제 1형 당뇨병 동물모델에서

Single- Chain Insulin Analog를

이용한 유전자 치료

연세대학교 대학원

의과학사업단

김 수 진

제 1형 당뇨병 동물모델에서

Single- Chain Insulin Analog를

이용한 유전자 치료

지도교수 이 현 철

이 논문을 박사 학위논문으로 제출함

2000년 12월 일

연세대학교 대학원

의과학사업단

김 수 진

김수진의 박사 학위논문을 인준함

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

연세대학교 대학원

2000년 12월 일

감사의 글

무엇보다도 지금까지 저를 사랑으로 인도하여 주시고 언제나 저의 생각과 마

음을 지켜주시는 하나님께 먼저 감사드립니다.

돌이켜 생각해 보면 지난 3년여간의 기간동안 많이 게으르고 부족한 제가 정

말 많은 분들의 따뜻한 관심과 도움을 받았습니다. 이것은 저에게는 아주 소중

한 기억으로 남을 것이며 제가 앞으로 살아가는 데 있어서도 큰 힘이 될 것 같

습니다.

우선 본 논문을 완성하기까지 세심한 지도와 격려를 아끼지 않으셨던 이 현철

교수님께 진심으로 감사드리며 연구를 진행하는 과정에서 연구방향의 설정을

바로잡아주시고 제가 힘들어 할 때마다 온갖 도움과 격려를 아끼지 않으셨던 김

경섭 교수님께 마음으로부터의 감사를 드리고 싶습니다. 그리고 바쁘신 중에도

논문 내용을 세심하게 살펴주시고 각별한 조언을 아끼지 않으신 김 주항 교수

님, 이 진성 교수님, 허 갑범 교수님께도 감사드립니다. 또한 본 연구를 시작하는

데 있어서 기초가 되었던 mutant 프로인슐린을 제작하여 주신 내분비 연구소

신 항철 교수님과 저에게 날카로운 데이타 분석과 논문쓰는 표본을 몸소 보여주

셨던 윤 지원 교수님께도 감사드립니다.

제가 힘들어할 때마다 용기를 불어넣어 주시고 따뜻한 충고를 해 주셨던 내분

비 내과 강사 안 철우 선생님과 많은 기쁨을 함께 나누었던 실험실의 이 근택

선생님, 조 정산 선생님께 깊은 감사를 드립니다. 제가 실망하여 포기하려 하던

순간에조차도 저를 믿어주시고 제가 다시 일어설 수 있도록 저를 위하여 항상

기도하여 주시는 어머님과 모자란 저를 예쁘게만 보아주시는 시어머님, 형님 내

외분께도 감사드립니다.

끝으로 저의 오래된 친구이자 동반자인 사랑하는 남편에게 저의 작은 결실을

드리고 싶습니다.

2000년 12월

저자 씀

차례

국문요약 1

I . 서 론 3

II . 재 료 및 방법 6

1 . 실험 동물 6

가 . 스트렙토조 토신에 의해 유도된 당 뇨백서 6

나 . n on - obe s e diab et ic (N OD ) m ou s e 6

2 . m ut ant 프로 인슐린 (S IA )의 제조 , 분리 및 특 성분석 6

3 . pS IA , pLP K - S IA 의 제조 및 in v iv o tran s du ct ion

4 . rA A V - S IA , rA A V - LP K - S IA 의 제조 및 in v iv o tran s du c tion 7

5 . P CR , RT - P CR an aly s i s 8

6 . RN a s e prot e c t ion a s s ay (RP A ) 8

7 . N orth e rn blot an aly s i s 8

8 . S out h ern blot an aly s i s 8

9 . W e s t e rn blot an aly s i s 9

10 . 혈 장 인슐린 , S IA , C - 펩타이드 , 글루카 곤 및 혈당농도의 측정 9

11 . h e m at ox y lin an d e o s in (H &E ) s t ain in g 및 면역조직화학 검사 9

12 . H y perg ly c e m ic c lam p ex perim e nt 9

III . 결과 10

1 . S IA 단 백질의 특성 10

2 . 스트 렙토조토신에 의 해 유도된 당뇨백서 에서

pLP K - S IA 의 일시적인 발현효 과 12

가 . pLP K - S IA 의 일시적 인 혈당강하효과 12

나 . 간장에서 S IA 의 선택적인 발현 12

다 . pLP K - S IA 가 간장에 존 재하는 유전자들 의

발현에 미치는 영향 12

3 . 스트 렙토조토신에 의 해 유도된 당뇨백서 에서

rA A V - LP K - S IA 의 장 기적인 발현효과 13

가 . rA A V - LP K - S IA 의 용량별 효과 13

나 . 당뇨치료백 서에서 rA A V - LP K - S IA D N A 의

in t e g ration 상 태 15

다 . 당뇨치료백 서의 간장에서 S IA 의 발현양상

및 S IA 의 발현이 간장 에 미치는 영향 16

라 . 당뇨치료백 서에서 내재적인 인 슐린의 발현양상 18

마 . 혈당농도에 따 른 S IA 의 발현양상 18

바 . 정상대조백 서와 당뇨치료백 서에서

복강 내 당부하검사 2 0

사 . 정상대조백 서와 당뇨치료백 서에서 당 부하에 따른

간장에 존재하는 유 전자들의 발현조 절양상 2 0

아 . LP K 프로 모터의 활성도에 GK가 미 치는 영향 2 1

자 . rA A V - LP K - S IA 가 주입된 정상 대조백서에서 의 반응양상 2 3

4 . N OD m ou s e에서 rA A V - LP K - S IA 의 장기적인 발 현효과 24

가 . 당뇨치료 N OD m ou s e에서 S IA 의 발현양 상 및 효과 24

나 . 당뇨치료 N OD m ou s e에서

rA A V - LP K - S IA D N A 의 in t e g rat ion 상태 25

다 . 당뇨치료 N OD m ou s e에서 복강 내 당부하검 사 26

라 . 당뇨치료 N OD m ou s e의 간장에서 S IA

및 내재적인 인슐린 의 발현양상 26

IV . 고찰 27

V . 결론 36

참 고문헌 37

영 문요약 4 3

그 림 차례

그림 1 . pSIA, pLPK- SIA construct의 모식도 7

그림 2 . pLPK - SIA의 일시적인 혈당강하효과 11

그림 3 . PCR 및 RT - PCR analysis 12

그림 4 . PEPCK, LPK, GK의 mRNA level 13

그림 5 . rAAV- LPK- SIA의 용량별 효과 14

그림 6 . 당뇨치료백서에서 rAAV - LPK - SIA DNA의 integration 상태 15

그림 7 . 당뇨치료백서의 간장에서 SIA의 발현양상 16

그림 8 . 당뇨치료백서에서 내재적인 인슐린의 발현양상 17

그림 9 . 혈당농도에 따른 SIA의 발현양상 18

그림 10 . 정상대조백서와 당뇨치료백서에서 복강 내 당부하검사 19

그림 11 . 정상대조백서와 당뇨치료백서에서 당부하에 따른

간장에 존재하는 유전자들의 발현조절양상 21

그림 12 . 금식시간과 과당, 글리세롤 부하에 따른

복강 내 당 부하검사 양상의 변화 22

그림 13 . rAAV - LPK- SIA가 주입된 정상대조백서에서의 반응양상 23

그림 14 . 당뇨치료 NOD mouse에서 SIA의 발현양상 및 효과 25

그림 15 . 당뇨치료 NOD mouse에서

rAAV - LPK- SIA DNA의 integration상태 26

그림 16 . 당뇨치료 NOD mouse에서 복강 내 당부하검사 27

그림 17 . 당뇨치료 NOD mouse의 간장에서 SIA

및 내재적인 인슐린의 발현양상 28

표 차례

표 1 . SIA 단백질의 특성 11

국문요약

제 1형 당 뇨병 동물 모델 에서 Si ngl e - Chai n Ins ul i n Anal og를

이용 한 유 전자 치료

제 1형 당뇨병은 인슐린을 분비하는 췌장베타세포의 파괴가 림파구에 의해 이루어지는

일종의 자가면역질환으로 절대적인 인슐린의 결핍현상을 나타낸다. 제 1형 당뇨병의 주된

치료방법으로는 매일 2회 이상의 인슐린 투여가 이루어지고 있으나 이러한 방식으로는 생

리적 자극에 따라 다양하게 변화되는 인슐린의 요구량을 정확하게 충족시키기가 어렵기 때

문에 고혈당이나 저혈당상태에 방치되기가 쉽다. 특히 장기간 고혈당이 지속되면 여러 기관

에 세포상해를 일으켜 만성 합병증을 일으키기 쉽기 때문에 이렇게 외부의존적으로 이루어

지는 인슐린의 투여가 제 1형 당뇨병의 완벽한 치료법이라고 말하기는 어려운 실정이다. 다

른 한편에서는 제 1형 당뇨병 환자의 체세포에서 유전자 치료에 의해 인슐린 분비능을 회복

시키고자 하는 시도들이 이루어지고 있는데 이러한 치료시도는 기존의 혈당강하제와 비교

할 때 자체적인 인슐린 분비기능 회복이라는 측면에서 보다 근본적인 치료방법으로 생각되

어지며 장기이식보다 더 광범위하게 적용되어질 수 있을 것으로 사료된다. 이러한 치료법이

성공하기 위해서는 첫째, 유전자치료에 있어서 적합한 대상세포의 선정이 이루어져야 하고

둘째, 기존의 프로인슐린보다 혈당강하능력이 뛰어난 m utant 프로인슐린이나 인슐린이 치

료유전자로 사용되어야 하고 셋째, 이러한 치료유전자의 발현과 분비는 혈당농도에 의해 정

확하게 조절되어야 하며 넷째, 생체 내에서 치료유전자의 발현이 장기간 이루어질 수 있는

효율적인 유전자전달체계를 이용하여야 한다.

따라서 본 연구에서는 프로인슐린에서 인슐린으로의 효소적 전환 과정을 거치지 않고도

생체 내에서 뛰어난 혈당강하능력을 가지는 m ut ant 프로인슐린 (single- ch ain in sulin

an alog , SIA )을 개발하여 치료유전자로 사용하였고, 간세포에서 혈당농도의 변화에 따라

SIA의 발현이 장기간 안정적으로 조절될 수 있도록 간세포 특이적인 L - type pyruv at e

kin ase (LPK ) 프로모터와 재조합 adeno- associat ed viru s (rAAV ) v ector sy st em을 이용하

여 유전자치료를 시도하였다. 그 결과, 스트렙토조토신의 처리에 의해 인위적으로 당뇨병을

유발시킨 당뇨백서모델이나 자가면역반응에 의해 당뇨병이 발증된다고 알려져 있는

non - obese diab etic (NOD) m ice 모델에서 SIA를 이용한 유전자치료를 통해 장기간 안정적

인 혈당의 교정이 가능하였으며, 췌장에서 분비되는 내재적인 인슐린의 작용을 완전히 배제

하고도 간장에서 발현, 분비되는 SIA 만으로 정상혈당이 유지될 수 있었다. 간장에서 LPK

프로모터에 의한 SIA의 발현은 혈당농도의 변화에 따라 엄격하게 조절되었으며, 특히 정상

대조백서에 재조합 viru s particle을 주입한 경우에도 저혈당현상이 관찰되지 않았다. 복강

내 당부하검사 결과 정상대조군과 당뇨치료군은 서로 상이한 반응양상을 나타내었지만 비

- 1 -

공복상태에서는 당뇨치료군이 항상 정상혈당농도를 유지하고 있는 것으로 보아 SIA의 발현

은 생리적 자극에 따라 잘 조절되고 있으며, 이 밖에도 정상혈당의 유지를 위하여 생체내의

다른 h om eost asis sy stem의 도움을 받고 있는 것으로 생각된다. 특히 정상대조백서와 비교

하여 당뇨치료백서에서 당 부하에 따른 당 분해효소들의 전사단계에서의 빠른 양적 변화는

혈당농도의 조절에 어느 정도 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구에서는 제 1형 당뇨병 실험동물모델에서 SIA를 이용한 유전자치료를 통해 생리적

자극에 따른 정교한 혈당교정이 이루어질 수 있음을 증명하였다. 특히 사람에서의 제 1형

당뇨병과 유사한 발병기작에 의해 당뇨병이 발증된다고 알려져 있는 NOD mice 모델의 경

우 간세포에서 장기간 SIA가 발현됨에도 불구하고 별다른 면역반응이 유발되지 않았다는

사실은 SIA를 이용한 유전자치료책이 사람에게도 치료적 가치를 가질 수 있음을 시사한다.

그러나 앞으로 이러한 개념의 치료를 보다 구체화하고 사람의 당뇨병 치료에 도입하기 위

해서는 좀 더 사람과 유연관계가 가까운 대동물에 적용하여 그 가능성을 타진해 보아야 할

것으로 생각된다.

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핵심되는 말: 제 1형 당뇨병, sin gle- ch ain in sulin an alog (SIA ), 유전자치료, L - type

pyruv ate kin ase (LP K ) 프로모터, 재조합 adeno- associat ed viru s (rAAV ), n on - ob ese

diabetic (NOD ) m ice

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제 1형 당 뇨병 동물 모델 에서 Si ngl e - Chai n Ins ul i n Anal og를

이용 한 유 전자 치료

< 지도 이 현 철 교수>

연세대학교 대학원 의과학사업단

김 수 진

I . 서 론

당뇨병은 포도당의 세포 내 흡수에 관여하는 인슐린 작용의 이상으로 포도당이 혈액 내

에서 적절한 농도로 유지되지 못함으로서 발생되는 대표적인 만성대사질환이다. 당뇨병은

경제발전 및 서구화에 따라 점차적으로 증가하는 질병으로 암, 고혈압 등과 함께 대표적인

성인병의 하나인 것으로 알려져 있다. 당뇨병은 그 병태 생리의 원인에 따라 크게 제 1형 당

뇨병과 제 2형 당뇨병의 두 가지 형태로 분류되는데 제 2형 당뇨병은 인슐린 저항성과 이에

따른 인슐린의 상대적 결핍으로 인해 발병되는 것으로 알려져 있으며 제 1형 당뇨병은 인슐

린을 분비하는 췌장베타세포의 선택적인 파괴로 인해 발병되며 인슐린의 절대적 결핍현상

을 나타낸다고 알려져 있다. 제 1형 당뇨병은 소아, 청소년 및 젊은 성인에서 주로 나타나는

당뇨병으로 발병이 대부분 급격하고 케토시스 경향이 있으며 절대적인 인슐린의 부족으로

생명을 유지하기 위해서는 인슐린의 투여가 반드시 필요하다.1 - 2 이러한 제 1형 당뇨병은 장

기 특이적인 자가면역질환의 일종으로 밝혀져 있으며 환자의 유전적 감수성과 환경인자가

관련된 것으로 생각되고 있다.3 - 4

제 1형 당뇨병의 주된 치료방법으로는 매일 2회 이상의 인슐린 투여가 이루어지고 있으

나 최근에 들어서는 3회 이상의 인슐린 투여가 합병증의 유발을 지연시킨다고 보고되어있

다. 하지만 이러한 방식으로는 여러 가지 생리적 자극에 따라 다양하게 변화되어지는 인슐

린의 요구량을 정확하게 충족시키기가 어렵기 때문에 고혈당이나 저혈당상태에 방치되어지

기 쉽다. 특히 장기간 고혈당이 지속되면 여러 종류의 기관에 세포상해를 일으켜 만성 합병

증을 일으키기 쉬운데 당뇨병 환자에서 발생되는 대부분의 문제점은 만성합병증으로 인한

것으로 당뇨병은 성인에 있어서 시력소실의 중요한 원인이며, 혈액투석을 받는 환자에 있어

서도 원인질환의 1/ 3을 차지한다. 또한 하지절단 환자중 절반은 당뇨병에 이환되어 있는 경

우이다. 상대적인 위험성으로 볼 때 당뇨병환자는 당뇨병이 없는 건강인에 비하여 시력소실

의 가능성이 25배 이상이고, 신장질환의 위험성이 17배 이상이며, 주요 사지절단 위험성이

- 3 -

30- 40배이고 심혈관질환이나 뇌혈관질환에 이환될 위험성이 2배이다.5 국내에서도 1990년

에 들어서면서부터 당뇨병으로 인한 합병증이 10대 사망원인에 들게 되었다. 이러한 사실들

을 고려하여 볼 때 이렇게 외부의존적으로 이루어지는 인슐린의 투여가 제 1형 당뇨병에 있

어서 완벽한 치료법이라고는 말하기 힘들다.6

다른 한편에서는 내재적인 인슐린 분비기능을 자체적으로 회복시키기 위하여 췌장이나

췌도세포의 이식이 시도되고 있다. 이러한 장기이식은 계속적으로 인슐린을 투여할 필요는

없으나 공여자의 제한이 따르고 면역거부반응을 일으켜 실패확률이 높으며 성공하였다고

할지라도 평생 면역억제제의 투여를 받아야 하는 등의 단점을 가지고 있어7 아직까지는 대

다수의 당뇨병 환자에서 이러한 장기이식을 시행한다는 것이 어려운 실정이다.8

최근 유전자조작기술을 응용한 유전자치료책으로 제 1형 당뇨병 환자의 체세포에서 인슐

린 분비능을 회복시키고자 하는 시도들이 이루어지고 있는데 이러한 치료시도는 기존의

혈당강하제와 비교할 때 자체적인 인슐린 분비기능 회복이라는 측면에서 보다 근본적인 치

료방법으로 생각되어지며 장기이식보다 더 광범위하게 적용되어질 수 있을 것으로 사료된

다. 유전자 치료책들은 비췌장세포를 대상으로 하여 주로 시도되고 있는데 그 이유는 제 1

형 당뇨병환자의 경우 췌장베타세포의 90% 이상이 이미 파괴된 상태이므로 이러한 세포에

서 인슐린 분비기능을 회복시키는 것은 그 치료효율이 많이 떨어질 것으로 생각되어지기

때문이다.9 일부에서는 췌장베타세포의 재생이 이루어지도록 유전자치료를 시도하고 있지만1 0 - 1 2 아직까지는 췌장베타세포의 재생기전이 확실히 규명되어 있지 않은 상태이기 때문에

유전자치료의 대상 유전자 선정에 문제가 있고 췌장베타세포의 재생에 성공한다고 할지라

도 재생된 베타세포가 자가면역기전에 의해 다시 파괴될 위험성이 있기 때문에 베타세포를

대상으로 하는 유전자치료는 현재 답보적인 상태이다. 한편 비췌장세포를 대상으로 하는 인

슐린 유전자 치료책들은 개체내에서 자가복제하여 오래도록 존재하고 분화, 증식하여 이입

유전자의 발현이 안정적으로 증폭될 수 있는 세포를 대상으로 하여 주로 시도되어지고 있

는 추세이다.1 3 비췌장세포를 대상으로 하여 유전자치료를 하는 경우에는 자가면역반응에

의해 치료유전자를 발현하는 대상세포가 파괴될 위험이 적으므로 지속적으로 인슐린이 공

급될 수 있고 당뇨병의 후기에 잔존하는 베타세포가 적을 때에도 적용할 수 있다는 장점이

있다.

비췌장 세포를 대상으로 하여 인슐린 유전자치료가 시도되었던 예를 살펴보면 1993년

M oore등은 제 1형 당뇨병을 대상으로 하는 유전자 치료책의 하나로 전엽분화 암세포주인

AtT 20 세포주에 사람 프로인슐린의 cDNA를 이입하여 신경세포에서 인슐린 분비기능이 회

복되도록 시도하였었고,1 4 1994년 Dav alli등은 중엽분화 암세포주인 proopiom elan ocortin

(POM C) 발현세포주에 사람 프로인슐린의 cDNA를 이입하여 유전자치료를 시도하였었다.1 5

이러한 신경세포들은 프로인슐린에서 인슐린으로의 전환에 관여하는 prohorm on e

conv erta se (PC)를 가지고 있기 때문에 신경세포에서는 생체활성도가 높은 인슐린이 만들

어질 수 있다.1 6 또한 인슐린의 분비도 췌장베타세포와 유사한 기작, 즉 포도당에 의해 세포

- 4 -

막상에 존재하는 칼슘채널이 열리면서 세포내로 칼슘이온이 유입되고 칼륨이온은 유출되는

신호전달에 의해 인슐린의 분비가 일어난다.1 7 - 1 9 그러나 췌장베타세포의 경우에는

glu cokin ase (GK )와 포도당전달체인 glu cose tr an sporter 2 (GLUT 2)에 의해 포도당감식체

계가 이루어지는데 반하여 신경세포는 GK는 췌장베타세포와 비슷한 정도로 발현되지만 또

다른 포도당감식계인 GLUT 2가 발현되지 않아 췌장베타세포와 유사한 포도당감식체계가

이루어지지 못한다. 게다가 부신피질자극 호르몬의 분비가 포도당에 의해 자극을 받는다고

알려져 있으므로 쿠싱증후군과 같은 부작용도 우려된다.2 0

인슐린 유전자치료에서 또 한가지 고려되어져야 할 점은 치료유전자 자체가 인슐린이나

프로인슐린이라는 호르몬이기 때문에 그 발현정도가 여러 가지 생리적 자극, 특히 혈당농도

의 변화에 따라 민감하게 조절되어야 한다는 것이다.2 1 - 2 5 초기에 시도되었던 인슐린 유전자

치료법들 가운데에는 이러한 문제점때문에 실패했었던 예가 많은데 cyt om egaloviru s

(CMV ) 프로모터나 레트로바이러스의 lon g term inal r epeat s (LT R )와 같은 강력한 프로모

터 뒤쪽에 치료유전자를 붙여서 대상세포에 이입한 경우 고인슐린혈증과 이에 따른 저혈당

증으로 실패한 사례도 있었다.2 6 1994년 Valera등은 간세포에서 프로인슐린의 발현 및 분비

가 혈당농도의 변화에 따라 민감하게 조절되도록 하기 위해서 프로인슐린의 cDNA 앞쪽에

간세포 특이적인 ph osphoenolpyruv ate carboxykin ase (PEPCK ) 유전자의 프로모터를 붙여

형질전환 생쥐를 만들었다.2 7 PEPCK는 당신생과정에서 ox aloacetate에서

ph osphoenolpyruv ate로의 전환에 관여하는 효소로 PEP CK 프로모터에는 글루카곤과 반응

할 수 있는 cAMP respon se elem ent (CRE )와 인슐린과 반응할 수 있는 in sulin r espon se

elem ent (IRE )가 각각 존재하기 때문에 글루카곤/ 인슐린의 비에 의해서 그 활성도가 조절되

게 된다.2 8 - 2 9 글루카곤은 PEP CK 프로모터의 활성도를 증가시키는 반면 인슐린은 프로모터

의 활성도를 억제시키므로 chim eric fu gion g en e (PEPCK 프로모터/ 프로인슐린 cDNA )은

글루카곤/ 인슐린의 비가 정상인보다 높은 경향이 있는 당뇨병환자들의 경우 자동적으로 전

사단계에서 활성화될 수 있다. 그러나 간세포에서 만들어진 인슐린은 다시 PEP CK 프로모

터의 활성도를 억제시킴으로써 장기적인 치료유전자의 발현 및 분비는 기대하기 어려울 것

으로 생각된다. 이론적으로 생각해 볼 때 치료유전자가 지나치게 많이 분비되어 저혈당상태

가 되었을 경우에는 반대로 글루카곤이 분비되어 PEP CK 프로모터가 활성화됨에 따라 치

료유전자는 더 많이 분비되게 되어 저혈당을 더욱 악화시키는 부작용을 초래하게 될 수도

있다. 그러나 chim eric fu sion g ene (PEP CK프로모터/ 프로인슐린 cDNA )을 이용하여 만들

었었던 형질전환 생쥐의 경우, 인슐린보다 혈당강하능력이 많이 떨어지는 프로인슐린

cDNA를 치료유전자로 사용하였기 때문에 당뇨병을 유발시켰을 때 아주 미미한 혈당강하

효과를 나타내었으며 이론적으로 생각해볼 수 있었던 저혈당현상은 실제로는 나타나지 않

았다고 보고되어 있다.

외국에서 시행되었던 인슐린 유전자 치료법들의 경우 그 실패원인을 분석하여 볼 때 이

러한 치료법이 성공하기 위해서는 첫째, 유전자 치료를 위한 적합한 대상세포의 선정이 이

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루어져야 하고 둘째, 기존의 프로인슐린보다 혈당강하능력이 우수한 m ut ant 프로인슐린이

나 인슐린이 치료유전자로 사용되어야 하고 셋째, 이러한 치료유전자의 발현과 분비는 혈당

농도에 의해 정확하게 조절되어야 하며 넷째, 생체 내에서 치료유전자의 발현이 장기간 이

루어질 수 있는 효율적인 유전자전달체계를 이용하여야 한다.

본 연구에서는 상기한 문제점들을 해결하고 제 1형 당뇨병 실험동물모델에서 생리적 자

극에 따라 정교한 혈당교정이 이루어질 수 있는 유전자 치료책을 개발하기 위하여 프로인

슐린에서 인슐린으로의 효소적 전환과정을 거치지 않고도 생체 내에서 뛰어난 혈당강하능

력을 가지는 m utant 프로인슐린 (sin gle- chain in sulin an alog , SIA )을 개발하여 치료유전자

로 사용하였다. 그리고 간세포에서 혈당농도의 변화에 따라 SIA의 발현이 장기간 안정적으

로 조절될 수 있도록 간세포 특이적인 L - type pyruv at e kin ase (LP K ) 프로모터와 재조합

adeno- associat ed v iru s (rAAV ) v ector sy stem을 이용하여 유전자치료를 시도하였는데 특

히 유전자 치료의 효과 및 안정성, 그리고 SIA의 발현조절양상에 주안점을 두어 연구를 수

행하였다.

I I . 재료 및 방 법

1 . 실 험 동 물 .

가 . 스 트 렙토 조 토 신 에 의 해 유 도 된 당 뇨 백 서 .

8- 10 주령의 수컷 Spragu e- Daw ley (SD) rat (200- 250g in b ody w eight )에 스트렙토조

토신 (60 m g/ kg )을 복강주사하여 당뇨를 유발시키고 고혈당상태 (혈당농도 450 m g/ dl 이

상)로 최소 2주간 방치시킨 후 실험에 사용하였다.

나 . n on - ob e s e diab et ic (N OD ) m ou s e .

20- 25주령의 암컷 NOD m ou se (30- 35g in body w eight )는 당뇨가 발증된 후 고혈당상

태 (혈당농도 450 m g/ dl 이상)로 최소 2주간 방치시킨 후 실험에 사용하였다.

2 . m u tan t 프 로 인 슐린 (s in g le - ch ain in s ulin an alo g , S IA )의 제 조 , 분 리 및 특 성 분 석 .

인슐린의 B chain과 A chain사이에 turn구조를 형성하는 7개의 아미노산으로 구성되어 있

는 펩타이드 ( 7 short - turn form in g heptapeptide linker , GGGPGKR )를 넣어

QUANT A/ CHARMm program을 사용하여 energy minim ization과 m olecular dyn amics를

최적화하였다. 사람 프로인슐린의 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 이용하여 ov erlappin g

fr agm ent를 얻은 후 이것을 주형으로 하여 다시 PCR을 하여 SIA cDNA를 만들었다. SIA

단백질의 정제를 위하여 SIA cDNA를 pET - 3a 3 0를 변형시킨 E . coli ex pression v ect or에

- 6 -

sub clonin g한 후 pET - SIA라고 명명하였다. pET - SIA를 BL21 (DE3) 에 tr an sform ation하

여 불용성 침전체 (inclu sion body )를 얻은 후 cation - ex ch an ge column을 이용하여 단백질

을 분리해 내고 sulphonation , r efoldin g과정을 거쳐 순수한 SIA 단백질을 정제하였다. 이렇

게 정제된 SIA 단백질의 생물학적 활성도를 조사하기 위하여 IM - 9 림파구와 쥐 지방세포

에서 인슐린 수용체 결합능력 (in sulin r eceptor bin din g assay )3 1 - 3 2과 포도당 운송능력

(glucose uptake as say )3 3을 각각 검사하였고 이 때 비교를 위하여 인슐린과 프로인슐린의

검사도 함께 수행하였다. 생체내에서 SIA 단백질의 혈당강하능력을 알아보기 위하여 18시

간동안 금식시킨 8- 10 주령의 SD rat (200- 250g in body w eight )에 피하주사하여 각 시간

대 별로 혈당강하효과를 측정하였고 비교를 위하여 인슐린과 프로인슐린의 혈당강하효과도

함께 측정하였다.

3 . p S IA , pLP K - S IA 의 제 조 및 in v iv o t ran s du ct ion .

SIA cDNA를 P CR - scr ipt sk +(Str at agen e, La Jolla , CA , USA )의 Bam HI/ Hin dIII sit e에

sub clonin g하였다. S IA m RNA의 안정성을 고려하여 SV40 poly (A ) signal sequ ence를

PCDM8 (Invit rogen , Carlsbad, CA , USA )으로부터 P CR로 증폭시킨 후 SIA cDNA 하단부

위의 HindIII/ ApaI sit e에 삽입시켰다. SIA ex pression의 basal lev el을 높이기 위해서 SV40

enh an cer를 pGL3- enhan cer (Prom eg a , M adison , W I, USA )로부터 P CR로 증폭시킨 후

SV40 poly (A ) signal sequ ence 하단부위의 ApaI site에 삽입하였다. 간세포에서 SIA의 분

비를 위하여 albumin leader sequ en ce (72 b ase pair s )를 SIA cDNA 앞쪽에 Ex SiteT M

PCR - ba sed Site - Dir ected Mutag en esis Kit (S tr atag en e, La Jolla , CA , USA )를 이용하여

fr am e에 맞게 삽입하였고 album in leader sequen ce가 들어간 clon e을 분리해낸 후 pSIA라

고 명명하였다. LP K 유전자의 프로모터부위 (- 3193 to +18)를 PCR로 증폭시킨 후 pSIA의

XbaI/ SalI sit e에 넣은 후 pLP K - SIA라고 명명하였다.

스트렙토조토신의 처리로 당뇨가 유발된 후 고혈당상태로 최소 2주간 방치된 당뇨백서를

Ket amine- chlor ide (10 m g/ kg )와 ether를 이용하여 마취시켰다. Midline ab domin al in cision

그 림 1 . p S IA , pLP K - S IA c on s tru ct의 모식 도

- 7 -

하여 30μg의 pSIA와 F uGENE T M 6 (Boehrin g er M annh eim GmBH , Lav al P Q, Germ any )

cationic polym er의 혼합액이나 pLPK - SIA와 F uGENE T M 6 cationic polym er의 혼합액을 인

슐린 주사기 (ultr afine needle, 29 guage 1/ 2", 12.7 m m )를 사용하여 간문맥에 주사하였다.

주사 후 g el foam을 이용하여 출혈을 막고 sutur ing하였다.

4 . rA A V - S IA , rA A V - LP K - S IA 의 제 조 및 in v iv o t ran s du c ti on

rAAV particle의 제조는 Sam ulski등이 개발한 방법3 4 - 3 5

에 기초하여 시행하였다. pSIA와

pLP K - SIA로 부터 4.3 Kb fragm ent를 P CR을 통해 증폭시킨 후 psub201의 XbaI site에

sub clonin g한 후 psub201- SIA , p sub 201- LP K - SIA라고 각각 명명하였다. Hum an

embry onic kidn ey 293 cells (AT CC CRL 1573, Manas sas , VA , USA )에 Lipofect amine

plu s r eag ent (Gib co- BRL, Gran d Islan d, NY , USA )를 이용하여 psub201- SIA와 pXX2 또

는 p sub 201- LP K - SIA와 pXX2를 cotr an sfect ion하였다. 6시간 후 tr an sfection m edia를

Iscov e ' s m odified Dulbecco ' s m edium (IMDM )으로 바꾼 후 aden oviru s type 5 dl312를 2

multiplicity of infection (M OI)로 감염시켰다. 3 일 경과 후 cell을 HEPES buffer (140mM

NaCl, 25m M HEPES , 0.7 m M Na 2 HPO4 , pH 7.05)에 harv est한 후 freezin g - thawin g과정을

거쳐 cell을 ly sis시키고 2000 x g에서 20분간 원심분리하여 cell debris를 제거하였다.

rAAV - SIA , rAAV - LP K - SIA 는 두번의 cesium chloride equilibrium den sity gradient과정

을 거쳐 정제하였고 분리정제된 rAAV - SIA , rAAV - LP K - SIA는 56。C에서 45분간 열처리

하여 잔존하는 아데노바이러스를 불활성화시켰다. rAAV - SIA , rAAV - LPK - SIA의 titr ation

을 위해서 DNa seI을 처리하여 viral DNA를 encapsulation시킨 후 ph enol- chloroform으로

ex tr action하고 eth anol precipitaion과정을 거쳐 qu antit ativ e com petit iv e P CR법3 6으로 정량

하였다.

스트렙토조토신의 처리로 당뇨가 유발된 후 고혈당상태로 최소 2주간 방치된 당뇨백서나

당뇨가 발증된 후 고혈당상태로 최소 2주간 방치된 NOD m ou se를 Ket amin e- chlor ide (10

m g/ kg )와 ether를 이용하여 마취시켰다. m idline abdom in al in cision하여 rAAV - SIA나

rAAV - LPK - SIA (1x 109 - 1x 101 2 viru s particles )를 인슐린 주사기 (ultr afine n eedle, 29

gu ag e 1/ 2", 12.7 mm )를 사용하여 간문맥에 주사하였다. 주사 후 g el foam을 이용하여 출혈

을 막고 sutur ing하였다.

5 . P CR , RT - P CR an aly s i s

pSIA 및 pLP K - SIA가 주입된 당뇨백서에서 수술 후 5일 째에 간장, 신장, 비장, 폐, 심장을

각각 sampling하여 DNA와 RNA를 분리한 후 PCR 및 RT - PCR을 수행하였다. 이때 P CR

및 RT - PCR에 사용된 prim er는 다음과 같다.

● pSIA가 주입된 당뇨백서에서의 P CR에 사용된 sen se prim er :

5 ' GT AAT A CGA CT CA CT AT A GGGC 3 '

- 8 -

● pLPK - SIA가 주입된 당뇨백서에서의 PCR에 사용된 sen se prim er :

5 ' AT T T CGAAT AA GAAGAGGAAGG 3 '

● pSIA , pLP K - SIA가 주입된 당뇨백서에서의 PCR에 사용된 ant i- sen se prim er :

5 ' GCGCAA GCT T T T ACT A GT T A CAAT A GT T 3 '

● pSIA , pLP K - SIA가 주입된 당뇨백서에서의 RT - P CR에 사용된 sen se prim er :

5 ' GCGCGGAT CCAT GT T CGT T AAT CA GCA C 3 '

● pSIA , pLPK - SIA가 주입된 당뇨백서에서의 RT - PCR에 사용된 ant i- sen se prim er :

5 ' GCGCAA GCT T T T ACT A GT T A CAAT A GT T 3 '

6 . RN a s e prot e ct ion a s s ay (RP A ) .3 2 P로 labellin g된 SIA antisen se RNA는 pET - SIA에서 T 7 RNA polym erase를 이용하여 in

v itro tr an scription하여 얻었다. 간장으로부터 total RNA (10μg )를 분리한 후 8 x 105 cpm

의 labellin g된 probe와 hybridizat ion하였고 RNase처리 후 protection된 probe는 6 %

den atur in g poly acrylam ide g el에 전기영동하여 autoradiogram을 시행하였다.

7 . N orth ern bl ot an aly s i s .

간장으로부터 total RNA (25μg )를 분리한 후 form aldehy de agarose 전기영동을 실시하여

m em bran e에 tr an sfer하였다. 3 2 P로 labellin g된 각각의 probe를 이용하여 hybridization하고

aut oradiogram을 시행하였다.

8 . S outh e rn b lot an aly s i s .

rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서와 당뇨치료 NOD m ou se의 간장에서 cellular

DNA (10μg )를 분리한 후 여러 종류의 제한효소를 처리하여 ag arose 전기영동을 실시하고

m em bran e에 tr an sfer하였다. 3 2 P로 labelin g된 SIA cDNA와 SV40 sequen ce부위를 포함하

는 probe를 사용하여 hybridizat ion하고 autoradiogram을 시행하였다.

9 . W e s t ern blot an aly s i s .

당 부하 후 0, 2, 4, 6시간대에 각각 혈장을 얻어 분자량 30,000 dalt on 이하만 cent ricon - 30

(Amicon , Bev erly , MA )을 이용하여 분리한 후 fr eezing dry er로 농축하였다. 농축된 단백질

은 10- 20 % tricin e gradient gel (NOVEX, S an Dieg o, CA , USA )에 전기영동하여

nitrocellulose m embran e에 tr an sfer하였고 SIA 단백질 ban d는 항- SIA 항체를 이용하여 검

출하였다.

- 9 -

10 . 혈 장 인 슐 린 , S IA , C - 펩타 이 드 , 글 루 카 곤 및 혈 당 농 도의 측 정 .

혈장 인슐린 및 C- 펩타이드 농도는 Linco rat in sulin RIA kit와 Lin co rat C- peptide kit

(Lin co Research Imm un oassay , S t . Ch arles , M O, USA )를 사용하여 각각 측정하였다. 혈장

글루카곤 농도는 DP C glu cag on RIA kit (DPC, Los Ang eles , CA , USA )를 사용하여 측정

하였다. 혈장 SIA 농도는 항- SIA 항체를 이용하여 competitiv e enzym e- link ed

imm un osorbent assay (ELISA )를 하여 측정하였다. 혈당농도는 Lifescan (M ount ain View ,

CA , USA ) on e touch m onit or를 이용하여 측정하였다.

11 . h em at ox y lin an d e o s in (H &E ) s ta in in g 및 면 역 조 직 화학 검 사 .

간장과 췌장을 분리한 후 form alin에 고정시켜 m orphology를 관찰하기 위하여 H&E

stainin g을 수행하였다. 고정된 간장과 췌장조직은 면역조직화학 검사를 하기 위하여 항

- SIA 항체나 항- 인슐린 항체와 함께 반응시킨 후 3- am in o- 9- ethylcarbazole (Dak o, Sant a

Barb ara , CA , USA )3 7을 이용하여 검출하였다.

12 . H y p erg ly c em ic c lam p ex p erim en t .

Hypergly cemic clamp는 Cam eron등이 개발한 방법3 8을 약간 변형하여 수행하였다. 1x 101 1의

rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서 수술 후 30주째에 salin e이나 20% 포도당 용

액을 elect ronic digit al syr in ge pum p (Hav ard, South Natik , MA , USA )를 이용하여 대퇴동

맥으로 주입시켜 혈당농도를 각각 100, 300, 500 m g/ dl가 되도록 30분간 유지시켰다.

equilibr ation period가 경과된 후 꼬리동맥으로부터 2분 간격으로 혈당농도를 측정하여 주

입 속도를 조절하였다. 포도당 자극 후 4시간이 경과되었을 때 간장에서 SIA의 DNA ,

mRNA 및 혈장에서 SIA 단백질의 농도를 각각 측정하였다.

I I I . 결 과

1 . S IA 단 백 질 의 특성 .

프로인슐린의 35개의 아미노산으로 구성된 C - 펩타이드부위를 turn구조를 형성하는 7개의

아미노산으로 구성되어 있는 펩타이드 (GGGPGKR )로 치환하여 E - coli에서 대량발현, 순수

정제한 후 폴딩시켜 생물학적 활성도를 측정하였다. 그 결과 SIA의 인슐린 수용체 결합능

력은 기존의 프로인슐린보다 약 14배 더 높았고 인슐린보다는 3- 4배 더 낮았다. 한편, SIA

의 포도당 운송능력은 프로인슐린보다는 17배 더 높았으며 인슐린보다는 4- 5배 더 낮았다.

SIA가 생체내에서 어느정도의 혈당강하능력을 가지는지를 알아보기 위해서 정상백서에 피

하주사한 후 혈당농도를 측정하여보았을 때 SIA는 기존의 프로인슐린보다는 탁월한 혈당강

하능력을 가지고 있었다 (표1).

- 10 -

표 1 . S IA 단 백 질 의 특 성

* 1 2 5 I으로 표식된 인슐린과 인슐린 수용체와의 최대 결합비율을 50%로 떨어뜨리는데 필요한 단백질의

농도.+

인슐린의 최대 포도당 운송능력을 50%로 떨어뜨리는데 필요한 단백질의 농도.+ +

인슐린을 쥐에 피하주사하고 1, 2시간대에 나타나는 최대 혈당강하효과의 50%에 달하는데 필요한

단밸질의 농도.

프로인슐린과 SIA의 백분율은 인슐린의 ED5 0 값을 100%로 보았을 때의 상대값임.

SIA의 인슐린 수용체 결합능력과 포도당 운송능력은 기존의 프로인슐린보다 각각 14배, 17배씩 더

높았다. 또한 SIA는 기존의 프로인슐린보다 탁월한 혈당강하능력을 가지고 있었다.

그 림 2 . pLPK - SIA의 일시적인 혈당강하효과. 당뇨백서에 pSIA와 FuGENET M 6 cationic polymer

의 혼합액이나 pLPK- SIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액을 주입한 후 시간이 경과되면서 혈당

농도의 변화를 살펴보았다. pSIA는 pSIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 당뇨백서 (n= 9, mean ± SD)이고 pLPK- SIA는 pLPK- SIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 당뇨

백서 (n = 5, mean ± SD)이다. pLPK- SIA가 주입된 당뇨백서의 경우 수술 후 5일 째에 정상혈당상태에

도달하였으나 시간이 경과되면서 다시 고혈당상태로 되돌아갔다.

Proteins

ED 50

Insulin Receptorbinding*

(ED5 0 - nM)

Glucose uptake+

(ED5 0 - nM)

In vivo Hypoglycemic effect + +

(ED5 0 - nmol/ kg)

1 hour 2 hour

Human Insulin 0.742 (100%) 0.322 (100%) 1.5±0.34 (100%) 1.8±0.37 (100%)

Human Proinsulin 36.1 (2%) 26.5 (1.25%) 9.1±1.12 (16.5%) 9.6±1.28 (18.8%)

Single ChainInsulin Analog (SIA)

2.68 (27.7%) 1.56 (21.3%) 3.6±0.42 (41.6%) 3.4±0.18 (52.9%)

- 11 -

2 . 스 트 렙 토 조 토신 에 의 해 유 도 된 당 뇨백 서 에 서 pLP K - S IA 의 일 시 적인 발 현 효 과 .

가 . pLP K - S IA 의 일 시 적 인 혈 당 강 하 효 과

pLPK - SIA와 Fu GENET M 6 cationic polym er의 혼합액이 주입된 당뇨백서의 경우 시간

이 경과하면서 혈당농도가 서서히 감소되기 시작하여 수술 후 5일째에는 정상혈당상태에

도달하였으며 그 후 4일간 정상혈당상태를 유지하다가 시간이 경과되면서 서서히 혈당농도

가 증가하여 수술 후 14일 째에는 500 m g/ dl에 달하였다. 반면 LPK 프로모터가 없는 pSIA

를 처리한 경우에는 수술 후 14일간 고혈당상태를 계속 유지하였다 (그림 2).

나 . 간 장 에서 S IA 의 선 택 적인 발 현

pSIA와 pLPK - SIA가 각각 주입된 당뇨백서에서 plasm id DNA가 간장에 선택적으로

tr an sfect ion되고 SIA m RNA가 간장에서 선택적으로 발현되는지를 알아보기 위하여 수술

후 5일 째에 간장, 신장, 비장, 폐, 심장을 분리하여 PCR과 RT - P CR을 수행하였다. plasm id

DNA는 pSIA와 pLPK - SIA가 주입된 당뇨백서와 당뇨치료백서의 간장에서 모두 발견되는

반면 SIA m RNA는 pLP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서의 간장에서만 발현되었다. 이상의

결과를 토대로 하여 보았을 때 간문맥을 통해 주입된 plasm id는 간장에 선택적으로

tr an sfect ion되며, SIA mRNA는 pLP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서의 간장에서만 선택적으

로 발현된다는 것을 알 수 있었다 (그림 3).

다 . pLP K - S IA 가 간 장 에 존 재하 는 유 전 자들 의 발 현 에 미 치 는 영향

pLPK - SIA의 처리에 의해 일시적인 혈당강하효과가 나타난 당뇨치료백서에서 간장에

존재하는 유전자들의 mRNA 상에서의 발현정도를 알아보기 위해서 수술 후 5일 째에 간장

그 림 3 P CR 및 RT - P CR an aly sis . pSIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이나 pLPK- SIA

와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 당뇨백서에서 수술 후 5일 째에 PCR과 RT - PCR을

수행하였다. pSIA는 pSIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 당뇨백서이고 pLPK- SIA는 pLPK- SIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 일시적인 혈당강하효과가 나타난 당뇨

치료백서이다. Li, 간장; K, 신장; S , 비장; Lu, 폐; H, 심장. pSIA 및 pLPK- SIA DNA는 간장에서만 발견되

었고 SIA mRNA는 pLPK- SIA가 주입된 당뇨치료백서의 간장에서만 선택적으로 발현되었다.

- 12 -

그 림 4 . PEPCK , LPK , GK의 m RNA lev el. 정상대조백서 및 pSIA와 FuGENET M 6 cationic polymer

의 혼합액이나 pLPK- SIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 당뇨백서에서 수술 후 5일째에 간장에 존재하는 PEPCK, LPK, GK의 mRNA level에서의 발현양상을 Northern blot을 통해 측정하

였다. NL은 정상대조백서이고 pSIA는 pSIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 당뇨대조

백서이며 pLPK- SIA는 pLPK- SIA와 FuGENET M 6 cationic polymer의 혼합액이 주입된 일시적인 혈당강

하효과가 나타난 당뇨치료백서이다. LPK, L- type pyruvate kinase; PEPCK, phosphoenolpyruvatecarboxykinase; GK, glucokinase. pLPK- SIA가 주입된 일시적인 혈당강하효과가 나타난 당뇨치료백서에

서 PEPCK, LPK, GK의 mRNA는 정상대조백서와 유사한 발현양상을 나타내었다.

에서 PEPCK , LPK , GK의 발현양상을 North ern blot을 통해 살펴보았다. 이때 비교를 위하

여 정상대조백서와 pSIA가 처리된 당뇨대조백서의 간장에서 PEP CK, LP K, GK의 발현양

상도 함께 살펴보았다. PEPCK는 당뇨대조백서에서는 증가되어 있었으나 정상대조백서와

당뇨치료백서에서는 감소되어 있었다. 한편 LPK와 GK는 당뇨대조백서에서는 감소되어 있

었으나 정상대조백서와 당뇨치료백서에서는 증가되어 있었다. pLP K - SIA의 처리에 의해

일시적인 혈당강하효과가 나타난 당뇨치료백서에서 PEP CK , LPK , GK의 mRNA는 정상대

조백서와 유사한 발현양상을 나타내었다 (그림 4).

3 . 스트렙토조토신에 의해 유도된 당뇨백서에서 rA A V - LP K - S IA 의 장기적인 발현효과

가 . rA A V - LP K - S IA 의 용량 별 효 과 .

pLPK - SIA 부위를 포함하는 재조합 AAV인 rAAV - LPK - SIA를 만든 후,

rAAV - LPK - SIA가 장기간 혈당농도를 조절할 수 있는 지를 알아보기 위해서 용량별로

1x 109에서 1x 101 2까지 각각 스트렙토조토신으로 당뇨를 유발시킨 백서의 간문맥에 주입하였

다. 1x 109과 1x 101 0이 처리된 경우에는 높은 혈당농도를 유지하였으나 1x 101 1과 1x 101 2이 처

리된 경우에는 수술 후 일주일내에 정상혈당농도로 회복되었고 그 후 9개월 이상 정상혈당

상태를 유지하였다 (그림 5a ). 한가지 재미있는 사실은 최적 치료 용량인 1x 101 1보다 10배나

더 많은 1x 101 2의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 경우에 있어서도 저혈당현상이 나타나지 않았

- 13 -

그 림 5 . rAAV - LP K - SIA의 용량별 효과. 1x 109에서 1x 101 2까지 각각의 용량이 주입된 당뇨백서에

서 수술 후 38주까지 혈당농도를 측정하였고, 수술 후 25주 째에 SIA의 DNA, mRNA 및 단백질 양을 각각

측정하였다. a , 혈당강하효과 (n = 10/ group, mean ± SD). b , 간장에서 rAAV- LPK- SIA DNA의 검출. c ,포도당 부하 후 4시간대에 간장에서 SIA mRNA의 발현양상. d, 혈장 SIA농도 (n = 7/ group, mean ±

SD). grey bar , 포도당 부하전 혈장 SIA농도; black bar , 포도당 부하 후 4시간대에서의 혈장 SIA농도.1x 101 1

과 1x 101 2이 주입된 당뇨백서에서 혈당강하현상이 나타났으며 정상혈당상태는 수술 후 9개월 이상

지속되었다. SIA mRNA 및 단백질 양은 1x 101 1과 1x 101 2

사이에 큰 차이가 없는 반면 SIA DNA 양은

1x 101 1과 1x 101 2사이에 현격한 차이를 나타내었다.

다는 것인데 이러한 현상이 viru s uptake의 satur at ion에 의한 것인지의 여부를 알아보기 위

해서 각각의 용량이 주입된 당뇨백서에서 수술 후 25주 째에 간장에서 gen omic DNA를 분

리하여 XbaI을 처리한 후 Southern blot을 실시하여 SIA의 DNA 양을 살펴보았다. SIA의

발현양상을 알아보기 위하여 각각의 용량이 주입된 당뇨백서에서 당 부하 후 간장에서 SIA

mRNA양과 혈장 SIA농도도 측정하였다. 그 결과 SIA m RNA와 단백질 양은 1x 101 1과

1x 101 2 사이에 큰 차이가 없는 반면 (그림 5c 와 d ), rAAV - LPK - SIA DNA 양은 1x 101 1과

1x 101 2 사이에 현격한 차이를 보여주었다 (그림 5b ).

- 14 -

나 . 당 뇨 치료 백 서 에 서 rA A V - LP K - S IA D N A 의 in t e g ration상 태

1x 101 1의 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서 rAAV - LPK - SIA DNA의 상태를

알아보기 위하여 South ern blot을 실시하였다. 1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치

료백서로부터 수술 후 5일, 5주, 15주 그리고 25주 째에 각각 간장으로부터 g enomic DNA를

분리한 후 XbaI을 처리하여 S outhern blot을 실시하였으며 이 때 SIA cDNA와 SV40

sequen ce부위를 probe로 사용하였다. 수술 후 5일 째 rAAV - LPK - SIA DNA는

sin gle- str and와 double- str an d상태로 존재하였으나 5주 이후에는 double str an d 상태로 존

재하였다 (그림 6b ). 수술 후 25주 째에 간장에서 g en om ic DNA를 분리한 후

rAAV - LPK - SIA DNA에 절단부위를 가지지 않는 제한효소 (n on - cutting en zym e)와

rAAV - LPK - SIA DNA에 절단부위를 한군데 가지는 제한효소 (sin gle- cut tin g en zym e)로

각각 처리하여 Southern blot을 실시하였다. n on - cut tin g enzym e을 처리하여 S outhern blot

을 하였을 때에는 4.3 Kb s보다 훨씬 큰 분자량을 가지는 서로 다른 크기의 ban d들이 각각

한 개씩 관찰되었으며 single- cuttin g enzym e을 처리하여 S outh ern blot을 하였을 때에는

그림 6 . 당뇨치료백서에서 rAAV- LPK- SIA DNA의 integration상태. a , psub201- LPK- SIA의 모식도. b ,수술 후 5일, 5주, 15주, 25주에 간장에서 genomic DNA를 분리하여 XbaI을 처리하여 시행한 Southernblot hybridization. c , 수술 후 25주 경과된 당뇨치료백서의 간장에서 genomic DNA를 분리하여 SspI,NotI, Kpn21, Bsp68I, Bsp119I, HindIII, ClaI, KpnI, SalI을 각각 처리한 후 시행한 Southern blothybridization. Uncut은 genomic DNA에 제한효소를 처리하지 않은 경우이다. rAAV- LPK- SIA DNA는

수술 후 5일 째에는 single- strand 와 double strand 상태로 존재하며 수술 후 5주 이후에는 double- strand상태로 존재하였다. non - cutt ing enzyme으로 처리하여 시행한 Southern의 경우 4.3 Kbs보다 큰 분자량을

갖는 서로 다른 크기의 band들이 관찰되었으며 single- cutting enzyme으로 처리하여 시행한 Southern의

경우 4.3 Kbs의 major band와 이보다 약간 더 큰 서로 다른 크기의 band들이 각각 관찰되었다.

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4.3 Kb s의 m ajor ban d와 이보다 약간 더 큰 서로 다른 크기의 ban d들이 각각 관찰되었다

(그림 6c).

다 . 당뇨치료백서의 간장에서 S IA 의 발현양상 및 S IA 의 발현이 간장에 미치는 영향 .

1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서의 간장에서 SIA의 발현양상을 알아

보기 위하여 항- SIA 항체를 사용하여 면역조직화학검사를 수행하였다. 그 결과 당뇨치료백

서의 간장에서는 간문맥과 간정맥 주변에 항- SIA 항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포들

이 관찰되는 반면 (그림 7a ), 정상대조백서의 간장에서는 항- SIA 항체에 대하여 양성으로

염색되는 세포들이 발견되지 않았다 (그림 7b ). 한편, rAAV - LP K - SIA의 주입이 간세포에

어떠한 상해를 가하지는 않는지의 여부를 알아보기 위하여 H &E st ainin g을 하여 보았는데

정상대조백서의 간장조직과 비교하여 보았을 때 어떠한 차이점도 발견할 수 없었다 (그림

그 림 7 . 당뇨치료백서의 간장에서 SIA의 발현양상. a , c는 1x 101 1의 rAAV- LPK- SIA가 주입된 수

술 후 15주 경과된 당뇨치료백서의 간장조직이고 b , d는 정상대조백서의 간장조직이다. a , b는 항- SIA 항

체를 이용한 면역조직화학검사결과이고 c , d는 H&E staining결과이다. 당뇨치료백서의 간문맥과 간정맥

주변에 항- SIA항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포들이 관찰되었으며 H&E staining 결과 당뇨치료백

서의 간장조직은 정상대조백서의 간장조직과 비교하여 어떠한 차이점도 발견할 수 없었다.

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7c and d ). 또한 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서의 간장에서 장기간 SIA가 발현되

었을 때 간에 어떠한 손상을 입히지는 않는지를 알아보기 위해서 간 손상의 지표인

aspart ate t ran samin ase (AST )와 alanin e tr an sam in ase (ALT )의 활성도를 비교하여 보았

는데 정상대조군 (94 ± 12 IU/ l for A ST an d 46 ± 9 IU/ l for ALT ; n = 7/ group )과

rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료군 (95 ± 10 IU/ l for AST an d 40 ± 9 IU/ l for ALT ;

n = 7/ group ) 사이에 차이를 발견할 수 없었다.

그 림 8 . 당뇨치료백서에서 내재적인 인슐린의 발현양상. a는 1x 101 1의 rAAV- LPK- SIA가 주입된

수술 후 15주 경과된 당뇨치료백서의 췌장조직이고 b는 정상대조백서의 췌장조직이다. a , b는 항- 인슐린

항체를 이용한 면역조직화학검사결과이다. c , 정상대조백서, 당뇨대조백서 및 당뇨치료백서에의 혈장에서

C- 펩타이드 농도 (n = 7/ group, mean ± SD). ST Z rat은 당뇨대조백서이고 ST Z- rAAV-

LPK- SIA는 rAAV- LPK- SIA가 주입된 수술 후 15주 경과된 당뇨치료백서이며 NL은 정상대조백서이다.grey bar , 포도당 부하 전 C- 펩타이드 농도; black bar , 포도당 부하 후 30분대에서의 C- 펩타이드 농도. d,당뇨치료백서의 혈장 SIA 농도 (n = 7, mean ± SD); grey bar , 포도당 부하 전 SIA 농도; black bar , 포

도당 부하 후 4시간대에서의 SIA 농도. 당뇨치료백서의 췌장에서는 항- 인슐린 항체에 대하여 양성으로 염

색되는 세포가 발견되지 않았으며 당 부하 후 극소량의 C- 펩타이드가 혈장에서 검출되었다. 한편 당뇨치

료백서에서는 수술 후 25주째까지 당 부하에 의해 상당량의 SIA가 혈장에서 관찰되었다.

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라 . 당 뇨 치 료 백서 에 서 내 재적 인 인 슐 린의 발 현 양 상

1x 101 1의 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서 혈당강하현상과 정상혈당의 유

지에 스트렙토조토신의 처리에 의해서도 파괴되지 않고 잔존하는 내재적인 췌장베타세포가

관여하는지의 여부를 알아보기 위해서 당뇨치료백서와 정상대조백서의 췌장조직을 각각 항

- 인슐린 항체를 사용하여 면역조직화학검사를 수행하였다. 그 결과 정상대조백서의 췌장에

서는 항- 인슐린 항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포가 발견되는 반면 당뇨치료백서의

췌장에서는 항- 인슐린 항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포가 발견되지 않았다 (그림 8a

와 b ). 한편, 당뇨대조백서, 정상대조백서 및 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서

당 부하 후 C - 펩타이드 농도를 측정한 결과 당뇨대조백서 및 당뇨치료백서에서는 극소량의

C- 펩타이드가 관찰되는 반면 정상대조백서에서는 다량의 C- 펩타이드가 검출되었다 (그림

8c). 또한 당뇨치료백서에서 수술 후 한달 간격으로 혈장에서 SIA 농도를 측정하였을 때 수

술 후 25주 째까지 상당량의 SIA가 측정되었다 (그림 8d).

마 . 혈 당농 도 에 따 른 S IA 의 발 현 양 상

LPK프로모터에 의한 SIA의 발현이 혈당농도에 따라 조절되어지는 지를 알아보기 위하

여 1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서 hypergly cem ic clamp를 수행하

였다. 혈당농도가 각각 100, 300, 500 m g/ dl가 되도록 30분간 유지시킨 각 그룹의 간장에서

그 림 9 . 혈당농도에 따른 SIA의 발현양상. 1x 101 1의 rAAV- LPK- SIA가 주입된 수술 후 30주 경과

된 당뇨치료백서에 생리식염수 혹은 20% 포도당액을 대퇴동맥을 통해 주입하여 30분간 혈당농도가 100,300, 500 mg/ dl가 되도록 유지시킨 후 SIA의 DNA, mRNA 및 단백질 양을 각각 측정하였다. a , 각 군에서

rAAV- LPK- SIA DNA의 검출. b , 생리식염수나 포도당액 주입 후 4시간대에 각 군의 간장에서 SIAmRNA의 발현양상 c , 각 군의 혈장에서 SIA농도; grey bar , 생리식염수나 포도당액을 주입시키기 전 혈

장 SIA농도; black bar , 생리식염수나 포도당액을 주입시킨 후 4시간대에서의 혈장 SIA 농도; 100, 혈당농

도가 100 mg/ dl가 되도록 유지시킨 그룹; 300, 혈당농도가 300 mg/ dl가 되도록 유지시킨 그룹; 500, 혈당농

도가 500 mg/ dl가 되도록 유지시킨 그룹. 혈당농도가 높을수록 더 많은 양의 SIA가 발현, 분비되었다.

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gen omic DNA를 분리한 후 Xb aI을 처리하여 South ern blot을 한 결과 rAAV - LP K - SIADNA lev el은 비슷한 반면 (그림 9a ), SIA의 m RNA와 단백질 양은 각 군간에 상당한 차이

를 나타내었는데 즉, 혈당농도가 높을수록 더 많은 양의 SIA가 발현, 분비되었다 (그림 9b와 c).

그 림 10 . 정상대조백서와 당뇨치료백서에서 복강 내 당부하검사. 정상대조백서와 당뇨치료백서

에서 4시간동안 금식시킨 후 2g/ kg의 포도당을 복강주사 하여 각 시간대에서 혈당농도, 혈장 인슐린 및

SIA농도, 혈장 글루카곤 농도, SIA mRNA 및 단백질 양을 각각 측정하였다. a , 혈당농도의 변화양상 (n= 4/ group, mean ± SD). b , 혈장에서 인슐린 및 SIA 농도의 변화양상 (n = 4/ group, mean ± SD). c , 혈

장에서 글루카곤 농도의 변화양상 (n = 4/ group, mean ± SD). NL은 정상대조백서이고 rAAV- LPK- SIA는 1x 101 1의 rAAV- LPK- SIA가 주입된 수술 후 20주 경과된 당뇨치료백서이다. d, 당뇨치료백서의 간장에

서 당 부하에 따른 SIA mRNA의 발현양상. e , 당 부하에 따른 혈장에서 SIA 단백질의 변화. Re, purifiedrecombinant SIA; NR, 비 환원조건; R, 환원조건. 당뇨치료백서는 당 부하후 정상혈당으로 회복되는데 150분이 소요되었으며 3- 6시간대에 경미한 혈당저하현상이 관찰되었다. 당뇨치료백서의 혈장 SIA 농도는 당

부하 후 3- 4시간대에 최고치를 이루다가 8시간대에 기저치로 떨어지는 양상을 나타내었으며 SIA mRNA

와 단백질도 비슷한 양상을 나타내었다.

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바 . 정 상 대 조 백서 와 당 뇨 치료 백 서 에 서 복 강 내 당부 하 검 사 .

1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서 당 부하검사를 수행하여 포도당

제거 능력을 조사하였다. 정상대조백서와 1x 101 1의 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료백

서를 4시간동안 금식시키고 2g/ k g의 포도당을 복강주사한 후 각 시간대에서 혈당농도와 혈

장에서 인슐린, SIA 및 글루카곤 농도를 각각 측정하였다. 정상대조백서에서는 당 부하 후

정상혈당으로 회복되는데 약 90분이 경과되는 반면 당뇨치료백서에서는 정상혈당으로 회복

되는데 약 150분이 경과되었으며 3- 6시간대에 경미한 혈당저하현상이 관찰되었다 (그림

10a ). 한편 정상대조백서의 혈장 인슐린 농도는 당 부하 후 30분대에 최고치를 이루다가 2

시간대에는 기저치로 떨어지는 양상을 나타내는 반면 당뇨치료백서의 혈장 SIA 농도는 당

부하 후 3- 4시간대에 최고치를 이루다가 8시간대에 기저치로 떨어지는 양상을 나타내었으

며, SIA m RNA와 단백질도 비슷한 양상을 나타내었다 (그림 10b , d 와 e). 즉, 정상대조백

서는 혈당농도와 혈장 인슐린 농도가 밀접한 상관관계를 나타내었지만 당뇨치료백서는 정

상대조백서와 비교할 때 혈당농도와 혈장에서의 SIA 농도사이에 상대적으로 낮은 상관관계

를 나타내었다. SIA의 turn구조를 형성하는 7개의 펩타이드 (GGGP GKR )가운데 KR site는

간장에서 분비되는 트립신에 의해 절단될 수 있는데3 9 혈장으로 분비된 SIA 단백질이 트립

신에 의해 절단된 이중사슬 형태인지 트립신에 의해 절단되지 않은 단일사슬 형태인지를

알아보기 위해서 환원조건과 비 환원조건에서 W estern blot을 하여보았다. 그 결과 β

- m ercaptoethan ol이 처리된 환원조건과 β- m ercapt oethan ol이 처리되지 않은 비 환원조건

에서 혈장으로 분비된 SIA 단백질의 분자량에 차이가 없었다 (그림 10e). 한편 당부하 검사

시 혈장에서 글루카곤 농도를 측정하여보았을 때 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서

에서 당 부하 후 6시간대에 글루카곤 농도가 정상대조백서와 비교하여 의미있게 증가되었

다 (그림 10c).

사 . 정 상대 조 백 서 와 당 뇨 치료 백 서 에 서 당 부 하 에 따 른 간 장 에 존 재하 는 유 전 자 들 의

발 현 조절 양 상 .

SIA가 인슐린과 마찬가지로 간장에 존재하는 유전자들의 발현을 전사단계에서 조절할

수 있는 지의 여부를 알아보기 위하여 정상대조백서와 1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA가 주입된

당뇨치료백서를 4시간동안 금식시키고 2 g/ k g의 포도당을 부하한 후 시간대별로 간장을 채

취하여 간장에 존재하는 유전자들의 발현조절양상을 mRNA 수준에서 살펴보았다 (그림

11). 그 결과 PEPCK는 0시간대에 당뇨치료백서와 정상대조백서에서 모두 높은 정도로 발

현되다가 당 부하 후 점차 감소하기 시작하여 당 부하 후 4시간대에는 거의 발현되지 않았

으며 6시간대에는 다시 증가하기 시작하였다. 반면, GK , LPK는 PEPCK와는 반대되는 조절

양상을 보여주었는데 당뇨치료백서와 정상대조백서에서 0시간대에는 낮은 정도로 발현되다

가 당 부하 후 점차 증가하기 시작하여 2- 4시간대에 최고치를 이루다 6시간대에는 다시 떨

어지는 양상을 나타내었다. 한편 인슐린에 의한 GK의 발현을 조절하는 전사인자로 알려져

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있는 sterol- r egulat ory elem ent bin ding prot ein 1 (SREBP 1)4 0 - 4 2는 GK , LP K와 유사한 발현

조절양상을 보여주었으며 반면, 콜레스테롤 항상성에 관여한다고 알려져 있는

sterol- r egulat ory elem ent bin din g prot ein 2 (SREBP2)4 3 - 4 5는 당뇨치료백서와 정상대조백서

에 있어서 모두 당 부하에 의해 발현양상이 변화되지 않았다. 정상대조백서와 비교하여 당

뇨치료백서에서 당 부하에 의해 GK, LP K , SREBP 1, PEPCK mRNA의 양적변화가 더 빨리

일어나는 경향을 보였다.

아 . LP K 프로 모 터 의 활성 도 에 GK가 미 치 는 영 향 .

1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료백서를 4시간동안 금식시키고 복강 내 당

부하검사를 수행하였을 경우 정상혈당으로 회복되는데 150분이 소요되는 반면 48시간동안

그 림 11 . 정상대조백서와 당뇨치료백서에서 당 부하에 따른 간장에 존

재하는 유전자들의 발현조절양상. 정상대조백서와 당뇨치료백서에서

당 부하후 각 시간대에서 PEPCK, GK, LPK 및 SREBP 1, 2 mRNA의

발현양상을 Northern blot을 통해 살펴보았다. NL은 정상대조백서이고

SIA는 1x 101 1의 rAAV- LPK- SIA가 주입된 수술 후 20주 경과된 당뇨치

료백서이다. PEPCK, phosphoenolpyruvate carboxykinase; SREBP,

sterol- regulatory element binding protein ; GK, glucokinase; LPK, L- type

pyruvate kinase. GK, LPK, SREBP1은 당 부하후 발현이 증가하여 2- 4

시간대에 최고치를 이루다가 6시간대에 기저치로 떨어지는 양상을 보

이는 반면 PEPCK는 당 부하후 발현이 감소되기 시작하여 4시간대에

기저치를 이루다가 6시간대에 다시 증가하기 시작하였다. 정상대조백서

와 비교하여 당뇨치료백서에서 당 부하에 의해 GK, LPK, SREBP 1,

PEPCK mRNA의 양적변화가 더 빨리 일어나는 경향을 보였다.

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금식시키고 복강 내 당부하검사를 수행하였을 경우에는 정상혈당으로 회복되는데 6시간이

소요되었다. 반면 정상대조백서에서는 당 부하시 정상혈당으로 회복되는데 금식시간이 영

향을 미치지 않았다 (그림 12 a 와 b ). 당뇨치료백서에서 4시간동안 금식시켰을 때와 48시간

동안 금식시켰을 때 GK를 mRNA와 단백질 수준에서 살펴보았을 때 4시간동안 금식시켰을

때에는 GK의 m RNA와 단백질이 상당량 관찰되는 반면 48시간동안 금식시켰을 때에는 GK

가 m RNA와 단백질 수준에서 모두 고갈되어 있는 상태였다 (그림 12c). 과당과 글리세롤은

LPK 프로모터에 포도당과 마찬가지로 작용한다고 알려져 있는데 GK의 작용없이 과당이나

그 림 12 . 금식시간과 과당, 글리세롤 부하에 따른 복강 내 당 부하 검사 양상의 변화. a , 4시

간동안 금식시키고 당 부하검사를 수행한 결과 (n = 6/ group, mean ± SD). b , 48시간동안 금식시키고 당

부하검사를 수행한 결과 (n = 6/ group, mean ± SD). NL은 정상대조백서이고 SIA는 1x 101 1의

rAAV- LPK- SIA가 주입된 수술 후 25주 경과된 당뇨치료백서이다. G, 2 g/ kg의 포도당을 복강주사한 그

룹; G+F , 1.8 g/ kg의 포도당과 0.2 g/ kg 의 과당을 복강주사한 그룹; G+Gly, 1.8 g/ kg의 포도당과 0.2 g/ kg의 글리세롤을 복강주사한 그룹. c , 4시간동안 금식시켰을 때와 48시간동안 금식시켰을 때 GK mRNA와

단백질의 발현양상. 당뇨치료백서에서 4시간동안 금식시키고 당부하검사를 수행하였을 경우 정상혈당으로

회복되는데 150분이 소요되는 반면 48시간동안 금식시키고 당부하검사를 수행하였을 경우에는 정상혈당으

로 회복되는데 6시간이 소요되었다. 한편 당뇨치료백서에서 48시간동안 금식시키고 포도당과 과당 또는 포

도당과 글리세롤을 부하하여 당부하검사를 수행하였을 경우에는 정상혈당으로 회복되는데 6시간에서 2.5- 3 시간 정도로 단축되었다. 4시간동안 금식시켰을 때에는 GK의 mRNA와 단백질이 상당량 관찰되는 반

면 48시간동안 금식시켰을 때에는 GK가 mRNA와 단백질 수준에서 모두 고갈되어 있는 상태였다.

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글리세롤로부터 직접 만들어지는 대사산물들이 LPK 프로모터의 활성도에 영향을 미친다고

알려져 있다. 당뇨치료백서에서 48시간동안 금식시키고 포도당과 과당 또는 포도당과 글리

세롤을 부하하여 복강 내 당부하검사를 수행하였을 경우에는 정상혈당으로 회복되는데 6시

간에서 2.5 - 3 시간으로 단축되었다 (그림 12b ). 하지만 당뇨치료백서에서 4시간동안 금식

시키고 포도당과 과당 또는 포도당과 글리세롤을 부하하여 복강 내 당 부하검사를 수행하

였을 경우에는 당 부하검사양상에 변화가 관찰되지 않았다 (그림 12a ).

자 . rA A V - LP K - S IA 가 주 입된 정 상 대 조백 서 에 서 의 반 응 양 상

다음으로 SIA를 이용한 유전자치료의 안정성을 조사하기 위해서 정상대조백서에

1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA를 처리하여 저혈당현상이 나타나는 지의 여부를 알아보았다. 정

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그 림 13 . rAAV- LPK- SIA가 주입된 정상대조백서에서의 반응양상. 1x 101 1의 rAAV- LPK- SIA가 주입

된 정상대조백서에서 a , 혈당농도의 변화양상 (n = 6/ group, mean ± SD). b , 복강 내 당 부하검사결과

(n = 6/ group, mean ± SD). c , 당 부하 후 각 시간대에서 혈장 SIA 농도 (n = 4/ group, mean ± SD).d , 당 부하 후 각 시간대에서 혈장 인슐린 농도 (n = 4/ group, mean ± SD). NL은 정상대조백서이고

SIA는 1x 101 1의 rAAV- LPK- SIA가 주입된 정상대조백서이며 SIA + ST Z는 101 1의 rAAV- LPK- SIA가

주입된 정상대조백서에 스트렙토조토신을 처리한 군이다. rAAV- LPK- SIA가 주입된 정상대조백서에서

저혈당현상이 관찰되지 않았으며, 당 부하검사를 하였을 때에는 당 부하후 정상혈당으로 회복되는데 90분이 소요되었으며 3- 6시간대에 거쳐 경미한 혈당저하현상이 나타났다. rAAV- LPK- SIA가 주입된 정상

대조백서에서 당 부하시 상당량의 혈장 인슐린과 그 보다는 적은 양의 SIA가 관찰되었다.

상대조백서에 1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA를 처리하였을 때 처리 후 한달 가량 정상혈당상태

를 유지하였으며 한달 후 스트렙토조토신의 처리로 내재적인 인슐린의 분비를 제거시켜준

경우에 있어서도 정상혈당상태를 유지하였다 (그림 13a ). 그렇다면 내재적인 인슐린과 SIA

가 함께 작용할 수 있는 상황하에서는 인슐린과 SIA 가운데 어떤 것이 더 우위적으로 작용

하는 지를 알아보기 위해서 1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 정상대조백서를 4시간동안

금식시킨 후 복강 내 당 부하검사를 수행하여 보았다. 그 결과 정상대조백서에서 관찰되는

당 부하검사 양상과 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서 관찰되는 당 부하 검사

양상의 혼합된 양상이 나타났는데 즉 정상대조백서에서처럼 포도당 부하 후 90분만에 정상

혈당으로 회복되고 그 후 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서처럼 3- 6시간대에

거쳐 경미한 혈당저하현상이 나타났다. 여기에 스트렙토조토신의 처리로 내재적인 췌장 인

슐린의 분비를 제거하였을 때는 전형적인 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료백서에서 발

견되는 당 부하 검사 양상, 즉 당 부하 후 150분만에 정상혈당으로 회복되고 그 후 3- 6시간

대에 거쳐 경미한 혈당저하현상이 나타나는 양상을 보였다 (그림 13b ). 실제로

rAAV - LPK - SIA가 주입된 정상대조백서의 혈장에서 당 부하 후 시간대 별로 인슐린과

SIA의 농도를 측정하여 보았을 때, 상당량의 혈장 인슐린과 그 보다는 적은 양의 SIA가 관

찰되었으며 스트렙토조토신을 처리하였을 때에는 혈장 인슐린은 기저치로 떨어지는 반면

SIA는 상당량 검출되었다 (그림 13c an d d ).

4 . N OD m ou s e에서 rA A V - LP K - S IA 의 장 기적 인 발 현 효과

가 . 당 뇨 치료 N OD m ou s e에 서 S IA 의 발현 양 상 및 효 과

이러한 SIA를 이용한 유전자치료가 스트렙토조토신의 처리에 의해 인위적으로 당뇨병을

유발시킨 당뇨병 실험동물모델에서 뿐만 아니라 자가면역반응에 의해 당뇨병이 유발되는

실험동물모델에서도 혈당농도를 조절할 수 있는 지의 여부를 알아보기 위해서 사람에서의

제 1형 당뇨병과 유사한 발병기작에 의해 당뇨병이 발증된다고 알려져 있는 NOD

(n on - ob ese diabetic ) m ou se 모델4 6에서 실험하여 보았다. 1x 101 2의 rAAV - LPK - SIA를

NOD m ou se의 간문맥에 주사하여 혈당농도의 변화정도를 살펴보았는데, 이 때 대조군으로

1x 101 2의 LP K 프로모터가 없는 control viru s particle, rAAV - SIA를 동일한 방식으로 NOD

m ou se의 간문맥에 주입하여 혈당농도의 변화정도를 비교해 보았다. rAAV - SIA가 주입된

NOD m ou se는 계속 고혈당상태를 유지하였고 3주내에 모두 사망한 반면 rAAV - LP K - SIA

가 주입된 NOD m ou se는 수술 후 1주일내에 모두 정상혈당으로 회복되었으며 이러한 정상

혈당상태는 실험기간 5개월 동안 계속 유지되었다 (그림 14a ). 수술 후 5주, 10주, 15주 째에

SIA의 mRNA와 단백질 양을 측정하여 보았는데 상당량의 SIA가 계속 발현, 분비되고 있는

것을 관찰할 수 있었다 (그림 14 b 와 c).

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그 림 14 . 당 뇨 치 료 N OD m ou s e에 서 S IA 의 발현 양 상 및 효 과 . a , 혈당농도의 변화양상 (n =

10/ group, mean ± SD). rAAV- SIA는 1x 101 2의 LPK 프로모터가 없는 control virus particle이 주입된

NOD mouse이고 rAAV- LPK- SIA는 1x 101 2의 rAAV- LPK- SIA virus particle이 주입된 NOD mouse이다.b , rAAV- LPK- SIA가 주입된 당뇨치료 NOD mouse의 간장에서 당 부하후 4시간대에 SIA mRNA 발현양

상. c , 혈장 SIA농도 (n = 7/ group, mean ± SD). grey bar , 포도당 부하전 SIA농도; black bar , 포도당 부

하후 4시간대에서의 SIA농도. rAAV- LPK- SIA가 주입된 NOD mouse에서 혈당강하현상이 나타났으며 정

상혈당상태는 실험기간 5 개월 동안 유지되었다. 당뇨치료 NOD mouse에서는 상당량의 SIA가 계속 발현,

분비되었다.

나 . 당 뇨 치료 N OD m ou s e에 서 rA A V - LP K - S IA D N A 의 in t e g rati on상 태

1x 101 2의 rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료 NOD m ou se에서 rAAV - LPK - SIA

DNA의 상태를 알아보기 위하여 수술 후 15주 째에 간장에서 DNA를 분리하여

rAAV - LPK - SIA DNA에 절단부위를 가지지 않는 제한효소 (n on - cutting en zym e)와

rAAV - LPK - SIA DNA에 절단부위를 한군데 가지는 제한효소 (sin gle- cut tin g en zym e)를

각각 처리하여 Southern blot을 실시하였다. n on - cut tin g enzym e을 처리하여 S outhern blot

을 하였을 때에는 4.3 Kb s 보다 훨씬 큰 분자량을 가지는 서로 다른 크기의 ban d들이 각각

한 개씩 관찰되었으며 (그림 15a ), single- cuttin g en zym e을 처리하여 S outh ern blot을 하였

을 때에는 4.3 Kb s의 m ajor b an d와 이보다 약간 더 큰 서로 다른 크기의 ban d들이 각각 관

- 25 -

찰되었다 (그림 15b ).

다 . 당 뇨 치 료 N OD m ou s e에서 복 강 내 당 부 하 검 사 .

정상대조군 (NOR m ou se)과 1x 101 2의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료 NOD

m ou se를 4시간동안 금식시킨 후 2 g/ k g의 포도당을 복강주사하여 시간대 별로 혈당농도의

변화를 관찰하였다. 당뇨치료 NOD m ou se에서의 반응양상은 당뇨치료백서에서의 반응양상

과 유사하였는데 즉, 정상대조군에서는 당 부하 후 정상혈당으로 회복되는데 약 90분이 소

요되는 반면 당뇨치료 NOD m ou se에서는 정상혈당으로 회복되는데 약 150분이 소요되었

으며 3- 6시간대에 경미한 혈당저하현상이 관찰되었다 (그림 16).

라 . 당 뇨 치 료 N OD m ou s e의 간 장 에 서 S IA 및 내 재 적 인 인 슐 린 의 발 현 양 상

한편 1x 101 2의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 당뇨치료 NOD m ou se의 간장에서 SIA의 발

현양상을 알아보기 위하여 항- SIA 항체를 이용하여 면역조직화학검사를 하여 보았다. 당

뇨치료백서에서와 마찬가지로 당뇨치료 NOD m ou se에서는 간문맥과 간정맥주위에 항- S IA

항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포들이 발견되었다 (그림 17a ). 반면 정상대조군 (NOR

m ou se)의 간장에서는 항- SIA 항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포들이 관찰되지 않았다

(그림 17b ). rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치료 NOD m ou se의 췌장조직을 H&E stainin g

해 보았을 때 전형적인 림파구의 침윤에 의한 in sulit is가 관찰되었고 (그림 17c), 항- 인슐린

그 림 15 . 당뇨치료 NOD mouse에서 rAAV- LPK- SIA DNA의

integration상태. 수술 후 15주 경과된 당뇨치료 NOD mouse의 간장에서

genomic DNA를 분리하여 insert non - cutt ing enzyme (SspI, NotI,Kpn21, Bsp68I, Bsp119I)과 insert single- cutting enzyme (HindIII, ClaI,KpnI, SalI)을 처리한 후 시행한 Southern blot hybridization. Uncut은genomic DNA에 제한효소를 처리하지 않은 경우이다. non- cuttingenzyme을 처리하여 시행한 Southern의 경우 4.3 Kbs보다 큰 분자량을 갖

는 서로 다른 크기의 band들이 관찰되었으며 single- cutt ing enzyme을 처

리하여 시행한 Southern의 경우에는 4.3 Kbs의 major band와 이보다 약

간 더 큰 서로 다른 크기의 band들이 각각 관찰되었다.

- 26 -

항체를 이용하여 면역조직화학검사를 하였을 때 당뇨치료 NOD m ou se의 췌장에서 항- 인슐

린 항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포들이 관찰되지 않았다 (그림 17d).

IV. 고 찰

당뇨병을 대상으로 하는 유전자치료법은 1980년대 중반부터 그 가능성이 제기되어 왔고

현재에 이르러서는 여러 종류의 대상세포를 이용한 다양한 시도들이 이루어지고 있는 추세

이다. 하지만 여러 가지 문제점과 부작용들로 인해 아직까지는 전 임상단계에서조차 성공적

인 사례보고가 전무한 실정이다. 당뇨병과 같이 혈당농도의 변화에 따라 치료유전자의 민감

한 발현조절이 이루어져야 하는 경우에는 더 복잡한 유전자 조작과정을 필요로 하기 때문

에 실험동물군에서조차 이상적인 모델제시가 늦어지고 있는 것으로 생각된다.

본 연구에서는 제 1형 당뇨병 실험동물모델에서 인슐린 유전자 치료책을 개발하기 위하

여 첫째, 췌장베타세포에서와 동일한 포도당 감식체계를 가지고 있는 간세포에서 효과적인

인슐린 분비기능을 회복시키고자 하였다. 일반적으로 췌장베타세포에서 분비된 인슐린은

간문맥을 통하여 높은 농도로 간장에 작용하여 간장에서의 당 신생과정이나 당 분해과정,

그림 16 . 당뇨치료 NOD mouse에서 복강 내 당부하검사. 당뇨치료 NOD

mouse와 정상대조군 (NOR mouse)에서 4시간동안 금식시키고 2 g/ kg의 포

도당을 복강주사하여 당부하검사를 실시하였다 (n = 7/ group, mean ±

SD). NC는 정상대조군이고 rAAV- LPK- SIA는 1x 101 2의 rAAV- LPK- SIA가 주입된 수술 후 10주 경과된 당뇨치료 NOD mouse이다. 정상대조군에서

는 당 부하 후 정상혈당으로 회복되는데 약 90분이 소요되는 반면 당뇨치

료 NOD mouse에서는 정상혈당으로 회복되는데 약 150분이 소요되었으며

3- 6시간대에 경미한 혈당저하현상이 관찰되었다.

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그 림 17 . 당뇨치료 NOD mouse의 간장에서 SIA 및 내재적인 인슐린의 발현양상. a는 1x 101 2의

rAAV- LPK- SIA가 주입된 수술 후 5주 경과된 당뇨치료 NOD mouse의 간장조직이고 b는 정상대조군

(NOR mouse)의 간장조직이다. a , b는 항- SIA 항체를 이용한 면역조직화학검사결과이다. c , d는 수술 후

5주 경과된 당뇨치료 NOD mouse의 췌장조직이다. c는 H & E staining 결과이고 d는 항- 인슐린 항체를

이용한 면역조직화학검사결과이다. 당뇨치료 NOD mouse의 간장조직에서는 간문맥과 간정맥주위에 항

- SIA 항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포들이 발견되었다. 당뇨치료 NOD mouse의 췌장조직에서는 림

파구의 침윤에 의해 항- 인슐린 항체에 대하여 양성으로 염색되는 세포들이 관찰되지 않았다.

글리코겐의 합성 및 분해를 조절하여 혈당농도가 일정하게 유지되게 된다.4 7 또한 간세포

는 췌장 베타세포와 동일한 포도당 감식체계, 즉 GK와 GLUT 2를 가지고 있기 때문에4 8 간

세포를 이용하여 유전자치료를 하면 췌장베타세포와 동일한 정도의 감수성을 가지고 혈당

농도의 변화정도를 감지할 수 있을 것으로 생각된다. 이러한 관점에서 볼 때 간장은 제 1형

당뇨병을 대상으로 하는 인슐린 유전자치료에 있어 가장 적합한 대상 장기라고 생각된다.

하지만 간세포에는 프로인슐린에서 인슐린으로의 전환에 관여하는 효소가 없기 때문에 간

세포를 이용하여 유전자치료를 시도할 경우 이러한 문제점이 보완되지 못한다면 인슐린에

비해 혈당강하능력이 10% 미만이라고 알려져 있는 프로인슐린만이 주로 발현되어지게 되

므로 실제적으로 큰 치료효과는 기대하기 어려울 것으로 생각된다.4 9

이를 위하여 본 연구에서는 둘째, 기존의 프로인슐린보다 생체활성도가 높은 SIA라는

mutant 프로인슐린을 개발하여 치료유전자로 사용하였다. S IA는 기존의 프로인슐린의 31

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개의 C- 펩타이드 부위를 turn구조를 형성하는 7개의 아미노산으로 구성되어 있는 펩타이드

(GGGPGKR )로 치환시킨 m ut ant 프로인슐린으로, 인슐린 수용체에 대한 결합력과 민감도

는 최대한 보존시키면서 기존의 프로인슐린보다는 혈당강하능력이 뛰어나도록 제조되었다.

사람의 프로인슐린은 86개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이 가운데 30개는 B ch ain을

이루고 21개는 A chain을 이루며 35개의 아미노산은 A ch ain과 B chain을 연결하는 C- 펩

타이드를 이루고 있다. 인슐린은 처음부터 순수한 인슐린으로 합성되는 것이 아니고 인슐린

을 포함한 전구물질인 프로인슐린으로 먼저 합성되고, 폴딩이 일어난 후 세포 내 단백 분해

효소에 의하여 순수 인슐린으로 전환되어 세포 밖으로 방출되게 되는데 알려진 바에 따르

면 프로인슐린은 인슐린과 비교하여 볼 때 그 혈당강하능력이 10% 미만인 것으로 보고되어

있다.5 0 C- 펩타이드 부위에는 호르몬의 기능은 없다고 알려져 있으며 인슐린의 A ch ain과

B chain을 연결하여 프로인슐린으로부터 인슐린으로 전환되는 과정에서 단백 분해효소가

효과적으로 작용하도록 하는데 관여하는 것으로 알려져 있다.5 1종에 따라 C- 펩타이드의 길

이가 26- 38개로 다양하게 나타나는 것으로 보아 인슐린의 입체구조형성에 C- 펩타이드가

반드시 필요한 것은 아니라고 생각되며, 따라서 인슐린의 삼차구조를 생각해볼 때 A ch ain

과 B chain사이에 적절한 turn구조를 형성하는 펩타이드를 연결한다면 인슐린 단백질의 삼

차구조와 유사한 구조를 가지는 m utant 프로인슐린의 제작이 가능할 것으로 생각된다. 이

렇게 만들어진 m ut ant 프로인슐린은 인슐린과 비슷한 구조를 가지므로 인슐린 수용체에 대

한 결합력이나 민감도가 기존의 프로인슐린보다는 뛰어날 것이다.5 2 - 5 3 또한 m ut ant 프로인

슐린은 프로인슐린에서 인슐린으로의 효소적 전환과정을 거치지 않고도 기존의 프로인슐린

보다는 높은 생체활성도를 나타낼 수 있기 때문에 이러한 특성을 가지는 mutant 프로인슐

린을 인슐린 유전자 치료책에 있어서 치료유전자로 사용한다면 간세포와 같이 프로인슐린

에서 인슐린으로의 전환에 관여하는 prohorm on e conv erta se (PC)가 없는 세포를 대상으로

하여서도 상당히 좋은 치료효과를 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

셋째, 이러한 치료유전자의 발현과 분비가 혈당농도의 변화에 따라 조절되어질 수 있도록

하기 위하여 프로모터부분에 glucose/ carb ohy drate r espon se elem ent (GIRE/ Ch oRE )를 가

지고 있는 LPK 유전자의5 4 - 5 7 프로모터를 치료유전자의 앞쪽에 붙여 chim eric fu sion g en e

con st ru ct (LP K 프로모터/ SIA cDNA )를 설계하여 실험하였다. LP K 프로모터는 혈당농도

의 변화에 따라 그 활성도가 조절된다고 알려져 있기 때문에 LPK 프로모터를 이용하면 생

리적으로 더 정확한 치료유전자의 발현조절이 가능하며 고인슐린혈증이나 저혈당증과 같은

부작용도 초래되지 않을 것으로 생각된다. 또한 LP K는 PK의 여러 isotype들 가운데 간장에

서만 특이적으로 발현된다고 알려져 있으므로5 8 - 5 9 LPK 프로모터를 이용하여 만든 chim eric

fu sion g ene은 간세포 특이적으로 발현될 것이다. 간세포는 췌장베타세포와 동일한 포도당

감식체계를 가지고 있으므로 혈당농도의 변화에 따라 췌장베타세포와 유사하게 치료유전자

의 발현과 분비가 정확하게 조절될 수 있을 것으로 생각된다.

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넷째, 생체 내에서 치료유전자의 이입효율을 높이기 위하여 비교적 크기가 크고 합성능력

을 가지고 있는 간을 표적기관으로 택하였으며, 세포내 이입효율이 높은 유전자 전달 체계

가운데 AAV v ect or sy stem을 사용하였다. 당뇨병환자들과 같이 장기간 안정적인 혈당의

교정이 이루어져야 하는 경우에는 오랫동안 치료유전자 산물을 생성할 수 있는 시스템의

선택이 불가피하므로 대상세포의 염색체 안으로 치료유전자를 삽입시킬 수 있는 레트로바

이러스나 AAV v ector sy stem이 적합하다. 하지만 레트로바이러스 v ector sy stem을 이용하

여 생체 상에서 유전자치료를 할 경우, 치료유전자를 가지고 있는 재조합 레트로바이러스가

대상세포의 염색체 안으로 이입되기 위해서는 세포분열이 일어나야 하는데 성인 간장의 경

우 대부분의 간세포는 정지기 상태에 있고 약 0.1- 0.5%만이 세포분열 중에 있으므로 이러한

steady - st ate organ에 재조합 레트로바이러스를 감염시키는 것은 치료유전자의 이입효율을

떨어뜨리게 된다.6 0부분 간 절제술로 간세포분열을 유도함으로써 생체 내에서 효과적인 외

래유전자의 이입이 이루어지도록 시도하는 경우도 있지만 임상적으로 적용하기엔 번거로울

뿐만 아니라 위험성이 있어 좀 더 안전하면서도 간편한 방법의 개발이 요구된다. 반면

AAV v ect or sy stem은 치료유전자가 대상세포의 염색체에 통합됨으로써 치료단백질이 장

기간 안정적으로 발현되며,6 1 - 6 3 레트로바이러스와는 달리 특정염색체에 선택적으로 통합되

기 때문에 변이의 위험성이 적고,6 4 분열하지 않는 세포에도 감염이 가능하다는 장점을 가진

다.6 5 또한 바이러스의 역가도 높으며6 6 면역반응을 유발시키지 않고 인체에 해가 없다는 점

등을 고려하여볼 때6 7 당뇨병을 대상으로 하는 인슐린 유전자치료책에 있어서 효과적인 유

전자 전달체계로 사용되기에 적합하다.

본 연구에서는 제 1형 당뇨병 실험동물모델에서 생리적 자극에 따라 정교한 혈당교정이

이루어질 수 있는 유전자치료책을 개발하기 위하여 SIA와 LP K 프로모터, 재조합 AAV

v ect or sy st em을 이용하여 제 1형 당뇨병 실험동물의 간장에서 유전자치료를 시도하였다.

본 연구에 재조합 AAV v ector sy st em을 도입함으로써 pLPK - SIA plasm id의 짧은 반감기

로 인한 일시적인 혈당강하현상 (그림 2)을 극복할 수 있었고, 그 결과 SIA가 생체 내에서

장기간 발현됨으로써 제 1형 당뇨병 실험동물모델에서 장기간 안정적인 혈당의 교정이 가

능하다는 것을 알게 되었다 (그림 5a , 그림 8d, 그림14). rAAV - LP K - SIA가 주입된 당뇨치

료백서와 당뇨치료 NOD m ou se에서 rAAV - LP K - SIA DNA의 m olecular stat e를 알아보기

위하여 rAAV - LP K - SIA DNA의 상, 하단에 절단부위를 가지는 XbaI, 절단부위를 가지지

않는 제한효소 (non - cutt in g enzym e) 및 절단부위를 한군데 가지는 제한효소

(sin gle- cut tin g en zym e)를 각각 이용하여 S outhern blot을 한 결과 rAAV - LPK - SIA DNA

는 생체 내에서 시간이 경과됨에 따라 sin gle- str and에서 double- st rand 상태로 전환되고

head - to- tail con catem er를 형성하면서 간장 염색체에 안정적으로 삽입된다는 것을 알 수

있었다 (그림 6, 15). 또한 당뇨치료백서나 당뇨치료 NOD m ou se에서 정상혈당의 유지에 췌

장에서 분비되는 내재적인 인슐린이 어느 정도 관여하는 지의 여부를 알아보기 위해 췌장

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인슐린의 발현양상을 살펴보았을 때 스트렙토조토신의 처리나 림파구의 침윤에 의해 베타

세포가 다 파괴된 상태인 것으로 보아 (그림 8b와 c, 그림 17c와 d ), 췌장에서 분비되는 내

재적인 인슐린의 작용을 완전히 배제하고도 간장에서 발현, 분비되는 SIA만으로 정상혈당

의 유지가 가능하다는 것을 알 수 있었다. 스트렙토조토신의 처리에 의해 인위적으로 당뇨

병을 유발시킨 당뇨백서모델의 경우 LP K 프로모터에 의한 SIA의 발현은 혈당농도의 변화

에 따라 정확하게 조절되어지는 것으로 생각되며 (그림 9b와 c), 특히 최적 치료 용량인

1x 101 1보다 10배나 더 많은 1x 101 2

의 rAAV - LPK - SIA가 주입된 경우, v iru s upt ake의

satur ation이 일어나는 용량이 아닌데도 불구하고 저혈당현상이 관찰되지 않은 것으로 보아

(그림 5) LPK 프로모터에 의한 SIA의 발현은 혈당농도의 변화에 따라 매우 엄격하게 조절

되는 것으로 생각된다. 또한 정상대조백서에 1x 101 1의 rAAV - LPK - SIA를 주입하였을 때 내

재적인 췌장 인슐린과 간장에서의 SIA가 함께 분비될 수 있는 상황 하에서도 저혈당현상이

관찰되지 않은 것은 (그림 13) SIA를 이용한 유전자치료의 안정성을 시사한다.

하지만 복강내 당부하검사 시 당 부하 후 정상혈당으로 회복되는데 정상대조군은 90분이

소요되는 반면 당뇨치료군은 150분이 소요되어 당뇨치료군에서 포도당 제거가 더 느리게

나타났는데 (그림 10a , 그림 16), 이러한 현상은 두 시스템간의 차이에 기인한 것으로 생각

된다. 정상대조군의 경우 포도당 자극에 따른 인슐린의 분비는 r egulat ed secretory

pathw ay에 의해 일어나게 되는데 즉, 췌장베타세포에서는 secr etory granule 안에 인슐린이

이미 만들어진 상태로 저장되어 있다가 외부의 생리적 자극에 따라 ex ocytosis에 의해 인슐

린이 분비되므로6 8 그 반응속도가 상당히 빠를 것으로 생각된다. 하지만 rAAV - LPK - SIA가

주입된 당뇨치료군에서 SIA가 분비되어 혈당농도가 조절되기 위해서는 우선 SIA m RNA가

전사단계에서부터 활성화되어 SIA 단백질이 만들어진 다음 간세포에서 con stitut iv e

secr etory pathw ay에 의해 분비되어지게 되므로6 9 regulated secret ory path w ay에 의한 생

리적인 인슐린의 분비기작보다는 느리게 일어날 것으로 생각된다. 이러한 시간 차는

con st itu tiv e secr etory path w ay만을 가지고 있는 간세포를 대상으로 하여 인슐린 유전자치

료를 시도할 때 직면하게 되는 어쩔 수 없는 한계점이라고 이야기할 수 있겠다. 하지만 현

재까지는 regulated secretory path w ay에 관여하는 모든 구성요소들이 확실히 규명되지 못

한 상태이고 모든 구성요소들이 확실히 규명되어 있는 상태라고 할지라도 이러한 구성요소

들이 발현되지 않는 체세포에서 모든 요소들을 재조합하여 r egulated secretory pathw ay를

새로이 구축한다는 것은 매우 힘든 작업이 될 것이다. 최근 Riv era등은 소포체에 단백질이

ag greg ation된 상태로 존재하다가 약물 처리에 의해 소포체로부터 단백질이 disag greg ation

되도록 하는, r egulat ed secretory pathw ay가 없는 체세포에서 단백질의 분비속도를 좀 더

빠르게 할 수 있는 방법을 개발하여 보고한 바 있다.7 0 하지만 이런 경우에는 처리한 약물의

생체 내에서의 흡수속도 및 반감기등이 단백질의 분비조절에 많은 영향을 미칠 것으로 생

각되며 소포체에 과량의 단백질이 정체함에 따라 세포독성을 유발시킬 수도 있을 것으로

- 31 -

생각된다. 또한 단백질의 분비를 자극하기 위해서는 계속적으로 약물을 처리하여 주어야 하

므로 인슐린 유전자치료법에서와 같은 자체적인 인슐린 분비기능의 회복은 기대하기 어려

울 것으로 생각된다.

본 연구결과에 따르면 복강 내 당 부하 검사 시 정상대조백서에서는 혈당농도와 혈장 인

슐린 농도 사이에 밀접한 상관관계를 나타내는 반면 당뇨치료백서에서는 혈당농도와 혈장

SIA 농도사이에 상대적으로 낮은 상관관계를 나타내어 당뇨치료백서와 정상대조백서간에

서로 다른 반응양상이 관찰되었다 (그림 10a와 b ). 실제 당 부하 검사 시 처음 0 - 2시간대

에 당뇨치료백서에서의 SIA 농도는 정상대조백서에서의 인슐린 농도에 비해 낮은데 반하여

당 부하 후 혈당은 두 그룹 간에 큰 차이 없이 올라갔다가 떨어지는데 이러한 현상은 정상

대조백서에서 인슐린이 분비되는 방식과 당뇨치료백서에서 SIA가 분비되는 방식이 서로 다

르기 때문인 것으로 생각된다. 앞에서 언급한 바와 같이 정상대조백서에서 인슐린은

regulated secret ory path w ay에 의해 분비되는 반면 당뇨치료백서에서 SIA는 간세포에는

regulated secret ory path w ay가 없기 때문에 con st itu tiv e secr etory pathw ay에 의해 분비되

어지게 된다. 따라서 인슐린과 SIA의 분비속도가 서로 다를 것으로 생각되므로 각 시간 대

에서 혈당농도의 변화와 혈장 인슐린 농도 그리고 혈당농도의 변화와 혈장 SIA 농도 사이

의 상관관계에 대해서 직접 비교하기는 어려울 것으로 생각되며, 실제 2시간대에 검출된

SIA의 농도는 낮지만 2시간대까지 분비된 SIA의 총 분비량은 혈당을 그 정도로 떨어뜨릴

수 있는 양일 수도 있을 것으로 생각된다. 또한 당 부하 후 2 - 5 시간대에 당뇨치료백서의

혈장에서 SIA농도는 최고치를 나타내는데 비해 이 시간대에 심각한 저혈당 현상은 관찰되

지 않고 있는데 이러한 현상에 대해서도 여러 가지 설명이 가능하다. 우선 첫 번째로는 2 -

5시간대에는 혈당이 어느 정도 정상화된 이후이기 때문에 SIA에 대한 감수성이 떨어져 있

을 가능성이 있다. 당뇨치료백서에서 2 - 5시간대에 걸친 계속적인 SIA의 분비는 세포의

인슐린 수용체 수를 감소시키거나 postr ecept or 단계에서 신호 전달 체계의 감수성을 떨어

뜨려 고농도의 SIA에 비해 심각한 저혈당현상이 나타나지 않았을 가능성이 있다. 두 번째

로 SIA는 기존의 프로인슐린보다는 탁월한 혈당강하능력을 가지고 있지만 정상 인슐린과

비교하여 보았을 때에는 혈당강하능력이 떨어지기 때문에 (표 1) 이러한 특성으로 인해 아

주 심각한 저혈당은 초래되지 않았을 가능성이 있다. 또한 이 외에도 글루카곤이나 카테콜

라민과 같이 혈당상승작용을 하는 인슐린길항호르몬들이 어느 정도 관여했을 가능성도 있

다. 실제 당 부하 검사 시 혈장 글루카곤 농도를 측정하여보았을 때 rAAV - LP K - SIA가 주

입된 당뇨치료백서에서 당 부하 후 6시간대에 혈장 글루카곤 농도가 정상대조백서와 비교

하여 의미있게 증가되어 있었는데 (그림 10c), 이는 혈당농도의 변화와 혈장 SIA 농도의 변

화를 모두 고려하여 볼 때 당 부하 시 3- 6시간대에 나타나는 경미한 혈당저하 상태에서 정

상혈당상태로 회복되는데 글루카곤이 어느 정도 기여하는 것으로 생각되며 LPK 프로모터

에 의한 SIA의 음성 되먹임 조절기작 (n eg ativ e feedb ack regulat ion )에 췌장 알파세포에서

- 32 -

분비되는 글루카곤이 어느정도 관여하는 것으로 생각된다. rAAV - LPK - SIA가 주입된 당

뇨치료군은 정상대조군과 비교하였을 때 당 부하검사 시에는 이러한 상이한 차이점을 나타

내었지만 비 공복 상태에서는 항상 정상혈당상태를 유지하고 있었으며 (그림 5a ), 이러한

점으로 미루어보아 SIA의 발현정도가 혈당농도의 변화에 따라 꽤 적절하게 조절되는 것으

로 생각된다.

앞에서 언급한 바와 같이 SIA가 분비되어 혈당농도가 조절되기 위해서는 우선 SIA

mRNA가 전사단계에서부터 활성화되어 SIA 단백질이 만들어진 다음 간세포에서

con st itu tiv e secret ory pathw ay를 통해 분비되어져야 하므로 혈당농도가 조절되기 위해서

는 상당한 시간이 소요될 것으로 생각된다. 몇몇 imm ediate ear ly r espon se gen e같은 경우

에는 전사단계에서 활성화되기 위해서 6시간 미만이 소요된다고 알려져 있지만7 1 일반적으

로 반응속도가 빠르지 않은 유전자들 같은 경우에는 유전자의 종류에 따라 차이가 많지만

전사단계에서 활성화되는데 이보다 훨씬 더 많은 시간이 소요된다고 알려져 있다. 이러한

사실을 고려하여볼 때 4시간동안 금식시키고 당 부하검사를 하였을 때, 당 부하 후 2시간

대에 SIA mRNA가 증가된 것은 (그림 10e) 상당히 빠른 것으로 생각되며 이는 당 부하에

의한 LPK 프로모터의 빠른 활성도 변화에 기인한 것으로 생각된다. LPK 프로모터는 6- 인

산 포도당에 의해 그 활성도가 조절된다고 알려져 있는데 포도당에서 6- 인산 포도당으로의

전환에 GK가 관여하기 때문에 LPK 프로모터가 활성화되기 위해서는 GK 발현의 증가가

선행되어야 한다.7 2 - 7 3 본 연구 결과에 따르면 당뇨치료백서에서 4시간동안 금식시키고 당

부하검사를 수행하였을 경우 정상혈당으로 회복되는데에는 150분이 소요되는 반면 (그림

12a ), 48시간동안 금식시키고 당 부하검사를 수행하였을 경우 정상혈당으로 회복되는데에는

6시간이 소요되었다 (그림 12b ). 당뇨치료백서에서 4시간동안 금식시켰을 때와 48시간동안

금식시켰을 때 GK의 mRNA와 단백질의 발현정도를 비교하여 보면 4시간동안 금식시켰을

때에는 상당량의 GK m RNA와 단백질이 관찰되는 반면 48시간동안 금식시켰을 때에는 GK

mRNA와 단백질이 모두 고갈되어 있는 상태였다 (그림 12c). 한편, 간세포에는 과당에서 1-

인산 과당으로의 전환에 관여하는 fruct okina se와 글리세롤에서 3- 인산 글리세롤로의 전환

에 관여하는 gly cerol kinase가 각각 존재하기 때문에 과당과 글리세롤은 GK를 경유하지

않고 LPK 프로모터에 포도당과 같은 대사산물로 작용할 수 있다.7 4 - 7 7 당뇨치료백서에서 48

시간동안 금식시키고 포도당과 과당 또는 포도당과 글리세롤을 부하하여 당 부하검사를 수

행하였을 때 정상혈당으로 회복되는데 2.5- 3시간이 소요되었다 (그림 12b ). 이러한 일련의

결과들은 LPK 프로모터의 활성도에 GK 상태가 미치는 영향의 중요성을 시사하는데 즉,

GK가 발현되고 있는 상태에서는 LP K 프로모터가 당 부하에 의해 빨리 활성화되지만 GK

의 발현이 고갈되어 있는 상태에서는 LPK 프로모터가 활성화되기 위해서 GK의 발현의 증

가가 선행되어야 하기 때문에 당 부하에 의해 LP K 프로모터가 활성화되는데 상대적으로

더 많은 시간이 소요되는 것으로 생각된다. 본 연구결과에 따르면 4시간동안 금식시켰을 때

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에는 GK뿐만 아니라 LPK 프로모터도 activ e한 상태였기 때문에 (그림 12c, 그림 10e와 d )

당 부하에 따른 SIA의 전사단계에서의 활성화가 더 빨리 나타나는 것으로 생각된다. 한편

48시간동안 금식시키고 과당과 글리세롤을 부하하여 당 부하검사를 수행하였을 경우에는

48시간 금식에 의해 GK의 발현이 고갈되어 있는 상태라고 할지라도 과당과 글리세롤은

GK를 경유하지 않고 LP K 프로모터에 포도당과 같은 대사산물로 작용할 수 있기 때문에

정상혈당으로 회복되는 시간이 6시간에서 2.5- 3시간으로 단축되어지는 것으로 생각된다.

앞에서 언급했던 바와 같이 LP K 프로모터는 6- 인산 포도당에 의해 그 활성도가 조절되

어진다고 알려져 있는데 포도당에서 6- 인산 포도당으로의 전환에 GK가 관여하기 때문에

LPK 프로모터가 활성화되기 위해서는 GK 발현의 증가가 선행되어야 한다. 따라서 LP K 프

로모터가 활성화되는 데에 인슐린이 직접적으로 작용하는 것은 아니지만 GK의 발현에 인

슐린이 절대적으로 관여하기 때문에 인슐린은 간접적으로 LPK 프로모터의 활성화에 관여

한다고 이야기할 수 있다.7 8 - 8 0또한 LPK 프로모터는 글루카곤에 의해서는 그 활성도가 억제

된다고 알려져 있기 때문에 당뇨상태에서는 인슐린 농도는 떨어져 있고 글루카곤 농도는

증가되어 있는 경향이 있으므로 LPK 프로모터가 활성화되기 어렵다. 따라서 이를 위해서는

초기에 LPK 프로모터를 활성화시키기 위한 인슐린이 절대적으로 필요할 것으로 생각된다.

LPK 프로모터의 활성화를 위한 초기 인슐린의 중요성은 1998년 Kahn등이 시도하였었던

실험을 통해 입증될 수 있다.8 1 Kahn등은 프로인슐린의 C- 펩타이드 부위가 간장에 존재하

는 fur in이라는 단백분해효소에 의해 절단될 수 있도록 프로인슐린의 B - C jun ct ion과 C- A

jun ction을 변형시켜 m utant 프로인슐린을 만들고 이 mutant 프로인슐린의 발현이 혈당농

도의 변화에 따라 조절될 수 있도록 LP K 프로모터를 이용하여 형질전환 생쥐를 만들었다.

보고된 바에 따르면 이 형질전환 생쥐의 간장에서 mutant 프로인슐린 m RNA가 발현되었고

고 탄수화물 식이를 주었을 때 furin에 의해 절단된 다량의 C- 펩타이드가 혈장에서 검출되

었다고 한다. 하지만 스트렙토조토신을 처리하여 형질전환 생쥐에 당뇨를 유발시켰을 때에

는 간장에서 mutant 프로인슐린 m RNA가 전혀 발현되지 않았고 그에 따른 혈당강하현상도

관찰할 수 없었다고 한다. 이러한 결과를 얻은 것에 대해서는 여러 가지 가능성을 생각해

볼 수 있겠는데 우선 첫 번째로는 이 그룹에서 만든 mutant 프로인슐린이 실제 생체 내에

서 어느 정도의 혈당강하능력을 가지고 있는가 하는 점이다. 하지만 이 사람들의 결과를 토

대로 하여 본다면 스트렙토조토신의 처리에 의해 당뇨가 유발되었을 때 간장에서 mutant

프로인슐린 m RNA가 전혀 발현되지 않았다는 것으로 보아 이 m ut ant 프로인슐린이 생체

내에서 어느 정도 혈당강하능력을 가지고 있다고 하더라도 당뇨상태에서는 전사단계에서부

터 저지되었다는 뜻이고, 이것은 다시 말해 당뇨상태에서 LP K 프로모터가 활성화되지 않았

다는 것을 의미한다. 앞에서 언급했던 바와 같이 당뇨상태에서 글루카곤 농도가 증가된 경

우에는 LPK 프로모터의 활성화가 억제되며 6- 인산포도당의 생성에 관여하는 GK 역시 당

뇨상태, 인슐린이 고갈된 상태에서는 활성화되기 어렵기 때문에 이러한 조건 하에서 LPK

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프로모터를 활성화시키기 위해서는 인슐린이 어느정도 요구될 것으로 생각된다. LP K 프로

모터의 활성화를 위해 요구되어지는 이러한 초기의 인슐린은 당뇨치료백서나 당뇨치료

NOD m ou se에서 스트렙토조토신의 처리나 림파구의 침윤에 의해서도 파괴되지 않고 잔존

하는 내재적인 췌장 베타세포에 의해서 충족될 수도 있겠지만 당뇨치료백서나 당뇨치료

NOD m ou se에서 췌장 인슐린은 거의 발현되지 않는 상태였고 (그림 8b와 c, 그림 17c와 d ),

따라서 LPK 프로모터의 활성화를 위해서 요구되어지는 초기의 인슐린의 요구량은

rAAV - LPK - SIA con struct에 있는 SV40 enhancer에 의해서 충족되어지는 것으로 생각된

다. SV40 enh an cer가 없는 pLPK - SIA와 SV40 enhan cer가 있는 pLPK - SIA를 스트렙토조

토신을 처리하여 당뇨를 유발시킨 백서에 일시적으로 발현시켰을 때 SV40 enhan cer가 있

는 pLPK - SIA가 주입된 당뇨백서에서는 수술 후 5일 째에 혈당이 정상화되는 반면 SV40

enh an cer가 없는 pLP K - SIA가 주입된 당뇨백서에서는 수술 후 14일째까지 혈당강하현상이

관찰되지 않았다 (data n ot sh ow n ). 이러한 결과를 토대로 하여 볼 때 LPK 프로모터의 활

성화에 필요한 초기의 인슐린의 요구량은 SV40 enhan cer에 의한 SIA의 b asal lev el의 증가

로 충족되어지는 것으로 생각된다. 본 연구결과만을 토대로 하여 본다면 실제 생체 내에서

당뇨 상태일 때 LP K 프로모터가 활성화되기 위해 요구되어지는 초기의 인슐린의 양이 어

느 정도인지 정확히는 알 수 없지만 SV40 enh ancer와는 다른 기저 활성도를 가지는

enh an cer를 이용하여 con struct를 만들어 일시적으로 발현시켜 본다면 당뇨상태에서 LPK

프로모터의 활성화를 더 앞당기거나 미룰 수도 있을 것으로 생각되며 따라서 SV40

enh an cer가 있는 pLP K - SIA가 주입된 당뇨백서에서 혈당이 정상화되는데 걸리는 5일이라

는 시간도 더 단축시키거나 지연시키는 등의 조절이 가능할 것으로 생각된다.

인슐린은 간장에 존재하는 PEPCK , SREBP 1, GK와 같은 여러종류의 유전자들의 발현을

전사단계에서 조절한다고 알려져 있다.8 2 본 연구결과에 따르면 pLPK - SIA를 주입한 당뇨

치료백서에서 PEP CK , GK, LP K등의 m RNA는 정상대조백서와 유사한 발현양상을 나타내

었으며 (그림 4), 복강내 당부하검사 시 정상대조백서와 당뇨치료백서에서 PEP CK , GK,

LPK , SREBP 1, 2등의 전사단계에서의 발현조절양상을 살펴보았을 때, 두 그룹간에 거의 비

슷한 반응양상을 나타내는 것으로 보아 (그림 11) SIA도 췌장에서 분비되는 내재적인 인슐

린과 마찬가지로 간장에 존재하는 유전자들의 발현을 전사단계에서 조절할 수 있는 것으로

생각된다. 한가지 재미있는 사실은 당뇨치료백서에서 당 부하에 따른 유전자들의 발현조절

양상이 정상백서에서 유전자들의 발현조절양상보다 더 빠르게 나타난다는 것인데 이러한

반응양상은 GK , LPK , SREBP 1에서 더욱 극명하게 나타난다. 이러한 현상은 아마도 정상대

조백서에서는 췌장에서 분비되는 인슐린이 간장에 en docrin e effect를 나타내지만 당뇨치료

백서에서는 SIA가 분비되는 기관도 간장이고 SIA에 대한 t arg et g en e이 존재하는 기관도

간장이기 때문에 en docrin e effect보다는 paracr ine이나 autocrine effect를 나타낼 것으로 생

각되며 이러한 이유 때문에 반응속도가 정상대조백서와 비교할 때 좀 더 빠르게 나타나는

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것이 아닐까 생각된다. 실제로 GK같은 경우에는 그 자체가 혈당강하효과가 있다고 보고되

어 있으며,8 3본 연구에서 당 분해효소들의 활성도를 직접 측정하여보지는 않았지만 정상대

조백서와 비교하여 당뇨치료백서에서 당 분해효소들의 전사단계에서의 빠른 양적 변화는

혈당농도의 조절에 어느 정도 기여할 수도 있을 것으로 생각된다.

본 연구에서는 스트렙토조토신을 처리하여 인위적으로 당뇨병을 유발시킨 당뇨백서모델

이나 자가면역반응에 의해 당뇨병이 발증되는 NOD m ou se모델에서 rAAV - LP K - SIA를 이

용한 유전자치료를 통하여 장기간 안정적인 혈당의 교정이 가능하다는 매우 고무적인 실험

결과를 얻게 되었다. 특히 NOD m ou se 모델의 경우 간장에서 장기간 SIA가 발현됨에도 불

구하고 별다른 면역반응이 유발되지 않았다는 사실은 rAAV - LPK - SIA를 이용한 유전자치

료책이 사람에게도 어느정도 치료적 가치를 가질 수 있음을 시사한다. 유전자 치료법은

1960년대부터 그 가능성이 제기되어 왔고 현재에 이르러서는 많은 임상 protocol이 확립된

상태이지만 이러한 유전자 치료법 가운데 실제 임상적으로 만족할만한 결과를 보인 것은

드물다. 하지만 유전자치료법은 분자생물학의 응용이기 때문에 질병의 DNA 수준에서의 기

전규명, 세포에서의 유전자 발현조절기전 규명, 유전자 조작법의 발전등 분자생물학의 기초

가 발전함에 따라 유전자요법의 치료효과도 점차 개선되고 있는 추세이다. 그러나 앞으로

이러한 개념의 치료를 구체화하고 사람의 당뇨병 치료에 도입하기 위해서는 좀 더 사람과

유연관계가 가까운 대동물에 적용하여 그 가능성을 타진해 보아야 할 것으로 생각되며 이

를 위해서는 재조합 AAV particle을 대량으로 손쉽게 만들고 분리해낼 수 있는 방법의 개

발이나 좀 더 효율적인 유전자전달체계의 개발이 선행되어야 할 것으로 생각된다. 이를 위

하여 앞으로 좀 더 많은 연구가 수행되어야 하겠지만 가까운 시일 내에 당뇨병을 유전자수

준에서 간단히 치료하여 완치시킬 수 있는 유전자 치료법이 당뇨병의 표준치료방법 가운데

하나로 자리잡게 될 것을 확신한다.

V. 결 론

본 연구에서는 제 1형 당뇨병 실험동물모델에서 효과적인 유전자치료책을 개발하기 위하여

인슐린으로의 효소적 전환 과정을 거치지 않고도 생체 내에서 뛰어난 혈당강하능력을 가지

는 SIA라는 mutant 프로인슐린을 개발하여 치료유전자로 사용하였고, 간세포에서 혈당농

도의 변화에 따라 SIA의 발현이 장기간 안정적으로 조절될 수 있도록 간세포 특이적인

LPK 프로모터와 재조합 AAV v ect or sy stem을 이용하여 유전자치료를 시도한 결과 다음

과 같은 결론을 얻게 되었다.

1. 스트렙토조토신의 처리에 의해 인위적으로 당뇨병을 유발시킨 당뇨백서모델이나 자가

면역반응에 의해 당뇨병이 발증된다고 알려져 있는 NOD m ou se 모델에서 SIA를 이용한 유

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전자치료를 통해 장기간 안정적인 혈당의 교정이 가능하며, 췌장에서 분비되는 내재적인 인

슐린의 작용을 완전히 배제하고도 간장에서 발현, 분비되는 SIA 만으로 정상혈당의 유지가

가능하다는 결론을 얻게 되었다. 특히 사람에서의 제 1형 당뇨병과 유사한 발병기작에 의해

당뇨병이 발증된다고 알려져 있는 NOD m ou se 모델의 경우 간장에서 SIA가 장기간 발현됨

에도 불구하고 별다른 면역반응이 유발되지 않았다는 사실은 SIA를 이용한 유전자치료가

사람에게도 어느 정도 치료적 가치를 가질 수 있음을 시사한다.

2. 스트렙토조토신의 처리에 의해 인위적으로 당뇨병을 유발시킨 당뇨백서에 최적 치료 용

량인 1x 101 1보다 10배나 더 많은 1x 101 2

의 rAAV - LPK - SIA를 주입하였을 때 저혈당현상이

관찰되지 않은 것으로 보아 LP K 프로모터에 의한 SIA의 발현은 혈당농도에 따라 엄격하게

조절되는 것으로 생각되며 특히 정상대조백서에 1x 101 1의 viru s particle을 주입한 경우에 있

어서도 심각한 저혈당현상이 관찰되지 않은 것은 SIA를 이용한 유전자치료의 안정성을 입

증해주는 또 다른 결과로 생각된다.

3 . 복강내 당부하검사 결과 정상대조군과 당뇨치료군에서의 상이한 반응양상에도 불구하고

비 공복 상태에서 당뇨치료군이 항상 정상혈당농도를 유지하고 있었다는 사실은 SIA의 발

현이 생리적 자극에 따라 적절하게 조절되고 있으며, 이 밖에도 정상혈당의 유지를 위하여

생체내의 다른 h om eostasis sy stem의 도움을 받고 있다는 사실을 시사해준다.

4 . 정상대조백서와 비교하여 당뇨치료백서에서 당 부하에 따른 당 분해효소들의 전사단계에

서의 빠른 양적변화는 혈당농도의 조절에 어느 정도 기여할 수 있을 것으로 사료된다.

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Abs t r ac t

Gene Ther apy us i ng a Si ngl e - Chai n Ins ul i n Anal og i n Ani mal Mode l sof Type 1 Di abe t e s

Su- J i n Ki m

B rain K orea 21 P roj ect f or M ed ical S ciencesT he Grad uate S chool, Y ons e i Univ ers ity

(Dir ected by Professor Hyun - Chul Lee)

T h e dev elopm ent of type 1 diabetes r esult s from the alm ost t otal destru ction of

in sulin - produ cin g pan creatic βcells by β cell- specific autoimm un e respon ses . St an dard

in sulin th erapy m ay n ot m aintain blood glucose concentr at ion s w ithin the r elativ ely

narrow rang e th at occur s in th e presence of n orm al pancreat ic β cells . T h e cure of

diabetes has lon g been sought u sing sev eral differ ent approach es , inclu ding islet

tr an splantat ion , r egen eration of β cells an d in sulin g en e therapy . How ev er , perm anent

rem ission of type 1 diab etes h as not y et b een sat isfactorily achiev ed.

W e approach ed th e long - term cure of type 1 diabetes by u sin g a recombin ant

adeno- associat ed v iru s (rAAV ) ex pressin g a single- ch ain in sulin an alog (SIA ), w hich

possesses biologically act iv e in sulin activ ity w ith out en zym at ic conv er sion from

proin sulin to in sulin , un der the control of hepatocyte- specific L - type pyruv at e kinase

(LP K ) prom oter , w hich regulates SIA ex pression in respon se to blood glu cose lev els .

SIA produced from th e gen e con struct (rAAV - LPK - SIA ) can remit diabetes in

str ept ozot ocin - in duced diabetic r at s an d autoim mune n on - ob ese diab etic (NOD ) mice for

a prolon ged tim e w ith out th e action of endog en eou s pan cretic in sulin . SIA ex pression by

LPK prom oter could be t ightly regulated in respon se t o blood glu cose lev el an d th e

tr eatm ent of n orm al cont rol SD rat w ith rAAV ex pressing SIA did n ot r ev eal

hypogly cemia . Although the differ ence in kin etics betw een in sulin of n orm al cont rol

group an d SIA of rAAV - LPK - SIA - t reated group in respon se to glucose loadin g ,

rAAV - LPK - SIA - tr eated group m aintained norm ogly cem ia in n on - fast in g stat e . T hese

data in dicat e th at SIA ex pression w a s properly regulated in respon se t o phy siological

stim uli an d the other hom eostasis sy stem m ight cont ribut e t o th e m ainten an ce of

norm ogly cem ic state . E specially Gly colyt ic enzym e of rAAV - LPK - SIA - t reated rat s w as

rapidly chan g ed at tr an scipt ion lev el in respon se to glu cose loadin g an d it might

par ticipat e in the r egulat ion of blood glu cose lev el. T hrou gh this study , th e tr eatm ent of

both ch emically in du ced diab etes in rat s an d autoimm un e diabet es in m ice w ith rAAV

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ex pressin g the SIA result ed in th e perm anent r emission of type 1 diabetes . T he

tr eatm ent of aut oim mune NOD mice w ith rAAV ex pressin g th e SIA resulted in the

perm an ent r emission of type 1 diab etes w ith out any detectable adv er se effect on the

hepatocytes , su gg est ing that this n ov el g ene th erapy m ay hav e th erapeutic v alu e for the

cure of type 1 diabet es in hum an s . But to realize this th erapy and u se for th e hum an , it

should be applied to th e large anim al w hich is ev olutionally close t o th e hum an an d

ev alu ated it s possibility .

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Key w ords : sin gle- chain in sulin an alog (SIA ), T ype 1 diabet es , gen e therapy , L - typepyruv ate kin ase (LPK ) prom oter , recombin ant aden o- associated viru s(rAAV ), n on - obese diabet ic (NOD) mice

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