqueux et n’a pas été déterminée dans un
mélange de solvants aqueux et organiques (Takekiyo T. et al., 2005).
Les études de modélisation moléculaires associées aux étude de l’échange H/D en
spectrométrie de masse ont permis de confirmer l’hypothèse émise pour interpréter les
deux pics de même rapport m/z = 809,6 correspondant à la Leu-Enk marquée avec
NDA/MeAT pour une molécule injectée. La Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT s’ionise lors
de l’élution acide sur deux sites de protonation, entraînant deux conformations stables
avec des propriétés d’hydrophobie distinctes et donc séparable en HPLC.
Ces travaux ont fait l’objet d’une publication (Lacroix M. et al., 2007).
Rapport m/z
Abo
ndan
ce r
elat
ive
%
136
B. Etude quantitative des relations structure-temps de rétention (QSRR).
Dans le chapitre 2, nous avons étudié la séparation des acides aminés et amines
biogènes marquées avec NDA/CN- sur plusieurs colonnes pour optimiser la séparation. Lors
de ces séparations des inversions au niveau des temps de rétention ont été observées pour
les dérivés benzisoindoles d’Ala, GABA et Tyr. La rétention sur chacune de ces phases
stationnaires ne fait donc pas intervenir les mêmes paramètres.
Nous avons dans un premier temps cherché à déterminer les paramètres des
molécules mis en jeu lors de l’élution sur chacune des phases stationnaires puis dans un
second temps établi une corrélation entre les temps de rétention et les propriétés des
molécules pour chacune des colonnes. Ces études théoriques ont été réalisées par une
étude QSRR (Quantitative Structure-Retention times Relationships).
I. Principe des études QSAR, QSPR, QSRR
Les études QSRR sont des dérivés d’études QSAR (Quantitative Structure-Activity
Relationships) et QSPR (Quantitative Structure-Property Relationships). Le principe de ces
études est d’établir une corrélation entre des données structurales de la molécule et leur
activité biologique dans le cas d’études QSAR ou leur propriété physico-chimique dans le
cas d’une étude QSPR.
Hansch et Fujita établirent, en 1964, les premières corrélations entre les propriétés
physico-chimiques (logP, pKa, paramètres stériques et électroniques) et l’activité
biologique (activité enzymatiques, pharmacologiques) (Hansch C. and Fujita T., 1964). En
1971, ils réalisent une étude de relation structure-activité sur différentes familles
d’antifongiques : benzoquinones, sels d’alkylpyridinium, imidazoles et phénols. Ils
observent que quels que soient la famille et le champignon utilisé, l’activité antifongique
dépend du logP (coefficient de partage eau-octanol) expérimental ou calculé (Hansch C.
and Lien E.J., 1971).
Ces études ont été extrapolées aux techniques séparatives en corrélant les
propriétés physico-chimiques des analytes avec les temps de rétention obtenus
expérimentalement (Tham S.Y. and Agatonovic-Kustrin S., 2002): c’est l’étude quantitative
des relations structure-temps de rétention noté QSRR.
Toutes ces études s’appuient sur le concept postulant que des structures similaires
ont des propriétés similaires. Ce type d’étude permet d’une part, d’expliquer les
137
paramètres moléculaires impliqués dans l’activité biologique, une propriété physico-
chimique ou l’élution sur une phase stationnaire et de prévoir d’autre part, l’influence de
certaines modifications structurales dans l’activité biologique, une propriété physico-
chimique ou la rétention d’un composé sur une colonne (Figure 91).
Figure 91 : Modèle d'étude quantitative de relations structure activité, propriété ou temps de rétention (QSAR, QSPR, QSRR).
Les descripteurs moléculaires sont généralement classés en trois catégories ; les
descripteurs physicochimiques, topologiques et électroniques. Ces descripteurs sont
caractéristiques de la structure bidimensionnelle ou tridimensionnelle de la molécule.
L’étude QSAR-2D permet de rationaliser une propriété avec des descripteurs
calculés à partir de la formule développée avec une équation de régression linéaire. Les
études QSAR-3D, décrites pour la première fois par Cramer et ses collaborateurs (Cramer
R.D. et al., 1988), permettent d’établir une relation entre une propriété et des
descripteurs calculés à partir d’une conformation spatiale de la molécule définie.
II. Les descripteurs moléculaires
1) Les descripteurs physico-chimiques
Les descripteurs physico-chimiques caractérisent généralement la structure
bidimensionnelle de la molécule.
Parmi ces descripteurs, certains reflètent la composition moléculaire du composé,
soit le nombre et le type d’atomes et de liaisons présents dans la molécule, son nombre de
cycle, son poids moléculaire… : ce sont les descripteurs constitutionnels (Bosque R. et al.,
Panel de composés
Données mesurées d’activité biologique, de propriété physico-
chimique ou d’un temps de rétention (Y)
Descripteurs moléculaires (X)
QSAR QSPR QSRR
Y = f(X)
Prévision Interprétation
138
2003). Certains représentent la surface accessible au solvant (nommée « Connolly
Accessible Surface »), le volume de solvant couvert par cette surface (« Connolly Solvent-
Excluded Volume ») (Connolly M.L., 1985), le caractère hydrophile ou lipophile de la
molécule généralement évalué à partir du coefficient de partage octanol/eau représenté
par le logP (Viswanadhan V.N. et al., 1989).
Ces descripteurs ne fournissent par assez d’information sur la structure des
molécules pour l’élaboration de modèles prédictifs plus complexes ; il est nécessaire
d’ajouter d’autres types de descripteurs.
2) Les descripteurs électroniques
Ces descripteurs caractérisent la distribution de charge des molécules (polarité des
molécules) mais aussi les paramètres de la chimie quantique : le moment dipolaire, les
énergies HOMO (Orbitale moléculaire occupée de plus haute énergie) et LUMO (Orbitale
moléculaire non-occupée de plus basse énergie) (Bosque R. et al., 2003).
3) Les descripteurs topologiques
Ces descripteurs décrivent les connectivités atomiques dans la molécule. Ils sont
pour la plupart représentés par des indices comme ceux de Balaban, Wiener… et sont issus
de la théorie des graphes. Cette théorie a été développée par Euler en 1736 avec les sept
ponts de Königsberg. Un graphe est un ensemble de point, certains reliés par des lignes ; il
permet de représenter la topologie de la molécules sans se soucier de la géométrie
spatiale exacte de cette dernière (Schultz H.P., 1989).
a) Principe de la théorie des graphes
Cette théorie est fondée à partir de quelques lois simples : deux points adjacents
sont reliés par des lignes et deux lignes avec un point commun sont adjacentes. L’ordre ou
le degré d’un point est le nombre de lignes reliées à ce point. Un pas est un enchaînement
de points et de lignes adjacentes débutant par un point et se terminant par un point. Un
chemin est un pas dans lequel aucun point n’est utilisé plus d’une fois.
D’un point de vue moléculaire, un point représente un atome et une ligne une
liaison covalente. Les chemins sont caractéristiques de l’architecture de l’ensemble des
atomes constituants la molécule. Les atomes d’hydrogène sont exclus du graphe pour
simplifier les calculs.
139
Une molécule de 2,3-diméthylpentane, par exemple, peut être représentée à partir
de sa formule développée soit par un modèle tridimensionnel soit par un graphe lié (Figure
92).
Figure 92 : Formule développée, modélisation moléculaire et graphe lié du 2,3-diméthylpentane.
A partir de ce graphe lié, une matrice de connectivité notée C et une matrice de
distance D peuvent être établies. Les éléments cij de la matrice C prennent la valeur de 1
si les points i et j sont adjacents et les éléments dij de la matrice D sont égaux à la
longueur du plus petit chemin joignant i et j. Les matrices de connectivité et de distance
du 2,3-diméthylpentane sont représentées sur la figure ci-dessous.
Figure 93 : Matrice de connectivité C et de distance D calculée à partir du graphe lié du 2,3-diméthylpentane
Ces matrices permettent de calculer de nombreux indices : Balaban, Wiener … mais
aussi le diamètre des molécules, son coefficient de forme (shape coefficient)…
b) Les indices topologiques
Dans ce paragraphe, ne seront décrits que les paramètres topologiques utilisés dans
nos études QSRR soit l’indice de Wiener, le diamètre, le coefficient de forme, la surface
polaire (Polarity surface area) et la somme des degrés de valence.
- L’indice de Wiener noté W, proposé en 1947 par Wiener (Wiener H., 1947),
caractérise la ramification et le volume moléculaire. Il correspond à la somme des
140
distances topologiques entre toutes les paires d’atomes de la molécule. Il est
calculé à partir de l’équation suivante :
- Le diamètre de la molécule notée d, correspond au plus court chemin entre les
sommets les plus distants d’un graphe lié.
- Le coefficient de forme (shape coefficient) caractérise la forme globale de la
molécule. Il est calculé à partir du carré de la matrice des distances D² (Randic M.,
1995).
- La surface polaire (polar surface area) notée PSA définie la superficie des atomes
polaires O, N, N-H et O-H constituant la molécule (Saunders R.A. and Platts J.A.,
2004).
- La somme des degrés de valence (sum of valence degree) notée SOVD est la somme
de tous les degrés de valence de la molécule représentée par un graphe, le degré
d’un point correspondant au nombre de ligne se terminant par ce point. Ce
paramètre dépend donc principalement de la ramification de la molécule (Jaiswal
D. et al., 2006).
Les études QSRR, établissant les corrélations entre les descripteurs moléculaires et
les temps de rétention des molécules, sont réalisées avec des réseaux de neurones
artificiels.
III. Les réseaux de neurones artificiels.
1) Historique
L’origine des réseaux de neurones peut être attribuée à McCulloh et Pitts en 1943
(McCulloh W.S. and Pitts W., 1943); ils proposent un modèle mathématique décrivant le
fonctionnement d’un neurone biologique. Rosenblatt en 1958 décrit le premier réseau de
neurone artificiel, le perceptron, constitué d’une couche de neurones d’entrée et d’une
couche de neurones de sortie (Rosenblatt F., 1958). Le perceptron est le premier réseau
artificiel capable d’apprendre par l’expérience. Minsky et Papert démontrent les limites de
ces réseaux de neurones à une seule couche en 1969(Minky M. and Papert S., 1969). Dans
les années 80, Hopfield suscite à nouveau l’intérêt des scientifiques en proposant des
neurones associatifs(Hopfield J.J., 1982).
141
2) Principe
Un réseau de neurones est composé d’unités de calculs disposées en couches et
reliées entre elles pour échanger de l’information (Hinton G., 1992). Trois types de
couches constituent le réseau ; les couches d’entrée, les couches cachées et les couches
de sortie. L’information circule des neurones d’entrée vers les neurones de sortie sans
retour arrière possible via des fonctions de transfert. Ces fonctions de transfert existent
essentiellement sous trois formes : les fonctions linéaires, les fonctions seuils et les
fonctions sigmoïdes. Ces dernières sont généralement les plus utilisées car elles
représentent un bon compromis entre les fonctions seuils et linéaires (Figure 94).
Figure 94 : Fonction de transfert (a) seuil, (b) linéaire et (c) sigmoïde du neurone
Dans notre cas d’étude, les couches d’entrée sont les descripteurs moléculaires et
les couches de sortie sont les temps de rétention de la molécule d’analyse. La Figure 95
schématise l’organisation d’un réseau de neurones artificiels.
Figure 95 : Architecture d'un réseau de neurones artificiel
Le premier travail de ce système consiste à déterminer les valeurs des poids de
chaque connexion. Pour se faire des cycles de présentation de données sont établis via un
142
algorithme d’apprentissage. Celui utilisé pour la suite de ces travaux est un algorithme de
rétropropagation.
3) Algorithme de rétropropagation
Le principe de l’algorithme de rétropropagation consiste à minimiser la différence
entre la sortie calculée et la sortie fournie par l’apprentissage soit les valeurs
expérimentales. Défini en deux étapes, l’algorithme propage, dans un premier temps, les
entrées (descripteurs moléculaires) vers l’avant jusqu’à obtenir une sortie (les temps de
rétention) calculée par le réseau. La sortie calculée est dans un second temps comparée
avec la valeur expérimentale. L’erreur obtenue par cette comparaison est ensuite
rétropropagée vers les couches d’entrée en modifiant le poids des neurones. Ce processus
est ainsi répété jusqu’à obtenir une erreur de sortie négligeable. Mathématiquement cet
algorithme est représenté par les équations ci-dessous.
Soit un neurone j d’une couche de sortie et i de la couche précédente. L’activité
totale du neurone j est calculée suivant :
Avec yi l’activité du neurone j de la couche supérieure et cij le coefficient
synaptique, ou poids de la liaison entre j et i.
La valeur yj est calculée en utilisant une fonction de transfert sigmoïde exponentielle :
Lorsque les activités de tous les neurones de sortie sont déterminées, le coût J est
calculé. Il correspond à l’erreur entre la valeur de sortie calculée et celle donnée dans la
série d’apprentissage.
Où yj représente l’activité du neurone de sortie j et dj la valeur fournie dans la
série d’apprentissage. Cette fonction coût varie quand la valeur de sortie est modifiée :
143
La fonction coût varie quand la valeur d’entrée est modifiée :
La fonction coût varie quand la valeur d’un coefficient synaptique est modifiée :
La fonction coût varie quand la valeur de l’activité d’un neurone de la couche
précédente est modifiée :
L’apprentissage continue jusqu’à ce que l’écart entre la valeur calculée et la valeur
donnée dans la série d’apprentissage soit acceptable. Le système a alors convergé.
IV. Méthode d’élaboration d’un réseau de neurone
Pour réaliser un réseau de neurone, il est nécessaire de modéliser chacune des
molécules dans un premier temps et de déterminer leurs paramètres.
Il faut dans un second temps calculer le poids des connexions liées à ces
descripteurs afin de déterminer ceux qui sont essentiels. Ce calcul est effectué en reliant
directement les neurones d’entrée correspondant aux descripteurs moléculaires avec les
neurones de sortie, dans notre cas les temps de rétention obtenus expérimentalement.
Chaque descripteur est alors affecté d’un poids décrivant son importance dans la
rétention.
Ensuite il faut construire le réseau prédictif en ne retenant que les descripteurs
essentiels qui ne sont pas corrélés entre eux.
Une fois élaboré, il faut estimer la qualité de ce réseau. Pour cela, on utilise le
système de validation croisée. Le temps de rétention de chacune des molécules est estimé
en éjectant les paramètres de la molécule d’intérêt du réseau d’apprentissage. Le réseau
est validé lorsque les temps de rétention expérimentaux et ceux obtenus par le calcul
concordent.
144
V. Résultats
Les molécules ont été modélisées avec le logiciel ChemOffice Ultra 2006. Les
molécules en 3D ont été minimisées avec le serveur MOPAC en utilisant la méthode de
calcul semi-empirique AM1 et 31 descripteurs moléculaires ont été calculés avec les
différents serveurs du logiciel Chem Office 3D Ultra 2006.
Les réseaux de neurones ont été construits à l’aide du logiciel SNNS version 4.2
(Stuttgart Neural Network Simulator) élaboré par Zell et ses collaborateurs (Zell A. et al.,
2006).
1) Détermination des descripteurs essentiels
Le poids des 31 descripteurs est mesuré en construisant un réseau de neurone (RN1)
contenant tous les descripteurs dans les couches d’entrées et le temps de rétention (tr) de
chaque dérivé benzisoindole dans la couche de sortie. Les neurones d’entrée sont donc
directement reliés au neurone de sortie correspondant au tr de chaque molécule. Ces
études ont été réalisées avec plusieurs cycles d’apprentissage afin d’optimiser le nombre
de descripteurs de forts poids. Les descripteurs moléculaires présentant une influence sur
la sortie supérieure à 1 pour 10000 cycles d’apprentissage sont regroupés avec leurs poids
respectifs dans le Tableau 20 A), B), C) et D) pour chaque colonne chromatographique.
Tableau 20 : Descripteurs sélectionnés pour l'étude QSRR avec leurs poids respectifs en fonction du nombre de cycle d'apprentissage. A) Colonne X-Terra 250 X 4,6 mm ; 5 µm. B) A : Résultats pour la colonne X-Terra (250 x 4,6 mm ; 5 µm)
Paramètres Poids 1000 cycles
Poids 5000 cycles
Poids 10000 cycles
Connolly Solvent-Excluded Volume
1 2,9 3,9
Coefficient de forme 1 2,7 3,5 Somme des degrés de valence
0,9 2,3 3,1
Log P 1,6 2,2 2,8 Diamètre 0,9 1,7 1,9 Indice de Wiener 0,5 1,2 1,6 Longueur de dipôle 0,4 1 1
Energie LUMO 0,2 1 1
145
B : Résultats pour la colonne X-Terra (150 x 2,1 mm ; 3,5 µm)
Paramètres Poids 1000 cycles
Poids 5000 cycles
Poids 10000 cycles
Connolly Solvent-Excluded Volume
0,9 2,7 3,7
Log P 2,8 3,1 3 Somme des degrés de valence 0,9 1,9 2,7
Coefficient de forme 0,9 1,8 2,3
Surface polaire 1,6 2,1 2,2
Diamètre 0,8 1,7 1,7
Ovalité 0,5 1 1,2
∆Hf° 0,8 1,2 1,1
C : Résultats pour la colonne monolithe RP18e β-test (3 x 100 mm)
Paramètres Poids 1000 cycles
Poids 5000 cycles
Poids 10000 cycles
Connolly Solvent-Excluded Volume
0,9 2,8 4
Coefficient de forme 1 2,3 3,2 Somme des degrés de valence
0,8 2 3
Log P 1,7 2 2,7 Diamètre 1,4 1,7 1,7 Longueur de dipôle 0,6 1,2 1,4
Indice de Wiener 0,5 1 1,3
Energie LUMO 0,2 0,9 1,1
D : Résultats pour la colonne X-Bridge Shield RP18 (2.1 x 100 mm, 3.5 µm)
Paramètre Poids 1000 cycles
Poids 5000 cycles
Poids 10000 cycles
LogP 2,8 3,4 3,5 Connolly Solvent-Excluded Volume
0,9 2,4 3,3
Somme des degrés de valence
0,7 1,9 2,8
Coefficient de forme 1,1 2,1 2,5 Surface polaire 1,3 2 2,3 Diamètre 1 1,9 1,8 Energie LUMO 0,3 1,4 1,7
∆Hf° 1 1,3 1,4
Ovalité 0,4 0,9 1,1
146
Le LogP, correspondant au logarithme du coefficient de partage eau/octanol,
apparaît comme le paramètre essentiel pour toutes les colonnes dès 1000 cycles. Avec
10000 cycles d’apprentissage certains descripteurs possèdent des poids supérieurs à LogP
avec des amplitudes plus élevées. Les colonnes peuvent donc être différenciées entre
elles.
La colonne X-Terra (250 x 4,6 mm ; 5 µm) et la colonne monolithe β-test RP18e (100
x 3 mm) possèdent les mêmes descripteurs de plus forts poids avec des valeurs très
proches. Le poids du paramètre LogP est de l’ordre de 2,7/2,8 pour ces deux colonnes ;
c’est le quatrième paramètre essentiel pour 10000 cycles d’apprentissage.
La colonne X-Terra (150 x 2,1 mm ; 3,5 µm) présente quelques différences ; le LogP
apparaît en deuxième position avec une valeur de poids supérieure (2,7).
Pour la colonne X-Bridge Shield RP18 (2.1 x 100 mm, 3.5 µm), le poids du paramètre
LogP est le plus élevé (3,5) ; il apparaît en première position.
Par comparaison avec les phases stationnaires, la colonne X-Bridge Shield RP18 (2.1
x 100 mm, 3.5 µm) permet une séparation dépendant plus de l’hydrophobie des composés.
Rappelons que cette colonne est équipée de la technologie BEH : elle possède des ponts
éthyliques entre ces fonctions silanols. Ces ponts CH2-CH2 réduisent le nombre de fonctions
silanols libres et donc les interactions parasites entre l’analyte et la phase stationnaire.
Le LogP est généralement le paramètre le plus utilisé pour interpréter les
séparations en HPLC en phase inverse (Tham S.Y. and Agatonovic-Kustrin S., 2002). Les
études QSRR que nous avons réalisées, démontrent que ce paramètre de lipophilie n’est
pas le seul impliqué dans la séparation chromatographique. D’autres descripteurs physico-
chimiques caractérisent les différents temps de rétention :
- L’ovalité O calculée à partir de la surface moléculaire S et le volume moléculaire V
de la façon suivante : O = S/4π(3V/4π)2/3.
- Le volume couvert par la surface accessible au solvant, ce paramètre mesuré par la
méthode de Connolly (Connolly M.L., 1985) définit le volume dans l’espace de la
molécule dans lequel les molécules de solvant modélisées en sphères sont exclues.
Les descripteurs physico-chimiques seuls ne sont pas suffisants pour corréler temps de
rétention et propriétés physico-chimiques, des descripteurs électroniques tels que la
longueur de dipôle et l’énergie LUMO ont un poids sur la séparation avec les différentes
phases stationnaires. L’enthalpie de formation ∆Hf° de la molécule est aussi impliquée
dans ces séparations.
Les paramètres topologiques sont toutefois les plus nombreux et ceux présentant de
forts poids pour corréler les temps de rétention avec les propriétés physico-chimiques des
molécules.
147
En conclusion, la séparation chromatographique sur la phase stationnaire X-Bridge
Shield RP18 (2.1 x 100 mm, 3.5 µm) dépend majoritairement de la lipophilie (LogP) des
molécules, de leurs formes globales (coefficient de forme), de leurs ramifications et leurs
nombres d’hétéroatomes (Somme des degrés de valence) et du volume de solvant exclu
des molécules (Connolly solvent-excluded volume). Ces descripteurs sont comparables à
ceux déterminés dans la littérature (Tham S.Y. and Agatonovic-Kustrin S., 2002) pour les
études QSRR d’acides aminés marqués (LogP et somme des degrés de valence).
Les inversions d’élution observées pour l’ALA, le GABA et la Tyr sur les colonnes X-
Terra (250 x 4,6 mm ; 5 µm) et monolithe β-test RP18e (100 x 3 mm) ne peuvent cependant
pas être interprétées avec les descripteurs moléculaires de forts poids de ces composés.
2) Construction des réseaux de neurones prédictifs
A partir de ces résultats, un réseau de neurone prédictif est construit pour chaque
colonne avec les descripteurs cités dans les tableaux précédents afin d’établir une relation
linéaire entre le temps de rétention expérimental et le temps de rétention calculé par ces
réseaux. Le nombre de neurones dans la couche d’entrée, la couche cachée et la couche
de sortie est répertorié pour chaque réseau dans le tableau ci-dessous :
Tableau 21 : Descriptif des réseaux de neurones construits pour chaque colonne chromatographique
Nom Colonne correspondante Nombre de neurones dans :
la couche d’entrée
la couche cachée
la couche de sortie
RN2 X-Terra (250 x 4,6 mm ; 5 µm) 8 cf tableau 5A 4 1 RN3 X-Terra (150 x 2,1 mm ; 3,5 µm) 8 cf tableau 5B 4 1 RN4 Monolithe RP18e (100 x 3 mm) 8 cf tableau 5C 4 1 RN5 X-Bridge Shield (100 x 2,1 mm, 3,5 µm) 9 cf tableau 5D 5 1
Le nombre de neurones dans la couche cachée est choisi arbitrairement ; il
correspond à la moitié supérieure du nombre de neurone de la couche d’entrée. Le calcul
du temps de rétention à partir de ces réseaux de neurones est réalisé avec 2000 cycles
d’apprentissage.
La méthode de validation croisée est utilisée pour calculer les temps de rétention
de chaque molécule avec le réseau de neurone correspondant à chacune des phases
stationnaires (Tableau 22).
148
Tableau 22 : Temps de rétention expérimentaux et calculés avec les réseaux de neurones RN2 à RN5 avec leurs écarts respectifs pour chaque colonne chromatographique.
Acides Aminés
Colonne X-Terra 250 x 4,6 mm 5 µm (RN2)
Colonne X-Terra 150 x 2,1 mm 3,5 µm (RN3)
Colonne Monolithe RP18e
100 x 3 mm (RN4)
Colonne X-Bridge Shield 100 x 2,1 mm
3,5 µm (RN5) Trexp min
Trcalc min
I∆trI min
Trexp min
Trcalc min
I∆trI min
Trexp min
Trcalc min
I∆trI min
Trexp min
Trcalc min
I∆trI min
His 3,95 9,05 5,10 1,69 6,41 4,72 1,32 2,90 1,58 1,31 5,65 4,34
Arg 1 5,25 5,77 0,52 2,02 1,44 0,58 1,99 2,14 0,15 1,69 1,8 0,11
Arg 2 5,25 7,49 2,24 2,02 0,75 1,27 1,99 2,55 0,56 1,69 1,26 0,43
Gln 6,90 4,28 2,62 3,47 3,19 0,28 2,36 1,89 0,47 4,63 3,31 1,32
Asn 6,90 5,51 1,39 3,73 2,82 0,91 2,50 1,44 1,06 5,02 2,78 2,24
Ser 10,38 11,49 1,11 5,16 4,67 0,49 3,57 4,06 0,49 6,75 4,61 2,14
Asp 11,18 10,09 1,09 5,65 7,29 1,64 3,91 3,51 0,40 7,29 5,61 1,68
Glu 11,99 9,98 2,01 6,67 6,80 0,13 4,47 3,70 0,77 7,94 4,91 3,03
Thr 14,15 14,63 0,48 7,46 6,80 0,66 5,64 5,55 0,09 8,81 5,29 3,52
Gly 16,35 16,27 0,07 8,54 11,20 2,66 6,48 6,60 0,13 9,50 9,19 0,31
Nor 17,06 21,82 4,76 12,53 10,01 2,52 7,20 8,83 1,64 10,23 7,21 3,02
Ala 20,53 22,16 1,63 13,94 12,93 1,01 8,68 9,18 0,50 11,49 10,89 0,60
GABA 20,53 20,56 0,03 13,94 16,66 2,72 8,68 8,43 0,25 11,81 13,6 1,79
Tyr 21,74 26,87 5,14 15,26 18,02 2,77 8,09 11,96 3,88 12,29 13,44 1,15
Dop 26,03 29,07 3,04 17,35 20,03 2,68 12,26 12,45 0,19 14,56 15,09 0,53
Met 27,55 19,65 7,90 18,98 15,51 3,47 11,14 8,56 2,58 15,38 12,03 3,35
Val 29,42 29,63 0,21 20,24 19,63 0,61 12,49 12,76 0,27 16,42 15,82 0,60
Try 29,71 19,88 9,83 21,20 19,02 2,18 12,82 8,07 4,75 16,65 14,38 2,27
Phe 30,22 29,71 0,51 21,20 20,16 1,04 13,69 12,91 0,78 17,29 15,8 1,49
Leu 32,44 30,94 1,50 22,70 21,06 1,64 14,68 13,51 1,17 18,54 17,05 1,49
Ile 32,96 31,11 1,85 22,70 21,19 1,51 14,87 13,35 1,52 18,63 17,11 1,52
Les droites de régression linéaire entre le temps de rétention expérimental et le
temps de rétention calculé ont été tracées pour chaque réseau de neurones (Figure 96 à
Figure 99).
149
Figure 96: Droite de régression linéaire entre les temps de rétention calculés par RN2 et les temps de rétention expérimentaux obtenus sur la colonne X-Terra (250 x 4,6 mm ; 5 µm).
Figure 97 : Droite de régression linéaire entre les temps de rétention calculés par RN3 et les temps de rétention expérimentaux obtenus sur la colonne X-Terra (150 x 2,1 mm ; 3,5 µm).
Figure 98 : Droite de régression linéaire entre les temps de rétention calculés par RN4 et les temps de rétention expérimentaux obtenus sur la colonne monolithe β-test RP18e (100 x 3 mm).
Tr expérimental (min)
Tr
calc
ulé
(min
)
Tr expérimental (min)
Tr
calc
ulé
(min
)
Tr expérimental (min)
Tr
calc
ulé
(min
)
35
30
25
20
15
10
5
0 0 5 10 15 20 25 30 35
16
14
12
10
8
6
4
2
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16
25
20
15
10
5
0 0 5 10 15 20 25
150
Figure 99 : Droite de régression linéaire entre les temps de rétention calculés par RN5 et les temps de rétention expérimentaux obtenus sur la colonne X-Bridge Shield (100 x 2,1 mm, 3,5 µm).
Les corrélations entre les temps de rétention expérimentaux et les temps de
rétention calculés par les réseaux de neurones RN2 à RN5 sont satisfaisantes pour chacune
des colonnes. Les coefficients directeurs a, de détermination R² et l’ordonnée à l’origine b
sont répertoriés dans le Tableau 23.
Tableau 23 : Résultats des corrélations des réseaux de neurones pour chaque colonne chromatographique.
Nom Colonne correspondante a b R² RN2 X-Terra (250 x 4,6 mm ;5 µm) 0,8709 2,1214 0,8614 RN3 X-Terra (150 x 2,1 mm ;3,5 µm) 0,8605 0,8279 0,9239 RN4 Monolithe RP18e (100 x 3 mm) 0,9102 0,9661 0,8715 RN5 X-Bridge Shield (100 x 2,1 mm, 3,5 µm) 0,9141 -0,1050 0,8849
Les coefficients de détermination R² sont inférieurs à ceux établis dans la
littérature pour des acides aminés marqués avec du phenylthiocarbamyle (PTC) et séparés
dans des conditions d’élution isocratique (R² > 0,97) (Tham S.Y. and Agatonovic-Kustrin S.,
2002). Ces coefficients sont du même ordre de grandeur pour chaque colonne, ce
paramètre seul n’est pas suffisant pour établir une comparaison entre les colonnes. Nous
avons donc étudié le coefficient directeur de la droite a et son ordonnée à l’origine b. Plus
la valeur de a est proche de 1 et la valeur de b de 0 meilleure est la corrélation entre les
points calculés et les points expérimentaux.
En considérant tous ces paramètres, les colonnes présentant les meilleures
corrélations sont les colonnes X-Bridge Shield (100 x 2,1 mm ; 3,5 µm) et X-Terra (150 x 2,1
mm ; 3,5 µm), soit les colonnes possédant une fine granulométrie (3,5 µm).
Tr expérimental (min)
Tr
calc
ulé
(min
)
18
16 14
12
10
8
6
4
2
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
151
Pour ce type de molécule, la séparation est optimisée lorsque le descripteur de plus
fort poids correspond au LogP (1er descripteur pour la colonne X-Bridge et 2ème pour la
colonne X-Terra), paramètre directement lié avec la HPLC en phase inverse.
En conclusion, la séparation pour les acides aminés marqués avec NDA/CN- est
idéale sur des colonnes de granulométrie fine influencée par le LogP principalement, soit
sur la colonne X-Bridge. Or la phase stationnaire de cette colonne possède les mêmes
particules (Technologie BEH) que les colonnes utilisées en UPLC de granulométrie plus fine
(1,7 µm). L’élution de ces dérivés benzisoindoles d’acides aminés peut donc être optimisée
au niveau de la séparation mais aussi du temps avec un système d’élution tel que l’UPLC.
3) Application de l’étude QSRR à l’arginine
Dans le chapitre 2, nous avons expliqué que parce que la Lys pouvait être marquée
deux fois grâce à ces deux fonctions amines, elle présentait une longueur d’onde
d’absorbance différente des autres acides aminés marqués (λabs = 442 nm). Nous avons
ajouté que cette observation n’était pas applicable à la fonction guanidine de l’Arg car
elle possède d’une part, une tautomérie qui la rend moins réactive et d’autre part, le pKa
de cette fonction (pKa = 12,5) est très différents du pKa de la fonction amine terminale
(pKa = 9) (Figure 100). Ces hypothèses ont été vérifiées avec l’étude QSRR pour chaque
colonne.
Figure 100 : Formules développées de l'Arg marquée avec NDA/CN- sur la fonction amine et marquée sur la fonction guanidine.
Chacune des molécules d’Arg marquée a été modélisée et leurs descripteurs
moléculaires respectifs ont été caractérisés avec le logiciel ChemDraw 3D Ultra 2006. Ces
molécules ont ensuite été insérées dans les réseaux de neurones correspondant à chaque
colonne. Les temps de rétention calculés par validation croisée sont comparés avec les
temps de rétention obtenus expérimentalement (Tableau 24).
152
Tableau 24 : Temps de rétention estimé pour chaque colonne chromatographique de l’Arg 1 et l’Arg 2 et temps de rétention obtenu expérimentalement.
Colonne correspondante Tr (Arg) expérimental
min
Tr (Arg1) calculé
min
Tr (Arg2) calculé
Min X-Terra (250 x 4,6 mm ;5 µm) 5,25 5,77 7,49
X-Terra (150 x 2,1 mm ;3,5 µm) 2,05 1,44 0,75 Monolithe RP18e (100 x 3 mm) 1,99 2,14 2,55
X-Bridge Shield (2,1 x 100 mm, 3,5 µm) 1,69 1,80 1,26
Les temps de rétention estimés pour l’Arg marquée sur la fonction amine (Arg 1)
sont plus proches des temps de rétention obtenus expérimentalement que ceux calculés
pour le marquage sur la fonction guanidine (Arg 2) pour chaque colonne. Ces résultats
confirment l’hypothèse émise dans le chapitre 2.
Les colonnes chromatographiques ont pu être classées autrement que par ses
grandeurs caractéristiques usuelles (résolution, capacité de pics…) en utilisant les réseaux
de neurones artificiels. Ces études QSRR ont été réalisées avec le gradient d’élution
contrairement à celles majoritairement décrites dans la littérature pour les acides aminés
marqués (Tham S.Y. and Agatonovic-Kustrin S., 2002) ; c’est la raison pour laquelle les
coefficient R² calculés sont inférieurs à ceux décrits.
Une application sur les sites de marquage de l’Arg avec ces études QSRR a permis
de localiser l’amine primaire réactive avec NDA/CN- et de confirmer l’hypothèse des pka
fournie dans le chapitre 2.
153
Conclusion générale
154
155
L’objectif de ces travaux était de mettre au point une méthode d’analyse de
neurotransmetteurs dans des échantillons biologiques en employant la chromatographie
liquide à haute performance (HPLC) couplée à la détection de fluorescence et la
spectrométrie de masse. Pour se faire, nous avons utilisé un agent fluorogène : le
naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) et l’ion cyanure (CN-) pour marquer les
neurotransmetteurs de type acides aminés. Ces molécules marquées ont été séparées en
HPLC en utilisant un éluant simplifié (H2O, 0,1% HCOOH ; AcN) compatible avec la source
electrospray (ESI) du spectromètre de masse. Plusieurs colonnes chromatographiques ont
été testées pour optimiser la séparation des acides aminés marqués avec NDA/CN-.
Ces dérivés fluorescents ont ensuite été séparés sur la colonne X-Bridge que nous
avons sélectionnée et identifiés en spectrométrie de masse en mode positif et en mode
négatif plus approprié pour ce type de molécule. La méthode de marquage a été
automatisée pour que la réaction se déroule directement dans la boucle d’injection. Les
limites de détection (LOD) et de quantification (LOQ) ont été déterminées pour chaque
acide aminé marqué et sont de l’ordre du nanomolaire (nM).
Cette méthode a été vérifiée en injectant des échantillons biologiques
(microdialysat et liquide céphalorachidien). Certains acides aminés ont pu être détectés et
quantifiés.
Nous avons ensuite appliqué cette méthode d’analyse à des molécules plus
complexes : des peptides. Nous avons choisi d’étudier les enképhalines. Ces molécules ont
été marquées avec le NDA et un nouveau nucléophile le N,N-diméthylaminoéthanethiol
(MeAT) pour que ce marquage soit à la fois compatible avec la détection de fluorescence
et la spectrométrie de masse en mode positif. Cette méthode de marquage a, elle aussi,
été automatisée et les LOD et LOQ ont été déterminées pour la leucine-enképhaline et la
méthionine-enképhaline et sont de l’ordre du nanomolaire. Des échantillons biologiques
ont été injectés pour vérifier la compatibilité de la méthode avec des matrices complexes.
Les enképhalines ont été identifiées mais n’ont pu être quantifiées à cause des nombreux
composés endogènes altérant la séparation et pouvant dégrader ces peptides.
Pour remédier ce problème de sensibilité, une méthode de quantification originale
a été développée en spectrométrie de masse en jouant sur les nucléophiles pour doser les
molécules. Nous avons utilisé deux nucléophiles de composition chimique similaire et de
masse différant de 28 unités, le MeAT et le EtAT, comme étalon interne. Cette méthode a
été brevetée mais peut toutefois être optimisée en synthétisant un nucléophile MeAT
deutéré.
Un phénomène très particulier a été observé lors de l’élution de ces molécules
marquées avec NDA/MeAT : deux pics de même rapport m/z ont été détectés en
156
spectrométrie de masse pour une molécule injectée. Des études théoriques ont été
réalisées en modélisation moléculaire, en spectrométrie de masse haute résolution et une
étude de l’échange H/D pour interpréter ces résultats. Nous en avons conclu que les
enképhalines marquées avec NDA/MeAT s’ionisaient sur différents sites lors de l’élution
acide et adoptaient des conformations différentes pouvant être séparées en HPLC.
Enfin nous avons réalisé des études quantitatives de relations structure temps de
rétention (QSRR) pour comparer les colonnes chromatographiques entre elles autrement
que par les grandeurs communément utilisées (résolution, efficacité…).
Une première étape a été franchie dans la réalisation des objectifs. Une méthode,
entièrement automatisée a été élaborée pour doser les neurotransmetteurs de types
acides aminés et une nouvelle méthode de quantification a été développée en
spectrométrie de masse pour le dosage des peptides.
Pour valider ces méthodes, il faut toutefois franchir une seconde étape à savoir,
répondre aux normes ISO/CEI 17025:2005 destinées aux laboratoires d’analyses. Pour cela,
des études statistiques sur le taux de recouvrement des échantillons biologiques doivent
être réalisées ainsi que des études de répétabilité (capacité de reproduire des séries
d’analyse dans un même laboratoire, par les mêmes appareils et le même opérateur) et de
reproductibilité (capacité de reproduire des séries d’analyse avec une même méthode dans
des laboratoires différents avec des appareils et des opérateurs différents) sur les temps
de rétention et les limites de détection et de quantification, pour prétendre utiliser cette
méthode dans l’analyse clinique de neurotransmetteurs.
157
Partie Expérimentale
158
159
A. Liste des produits chimiques :
Nom Abréviation Pureté Fournisseur
Naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde NDA 98% FLUKA Cyanure de potassium KCN 97% ALDRICH N,N-diméthylaminoéthanethiol MeAT 97% FLUKA N,N-diéthylaminoéthanethiol EtAT 95% FLUKA Acide borique H3BO3 99% SIGMA Tétraborate de sodium décahydrate NaB4O7 99,90% FLUKA Phénylalanine Phe 99% FLUKA Glutamine Gln 99,50% FLUKA Tryptophane Try 99% FLUKA Acide glutamique Glu 99% FLUKA Valine Val 97 SIGMA Asparagine Asn 99% FLUKA Sérine Ser 99% FLUKA Méthionine Met 99% FLUKA Arginine Arg 99,50% FLUKA Acide 4-aminobutyrique GABA 99% FLUKA Noradrénaline Nor 98,50% FLUKA Dopamine Dop Nc SIGMA Alanine Ala 99% JANSSEN CHIMICA Histidine His 98% ALDRICH Tyrosine Tyr 98% FLUKA Glycine Gly 99,70% MERCK Lysine Lys 98% FLUKA Isoleucine Ile 99% ALDRICH Leucine Leu 99% MERCK Acide aspartique Asp 99% SIGMA Cystéine Cys 99% FLUKA Thréonine Thr 98% ALDRICH Leucine-enképhaline Leu-Enk 96% FLUKA Méthionine-enképhaline Met-Enk 98% SIGMA Riboflavine 98% SIGMA Eau deutérée D2O 99,90% Eurisotop Acide formique HCOOH 98% FLUKA Acide Formique d2 DCOOD 99% Eurisotop Acétonitrile AcN 99,80% VWR Méthanol MeOH 99,80% VWR Acide phosphorique Nc SIGMA Nc : non communiqué
160
B. Protocole de marquage
I. Marquage manuel
1) Préparation des solutions
Une solution de tampon borate est préalablement préparée en dissolvant
respectivement 4,76 g de tétraborate de sodium décahydrate et 6,12 g d’acide borique
dans 100 mL et 200 mL d’eau distillée. Le pH de la solution basique est mesuré avec un pH-
mètre (Satrorius) et ajustée à 8,7 avec la solution d’acide borique. La concentration finale
en borate est de 500 mM.
Les solutions suivantes sont préparées chaque semaine et conservées à 4°C. 4,6 mg
de NDA sont dissous dans 5mL de méthanol afin d’obtenir une solution de NDA à 5 mM. Les
différents nucléophiles sont préparées en dissolvant 11,2 mg de KCN, 24,3 mg de MeAT,
29,2 mg de EtAT dans 4 mL d’eau distillée et 6 mL de solution tampon à pH 8,7 afin d’avoir
des solutions à 43 mM de concentration. Les solutions standard d’acides aminés ou de
peptides sont préparées à différentes concentrations dans des fioles jaugées variant de 5
mL à 20 mL.
2) Marquage des amines primaires
Dans un eppendorf de 2 mL sont ajoutées : 120 µL de solution tampon borate à pH
8,7, 120 µL de nucléophile à 43 mM, 720 µL d’echantillon à marquer et de concentration
inférieure à 100 µM et 40 µL de solution de NDA à 5 mM. La solution est mélangée avec un
vortex une dizaine de seconde. Le temps de réaction varie de quelques secondes pour le
marquage avec NDA/MeAT à 15 minutes pour le marquage avec NDA/CN-. Les proportions
de ce marquage peuvent être ajustées selon la quantité d’échantillon désirée (1, 2 ou 3 mL
selon l’étude menée).
Ce marquage est utilisable pour tous les appareils d’analyse sauf lors d’injection
directe en spectrométrie de masse. La présence de sels dans la solution tampon
contaminerait la source électrospray de l’appareil. Pour les études en infusion directe, la
solution tampon est remplacée par une solution de triéthylamine diluée à 10-3 M et les
nucléophiles sont préparés dans de l’eau distillée sans solution tampon.
161
II. Marquage automatisé dans la boucle d’injection
1) Préparation des solutions
Une solution de NDA à 12,5 mM est préparée à partir de 11,5 mg dans 5 mL de
MeOH. Les solutions de KCN à 16,7 mM et de MeAT à 33,3 mM sont préparées en dissolvant
respectivement 10,4 mg de KCN et 47,0 mg de MeAT dans 5 mL d’H2O distillée et 5 mL de
solution tampon borate à pH = 8,7.
2 mL de chacune de ces solutions sont préalablement filtrés et versés dans des flacons
HPLC.
Les échantillons biologiques ont été fournis par la société Picometrics (Toulouse),
les microdialysats sont issus du striatum de rat anesthésié et le liquide céphalorachidien
provient de ponctions lombaires humaines. 10 µL de chacun de ces échantillons sont versés
dans des inserts de 150 µL (Waters) adaptés aux flacons de 2 mL sans filtration préalable.
2) Protocole de marquage
Le marquage automatisé est réalisé dans une boucle d’injection de 10 µL
préalablement fabriquée à partir 41,6 cm de peek de diamètre interne de 175 µm et de
diamètre externe 1/16’’. A l’aide du programme « Autoaddition » présent dans le logiciel
Empower 2 (Waters Corporation, Milford, MA, USA), 3 µL de solution de KCN sont d’abord
injectés dans la boucle suivi de 3µL de solution d’acide aminés ou de peptides et 4 µL de
NDA. La durée d’incubation est de 5 min pour le marquage des acides aminés et de 1 min
pour les enképhalines.
3) Etude des rapports NDA/CN- et NDA/MeAT et des durées d’incubation
Les rapports NDA/CN- et NDA/MeAT ont été réalisés en maintenant la concentration
de NDA fixe à 12,5 mM et en faisant varier la concentration de KCN ou de MeAT
respectivement de 1,67 mM à 167 mM (NDA/MeAT 10/1 à 1/10) et de 1,67 mM à 333 mM
(NDA/MeAT 10/1 à 1/20) avec une durée d’incubation de 5 min pour le marquage des
acides aminés et de 1 min pour le marquage des enképhalines.
Les durées d’incubation ont été déterminées en utilisant le rapport NDA/CN- (1/1)
et NDA/MeAT (1/2) et en faisant varier le temps d’incubation dans la boucle d’injection de
0 à 30 min pour le marquage avec NDA/CN- et de 0 à 10 min pour le marquage avec
NDA/MeAT avec le logiciel Empower 2 (Waters Corporation, Milford, MA, USA).
162
C. Etudes spectrométriques du marquage
I. Etudes en UV-visible
Les études en UV-visible ont été effectuées sur un spectrophotomètre à barrette de
diode (Hewlett Packard 8452A, USA). Les échantillons ont été analysés dans des cuves à
usage unique de 10 x 10 mm de dimensions et de 3 mL de contenance (Dutscher, France).
Le marquage a été ajusté à 3 mL et pour obtenir le blanc, il est réalisé sur de l’eau
distillée. L’absorbance de ces échantillons a été mesurée dans la gamme de longueur
d’onde variant de 190 à 820 nm. Le temps d’intégration est d’une seconde.
Les études cinétiques ont été effectuées à la longueur d’onde de λabs = 442 nm. Les
cinétiques ont été menées de 30 min à 2 heures. Le temps d’intégration de mesure est
d’une seconde et les mesures ont été effectuées toutes les 5 minutes pour les acides
aminés et toutes les minutes pour les enképhalines.
II. Etudes en fluorescence
Les études de fluorescence ont été effectuées sur un fluorimètre avec une source
xénon pulsée (Quantamaster QM-2, Photon Technology International, Canada). Les
longueurs d’onde d’émission des amines primaires marquées ont été déterminées à la
longueur d’onde d’excitation préalablement définie en spectrométrie UV-visible, dans des
cuves en Quartz de 3 mL et de 10 x 10 mm de dimensions (Hellma, France).
L’intensité de fluorescence est mesurée dans la gamme d’émission variant de 450 à
600 nm.
D. Conditions chromatographiques
I. Appareillage
1) Chaîne HPLC
Les expériences chromatographiques ont été réalisées sur trois chaînes de
chromatographie liquide haute performance (HPLC). La première chaîne Alliance 2695
(Waters Corporation, Milford, MA, USA) est équipée d’un système de pompe à gradient
quaternaire, d’un dégazeur, d’un injecteur automatique et un détecteur JASCO FP 1520
(Jasco Corporation, Japan). La deuxième chaîne identique à la première est couplée à un
détecteur de fluorescence multilongueur d’onde Waters 2475 (Waters Corporation).
163
Une troisième chaîne HPLC est composée de pompe Dionex P680, d’un injecteur
automatique LC-Packing Famos avec un échantillonneur thermostaté à 20°C (Dionex
Corporation, Voisin Le Bretonneux). Cette chaîne est couplée à un détecteur de
fluorescence induite par laser ZetaLIF, Hd-Cd 442 nm, série 56 (Picometrics, Toulouse) ou
au détecteur JASCO FP 1520. Chaque chaîne est munie d’un logiciel de traitement des
données : le logiciel Chromeléon 6.60 (Dionex Corporation) pour la chaîne Dionex, le
logiciel Millénium (Waters Corporation) pour la première chaîne Alliance et le logiciel
Empower 2 (Waters Corporation).
2) Paramétrage des détecteurs
Tous les détecteurs sont paramétrés en fonction du marquage des amines et plus
particulièrement en fonction du nucléophile utilisé pour le marquage. En fluorescence, la
longueur d’excitation est fixée à 442 nm pour tous les nucléophiles et la longueur
d’émission est de 480 nm lors de l’utilisation du cyanure et de 510 nm avec les
nucléophiles aminothiols. Le gain du détecteur JASCO est fixé à 1000 avec une atténuation
de 16. Celui du détecteur multilongueur d’onde Waters 2475 est de 1. Quant au détecteur
LIF le « Range » est fixé à 2. Il est muni d’un capillaire en silice fondu de 375 µm de
diamètre global et de 100 µm de diamètre interne (Polymicro technology, Phoenix,
AR).Une fenêtre de 1 cm de long est brûlée sur le capillaire à 20 cm de la colonne
chromatographique. Cette fenêtre est montée sur la cellule munie d’une bille de saphir.
Le réglage du rayon laser sur cette cellule est optimisé avec l’infusion d’une solution de
riboflavine à 10 µM.
3) Préparation des solvants et des échantillons
Les solvants, fournis par VWR, sont de qualité HPLC, et préalablement filtrés sous
vide à l’aide d’une membrane uptidisc Nylon de 4,7 mm de diamètre et de 0,45 µm de
pores (Waters).
Les échantillons standards sont filtrés avec des filtres seringues nylon de 13 mm de
diamètre et de 0,2 µm de pores (Waters) dans des flacons de dimensions 12 x 32 mm et de
2 mL de contenance muni d’un bouchon prépercé en PTFE (Waters).
Les échantillons biologiques sont filtrés sur des filtres seringues en nylon de 4 mm
de diamètre et de 0,2 µm de pores (Interchim, Montluçon, France) dans des inserts de 150
µL (Waters) compatibles avec les flacons cités précédemment.
164
II. Séparation des acides aminés et amines biogènes marqués avec NDA/CN-
Les acides aminés et les amines biogènes ont été étudiés sur plusieurs colonnes
avec différents gradients d’élution. Les solvants utilisés sont de l’eau acidifiée à 0,1%
d’acide formique (pH = 3) et d’acétonitrile. Le volume d’injection total est fixé à 10 µL
pour chaque étude. Les débits ont été déterminés en fonction des colonnes utilisées. Les
séparations sont réalisées à température ambiante (23°C).
1) Séparation sur colonnes X-Terra RP18 (250 x 4,6 mm ; 5 µm)
Les amines marquées à 10-6 M avec NDA/CN- ont été séparées sur une colonne X-
Terra RP18 4,6 x 250 mm ; 5 µm (Waters Corp., Milford, MA, USA) avec la chaîne Alliance
2695 et détectés avec le détecteur de fluorescence JASCO FP 1520. Le débit d’élution est
de 1 mL/min et le gradient utilisé est le suivant :
T (min) % H2O, 0,1 % HCOOH % AcN
0 60 40
12 60 40
40 30 70
La colonne est rééquilibrée pendant 30 minutes après chaque injection.
1) Séparation sur colonnes X-Terra RP18 (150 x 2,1 mm ; 3,5 µm)
Une deuxième colonne X-Terra RP18 2,1 x 150 mm ; 3,5 µm (Waters) a été utilisée
pour analyser les amines marquées à 10-6 M avec NDA/CN- sur la chaîne HPLC Alliance 2695
avec le détecteur de fluorescence multilongueur d’onde Waters 2475. Le débit est de 0,3
mL/min et le gradient est de :
T (min) % H2O, 0,1 % HCOOH % AcN
0 64 36
9 64 36
30 30 70
Le temps de rééquilibrage est de 20 minutes après chaque injection.
165
2) Séparation sur colonne monolithe RP 18e β-test (3 x 100 mm)
Une colonne monolithe RP18 β-test de dimensions 3 x 100 mm (Merck KGaA,
Darmstadt, Germany) a été testée pour séparer ces dérivés benzisoindoles d’acides aminés
à 10-6 M avec un débit de 1mL/min. La chaîne HPLC Dionex P680 et le détecteur de
fluorescence JASCO FP 1520 ont été utilisés avec le gradient décrit dans le tableau
suivant :
T (min) % H2O, 0,1 % HCOOH % AcN
0 70 30
4,5 70 30
15 50 50
La colonne est rééquilibrée pendant 10 minutes après chaque injection.
3) Séparation sur colonne X-Bridge Shield RP18 (2,1 x 100 mm, 3.5 µm)
Les acides aminés marqués à 10-6 M avec NDA/CN- ont été séparées avec une
colonne X-Bridge Shield RP18 2,1 x 100 mm ; 3,5 µm (Waters) avec la chaîne Dionex P680 et
le détecteur LIF PICOMETRICS. Le débit est de 0,3 mL/min et le gradient d’élution est
décrit dans le tableau suivant :
T (min) % H2O, 0,1 % HCOOH % AcN
0 70 30
20 30 70
La colonne est rééquilibrée pendant 15 minutes après chaque injection.
166
III. Séparation des enképhalines marquées avec NDA/MeAT
Les enképhalines ont été chromatographiées sur la colonne Xbridge Shield RP18 2.1 x
100 mm ; 3,5 µm (Waters) avec la chaîne Dionex P680 et le détecteur LIF. Le débit utilisé
est de 0,3 mL/min et le gradient d’élution est le suivant :
T (min) % H2O, 0,1 % HCOOH % AcN
0 20 80
2 20 80
15 80 20
La colonne est rééquilibrée pendant 15 minutes dans les conditions initiales, entre chaque
injection. Les séparations sont réalisées à température ambiante (23°C).
IV. Calcul des limites de détection et de quantification
Les limites de détection et de quantification sont calculées à partir du logiciel
Microsoft Excel. Des solutions d’acides aminés ou d’enképhalines sont injectées trois fois à
des concentrations variant de 10-8 mol/L à 10-5 mol/L. Les droites de calibration pour
chaque composé sont tracées à partir du logarithme de l’aire des pics en fonction du
logarithme de leur concentration et l’équation résultante est de la forme logA= a*logC +b.
Un blanc, soit de l’H2O marquée avec NDA/CN- ou NDA/MeAT, est préalablement injecté
trois fois. L’aire minimale d’un pic intégrable est fixée à 400000, le signal sur bruit pour
déterminer la limite de détection est de 3 et de 10 pour la limite de quantification. Ces
limites sont calculées à partir des équations des droites de calibration de chaque composé.
V. Etudes de l’échange hydrogène/deutérium
L’étude de l’échange H/D est réalisée sur la chaîne Dionex P680. L’eau acidifiée est
remplacée par de l’oxyde de deutérium (D20) de 99,9 % de pureté fourni par Eurisotop
(Saint-Aubin, France). Cet éluant est acidifié à 0,1 % avec de l’acide formique deutéré
(DCOOD) (Eurisotop).
167
E. Conditions en spectrométrie de masse
I. Paramétrage
Le spectromètre de masse est un quadripôle temps de vol muni d’une source
d’ionisation electrospray Q-TOF Ultima API (Waters corp., Milford, MA, USA). Les tensions
dans le capillaire, de cône et le Rf lens sont respectivement de 3 kV, 35 V et 40 V. Les
températures de la source et de déssolvatation sont paramétrées à 100 et 120°C. L’énergie
de collision est fixée 10 eV en mode TOF-MS ou varie de 15 à 60 eV en mode MS/MS. La
tension du temps de vol (TOF) est de 9,1 kV. Les analyses sont acquises avec le logiciel
MassLynx 4.1 (Waters Corp., Milford, MA, USA).
II. Etalonnage de l’appareil
L’appareil est étalonné avec une solution de H3PO4 diluée à 0,1 % dans un mélange
d’eau et d’acétonitrile (50/50 : v/v). Cette solution est injectée avec un pousse-seringue
avec un débit de 0,6 µL/min. La durée d’acquisition est de 5 min. Le spectre de masse
global pendant ces 5 min d’acquisition est centré par rapport aux masses exactes des
adduits de H3PO4. Le spectromètre de masse est étalonné à chaque nouvelle utilisation de
l’appareil ou changement de mode (ESI+ en ESI- et vice et versa).
III. Mesure en injection directe
Lors des mesures en injection directe de la Leu-Enk à 10-5 M marquée avec
NDA/MeAT, les échantillons sont dilués de moitié dans une solution d’eau et d’acétonitrile
(50/50 : v/v) à 0,1 % d’acide formique. Le mélange est ensuite infusé dans la source à
l’aide d’un pousse-seringue à 0,6 µL/min. La durée d’acquisition est de 1 min.
IV. Mesure en couplage LC/MS
Le spectromètre de masse peut être couplé soit à la chaîne Alliance 2695 soit à la
chaîne Dionex P680. La sortie de colonne pour la chaîne Alliance ou la sortie du détecteur
LIF pour la chaîne Dionex est reliée à la source electrospray au moyen d’un peek de
diamètre interne de 250 µm.
168
V. Mesure de la masse exacte de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT
Le spectromètre de masse est calibré avec l’acide phosphorique (H3PO4) et une
impureté présente dans l’éluant. L’éluant avec l’impureté à m/z = 453,3420 est d’abord
calibré avec les adduits de H3PO4 et chaque pic correspondant à la Leu-Enk marquée avec
NDA/MeAT est étalonné avec la masse exacte de l’impureté.
La masse exacte obtenue expérimentale est alors comparée à la masse exacte
théorique calculée à partir de la fonction « elemental composition » du logiciel MassLynx.
VI. Mesure de l’abondance isotopique relative de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT
L’abondance isotopique relative de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT est
mesurée théoriquement à partir de la fonction « isotopic profile » du logiciel MassLynx. Les
abondances isotopiques relatives de chaque pic correspondant à la Leu-Enk marquée avec
NDA/MeAT sont mesurée manuellement en calculant le pourcentage du rapport des
hauteurs de chaque pic isotopique en fonction de la hauteur du pic majoritaire à m/z =
809,5.
De même lors de l’échange H/D, les abondances isotopiques relatives sont calculées
à partir des pics majoritaires m/z = 814,5 et m/z =816,5 à tr = 9,04 min et tr = 10,00 min
respectivement.
F. Modélisation moléculaire
I. Modélisation de la Leu-Enk marquée avec NDA/MeAT
Les études de modélisation moléculaires ont été réalisées sur la Leu-Enk marquée
avec NDA/MeAT avec le logiciel Chem3D Ultra version 9.0 (ChemOffice Ultra 2005, Logiciel
Cambridge, Cambridge, MA USA). L’énergie des structures de chacune des Leu-Enk
protonée sur aux différents sites ionisables est minimisée avec le calcul semi-empirique
quantique AM1 du server MOPAC avec un gradient de minimisation RMS de 0,100.
Le coefficient de partage octanol/eau (LogP) est mesuré avec le serveur CLogP du
logiel ChemOffice Ultra 2005.
Les enthalpies de formation (∆H°f), exprimées en Kcal/mol, sont calculées à partir
du logiciel ChemOffice Ultra 2005 avec le serveur AM1 pour chacune des conformations.
Les liaisons hydrogènes sont déterminées en mesurant la distance obtenue sur le modèle
169
moléculaire en 3D entre le N-H de la liaison amide et le C=O de la fonction amide la plus
proche. Cette distance est exprimée en Angstrom (Å).
La distance entre le proton et le soufre de la fonction thioether est mesurée de la
même façon.
II. Modélisation des acides aminés marqués avec NDA/CN- pour l’étude QSRR
Les dérivés benzisoindoles d’acides aminés ont été modélisés avec le logiciel
Chem3D Ultra version 9.0. L’énergie de ces structures en 3D a été minimisée avec le
serveur MOPAC en utilisant la méthode de calcul semi-empirique AM1 avec un gradient de
minimisation RMS de 0,100.
Après la minimisation, les descripteurs moléculaires de chacun de ces modèles
moléculaires sont déterminés avec les différents serveurs du logiciel répertoriés dans le
tableau suivant :
170
Descripteurs moléculaires Serveur utilisé Types de
descripteurs
∆Hf° kcal/mol MOPAC AM1 Thermodynamiques Log P
Crippen's fragmentation
Physico-chimique
Réfractivité moléculaire Log P Viswanadhan's
fragmentation Réfractivité moléculaire Superficie accessible calculée par la
méthode de Connolly
ChemProdStd
Aire moléculaire calculée par la méthode de Connolly
Volume de solvant couvert par la surface moléculaire calculée par la
méthode de Connolly Ovalité LogP
ClogP Réfractivité moléculaire
Dipole D
Mopac Electronique
Longueur dipolaire Energie électronique
Energie HOMO Energie LUMO
Energie de répulsion Somme des énergies de symétrie
Indice de Balaban
Topology Indices Topologique
Nombre de cluster Diamètre
Indice topologique de la molécule Surface polaire
Rayon Attribut de forme
Coefficient de forme Somme des degrés
Somme des degrés de valence Somme des connectivités
Total des connectivités de valences Indice de Wiener
Les résultats obtenus pour chacun de ces descripteurs sont normalisés entre 0 et 1
afin d’être insérer dans les réseaux de neurones.
Ces réseaux de neurones sont construits avec le logiciel SNNS version 4.2 (Stuttgart
Neural Network Simulator 2OO6, université de Stuttgart, Allemagne).
Un premier réseau noté RN1 est crée avec, en couches d’entrée tous les
descripteurs de chaque acide aminé marqué avec NDA/CN- et en couche de sortie les
temps de rétention de chaque molécule pour chaque colonne. Le poids de ces descripteurs
est déterminé avec différents cycles d’apprentissage (1000, 5000 et 10000) en utilisant
l’algorithme de rétropropagation pour chaque phase stationnaire.
171
Les descripteurs de poids supérieur à 1 qui ne sont pas corrélés entre eux sont
retenus.
Un réseau de neurones est alors construit pour chaque colonne (RN2, RN3, RN4,
RN5) avec en entrée les descripteurs moléculaires sélectionnés, en sortie les temps de
rétention et un nombre de couches cachées correspondant à la moitié supérieure du
nombre de couches d’entrées.
Les temps de rétention de chacun des acides aminés marqués avec NDA/CN- sont
calculés avec les réseaux de neurones RN2, RN3, RN4 et RN5 en utilisant la méthode de
validation croisée avec 2000 cycles d’apprentissage. Les temps de rétention calculés sont
comparés avec les temps de rétention expérimentaux.
172
173
Références bibliographiques
174
175
http://www.waters.com/Library > How-to Guides > Mass Spec Primer > The Mass
Spectrometer. Arner P. (1999). Microdialysis : use in human exercise studies. Proc. Nutr. Soc. 58, 913-
917. Bauza T., Blaise A., Daumas F., and Cabanis J.C. (1995). Determination of biogenic amines
and their precursor amino acids of the Vallée du Rhône by high-performance liquid chromatography with precolumn derivatization and fluorimetric detection. J. Chromatogr. A 707, 373-379.
Bayle C., Poinsot V., Fournier-Noel C., and Couderc C. (2006). Laser-induced fluorescence detection : a summary. In "Electrokinetic Chromatography : Theory Instrumentation & Applications" (U. Pyell, ed.), pp. 263-280. John Wiley and sons limited, England.
Bellander B.M., Cantais E., Enblad P., Hutchinson P., Nordström C.H., Robertson C., Sahuquillo J., Smith M., Stocchetti N., Ungerstedt U., Unterberg A., and Olsen N.V. (2004). Consensus meeting on microdialysis in neurointensive care. Intensive Care Med. 30, 2166-2169.
Bert L., Parrot S., Robert F., Desvignes C., Denoroy L., Suaud-Chagny M.F., and Renaud B. (2002). In vivo temporal sequence of rat striatal glutamate, aspartate and dopamine efflux during apomorphine, nomifensine, NDMA and PDC in situ administration. Neuropharmacology 43, 825-835.
Bert L., Robert F., Denoroy L., Stoppini L., and Renaud B. (1996). Enhanced temporal resolution for the microdialysis monitoring of catecholamines and excotatory amino acids using capillary electrophoresis with laser-induces fluorescence detection. Analytical developments and in vitro validations. J. Chromatogr. A 755, 99-111.
Biemann K. (1987). Contribution of mass spectrometry to peptide and protein structure. Biomed. Environ. Mass Spectrom. 16, 99-111.
Blancafort L., Gonzalez D., Olivucci M., and Robb M.A. (2001). Quenching of tryptophan 1(π,π*) fluorescence induced by intramolecular hydrogen abstraction via an aborted decarboxylation mechanism. J. Am. Chem. Soc. 124, 6398-6406.
Bosque R., Sales J., Bosch E., Rosès M., Garcia-Alvarez-Coque M.C., and Torres-Lapasio J.R. (2003). A QSPR study of the p solute polarity parameter to estimate retention in HPLC. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 43, 1240-1247.
Bouchoux G., and Sablier M. (2005). Spectrométrie de masse : appareillage. Technique de l'ingénieur P2, 1-37.
Bourcier S., Clerc F., Rigal O., Taghi M., and Hoppilliard Y. (2006). Detection of 28 neurotransmitters and related compounds in biological fluids by liquid chromatography/tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 1405-1421.
Brier S., Lemaire D., DeBonis S., Kozielski F., and Forest E. (2006). Use of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry and mutagenesis as a tool to identify the binding region of inhibitors targeting the human mitotic kinesin Eg5. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 456-462.
Cai X., and Dass C. (2005). Structural characterization of methionine and leucine enkephalins by hydrogen/deuterium exchange and electrospray ionization tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1-8.
Cajal S.R. (1894). "Les nouvelles idées sur la structure du système nerveux chez l'homme et chez les vertébrés," Paris.
Campbell R. (1955). "Théorie générale de l'équation de Mathieu," Paris. Carlson R.G., Srinivasachar K., Givens R.S., and Matuszewski B.K. (1986). New derivatizing
agents for amino acids and peptides. 1. Facile synthesis of N-Substituted 1-cyanobenz[f]isoindoles and their spectroscopic properties. J. Org. Chem. 51, 3978-3983.
Carlsson A., Lindqvist M., and Magnusson T. (1957). 3,4-Dihydroxyphenylalanine and 5-hydroxytryptophan as reserpine antagonists. Nature 180, 1200.
176
Caude M., and Jardy A. (1995). Chromatographie en phase liquide : Appareillage et applications. Technique de l'ingénieur, traité Analyse et Caractérisation PE 1, 1-17.
Caude M., and Jardy A. (1996). Chromatographie en phase liquide : Introduction. Technique de l'ingénieur, traité Analyse et Caractérisation PE 1, 1-6.
Cellar N.A., Burns S.T., Meiners J.C., Chen H., and Kennedy R.T. (2005). Microfluidic chip for low-flow push-pull perfusion sampling in vivo with on-line analysis of amino acids. Anal. Chem. 77, 7067-7073.
Chang P.L., Chiu T.C., and Chang H.T. (2006). Stacking, derivatization, and separation by capillary electrophoresis of amino acids from cerebrospinal fluids. Electrophoresis 27, 1922-1931.
Chen L., and Yung W.H. (2004). GABAergic neurotransmission in globus pallidus and its involvement in neurologic disorders. Sheng Li Xue Bao 56, 427-435.
Clough G.F. (2005). Microdialysis of large molecules. AAPS J. 7, E686-E692. Connolly M.L. (1985). Computation of molecular volume. J. Am. Chem. Soc. 107, 1118-
1124. Cook C.J. (1998). Monitoring of the extracellular gamma-amino-4butyric acid using
microdialysis coupled to immunosensor analysis. J. Neurosci. Methods 82, 145-150. Cossart R., Bernard C., and Ben-Ari Y. (2005). Multiple facets of GABAergic neurons and
synapses: multiple fates of GABA signalling in epilepsies. Trends Neurosci. 28, 108-115.
Couderc F., Lacroix M., and Poinsot V. (2005). Method of quantification of primary amines at very low concentration. Fr. pat. n°0509209.
Cramer R.D., Patterson D.E., and Bunce J.D. (1988). Comparative molecular field analysis (CoMFA). 1. Effect of shape on binding of stereoids to carrier proteins. J. Am. Chem. Soc. 110, 5959-5967.
Cropley V.L., Fujita M., Innis R.B., and Nathan P.J. (2006). Molecular imaging of the dopaminergic system and its association with human cognitive function. Biol. Psychiatry 59, 898-907.
Curtis D.R., Phillis J.W., and Watkins J.C. (1959). Chemical Excitation of Spinal Neurones. Nature 183, 611-613.
Dave K., Stobaugh J.F., Repta A.J., Sternson L.A., and Riley C.M. (1992a). Reversed-phase liquid chromatography of the opioid peptides - 2. Quantitative structue-retention relationships and isocratic retention prediction. J. Pharm. Biomed. Anal. 10, 49-60.
Dave K., Stobaugh J.F., Rossi T.M., and Riley C.M. (1992b). Reversed-phase liquid chromatography of the opioid peptides.3.Development of a microanalytial system for opioid peptides involving microbore liquid chromatography, post-column derivatisation and laser-induced fluorescence detection. J. Pharm. Biomed. Anal. 10, 965-977.
Dawson L.A., Organ A.J., Winter P., Lacroix L.P., Shilliam C.S., Heidbreder C., and Shah A.J. (2004). Rapid high-throughput assay for the measurement of amino acids from microdialysates and brain tissue using monolithic C18-bonded reversed-phase columns. J. Chromatogr. B 807, 235-241.
De Hoffmann E., Charette J., and Stroobant V. (1999). Spectrométrie de masse. (Dunod, ed.), pp. 1-9, 42-53 & 349-362, Paris.
De la Pena A., Ping L., and Derendorf H. (2000). Microdialysis in peripheral tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 45, 189-216.
De Montigny P., Riley C.M., Sternson L.A., and Stobaugh J.F. (1990). Fluorogenic derivatization of peptides with naphtalene-2,3-dicarboxaldehyde/cyanide: optimization of yield and application in the determination of leucine-enkephalin spiked in human plasma samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 8, 419-429.
Delgado J.M., DeFeudis F.V., Roth R.H., Ryugo D.K., and Mitruka B.M. (1972). Dialytrode for long term intracerebral perfusion in awake monkeys. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 198, 9-21.
177
Dempster A.J. (1918). A new Method of Positive Ray Analysis. Phys. Rev. 11, 316-325. Desiderio D.M., and Zhu X. (1998). Quantitative analysis of methionine enkephalin and β-
endorphin in the pituitary by liquid secondary ion mass spectrometry and tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 794, 85-96.
Devall A.J., Blake R., Langman N., Smith C.G., Richards D.A., and Whitehead K.J. (2007). Monolithic column-based reversed-phase liquid chromatography separation for amino acid assay in microdialysates and cerebral spinal fluid. J. Chromatogr. B 848, 323-328.
Diez M., Danner S., Frey P., Sommer B., Staufenbiel M., Wiederhold K.H., and Hökfelt T. (2003). Neuropeptide alterations in the hippocampal formation and cortex of transgenic mice overexpressing β-amyloid precursor protein (APP) with the Swedish double mutation (APP23). Neurobiol. Dis. 14, 579-594.
Dongré A.R., Jones J.L., Somogyi A., and Wysocki V.H. (1996). Influence of peptides composition, gas-phase basicity, and chemical modification on fragmentation efficiency : Evidence for the mobile proton model. J. Am. Chem. Soc. 118, 8365-8374.
Eeltink S., and Kok W.T. (2006). Recent applications in capillary electrochromatography. Electrophoresis 27, 84-96.
Elmquist W.F., and Sawchuk R.J. (1997). Application of microdialysis in pahrmacokinetic studies. Pharm. Res. 14, 267-288.
Englander S.W. (2006). Hydrogen exchange and mass spectrometry : a historical perspecive. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1481-1489.
Epelbaum J. (1995). Neuropeptides et neuromédiateurs. (2ème, ed.), pp. 45-62 & 115-124, Paris.
Fan X., You J., Kang J., Ou Q., and Zhu Q. (1998). New reagents for determination of amino acids by liquid chromatography with pre-column fluorescence derivatization. Anal. Chim. Acta 367, 81-91.
Fukushima T., Usui N., Santa T., and Imai K. (2003). Recent progress in derivatization methods for LC and CE analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 30, 1655-1687.
Gacel G., Fournie-Zaluski M.C., Fellion E., Roques B.P., Senault B., Lecomte J.M., Malfroy B., Swerts J.P., and Schwartz J.C. (1979). Conformation and biological activities of hexapeptides related to enkephalins: respective roles of the ammonium and hydroxyl groups of tyrosine. Life Sci. 24, 725-731.
Gandarias J.M., Casis O., Varona A., Gallego M., Irazusta J., and Casis L. (1997). Interaction mechanisms of imipramine and desipramine xith enkephalin-degrading aminopeptidases in vitro. Life Sci. 61, 321-326.
Grushka E. (1970). Chromatographic peak capacity and the factors influencing it. Anal. Chem. 42, 1142-1147.
Hansch C., and Fujita T. (1964). π−σ−π Analysis. A method for the correlation of biological activity and chemical structure. J. Am. Chem. Soc. 86, 1616-1626.
Hansch C., and Lien E.J. (1971). Structure-activity relationships in antifungial agents. A survey. J. Med. Chem. 14, 653-670.
Hernandez L., and Paez X. (1997). Blood microdialysis in humans: a new method for monitoring plasma compounds. Life Sci. 61, 847-856.
Hillenkamp F., Bachmann D., and Karas M. (1985). Influence of wavelength in high-irradiance ultraviolet laser desorption mass spectrometry of organic molecules. Anal. Chem. 57, 2935-2939.
Hinton G. (1992). Apprentissage et réseaux de neurones. Pour la science 181, 124-132. Holme D.J., and Peck H. (1998). Analytical Biochemistry. (3ème, ed.), pp. 227-245, New
York. Hopfield J.J. (1982). Neural networks and physical systems with emergent collective
computational properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 2554 - 2588.
178
Huang Y., Duan J., Jiang X., Chen H., and Chen G. (2005). Separation and determination of enkephalin-related peptides using capillary electrophoresis. J. Sep. Sci. 28, 2534-2539.
Hughes J., Smith T.W., and Kosterlitz H.W. (1975). Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity. Nature 258, 577-579.
Hunter E.P.L., and Lias S.G. (1998). Evaluated gas phase basicities and proton affinities of molecules : un update. J. Phys. Chem. Ref. data 27, 413-656.
Hutchinson P.J., O'Connell M.T., Al-Rawi P.G., Maskell L.B., Kett-White R., Gupta A.K., Richards H.K., Hutchinson D.B., Kirkpatrick P.J., and Pickard J.D. (2000). Clinical cerebral microdialysis : a methodological study. J. Neurosurg. 93, 37-43.
Ivanov A.R., Nazimov I.V., Lobazov I.P., and Popkovich G.B. (2000). Direct determination of amino acids and carbohydrates by high-performance capillary electrophoresis with refractometric detection. J. Chromatogr. A 894, 253-257.
Jaiswal D., Karthikeyan C., and Trivedi P. (2006). Rationalization of physicochemical properties of alkanoic acid derivaties towards histone deacetylase inhibition. Internet Electron. J. Mol. Des. 5.
Jiang Y., and Lee C.S. (2001). On-line coupling of hollow fiber membranes with electrospray ionization mass spectrometry for continuous affinity selection, concentration and identification of small-molecule libraries. J. Mass Spectrom. 36, 664-669.
Johnson R.S., Martin S.A., and Biemann K. (1988). Collision-induced fragmentation of (M + H)+ ions of peptides. Side chain specific sequence ions. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 86, 137-154.
Johnson R.S., Martin S.A., Biemann K., Stults J.T., and Watson J.T. (1987). Novel fragmentation process of peptides dy collision-induced decomposition in a tandem mass spectrometer : differentiation of leucine and isoleucine. Anal. Chem. 59, 2621-2625.
Jorgenson J.W., and Lukacs K.D. (1981). Free-zone electrophoresis in glass capillaries. Clin. Chem. 27, 1551-3.
Kalita J., Kumar S., Vijaykumar K., Palit G., and Misra U.K. (2007). A study of CSF catecholamine and its métabolites in acute and convalescent period of encephalitis. J. Neurol. Sci. 252, 62-66.
Kaluszyner A., and Galun A.B. (1961). N-methylation of amino alcohols and amino mercaptans. J. Org. Chem. 26, 3536.
Kebarle P., and Tang L. (1993). From ions in solution to ions in the gas phase - the mechanism of electrospray mass spectrometry. Anal. Chem. 65, 972A-.
Kritz Z., Carlsen P.H.J., and Koca J. (2001). Conformational features of linear and cyclic enkephalins. A computational study. J. Mol. Struc : Theochem 540, 231-250.
Lacroix M., Garrigues J.C., and Couderc F. (2007). Reaction of naphtalene-2,3-dicarboxaldehyde with enkephalins for LC-fluorescence and LC-MS analysis : Conformational studies by molecular modelling and H/D exchange mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1706-1713.
Lacroix M., Poinsot V., Fournier C., Couderc F. (2005). Laser-induced fluorescence detection schemes for the analysis of proteins and peptides using capillary electrophoresis. Electrophoresis 26, 2608-2621.
Lakowicz J.R. (1999). Principle of fluorescence spectroscopy, 2nd edition. (Academic/Plenum, ed.), pp. 1-23 & 237-264, New York.
Lapainis T., Scanlan C., Rubakhin S.S., and Sweedler J.V. (2007). A multichannel native fluorescence detection system for capillary electrophoretic analysis of neurotransmitters in single neurons. Anal. Bioanal. Chem. 387, 97-105.
Lemke M.R., Fuchs G., Gemende I., Herting B., Oelhwein C., Reichmann H., Rieke J., and Volkmann J. (2004). Depression and Parkinson's disease. J. Neurol. 251, VI/24-VI/27.
179
Lisi T.L., and Sluka K.A. (2006). A new electrochemical HPLC method for analysis of enkephalins and endomorphins. J. Neurosci. Meth. 150, 74-79.
Lisi T.L., Westlund K.N., and Sluka K.A. (2003). Comparison of microdialysis and push-pull perfusion for retrieval of serotonin and norepinephrine in the spinal cord dorsal horn. Journal of Neuroscience Methods 126, 187-194.
Liu D.Q., and Hop C.E.C.A. (2005). Strategies for characterization of drug metabolites using liquid chromatography-tandem mass spectrometry in conjunction with chemical derivatization and on-line H/D exchange approaches. J. Pharm. Biomed. Anal. 37, 1-18.
Manica D.P., Lapos J.A., Jones A.D., and Ewing A.G. (2003). Analysis of the stability of amino acids derivatized with naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde using high-performance liquid chromatography and mass spectrometry. Anal. Biochem. 322, 68-78.
Marcotte I., Separovic F., Auger M., and Gagné S.M. (2004). A multidimensional 1H NMR investigation of the conformation of methionine-enkephalin in fast-tumbling bicelles. Biophys. J. 86, 1587-1600.
Marinelli P.W., Bai L., Quirion R., and Gianoulakis C. (2005). A microdialysis profile of Met-Enkephalin release in the rat nucleus accumbens following alcohol administration. Alcoholism Clin. Exp. Res. 29, 1821-1828.
Matuszewski B.K., Givens R.S., Srinivasachar K., Carlson R.G., and Higuchi T. (1987). N-substituted1-cyanobenz[f]isoindole : Fluorescence efficiencies of a new fluorogenic label for primary amines and amino acids. Anal. Chem. 59, 1102-1105.
McCulloh W.S., and Pitts W. (1943). A Logical Calculus of the Ideas Imminent in Nervous Activity. Bull. Math. Biophys. 5, 115-133.
McLaren L., Myers M.N., and Giddings J.C. (1968). Dense-Gas Chromatography of Nonvolatile Substances of High Molecular Weight. Science 159, 197-199.
Merck KGaA (2006/2007). Chromolith HPLC Columns. Speed and performance in monolithic form. Chrom Book, 44-47.
Meunier J.M., and Shvaloff A. (1995). Neurotransmetteurs. (Masson, ed.), pp. 4-8 & 71-92, Paris.
Michael D.J., and Wightman R.M. (1999). Electrochemical monitoring of biogenic amine neurotransmission in real time. J. Pharm. Biomed. Anal. 19, 33-46.
Mifune M., Krehbiel D.K., Stobaugh J.F., and Riley C.M. (1989). Multi-dimensional high-performance liquid chromatography of opioid peptides following pre-column derivatization with naphtalene-2,3-dicarboxaldehyde in the presence of cyanide ion. Preliminary results on the determination of leucine- and methionine-enkephalin-like fluorescence in the striatum region of the rat brain. J. Chromatogr. 496, 55-70.
Mikkers F., Ringoir S., and De Smet R. (1979). Analytical isotachophoresis of uremic blood samples. J. Chromatogr. 162, 341-350.
Miksik I., Sedlakova P., Mukilikova K., Eckhardt A., Cserhati T., and Horvath T. (2006). Matrices for capillary gel electrophoresis-a brief overview of uncommon gel. Biomed. Chromatogr. 20, 458-465.
Minky M., and Papert S. (1969). "Perceptrons : An Introduction to Computational Geometry.," Cambridge.
Mitsunobu D., Masayuki T., Toshimasa I., and Masatoshi I. (1987). The three-dimensional similarity between a dimeric antiparallel extended structure and a -turn folded form of enkephalin. FEBS Lett. 213, 265-268.
Mol R., De Jong G., and Somsen G. (2006). Coupling of electrochromatography to mass spectrometry. In "Electrokinetic Chromatography : Theory, Instrumentation & Applications" (U. Pyell, ed.), pp. 307-336. John Wiley and sons limited, England.
Molnar-Perl I. (1998). Advanced Chromatographie and Electromigration Methods in Biosciences. (Z. D. e. Al., ed.), pp. 416. Elsevier, Amsterdam.
180
Molnar-Perl I. (2001). Derivatization and chromatographic behavior of the o-phthaldialdehyde amino acid derivaties obtained with various SH-group-containing additives. J. Chromatogr. A 913, 283-302.
Myers R.D. (1986). Development of push-pull system for perfusion of anatomically distinct regions of the brain of the awake animal. Ann. N. Y. Acad. Sci. 473, 21-41.
Myers R.D., Adell A., and Lankford M.F. (1998). Simultaneous comparison of cerebral dialysis and push-pull perfusion in the brain of rats: a critical review. Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 371-387.
Nouadje G., Rubie H., Chatelut E., Canal., Nertz M., Puig P., and Couderc F. (1995). Child cerebrospinal fluid analysis by capillary electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. J. Chromatogr. A 717, 293-298.
Oates M.D., and Jorgenson J.W. (1989). Determination of naphtalene-2,3-dicarboxaldehyde-labeled amino acids by open tubular liquid chromatography with electrochemical detection. Anal. Chem. 61, 432-435.
Paul W., and Steinwedel H. (1953). Ein neues massenspektrom-. eter ohne magnetfeld. Z. Naturforsch. A 8, 448-50.
Paul W., and Steinwedel H. (1960). Apparatus for separating charged particles of different specific charges. U.S. Pat. 2939952.
Perez-Neri I., Ramirez-Bermudez J., Montes S., and Rios C. (2006). Possible mechanisms of neurodegeneration in schizophrenia. Neurochem. Res. 31, 1279-1294.
Petritis K., Elfakir C., and Dreux M. (2002). A comparative study of commercial liquid chromatographic detectors for the analysis of underivatized amino acids. J. Chromatogr. A 961, 9-21.
Poinsot V., Lacroix M., Maury D., Chataigné G., Feurer B., and Couderc C. (2005). Recent advances in amino acid analysis by capillary electrophoresis. Electrophoresis 27, 176-194.
Powell P.R., and Ewing A.G. (2005). Recent advances in the application of capillary electrophoresis to neuroscience. Anal. Bioanal. Chem. 382, 581-591.
Psurek A., Matysik F.M., and Scriba G.K.E. (2006). Determination of enkephalin peptides by nonaqueous capillary electrophoresis with electrochemical detection. Electrophoresis 27, 1199-1208.
Rammouz G., Lacroix M., Garrigues J.C., Poinsot V., and Couderc F. (2007). The use of naphthalenedicarboxaldehyde for the analysis of primary amino acid. Biomed. Chromatogr. sous presse.
Randic M. (1995). Molecular shape profiles. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 35, 373-382. Richards D.A., Silva M.A., Murphy N., Wigmore S.J, and Mirza D.F. (2007). Extracellular
amino acid levels in the human liver during transplantation : a microdialysis study from donor to recepient. Amino Acids sous presse.
Roach M.C., and Harmony M.D. (1987). Determination of amino acids at subfemtomole levels by high-performance liquid chromatography with laser-induced fluorescence detection. Anal. Chem. 59, 411-415.
Robert F., Bert L., Denoroy L., and Renaud B. (1995). Capillary zone electrophoresis with laser-induced fluorescence detection for the determination of nanomolar concentrations of noradrenaline and dopamine: Application to brain microdialysis. Anal. Chem. 67, 1838-1844.
Robinson D.L., Venton B.J., Heien M.L.A.V., and Wightman R.M. (2003). Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin. Chem. 49, 1763-1773.
Roespstorff P., and Fohlman J. (1984). Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed. Mass Spectrom. 11, 601.
Rosenblatt F. (1958). The perceptron: a probabilistic model for information storage and organization in the brain. Psychol. Rev. 65, 386-408.
Roth K.D.W., Huang Z.H., Sadagopan N., and Watson J.T. (1998). Charge derivatization of peptides for analysis by mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 17, 255-274.
181
Sadagopan N., and Watson J.T. (2000). Investigation of the Tris(trimethoxyphenyl)phosphonium acetyl charged derivatives of peptides by electrospray ionization mass spectrometry and tandem mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11, 107-119.
Sadagopan N., and Watson J.T. (2001). Mass spectrometric evidence for mechanisms of fragmentation of charge-derivatized peptides. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 399-409.
Saunders R.A., and Platts J.A. (2004). Scaled polar suface area descriptors : development and application to three sets of partition coefficients. New J. Chem. 28, 166-172.
Schultz H.P. (1989). Topoligical organic chemistry. 1. Graph theory and topological indies of alkanes. J. Chem. Inf. Comput. Sci. 29, 227-228.
Shah A.J., Crespi F., and Heidbreder C. (2002). Amino acid neurotransmitters: separation approaches and diagnostic value. J. Chromatogr. B 781, 151-163.
Shah A.J., De Biasi V., Taylor S.G., Roberts C., Hemmati P., Munton R., West A., Routledge C., and Camilleri P. (1999). Development of a protocol for the automated analysis of amino acids in brain tissue samples and microdialysates. J. Chromatogr. B 735, 133-140.
Shippy A., Shaik I., and Kottegoda S. (2002). Demonstration of lowflow push-pull perfusion. J. Neurosci. Methods 121, 93-101.
Shou M., Ferrario C.R., Schultz K.N., Robinson T.E., and Kennedy R.T. (2006). Monitoring dopamine in vivo microdialysis sampling and on-line CE-Laser-Induced-Fluorescence. Anal. Chem. 78, 6717-6725.
Shuaib A., and Siddiqui M.M. (2001). Intracerebral Microdialysis and its clinical application : a review. Methods 23, 83-94.
Sinnaeve B.A., Storme M.L., and Bocxlaer J.F.V. (2005). Capillary liquid chromatography and tandem mass spectrometry for the quantification of enkephalins in cerebrospinal fluid. J. Sep. Sci. 28, 1779-1784.
Siri N., Lacroix M., Garrigues J.C., Poinsot V., and Couderc F. (2006). HPLC-fluorescence detection and MECK-LIF detection for the study of amino acids and catecholamines labelled with naphthalene-2,3-dicarboxyaldehyde. Electrophoresis 27, 4446-4455.
Skoog D.A., West D.M., and Holler F.J. (1997). Chimie Analytique. (University, ed.), pp. 701-724, Paris.
Stobaugh J.F., Repta A.J., and Sternson L.A. (1984). Autoxidation of 1-(tert-butylthio)-2(n-propyl)isoindole. J. Org. Chem. 49, 4306-4309.
Stroink T., Wiese G., Teeuwsen J., Lingeman H., Waterval C.M., Bult A., De Jong G.J., and Underberg W.J.M. (2002). On-line coupling of SEC and RP-LC for the determination of structurally related enkephalins in cerebrospinal fluid. J. Pharm. Biomed. Anal. 30, 1393-1401.
Swartz M.E. (2005). UPLC : An introduction and review. J. Liq. Chromatogr. Rel. Technol. 28, 1253-1263.
Takekiyo T., Kato M., and Taniguchi Y. (2005). FT-IR spectroscopic study on conformational equilibria of [Leu]5-enkephalin in DMSO and ²H2O solutions. J. Mol. Liq. 119, 147-152.
Taverna M., Le Potier I., and Morin P. (2003). L'électrophorèse capillaire : Principe. Technique de l'ingénieur, traité Analyse et Caractérisation P3, 1-12.
Terabe S., Otsuka K., and Ando T. (1985). Electrokinetic chromatography with micellar solution and open-tubular capillary. Anal. Chem. 57, 834-841.
Tham S.Y., and Agatonovic-Kustrin S. (2002). Application of the artificial neural network in quantitative structure-gradient elution retention relationship of phenylthiocarbamyl amino acids derivaties. J. Pharm. Biomed. Anal. 28, 581-590.
Torchy S., B. D. (2001). N-alkylation of amines under microwaves irradiation : modified Eschweiler-Clarke reaction. J. Chem. Res. 7, 292-293.
Tracqui A., Raul J.S., Géraut A., Berthelon L., and Ludes B. (2002). Determination of blood cyanide by HPLC-MS. J. Anal. Toxicol. 26, 144-148.
182
Ungerstedt U., and Pycock C. (1974). Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull. Schweiz. Akad. Med 30, 44-55.
Ustyuzhanin P., Kogan A., Reuben B.G., and Lifshitz C. (2001). An electrospray-ionization-flow-tube study of H/D exchange in protonated leucine-enkephalin. Int. J. Chem. Kin. 33, 707-714.
Veledo M.T., De Frutos M., and Diez-Masa J.C. (2005). Amino acids determination using capillary electrophoresis with on-capillary derivatization and laser-induced fluorescence detection. J. Chromatogr. A 1079, 335-343.
Vengadesan K., and Gautham N. (2004). Conformational studies on enkephalins using the MOLS technique. Biopolymers 74, 476-494.
Vial J., and Jardy A. (1999). Experimental comparison of the different approaches to estimate LOD and LOQ of an HPLC method. Anal. Chem. 71, 2672-2677.
Viswanadhan V.N., Ghose A.K., Revankar G.R., and Robins R.K. (1989). Atomic physicochemical parameters for three dimensional structure directed quantitative structure-activity relationships. 4. Additional parameters for hydrophobic and dispersive interactions and their application for an automated superposition of certain naturally occuring nucleoside antibiotics. J. Chem. Inf. Comput. 29, 163-172.
Vogt M. (1954). Norepinephrine and epinephrine in the central nervous system. Pharmacol. Rev. 6, 31-32.
Von Euler U.S., Hamberg U., and Purkhold A. (1949). Noradrenaline and adrenaline in the suprarenals of the guinea-pig. Experientia 5, 451.
Waters Corp. (2007). http://www.waters.com/Library > How-to Guides > Mass Spec Primer > The Mass Spectrometer.
Weast R.C., A. M., and Beyer W.H. (1989). "Handbook of chemistry and physics," Florida. Whitehouse C.M., Dreyer R.N., Yamashita M., and Fenn J.B. (1985). Electrospray interface
for liquid chromatographs and mass spectrometers. Anal. Chem. 57, 675-679. Wiener H. (1947). Correlation of heats of isomerization, and differences in heats of
vaporization of isomers, among the paraffin hydrocarbons. J. Am. Chem. Soc. 69, 2636-2638.
Wiley W.C., and Mc Laren I.H. (1955). Time-of-flight mass spectrometer with improved resolution. Rev. Sci. Instr. 26, 1150-1157.
Wyndham K.D., O'Gara J.E., Walter T.H., Glose K.H., Lawrence N.L., Aldren B.A., Izzo G.S., Hudalla C.J., and Iranet P.C. (2003). Characterization and evaluation of C18 HPLC stationary phase based on ethyl-bridged hybrid organic/inorganic particles. Anal. Chem. 75, 6781-6788.
Yamamoto K., and Hornykiewicz O. (2004). Proposal for a noradrenaline hypothesis of schizophrenia. Progr. Neuro-Psychopharmacol. Biol. Psychiatry 28, 913-922.
Yan D., Li G., Xiao X.H., Dong X.P., and Li Z.L. (2007). Direct determination of fourteen underivatized amino acids from Whitmania pigra by using liquid chromatography-evaporative light scattering detection. J. Chromatogr. A 1138, 301-304.
Yang C.S., Tsai P.J., Chen W.Y., Tsai W.J., and Kuo J.S. (1999). On-line derivatization for continuous and automatic monitoring of brain extracellular glutamate levels in anesthetized rats : a microdialysis study. J. Chromatogr. B 734, 1-6.
Yang J.Z., Bastian K. C., Moore R.D., Stobaugh J.F., Borchardt R.T. (2002). Quantitative analysis of a model opioid peptide and its cyclic prodrugs in rat plasma using high-performance liquid chromatography with fluorescence and tandem mass spectrometric detection. J. Chromatogr. B 780, 269-281.
Yew D.T., Li W.P., Webb S.E., Lai H.W.L., and Zhang L. (1999). Neurotransmitters, peptides, and neural cell adhesion molecules in the cortices of normal elderly humans and alzheimer patients: a comparison. Experimental Gerontology 34, 117-33.
183
Yoshihiko W., and Kazuhiro I. (1982). Pre-column labelling for high-performance liquid chromatography of amino acids with 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole and its application to protein hydrolysates. J. Chromatogr. 239, 723-732.
Zell A., Mamier G., Vogt M., Mache N., Hübner R., Döring S., Herrmann K.U., Soyez T., Schmalzl M., Sommer T., Hatzigeorgiou A., Posselt D., Schreiner T., Kett B., Clemente G., Wieland J., and Gatter J. (2006). Stuttgart Neural Network Simulator ; User Manual. Stuttgart.
Zhang M.Y., and Beyer C.E. (2006). Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatographiy-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 40, 492-499.
Zhang X., Wulfert E., and Hanin I. (1992). Development of a sensitive and inexpensive micropush-pull technique for the continuous analysis of brain neurotransmitters and metabolites in vivo. J. Neurosci. Methods 42, 139-47.
Zhou Q., and Gallo J.M. (2005). In vivo microdialysis for PK and PD studies of anticancer drugs. AAPS J. 7, E659-E667.
Zilkha E., Obrenovitch T.P., Koshy A., Kusakabe H., and Bennetto H.P. (1995). Extracellular glutamate : on-line monitoring using microdialysis coupled to enzyme-amperometric analysis. J. Neurosci. Methods 60, 1-9.
Zonszain F., Dupont G., and Audigié O. (1992). Principes des méthodes d'analyses biochimique Tome 2. (Doin, ed.), pp. 109-125, Paris.
Zuman P. (2004). Reactions of Orthophtalaldehyde with nucleophiles. Chem. Rev. 104, 3217-3238.
UNIVERSITE TOULOUSE III – PAUL SABATIER
Auteur : Marlène LACROIX
Directeur de thèse : François COUDERC
Date et lieu de soutenance : le 17 octobre 2007 à Toulouse
Titre :
Optimisation d’une méthode de dosage de neurotransmetteurs par le couplage
LC/Fluo/MS. Etudes théoriques du marquage au NDA par spectrométrie de masse haute
résolution, modélisation moléculaire et étude quantitative de relations structure-temps de
rétention (3D-QSRR)
Résumé :
Certains acides aminés et peptides sont des neurotransmetteurs impliqués dans les
maladies neurologiques. Présents en très faible quantité dans les échantillons biologiques,
une HPLC couplée à un détecteur de fluorescence et un spectromètre de masse est utilisée
pour identifier et doser ces molécules. Les acides aminés sont marqués avec un agent
fluorogène : le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA) et un nucléophile (CN-). Pour
l’analyse des peptides enképhalines, le marquage est modifié afin de faciliter l’analyse en
spectrométrie de masse : le nucléophile CN- est remplacé par un aminothiol facilement
ionisable en mode positif, le N,N-diméthylaminoéthanethiol (MeAT). Des études théoriques
en modélisation moléculaire, spectrométrie de masse haute résolution et sur l’échange
H/D ont été réalisées pour interpréter les résultats obtenus avec chaque marquage.
Mots Clés : HPLC, Spectrométrie de masse, Détection de fluorescence, NDA, Acides
aminés, Enképhalines
Thèse de CHIMIE, spécialité : chimie macromoléculaire et supramoléculaire
Laboratoire des Interactions Moléculaires et Réactivité Chimique et Photochimique (IMRCP), UMR – 5623, Université P.Sabatier, Bât. 2R1, 118 route de Narbonne, 31062 Toulouse Cedex 9 – FRANCE.