Biochemia stresu oksydacyjnego

Dr hab. Agnieszka Łoboda

Oksygenazy hemowe – nowe funkcje

starych enzymów

Wykład 4

28.10.2016

HO-1/BVR

2 dni

zielony

biliwerdyna

12h

czerwony

hem

5 dni

żółty bilirubina

10 dni

żółty

bilirubina

Mann & Motterlini, Chem. Commun. 2007

Oksygenaza hemowa-1

HO-1

Siniak

gojenie

hemoglobina

biliwerdyna

bilirubina

Oksygenaza hemowa-1 (HO-1)

- HO-1 jest indukowalnym enzymem mikrosomalnym (ale obecnym także w jądrze i

mitochondriach) o masie 32,000 Da.

Abraham & Kappas. Pharmacologic Rew 2008.

Test aktywności HO –

ekstrakcja bilirubiny w chloroformie

Bufor fosforanowy +

MgCl2

Glukozo-6-fosforan

Dehydrogenaza glukozo-6-

fosforanu

Źródło reduktazy biliwerdyny

(BVR)

Lizaty komórkowe – liza mechaniczna –

źródło HO

NADPH

Regeneracja NADPH

Szczurzy cytozol wątrobowy

Oczyszczone białko - rBVR

Hemina

Chloroform

37 °C

1 h

Loboda et al. Vascular Pharmacology, 2015

Oksygenazy hemowe

HO-1 – forma indukowalna

HO-2 – forma konstytutywna

Science. 1987 Feb 27;235(4792):1043-6.

Bilirubin is an antioxidant of possible physiological importance.

Stocker R, Yamamoto Y, McDonagh AF, Glazer AN, Ames BN.

Abstract

Bilirubin, the end product of heme catabolism in mammals, is generally regarded

as a potentially cytotoxic, lipid-soluble waste product that needs to be excreted.

However, it is here that bilirubin, at micromolar concentrations in vitro, efficiently

scavenges peroxyl radicals generated chemically in either homogeneous solution or

multilamellar liposomes. The antioxidant activity of bilirubin increases as the

experimental concentration of oxygen is decreased from 20% (that of normal air)

to 2% (physiologically relevant concentration). Furthermore, under 2% oxygen, in

liposomes, bilirubin suppresses the oxidation more than alpha-tocopherol, which is

regarded as the best antioxidant of lipid peroxidation. The data support the idea

of a "beneficial" role for bilirubin as a physiological, chain-breaking antioxidant.

Bilirubina i biliwerdyna - przeciwutleniacze

Ryter @ Tyrrel. Free Radic Biol Med. 2000.

- W fizjologicznych stężeniach tlenu zarówno biliwerdyna jak i bilirubina mają

działanie antyoksydacyjne:

* chronią nienasycone kwasy tłuszczowe przed utlenieniem, nie mniej efektywnie

niż a-tokoferol

* bilirubina w kompleksie z albuminą surowicy chroni przed peroksydacją lipidy

związane z albuminą i chroni albuminę przed degradacją indukowaną przez rodnik

hydroksylowy

* Bilirubina reaguje z anionorodnikiem ponadtlenkowym i HOCl, chroni również

białka przed fotooksydacją. Jest zlokalizowana głównie w błonach

* Koniugaty biliwerdyny (takie jak w żółci) chronią lipidy przed peroksydacją

* Bilirubina i biliwerdyna działają synergistycznie z a-tokoferolem i zmniejszają

zużycie a-tokoferolu

* W surowicy endogenne antyoksydanty zużywane są w kolejności: ubichinol-10,

askorbinian i bilirubina. Czyli bilirubina chroni lipidy przed peroksydacją po

wyczerpaniu endogennych antyoksydantów

Bilirubina i biliwerdyna - przeciwutleniacze

- Akumulacja bilirubiny u noworodków (żółtaczka noworodków) może prowadzić do

encefalopatii i neurotoksyczności.

- W stężeniach 30-70 mM bilirubina powoduje lizę erytrocytów.

- W stężeniach nanomolarnych jest neuroprotekcyjna.

Ryter @ Tyrrel. Free Radic Biol Med. 2000.

wewnątrz komórek stężenie bilirubiny jest 10,000 razy niższe niż GSH

- BVR jest enzymem obecnym we wszystkich komórkach

- Jest enzymem konserwatywnym ewolucyjnie: występuje u ssaków i innych

kręgowców oraz np. krasnorostów. Wśród ssaków homologia BVR to około 80%

- Gen BVR składa się z 8 egzonów i 7 intronów, obejmuje 17,025 bp

Reduktaza biliwerdyny (BVR)

Sedlar & Snyder. Peditrix 2004.

- Białko BVR zlokalizowane jest w kaweolach

błony komórkowej, w cytoplazmie i w jądrze

- BVR jest reduktazą o dwóch optimach pH: 7.0

(wtedy źródłem wodoru jest NADH) oraz 9.0 (wtedy

źródłem wodoru jest NADPH).

- Jest kinazą serynowo-treoninową.

- Jest także kinazą tyrozynową – prowadzi

autofosforylację, a autofosforylacja jest konieczna

do redukcji biliwerdyny do bilirubiny.

- BvR jest czynnikiem transkrypcyjnym z

domeną suwaka leucynowego. Działa jako dimer i

wiąże się do sekwencji rozpoznającej AP-1.

Maines M. Physiology 2005.

Reduktaza biliwerdyny (BVR)

Tlenek węgla

Dulak et al. Circulation 2008

Beltowski et al. Postepy Hig Med Dosw , 2004

Dulak et al. Circulation 2008

Oksygenazy hemowe - funkcje

HO-1 Fe2+

antioxidant

anti-inflammatory

anti-apoptotic

pro-angiogenic

cytoprotection

ACTIVITY PRODUCT MECHANISM

ferritin

synthesis

iron ATP-ase

pump

ROS BVR

activation of sGC leading

to cGMP production

p38 MAPK regulation

BILIVERDIN

BILIRUBIN

CO

ROS

scavenging

Inhibition of

complement

anti-apoptotic

anti-proliferative

anti-thrombotic

anti-

inflammatory

pro-angiogenic

cytoprotection

antioxidant

anti-inflammatory

anti-apoptotic

cytoprotection

HEME

others

HO-1 i stres oksydacyjny/apoptoza

cytoprotekcyjne działanie HO-1 ochrona śródbłonka przed stresem oksydacyjnym Balla et al., J Biol Chem., 1992

HO-1 i stres oksydacyjny/apoptoza

EC

TNFa, oxLDL, oxidative stress

lack of nutrients

EC

Anti-apoptotic genes

Pro-apoptotic genes

CO

p38 MAPK

NF-B HSF-1

apoptotic EC apoptotic EC

cytochrome C release

p53 expression

caspase 3, 8, 9

HO-1

Loboda et al. ARS 2008

Mechanizmy tworzenia naczyń krwionośnych

Carmeliet, Nature 2000

Waskulogeneza

Do niedawna uważano, że waskulogeneza

ograniczona jest jedynie do okresu rozwoju embrionalnego, ale

ostatnie badania sugerują, iż tzw. waskulogeneza postnatalna z

komórek progenitorowych pochodzenia szpikowego może przyczyniać

się do tworzenia naczyń krwionośnych w procesach fizjologicznych

(np. dojrzewanie oocytów w jajniku), naprawczych (gojenie ran) oraz

patologicznych (np. wzrost naczyń w nowotworach).

Waskulogeneza

Grochot-Przeczek et al. Thromb haemost

Proangiogenne komórki progenitorowe (PACs)

CD45-Sca-1+KDR+

Szpik kostny

Komórki jądrzaste

Fibronektyna/żelatyna

Komórki

adherentne

PACs

Inkorporacja do naczyń

krwionośnych in vitro AcLDL

Lektyna 9 dni hodowli

Grochot-Przeczek et al. Antioxid Redox Signal 2014

Dysfunkcja śródbłonka w cukrzycy

Abraham et al. Pharmacol Rev, 2008

Diabetes. 1993; 42: 801-8 13.

Hyperglycemic pseudohypoxia and diabetic complications.

Williamson JR et al.

Abstract

Vasodilation and increased blood flow are characteristic early vascular responses to acute hyperglycemia

and tissue hypoxia. In hypoxic tissues these vascular changes are linked to metabolic imbalances

associated with impaired oxidation of NADH to NAD+ and the resulting increased ratio of NADH/NAD+. In

hyperglycemic tissues these vascular changes also are linked to an increased ratio of NADH/NAD+, in

this case because of an increased rate of reduction of NAD+ to NADH. Several lines of evidence

support the likelihood that the increased cytosolic ratio of free NADH/NAD+ caused by

hyperglycemia, referred to as pseudohypoxia because tissue partial pressure oxygen is normal, is a

characteristic feature of poorly controlled diabetes that mimics the effects of true hypoxia on vascular

and neural function and plays an important role in the pathogenesis of diabetic complications. These

effects of hypoxia and hyperglycemia-induced pseudohypoxia on vascular and neural function are

mediated by a branching cascade of imbalances in lipid metabolism, increased production of superoxide

anion, and possibly increased nitric oxide formation.

Hiperglikemiczna pseudohipoksja

Szlak poliolowy – konwersja glukozy do sorbitolu, w wyniku aktywacji tego toru przemian dochodzi

do obniżenia stosunku NADPH/NADP+ oraz wzrostu stosunku NADH/NAD+.

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Mobilizacja EPC ze szpiku

- EPC: komórki progenitorowe śródbłonka

- VEGF: czynnik wzrostu śródbłonka naczyń

- MMP-9: metaloproteinaza-9

- eNOS: śródbłonkowa syntaza tlenku azotu

SDF-1

EPC

EPC

Regulacja mobilizacji EPC w cukrzycy

- W cukrzycy zmniejszony jest poziom fosforylacji eNOS przez kinazy PI3K/Akt,

przez co zmniejsza się produkcja NO.

- Nasilony stres oksydacyjny i zwiększona produkcja anionorodnika

ponadtlenkowego prowadzi do nasilonej syntezy nadtlenoazotynu (ONOO-) i

zmniejszenia dostępności NO.

- W ranach cukrzycowych osłabiona jest synteza SDF-1, co zmniejsza napływ

komórek progenitorowych do uszkodzonych tkanek. To przyczynia się do

upośledzenia angiogenezy i opóźnia gojenie.

- Cukrzyca powoduje również zmniejszenie liczby EPC w szpiku.

WT db/db

Liu & Velazquez. Antioxid Redox Signal 2008

Regulacja mobilizacji EPC w cukrzycy

Jarajapu & Grant. Circ Res 2010.

Upośledzenie funkcji EPC w cukrzycy

EPC: komórki progenitorowe śródbłonka

- U zdrowych osobników czynniki uwalniane

przez ischemiczne lub zranione tkanki

mobilizują komórki progenitorowe (w tym

EPC) ze szpiku, a te po dotarciu do miejsc

zranienia lub niedotlenienia uwalniają

czynniki proangiogenne (w tym niewielkie

ilości ROS) oraz biorą udział w

neowaskularyzacji i naprawie naczyń.

- W cukrzycy sygnały wysyłane przez

niedotlenione lub zranione tkanki są słabsze,

przez co mobilizacja komórek progenitoro-

wych jest mniejsza. Komórki progenitorowe

które docierają do zranionych tkanek

uwalniają niewiele czynników proangiogen-

nych, natomiast dużo prozapalnych i

antyangiogennych (w tym duże ilości ROS).

Komórki progenitorowe śródbłonka (EPC)

WT

db/db

EPC

wt db0.0000

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

0.0006

0.0007

*

% k

om

óre

k

Krew obwodowa

CD45(-), Sca-1(+), KDR(+)

% o

f cells

Kotlinowski et al. In preparation; Grochot-Przeczek et al. PLoS One 2009

db/db WT

Day 1

Day 3

Day 8

Day 17

Day 0

Skóra - rana

ZBM UJ

Wpływ cukrzycy na komórki śródbłonka

Krążki aorty zatopione w matriżelu - 5 dni inkubacji. Widoczne tworzące się

kapilary.

Myszy WT

Myszy db/db

Proangiogenne komórki progenitorowe % o

f cells

Num

ber

of

cells

Num

ber

of

connecti

ons

Tota

l le

ngth

of

spro

uts

proliferacja migracja tubule

kontrola cukrzyca N

um

ber

of

connecti

ons

empty

medium

growthy

medium

WT db/db

test sferoidalny tworzenie tubul na matriżelu migracja

kontrola db/db db/db

Kotlinowski et al., 2014

sferoidy

kontrola kontrola db/db

(jeden z) Mechanizm: stres oksydacyjny prowadzący do zwiększenia

produkcji ROS, obniżonej biodostępności NO, zaburzonego przekazu

sygnału (PI3K/Akt) i zwiększonego zapalenia

EPC

liczba i

funkcja

cukrzyca

nadciśnienie

Palenie

papierosów

otyłość

Zaburzenia w funkcjonowaniu EPC może

wynikać z obniżonej ekspresji/aktywności

genów antyoksydacyjnych oraz

zwiększonego stresu oksydacyjnego

EPC u pacjentów z chorobami układu naczyniowego

Czy można zahamować stres oksydacyjny w EPC?

hyperlipidemia

Czy możemy poprawić funkcje komórek EPC w cukrzycy?

Abraham et al. Pharmacol Rev, 2008

*

Aktywność oksygenaz hemowych

oksygenaza hemowa

Ferritin

uszkodzenie tkanek

białka

hemowe

Fe2+ uszkodzenie tkanek

bilirubina ochrona biliwerdyna

CO

ochrona

rozpuszczalna cyklaza

guanylanowa

cGMP GTP

pompa żelazowa

ochrona

Hem

ochrona p38

BvR

Brak HO-1 wpływa na właściwości angiogenne komórek PACs

control SDF-1 10% FBS 0

10

20

30

40

50

nu

mbe

r of

cel

ls *

# #

HO-1+/+

HO-1-/-

control VEGF

*

*

#

##

0

20

40

60

80

100

% o

f p

osit

ive

cell

s

HO-1+/+

HO-1-/-

DAPI

DAPI

PCNA

PCNA

HO-1+/+

HO-1-/-

Proliferacja Migracja

Grochot-Przeczek et al., Antioxid Redox Signal, 2014

HO-1+/+ HO-1-/-

Różnicowanie

Skutki braku HO-1 u myszy

Na istotność HO-1 wskazują skutki jej braku u myszy: zwiększona

peroksydacja lipidów, uszkodzenie śródbłonka i wątroby, niedorozwój

gonad, niepłodność, przedwczesna śmierć.

- Fibroblasty myszy HO-1-/- są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny.

After Poss & Tonegawa, PNAS 1997.

0

100

200

300

400

HO-1+/+

Zwiększona produkcja ROS przez

mysie fibroblasty HO-1-/-

% F

luore

scene o

f untr

eate

d c

ells

Komórki traktowane

100 mM heminą przez 24 h

0

20

40

60

80

100

Obniżona przeżywalność

mysich fibroblastów HO-1-/-

Komórki traktowane

100 mM heminą przez 24 h

% S

urv

ival

HO-1-/- HO-1+/+ HO-1-/-

*

*

Yet et al. FASEB J. 2003.

Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych

lesion

lesion

lipid accumulations

Yet et al. FASEB J. 2003.

HO-1 i VEGF

Jozkowicz et al. Antioxid Redox Signal 2003, 2007

Proliferacja komórek śródbłonka

10 30

Synteza VEGF

0

50

100

150

200

control 1 3

WT HO-1 KO

VEG

F [p

g/m

l]

* *

*

*

#

#

# # #

15d-PGJ2 [mM]

0

0.1

0.2

0.3

control 1 3 10

Brd

U in

corp

ora

tio

n

[OD

45

0 n

m]

WT HO-1 KO

VEGF [ng/ml]

Dulak et al. in: Heme oxygenase in biology and medicine, 2005

VEG

F [%

of

con

tro

l]

0

50

100

150

200

250

300

VEGF to

tal l

en

gth

of

spro

uts

[%

of

con

tro

l] *

VEGF HO-1

VEGF VEGF + bgal

cDNA

0

50

100

150

200

250

300 * Synteza VEGF

control b-gal HO-1

VEGF + HO-1 cDNA

Tworzenie kapilar in vitro

VEGF bgal

Nadekspresja HO-1 in vitro

Nadekspresja HO-1 zwiększa syntezę VEGF poprzez

aktywację promotora

(komórki HMEC-1 transfekowane przejściowo pcDNA-HO1)

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003

VEG

F [

% o

f contr

ol]

0

50

100

150

200

250

300

*

VEGF - białko

control b-gal HO-1

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

VEG

F/G

APD

H r

ati

o

*

VEGF mRNA

control b-gal HO-1

Lum

inesc

ence [

% o

f contr

ol]

0

100

200

300

400

b-gal HO-1

*

VEGF aktywność promotora

pGL2-VEGF

VEGF VEGF +

CORM, 1 mM

VEGF +

HO-1 transfection

VEGF +

bgal

transfection

0 VEGF + HO-1

cDNA

bgal

cDNA + CORM

1 mM

cum

ula

tive

len

gth

of

spro

uts

[% o

f co

ntr

ol

valu

e]

50

100

150

200

250 *

*

Nadekspresja HO-1 nasila angiogenne właściwości komórek śródbłonka

Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal, 2003

Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal 2003, 2007

HO-1

CO

cGMP

p38

PKG CREB

PKA

AP-1 AP-1

PI3K Akt

VEGF HO-1 cDNA

bgal cDNA

VEGF +

VEGF + VEGF + CORM

Nadekspresja HO-1 lub podanie CO ułatwia tworzenie kapilar

Biliwerdyna w sposób zależny od dawki i czasu zwiększa ekspresję VEGF w ludzkich keratynocytach

- p<0,05 vs control

control 10 mM 30 mM

VEGF

EF2

Control 3 h 6 h 12 h 24 h

165 121

30 μM biliverdin

0 50

100 150 200 250 300 350 400

VE

GF

(%

of

con

tro

l)

Control BV 1 mM

BV 10 mM

BV 30 mM

0 100

200 300

400 500

600 700

800

3h 6h 12h 24h

VE

GF

(%

of

con

tro

l)

*

* *

*

dose-dependent time-dependent

30 μM biliverdin

Loboda et al., Antioxid Redox Signal , 2008

control VEGF + SnPPIX VEGF

Zahamowanie HO-1 blokuje właściwości angiogenne

komórek śródbłonka

control VEGF VEGF SnPPIX

cum

ula

tive

len

gth

of

tub

es

[% o

f co

ntr

ol v

alu

e]

0

20

40

60

80

100

120

Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal, 2003

SnPPIX – Inhibitor aktywności HO-1

Deshane et al. J Exp Med, 2007

HO-1 jest konieczna do proangiogennego działania SDF-1

Grochot-Przeczek et al., ARS 2013.

Wpływ braku HO-1 na proliferację EPC

[barwienie PCNA ]

EPC WT EPC KO VEGF VEGF control control

*

*

0

20

40

60

80

100

Control

% o

f posi

tive c

ells

WT

KO

VEGF

30 ng/ml

*

*

Control H2O2 100 uM

Annexin

V p

osi

tive c

ells

[% o

f contr

ol]

*

** #

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900 HO-1 +/+

HO-1 -/-

Wpływ braku HO-1 na wrażliwość EPC na stres oksydacyjny

Grochot-Przeczek et al., ARS 2013.

Apoptoza

[Annexin V staining]

Keap1

NORMAL

CONDITIONS

cytoplasm

Nrf2 is sequestered

in cytoplasm by Keap1

Nrf2

proteasom 26 S Nrf2

Ub Ub

Ub Nrf2 degradation by the ubiquitin

proteasome pathway

Keap1

-S-S- -S-S-

Disruption

of Nrf2-Keap1 complex

Nrf2 translocates

to the nucleus and activates gene expression

STRESSFUL

CONDITIONS

ARE

Maf

Nrf2 cytoplasm

P

P Nrf2

CBP nucleus

HO-1, GST, NQO1 …

P

P

Loboda et al., CMBL 2016

Czynnik transkrypcyjny Nrf2

IL-8 Loboda et al., Antioxid Redox Signal 2009

HO-1

Nrf2 Keap1

Cul3

E2

Rbx1

Ub

ARE Nrf2

Nrf2 Maf

nucleus

CBP

Degradacja Nrf2

Keap1

Ischemia

ROS

sulforafan

Czynnik transkrypcyjny Nrf2

Enzymy detoksyfikujące, antyzapalne, antyoksydacyjne

ARE – ang. antioxidant response element

element odpowiedzi antyoksydacyjnej

Brak Nrf2 upośledza proces angiogenezy

Nrf2-/- Nrf2+/+

400x

10

0 x

2

00

x

Test krążków aortalnych

Florczyk et al., Antiox Redox Signal, 2014

W komórkach PAC Nrf2-/- procesy angiogenne są zaburzone

control VEGF 0

10

20

30

40

50

60

70

% o

f p

roli

fera

ting c

ells

# #

Nrf2+/+

Nrf2-/-

400 x 400 x

#

Nrf2+/+ Nrf2-/- 0

5

10

15

20

nu

mb

er o

f tu

bu

les/

sp

her

e

0

50

100

150

200

#

Nrf2+/+ Nrf2-/-

#

*

control SDF-1α 10% FBS 0

10

20

30

40 Nrf2+/+

Nrf2-/- m

igra

ting c

ells

n

um

ber

of

nu

mb

er o

f

cap

illa

ry-l

ike

stru

ctu

res

Tworzenie tubul w matriżelu

migracja proliferacja

Florczyk et al., Antiox Redox Signal, 2014

Nrf2

SDF-1 VEGF IL-8

HO-1

HO-1

Nrf2

waskularyzacja

Rola Nrf2 i HO-1 w angiogenezie

Brak HO-1 u człowieka

U dwóch znanych pacjentów pozbawionych HO-1:

* obecność wysoce oksydowanych lipoprotein niskiej gęstości (LDL)

we krwi

* bardzo duża wrażliwość komórek śródbłonka na uszkodzenia

Nasilające się reakcje zapalne i ciągły stres oksydacyjny

prowadzą do:

* poważnych uszkodzeń śródbłonka

* tworzenie nacieków tłuszczowych i blaszek miażdżycowych w

tętnicach

Taha et al. ATVB, 2010

Polimorfizm promotora HO-1

(GT)n

Exon 1

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

allele

fre

quency

number of GT repeats

S M L

W komórkach ludzkich synteza HO-1 jest zależna od polimorfizmu promotora. W promotorze

genu HMOX1 około 250 par zasad powyżej miejsca startu transkrypcji znajduje się bowiem

różna (od n = 11 do n = 40) liczba powtórzeń GT, wpływających na transkrypcję. Okazuje się,

że obecność dłuższych sekwencji powtórzeń GT (n ≥ 29) koreluje z niższą zawartością HO-1,

podczas gdy posiadanie allelu krótkiego, o n ≤ 23, wiąże się z wyższym poziomem HO-1

Polimorfizm promotora HO-1

Taha et al., ATVB 2010.

*

***

0

0.004

0.008

0.012

S M L

0

0.06

0.12

0.18

S M L

**

***

control

H2O2

0

0.2

0.4

0.6

S M L

CoPP

* **

0

0.4

0.8

1.2

1.6

S M Hem

e o

xygenase

-1 m

RN

A e

xpre

ssio

n (

HO

-1/E

F2)

15d-PGJ2

* **

L

H2O2 [uM]

control 100 200 400 800

***

*** *** ***

*** *** *

*

0

20

40

60

80

100

120

MT

T [

% o

f contr

ol]

S M L

*

0

5

10

15

20

25

S M L

GSH

: G

SSG

[nm

ol/

mg]

GSH : GSSG

żywotność

***

**

0

100

200

300

400 Brd

U r

educti

on [

% o

f contr

ol]

S M L control

Wpływ polimorfizmu HO-1 na proliferację śródbłonka

VEGF

Taha et al. ATVB 2010.

[ELISA]

IL-1b

#

#

*

*

0

50

100

150

200

250

S M L

IL-1

β [

pg/m

l]

Allele

#

#

Control

LPS

Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną

Taha et al. ATVB 2010.

cell proliferation

proinflammatory

cytokines production

oxidative stress resistance

number of GT repeats

HO-1 expression and activity

Polimorfizm promotora HO-1

Grochot-Przeczek et al. Clinical Science

Jazwa A et al., Cardiovasc Res, 2013

hind limb ischemia model femoral artery ligation

podwiązanie tętnicy udowej

Rewaskularyzacja: czy HO-1 jest istotna?

Choroba tętnic obwodowych (ang. PAD –

peripheral artery disease) – grupa chorób tętnic,

która doprowadza do zwężenia lub niedrożności

dużych tętnic. Zaburzenia krążenia w tych

naczyniach są najczęściej wynikiem miażdżycy,

ale mogą być też spowodowane stanem zapalnym,

wadą anatomiczną, zakrzepem lub zatorem.

Wspólnym mianownikiem patofizjologicznym tych

zaburzeń jest ostre lub przewlekłe niedokrwienie.

Rewaskularyzacja: HO-1 i cukrzyca

d0 d7 d28 0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

WT ctr

WT STZ

HET ctr

HET STZ

day after surgery

blo

od

per

fusi

on

[isc

hem

ic:n

on

-isc

hem

ic]

**

$

d0 d7 d28

WT ctr

WT STZ

HET ctr

HET STZ

day after surgery

WT ctr

WT STZ

HET ctr

HET STZ

*

**

* *

#

##

###

Brak HO-1 opóźnia gojenie ran

Grochot-Przeczek et al. PLoS One, 2009

CD31 staining

HO-1-/- HO-1+/+

injected

subcutaneously

injected

intraperitoneally

Grochot-Przeczek et al. PLoS One. 2009

Zahamowanie HO-1 opóźnia gojenie ran

Gojenie ran u myszy cukrzycowych

Days after wounding

0

20

40

60

80

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 13 15

Surf

ace o

f th

e w

ound [

%]

WT

db/db **

*** **

***

*** *** *** *** *** ***

***

Grochot-Przeczek et al. PLoS ONE, 2009

db/db WT

Day 1

Day 3

Day 8

Day 17

Day 0

Myszy cukrzycowe z nadekspresją HO-1

Grochot-Przeczek et al. PLoS One 2009

CD31

Days after wounding

Nu

mber

of

vess

els

per

surf

ace

[arb

itra

ry u

nit

s]

14

3 14 0

2

4

6

8

10

12

** AdGFP

AdHO-1 AdGFP AdHO-1

d0 d10

Zamykanie rany

hyperglycemia

chronic wounds

HO-1

oxidative stress

endothelial injury

poor vascularization

ROS generation

induction

inhibition

Loboda et al. ARS 2008

Oksygenaza hemowa-1

Skutki indukcji HO-1:

• Cytoprotekcja

(oporność na stres oksydacyjny)

• Immunomodulacja (zahamowanie zapalenia, regulacja

komórek Treg)

• Modulacja angiogenezy

heme

HGF

inflammatory

cytokines

oxidants hypoxia

irradiation

chemo-

therapy

after Otterbein et al. 2003

heme

HO-1/CO (?)

Proliferation of tumor cells

- Increased proliferation

- Immortality

Migration of tumor cells

Survival of tumor cells

- Increased resistance to ROS

- Decreased apoptosis

- Decreased autophagy

Invasion/metastasis

of tumor cells

Deregulated metabolism

- Tumor cells

- Endothelial cells

- Immune cells?

Immune evasion

- M1 M2 macrophage switch

- M2 suppressive macrophages

- Immunosuppressive Tregs

Angiogenesis

- Increased production of growth factors

- Increased response of endothelial cells

- Increased survival of endothelial cells

- Proangiogenic cells (M2 macrophages)

- Increased vasculogenesis

Inflammation

Cancer initiating (stem) cells

- Survival

- Immortality

- Impaired differentiation

(microRNAs?)

HO-1 i nowotwory

Loboda et al. Vascular Pharmacology 2015

HO-1 i regulacja apoptozy w nowotworach

Jozkowicz et al, Antioxid Redox Signal. 2007

HO-1 i regulacja angiogenezy w nowotworach

Jozkowicz et al, Antioxid Redox Signal. 2007

HO-1 i regulacja proliferacji w nowotworach

Jozkowicz et al, Antioxid Redox Signal. 2007

Jozkowicz et al, Antioxid Redox Signal. 2007

HO-1 i nowotwory

Was et al. Am J Pathol 2006, Was et al.

Nadekspresja HO-1 w czerniaku B16(F10)

mRNA

0

40

80

120

0 25 50 100 200 400 800

% o

f livin

g c

ells

H2O2 [mM]

HO-1

control

b-gal

* * *

*

żywotność

Komórki śródbłonka stymulowane mediami kondycjonowanymi

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

control

Pro

life

rati

on [

OD

] proliferacja *

H2O2

[50 mM]

*

#

ctr

HO-1

Day of experiment

0

20

40

60

80

10 20 30 40 50

Surv

ival ra

te [

%]

WT

HO-1

100

P=0.017

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach czerniaka

na przeżywalność myszy

0

20

40

60

80

0 1 2 3 weeks after injection

nu

mb

er o

f m

eta

sta

ses WT

HO-1

p=0.054

*

*

HO-1 zwiększa liczbę

przerzutów w płucach

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

*

*

Wpływ HO-1 na przerzutowanie czerniaka

Rola HO-1 w niedrobnokomórkowym raku płuca

Tertil et al., Free Radic Biol Med. 2015

Skrzypek et al., Antioxid Redox Signal. 2013

HO-1 może promować progresję nowotworów poprzez

zwiększanie ich proliferacji oraz obniżenie procesu

apoptozy, przez nasilanie angiogenezy oraz stymulujące

działanie na przerzutowanie komórek nowotworowych.

Efekt ten może być jednak zależny od typu nowotworu

(czasem obserwowane są odmienne efekty).

procarcinogen

carcinogen DETOXIFICATION

INITIATION

PROMOTION

normal

healthy cell

DNA damage

tumorigenesis

neutralization of

toxic substances

Cell division

and proliferation

PROGRESSION

Nrf2 Angiogenic signaling

Increased production of growth factors, VEGF or SDF-1α

Increased survival of endothelial cells

Survival of tumor cells

Increased resistance to ROS

Decreased apoptosis and/or

autophagy

Regulation of

microRNA expression

Increased cell proliferation

and cell migration

HO-1 pro-tumoral

effects HO-1

HO-1 HO-1

Loboda et al., CMBL 2016

PODSUMOWANIE

- HO-1 to cytoprotekcyjny enzym, chroniący przed działaniem ROS,

apoptozą, zapaleniem

- System biliwerdyna/bilirubina to sprawnie działające antyoksydanty

- CO odgrywa bardzo dużą rolę w biologii komórek śródbłonka,

zapobiegając ich dysfunkcji

- Dysfunkcja śródbłonka jest cechą charakterystyczną licznych chorób, w

tym cukrzycy

- Modulacja poziomu/ekspresji HO-1 może być terapią w zapobieganiu

dysfunkcji śródbłonka

Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej

Zapraszam na wykład 5