Obecná genetika nádoru, strategie léčby a farmakogenetika

Mgr. Spiros Tavandzis Laboratoř klinické genetiky, P&R Lab a.s.

Onkologické centrum J. G. Mendela Nový Jičín

Klonální povaha nádoruVzniká vícečetnými genetickými změnamiVšechny buňky nádoru pochází původně z

jediné mutované buňky = KLONprimární příčina vzniku nádoru = MUTACEFaktory ovlivňující vznik nádoru:

genetické faktory + vliv prostředí epigenetické změny: metylace, microRNA

Základní dělení nádorůBenigní (nezhoubný) Maligní (zhoubný)pomalý růst rychlý růst

bez invaze do orgánů invaze do orgánů

bez angiogeneze angiogeneze

nemetastazuje metastazuje

ohraničen bez ohraničení

podoba s okolní tkání odlišné od okolní tkáně

nepostihuje uzliny uzliny zasaženy

Některé benigní nádory mohou být nebezpečné např. v CNS – utlačují nervovou tkáň

Maligní nádory podle původu

Karcinomy – epiteliální tkáň (90% nádorů)Sarkomy – mezenchymální tkáňLymfomy – lymfatická tkáňLeukemie – hematopoetická tkáň

Rozdělení nádorů z genetického hlediska

ZÍSKANÁ vs. DĚDĚNÁ ZMĚNA

Převážná většina nádorů vzniká spontánně aktivací určitých genů nebo jejich vyřazením z funkce = KANCEROGENEZE

Forma nádoru

% z celkového počtu výskytu nádoru Celoživotní

úroveň rizika vzniku

Způsob vzniku

ca prsu ca kolorekta

Sporadická 80% 75% Populačnínáhodně (prostředí)

Familiální 10-15% 20% Střednípolygenní + prostředí

Hereditární (predispozice) 5-10% 5% Vysoká monogen

ní

Úrovně ochrany organismu před látkami přijímanými z prostředí (xenobiotiky)

Organismální (vylučování, pocení) Tkáňová (chemická modifikace xenobiotik v játrech)Buněčná (aktivita imunitních buněk, tvorba protilátek,

apoptóza poškozené buňky)Molekulárně genetická (reparace poškození DNA) v těle

vzniká v průběhu života cca 30-50 mutací/dipl. genom/generaci.

Příjem xenobiotik: potrava, tekutiny, vzduch = část negenetické složky variability

INICIACE

PROMOCE

PROGRESE

ApoptózaBuněčná toxicita

Buňka s adukty Iniciovaná buňka

Reparace DNA

Normální buňka

Buněčné dělení

Buněčné dělení

Buněčné dělení

MALIGNÍ NÁDOR

PRENEOPLASTICKÁ LÉZE

GENOTOXICKÉ kancerogeny

NEGENOTOXICKÉ kancerogeny

- endokrinní faktory- zánět- výživa

Genetické změny

Další genetické změny

Detoxikační Systémy buňky

Proces kancerogeneze

Proces kancerogenezeIniciace (mutace, onkogenní viry) - trvalá změna v

DNAPromoce – růstová výhodaProgrese - zisk dalších výhod (neomezený růst,

únik apoptóze, neoangiogeneze, nezávislost na podnětech)

Metastáze – extracelulární matrix, migrace,

PRO MALIGNÍ TRANSORMACI BUŇKY JE NUTNÝCH 6 – 7 GENETICKÝCH ZMĚN

Vznik nádoru je boj mezi obrannými mechanizmy organizmu a nově získanými

vlastnostmi nádorové buňky

Základní úkol zdravé buňky je udržet svou genetickou informaci bez poškození

Zisk nových vlastnostíNeomezený růst (vysoká aktivita telomerázy)Angiogeneze (zvýšená exprese VEGF)Nezávislost na růstových signálech (autokrinní

stimul)Nereaguje na sebevražedné signály Schopnost invaze (aktivní metaloproteázy,

kolagenázy)Schopnost průniku do krve nebo lymfy

(poškození mezibuněčné adheze

Tyto vlastnosti jsou v zájmu farmaceutických firem

DOBRÉ – jsme schopni se bránit Reparace (mutátorové geny) Detoxikační systémy

ŠPATNÉ – poškození reparace = zvýšení mutační rychlosti až 1000x - poškození genů detoxikačního systému

POŠKOZENÍ INTEGRITY GENOMU

JEŠTĚ HORŠÍ – ztráta nádorového supresoru nebo aktivace protoonkogenu

NEJHORŠÍ – kombinace a kumulace změn

Maligní transformace buňkyDobré, špatné, ještě horší…

Molekulární podstata kancerogeneze AKTIVACE PROTOONKOGENU

Způsoby aktivace:Mutace: c-K-ras ztráta GTPázové aktivity – trvale aktivní

Amplifikace: c-MycTranslokace: fůze bcr-abl Inzerční mutageneze: transdukce retrovirů

Funkce protoonkogenů: regulace b. dělení, přenos signálu Mutace protoonkogenů v somatických buňkách = nedědí seÚčinek mutace na fenotyp: autozomálně dominantní

Protoonkogen → onkogen → onkoprotein (cíl terapie)

aktivace

Molekulární podstata kancerogeneze produkty ONKOGENŮ

Transkripční faktory: MYC, FOS, JUNNereceptorové proteinkinázy:G-proteiny: RASRůstové faktory: EGFReceptory růstových faktorů: EGFRmicroRNA inhibující nádorové supresory

Potenciální terapeutické cíle

Molekulární podstata kancerogeneze NÁDOROVÉ SUPRESORY

Rb - retinoblastomAPC – familiální adenomatózní polypózaTP53 - Li-Fraumeniho syndrom (mutován u 50%

nádorů)

BRCA1/2 - karcinom prsu / vaječníkůMSH2, MLH1 – kolorektální karcinom

Funkce nádorových supresorů: potlačení proliferace buněk

Mutace v zárodečných buňkách = dědičná predispozice (AD)

Účinek mutace na fenotyp: autozomálně recesivní ztrátou heterozygozyty (mutace, delece, nondisjunkce atd.)

Reparační geny

Léčba nádoruChemoterapie:

DNA poškozující (deriváty cis Pt) mitotické jedy (vinblastin apod.) – zástava replikace

Radioterapie – zlomy v DNA

Hormonální terapie (Tamoxifen)

Biologická léčba: Antiangiogenní Diferenciační Inhibitory proteazomu Inhibitory tyrosinkináz Léčba monoklonálními protilátkam

Biologická léčba nádoruAntiangiogenní Diferenciační Inhibitory proteazomuInhibitory tyrosinkinázLéčba monoklonálními protilátkami

Cílové struktury léčivSložky signálních drah (fůzní produkt bcr-abl – Glivec , CML)Receptory (EGFR, HER2/neu, ca prsu)proteazómy

Při léčbě sledovány také jiné markery

PredikcePrognózaUltrastagingSledování (MRN)

Cílové struktury léčiv Složky signálních drah

Produkt fůzního genu bcr-abl: vznik translokaci t(9;22), chybí kinázová reg. doména → trvalá aktivita kinázy abl

Detekce fůzního produktu PCRCML -> lék Glivec = kompetitor původního substrátu

Fůzní produkty:Major – CML a 30-50% ALLMinor - ALL

Cílové struktury léčivReceptory (HER2/neu,c-erbB2)

Amplifikace u 15-25% invazivních ca prsu: lék Herceptin (Trastuzumab)

Popis léku Použití Účinek Vznik rezistence k němu

Cílové struktury léčivReceptory

Detoxikační systém buňky - systém gp-P

Gp-P protein kódován genem MDR1 (multidrug-resistance)Rodina ABC transporterů (ATP binging cassette), 7 podrodinŠiroká substrátová specifita

Funkce: transport xenobiotik přes intra- a extracelulární membrány (ATP-dependentní „odtoková“ pumpa xenobiotik)

Lokalizace: játra, ledviny, střeva

Způsobuje rezistenci vůči široké škále lékům, včetně protinádorových.

Detoxikační systém buňky - systém cytochrómu P450

První fáze detoxikace - transformační: zvyšování polarity xenobiotik (např. vazbou -OH skupin)

Účast také na přeměně promutagenů na genotoxické kancerogeny (epoxidy ap.)

Monooxygenázy závislé na cytochromu P450: Flavinové oxygenázy (odstraňují sloučeniny obsahující N,S,P) Reduktázy ADH, SOD, glutathionperoxidázy, katalázy

Druhá fáze detoxikace - konjugační: konjugace s produkty buňky a vyloučení

GST -> vysoká hladina v nádorech, braní léčbě Metyltransferázy- př. TPMT (thiopurin-S-methyltransferáza) UDP-glukuronozyltransferázy - > glukuronidace (játra, ledviny)

Detoxikační systém buňky - systém cytochrómu P450

Aktivita enzymů (odezva na léčbu) je ovlivněna: faktory prostředí (podávání enzymových inhibitorů, strava,

hormony apod.) mutacemi v důležitých oblastech genů, které je kódují

pomalí metabolizátoři – mutace na obou alelách = kompletní deficit daného enzymu = kumulace léčiv (TOXICITA)

středně rychlí metabolizátoři – mutace na jedné alele – dostačuje běžná dávka

rychlí metabolizátoři - bez mutace = nedostatečná hladina léku (BĚŽNÁ DÁVKA NEÚČINNÁ)

Zpracování xenobiotik systémem cytochromu P450

Monooxygenázy závislé na cytochromu p450: nadrodina CYP

18 rodinpodrodiny A-Q

Široká substrátová specifita (psychofarmaka,chemoterapeutika, imunosupresiva atd.)

inducibilita

Nežádoucí účinky léků jsou 4. až 6. nejčastější příčinou úmrtí v

USA.

Důvody rozdílné odezvy na léčbuIndividualita každého organismu:

Stejný lék -> různí lidé -> různá odezva (rezistence , toxicita, normální metabolizace)

(interakce genotyp <-> prostředí)

Rychlejší odstraňování léku z buněk (větší počet ABC transportérů)Snížená / zvýšená aktivita enzymu detoxikačního systému (mutace

enzymů detoxikační kaskády)V buňkách mohou chybět nebo mohou být změněny cílové proteiny

pro použitý lék (mutace, změna exprese)Vliv prostředí (hormony, strava, léky apod.)

NUTNÁ ÚPRAVA DÁVKY NEBO ZMĚNA LÉKU

Farmakogenetika(-omika)Zkoumá účinnost léčby v závislosti na genotypu jedince.

Důvodem rozdílné odezvy na léčbu je variabilita na úrovni DNA(polymorfismy, delece, inzerce)

Farmakogenetika (-omika) poskytuje odpovědi na otázky:

Jak léčit? - správný výběr léku (lék na míru)Koho léčit? - výběr pacientů podle profitu z léčby

PREDIKCE a PROGNÓZA

Farmakogenetika nebo farmakogenomika?

Farmakogenetika: analýza jednoho nebo několika polymorfismů u známých genů asociovaných s metabolizaci určitého léku.DNA úroveň – vliv mutace na aktivitu enzymu

Farmakogenomika: analýza expresního profilu velkého počtu nespecifikovaných genů (desítky až tisíce genů) u vybrané skupiny pacientů. RNA úroveň - porovnáváním expresních profilů

lze : vytipovat nebo sledovat expresi skupin genů asociovaných s

odpovědi na léčbu (neúčinnost léčby, toxicita). zjistit skupiny pacientů s příznivou x nepříznivou prognózou

Metody farmakogenetiky PCR – sledování patogenních mutací ve

vybraných genech

Q-RT-PCR - sledování úrovně exprese několika genů

Microarrays – souběžná analýza velkého počtu genů (řádově až tisíce) – vyhledávání odlišností v expresním profilu

Prognóza onemocnění a predikce léčby

Prognóza: dle výsledku stagingu a gradingunutné průběžně monitorovat účinek zvoleného

léku.

Včasný záchyt mikrometastáz (sledování MRN)

Prognóza Klinický a histopatologický odhad rizika

je založen na sledování nepřímých parametrů:

• Věk • Velikost nádoru• Postižení lymf uzlin• Histologický grade atd.

Tyto směrnice mohou vést ke zbytečné léčbě mnoha pacientů!

Způsob léčbydle doporučení

směrnic EU a US

Prognóza a monitoring léčbyStandardně používané metody

Histologie a IHC: PCAN, Ki67 prolif. aktivita, onkoproteiny, receptory HER2, ER

Fyzikální metody (MRI, CT apod.)

Biochemické a sérologické metody (ELISA) Cytogenetika

Prognóza a monitoring léčbyMolekulárně biologické a genomické metody

Imunomagnetická selekce nádorových buněk Krev

Ultrastaging - exprese vybraných genů asociovaných s nádorem

Q-real time RT-PCR Low density arrays Microarrays

Primární nádor