БИОХИМИЯ, 1999, том 64, вып, 1, с. 68 - 75

УДК 677.152.1.

В Л И Я Н И Е С Т Е П Е Н И Г И Д Р А Т А Ц И И О Б Р А Щ Е Н Н Ы Х М И Ц Е Л Л А Э РО ЗО Л Я О Т В Г Е П Т А Н Е Н А ИНГИБИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛИСУЛЬФИДА

Г А Л Л О В О Й К И С Л О Т Ы В П Е Р О К С И Д А З Н О М О К И С Л Е Н И И 3 ,3 ’, 5 ,5’ Т Е Т Р А М Е Т И Л Б Е Н ЗИ Д И Н А

© 1999 г. Е.И. Карасева, Д.И. Метелица*Институт биоорганической химии НАН Беларуси,

220141 Минск, Жодинская ул., 5/2; факс: (0172)63-7274, электронная почта: ibochbеl@ns.i g s.ac.by

Поступила в редакцию 20.11.97 После доработки 25.03.98

Полидисульфид галловой кислоты (ПДСГ) с высокой эффективностью ингибирует пероксидазное окисле- ние тетраметилбензидина (ТМБ) при 20° в обращенных мицеллах аэрозоля ОТ (АОТ) в гептане при разной

степени их гидратации w0 - от 8,3 до 47,2. Как и в водной среде, константа ингибирования для ПДСГ в этой реакции имеет порядок ~10-6 М и уменьшается с увеличением w0 от 15,3 до 25. В мицеллах АОТ с разной степенью гидратации определены начальные скорости пероксидазного окисления ТМБ (υ0) в отсутствие ПДСГ. Из зависимостей периодов индукции при окислении ТМБ от начальной концентрации ПДСГ вы- числены величины стехиометрического коэффициента ингибирования ПДСГ (f) при разной степени гидра- тации мицелл АОТ. Коэффициенты f равны 30-31 при низкой степени гидратации мицелл и уменьшаются с ее ростом, достигая при w > 30 величин 11,5-12,5, что существенно выше значений f (2) для Множества из- вестных ингибиторов.КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: полидисульфид галловой кислоты, пероксидаза, тетраметилбензидин, обращенные мицеллы, аэрозоль ОТ, ингибиторы радикальных реакций, биоантиоксиданты, стехиометрический коэф- фициент ингибирования, ферменты в неводных средах.

Полидисульфид галловой кислоты (ПДСГ) успешно применяется в качестве высокоэффек­тивного биоантиоксиданта иерекисного окисле­ния липидов при черепно-мозговых травмах и других патологиях [1,2], Недавно в нашей лабо­ратории показано сильное ингибирующее дейст­вие ПДСГ в ферментативных процессах, включа­ющих радикальные реакции. Этот антиоксидант ингибировал супероксиддисмутазу (СОД), ката­лизирующую диспропорционирование анион-ра­дикалов О2 до Н20 2 и 0 2 [3]. С высокой эффектив­ностью замедлял пероксидазиое окисление 3,3', 5,5'-тетраметилбензидина (ТМБ) в водных раство­рах, проходящее по радикальному механизму с участием активных промежуточных форм перок- сидазы - комплексов I (Е0 и Н (Е2) [4], Сильное

П р и н я т ы е со к р а щ е н и я : АОТ - аэрозоль ОТ или на­триевая соль ди-(2-этил)гекеилового эфира сульфоянтар- ной кислоты, ПДСГ - полидисульфид галловой кислоты, ИХ (И) псроксидаза хрена, ТМБ - 3,3', 5,5'-тстрамстил- бензидич, ФБ - натрий-фосфатный буфер, Hi - соединение I пероксидазы, Н2 - соединение И пероксидазы, w0 = [H2OJ/ /[АОТ] - степень гидратации мицелл АОТ в гептане, InH - ингибитор радикальных процессов,* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

Ингибирующее действие ПДСГ в пероксидазных реакциях представляет не только фундаменталь­ный, но и большой практический интерес, так как невысокие концентрации ПДСГ (~1 мкМ) поз­воляют останавливать пероксидазиое окисление таких субстратов, как ТМБ (~1 мМ), что очень важно в практике иммуноферментного анализа (И ФА) при автоматизированных и массовых определениях вирусов, гормонов, лекарств, нар­котиков и многих других биологически актив­ных соединений, когда псроксидаза использует­ся в качестве фермента-маркера антигенов [5, 6].

В 1989 г. впервые был предложен метод го­могенного иммуноферментного анализа стерои­дов [7] и тироксина [8] в среде обращенных ми­целл аэрозоля ОТ (АОТ) в органических раство­рителях с использованием пероксидазных конъю­гатов прогестерона и тироксина. Проведение ИФА в мицеллярных средах имеет несомненные преимущества перед традиционным анализом в водных растворах |7 10] и по этой причине для практики важно глубокое и полное ингибирова­ние пероксидазных реакций в обращенных ми­целлах поверхностно-активных веществ (ПАВ) в органических растворителях, Фундаменталь­

68

.

©1999 Российская Академия Наук. Материал из электронного архива журнала ”Биохимия”. Статья оцифрована в Отделе Научной Информации НИИФХБ

им. А.Н. Белозерского МГУ. Использование материала автоматически предполагает выполнение условий Пользовательского соглашения.

Постоянная ссылка на материал: http://journals.belozersky.msu.ru/biochemistry/paper/1999/01/68.

1

ВЛИЯНИЕ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АЭРОЗОЛЯ 69

ный аспект проблемы состоит в том, что взаи­модействие ферментов (белков) с лигандами, субстратами (или ингибиторами) в мицелляр­ной среде может существенно отличаться от тех же процессов в водном окружении [11—13).

Поэтому цель настоящей работы - детальное кинетическое исследование ингибирующего дей­ствия ПДСГ в реакции пероксидазного окисле­ния ТМБ в обращенных мицеллах АОТ в гептане, изучение влияния на эффективность ингибирова­ния степени гидратации обращенных мицелл vv0, определение констант ингибирования К , и сте­хиометрических коэффициентов ингибирования / и сравнение полученных параметров с их зна­чениями для ПДСГ при пероксидазном окисле­нии того же субстрата в водных растворах [4],

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реагенты. В работе использовали пероксидазу хрена (КФ 1.11.1.7, ПХ) марки А с оптическим показателем чистоты R Z = 2,75 производства НПО «Биолар» (Олайне, Латвия). Для опреде­ления концентрации фермента использовали его молярный коэффициент поглощения в максимуме полосы Соре (403 нм), равный 102 000 М”1 • см"1

■ [14]. В качестве окислителя применяли разбав­ленный пергидроль, определяя концентрацию Н20 2 спектрофотометрически с использованием е23о = 72,1 М”1 ■ см”1 [15]. В качестве восстанавли­вающего субстрата ПХ применяли ТМБ фирмы «Serva» (Германия).

ПДСГ с молекулярной массой ~1760 Да был синтезирован по ранее описанной методике [1] и любезно предоставлен нам Ю.П. Лосевым (Бело­русский государственный университет, Минск). ПДСГ содержал в своем составе 7-8 мономер­ных звеньев дисульфида галловой кислоты. УФ-Спектры ПДСГ характеризуются двумя максимумами поглощения: при 216 и 268 нм [4].

В качестве мицеллообразователя применяли аэрозоль ОТ (АОТ) фирмы «Sigma» (США) в све- жеперегнанном гептане.

Приготовление обращенных мицелл АОТ и пероксидазное окисление ТМ Б в мицеллярной среде. В дистиллированной воде готовили ис­ходные растворы 0,1 М фосфатного буфера (ФБ), pH 6,4; 0,2 М Н20 2; 0,2 мкМ ПХ и ПДСГ необ­ходимой концентрации. Исходный раствор 0,1 М ТМБ готовили в диметилформамиде (ДМФ).

Общий объем мицеллярной смеси составлял 1,2 мл. Приготовление этой смеси проводили сле­дующим образом. В 0,2 М растворе АОТ в гепта­не последовательно солюбилизировали 0,012 мл ФБ, pH 6,4, ПДСГ в воде и Н 20 в зависимости от заданного значения степени гидратации ми­

целл w0. Добавляли к смеси 0,012 мл раствора ТМБ в ДМФ и выдерживали ее при 20° в течение 2 мин. К смеси добавляли 0,006 мл раствора ПХ и интенсивно встряхивали ее 15 с, после чего при­ливали к смеси 0,006 мл раствора Н20 2 и вновь встряхивали ее 15 с, считая это началом реакции.

Как правило, конечные концентрации ком­понентов мицеллярной системы, рассчитанные на весь ее объем, составляли: 0,001 М ФБ, pH 6,4; 1 мМ ТМБ, 1 мМ Н20 2, 1 нМ ПХ и 1%-ный ДМФ (по объему). В разных сериях эксперимен­тов меняли конечные концентрации ПДСГ, ТМБ или Н 20 2 по потребности,

За реакцией пероксидазного окисления ТМБ при 20° в присутствии ПДСГ в мицеллярной си­стеме и без него следили по росту поглощения продукта окисления ТМБ при длине волны 674 нм на фотометре КФК.З (Россия), имевшем термо­статированное кюветное отделение и цифровую индикацию поглощения. Начальные скорости окисления ТМБ v0 рассчитывали по начальным прямолинейным участкам роста поглощения его продукта с использованием молярного ко­эффициента поглощения е674 = 39 000 М 1 ■ см”1 [16]. В течение 1-10 мин поглощение продуктов окисления ПДСГ перекисью водорода не вноси­ло никакого вклада в полосу поглощения про­дукта окисления ТМБ (674 нм), т.е, обеспечи­вался корректный спектральный контроль пре­вращения субстрата в ходе ферментативного процесса в мицеллах АОТ в гептане.

Определение констант ингибирования К{ и стехиометрических коэффициентов ингибитора / . Для определения констант ингибирования К{ при использовании ПДСГ в мицеллярных средах применяли метод Диксона, так же как ранее в вод­ной среде [4,17]: Кх вычисляли по точке пересече­ния прямых линий в координатах Dq1 - [ПДСГ]0, полученных при разных начальных концентра­циях субстрата (ТМБ).

Так как окисляющие агенты пероксидазы - соединения Ej и Е2 - действуют по радикальному механизму [4,16,18], то к ингибированию лерок- сидазных процессов можно применить теорию метода ингибиторов, разработанную Н.М. Эма­нуэлем и сотр. [19,20]: при постоянной скорости инициирования радикалов о] и линейном обры­ве цепей справедливо равенство |1пН| ~ [1пН]0 •- (u; If) • t, т.е. ингибитор расходуется с постоян­ной скоростью г. I f где/ - стехиометрический ко­эффициент ингибитора, означающий число ради­калов, элиминируемых на одной его молекуле.

Момент окончания периода индукции в окис­лении субстрата, вызванного действием ингиби­тора, определяется уравнением (1):

Ат, - / М '‘ (1)БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

70 КАРАСЕВА, МЕТЕЛИЦА

Если справедливо уравнение (1), то из него мож­но вычислить Vi I f т ;е. оценить скорость иници­ирования радикальных частиц с точностью до

( коэффициента 1 If, как это было сделано нами при ингибировании пероксидазного окисления ТМБ в водной среде [4].

При стационарном протекании радикального процесса начальная скорость расходования суб­страта v0 практически равна скорости иниции­рования [19, 20]:

VQ~( Vi / f ) f . (2)Определив v() при окислении ТМБ в мицеллах без ингибитора и вычислив по уравнению (1) v-Jf из опытов с разными концентрациями ингиби­тора, из соотношения (2) легко получить значе­ние стехиометрического коэффициента/^ харак­теризующего данный ингибитор в конкретных условиях его использования. ,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ■ I

Каталитическая активность разных изоформ ПХ в водных средах сильно зависит от pH [21]. Поэтому мы изучили влияние pH водной микро­фазы обращенных мицелл АОТ в гептане ца на­чальную скорость пероксидазного окисления ТМБ. Как видно на рис. 1, при увеличении pH выше 6,0 скорость окисления ТМ Б в мицеллах АОТ в гептане монотонно снижается при степени гид­ратации мицелл wQ, равной 25 (зависимость 1) и 15,3 (зависимость 2), Характер зависимостей 1,2 не является неожиданным, так как изоэлектри- ческая точка кислой изоформы пероксидазы хре­на А2 pi составляет 5,0 [21]. Введение в мицелляр­ную систему ингибитора радикальных реакций

' ПДСГ не только сильно снижает начальные ско­рости окисления ТМБ при разных pH в диапазо­не 6,0—7,8, но и меняет характер зависимостей н0 от pH, которые обнаруживают максимум при pH ~6,4. Этот максимум определяется не только состоянием фермента, но и состоянием ПДСГ, так как с изменением pH происходит диссоциация ПДСГ: с ростом pH возрастает ионизация кар­боксильных групп ингибитора, так как рК гал­ловой кислоты при 25° составляет 4,41 [22], а при pH > 7,0 становится все более значительной дис­социация гидроксильных групп ингибитора, что приводит к росту его реакционной способ­ности по отношению к радикальным частицам

/ [3, 4]. В дальнейшем в большинстве эксперимен­тов мы использовали водную фазу обращенных мицелл с pH 6,4.

Каталитическая активность многих фермен­тов сильно зависит от степени гидратации обра­

щенных мицелл АОТ [11, 12]. Профили зависи­мостей v0 - w0 при пероксидазном окислении многих субстратов обнаруживают максимумы при w0 «15, если концентрация ПХ в мицеллах АОТ меньше 1 нМ [12, 23]. G увеличением [ПХ]0 выше51 нМ при окислении офенилендиамина в мицеллах АОТ в гептане максимум сглаживается, а при [ПХ]0, равном 1,5 нМ, зависимость н0 - и)0 имеет вид кривой с насыщением [23]. Как видно на рис. 2 (зависимости 1, 2), при пероксидазном окислении ТМБ в мицеллах АОТ в гептане и на­чальной концентрации [ПХ], равной 1 нМ, мак­симумы проявляются при w0 «17 как при pH 6,4 (7), гак и при pH 6,9 (2). При введении в мицел­лярную систему ПДСГ в разных концентрациях начальные скорости пероксидазного окисления ТМБ снижаются при всех степенях гидратации мицелл АОТ, положение максимума на зависи­мостях п0 - и>0 меняется и появляется небольшой по величине максимум при w0 «30 .(рис. 2, зави­симости 5-5). 1

Так как концентрация ПХ в мицеллах АОТ постоянна (1 нМ), как и концентрации восста­навливающего (ТМБ) и окисляющего (Н20 2)

Рис. 1. Зависимости начальной скорости окисления ТМБ (1 мМ) пероксидом водорода (1 мМ) в обращенных мицел­лах АОТ (0,2 М) в гептане от pH водной микрофазы (0,001 М фосфатный буфер) (1 нМ ПХ, степень гидратации w0 рав­на 25 (1) или 15,3 (2-4)): 1 ,2 - без ПДСГ, 3, 4 - в присутст­вии 5 (5) и 10 мкМ ПДСГ (4)

.. I 4 ■БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

ВЛИЯНИЕ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АЭРОЗОЛЯ ,71

Рис. ?• Зависимости начальной скорости псроксидазного окисления ТМБ (1 мМ) в обращенных мицеллах 0,2 М ЛОТ в гептане от степени их гидратации w0 (0,001 М фос­фатный буфер) (1 нМ ПХ, 1 мМ Н20 2): 7, 3-5 - pH 6,4; 2 - pH 6,9; 1,2 - без ПДСГ, 3 - .5, 4 - 10 и 5 - 20 мк1Ц ПДСГ

субстратов (1 мМ), все изменения профиля зави­симостей о0-и'0 при введении в мицеллярную си­стему ПДСГ приходится связывать с воздейст­вием этой полимерной молекулы. Поэтому сле­дующей задачей стало выяснение характера ин­гибирующего действия ПДСГ на пероксидазное окисление ТМБ в мицеллах АОТ при растущих концентрациях ингибитора. На рис. 3, а в двой­ных обратных координатах показаны зависимо­сти начальной скорости окисления ТМБ от на­чальной концентрации субстрата в отсутствие (7) и в присутствии ингибитора (2-4). Характер зависимостей свидетельствует о смешанном типе ингибирования [17], который можно объяснить конкуренцией ПДСГ и ТМБ за активные проме­жуточные формы пероксидазы Е, и Ег. Из зави­симостей обратной величины начальной скоро­сти окисления ТМ Б от концентрации [ПДСГ]0 при растущих концентрациях субстрата (ТМБ) но методу Диксона [17] вычислена константа ингибирования — 1,07 ■ КГЛ М (рис. 3, б). По­лученная величина К[ свидетельствует о высо­кой эффективности ПДСГ как ингибитора пе- роксидазного окисления ТМБ в мицеллах АОТ в гептане со степенью гидратации w0 = 15,3.

В мицеллах АОТ (ир = 15,3) были получены также зависимости и о от начальной концентра­ции окисляющего субстрата (Н20 2) при расту­щих концентрациях ПДСГ. Эти зависимости

• V .)

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

а

1 lv0 X КГ7, М-1 • с

б

Рис. 3. Зависимости обратной скорости пероксидазного окисления ТМБ от начальных концентраций субстрата и ингибитора, а - Зависимости начальной скорости перокси­дазного окисления ТМБ в обращенных мицеллах 0,2 М АОТ в гептане (w0 - 15,3) от начальной концентраций суб­страта в двойных обратных координатах при возрастаю­щих концентрациях ПДСГ (1 нМ Г1Х, 1 мМ Н26 2) в отсут­ствие (7) и в присутствии 2 (2), 5 (3) и 10 мкМ ПДСГ (4). б - Зависимости обратной скорости пероксидазного окис­ления ТМБ в мицеллах АОТ в гептане от концентрации ПДСГ при растущей концентрации ТМБ: 0,5 (7), 0,7 (2), 0,8 (3) и 1,0 мМ (4)

72 КАРАСЕВА, МЕТЕЛИЦА

были представлены сначала в двойных обрат­ных координатах, а затем в координатах Диксо­на, точно так же, как на рис. 3, а, б для восстав навливающего субстрата. Характер зависимос­тей для обоих субстратов пероксидазы (ТМБ и Н20 2) оказался аналогичным, однако величина К„ полученная из зависимостей в координатах Дик­сона при растущей концентрации Н20 2, равня­ется 1,20 • 1(Г6 М, т.е. несколько выше К\, полу­ченной в серии экспериментов с растущей кон­центрацией ТМБ (1,07 ■ 1(Г6 М). Расхождение ве­личин Ki связано с тем, что пероксид водорода расходуется в пероксидазном окислении не только продуктивно (на окисление субстрата и ингибитора), но и непродуктивно - на инакти­вацию фермента, как это показано нами ранее в водной среде [4, 23]. Поэтому истинной величи­ной следует считать К„ полученную из серии за­висимостей и0 от [ТМБ]0, а величину К{ из серии зависимостей v0 - [EEOJo - завышенной, так как при растущей концентрации Н20 2 заметно уве­личивается непродуктивное расходование окис­лителя.

Серии зависимостей, аналогичных показан­ным на рис. 3, й, 6, были получены также для восстанавливающего и окисляющего субстра­тов при более высоком значении степени гидра­тации мицелл АОТ w0 = 20. Характер самих за­висимостей не изменился, однако величины К, возросли в сравнении с их значениями в мицел­лярной среде с и>о = 15,3. В табл. 1 сравнены ве­личины К„ полученные в мицеллярных средах с разными степенями гидратации w и ранее в вод­ной среде [4].

Особенно важно знать, как влияет степень гидратации мицелл АОТ на другой параметр ингибитора - стехиометрический коэффициент ингибирования / . С этой целью изучена кинетика ингибирования пероксидазного окисления ТМБ в мицеллярной системе при растущих концент­рациях ПДСГ и разных степенях гидратации мицелл w0 в широком диапазоне их величин - от В,33 до 47,22. На рис. 4, а показаны кинетичес­кие кривые роста поглощения продукта окисле­ния ТМБ в мицеллах АОТ со степенью гидрата­ции w0 = 25 при разных начальных концентра­циях ПДСГ в диапазоне 1,4-11,0 мкМ, Как ви­дим, периоды индукции Дт при окислении ТМБ возрастают линейно с увеличением концентра­ции [ПДСГ]0 (рис. 4, б), т.е. выполняется ̂ уравне­ние (1) (см. «Методы исследования»), что озна­чает справедливость теории ингибирования ра­дикальных реакций в приложении к пероксидаз- ному окислению ТМБ в мицеллярной среде. Применимость теории ингибирования [19, 20] к пероксидазным реакциям в водной среде дока­зана нами ранее [4]. Зависимости, аналогичные

Таблица 1. Константы ингибирования K t для полидисуль­фида галловой кислоты (ПДСГ) в реакции пероксидазного окисления ТМБ при 20° в разных средах (1 нМ ПХ, 1 мМ Н20 2 при меняющейся [ТМБ]0, 1 мМ ТМБ при меняющейся [Н2О2]0)

Среда реакции Значения К х 106, М

из серии зависимостей н0

от [ТМБ]„

из серии зависимостей н0

от [Н2О2]0

Мицеллы АОТ в гептане, vv0 = 15,3 1,07 ± 0,05 1,20 + 0,05

Мицеллы АОТ в гептане, w0 = 25,0 1,60 + 0,05 1,87 ±0,05

0,01 М фосфатный буфер, pH. 6,4 1,30 ±0,05* 1,80 ±0,05*

* Величины получены нами ранее [4].

представленным на рис. 4, а, б, были получены нами также при других степенях гидратации ми­целл АОТ в гептане. Во всех случаях определе­ны периоды индукции Дт, начальные скорости пероксидазного окисления v0 в отсутствие ПДСГ, по уравнению (1) вычислены величины и / / а из соотношения (2) определены стехиометрические коэффициенты ингибирования / Все .экспери­ментально полученные величины и коэффици­енты /п ри разных степенях гидратации мицелл АОТ в гептане приведены в табл. 2.

На рис. 5 и в табл. 2 представлено изменение коэффициентов/в зависимости от w0: увеличе­ние w0 до 25-28 сопровождается снижением/бо- лее чем в 3 раза, до минимальной величины 9,2, а при дальнейшем повышении w0 выше ,30 до­стигается почти постоянный уровень / ' состав­ляющий ~ 11,5-12,5, т.е. ПДСГ максимально ак­тивен в мицеллах АОТ с относительно низкой степенью гидратации и менее активен в мицел­лах с высокой увлажненностью.

Из рис. 5 следует, что ПДСГ теряет свою эф­фективность с ростом увлажненности мицелл. Наиболее вероятным объяснением этого инте­ресного факта может быть сольватация самого ингибитора при растущем содержании воды в мицеллах, что приводит к понижению его реак­ционной способности по отношению к ради­кальным частицам: именно так рассматривается роль сольватации в реакциях обрыва цепей на ингибиторах в жидкофазных процессах окисле­ния углеводородов [24]. Нельзя исключить так­же, что одной из причин высокого значения / в мицеллярной среде при окислении ТМБ может быть обменная реакция аминильных радикалов

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

ВЛИЯНИЕ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АЭРОЗОЛЯ 73

Рис. 4, Кинетические зависимости пероксидазного окисления ТМБ при разных концентрациях ПДСГ. а - Кинетические кривые роста поглощения продукта пероксидазного окисления ТМБ (1 мМ) в обращенных мицеллах 0,2 М АОТ в гептане (w0 = 25) при возрастающих концентрациях ПДСГ (1 нМ ПХ, 1 мМ Н20 2): 0 (1), 1,4 (2), 2,0 (3), 3,0 (4), 4,0 (5), 5,0 (б), 6,0 (7), 8,0 (8), 9,0 (9), 11 {10) и 12 мкМ ПДСГ (11). б - Зависимость периодов индукции в пероксидазном окислении ТМБ в обра­щенных мицеллах АОТ в гептане (vv0 = 25) от начальной концентрации ПДСГ (условия - те же)

f

0 Ю 20 30 40 50

иу

Рис. 5. Зависимость стехиометрического коэффициента ингибирования / для ПДСГ в реакции пероксидазного окислений ТМБ (1 мМ) в обращенных мицеллах 0,2 М АОТ в гептане от степени их гидратации w0 (0,001 М фос­фатный буфер, pH 6,4): 1 нМ ПХ, ГмМ Н20 2, 10 или 20 мкМ ПДСГ (см. табл, 2)

(ТМБ)* с фенольным ингибитором ПДСГ, как это показано Н.М. Эмануэлем и сотр. для многих пар ароматических аминов и фенолов [25, 26]:

(ТМБ)* + ПДСГ ТМБ + (ПДСГ)*. (3)

Эта реакция обеспечивает регенерацию ТМБ и препятствует его расходованию (образованию продукта окисления) до тех пор, пока не израс­ходуется ингибитор (ПДСГ)*. Если обменная реакция (3) играет важную роль при перокси­дазном окислении ТМБ, то уменьшение / с рос­том w0 может объясняться не только сольвата­цией ПДСГ, но и сольватацией радикала (ТМБ)*. Еще одной из возможных причин снижения/с ростом w0 может стать увеличение размера ми­целл АОТ с возрастанием степени их гидрата­ции [27], так как в радикальных процессах боль­шую роль играет эффект «клетки растворителя» [28]: чем меньше ее объем, тем вероятнее реак­ция радикалов с их акцептором и друг с другом. Если это так, то с ростом размера мицелл (уве­личением и’о) скорость обменной реакции (3) бу-

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

74 КАРАСЕВА, МЕТЕЛИЦА

Таблица 2. Кинетические параметры пероксидазного окисления ТМБ при 20° в обращенных мицеллах АОТ в гептане при разной степени гидратации мицелл w0 (1 нМ ПХ, 1 мМ ТМБ, ГмМ Н20 2)

Щ [ПДСГ]0, мкМ Дг, с и0 х Ю7, М ■ с 1 (Ui/Д х 108, М • с 1 / '

■ 8,33 ю.о ; 640 4,71 1,56 30,2

11,10 10,0 500 6,24 2,01 31,0

13,89 20,0 705 7,63 2,84 26,916,67 20,0 400 7,96 5,04 15,8

19,44 20,0 . 405 7,49 4,93 15,2

< . 22,22 20,0 ' 280 7,75 7,11 ; 10,9

25,0 20,0 250 А 7.4° 7,96 9,327,78 20,0 260 7,09 7,71 ' 9,230,56 20,0 315 6,94 6,37 10,933,33 20,0 345 6,70 5,78 11,636,17 20,0 325 6,92 6,18 11,238,89 20,0 ■ 345 6,85 5,81 ‘ 11,841,67 20,0 365 6,83 5,45. 12,5'44,45 20,0 350 6,81 5,67 12,0

' . 47,22 . 20,0 330 6,95 5,99 11,6

дет сильно снижаться, что формально может быть выражено как уменьшение / . В пользу по­следней версии свидетельствует высокое значе­ние/, полученное нами для ПДСГ при перокси- дазном окислении ТМБ в водной среде: /= 1 7 ,8 [4]. В водном растворе возможность сольвата­ции как самого ингибитора, так и аминильных радикалов больше, чем в мицеллах, однако ко­эффициент/ в водной среде выше, чем в мицел­лах при vr0 > 30 (11,5-12,5); в то же время в ми­целлах малого размера (при уменьшении w0 до ~ 11)/достигает 31, что можно связать с эффек­том «клетки», которую представляет собой вну­тренняя полость обращенной мицеллы АОТ.

■ Высокая ингибирующая эффективность ПДСГ как в водной среде [4], так и в обращенных ми­целлах АОТ в гептане несомненно связана с его полимерной природой: одна молекула ПДСГ содержит ,7—8 звеньев мономерного ингибитора, аналогом которого может быть галловая кисло­та. Нами показано, что в водной среде при пе- роксидазном окислении ТМБ галловая кислота характеризуется коэффициентом / который ме­няется в пределах 1,5—2,1, т.е. галловая кислота по этому критерию попадает в категорию обыч­ных ингибиторов, для которых, как правило,/ж 2 [28]. Если коэффициент / для ПДСГ в перокси- дазных процессах в водной среде отнести к чис­лу мономеров (17, 8/8), то получится средняя ве-

1- : . ■

личина 2,2, близкая к значению /д л я галловой кислоты в пероксидазном окислении того же субстрата. ;

Проведенная работа показала, что полиди­сульфид, галловой кислоты не только сохраняет свою высокую ингибирующую эффективность в пероксидазном окислении ТМБ в мицеллярной среде, но и превосходит по двум показателям (К-, и J) его возможности в водной среде, если ув­лажненность мицелл АОТ в гептане относитель­но невысока (и>0 < 15-17). Это открывает пер­спективу практического использования ПДСГ в качестве ингибитора пероксидазных реакций ib мицеллярных средах. Установленная зависи1 мость коэффициента ингибирования от степени гидратации обращенных мицелл АОТ в гептане (рис. 5) требует дополнительного изучения на новых примерах/пероксидазного окисления дру­гих субстратов в мицеллярных системах разного состава.

Авторы приносят большую благодарность Ю.П. Лосеву за предоставление поЛидисульфи- да галловой кислоты. ■

/Представленная работа выполнена в рамках

Европейского проекта совместных исследова­ний (№ 93-2223) при финансовой поддержке ИНТАС.

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВЛИЯНИЕ СТЕПЕНИ ГИДРАТАЦИИ ОБРАЩЕННЫХ МИЦЕЛЛ АЭРОЗОЛЯ 75

1. Лосев Ю.П., Лосев В.И., Федулов А.С., Олешкевич Ф.В., Климкович В.А., Бирюкова Н.М. (1989) Поли-

- дисульфид галловой кислоты как биоантиоксидант. Авт. свид. СССР № 1452087, МКИ 4G 08 С 75/14, А 61 4 31/795. Опубл. 17.04.89. Бюлл. изобр. № 4.

2. Федулов А.С: (1996) Очаговые травматические повреждения головного мозга; клинике-эксперимен­тальное обоснование применения антиоксидантов в комплексной терапии. Автореферат дисс. докт. мед. наук, БелГИУВ, Минск.

3. Еремин А.Н., Лосев Ю.П., Метелица Д.И. (1997) Биохимия, 62, 894-904.

4. Карасева Е.И., Лосев Ю.П., Метелица Д.И. (1997) Биохимия, 62, 1255-1263.

5. Йммуноферментный анализ (1988) (под ред. Нго Т.Т., Ленхоффа Г.), Мир, Москва. ■

6. Егоров А.М., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М, (1991) Теория и практика иммунофёрментцого анализа. Высшая школа, Москва.

7. Еремин А Н., Метелица Д.И. (1989) Дот . АН БССР, 33,932-935,

8. Кабанов А.В., Хруцкая М .М ., Будавари М.И.,, Еремин С.А., Клячко Н.Л., Левашов А.В. (1989) Докл.

АН СССР, 305, 1253-1256.9. Еремин А.Н., Карасева Е.И., Метелица Д.И. (1991)

Докл. АН БССР, 35, 549-552.10. Еремин А.Н., Метелица Н.М., Метелица Д.И. (1992)

Изв. А Н Беларуси. Сер. хим. наук, № 2, 83-88.11. Левашов А.В. (1987) Итоги пауки и техники. Био­

технология. Т. 4. ВИНИТИ, Москва, с. 112-158.12. Метелица Д.И., Еремин А.Н. (1988) Успехи биол.

химии, 28, 145-173.13. Metelitza, D.I., and Eryomin, A.N. (1986) in Fundamen­

tal Research in Homogeneous Catalysis (Shilov, A.E., ed.), Gordon and Breach Sci. Publ. Ltd., London, pp. 723-732.

14. Shannon, L., Kay, M.E., and Lew, E.J. (1966) J. Biol. Chem., 241,2166-2172.

15. Справочник химика (1967) (под ред. Никольского Б.П.). Т. 4, Химия, Ленинград, с. 919.

16. Метелица Д.И ., Савенкова М.И., Курченко В.П. (1987) Прикл. биохим. и микробиол., 23, 116-124.

17. Келети Т. (1990) Основы ферментативной кинетики. Мир, Москва, с. 183-203.

18. Метелица Д.И. (1984) Моделирование окислительно-вос­становительных ферментов. Наука и техника, Минск.

19. Эмануэль Н.М., Денисов Е.Т., Майзус З.К. (1965) Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе. Наука, Москва.

20. Эмануэль Н.М., Бучаченко А.Л. (1982) Химическая физика старения'и стабилизации полимеров. Наука, Москва, с. 239-308.

21. Газарян И.Г. (1992) Итоги науки и техники. Биотех­нология. Т. 36. Биотехнология пероксидазрастений и гри­бов (под ред. Егорова А.М.), ВИНИТИ, Москва, с. 4-9.

22. Краткая химическая энциклопедия. Т. 1 (1961) Совет­ская энциклопедия, Москва, с. 778.

23. Карасева Е.И., ЧереДникова Т.В., Метелица Д.И. (1996) Биохимия, 61, 322-335.

24.. Эмануэль Н.М., Заиков.Г.Е., Майзус З.К. (1973) Роль среды в радикально-цепных реакциях окисления органи­ческих соединений. Наука, Москва, с. 205-228.

25. Карпухина Г.В., Майзус З.К., Эмануэль Н.М. (1963) Докл. АН СССР, 152, 110-114.

26. Карпухина Г.В., Майзус З.К., Эмануэль Н.М. (1965) Докл. А Н СССР, 160, 158-162.

27. Eicke, H.-F., and Rehak, J. (1976) Helv. Chim. Acta, 59, 2883-2891.

28. Денисов E.T. (1971) Константы скорости гемо­литических жидкофазных реакций. Наука, Москва, с. 108 118,405 417.

EFFECT OF A E R O SO L ОТ REVERSED M ICELLES HYDRATION DEGREE IN H EPTA N E O N INHIBITING ACTIO N O F PO LYDISULFIDE

OF GALLIC ACID IN PER O X IDA SE-D EPEN D EN T OXIDATION O F 3,3',5,5'-TETRAM ETH YLBENZIDINE

E.I. Karaseva, D.I. Metelitza

Institute o f Bioorganic Chemistry, National Academy o f Sciences o f Belarus, ul. Zhodinskaya 5/2, Minsk 220141, Belarus; fax: (0172)63-7274, E-mail: ibochbel@ns.igs.ac.by

Submitted November 20, 1997Revision submitted March 2 5 , 1998

Polydisulfide of gallic acid (PDSG) inhibits with high efficiency the peroxidase-catalyzed oxidation of tetramethyl- benzidine (TMB) at 20°C in reversed Aerosol ОТ (AOT) micelles in heptane with various hydration degree w0 rang- ing from 8.3 up to 47.2. Like in aqueous medium, the inhibition constant, K i for PDSG in this reaction had the order of ~ 10-6 M and decreased with increasing the w0 from 15.3 to 25. In the AOT micelles with various hydration degree, the initial rates of peroxidase-catalyzed oxidation of TMB in the absence o f PDSG were determined. From dependencies o f induction time o f TMB peroxidation on the initial PDSG concentration, the values of stoichio- metric inhibition coefficient were calculated. The coefficients f equal 30-31 at low hydration degree of the AOT micelles and decrease with its increase achieving at w0 > 30 the constant level o f 11.5-12.5 that is much higher than

the coefficients for many know inhibitors.KEY WORDS: polydisulfide o f gallic acid, peroxidase, tetramethylbenzidine, reversed micelles, aerosol ОТ, inhibitors of radical reactions, bioantioxidants, stoichiometric coefficient o f inhibition, enzymes in non-aqueous media.

БИОХИМИЯ том 64 вып. 1 1999