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Prácticas de Biotecnología

Salvador Camacho Garrido

P1. OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la obtención de proteínas a partir de

muestras naturales.

Fundamento: Las proteínas, debido al gran tamaño de sus moléculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas

soluciones pueden precipitar con formación de coágulos al ser calentadas a temperaturas superiores a los 70ºC o al ser tratadas con soluciones salinas, ácidos, alcohol, enzimas, plantas, sustancias caotrópicas, etc. La coagulación de las proteínas es un proceso irreversible y se debe a su desnaturalización por los agentes indicados, que al actuar sobre la proteína la desordenan por la destrucción de su estructura terciaria y cuaternaria. Otras técnicas alternativas a la coagulación son el intercambio iónico y la micro y ultrafiltración.

Material: - Mechero. - Tubos de ensayo. - Tubos de centrífuga. - Vasos de precipitados. - Pipetas de 10 mL. - Pipetas de Pasteur. - Espátula. - Placa calefactora. - Centrifugadora.

Reactivos: - Ácido acético.

Muestras: - Huevo. - Leche

Procedimientos:

• OBTENCIÓN DE OVOALBÚMINA. • OBTENCIÓN DEL SUERO LÁCTICO.

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OBTENCIÓN DE OVOALBÚMINA:

1. De un huevo de gallina separa la yema y

preserva la clara1.

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2. Añade agua destilada y agita hasta que aún quede una mezcla espesa.

3. Coloca en un tubo de ensayo una pequeña cantidad de clara de huevo.

4. Añadir 5 gotas de ácido acético y calentar el tubo a la llama del mechero2.

5. Agita hasta obtener una disolución homogénea. Caso de que existan flóculos, eliminarlos mediante centrifugación a 4000 rpm durante 5 min. Con ello se obtiene una disolución de aprox. 5 mg/ml de proteína3.

6. Preserva tanto las aguas madres como el centrifugado a temperatura de refrigeración en sendos tubos de ensayo.

OBTENCIÓN DEL SUERO LÁCTICO: 1. Toma unos 10 ml de leche. 2. Calienta al baño maría. 3. Añade 1 ml de ácido acético. 4. Agitando continuamente. Se forma un

precipitado que contiene la caseína4 y la grasa quedando en disolución5, los glúcidos, las sales y las proteínas solubles6.

5. Centrifuga. 6. Preserva tanto las aguas madres como el

centrifugado a temperatura de refrigeración en sendos tubos de ensayo.

1 De esa cantidad, el 10% aprox. es ovoalbúmina, la proteína mas abundante en la clara. 2 De forma alternativa, de una clara de huevo de gallina, toma entre 1-2 g con la ayuda de una espátula o una pipeta Pasteur. Diluye 20 veces con tampón fosfato. 3 Caso de suministrar una disolución de albúmina de 5 mg/ml, no es necesario realizar la extracción. 4 Fosfoprotéina insoluble. 5 Se denomina suero lácteo. 6 Lactoalbúmina e inmunoglobulinas.



P2. RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinación cualitativa de aminoácidos,

péptidos y proteínas a partir de muestras naturales.

Fundamento: Los aminoácidos pueden detectarse con reactivos que reaccionen con sus grupos característicos, el carboxilo, el amino u otros de la cadena lateral. Aunque el número de ensayos es muy grande, uno de los más utilizados es la detección con ninhidrina, que produce un color púrpura que en algunos casos puede ser rosa o rojizo. Si partimos de proteínas debemos hidrolizarla. La hidrólisis puede ser ácida (HCl 6N/90ºC/18 h), básica y enzimática. La reacción del Biuret la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del enlace peptídico (-CO-NH-) que se destruye al liberarse los aminoácidos. Cuando una proteína se pone en contacto con un álcali concentrado, se forma una sustancia compleja denominada biuret, que en contacto con una solución de sulfato cúprico diluida, da una coloración violeta característica.

La reacción xantoprotéica es debida a la formación de un compuesto aromático nitrado de color amarillo, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos aromáticos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro. Por otro lado se pone de manifiesto el azufre de los aminoácidos por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo, cuando se separa mediante un álcali, y se hace reaccionar con una solución de acetato de plomo para formar sulfuro de plomo

Material: - Mechero. - Tubos de ensayo. - Tubos de centrífuga. - Vasos de precipitados. - Pipetas de 10 mL. - Espátula. - Placa calefactora. - Cuentagotas.

Reactivos: - Ninihidrina (1 mg/ml). - Alanina (0,1 % en agua acidulada) - Etanol. - Hidróxido sódico al 20 %. - Hidróxido sódico al 40 %. - Sulfato de cobre al 1 %. - Ácido nítrico. - Acetato de plomo al 5 %

Procedimientos: • PREPARACIÓN DE NINHIDRINA. • ENSAYO CON NINHIDRINA. • REACCIÓN DEL BIURET. • REACCIÓN XANTOPROTÉICA, • REACCIÓN DE AZUFRADOS.

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PREPARACIÓN DE NINHIDRINA:

1. Pesa 100 mg de ninhidrina. 2. Disolver en 10 ml. de etanol a 95%. 3. Completar a 100 ml con agua destilada.

ENSAYO CON NINHIDRINA:

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1. Rotula cuatro tubos de ensayo identificando cada uno como: blanco, alanina, albúmina de huevo y suero láctico.

2. A cada uno de los tubos de ensayo agrega 1 mL. de las respectivas sustancias que indica el rótulo usando agua destilada para el tubo marcado como blanco.

3. Adiciona a cada tubo 1 mL. de reactivo de ninhidrina.

4. Calienta en baño de agua a ebullición por 10 min.

5. Observa los colores desarrollados y anote los resultados.

REACCIÓN DEL BIURET:

1. Procede como en los puntos 1 y 2 del anterior apartado.

2. Añadir 2cc. de solución de hidróxido sódico al 20% en cada tubo.

3. A continuación 4 ó 5 gotas de solución de sulfato cúprico diluida al 1%7.

4. Observa los colores desarrollados y anote los resultados.

REACCIÓN XANTOPROTÉICA:


2. Añade 1 ml de HNO3 concentrado en cada tubo.

3. Calienta al baño maría a 100º C. 4. Enfría en agua fría. 5. Añade gota a gota una disolución de sosa al

40 % hasta alcalinización. 6. Observa los colores desarrollados y anote

los resultados. REACCIÓN DE AZUFRADOS:


2. Añade 2 ml. de sosa al 20%. 3. Añade 10 gotas de solución de acetato de

plomo al 5%8.

7 Debe aparecer una coloración violeta-rosácea característica. 8 Si se forma un precipitado de color negruzco nos indica que se ha formado sulfuro de plomo, utilizándose el azufre de los aminoácidos, lo que nos

4. Calentar el tubo hasta ebullición. 5. Observa los colores desarrollados y anote los

resultados.

sirve para identificar proteínas que tienen en su composición aminoácidos con azufre.



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P3. DETERMINACIÓN DE ENZIMAS.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinación de enzimas a partir de

muestras naturales.

Fundamento: La catalasa es una enzima que se encuentra en las células de los tejidos animales y vegetales. La función de esta enzima en los tejidos es necesaria porque durante el metabolimo celular, se forma una molécula tóxica que es el peróxido de hidrógeno, H2O2 (agua oxigenada) que es necesario eliminar. Ya que la catalasa químicamente es una proteína, podemos desnaturalizarla al someterla a altas temperaturas. Al desnaturalizarse, perderá también la función y como consecuencia su función catalítica, por lo que no podrá descomponer el agua oxigenada. Por otro lado, otra enzima, la amilasa o ptialina, presente en la saliva, actúa sobre el polisacárido almidón, hidrolizando el enlace O-glicosídico, por lo que el almidón se terminará por transformar en unidades de glucosa. La presencia de almidón puede ser puesta de manifiesto mediante lugol (solución yodo-yodurada), mientras que la glucosa (azúcar reductor), puede ser puesta de manifiesto mediante la reacción de Fehling.

Material: - Mechero. - Tubos de ensayo. - Baño de agua. - Pipetas. - Cuentagotas. - Espátula. - Placa calefactora. - Centrifugadora.

Reactivos: - Fehling A. - Fehling B. - Lugol. - Almidón soluble. - Peróxido de hidrógeno.

Muestras: - Hígado de res. - Saliva.

Procedimientos:

• OBTENCIÓN DE α-AMILASA. • DETECCIÓN DE α-AMILASA. • DETECCIÓN DE CATALASA.



OBTENCIÓN DE α-AMILASA: 1. Se prepara un tubo de ensayo limpio sobre

el que se coloca un embudo con un filtro de papel.

2. Este filtro se humedece con suero fisiológico hasta aparición de alguna gota de filtrado en el tubo de ensayo de recogida.

3. Activar en lo posible la secreción de saliva y depositar sobre el embudo un poco de saliva escupiendo suavemente.

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4. Para facilitar la filtración y fluidificación de dicha saliva, añadir 12 ml de suero fisiológico en el embudo y esperar que el volumen de filtrado sea de unos 10 ml sobre el tubo de ensayo9.

DETECCIÓN DE α-AMILASA:

1. Pon en una gradilla cuatro tubos de ensayo, numerados del 1 al 4.

2. Añade en cada tubo 5 mililitros de una solución diluida de almidón (0,5 %).

3. A los tubos 3 y 4 añadir 1 ml de la solución de amilasa obtenida de la saliva.

4. En el tubo 1, haz la reacción de Fehling10. 5. En el tubo 2, realiza la Reacción de

Lugol11. 6. Los tubos 3 y 4 que contienen el almidón,

al que le hemos echado la saliva, ponerlos al baño María, a unos 37º C.

7. Dejarlo unos 15 minutos. 8. A continuación en el tubo número 3,

realizar la Reacción de Fehling y en el tubo número 4, realizar la Prueba del Lugol.

9. Anota los resultados obtenidos. 10. Explica dichos resultados. DETECCIÓN DE LA CATALASA:

1. Colocar en un tubo de ensayo unos trocitos de hígado.

2. Añadir 5 mililitros de agua oxigenada de 10 volúmenes12.

3. Observa y anota el resultado

9 Puede utilizarse α-amilasa 0.2 mg/ml. 10 A 5 ml de la solución de azúcar agregarle 10 gotas de reactivo de Fehling A (7 g de sulfato cúprico monohidrato en 100 ml de agua destilada)y 10 gotas de Fehling B (35 g de tartrato de sodio y 10 g de hidróxido de sodio en 100 ml de agua destilada), calentar a ebullición por 1 minuto. Positivo: precipitado naranja a rojo. 11 En un tubo de ensayo unos 5 ml del glúcido a investigar, añadir unas gotas de lugol (solución de I2 al 1% en equilibrio con KI al 2% en agua destilada). Si la disolución del tubo de ensayo se torna de color azul-violeta, la reacción es positiva. 12 Preferiblemente recientemente preparada.

4. Colocar en un tubo de ensayo varios trocitos de hígado.

5. Añadir agua para hervir la muestra. Hervir durante unos minutos.

6. Después de este tiempo, retirar el agua sobrante. 7. Añadir el agua oxigenada. 8. Observar y anota el resultado. 9. Interpreta la diferencia.



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P4. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE UNA PROTEÍNA.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinación del punto isoeléctrico (PI)

de proteínas a partir de muestras naturales.

Fundamento: La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico) y representa del 77% - 82% de las proteínas y el 2,7% en composición de la leche líquida. Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos. Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina estarían protonados (-NH3

+). De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (-COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (-NH2). De lo anterior se deduce que las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le denomina punto isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación. Esta medida de la agregación puede visualizarse por espectrofotometría de absorción a 640 nm.

Material: - Vasos de precipitados. - Pipetas. - Probeta. - Matraces aforados. - Embudo de vidrio. - Papel de filtro. - Termómetro. - Placa calefactora. - pH-métro. - Espectrofotômetro V. - Cubetas de 1 cm de paso.

Reactivos: - Ácido acético. - Acetato sódico. - Hidróxido sódico. - Éter etílico. - Etanol (70%). - Soluciones tampón (calibrado pH-métro).

Muestra: - Leche de vaca entera.

Procedimientos: • AISLAMIENTO DE LA CASEÍNA. • PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE CASEÍNA. • PREPARACIÓN DE TAMPONES Y MEDIDA DEL pH. • DETERMINACIÓN DEL PI.



AISLAMIENTO DE LA CASEÍNA:

1. Calienta en un vaso de precipitado 150 ml de agua destilada a 38ºC.

2. Añade 50ml de leche. 3. Luego gota a gota y con agitación, adiciona

ácido acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se corta).

4. Deja sedimentar. 5. Filtra sobre papel.

8

6. Lava el precipitado con 20ml de etanol en el mismo filtro.

7. Seca el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.

8. Coloca el precipitado en un vaso pequeño y previamente tarado.

9. Pesa el vaso con el precipitado. 10. Adicione 5 ml/g de éter etílico. 11. Filtra nuevamente. 12. Desecha el líquido quedando un precipitado

blanco de fácil manipulación que es la caseína.

DISOLUCIÓN DE LA CASEÍNA: 1. Pesa aproximadamente 0,2500 g de caseína

en un vaso de 50 ml. 2. Agrega 20ml de agua destilada y 5 ml de

NaOH 1N. 3. Agita hasta lograr una solución total de la

caseína. 4. Aforada a 50 ml, con 5 ml de ácido acético

1N y agua destilada13. PREPARACIÓN DE TAMPONES Y MEDIDA DEL pH:

5. Se debe preparar disoluciones de tampón de ácido acético / acetato sódico, que cubran un rango de pH suficiente para la caseína14.

6. Calibra el pH-métro. 7. Mide el valor del pH de cada tampón. DETERMINACIÓN DEL PI:

1. Añade 1 ml de disolución de caseína a cada tubo.

2. Agita suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.

3. Mide la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetría de 1 cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de cada tubo para obtener una solución/suspensión

13 La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar. 14 De 3,0 a 6,5 mínimo. .

homogénea antes de verter una parte en la cubeta.

4. Anota los resultados. 5. Representa la absorbancia frente al pH. 6. Determina el pI aproximado de la caseína15.

Electroforetrograma de la leche

Estructura micelar de la caseína

15 Su punto isoeléctrico promedio es de 4,6.

http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Miscela.png



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P5. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE AMINOÁCIDOS.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la separación cromatográfica e

identificación de aminoácidos a partir de mezclas de los mismos.

Fundamento: La cromatografía es una técnica muy empleada para separar e identificar los componentes de una mezcla. La separación se basa en la diferente interacción de cualquier soluto con dos fases, una conocida como fase estacionaria, generalmente sólida, y otra denominada fase móvil, que puede ser líquida o gaseosa. Debido a procesos como adsorción en la fase sólida, solubilización y arrastre por la fase móvil etc., cada soluto se distribuye entre las dos fases con un coeficiente de reparto característico. Este coeficiente depende de la naturaleza de las fases y de los solutos, o componentes de la mezcla a separar. La cromatografía en capa fina (TLC) es una de las más sencillas. Se denomina así porque la fase estacionaria es una capa fina de una sustancia hidrofílica (sílice, alúmina o acetato de celulosa) colocada sobre un soporte inerte. La fase móvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones que migra por la fase estacionaria en base a capilaridad dentro de una cubeta cerrada y que se encuentra saturada de vapor de la fase móvil. En este tipo de cromatografía se utiliza un parámetro relacionado con el coeficiente de reparto, que se denomina Rf. Se define como la relación entre la distancia recorrida por la sustancia y la distancia recorrida por la fase móvil. En el caso de esta práctica, es directamente proporcional con la solubilidad de la sustancia en la fase móvil. Sus valores oscilan entre 0, para las sustancias insolubles, y 1 para las sustancias muy solubles en la fase móvil y que no interacciona con la fase estacionaria. En esta práctica, la cromatografía en capa fina se utiliza para separar e identificar aminoácidos. Estos se revelarán en la placa mediante reacción con ninhidrina.

Material: - Cubeta cromatográfica. - Vasos de precipitados. - Pipetas. - Matraces aforados. - Capilares.

Reactivos: - Ninhidrina. - n-propanol. - Hidróxido amónico. - Etanol. - Aminoácidos.

Muestras: - Mezcla de aminoácidos.

Procedimientos:

• PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES. • PREPARACIÓN DE LA PLACA. • DESARROLLO. • REVELADO E IDENTIFICACIÓN.



PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES:

Prepara la cantidad necesaria, de las disoluciones a utilizar, disolución de patrones y mezcla problema, eluyente (en dos etapas) y solución reveladora16.

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PREPARACIÓN DE LA PLACA:

1. Sobre una placa de silicagel de 10 x 10 cm

se traza con un lápiz una recta paralela a uno de los bordes y a una distancia de éste de 2 cm17.

2. Sobre esta línea se pone n+1 puntos equidistantes entre si y sobre los bordes18.

3. En cada punto (identificados con el nombre de cada uno de los aminoácidos) se aplicarán tres gotas de la solución de aminoácidos y solución problema (un aminoácido en cada punto y en el último la solución problema). Se utiliza un capilar para aplicar la muestra gota a gota (hacerlo con mucho cuidado). Se seca con un secador de pelo después de haber aplicado cada gota.

4. Se marca con lápiz, y en el extremo opuesto de la placa, algún indicativo del grupo que realiza la cromatografía.

DESARROLLO:

1. Se añade al tanque cromatográfico eluyente

hasta una altura aproximada de 1 cm y sin que éste alcance la zona de aplicación de las muestras.

2. Se mete la placa en el tanque, se tapa. 3. se deja desarrollar la cromatografía hasta

que el eluyente alcance el borde superior, (1-2 h aproximadamente)19.

16 Solución reveladora (se prepara el día de uso). 17 No hay que tocar la parte del silica gel de la placa con las manos, ya que la contaminaríamos con aminoácidos procedentes de nuestras manos. No utilizar nunca bolígrafo ni rotulador. No horadar la placa cuando la marquéis. 18 Donde n es el número de patrones a utilizar.

19 Sin llegar a sobrepasarlo.



REVELADO E IDENTIFICACIÓN:

1. Terminada la cromatografía se saca la

placa. 2. Se marca la distancia recorrida por el

eluyente. 3. Se seca dentro de la campana de gases con

la ayuda de un secador de aire20. 4. Se rocía con un pulverizador que contiene

la solución reveladora (en la campana de gases).

5. Mide las distancias necesarias para calcular el valor del Rf de cada uno de los componentes de la mezcla, y de los patrones usados.

6. Identifica los componentes de la mezcla.

20 La placa se secará haciéndole llegar aire caliente con el secador.

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P6. SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la separación electroforética de proteínas a

partir de muestras naturales.

Fundamento: La electroforesis es una técnica basada en los movimientos de moléculas cargadas en un campo eléctrico, cada molécula se mueve hacia el electrodo de carga opuesta (cátodo y ánodo), este movimiento denominado “electroforesis” da nombre a la técnica. La electroforesis se aplica en el campo de la Bioquímica a la separación de compuestos que poseen grupos ionizables (aminoácidos, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos) teniendo en cuenta que la carga neta de estas sustancias depende del pH del medio en que se encuentren. Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente - COO- y -NH3

+) pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. Además de sobre papel y en gel se puede utilizar como soporte tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Las proteínas de suero se pueden separar mediante esta técnica. Sus puntos isoeléctricos están entre 4,9 (Albúmina) y 7,4 (Gamma-globulinas). Al realizar la electroforesis con un tampón de pH = 8,6, todas las proteínas del suero tendrán carga negativa.

Material: - Tiras de acetato de celulosa. - Cubeta electroforética. - Fuente de alimentación de electroforesis. - Matraces aforados. - Balanza analítica. - Pinzas. - Aplicador. - Rodillo. - Papel de filtro.

Reactivos: - Tris base [tris(hidroximetil)aminometano]. - Glicina. - Negro amido. - Ácido acético. - Metanol.

Muestra: - Plasma (de rata o humano).

Procedimientos: • PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES. • PREPARACIÓN DEL SOPORTE. • ELECTROFORESIS. • REVELADO. • MEDIDA.



PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES: 2. Realizar el cálculo del porcentaje de las proteínas del plasma el programa informático “scion image”. Tampón:

Tris 0,025 M, glicina 0.192 M pH=8,6 3. Calcular los porcentajes relativos de las proteínas contenidas en suero, a partir del escaneado.

Solución de tinción:

4. Dibujar el patrón de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de proteínas séricas, indicando la posición de ánodo y cátodo así como el punto de aplicación de la muestra.

0.5% (p/v) negro amido en metanol 45% (v/v) + ácido acético10% (v/v) Solución de distinción:

5. Identificar las proteínas que corresponden a cada banda y justificar el orden.

Metanol 45% (v/v) + ácido acético 10% (v/v)

PREPARACIÓN DEL SOPORTE:

1. Humedecer en tampón las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su uso, para su equilibrado.

2. Eliminar el exceso de tampón poniendo las tiras entre dos hojas de papel de filtro, con cuidado de que no lleguen a secarse por completo.

3. Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie penetrable quede hacia la parte superior21.

ELECTROFORESIS:

1. Depositar con ayuda del aplicador dos muestras de suero en cada tira, en el extremo próximo al cátodo.

2. Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 200 voltios.

3. Mantén durante 60 minutos. REVELADO:

1. Finalizada la separación, depositar las tiras en una cubeta con solución de tinción, de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10 minutos.

2. Lavar las tiras en solución de destinción hasta que se observen bien las bandas de proteína (azules) sobre un fondo blanco.

3. Limpiar las tiras en agua del grifo durante unos segundos.

4. Colocar las tiras entre 2 láminas de transparentes, eliminando las burbujas con un rodillo.

MEDIDA:

1. Escanear las bandas obtenidas por electroforesis.

14

21 El lado penetrable es el que se ve cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha.



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P7. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la determinación cuantitativa de proteínas a

partir de muestras naturales.

Fundamento: Las proteínas pueden medirse por espectrofotemtría de absorción UV a 280 nm. No obstante es mucho más sensible usar reacciones de coloración. Las proteínas pueden determinarse mediante espectrofotometría visible, haciéndolas reaccionar con reactivos que den de forma cuantitativa productos coloreados, utilizando la interpolación en una curva de calibrado. Los procedimientos a utilizar varían en función del método de coloración y de eliminación de interferencias, pudiendo citarse como los más utilizados los métodos de Bradford, Lowry, Lowry HEPES y Lowry TCA. Se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y líquidos orgánicos como el metanol. El método de Bradford utiliza, como colorante azul de Coomassie G250, patrón de proteína la γ-globulina bobina o seroalbúmina bovina (BSA) y mide la absorbancia a 595 nm.

Material: - Vasos de precipitados. - Pipetas. - Espátula. - Matraces aforados. - Balanza analítica. - Espectrofotómetro V. - Cubetas de 1 cm de paso. - Cuentagotas. - Papel de filtro de alta calidad.

Reactivos: - Azul de Coomassie G250. - Albúmina de suero bovino (BSA). - Etanol. - Ácido fosfórico.

Muestra: - Leche de vaca desnatada.

Procedimientos: • PREPARACIÓN DEL REACTIVO DE BRADFORD. • PREPARACIÓNDE LA SOLUCIÓN PATRÓN MADRE DE BSA. • PREPARACIÓN DE PATRONES. • PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES PROBLEMAS. • REACCIÓN DE COLORACIÓN. • MEDIDA.



PREPARACIÓN DEL REACTIVO BRADFORD:

3. Calcula para cada dilución de la muestra su concentración.

4. Teniendo en cuenta los volúmenes utilizados en cada caso, calcula el contenido protéico de la leche.

1. Pesa 100 mg de azul de Coomassie G250 en 50 ml de etanol del 95%22.

2. La solución después se mezcla con 100 ml de ácido fosfórico del 85%. 5. Obtén el valor medio de la leche expresado en g

de proteínas por cada 100 mL de leche. 3. Llevar a 1 L con agua destilada. 6. Calcula la absortividad del complejo coloreado para el BSA27. 4. El reactivo se debe filtrar a través del papel

de filtro de Whatman Nº 1 y después guarda en una botella ámbar a temperatura ambiente23.

Reactivo de Bradford

PREPARCIÓN DEL PATRÓN DE ALBÚMINA:

Disolver 100 mg de albúmina bovina en 100 ml de agua destilada24. Disoluciones patrones PREPARACIÓN DE PATRONES DE LA CURVA DE CALIBRADO:

Se debe preparar disoluciones que contengan de 0 (blanco) a 60 μg/ml en agua destilada a un volumen final de 25 ml25.

Disoluciones de la muestra

PREPARACIÓN DE LAS DISOLUCIONES PROBLEMAS:

1. Hacer una dilución 1:20 de la leche comercial. Curva de calibrado

2. A continuación realizar tres diluciones diferentes 5:100, 7:100 y 10:100 para un volumen final de 100 ml26.

Curva de calibración Bradford Std.

00,046

0,082

0,172

0,333

y = 0,0168xR2 = 0,9873

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

0 5 10 15 20 25Masa de proteína [ug]

Abso

rba

ncia

.

REACCIÓN DE COLORACIÓN:

1. Tanto a las disoluciones patrones como a las diluciones problemas se le debe añadir colorante en la proporción 1:10.

2. Agita y deja reposar. MEDIDA:

1. Mide las absorbancias de todas las disoluciones coloreadas frente al blanco a 595 nm.

16

2. Realiza la recta de calibrado, preferentemente por regresión lineal.

22 No confundir el Coomasie G-250 con el Coomasie R-250. 23 Es estable por varias semanas. Sin embargo, durante este tiempo el colorante puede precipitar de la solución y así por tanto el reactivo guardado se debe filtrar antes de uso. 24 Con lo que tenemos una disolución madre con una concentración de 1 mg/ml. En general se suele comprar como patrón.

25 El método propone a volumen final de 300 μl. 26 El método propone a volumen final de 300 μl. 27 la albúmina del suero vacuno es 0,66.



P8. EXTRACCIÓN DE ADN.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la obtención de ADN a partir de muestras

naturales.

Fundamento: La extracción de ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisar (romper) las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos moleculares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN, de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas, y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol isoamílico, probablemente el único reactivo de esta práctica que no suele haber en una cocina.

EXTRACCIÓN

Material: - Mortero de vidrio. - Probeta. - Vasos de precipitados. - Pipetas. - Varilla de vidrio. - Filtro de tela.

Reactivos: - Dodecil sulfato sódico (SDS). - Cloruro de sodio. - Alcohol de 96º. - Alcohol isoamílico. - Azul de metileno.

Muestras: - Higadito de pollo.

Procedimientos:

• SEPARACIÓN DE NUCLEOS. • SEPARACIÓNDE CROMATINA. • ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS. • EXTRACCIÓN DE ADN.

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SEPARACIÓN DE NÚCLEOS:

1. Triturar medio higadito de pollo en un mortero.

2. Añadir arena para que al triturar se puedan romper las membranas de y queden los núcleos sueltos.

3. Añadir al triturado, 50 ml de agua. 4. Remover hasta hacer una especie de papilla

o puré. 5. Filtrar varias veces sobre una tela para

separar los restos de tejidos que hayan quedado por romper.

SEPARACIÓN DE CROMATINA: 1. Medir el volumen del filtrado con una

probeta. 2. Añadir al filtrado un volumen igual de

cloruro sódico 2M28.

ELIMINACIÓN DE PROTEÍNAS: A continuación se añade 1 ml de SDS29. EXTRACCIÓN DE ADN:

1. Añadir mediante una pipeta 50 ml de alcohol de 96º30. Hay que hacerlo de forma que el alcohol resbale por las paredes del vaso y se formen dos capas.

2. En la interfase, precipita el ADN. 3. Introducir una varilla de vidrio e ir

removiendo en la misma dirección. Sobre la varilla se van adhiriendo unas fibras blancas, visibles a simple vista, que son el resultado de la agrupación de muchas fibras de ADN.

4. observa con lupa binocular y si tienes tiempo tiñe con un colorante básico31 y observa al microscopio.

Si queremos usar DNA de mayor pureza, por ejemplo para su cuantificación, se debe purificar o reextraer usando fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) otra vez.

El envase con el DNA se debe almacenar, en caso necesario, en un refrigerador 4°C.

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28 Con ello conseguimos producir el estallido de los núcleos para que queden libres las fibras de cromatina. 29 Si no se dispone de este producto puede sustituirse por un detergente de vajillas, tipo Mistol o similar. La acción de este detergente es formar un complejo con las proteínas y separarlas del ADN. Así nos quedará el ADN libre de las proteínas que tiene asociadas.

30 Mejor alcohol isoamílico a 0 ºC. 31 Por ejemplo hematoxilina (Hematoxilina de Mayer 10-15 min. y lavar bajo flujo de agua corriente hasta azulear), o azul de metileno.



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P9. ELECTROFORESIS DE ADN.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la electroforesis de ADN a partir de muestras

naturales.

Fundamento: La electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de moléculas de ácidos nucleicos. Los materiales más comunes para separar moléculas de ácidos nucleicos son polímeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de electroforesis, sumergidos en un tampón de pH alrededor de 8. De esta forma, las moléculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarán al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen carga negativa. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso de los geles de agarosa, se le añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.

Material: - Micropipetas. - Matraz aforado. - Erlenmeyer. - Placa calefactora. - Equipo de electroforesis. - Transluminador UV. - Cámara fotográfica sensible.

Reactivos: - Tris base, [tris(hidroximetil)aminometano]. - EDTA (sal disódica). - Ácido bórico. - Agarosa. - Bromuro de etidio.

Muestras: - Extracto De ADN (P8 u otro).

Procedimientos: • PREPARACIÓN TAMPON TRIS BÓRICO EDTA • PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA • PREPARACIÓN DEL ADN • ELECTROFORESIS



PREPARACIÓN DEL TAMPÓN TBE: Prepara un litro de tampón TBE (Tris borato a pH

8). Tampón

PREPARACIÓN DEL GEL DE AGAROSA:

1. Se vierten en un matraz 30 ml del tampón de electroforesis TBE y 0,21 g de agarosa (0,7 %).

2. Se funde la solución de agarosa en un microondas o placa calefactora.

Visualización 3. Se deja enfriar la suspensión hasta que

alcance unos 50ºC aproximadamente. 4. Se sella con cinta adhesiva el soporte donde

se va a verter el gel de agarosa y se coloca el peine que servirá para formar los pocillos del gel.

5. Una vez que la solución de agarosa ha alcanzado los 50ºC, se le añaden 2 μL de bromuro de etidio (10 mg/ml) y se mezcla bien. ¡¡¡PONEROS GUANTES!!!32 6. Se vierte la solución de agarosa con bromuro de etidio en el soporte, previamente sellado. Se deja polimerizar durante unos 30 minutos.

Nota: Si se dispone de más de un marcador se puede utilizar para el cálculo del peso molecular de los fragmentos de ADN según la gráfica: PREPARACIÓN DEL ADN:

Se toman 20 μl del DNA aislado y purificado y se le añaden 5 μl de tampón de carga. ELECTROFORESIS:

1. Se quita la cinta adhesiva con la que se ha sellado el soporte del gel y se coloca en la cubeta de electroforesis33.

2. Se añade tampón de electroforesis TBE, de forma que cubra bien el gel de agarosa.

3. Se aplican 10 μl de la muestra preparada en el apartado anterior en dos de los pocillos.

4. Se aplican 10 μl de marcadores de peso molecular en dos de los pocillos34.

5. Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente de alimentación. Se comprueba que está bien conectada.

6. Se programa la fuente a unos 100 voltios y se comienza a correr la electroforesis que durará unos 30-45 minutos.

7. Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen.

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32 El bromuro de etidio agente intercalante y alquilante es un conocido carcinogénico, por lo que es obligado el uso de guantes y de la vitrina extractora. 33 ¡¡OJO!!: Los pocillos deben de estar cerca del cátodo (polo negativo, color negro). 34 Si se poseen.



P10. CUANTIFICACIÓN DE ADN.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la cuntificación de ADN a partir de muestras

naturales.

Fundamento: Para la cuantificación del ADN, existen dos métodos indirectos que permiten estimar la concentración del ADN en las muestras, por visualización y mediante espectrofotómetro. El método indirecto más recomendable para la determinación de la concentración de ADN en una muestra es mediante la visualización de un gel de electroforesis en el cual se colocan muestras con concentraciones conocidas. No obstante se puede efectuar una estimación mediante espectrofotometría UV. La longitud de onda de máxima absorción es de 260 nm, pero desgraciadamente a esa longitud de onda también absorben las proteínas que pudieran impurificar la muestra, por lo que se recurre a medir las absorbancias a 260 nm y 280 nm. Para determinar pureza, se utiliza la razón de ADN/proteínas. Un buen ADN (calidad y pureza) es aquel cuyo A260/A280 es de 1.7 a 2.0. La abundancia de proteínas residuales en el extracto se determina midiendo absorbancia a 260 nm:

μg/ml de ADN = (Abs260 X Factor Dilución X 50 μg ADN/ml)

Material: - Vasos de precipitados. - Pipetas. - Matraz aforado. - Agitador magnético. - Espectrofotómetro UV. - Cubetas de cuarzo de 1 cm de paso.

Reactivos: - Tris base, [tris(hidroximetil)aminometano]. - EDTA (sal disódica). - Ácido clorhídrico. - Sucrosa. - Fenol. - Cloroformo. - Isopropanol.

Muestras: - Extracto De ADN (P8 u otro).

Procedimientos: • PREPARACIÓN TAMPON TRIS EDTA SUCROSA • PURIFICACIÓN DE ADN • .DILUCCIÓN DE ADN • MEDIDA DE ADN

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PREPARACIÓN TAMPÓN TE-SUCROSA35:

• μg ADN/ml ó g = (Abs260 X 20 X 50 μg ADN/ml)/(volumen muestra [ml o g])

1. Pesa 1,21 g de Tris base, [tris(hidroximetil)aminometano] en un vaso de precipitados de 1 l.

2. Disuelve con ayuda de agitador magnético. 3. Ajusta el valor del pH hasta

aproximadamente 8 con ácido clorhídrico36. 4. Añade 0,29 g de EDTA (sal disódica

anhidra) y disuelve. 5. Añade 250 g de sucrosa37 y disuelve. 6. Afora a 1 L con agua destilada.

PURIFICACIÓN DE ADN38: 1. Suspende el ADN bruto obtenido en la

práctica anterior en agua. 2. Añade un volumen igual de fenol /

cloroformo / alcohol isoamílico (25:24:1)39. 3. Centrifuga. 4. Elimina el sobrenadante totalmente. 5. Suspende en agua. 6. Incuba a 65 ºC durante 5 minutos. 7. Conserva a temperatura de refrigeración. DILUCIÓN DE ADN: Prepara una disolución 1:20 del ADN purificado con TE-Sucrosa. MEDIDA DE ADN:

1. Llena una cubeta de cuarzo con la disolución de ADN en TE-Sucrosa.

2. Llena otra con solución de TE-Sucrosa. 3. Mide las absorbancias a 260 y 280 nm de la

primera cubeta utilizando como blanco la segunda.

4. Anota los resultados:

5. Calcula la concentración de ADN. En la

muestra original. 6. Estima la cantidad total de ADN referida a

la muestra. • μg/ml de ADN =

(Abs260 X Factor Dilución X 50 μg ADN/ml40)

35 Solución de TE-sucrosa (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8, 25% sucrosa). 36 Se necesitan aproximadamente unos 42 ml. 37 También denominada sacarosa o dextrosa. 38 Como alternativa puede usarse algún protocolo de extracción total de ADN. 39 Como alternativa puede usarse isopropanol absoluto a -20 ºC.

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40 50 mg ADN/ml es un factor de conversión.



P11. DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO Y COMPATIBILIDAD.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicación de las técnicas inmunológicas

para diferentes determinaciones a partir de muestras naturales.

Fundamento: Un grupo sanguíneo es una forma de agrupar ciertas características de la sangre que dependen de los antígenos presentes en la superficie de los glóbulos rojos y en el suero de la sangre. Las dos clasificaciones más importantes para describir grupos sanguíneos en humanos son los antígenos y el factor Rh. Las personas con sangre del tipo A tienen glóbulos rojos que expresan antígenos de tipo A en su superficie y anticuerpos contra los antígenos B en el suero de su sangre. Las personas con sangre del tipo B tienen la combinación contraria, glóbulos rojos con antígenos de tipo B en su superficie y anticuerpos contra los antígenos A en el suero de su sangre. Los individuos con sangre del tipo O ó 0 (cero) no expresan ninguno de los dos antígenos (A o B) en la superficie de sus glóbulos rojos pero tienen anticuerpos contra ambos tipos, mientras que las personas con tipo AB expresan ambos antígenos en su superficie y no fabrican ninguno de los dos anticuerpos. A causa de estas combinaciones, el tipo 0 puede ser transfundido sin ningún problema a cualquier persona con cualquier tipo AB0 y el tipo AB puede recibir de cualquier tipo AB0. En 1940, el Dr. Landsteiner descubrió otro grupo de antígenos que se denominaron factores M. Rhesus (factores Rh), porque fueron descubiertos durante unos experimentos con monos Rhesus. Las personas con factores Rhesus en su sangre se clasifican como Rh positivas; mientras que aquellas sin los factores se clasifican Rh negativas. Las personas Rh negativas forman anticuerpos contra el factor Rh, si están expuestas a sangre Rh positiva. El Factor Rh es una proteína integral de la membrana aglutinógena que está presente en todas las células. Un 85% de la población tiene en esa proteína una estructura dominante, que corresponde a una determinada secuencia de aminoácidos que en lenguaje común son denominados habitualmente Rh+. Rh- es tener la misma proteína pero con modificaciones en ciertos aminoácidos que determinan diferencias significativas en la superficie de los glóbulos rojos, y hacen a los humanos Rh- disponer de anticuerpos (aglutininas) en el plasma que reaccionan con los glóbulos rojos Rh+. La determinación más simple del sistema ABO (+, -) es utilizar la técnica de hemoaglutinación, que puede hacerse tanto en placa como en tubo, y consisten en poner en contacto la sangre (o una dilución de la misma) en contacto con antisueros A, B, AB (o mezcla A +B), y D y observar si existe o no aglutinación.

Las transfusiones de sangre entre grupos incompatibles pueden provocar una reacción inmunológica que puede desembocar en hemólisis, anemia, fallo renal, shock, o muerte. Los donantes de sangre y los receptores deben tener grupos compatibles. El grupo O- es compatible con todos, por lo que quien tiene dicho grupo se dice que es un donante universal. Por otro lado, una persona cuyo grupo sea AB+ podrá recibir sangre de cualquier grupo, y se dice que es un receptor universal La transfusión de sangre de un Rh+ a un Rh- que no tiene dicho aglutinógeno induce la formación de anticuerpos, que en sucesivas donaciones puede aglutinar la sangre (formar grumos). De ahí que en las donaciones de sangre y órganos se tenga en cuenta dicho factor. Es necesario por tanto tener un procedimiento sencillo en el laboratorio para determinar la compatibilidad sanguínea, el más simple de los cuales es el test cruzado de Coombs.

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http://es.wikipedia.org/wiki/Sangre

http://es.wikipedia.org/wiki/Ant%C3%ADgeno

http://es.wikipedia.org/wiki/Gl%C3%B3bulo_rojo

http://es.wikipedia.org/wiki/Suero_sangu%C3%ADneo

http://es.wikipedia.org/wiki/Anticuerpo

http://es.wikipedia.org/wiki/Hem%C3%B3lisis

http://es.wikipedia.org/wiki/Anemia

http://es.wikipedia.org/wiki/Fallo_renal

http://es.wikipedia.org/wiki/Shock

http://es.wikipedia.org/wiki/Muerte



24

Tabla de compatibilidad entre grupos sanguíneos

Donante Receptor

O- O+ B- B+ A- A+ AB- AB+

AB+ X X X X X X X X

AB- X X X X

A+ X X X X

A- X X

B+ X X X X

B- X X

O+ X X

O- X

La prueba cruzada de la sangre del donador con la del receptor puede constar de dos partes, conocidas como fase mayor y fase menor. La fase mayor consiste en mezclar los eritrocitos del donador con el suero del receptor tanto en presencia como en ausencia del suero de Coombs, mientras la fase menor consiste en mezclar los glóbulos rojos del receptor con el suero del donador, con y sin el suero de Coombs. La fase mayor recibe ese nombre por que permite descubrir en el suero del receptor los anticuerpos que suelen presentar la causa más común de las reacciones hemolíticas graves o fatales ante las transfusiones. La reacción a la transfusión suele ser leve, cuando se debe a incompatibilidad en la fase menor de la prueba cruzada.

Material: - Tarjetas sanguíneas. - Pipetas Pasteur. - Tubos de centrífuga. - Centrífuga. - Placa de toques. - Lupa binocular.

Reactivos: - Suero salino. - Suero anti-A. - Suero anti-B. - Suero anti-D (anti-Rh).

Muestras: - Sangre.

Procedimientos: • PRUEBAS CRUZADAS. • DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO.



PRUEBAS CRUZADAS (salina)41:

1. Hacer una extracción de 3 ml de sangre al donador y receptor.

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2. Preparar una suspensión al 5% de glóbulos rojos en suero fisiológico en un tubo de hemólisis, tanto del donador como del receptor.

3. Dejar coagular la sangre, desprender el coágulo por medio de un aplicador, centrifugar a 3000 r.p.m. durante 5 minutos, separar el suero por medio de una pipeta Pasteur de ambos tubos.

4. Marcar tres tubos de la siguiente manera: Ds (prueba mayor), Rs (prueba menor) y Ts (autotestigo).

5. Al tubo Ds colocar dos gotas de suero del receptor más una gota de glóbulos rojos del donador y mezclar.

6. Al tubo Rs colocar dos gotas de suero del donador más una gota de glóbulos rojos del receptor y mezclar.

7. Al tubo Ts colocar dos gotas del suero del donador más una gota de glóbulos rojos del donador42.

8. Centrifugar los tubos Ds Rs y Ts a 3400 r.p.m. durante 30 segundos y observar si hay aglutinación.

9. Mezcle y centrifugue a 340 r.p.m. durante 30 segundos y observe si hay aglutinación.

10. Anota los resultados.

DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO:

En Tarjeta: 1. Prepara una tarjeta con cartulina normal y

cartulina plastificada (en amarillo según la imagen).

2. Colocar en la tarjeta una gota se suero anti-A, una de anti-B, una mezcla de anti-A y anti-B, y una gota de anti-D, cada una en su casilla correspondiente.

3. Desinfecta o mejor esteriliza un alfiler de disección.

4. Pinchar la yema del dedo, previa desinfección con alcohol o agua oxigenada. Depositar una gotita de sangre en cada casilla y mezclar con los sueros.

5. Observar los resultados. 6. Determina el grupo sanguíneo.

41 Puede realizarse con albúmina y solución liss. 42 También puede hacerse con el receptor.



5. Centrifuga a 1000 r.p.m. durante un minuto o bien a 3500 r.p.m. durante 30 segundos.

6. Resuspenda los glóbulos rojos con agitación ligera.

7. Observa si hay hemoaglutinación.

En Placa: 1. Prepara una suspensión de glóbulos rojos al

2% en solución salina fisiológica, (al 0.85% o 0.9%), o bien proceder con sangre total.

2. Coloca una gota de sangre total en cinco43 excavaciones de una placa, previamente marcadas para no confundirse.

3. Añada a la primera gota de sangre una gota de suero anti-A, a la segunda, una gota de suero anti-B, a la tercera una gota de suero anti-AB44 y a la cuarta una gota de suero anti – D o Rh.

4. Con ayuda de un aplicador de madera mezcla cada uno de ellos (debe emplearse, un segmento de aplicador para cada uno).

5. Agita suavemente cada una de las placas o la placa con movimientos suaves y circulares de balanceo durante 30 segundos aproximadamente.

6. Lea el resultado; si hay duda, deje reposar la placa por un minuto aproximadamente y lea nuevamente la hemoaglutinación45.

En tubo: 1. Prepara una suspensión de glóbulos rojos al

2% en solución salina fisiológica al 0.85%. 2. Adicionar una gota de suspensión de

glóbulos rojos a cada uno de los cinco46 tubos, previamente marcados.

3. Agregar a cada tubo dos gotas de suero anti -A, anti-B, anti-AB y anti-D respectivamente.

4. Mezcla. 43 Un tubo será el testigo. 44 O una gota de anti-A y otra de anti-B. 45 Para una mejor visualización puede emplearse una lupa binocular.

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46 Un tubo será el testigo.



P12. DETERMINACIÓN DEL EMBARAZO.


con anticuerpos monoclonales para diferentes determinaciones a partir de muestras naturales.

Fundamento: La detección de la gonadotropina coriónica humana (hCG) constituye el fundamento de las pruebas inmunoquímicas realizadas en suero y orina para el diagnóstico del embarazo normal o patológico. Esta hormona se produce, en condiciones normales, por el tejido trofoblástico de la placenta y pertenece a la familia de las gonadotropinas glucoprotéicas, tiene alta homología estructural con la hormona luteotrópica (hLH) con la cual comparte no sólo la subunidad alfa, como el resto de las hormonas glicoproteicas de origen pituitario, sino gran parte de la beta. Los inconvenientes analíticos asociados a la similitud estructural de la hCG y LH que ocasionaron en el pasado confusiones entre el diagnóstico de embarazos, picos ovulatorios y amenorreas posmenopáusicas, fueron erradicados con la aplicación, en este campo, de los anticuerpos monoclonales (AcM) frente a la fracción β.

La mayor parte de las pruebas emplean un anticuerpo monoclonal (MAb) específico de la subunidad β de la hCG (βhCG). Este procedimiento se emplea para asegurar que las pruebas no dan falsos positivos por confusión de la hCG con la LH y la FSH. Estas dos últimas están siempre presentes en diferentes niveles en el cuerpo, mientras que la presencia de hCG casi siempre indica el embarazo. Estos test detectan la presencia de la hormona gonadotropina coriónica humana (HCG) en la orina de la mujer en fase temprana a partir de 10 mIU/ml. HCG aparece en la orina, después de que el óvulo ha sido fecundado y se implanta en el útero, esto suele ocurrir aproximadamente 6-8 días después de la fecundación. La hormona HCG mantiene la producción de progesterona después de la concepción. El nivel de concentración de la hormona se duplica cada dos días.

Material y Reactivos: - Kit comercial. - Envase Anaorin.

Muestras: - Orina femenina de la mañana. -

Procedimientos: • DETERMINACIÓN DEL EMBARAZO.

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DETERMINACIÓN DEL EMBARAZO:

1. Las muestras refrigeradas y otros materiales de test incluyendo el dispositivo deben adaptarse a temperaturas ambiente antes de testear.

2. Retira una tira del sobre. 3. Rotular el test y el recipiente de

conformidad. 4. Sostén la tira verticalmente del extremo del

agarre. 5. Sumerge la almohadilla en la muestra por

aproximadamente 10 segundos. 6. Mantén la superficie de la muestra al nivel

que indica la flecha en el test. 7. Retira el test de la muestra y colóquelo

sobre una superficie plana y seca. 8. Los resultados positivos fuertes se observan

a los 2-3 minutos. Los resultados positivos débiles pueden tardar más tiempo, hasta 5 minutos, en aparecer47.

28

+ - No válido

47 Importante: No interpretar el resultado después de los 10 minutos.



P13. DETERMINACIÓN DE ALBUMINURIA.


para diferentes determinaciones de aplicación sanitaria a partir de muestras humanas.

Fundamento: Las proteínas contenidas en el suero, forma con anticuerpos específicos, por medio de una reacción inmunoquímica, inmunocomplejos que pueden dispersar un rayo de luz incidente. La intensidad de la luz dispersada es proporcional a la concentración de la correspondiente proteína en la muestra. La valoración se hace comparando con un estándar de concentración conocida.

Se denomina microalbuminuria al aumento en la excreción urinaria de albúmina, sobre el rango normal, pero bajo el umbral de detección de los tests usualmente empleados para la determinación de proteinuria. Estos rangos son 30 y 300 mg/día respectivamente; toda cifra superior a 300 mg/día es considerada albuminuria clínica (o macroalbuminuria). Originalmente el concepto de microalbuminuria surgió en relación a la detección del daño renal precoz en diabetes, denominada nefropatía incipiente; actualmente la microalbuminuria es considerada también un marcador de daño cardiovascular en general, tanto en diabéticos como en no-diabéticos. Como agente precipitante se utilizan los N antisueros. Son sueros animales, líquidos, producidos mediante inmunización de conejos con albúmina, prealbúmina y PFR humanas, de alta pureza. Los títulos de los anticuerpos (T) indican, cuantos mg de antígeno van a ser precipitados en un gel de agarosa por 1 mL de antisuero correspondiente.

Material: - Vasos de precipitados. - Pipetas. - Matraz aforado. - Centrífuga. - Nefelómetro. - Cubetas de nefelometría. - Recipiente anaorin.

Reactivos: - Cloruro de sodio. - Tween 20. - Albúmina humana. - Suero de conejo anti-albúmina humana.

Muestras: - Recolección de orina de 24 horas.

Procedimientos: • RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA. • PREPARACIÓN DE SUERO SALINO AL TWEEN. • CURVA DE CALIBRACIÓN. • MEDIDA.

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RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA:

1. El día 1 hay que orinar en el váter hasta levantarse por la mañana.

2. A partir de ese momento, hay que orinar todas las veces en el contenedor durante las siguientes 24 horas.

3. El día 2 hay que orinar en el contenedor hasta la primera micción después de levantarse.

4. Hay que guardar el contenedor en lugar fresco durante todo el periodo de recogida de la orina

5. Una vez lleno, taparlo y llevarlo al laboratorio de análisis lo antes posible.

6. Anota el volumen de orina en 24 h.

PREPARACIÓN DEL DILUYENTE: 1. Pesa exactamente 9 g de cloruro de sodio. 2. Disuelve en medio litro de agua. 3. Añade 0,15 ml de Tween 20. 4. Trasvasa a un matraz aforado de 1litro. 5. Afora. 6. Conserva a temperatura de refrigeración. CURVA DE CALIBRADO: 1. Prepara las siguientes concentraciones de

albúmina humana en diluyente: 0,000, 0,50, 1,25, 2,50 5,00 mg en 100 ml c/u de cada concentración.

2. Deposita 1 ml de cada disolución en las cubetas de nefelometría.

3. Añade a cada cubeta 2 ml de antisuero anti-albúmina humana diluido 1:10 utilizando el mismo diluyente en caso necesario.

4. Agita y se deja a temperatura ambiente por una hora.

5. Mide la luz dispersada con el nefelómetro. MEDIDA: 1. Homogeneiza la muestra de orina. 2. Toma 10 ml en un tubo de centrífuga. 3. Centrifugan a 2.000 r.p.m. por 10 minutos a

4 ºC. 4. Decanta y del sobrenadante se toman 2 ml,

que se deposita directamente en la celdilla para nefelometría.

5. Se complementa el volumen con 8 ml de solución salina Tween 20.

6. Procede igual que en la curva de calibración (puntos 2-5).

7. Representa la curva de calibrado.

8. Interpola el valor de la orina en la curva de calibrado.

9. Calcula la concentración en la muestra original. 10. Calcula el valor de la albúmina por día y

compáralo con la bibliografía.



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P14. DETECCIÓN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. PAGE.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicación de las técnicas electroforéticas

de proteínas para análisis de aplicación alimentaria a partir de muestras naturales.

Fundamento: La composición de las proteínas del suero lácteo de distintas especies es diferente y equivale a una “huella dactilar” de la misma. En análisis alimentario a veces es necesario conocer si en un alimento la leche utilizada es de una única especie o mezcla de varias para evitar fraudes. Así una denominación de origen, como el queso manchego, sólo puede contener proteínas de leche de ovejas manchegas. La fracción sérica de la muestra se extrae por adición de solución tampón a pH 4,6 y posterior centrifugación. Las proteínas se suero son separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida a pH 8,3. El método es aplicable a leche cruda o pasteurizada a una temperatura máxima de 90ºC, durante 30 segundos. Leche conservada mediante congelación o por adición de dicromato de potasio. El mismo método es aplicable a quesos.

Material: - Material general de laboratorio. - Micropipetas. - Cubeta vertical de electroforesis y accesorios. - Fuente de alimentación. - pH-metro. - Centrífuga. - Papel de filtro de alta calidad.

Reactivos: - Tris base (Tris(hidroximetil)aminometano). - Ácido clorhídrico. - Glicina. - Azul de Coomassie G-250. - Ácido sulfúrico. - Hidróxido potásico. - Ácido tricloroacético. - Acrilamida-bisacrilamida. - TEMED (N,N,N’,N’,-tetrametilendiamina). - Persulfato amónico. - Acetato de sodio. - Azul de bromofenol. - Glicerina. - Etanol.

Muestras: - Sueros de leches (o quesos) de distinta procedencia animal.

Procedimientos: • PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES. • PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA. • PREPARACIÓN DE LA MUESTRA. • ELECTROFORESIS. • REVELADO.



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PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES:

Tampón Tris pH 8,9 (Gel):

Pesa 46 g de Tris(hidroximetil)aminometano, medir 4 mL de HCl cc. (35%) y disolver en agua a un litro. Tampón Tris pH 8,3 (electrodos):

Pesa 1,2 g de Tris(hidroximetil)aminometano, 5,8 g de glicina y disolver en agua hasta 2.000 mL. Disolución fijadora-reveladora

1. Disuelve 1 g de azul de Coomassie G-250 en 500 mL de agua.

2. Añade a la solución 500 mL de ácido sulfúrico 1M.

3. Mezcla bien agitando durante una hora y filtrar con papel Whatman número 1.

4. Medir el volumen de filtrado y añadir 1/9 de este volumen de solución de hidróxido de potasio 10N.

5. Añade ácido tricloroacético a esta disolución hasta que la concentración final sea de 12%48.

PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA: 1. Una vez limpias las placas de vidrio con

agua y jabón se dejan escurrir en posición vertical. Se vuelven a limpiar con un papel humedecido en acetona. Se montan los separadores entre las placas de vidrio y se colocan en el soporte.

2. Toma dos tubos de ensayo de poliestireno de 10 mL los pones en una gradilla y añade a cada uno de ellos y por riguroso orden los siguientes reactivos:

Acrilamida-Bisacrilamida 2,5 mL Agua 4,0 mL Tampón de los geles, pH 8,9 1,0 mL TEMED 8 μL Persulfato amónico 10% 75 μL 3. Inmediatamente después de preparar el gel,

se vierte éste con la ayuda de una pipeta Pasteur teniendo mucho cuidado de no formar burbujas sobre las placas hasta el nivel que será ocupado por el peine formador de pocillos.

48 Esta solución de teñido es estable durante varios meses si el pH <1. Se puede utilizar varias veces pero es conveniente filtrarla antes de cada uso.

4. A continuación introducir el peine previamente lavado con agua y etanol, evitando que queden burbujas entre el peine y el gel.

5. Se deja polimerizar el gel a temperatura ambiente durante 30 minutos.

6. Una vez polimerizado el gel, se retira el peine con mucho cuidado de no romper los pocillos reservados a las muestras.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA: 11. En vasos de precipitados de 50 mL pon 20 mL

de cada una de las leches (o 15 g de queso previamente triturado).

12. Añade a cada una de las muestra 10 mL de ácido acético al 10 % v/v y 10 mL de acetato de sodio 1 M.

13. Centrifuga a 3.000 r.p.m. durante 10 minutos. 14. Filtra el líquido sobrenadante a través de papel

de filtro de velocidad media. 15. Guardar los filtrados en viales debidamente

etiquetados. ELECTROFORESIS: 1. Coloca el soporte del gel en la cubeta de

electroforesis y llenar las cámaras de los electrodos con tampón de los electrodos (hasta la marca de la cubeta y comprobar que los pocillos del gel quedan llenos de tampón).

2. Inmediatamente antes de su aplicación en los pocillos del gel mezclar para cada muestra: 1 volumen de la fracción soluble de muestra obtenida anteriormente, 1 volumen de glicerina al 40 % v/v y ½ volumen de azul de bromofenol al 0,1 %.

3. Sobre cada uno de los pocillos, aplica con micropipeta (o microjeringa) provista de una punta adecuada (introducir la punta de la pipeta hasta el fondo del pocillo) un volumen de 10 a 20 μL de las disoluciones de muestras obtenidas en el apartado anterior.

4. Anota el orden de las muestras que se pone en cada uno de los pocillos.

5. Conecta correctamente los cables de la cubeta a la fuente de alimentación y realiza la electroforesis a un máximo de 120 V.

6. Deja correr el frente del disolvente hasta que la línea del azul de bromofenol esté a 5 mm del extremo inferior del gel.

7. Desconecta la corriente y se saca el soporte de las placas de la cubeta depositándolo sobre una bandeja.



REVELADO: 1. Separa con mucho cuidado los cristales,

retira el gel y colócalo en una cubeta conteniendo la solución de fijación y tinción.

33

2. Deja que el gel se fije y tiña durante el tiempo necesario (una o más horas), agitando de vez en cuando la cubeta.

3. Pasar el gel a una cubeta con agua destilada para decolorarlo.

4. Renovar con frecuencia el agua de la cubeta agitando de vez en cuando ésta, hasta eliminar el color de fondo del gel.

5. Fotografía el gel e identifica las bandas obtenidas.

6. Saca las conclusiones oportunas.

Diagrama electroforético de las proteínas de suero de:

• A leche de vaca • B leche de cabra • C leche de oveja.

1. Seroalbúmina 2. β lactoglobulina de cabra. 3. α lactoalbúmina de cabra y oveja. 4. α lactoalbúmina de vaca y β lactoglobulina de oveja. 5. β lactoglobulina B de vaca. 6. β lactoglobulina A de vaca.

65 4 32 1

+

-

A B C



P15. DETECCIÓN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. ELISA.

Objetivo: Hacer prácticos todos los conocimientos adquiridos en cuanto a la aplicación de los ensayos

inmunoenzimáticos en análisis de aplicación alimentaria a partir de muestras naturales.

Fundamento: Tanto antígenos como anticuerpos pueden ser detectados y cuantificados de forma rápida y específica por el procedimiento ELISA. Entre la diversidad de métodos de ELISA desarrollados, una de las aplicaciones más extendidas es el método sandwich (o de doble anticuerpo) en placa microtiter. Un primer anticuerpo se inmoviliza en la superficie de los pocillos la placa microtiter. A continuación, se añaden las muestras que contienen el antígeno que quedará atrapado por el este primer anticuerpo. Las muestras se retiran y se añade el segundo anticuerpo que también se une al antígeno formando un sandwich. Este segundo anticuerpo tiene una enzima unida que al añadir su sustrato producirá un producto de color.

La intensidad de color del producto se mide espectrofotométricamente ( o visualmente) y será proporcional a la cantidad de antígeno detectado. De esta forma se puede calcular la concentración exacta de antígeno en cada muestra.

Material: - Material general de laboratorio. - Pipetas Pasteur. - Kit E.L.I.S.A.-RC-didac. - -Espectrofotómetro ELISA (para determinaciones cuantitativas).

Reactivos: - Kit E.L.I.S.A.-RC-didac.

Muestras: - Kit E.L.I.S.A.-RC-didac.

Procedimientos: • VISUALIZACIÓN DEL KIT. • PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS. • PREPARACIÓN DEL CONJUGADO. • DESARROLLO DEL ENSAYO. • DETERMINACIÓN SEMICUENTITATIVA. • DETERMINACIÓN CUANTITATIVA. (OPCIONAL).

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VISUALIUZACIÓN DEL KIT:

El Kit E.L.I.S.A.- RC-didac49 debe contener:

- Tiras de 8 pocillos con el primer anticuerpo fijado (6 o 12 unidades).

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- 4 x Patrones de lactosuero de vaca (0%, 1%, 5%, 10%, 15%) en lactosuero de oveja.

- 3 x Muestras problema de lactosuero (muestra 1, muestra 2 y muestra 3).

- 1 x Patrón de lactosuero de oveja pura (100%).

- 1 x Anticuerpo anti-proteína bovina marcado con peroxidasa (Conjugado x 20) (Tubo 1).

- 1 x Sustrato/Cromógeno (TMB) (Tubo 2).

- 1 x Solución stop (Acido sulfúrico 1M) (Tubo 3). Corrosivo!

- 1 x Solución de dilución del conjugado (Tubo 4).

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS: Las muestras y patrones incluidos en el kit están listos para usar. Es decir, no necesitan predilución50. PREPARACIÓN DEL CONJUGADO: Preparar solo el volumen de solución necesario para el ensayo51. Para ello, mezclar 1 volumen de la Solución stock de conjugado (Tubo 1) con 19 volúmenes de la Solución de dilución del Conjugado (Tubo 4)52. DESARROLLO DE LA PRUBEBA:

1. Sacar de la bolsa la placa con las tiras que van a ser utilizadas.

2. Guardar en la bolsa el resto de tiras.

49 Todos los componentes del kit deben ser conservados en nevera (0- 4ºC). El kit tiene una estabilidad de 4-8 meses. 50 En el caso de utilizar otras muestras, diluirlas 1/100 con agua destilada. Por ejemplo: 0,01 ml de patrón más 0,99 ml de agua destilada. 51 La solución de conjugado, una vez preparada, es estable varios días por lo que se puede preparar la cantidad necesaria para toda la semana. 52 Por ejemplo: Para analizar 8 muestras, es necesario 0,4 ml (50 ml/pocillo) de la solución de conjugado. 0,5 ml de esta solución se prepara mezclando 25 µl de la solución del Tubo 1 con 475 µl de la solución del Tubo 4.

3. Atemperar todos los reactivos, patrones, muestras y tiras que van a ser utilizados en el ensayo53.

4. Aplicar en cada pocillo de la placa 50 μl de

muestra (0%, 1%, 5%, 10%, 15%) o patrón diluido e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.

5. Eliminar el líquido de los pocillos volcando la placa sobre un recipiente54.

6. Lavar cada pocillo con 0,3 ml de agua destilada (o sea, llenándolo hasta arriba el pocillo) y eliminar el agua como en el paso 5.

7. Repetir este lavado una vez más55. 8. Aplicar en cada pocillo 50 μl de Solución de

conjugado. 9. Incubar a temperatura ambiente durante 30

minutos 10. Repetir 3 veces la secuencia de lavados como en

los pasos 6 y 7. 11. Aplicar en cada pocillo 50 μl de la Solución de

sustrato/cromógeno (Tubo 2) y dejar desarrollar el color azul 30 minutos a temperatura ambiente56.

53 Entre etapa y etapa del procedimiento de análisis, no se debe dejar secar completamente los pocillos. 54 Para asegurarse que el líquido es completamente eliminado, se puede golpear la placa con los pocillos mirando hacia abajo sobre un papel absorbente/secamanos. 55 Un lavado incompleto de los pocillos puede originar falsos positivos. En este caso, se puede aumentar el número de lavados de la muestra y del conjugado para intensificar el proceso. 56 La solución de sustrato/cromógeno es sensible a la luz por lo que se debe evitar la exposición directa a ésta. Cerrar el tubo después de usarlo. Como es una solución lista para usar, para evitar que se contamine con algún catalizador y vire a color azul, es conveniente no pipetear directamente del tubo con una punta de pipeta usada. Por tanto, se recomienda trasvasar a



12. Añadir en cada pocillo 50 μl de la Solución stop (Tubo 3) para parar la reacción.

13. Mezclar bien dando unos golpes suaves en el borde lateral del marco.

14. Efectuar la lectura antes de los 30 minutos desde la parada de la reacción.

DETERMINACIÓN SEMICUENTITATIVA:

Como la intensidad del color que se obtiene en cada pocillo va ser directamente proporcional al porcentaje de leche de vaca en la muestra, por comparación visual con el color de los patrones del 0%, 1%, 5%, 10%, 15% se puede identificar en que rango de concentración se encuentra la muestra: menor del 1%, entre 1-5%, entre 5-10%, etc...

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA:

1. Leer la absorbancia de cada pocillo a una longitud de onda de 450 nm con un espectrofotómetro para placas microtiter57.

2. Utilizar como blanco aire. 3. Leer durante los 30 minutos siguientes a la

parada de la reacción. 4. Para calcular el porcentaje de mezcla de

cada muestra problema se representa gráficamente la absorbancia de los patrones (Eje Y) en función del porcentaje de mezcla de cada patrón (Eje X).

5. Con la curva obtenida (lineal a

concentraciones bajas) se interpola el porcentaje de mezcla de las muestras problema a partir del valor de absorbancia obtenido de éstas58,59.

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otro tubo o envase la cantidad de solución que se va a utilizar para el ensayo. 57 En el caso de no poseerlo, puede realizarse con un espectrofotómetro para cubetas. Diluir los patrones y muestras 1/10 con agua destilada y medir a 450 nm. Hacer blanco frente a aire. 58 La absorbancia de la muestra de lactosuero de oveja (control negativo) se debe considerar concentración cero a la hora de hacer los cálculos. Las muestras problema que den una absorbancia inferior o igual a la de lactosuero de oveja no contienen leche de vaca. Valores superiores de absorbancia indicarán la presencia de leche de vaca en esas muestras. 59 Cuando se desea realizar un cálculo exacto, es conveniente analizar por duplicado las muestras y patrones.



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ÍNDICE DE CONTENIDOS

P1. OBTENCIÓN DE PROTEÍNAS. 1

P2. RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS Y PROTEÍNAS. 3

P3. DETERMINACIÓN DE ENZIMAS. 5

P4. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE UNA PROTEÍNA. 7

P5. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE AMINOÁCIDOS. 9

P6. SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA DE PROTEÍNAS. 13

P7. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS. 15

P8. EXTRACCIÓN DE ADN. 17

P9. ELECTROFORESIS DE ADN. 19

P10. CUANTIFICACIÓN DE ADN. 21

P11. DETERMINACIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO Y COMPATIBILIDAD. 23

P12. DETERMINACIÓN DEL EMBARAZO. 27

P13. DETERMINACIÓN DE ALBUMINURIA. 29

P14. DETECCIÓN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. PAGE. 31

P15. DETECCIÓN DE FRAUDES ALIMENTARIOS. ELISA. 35

p1. obtención de proteínas. - educa. · pdf file1 de esa cantidad, el 10% aprox....

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