Svensk Mjölk ForskningTelefon 0771-191900. E-post fornamn.efternamn@svenskmjolk.se

Pastöriseringsöverlevande bakterier ileverantörsmjölk

Birgitta Svensson, Kerstin Ekelund, Anders Christiansson

Branschintern Rapport nr 7035-1 2004-04-26

2

Pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörsmjölk

Birgitta Svensson, Kerstin Ekelund, Anders Christiansson

SammanfattningMed ökade kundkrav på totalantal bakterier i mjölkpulver (10 000 per gram) ökar ocksåkravet på mjölkråvarans innehåll av bakterier som överlever pastörisering (<1000 per ml). Idenna studie undersöktes halten av pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölk från ca 100leverantörer. Femton leverantörer hade lågt totalantal (<20 000/ml) men högt antalpastöriseringsöverlevande bakterier (>200/ml). Den högsta halten efter värmebehandling var14 000/ml. Totalt hade 29% av leverantörerna halter efter värmebehandling på >200/ml. Dettaindikerar problem med disk av mjölkningsanläggningen. Bakterier isolerades eftervärmebehandlingen och typades. Vanligast var coryneforma bakterier (71%), följt av kocker(17%) och resten utgjordes av aeroba sporbildande bakterier (12%). Kockerna och decoryneforma utgör en del av kornas normala hudflora och kommer alltid att finnas i mjölken ihalter upp till ca 200/ml. Endast 7 isolat, av totalt 421, var potentiellt patogena. Dessa komfrån olika prov och förekom i låg halt. Ett urval av coryneforma bakterier och kocker testadesför värmetolerans, disktålighet och biofilmsbildning. Värmetoleransen visade sig vara så passhög (D73 0.2-62 min) att förändringar i pastörisering på mejeriet inte är en lösning för attavdöda dessa bakterier i mjölken. Disk utfördes i laboratorieskala vid 42 och 68°C (statisktemperatur), med alkaliskt diskmedel med klor och med surt diskmedel. Dosering gjordesenligt rekommendation från diskmedelstillverkarna. De utvalda bakterierna avdödadeseffektivt av diskmedel i suspension (både alkaliskt med klor och surt diskmedel), men dåmjölkrester (1%) fanns med i disklösningen ökade överlevnaden markant. Jämfört med t.ex.Escherichia coli är överlevnaden betydligt bättre för denna typ av bakterier. Bakteriernabildade lätt biofilm. Denna var betydligt mer resistent mot diskmedel än bakterierna i lösning.Även för biofilmen ökade överlevnaden då mjölkrester fanns med i disklösningen. Detalkaliska diskmedlet var effektivare på att få loss biofilmen från ytan än det sura diskmedlet.Här ger kloret också en extra effekt. Surt diskmedel vid låg temperatur gav ett genomgåendedåligt resultat.

Om man följer de rekommendationer för disk som finns idag med avseende på dosering,disktid, start- och sluttemperatur bör man klara att avdöda de pastöriseringsöverlevandebakterierna. Möjligen kan den rekommenderade sluttemperaturen på 42°C vara något låg.Sköljning av mjölkningsanläggningen innan disk är mycket viktig för att få optimal effekt avdiskmedlen. Förekomst av svackor kan medföra att mjölkrester finns kvar i anläggningenäven efter försköljning och kan negativt påverka diskeffekten. Biofilmer av bakterier ärmycket mer resistenta mot disk än bakterierna i lösning. Det är därför viktigt att förhindra attbakterierna får möjlighet att bilda biofilm. I en anläggning som är ren från mjölkrester finnssämre möjligheter för bakterierna att få fäste.

3

InledningÖkade kundkrav på mjölkpulver från 50 000 bakterier per gram pulver till 10 000 per gram,har gjort det svårt för mejerierna att få fram första klassens pulver. Mjölkråvaran får efterpastörisering inte innehålla mer än 1000 bakterier per ml för att klara det nya kravet på pulver.Vissa leverantörer klarar inte att leverera en mjölkråvara med denna kvalitet, trots atttotalantalet på mjölken är mycket lågt, <10 000 per ml.

På senare år har få studier gjorts av icke sporbildande bakterier som kan överlevalågpastörisering (72°C i 15 s) på mejeriet. Under 40- till 60-talet gjordes flera stora studier avleverantörsmjölkens mikroflora där man även studerade pastöriseringsöverlevande bakterier(Thomas, Druce, Peters, & Griffiths, 1967). Vid denna tid skedde stora förändringar teknisktute på mjölkgårdarna. Man gick över från handmjölkning till maskinmjölkning, frånmjölkning i spann till rörledningar, från flaskhämtning till tankhämtning och nya automatiskadisksystem infördes. I studierna av de pastöriseringsöverlevande bakterier fann man att hurman diskade hade stor betydelse för halterna i mjölken (Mackenzie, 1973; Thomas et al.,1967). Den värmetoleranta floran består till stor del av organismer som finns på kons hud(Angula, Lorenzo, & Riveiro, 1989; Bergey, 1986). I de tidigare studierna kan man se att detär samma typ av organismer som återfinns, men vilka som dominerar växlar med disksystemoch teknisk utrustning (Thomas et al., 1967). Denna flora är inte psykrotrof och kan alltså inteväxa till i den kylda mjölken. Däremot kan dessa bakterier etablera sig och växa i en dåligtdiskad mjölkningsanläggning. När sedan mjölken passerar genom utrustningen spolasbakterierna med ner i tanken, vilket kan resultera i högt antal värmetoleranta bakterier imjölken. Sporbildande bakterier förekommer också fast oftast i lägre halter. Här är det merfrågan om kontamination av spenarna från jord eller bäddmaterial och en otillräckligavtorkningsrutin vid mjölkning. Men även vissa Bacillus-arter har visat sig kunna koloniseramjölkningsanläggningar som är otillräckligt diskade (Christiansson, Bertilsson, & Svensson,1999).

Då problemet uppstår redan på gårdsnivå så fick Svensk Mjölk i uppdrag att ta reda på omdet är vanligt med höga halter av pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölk från svenskaleverantörer. I uppdraget ingick att isolera bakterierna och ta reda på vilka typer det rör sig omsamt att få ett mått på hur pass värmetåliga dessa bakterier är och vad som krävs för att diskabort dem från anläggningarna. Det bestämdes att samla in tankmjölksprov från ca 100leverantörer fördelat på de fyra största mejeriföreningarna och isolera bakteriestammar fråndessa prov för typning, värmetolerans- och diskförsök.

Utförande av projektetLängst bak i rapporten finns en bildbilaga med bilder som illustrerar hur vissa moment utförts.Då det i texten refereras till Bild är det bilderna i denna bilaga som avses.

Insamling av provLeverantörsprov togs ut via mjölkbedömningen från 4 linjer vid 4 mejerier. Totalt togs provfrån 93 leverantörer. Samlingsprov togs också ut från de bilar som samlat in mjölken och desilos som mjölken pumpats in i. Proverna skickade kylda till Svensk Mjölk Forskning i Lundoch analyserades direkt vid ankomst.

Värmebehandling och isolering av pastöriseringsöverlevande bakterierTotalantalet bestämdes genom ingjutning av 1 ml mjölk av spädning 10, 100 och 1000 gångeri TGA. Plattorna inkuberades vid 30°C i 3 dygn före avläsning. För att bestämma haltenpastöriseringsöverlevande bakterier värmebehandlades mjölkproven först med en metod

4

utarbetad av ArlaFoods i Götene för att motsvara deras pastör. Ett vattenbad tempererades till77.5°C. Mjölkprov om 10 ml överfördes till sterila provrör av glas. En termometer sattes i ettreferensrör som också innehöll 10 ml mjölk. Samtliga rör sattes ner i vattenbadet samtidigt.Då termometern i referensröret visade 73.8°C togs tiden 15 sekunder och då ska temperaturenvara uppe i 75°C. Eventuellt kan längre tid behövas. Därefter kyldes rören i kallt vatten och0.1 ml av ospätt prov och 10x spätt prov spreds på ytan av BHI-agarplattor (Brain HeartInfusion argar). Plattorna inkuberades vid 30°C i 3 dygn innan de räknades. Ca 5 olikakolonier från varje värmebehandlat leverantörsprov isolerades slumpmässigt och renströks påBHI-agar. Renkulturer förvarades i –80°C i BHI med 20% glycerol.

Tabell 1. Artnamn och stamnummer för de typstammar som använts vid typning av isolatenfrån värmebehandlad leverantörsmjölk. Samt som jämförelse vid värmeavdödning.

Kocker Coryneforma bakterier BacillusArtnamn Stamnr Artnamn Stamnr Artnamn StamnrEnterococcus faecalis SMR111 Arthrobacter globiformis SMR291 Bacillus subtilis SMR772Enterococcus faecium SMR700 Arthrobacter oxydans SMR287 Bacillus amyloliquefaciens SMR765Streptococcustermophilus

SMR109 Aurerobacteriumliquefaciens

SMR285 Bacillus brevis SMR716

Micrococcus luteus SMR282 Brevibacterium linens SMR292 Bacillus cereus SMR750Kocuria varians SMR283 Brevibacterium casei SMR293 Bacillus circulans SMR763Streptococcus bovis SMR286 Caseobacter polymorphus SMR295 Bacillus licheniformis SMR766Leuconostoc cremoris SMR92 Cellulomonas flavigena SMR296 Bacillus megaterium SMR768Lactococcus lactis SMR42 Corynebacterium

flavescensSMR288 Bacillus mycoides SMR758

Lactococcus cremoris SMR8 Corynebacterium bovis SMR289 Bacillus polymyxa SMR769Deinococcus SMR499 Corynebacterium

vitaeruminisSMR290 Bacillus pumilus SMR770

Micrococcus roseus SMR498 Curtobacterium citreum SMR294 Bacillus sphaericus SMR173Pediococcus SMR1207 Microbacterium lacticum SMR284 Bacillus stearotermophilus SMR149Pediococcus SMR1208 Bacillus thuringiensis SMR752

Metoder för karakterisering av isolatSamtliga isolat studerades i faskontrast-mikroskop efter 1 och 3 dygns inkubering på BHI-agar (Bild 1-2). Cellform, rörlighet, storlek, formation (t.ex. kedjor, klasar, palissad) ocheventuell sporbildning noterades. Koloniutseende på BHI-plattorna och eventuellpigmentering noterades också. Alla isolat Gram-färgades och testades för katalas och oxidas.Isolaten grupperades i kocker, sporbildande Bacillus och coryneforma bakterier och testadespå API efter respektive grupp (Bild 5-7). För att välja coryneforma bakterier för API-testgrupperades dessa i 8 grupper (I-VII + resten) med avseende på utseende i mikroskop och påBHI-platta. API-Staph användes för kockerna, API 50CHB/20E för Bacillus-arter och API-Coryne för de coryneforma bakterierna. Bacillus-isolaten studerades också på blodagarplattor(Bild 3-4). Presumtiva mikrokocker och stafylokocker testades för lysostaphin-resistens(FDA, 1992). För att fastställa släktskap mellan de olika bakterieisolaten beräknades enlikhets-matrix på API-resultaten med hjälp av SYSTAT (SYSTAT®, 1999). Denna matrixanvändes sedan för att skapa dendrogram (släktskapsträd). Kocker behandlades för sig ochcoryneforma bakterier för sig. Ett urval av typstammar användes som jämförelse vidart/släktes bestämningen (Tabell 1).

Utvalda stammar för avdödningUrvalet av stammar för värmebehandling gjordes med hjälp av dendrogramen (Figur 1 ochFigur 2). De valda stammarna skulle representera så stor spännvidd på bakterierna sommöjligt. Samt att få med representanter från alla mejeriföreningarna. Stambeteckningen står

5

till vänster om trädet. I dendrogrammen finns stammar med stor likhet i samma gren, medanstammar som är olika finns i olika grenar.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7Distances

KVARIANS

KKRISTINAE

MLUTEUS

SMR282

SMR283M101

M102

M109

M122

M126

M17

M32M35

M37M38

M46M47

M66

M67

M71

M72

M89

O1

O106

O12

O25O33

O37

O46O48

O50

O53O54

O72O73

O77

O83

G32

G74

U12

U2

U28

U30

U32

U33U34U35U36

U4U5U6U7

U79

U8

Figur 1. Dendrogram över API-resultat för mikrokockerna. Urval av stammar tillavdödningsförsök har gjorts för att få så stort spann som möjligt. API-resultat för typstammarfinns med som jämförelse. Dessa betecknas med namn eller SMR-nummer (Tabell 1).

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9Distances

SMR284

SMR285SMR287

SMR288

SMR289

SMR290SMR291

SMR292SMR293SMR294

SMR295

SMR296

G11

G15G19

G33

G42

G46

G54

G6

G83

M120

M127

M21M36

M39

M62

M81

M99

O104

O110

O14

O41

O44

O70

O8

O91

O95

U21U40

U43U51

U64

U66

U85

U88

Figur 2. Dendrogram över API-resultat för utvalda coryneforma bakterier. Urval av stammartill avdödningsförsök har gjorts för att få så stort spann som möjligt. API-resultat förtypstammar finns med som jämförelse. Dessa betecknas med SMR-nummer (Tabell 1).

6

Metod för värmeavdödning

KockerKockerna (U33, U28, M122, O54, O46, M72, G32, U5, G80, samt SMR283) ströks om påBHI-agar och inkuberades vid 30°C i 1.5 dygn. Ca 20 ml BHI-buljong i en 100 ml flaskaympades till svag grumling med bakterier från plattan. Flaskan inkuberades på skak (150 rpm)vid 30°C i ca 18 timmar. Tre x 2 ml utvuxen kultur överfördes till eppendorfrör ochcentrifugerades vid 12000 g ca 5 minuter. Supernatanten hälldes av och bakteriepelletenslammades upp i 1 ml Sörensen-buffert (67mM Na,K-fosfatbuffert, pH 7.0).Bakteriesuspensionen poolades ihop i ett rör och centrifugerades igen som ovan.Supernatanten hälldes av och bakterierna slammades upp i 1ml Sörensen-buffert pH 7.0.Bakteriehalten (ca 108-109 cfu/ml) på den färdiga suspensionen bestämdes genom utspädningoch ingjutning av 1ml i BHI-agar och användes som nollprov. Samma suspension användesför alla tre testtemperaturerna och förvarades i kylskåp under dagen.

Till en 300 ml E-kolv sattes 100 ml Sörensen-buffert, pH 7.0 och kolven sattes i ettvattenbad och tempererades till 62.8°C under omrörning (Bild 8). Då lösningen uppnåttönskad temperatur tillsattes 100µl av bakteriesuspensionen och klockan startades. Ett 1 mlprov togs ut sterilt vid 0.5, 1, 5, 10, 15, 30 och 60 minuter. Proven sattes omedelbart till 9 mlspädvatten (spädning –1) i ett rör som stod i isvatten. Proven fick stå där tills tid fanns attspäda (-2 till -8) och gjuta in 1ml i BHI-agar (Bild 9). Plattorna inkuberades vid 30°C.Avläsning gjordes efter 3 och 5 dygns inkubering.

Motsvarande försök gjordes vid 67.6°C med provuttag vid 0.5, 1, 2, 5, 10, 15 och 30minuter (för vissa stammar togs prov ut vid tider mellan de angivna) och vid 72.9°C medprovuttag vid 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 5 och 10 minuter (för vissa stammar togs prov ut vid tidermellan de angivna).

Efter avslutat avdödningsförsök gjordes en ny spridning på bakteriesuspensionen somanvändes för tillsats för att kontrollera att bakterieantalet inte ändrats under tiden försöketgenomförts.

Coryneforma bakterierDe coryneforma bakterierna (G6, U66, M36, U85, M99, O41, O44, U40, M81, O70, M62,M95 samt SMR284) ströks om på BHI-agar och inkuberades vid 30°C i 1.5 dygn. Ombakterieväxten på BHI-plattan var god ympades ca 20 ml BHI-buljong i en 100 ml flaska tillsvag grumling med bakterier från plattan. Flaskan inkuberades på skak (150 rpm) vid 30°C ica 18 timmar. Om växten på BHI-plattan var svag ströks en koloni om på Columbia-agar med5% fårblod (SVA). Bakterierna skördades från plattan genom att hälla på 2 ml Sörensen-buffert och suspendera växten i denna. Tre x 2 ml utvuxen kultur eller 2 ml skörd från plattaöverfördes till eppendorfrör och centrifugerades vid 12000 g ca 5 minuter. Supernatantenhälldes av och bakteriepelleten slammades upp i 1ml Sörensen-buffert . Bakteriesuspensionenpoolades ihop i ett rör och centrifugerades igen som ovan. Supernatanten hälldes av ochbakterierna slammades upp i 1ml Sörensen-buffert pH 7.0. Bakteriehalten (ca 108-109 cfu/ml)på den färdiga suspensionen bestämdes genom utspädning och ingjutning av 1ml i BHI-agaroch användes som nollprov. Samma suspension användes för alla tre testtemperaturerna ochförvarades i kylskåp under dagen.

Till en 300 ml E-kolv sattes 100 ml Sörensen-buffert, pH 7.0 och kolven sattes i ettvattenbad och tempererades till ca 70°C under omrörning (temperaturen varierade något förde olika stammarna) (Bild 8). Då lösningen uppnått önskad temperatur tillsattes 100µl avbakteriesuspensionen och klockan startades. Ett 1 ml prov togs ut sterilt vid 0.5, 2, 10, 15, 30och 45 minuter. Proven sattes omedelbart till 9 ml spädvatten (spädning –1) i ett rör som stod

7

i isvatten. Proven fick stå där tills tid fanns att späda (-2 till -8) och gjuta in 1ml i BHI-agar(Bild 9). Plattorna inkuberades vid 30°C. Avläsning gjordes efter 3 och 5 dygns inkubering.

Motsvarande försök gjordes vid ca 74°C (temperaturen varierade något för de olikastammarna) med provuttag vid 0.5, 2, 5, 10, 15, 20 och 30 minuter (för vissa stammar togsprov ut vid tider mellan de angivna) och vid ca 80°C (temperaturen varierade något för deolika stammarna) med provuttag vid 0.25, 0.5, 1, 2, 5 och 10 minuter (för vissa stammar togsprov ut vid tider mellan de angivna).

Efter avslutat avdödningsförsök gjordes en ny spridning på bakteriesuspensionen somanvändes för tillsats för att kontrollera att bakterieantalet inte ändrats under tiden försöketgenomförts.

Metod för diskning i lösning

Testade diskmedelAlkaliskt diskmedel: P3-Asepto flytande (Henkel-Ecolab) (NaOH 5-15%; Na-hypoklorit <5%aktivt klor; nonjonaktiv tensid <1%; organisk kompexbildare 1-5%). Rekommenderaddosering är 0.5dl/10 l (0,025-0,075% NaOH) för mjukt vatten och den har använts i försöken(bruksdisklösning). Diskmedlet späddes med sterilt kranvatten. En starttemperatur på >65°Crekommenderas av tillverkaren. I försöken har 68°C använts som högsta temperatur.Rekommenderad sluttemperatur är 42°C och den har använts som en av försöks-temperaturerna. Rekommenderad cirkulationstid är 8-10 minuter. Diskförsöken har gjortsinom 10 minuter.

Surt diskmedel: P3-Horolith BA flytande (Henkel-Ecolab) (fosforsyra >30%; nonjoniskatensider <5%; fosfonsyra<5%; stabilisatorer <5%). Rekommenderad dosering är 0.3 dl/10 loch den har använts i försöken (bruksdisklösning). Diskmedlet späddes med sterilt kranvatten.En starttemperatur på >65°C rekommenderas av tillverkaren. I försöken har 68°C använtssom högsta temperatur. Rekommenderad sluttemperatur är 42°C och den har använts iförsöken. Rekommenderad cirkulationstid är 8-10 minuter. Diskförsöken har gjorts inom 10minuter.

För att neutralisera diskmedlen efter behandling användes en neutraliseringsbuffertbestående av 0.25M Na/K-fosfatbuffert, pH 7.0 med 0.5% Na-tiosulfat.

FörförsökFör att kontrollera, att neutraliseringslösningen kunde neutralisera disklösningarna och att deninte påverkade bakterierna, gjordes ett antal förförsök. 1 ml av bruksdisklösningen (alkaliskrespektive sur) sattes till 9 ml neutraliseringslösning. pH testades med pH-sticka. 1mlbakteriesuspension (gjordes för kockerna U33, O54, M122 och coryneforma G6, M99, U66,M64, M95, G56, O59, U53) sattes till 9 ml neutraliseringslösning. Blandningen fick stå på is sålänge som man tror att den kommer att stå under avdödningsförsöket. Spädningsserie gjordes ispädvatten och spridning från lämpliga spädningar gjordes på BHI-agar.

Bakterier sattes till bruksdisklösning i samma koncentration som vid start avavdödningsförsöket med värme (se ovan). 1 ml överfördes omedelbart efter blandning till 9 mlneutraliseringslösning. Blandningen fick stå på is så länge som man tror att den kommer att ståunder avdödningsförsöket. Spädningsserie gjordes i spädvatten och spridning från lämpligaspädningar gjordes på BHI. Detta gjordes för samtliga testorganismer i både alkaliskt och surtdiskmedel.

Eftersom samtliga bakterier dog av mycket snabbt i försöken med disklösning irumstemperatur studerades effekten av diskmedel då mjölk finns som bakgrund. En”spädningsserie” 0.5, 1, 2, 5 och 10% standardmjölk i sterilt kranvatten gjordes. Standardmjölk

8

hälldes i en flaska och därefter hälldes mjölken ut och ersattes av motsvarande mängd vatten.Detta mjölkblandade vatten jämfördes sedan med ”spädningsserien” för att finna en nivå sommotsvarar ett tömt rör som ej sköljts före diskning. 0.5% motsvarades bäst (Bild 10).

Försöken med bakteriesuspension i disklösning gjordes om med 0.5 och 5% sterilstandardmjölk i bakgrunden. Det bestämdes att använda 1% standardmjölk som bakgrund idiskförsöken.

DiskförsökDiskförsök gjordes med kockerna U33, O54, M122 och coryneforma M95, G6, U66, M99,O59, G56, M64, U53. Bakterierna odlades upp på samma sätt som vid värmeavdödning. Deförsökstemperaturer som användes var 42 och 68°C. En 300 ml E-kolv med bruksdisklösning(alkalisk eller sur) innehållande 1% steril standardmjölk sattes under omrörning i vattenbadet.Då disklösningen nått rätt temperatur tillsattes 1 ml bakteriesuspension och klockan startades.1 ml prov togs ut vid 1, 5 och 10 minuter och sattes omedelbart till 9 ml neutraliseringsbuffert(spädning –1) som förvarades i isvatten. Proven späddes därefter med spädvatten (-2 till -8)och 1 ml göts in i BHI-agar. Plattorna inkuberades vid 30°C ca 5 dygn innan de räknades.

För några utvalda stammar gjordes försöken med provuttag vid fler tider och flertemperaturer. Med alkaliskt diskmedel testades kock U33 och coryneforma M95 och U66 vidrumstemperatur, 42, 60 och 67°C med mjölk i bakgrunden och vid 67°C utan mjölk. Prov togsut vid 0.25, 0.5, 1, 2, 5, och 10 minuter och behandlades som ovan. Även E. coli SMR702testades på samma sätt för att få en jämförelse med andra typer av bakterier. Med surtdiskmedel testades kockerna O54 och U33 samt coryneforma M95, G6, M99 och U66 vid 42,60 och 68°C. Prov togs ut vid 0.25, 0.5, 1, 2, 5 och 10 minuter och behandlades som ovan.

Diskförsök med enbart NaOH utfördes vid 42 och 68°C med M95 och U66. Halten NaOHi den färdiga disklösningen var 0.03 %. Försöken genomfördes som ovan men utan tillsats avmjölk.

Odling av biofilmFör att kontrollera förmåga att bilda biofilm odlades 11 pastöriseringsöverlevande isolat (U33,O54, G6, U66, M99, M95, M122, M64, G56, O59, U53), 3 Bacillus cereus stammar och enEscherichia coli i BHI i en 96-håls mikrotiterplatta vid 30°C i 22 timmar. Mediet hälldes avoch 300 µl kristallviolett-lösning (4 g/l i 20% (v/v) metanol) tillsattes och fick dra i 3 minuter.Färgen hälldes ut och brunnarna tvättades sedan 3 gånger försiktigt under rinnande vatten.300µl etanol tillsattes till brunnarna för att lösa upp eventuell bunden färg och mätninggjordes i spektrofotometer vid 340 och 620 nm. Ju mer färg som bundit desto bättre förmågaatt bilda biofilm. Metoden är modifierad från Kolari et al (2001).

Två kocker, U33 och O54, och 4 coryneforma, M95, M99, U66 och G6 valdes för att testaförmåga att bilda biofilm på objektsglas med och utan 1% standardmjölk. Sterila objektsglaslades i petriskålar och 30 ml steril Wirtanen-buljong (LabLemco powder 2.4g; Nutrient broth8.0g; sukros 50g; glukos 10g; fruktos 10g; 1000 ml destillerat vatten (Wirtanen, Husmark, &Mattila-Sandholm, 1996)) ympad med 0.3 ml bakteriesuspension (1 plastinösögla bakterierslammade i 1 ml Wirtanen-buljong) hälldes på. Skålarna inkuberades mörkt vidrumstemperatur i ca 5 dygn. Objektglasen togs upp med hjälp av steril pincett, doppades isterilt destillerat vatten och torkades av på undersidan innan de färgades med kristallviolett.Efter färgning sköljdes glasen försiktigt med destillerat vatten och fick sedan lufttorka. Denblå färgen visade hur mycket film som bildats på glasen (Bild 11).

9

Metod för diskning av biofilmFör diskförsök valdes kockerna U33, M122, O54 och coryneforma M95, M99, G6, U66 (O54,G6 och U66 endast utan mjölk). Biofilmerna odlades som ovan. Disk gjordes i glasvannormed omrörning (Bild 12). Vannorna innehöll disklösning av alkaliskt eller surt diskmedelmed eller utan 1% steril standardmjölk. Dessa sattes i vattenbad vid 42°C eller 68°C ochtempererades ca 1 timme. Två objektsglas sattes ned i varje vanna (en vanna för varjeprovtagningstid). Vid 1, 5 och 10 minuter togs 2 objektsglas upp med hjälp av steril pincettoch lades i 30 ml neutraliseringsbuffert i sterila petriskålar. Därefter svabbades glasen med 2sterila bomullstops fuktade med spädvatten som därefter sattes i spädvattenrör (Bild 13). Tvåicke disklösningsbehandlade objektglas med biofilm lades i neutraliseringsbuffert ochsvabbades som de behandlade och fick utgöra nollprov. En spädningsserie gjordes ochytspridning gjordes på BHI-agarplattor. Dessa inkuberades vid 30°C i 5 dygn innan deavlästes. Antalet cfu beräknades per cm2 objektglasyta.

Biofilmer av M95 och U33 diskades också enbart med NaOH vid 41 och 65 respektive63°C. Halten NaOH i den färdiga disklösningen var 0.03%. Försöken utfördes som ovan.Ingen tillsats av mjölk gjordes.

Analys av värmeresistenta bakterier i spånObegagnat och begagnat sågspån samt tankmjölk inhämtades från Alnarps mellangård (SLU).25 g spån vägdes in i stomacherpåse och 225 g peptonvatten tillsattes. Proven Stomacher-behandlades i 1 minut. 10 ml prov eller 10 ml mjölk överfördes till sterila glasrör ochvärmebehandlades på samma sätt som mjölkproven i den första provtagningen. På ytan avBHI-agarplattor spreds 0.1 ml av direkt och spädning –1 från mjölkproven och direkt tillspädning –4 för spånproven. Plattorna inkuberades vid 30°C i 3 dygn före avläsning. Ca 5kolonier plockades från varje prov och jämfördes med tidigare isolat.

Resultat och Diskussion

Analys av leverantörsprovPå våren 2001 togs prover in från 93 olika leverantörer (ca 1 linje per varje mejeriförening)och analyserades med avseende på totalantal och pastöriseringsöverlevande bakterier (seBilaga 1). Enligt amerikanska rekommendationer bör antalet bakterier i mjölken efterlågpastörisering, vid 72°C i 15 sekunder, inte överstiga 200/ml mjölk(http://www.uwex.edu/milkquality/PDF/A3705.pdf). Ett högre antal tyder på hygienproblem.Av de 93 analyserade mjölkproven hade 27 halter efter värmebehandling på mer än 200/ml(Tabell 2). Tio av dessa hade >1000 per ml. Andelen gårdar med förhöjda halter var alltså29% och 11% hade kraftigt förhöjda halter (>1000/ml). Linjen vid Mejeri 1 har procentuelltsett fler leverantörer med halter som överstiger 200/ml, 48% jämfört med 20% för de övriga 3linjerna. Denna linje skiljer sig markant från de övriga. Fler linjer från varje mejeri skullebehöva undersökas för att se om det är denna linje som utmärker sig eller om det finns en mersystematisk skillnad mellan Mejeri 1:s leverantörer och de övrigas med avseende påpastöriseringsöverlevande bakterier.

Förhöjt totalantal (>20000/ml) förekom hos 22 av leverantörerna (Tabell 2). Av dessa hade12 också >200 pastöriseringsöverlevande bakterier per ml mjölk. Femton leverantörer hadealltså lågt totalantal (<20000/ml) men högt antal pastöriseringsöverlevande (>200/ml) (Tabell2). Dessa utgör 55% av de som hade högt totalantal. Det är tydligt att analys av totalantaletbakterier inte räcker för att finna de leverantörer som har högt antalpastöriseringsöverlevande bakterier i mjölken.

10

Tabell 2. Fördelning av proven i olika kategorier baserat på halt pastöriseringsöverlevandebakterier och totalantal, uppdelat på de olika mejerierna och totalt.

Mejeri 1 Mejeri 2 Mejeri 3 Mejeri 4 Totalt

Antal undersökta leverantörsprov 29 26 21 17 93

Antal med <200/ml avpastöriseringsöverlevande bakterier 15 19 18 14 66

Antal med 200-<500/ml 5 3 1 1 10

Antal med 500-<1000/ml 4 2 0 0 6

Antal med >1000/ml 5 2 2 2 11

Antal med högt totalantal>20 000/ml 10 0 7 5 22

Antal med högt på båda>20 000/ml/>200/ml 8 0 3 1 12

Lågt totalantal/hög haltpastöriseringsöverlevande >200/ml 6 7 0 2 15

Högt totalantal/låg haltpastöriseringsöverlevande <200/ml 2 0 4 4 10

Våren 2003 togs nya prov in från 11 av leverantörerna som hade >500 bakterier per ml eftervärmebehandling 2001 (resultatet redovisas ej). Samtliga hade fortfarande högt antal bakterierefter värmebehandling. Några hade till och med högre antal än vid det förstaprovtagningstillfället. Detta tyder på att om man fått en etablering avpastöriseringsöverlevande bakterier så måste man vidtaga särskilda åtgärder för att bliav med problemet. Om man inte gör detta så snarare förvärras det med tiden.

Karaktärisering av isolatFrån de 93 leverantörsproven isolerades 421 olika bakteriestammar. Isolat togs från samtligaprov där denna typ av bakterier förekom för att se om det fanns någon skillnad i bakteriefloramellan gårdar som hade höga respektive låga halter pastöriseringsöverlevande bakterier.Isolaten karakteriserades genom mikroskopering, katalas- och oxidastest, Gram-färgning,utseende på blodagar, lysostaphin-resistens och API. Av isolaten fanns 17% vara kocker, 12%sporbildande Bacillus-arter och 71% coryneforma bakterier (Tabell 3; Bilaga 1). Blandisolaten från Mejeri 1:s leverantörer fanns något fler sporbildande Bacillus än hos de övriga.Det var vanligare att samtliga isolat var coryneforma från leverantörsmjölk med högt antalpastöriseringsöverlevande bakterier än från mjölk med lågt antal (Fisher exact test, p=0.05)

Kockerna dominerades av katalas-positiva isolat och de flesta identifierades efter analysmed API till släktena Micrococcus och Kocuria, men även en del icke-patogenaStaphylococcus spp. hittades. Dessa utgör en del av kons normala hudflora. Det inbördessläktskapet mellan mikrokockerna illustreras i Figur 1 genom ett dendrogram baserat på API-data. Mikrokockerna är oftast gula och växer tjockt på BHI-agarplattorna (Bild 1). Imikroskop är de stora och runda och bildar par eller sitter ihop 4 och 4. Isolaten från Mejeri3:s leverantörer avvek något genom att fler av kockerna var katalas-negativa alltså av släktenaStreptococcus, Lactococcus eller Enterococcus (Bilaga 1). Även en del av dessa kan finnas

11

naturligt på kons hud. Dessa växer mycket tunnare på plattorna än mikrokockerna ochformerar sig i kedjor eller par i mikroskop. De kan även vara litet ovala i formen i kedjorna.

Bland de sporbildande bakterierna dominerade arterna Bacillus licheniformis och Bacilluspumilus. B. licheniformis har ett karaktäristiskt utseende på agarplatta genom att först varaslemmig och sedan torr och hopskrumpen (Bild 4). B. pumilus har på blodagar en grönaktigton på hemolysen (Bild 3), men det finns även andra Bacillus-arter som kan uppvisa grönhemolys. Båda dessa arter är vanliga i kons omgivning. De finns i jord, bäddmaterial och ifoder och hamnar i mjölken främst genom att sporerna fastnar på kons spenar då hon liggerner. Även de övriga Bacillus-arterna som hittades är vanliga i kons omgivning (Bilaga 1). B.licheniformis tillhör de mer värmetåliga av Bacillus-arterna och är känd som kontaminant vidpulvertillverkning (Ronimus, Parker, Turner, Poudel, Rückert, & Morgan, 2003). Dennabakterieart har varit inblandad i ett dödsfall orsakat av felbehandling av välling (Salkinoja-Salonen, Vuorio, Andersson, Kämpfer, Andersson, Honkanen-Buzalski et al., 1999). Toxinetsom var orsak till dödsfallet är besläktat med det emetiska toxinet hos Bacillus cereus(orsakar kräkning). Även vissa B. pumilus stammar kan bilda liknande toxiner (våra resultat).

Tabell 3. Antal isolat och fördelning på olika bakteriegrupper frånleverantörer som levererar till de olika mejerierna

Antal isolat Kocker (%) Bacillus (%) Coryneforma (%)Mejeri 1 133 23 (17) 26 (19) 84 (63)Mejeri 2 111 19 (17) 6 ( 5) 86 (77)Mejeri 3 85 12 (14) 10 (12) 63 (74)Mejeri 4 92 17 (18) 8 ( 9) 67 (73)Totalt 421 71 (17) 50 (12) 300 (71)

De coryneforma bakterierna utgjordes främst av Microbacterium/Cellulomonas spp. Vi harinte haft möjlighet att särskilja vilket släkte de tillhör. Mest troligt är dock släktetMicrobacterium då dessa är en vanlig typ av bakterier på hud och har tidigare isolerats frånmjölk. Cellulomonas är bakterier som bryter ned cellulosa och dessa skulle kunna finnas ibäddmaterial som t.ex. sågspån. Släktskapet mellan de coryneforma isolaten kan ses idendrogrammet i Figur 2. De coryneforma bakterierna är liksom mikrokockerna ofta gula,men de växer tunnare på BHI-plattorna (Bild 2). Bakteriemassan är blank och litet halvtgenomskinlig. I mikroskop är de coryneforma oftast små. I unga kulturer (1 dygn) ärbakterierna längre än i något äldre (3 dygn). Det finns särskilt i de yngre kulturerna ofta bådelånga och korta celler i samma preparat när man tittar i mikroskop. Det gör att ävenrenkulturer kan upplevas som orena. Ofta ser man bakterier som två och två bildar ett V.Detta är typiskt för många coryneforma bakteriers sätt att dela på sig. Vissa av decoryneforma växer mycket tunt på plattorna och ser i mikroskop ut som kinesiska tecken ellersom ”ballongdjur” och de enskilda bakterierna är mycket större än för de coryneforma somger en gul och kraftigare växt på platta.

Endast 7 av 421 isolat var potentiella patogener. Dessa var av arten Arcanobacteriumhaemolyticum enligt API-analysen. Bakterier inom släktet Arcanobacterium har varit orsaktill mastiter (Milne, Barrett, Fitzpatrick, & Biggs, 2002). De 7 isolaten kom alla från olikamjölkprov och inom respektive mjölkprov fanns endast ett isolat som var presumtivtArcanobacterium så halten av dem var sannolikt låg. Dessutom hade 5 av proven låga halter,<100/ml, av pastöriseringsöverlevande bakterier. Troligen beror deras närvaro inte på mastit,med tanke på den låga halten.

Avsikten med karakteriseringen var dels att fastställa vad det var för typer av bakterier somdominerar i värmebehandlade mjölkprov. Genom att veta vilka bakterier det rör sig om kanman även dra slutsatser om var de kommer i från och även om var man kan sätta in åtgärder

12

för att bli av med dem. De flesta isolaten visade sig tillhöra den normala hudfloran man hittarhos kor. Man kan inte bli av med dessa bakterier helt eftersom de utgör en stor del av konsnormala hudflora. I halter upp till 200/ml är det helt normalt att de förekommer i mjölken. Vidhögre halter har dessa bakterier fått möjlighet att etablera sig och växa till imjölkningsutrustningen. Detta extra tillskott är möjligt att bli av med genom att ha endiskrutin som avlägsnar bakterierna från utrustningen. Karakteriseringen var också nödvändigför att kunna välja representativa stammar av olika bakteriegrupper för test avvärmekänslighet och diskmedelskänslighet och förmåga att bilda biofilmer.

VärmeavdödningFör värmeavdödning valdes 9 kocker och 12 coryneforma bakterier. Några kom från gårdarmed högt antal och några från gårdar med lågt antal pastöriseringsöverlevande bakterier föratt se om det fanns någon skillnad i värmetålighet mellan dem. Testtemperaturerna har lagtsrunt temperaturen för lågpastörisering (72°C) för att se om det var möjligt att ändra på tideller temperatur för att minska antalet bakterier i mjölken efter pastörisering. D- och z-värdenberäknades för respektive isolat då så var möjligt. D-värdet är den tid vid en given temperatursom krävs för att avdöda 90% av en bakteriepopulation. Z-värdet är det antal grader sommåste läggas till för att minska D-värdet med 90%.

Kockerna värmebehandlades vid 63, 67 och 73°C (Tabell 4). D-värdena vid 63°C lågmellan 0.16 och 90 minuter, vid 67°C mellan <0.01 och 7 minuter och vid 73°C mellan <0.01och 1.4 minuter. Exempel på avdödningskurva visas i Figur 3. Mikrokockerna var mervärmetåliga än den stafylokock (G80) som testades. M122 och O54 kom från gårdar med högtantal pastöriseringsöverlevande bakterier, men var inte mer värmetåliga än U33 och U28 somkom från gårdar med lågt antal (Tabell 4).

Tabell 4. D-värden och z-värden för kocker vid avdödningmed värme i Sörensens-buffert.Stamnummer

D-värde (min)62,8°C

D-värde (min)67,6°C

D-värde (min)72,9°C

Z-värde(°C)

U33 45.45 3.72 1.40 6.8U28 90.90 6.71 0.82 4.9M122 31.25 3.31 0.63 6.0O54 25.64 2.59 0.92 7.0O46 1.50 1.21 i.u. i.u.M72 2.55 1.20 i.u. i.u.G32 1.73 0.43 i.u. i.u.U5 2.79 i.u. i.u. i.u.G80 0.16 i.u. i.u. i.u.SMR283 11.76 1.22 0.63 8.0i.u. inte utfört

De coryneforma bakterierna beräknades vara mer värmetåliga än kockerna ochvärmebehandlades därför vid högre temperatur. Den höga temperaturen gjorde att det varsvårt att hålla exakt samma temperatur för alla isolaten, därför varierar temperaturen förvärmebehandlingen något mellan isolaten (Tabell 5). Vid ca 69°C uppmättes D-värden påmellan 13 och 1000 minuter, vid ca 73°C låg D-värdena på 0.74-62.5 minuter och vid ca 80°Cuppmättes D-värden på 0.3-7 minuter. Exempel på avdödningskurva visas i Figur 3. Liksomför kockerna sågs ingen markant skillnad i värmetålighet mellan Microbacterium/Cellulomonas-isolat från gårdar med högt antal pastöriseringsöverlevande bakterier (M36,

13

U85, M99, M95) jämfört med motsvarande isolat från gårdar med lågt antal (G6, O41, O44,U40, M81, M62) (Tabell 5). O70 var mindre värmetålig än de övriga coryneformabakterierna. U66 (Arcanobacterium) uppvisade hög värmetålighet.

Tabell 5. D- och z-värden för coryneforma bakterier vid avdödning med värme iSörensens-buffert.Stamnummer

Temperatur(°C)

D-värde(min)

Temperatur(°C)

D-värde(min)

Temperatur(°C)

D-värde(min)

z-värde(°C)

SMR284 68.0 142.86 72.6 20.83 79.7 3.01 7.1G6 68.1 83.33 72.8 4.90 79.9 0.34 5.0U66 68.1 1000.00 72.8 62.50 79.3 7.30 5.3M36 70.8 62.50 75.6 2.08 80.2 0.31 4.1U85 71.0 125.00 75.8 3.30 80.0 0.64 3.9M99 70.7 166.67 75.0 5.59 80.0 0.63 3.9O41 70.6 15.15 74.9 3.68 80.4 0.69 7.3O44 69.8 50.00 73.9 16.95 76.8 6.62 5.6U40 65.2 12.05 70.0 2.09 74.8 0.46 6.8M81 69.4 15.15 74.7 2.28 77.8 0.89 6.8O70 61.8 0.53 70.5 0.20 74.8 0.05 13.5M62 68.9 13.16 72.7 0.74 77.4 0.29 5.2M95 68.6 1.51 73.2 0.90 78.0 0.78 33.3

De uppmätta D- och z-värdena visar att det inte går att öka temperaturen eller tiden vidlågpastörisering på mejeriet för att minska antalet värmetoleranta bakterier utan att påverkasmak och kvalitet på produkterna. För att bli av med problemet i produkterna måste antaletpastöriseringsöverlevande bakterier i mjölken minskas redan på gården.

Kock U33

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40 50 60

Tid i minuter

log

cfu/

ml

62,8°C67,6°C72,9°C

Coryneform M99

0

2

4

6

8

10

0 10 20 30 40 50

Tid i minuter

log

cfu/

ml

70,8°C75°C80°C

Figur 3. Exempel på avdödningskurvor för en kock och en coryneform bakterie.Avdödningen är utför i buffert under omrörning vid olika temperaturer.

Diskförsök i lösningFör diskförsök valdes 3 kocker och 8 coryneforma stammar bland de tidigarevärmebehandlade isolaten. Diskmedlen som testades var P3-Asepto flytande (Henkel-Ecolab),alkaliskt diskmedel som även innehåller klor och P3-Horolith BA flytande (Henkel-Ecolab),surt diskmedel. Diskmedlen doserades enligt tillverkarens rekommendationer. Detemperaturer som valdes var 42 och 68°C för att avspegla rekommenderad slut- ochstarttemperatur. Tyvärr fanns ingen möjlighet att ändra temperaturen under ”diskförloppet”för att motsvara vad som händer i mjölkningsanläggningen, utan all ”disk” har skett vidkonstant temperatur.

14

Corynefom M95 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Kock U33 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Coryneform G6 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Coryneform U66 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Kock O54 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Coryneform M99 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Coryneform O59 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Kock M122 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Coryneform G56 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Coryneform M64 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

Coryneform U53 med mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml alk42°C

alk68°C

surt42°C

surt68°C

NaOH utan mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10Tid i minuter

log

cfu/

ml M95 42°C

M95 68°C

U66 42°C

U66 68°C

Figur 4. Diskförförsök i lösning med alkaliskt diskmedel med klor och surt diskmedel. Förtvå stammar har även disk med enbart 0,03% NaOH utförts.

15

En neutraliseringsbuffert gjordes för att neutralisera disklösningen direkt efter provuttagfrån kolven. Detta är nödvändigt eftersom diskmedlet annars skulle fortsätta att ha enhämmande effekt på bakterierna även på plattorna i de minst utspädda proven och man skullefå ett helt felaktigt resultat. Neutraliseringsbufferten hade i sig själv ingen effekt påbakterierna enligt de förförsök som gjordes.

Ett förförsök visade att alla stammarna utom en (M95) dog mer eller mindre omedelbart dåde sattes till disklösningen i rumstemperatur. Tester gjordes med tillsats av mjölk som skullemotsvara den mängd mjölk som kan finnas i anläggningen om ingen eller dålig försköljninggjorts. En bättre överlevnad uppnåddes och det beslutades att 1% mjölk skulle tillsättas tilldisklösningen för diskförsök med värme.

För samtliga teststammar gjordes disk med alkaliskt och surt diskmedel vid 42 och 68°Cmed provuttag vid 1, 5 och 10 minuter. Försöken visar att både alkaliskt och surt diskmedelreducerar antalet bakterier med 4-8 logenheter inom 10 minuter vid båda temperaturerna förde flesta stammarna (Figur 4). För U66 och U53 var reduktionen lägre än för de övriga vid68°C i alkaliskt diskmedel, 1 respektive 3 logenheter. Ett förvånande resultat var att församtliga stammar utom O54 hade det alkaliska diskmedlet med klor bättre effekt påbakterierna vid 42°C än vid 68°C. Ett avdödningsförsök gjordes med M95 och U66 medenbart natriumhydroxid i motsvarande koncentration som i det alkaliska diskmedlet vid 42och 68°C. Natriumhydroxiden hade enbart effekt på M95 vid 68°C. Så den avdödandeeffekten man såg med diskmedlet beror förmodligen på kloret. Hypokloriten i klordiskmedelkan omvandlas på två olika sätt, i det ena fallet bildas en aktiv substans som ärbakteriedödande och i det andra fallet bildas en inaktiv substans. Det är möjligt att det bildasmer av den aktiva substansen vid 42°C än vid 68° och att det är därför man ser en större effektav kloret vid den lägre temperaturen. Men efter 8-10 minuter har man ändå fått en brareduktion av antalet bakterier. Det sura diskmedlet hade däremot i samtliga fall en bättreeffekt vid den högre temperaturen.

Två coryneforma bakterier (M95 och U66) och en kock (U33) valdes ut för mer detaljeradediskförsök med alkaliskt diskmedel med klor och mjölkrester i disklösningen. Prov togs ut vidfler tidpunkter och effekt vid fyra olika temperaturer (rumstemperatur, 42°C, 60°C och 67°C)studerades. Vid 67°C gjordes även försök utan mjölk i bakgrunden med M95 och U33.Resultaten redovisas i Figur 5. för de två coryneforma bakterier var avdödningen effektivastvid 42 och 60°C. Medan 60°C hade sämst effekt för kocken. Både M95 och U33 avdödadeseffektivt då mjölk inte fanns med i bakgrunden. Som jämförelse gjordes ett motsvarandediskförsök med Escherichia coli (Figur 5). E. coli bakterierna var betydligt känsligare fördiskmedlet än de pastöriseringsöverlevande bakterierna oberoende av temperatur.

Mer detaljerade diskförsök gjordes även med surt diskmedel och med mjölk idisklösningen (Figur 6). Försöken gjordes vid 42, 60 och 67°C. Samtliga testadebakteriestammar avdödades effektivast vid högre temperatur. De coryneforma bakteriernaM95, M99 och U66 var något mindre känsliga vid 42°C än de övriga.

Slutsatserna man kan dra är att försköljning är viktigt eftersom mjölkrester idiskvattnet ökar överlevnaden hos bakterierna. Dålig montering av rörledningar medsvackor som följd bidrar också till att öka halten mjölkrester i diskvattnet även omförsköljning gjorts. Om man följer de rekommendationer som finns vad gäller dosering,temperatur och tid för disk så bör man klara att avdöda denna typ av bakterier så längede befinner sig i lösning. Även om temperaturen på diskvattnet sjunker under cirkuleringen.Underhållvärmning kan behövas för att vattentemperaturen inte ska sjunka allt för mycket. Ivåra försök har vi inte haft möjlighet att variera temperaturen under försökets gång för attmotsvara den avsvalning av vattnet som sker under cirkulationsdisk imjölkningsanläggningen.

16

Coryneform M95 alkaliskt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10Tid i minuter

log

cfu/

ml rumstemp

42°C

60°C

67°C

67°C-mjölk

Kock U33 alkaliskt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml rumstemp

42°C

60°C

67°C

67°C-mjölk

Coryneform U66 alkaliskt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml rumstemp

42°C

60°C

67°C

Escherichia coli SMR702 alkaliskt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10Tid i minuter

log

cfu/

ml rumstemp

42°C

60°C

67°C

Figur 5. Diskförsök i lösning med alkaliskt diskmedel med klor. E. coli har tagits med somjämförelse till de mer tåliga pastöriseringsöverlevande bakterierna. För M95 och U33 gjordesäven försök utan tillsats av mjölk.

Diskförsök med biofilmerDe bakterier som användes i diskförsöken testades för förmåga att bilda biofilm. Samtligabildade film. Två kocker (U33 och M122) och två coryneforma bakterier (M95 och M99)valdes för avdödning av biofilm. Avdödning skedde vid 42 och 64°C med och utan mjölk i

17

Coryneform M95 surt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml 42°C

62°C

67°C

Coryneform G6 surt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml 42°C

60°C

68°C

Kock O54 surt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml

42°C

60°C

67°C

Coryneform M99 surt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml 42°C

60°C

67°C

Kock U33 surt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml

42°C

60°C

67°C

Coryneform U66 surt diskmedel med mjölk

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 10

Tid i minuter

log

cfu/

ml 42°C

60°C

67°C

Figur 6. Diskförsök i lösning med surt diskmedel.

disklösning och med både alkaliskt och surt diskmedel. För ytterligare en kock (O54) och tvåcoryneforma (G6 och U66) gjordes diskförsök utan mjölk. Biofilm odlades på objektsglas isärskilt slembildande medium. Alla prov gjordes som dubbelprov för att minska variationenmellan olika glas. Glasen lades i neutraliseringsbuffert efter behandling i diskmedlen och

18

Biofilm coryneform M99 utan m jölk

012345678

0 5 10

Tid i m inuter

log

cfu/

cm2 alk 41,5°C

alk 64,2°C

sur 41.5°C

sur 64.2°C

Biofilm kock U33 utan mjölk

012345678

0 5 10

Tid m inuter

log

cfu/

cm2 alk 41,4°C

alk 63.8°C

sur 41.4°C

sur 63,8°C

Biofilm coryneform M95 utan m jölk

012345678

0 5 10

Tid i m inuter

log

cfu/

cm2 alk 41,6°C

alk 64.4°C

sur 41.6°C

sur 64,4°C

Biofilm coryneform M95 1% mjölk

012345678

0 5 10

Tid i m inuter

log

cfu/

cm2 alk 41,6°C

alk 64.2°C

sur 41.6°C

sur 64,2°C

Biofilm kock U33 1% mjölk

012345678

0 5 10

Tid i m inuter

log

cfu/

cm2 alk 41,4°C

alk 64.2°C

sur 41.4°C

sur 64,2°C

Biofilm coryneform M99 1% mjölk

012345678

0 5 10

Tid i m inuter

Log

cfu/

cm2 alk 41,5°C

alk 64.2°C

sur 41.5°C

sur 64,2°C

Biofilm kock M122 utan m jölk

012345678

0 5 10

Tid i m inuter

log

cfu/

cm2 alk 41,4°C

alk 64.4°C

sur 41.4°C

sur 64,4°C

Biofilm kock M122 1% mjölk

012345678

0 5 10

Tid i m inuter

log

cfu/

cm2 alk 41,6°C

alk 64.4°C

sur 41.6°C

sur 64,4°C

Figur 7. Diskförsök med biofilm med alkaliskt diskmedel med klor och surt diskmedel, medoch utan tillsats av 1% mjölk till disklösningen.

19

Biofilm kock O54 utan mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10

Tid i minuterlo

g cf

u/cm

2

alk 41,4°C

alk 63.4°C

sur 41.4°C

sur 63,4°C

Biofilm coryneform G6 utan mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10

Tid i minuter

log

cfu/

cm2

alk 41,4°C

alk 64.7°C

sur 41.4°C

sur 64,7°C

Biofilm coryneform U66 utan mjölk

0

2

4

6

8

0 5 10

Tid i minuter

log

cfu/

cm2

alk 41,4°C

alk 64.2°C

sur 41.4°C

sur 64,2°C

Figur 8. Diskförsök med biofilm med alkaliskt diskmedel med klor och surt diskmedel utantillsats av mjölk till disklösningen.

svabbades sedan med fuktade sterila bomullstops. Resultaten uttrycks som cfu/cm2. I Figur 7,8 och 9 visas resultaten av försöken.

Biofilmerna av samtliga bakterier överlevde disk bättre än bakterierna i lösning. Enreduktion på 6-log uppmättes på 10 minuter för alkaliskt diskmedel med klor utan mjölk idisklösningen vid 41°C, och vid 64°C var reduktionen 6-log på 5 minuter (Figur 7 och 8). Dåmjölk fanns med i disklösningen nåddes bara en reduktion på 1-3-log på 10 minuter vid 41°C,medan alkaliskt diskmedel vid den högre temperaturen (64°C) hade nästan samma avdödandeeffekt som utan mjölk. Surt diskmedel vid låg temperatur var genomgående sämre på attavdöda biofilm än alkaliskt diskmedel med klor eller surt vid högre temperatur (Figur 7och 8). Reduktionen för det sura diskmedlet vid 41°C utan mjölk var 2-5-log på 10 minuteroch med mjölk 1-3-log på 10 minuter. Vid den högre temperaturen (64°C) nåddes en brareduktion av antalet bakterier både utan mjölk (6-log på 1 minut) och med mjölk (6-log på 5minuter). Men vid diskning med surt diskmedel satt biofilmen fortfarande kvar på glaset

20

även om bakterierna var döda. När man diskade med alkaliskt diskmedel med klorlossnade filmen däremot från glaset.

För att ta reda på om det är kloret eller natriumhydroxiden i det alkaliska diskmedlet somfår filmen att lossna gjordes diskförsök med biofilm av coryneform M95 och kock U33 medenbart natriumhydroxid. Båda biofilmerna fanns kvar som rester på glasen efter behandling.Resterna av M95 upplevdes som mer slemmig än U33. Detta kan bero på lysering av M95.Avdödningen av U33 var 1-log på 10 minuter vid 41°C och 3-log på 10 minuter vid 63°C(Figur 9). För M95 var avdödningen 3-log på 10 minuter vid 41°C och 6-log på 5 minuter vid65°C (Figur 9). Detta stämmer med att M95 verkar lysera i större utsträckning än U33.Resultaten tyder också på att det behövs någon form av oxiderande ämne som klor föratt avlägsna biofilmer från ytan vid disk.

Biofilm coryneform M95 NaOH

012345678

0 2 4 6 8 10 12

Tid (min)

log

cfu/

m2

41°C65°C

Biofilm kock U33 NaOH

012345678

0 2 4 6 8 10 12

Tid (min)

log

cfu/

m2

41°C63°C

Figur 9. Diskförsök med biofilm med enbart NaOH. Ingen tillsats av mjölk har skett.

Försöken visar att om man följer de rekommendationer som finns avseende dosering,temperatur och tid så klarar man att avdöda även biofilmer, förutsatt att disklösningenkommer åt biofilmen. Möjligen kan den rekommenderade sluttemperaturen på 42°C vara iunderkant. Man bör därför ha så hög starttemperaur som möjligt för att temperaturen undercirkulationsdisken inte ska sjunka alltför lågt. I den fältundersökning Svensk Mjölk gjort fannman att gårdar med hög starttemperatur, underhållsvärme och hög sluttemperatur (>45°C) viddisk genomgående hade lägre halter pastöriseringsöverlevande bakterier i mjölken(Christiansson, Svensson, Ekelund, Gyllenswärd & Andersson, 2003). Någon form avoxiderande ämne behövs också i disklösningen för att avlägsna biofilmer från ytorna ianläggningen. De litet olika effekterna som det sura och alkaliska diskmedlet har påbakterierna indikerar också att det är bra med växeldisk. Mjölkrester ger en ökadöverlevnad, vilket indikerar att försköljning för att minska mjölkrester i anläggningen vid diskär viktig. I våra försök har disken skett vid statisk temperatur och utan någon mekanisk effekt,men det ger ändå en bild av vad denna typ av bakterier kan tänkas tåla. Det skulle ändå varaönskvärt att göra försök där påverkan av både temperatursänkningen och den mekaniskaeffekten kan mätas.

Värmeresistenta bakterier i spånProv på obegagnat och begagnat spån, samt tankmjölk togs in från Alnarps mellangård för attse om de pastöriseringsöverlevande bakterierna var vanliga i spån. Antalet bakterier eftervärmebehandling av mjölken var 320/ml. I det obegagnade spånet hittades bara Bacillus-arter efter värmebehandling. I begagnat spån hittades mest kocker, men även coryneformabakterier och sporbildande Bacillus fanns i det begagnade spånet efter värmebehandling. Imjölken hittades enbart coryneforma bakterier. Resultatet stödjer att kockerna och decoryneforma bakterierna inte främst kommer från strömaterialet, utan kommer frånkon. Dominansen av kocker i det begagnade spånet tyder på att dessa är mest

21

konkurrenskraftiga bland de pastöriseringsöverlevande bakterierna i förhållande till alla deandra bakterier som förekommer i den miljön. Att de coryneforma bakterierna dominerar imjölken efter värmebehandling tyder på att man selekterar för dessa i mjölknings-anläggningen.

SlutsatserAv de undersökta leverantörerna hade 29% förhöjda halter av pastöriseringsöverlevandebakterier i mjölken. Den termotoleranta floran dominerades av coryneforma bakterier. Omman följer de rekommendationer för disk som finns idag med avseende på dosering, disktid,start- och sluttemperatur bör man klara att avdöda de pastöriseringsöverlevande bakterierna.Möjligen kan den rekommenderade sluttemperaturen på 42°C vara något låg. Sköljning avmjölkningsanläggningen innan disk är mycket viktig för att få optimal effekt av diskmedlen.Förekomst av svackor kan medföra att mjölkrester finns kvar i anläggningen även efterförsköljning och kan negativt påverka diskeffekten. Biofilmer av bakterier är mycket merresistenta mot disk än bakterierna i lösning. Det är därför viktigt att förhindra att bakteriernafår möjlighet att bilda biofilm. I en anläggning som är ren från mjölkrester finns sämremöjligheter för bakterierna att få fäste.

TackVi riktar ett tack till de personer som hjälpt till med insamling av prov från gårdarna. Och tillreferensgruppen för givande diskussioner.

22

ReferenserAngula, L., Lorenzo, A., & Riveiro, M. (1989). Isolation and identification of thermoduric

flora of raw cow´s milk from the Province of Pontevedera. Modern MicrobiologicalMethods for Dairy Products., International Dairy Federation Special Issue No. 8901,122-128.

Bergey (1986). Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2.: Williams & Wilkins.Christiansson, A., Bertilsson, J., & Svensson, B. (1999). Bacillus cereus spores in raw milk:

Factors affecting the contamination of milk during the grazing period. Journal of DairyScience, 82, 305-314.

Christiansson, A., Svensson, B., Ekelund, K., Gyllenswärd, M. & Andersson, I. 2003.Förekomst av pastöriseringsöverlevande bakterier i leverantörmjölk - en fältstudie.Svensk Mjölk Forskning Rapport nr. 7031-I.

FDA (1992). Bacteriological Analytical Manual.Kolari, M., Nuutinen, J., & Salkinoja-Salonen, M. S. (2001). Mechanisms of biofilm

formation in paper machine by Bacillus species: the role of Deinococcus geothermalis.Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 27, 343-351.

Mackenzie, E. (1973). Thermoduric and psychrotrophic organisms on poorly cleansedmilking plants and farm bulk milk tanks. Journal of Applied Bacteriology, 36, 457-463.

Milne, M., Barrett, D. C., Fitzpatrick, J. L., & Biggs, A. M. (2002). Prevalence and aetiologyof clinical mastitis on dairy farms in Devon. Veterinary Record, 151, 241-243.

Ronimus, R. S., Parker, L. E., Turner, N., Poudel, S., Rückert, A., & Morgan, H. W. (2003).A RAPD-based comparison of thermophilic bacilli from milk powders. InternationalJournal of Food Microbiology, 85, 45-61.

Salkinoja-Salonen, M. S., Vuorio, R., Andersson, M. A., Kämpfer, P., Andersson, M. C.,Honkanen-Buzalski, T., & Scoging, A. C. (1999). Toxigenic strains of Bacilluslicheniformis related to food poisoning. Applied and Environmental Microbiology, 65,4637-4645.

SYSTAT®, Statistics I, Version 9.0. 1999. SPSS, Inc, Chicago IL.Thomas, S. B., Druce, R. G., Peters, G. J., & Griffiths, D. G. (1967). Incidence and

significans of thermoduric bacteria in farm milk supplies: A reappraisal and review.Journal of Applied Bacteriology, 30, 265-298.

Wirtanen, G., Husmark, U., & Mattila-Sandholm, T. (1996). Microbial evaluation of thebiotransfer potetial from surfaces with Bacillus biofilms after rinsing and cleaningprocedures in closed food processing systems. Journal of Food Protection, 59, 727-733.

23

Bilaga 1.

Mejeri 1Leverantör Rörnr. Arbetsnr. Presumtivt namn Coryneform

gruppTotalantal

cfu/mlAntal past.överlevande

cfu/ml

silo M1A M1 Grupp VI 235000 >30000silo M1B M2 Grupp Isilo M1C M3 Grupp VIsilo M1D M4 Grupp Isilo M2A M5 Grupp II 169000 27700silo M2B M6 Bacillus licheniformissilo M2C M7 Grupp IBil M3A M8 Grupp III 22000 140Bil M3B M9 Bacillus licheniformisBil M3C M10 Grupp IIBil M3D M11 Grupp VBil M3E M12 Paenibacillus macerans?Bil M4A M13 Grupp II 10600 380Bil M4B M14 Grupp IBil M4C M15 Grupp IIIBil M5A M16 Grupp IV 13200 910Bil M5B M17 Kocuria variansBil M5C M18Bil M5D M19 Grupp IIBil M5E M20 Bacillus licheniformisBil M6A M21 Cellulomonas/Microbacterium Grupp II 8000 6800Bil M6B M22 Grupp IIBil M6C M23 Grupp IIBil M6D M24 Grupp ILeverantör 1 M7A M25 Grupp VI 60000 70Leverantör 1 M7B M26 Bacillus licheniformisLeverantör 1 M7C M27 Grupp ILeverantör 1 M7D M28 Bacillus licheniformisLeverantör 2 M8A M29 Grupp V 5500 35Leverantör 2 M8B M30 Grupp VLeverantör 2 M8C M31 Grupp VLeverantör 3 M9A M32 Kocuria varians 13900 140Leverantör 3 M9B M33 Grupp IIILeverantör 3 M9C M34 Grupp IIILeverantör 3 M9D M35 Kocuria variansLeverantör 4 M10A M36 Cellulomonas/Microbacterium? Resten 44000 950Leverantör 4 M10B M37 Kocuria variansLeverantör 4 M10C M38 Kocuria variansLeverantör 4 M10D M39 Cellulomonas/Microbacterium Grupp VIILeverantör 5 M11A M40 Grupp V 10500 <10Leverantör 6 M12A M41 Bacillus pumilus 5000 70Leverantör 6 M12B M42 EnterococcusLeverantör 6 M12C M43 coryneform? ogrupperadLeverantör 6 M12D M44 Bacillus sphaericusLeverantör 7 M13A M45 Kocuria kristinae, coryneform? 7800 <10Leverantör 7 M13B M46 Micrococcus lylaeLeverantör 7 M13C M47 Micrococcus lylaeLeverantör 8 M14A M48 Grupp I 17300 440Leverantör 8 M14B M49 Grupp I

24

Leverantör 8 M14C M50 Grupp IVLeverantör 8 M14D M51 Grupp ILeverantör 8 M14E M52 Grupp ILeverantör 9 M15A M53 Grupp I 15000 90Leverantör 9 M15B M54 Paenibacillus polymyxa?Leverantör 9 M15C M55Leverantör 9 M15D M56 Grupp ILeverantör 9 M15E M57 Grupp IIILeverantör 10 M16A M58 Brevibacillus brevis? (B.

sphaericus)2200 10

Leverantör 10 M16B M59 SteptococcusLeverantör 11 M17A M60 Grupp I 7500 680Leverantör 11 M17B M61 Grupp ILeverantör 11 M17C M62 Cellulomonas/Microbacterium Grupp ILeverantör 11 M17D M63 Grupp ILeverantör 12 M18A M64 Grupp IV 13200 3160Leverantör 12 M18B M65 Grupp IILeverantör 13 M19A M66 Kocuria varians 9700 15Leverantör 13 M19B M67 Kocuria kristinaeLeverantör 13 M19C M68 Grupp ILeverantör 13 M19D M69 Grupp IIILeverantör 14 M20A M70 Staphylococcus 1700 5Leverantör 14 M20B M71 Kocuria variansLeverantör 14 M20C M72 Kocuria kristinaeLeverantör 14 M20D M73 Bacillus circulans?Leverantör 15 M21A M74 Grupp VI 3300 200Leverantör 15 M21B M75 Grupp VILeverantör 15 M21C M76 Grupp IIILeverantör 16 M22A M77 Bacillus pumilus 32600 90Leverantör 16 M22B M78 Brevibacillus brevisLeverantör 16 M22C M79 Grupp VILeverantör 16 M22D M80 Bacillus cereusLeverantör 16 M22E M81 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IIILeverantör 17 M23A M82 Bacillus pumilus 10100 210Leverantör 17 M23B M83 Bacillus sphaericusLeverantör 17 M23C M84 Grupp IIILeverantör 17 M23D M85 Grupp IILeverantör 17 M23E M86 Grupp IILeverantör 18 M24A M87 Grupp I 11500 80Leverantör 18 M24B M88 Grupp ILeverantör 18 M24C M89 Micrococcus luteusLeverantör 18 M24D M90 Grupp ILeverantör 19 M25A M91 Grupp I 81000 9400Leverantör 19 M25B M92 Grupp ILeverantör 19 M25C M93Leverantör 19 M25D M94 Grupp ILeverantör 20 M26A M95 Grupp I 25500 14000Leverantör 20 M26B M96 Grupp IILeverantör 20 M26C M97 Grupp IIILeverantör 20 M26D M98 Grupp IIILeverantör 21 M27A M99 Cellulomonas/Microbacterium Grupp VI 47000 750Leverantör 21Leverantör 21 M27B M100 Bacillus licheniformisLeverantör 21 M27C M101 Kocuria variansLeverantör 22 M28A M102 Micrococcus luteus 24900 310

25

Leverantör 22 M28B M103 StreptococcusLeverantör 22 M28C M104 Geobacillus stearotermophilus?Leverantör 22 M28D M105 Bacillus pumilusLeverantör 22 M28E M106 Grupp VLeverantör 23 M29A M107 Bacillus circulans? 12000 320Leverantör 23 M29B M108 Bacillus licheniformisLeverantör 23 M29C M109 Kocuria kristinaeLeverantör 23 M29D M110 Paenibacillus macerans?Leverantör 23 M29E M111 Bacillus licheniformisLeverantör 24 M30A M112 Bacillus licheniformis 40000 200-4000Leverantör 24 M30B M113 Grupp IIILeverantör 24 M30C M114 Grupp IIILeverantör 24 M30D M115 Grupp IIILeverantör 24 M30E M116 Grupp IIILeverantör 25 M31A M117 Grupp I 24500 1260Leverantör 25 M31B M118 Grupp VIIILeverantör 25 M31C M119 Grupp VILeverantör 25 M31D M120 Cellulomonas/Microbacterium Grupp ILeverantör 26 M32A M121 83000 900Leverantör 26 M32B M122 Kocuria variansLeverantör 26 M32C M123 Bacillus pumilusLeverantör 26 M32D M124 Grupp IILeverantör 26 M32E M125 Grupp ILeverantör 27 M33A M126 Micrococcus luteus 6000 10Leverantör 28 M34A M127 Cellulomonas/Microbacterium Grupp V 6200 30Leverantör 28 M34B M128 Grupp IVLeverantör 28 M34C M129 Grupp ILeverantör 29 M35A M130 Bacillus licheniformis 11000 70Leverantör 29 M35B M131Leverantör 29 M35C M132 Grupp ILeverantör 29 M35D M133 Grupp I

26

Mejeri 2Leverantör Rör nr. Arbetsnr Presumtivt namn Coryneform

gruppTotalantal

cfu/mlAntal past.överlevande

cfu/ml

Bil O1A O1 Kocuria varians 1400 30Bil O1B O2 Grupp IVBil O1C O3 Grupp IBil O1D O4 Grupp IVBil O1E O5 Grupp IBil O2A O6 Grupp II 47000 270Bil O2B O7 Grupp VIBil O2C O8 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IIBil O2D O9 Grupp IBil O2E O10 Kocuria kristinaeLeverantör 1 O3A O11 3700 20Leverantör 1 O3B O12 Kocuria variansLeverantör 1 O3C O13 Grupp IVLeverantör 1 O3D O14 Arcanobacterium? hemolytisk RestenLevernatör 2 O4A O15 Grupp II 8200 90Levernatör 2 O4B O16Levernatör 2 O4C O17 Grupp IILevernatör 2 O4D O18 Grupp IILevernatör 2 O4E O19 Grupp IIILeverantör 3 O5A O20 Grupp I 6900 240Leverantör 3 O5B O21 Grupp IVLeverantör 3 O5C O22 Grupp ILeverantör 3 O5D O23 Grupp VLeverantör 3 O5E O24Leverantör 4 O6A O25 Kocuria kristinae 7200 140Leverantör 4 O6B O26 Bacillus sphaericusLeverantör 4 O6C O27 Bacillus licheniformisLeverantör 4 O6D O28 Grupp IIILeverantör 4 O6E O29 Bacillus licheniformisLeverantör 5 O7A O30 Bacillus subtilis? 1900 60Leverantör 5 O7B O31 Grupp IVLeverantör 5 O7C O32 Bacillus licheniformisLeverantör 5 O7D O33 Kocuria kristinaeLeverantör 5 O7E O34 Grupp VLeverantör 6 O8A O35 Grupp V 3500 230Leverantör 6 O8B O36 Grupp VLeverantör 6 O8C O37 Kocuria kristinaeLeverantör 6 O8D O38 Grupp VLeverantör 6 O8E O39 Grupp VLeverantör 7 9 7200 <10Leverantör 8 O10A O40 Grupp I 6300 50Leverantör 8 O10B O41 Cellulomonas/Microbacterium Grupp ILeverantör 8 O10C O42 Grupp ILeverantör 8 O10D O43 Grupp ILeverantör 8 O10E O44 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IIILeverantör 9 O11A O45 Grupp II 11300 60Leverantör 9 O11B O46 Kocuria kristinaeLeverantör 9 O11C O47 StaphylococcusLeverantör 9 O11D O48 Kocuria kristinaeLeverantör 9 O11E O49 Grupp II

27

Leverantör 10 O12A O50 Micrococcus luteus 8300 590Leverantör 10 O12B O51 StaphylococcusLeverantör 10 O12C O52 Grupp IILeverantör 10 O12D O53 Kocuria kristinaeLeverantör 10 O12E O54 Kocuria kristinaeLeverantör 11 O13A O55 5000 4100Leverantör 11 O13B O56Leverantör 11 O13C O57Leverantör 11 O13D O58Leverantör 11 O13E O59 Grupp IILeverantör 12 O14A O60 Grupp II 4100 30-500Leverantör 12 O14B O61 Grupp ILeverantör 12 O14C O62 Grupp ILeverantör 12 O14D O63 Gruppp IIILeverantör 12 O14E O64 Grupp IILeverantör 13 O15A O65 Grupp II 3700 30-300Leverantör 13 O15B O66 Grupp IILeverantör 13 O15C O67 Grupp IILeverantör 13 O15D O68 Grupp VILeverantör 13 O15E O69 Grupp ILeverantör 14 O16A O70 Aktinomycet? Aureobacterium? Resten 1700 10Leverantör 14 O16B O71 Grupp VLeverantör 15 17 2500 5Leverantör 16 O18A O72 Kocuria varians 1500 40Leverantör 16 O18B O73 Kocuria variansLeverantör 16 O18C O74 Grupp IVLeverantör 16 O18D O75 Grupp IVLeverantör 16 O18E O76 Grupp IVLeverantör 17 O19A O77 Micrococcus luteus 3300 5Leverantör 17 O19B O78 Bacillus pumilusLeverantör 18 O20A O79 Grupp VI 1300 180Leverantör 18 O20B O80 Grupp ILeverantör 18 O20C O81 Grupp ILeverantör 18 O20D O82 Grupp ILeverantör 18 O20E O83 Kocuria kristinaeLeverantör 19 O21A O84 Grupp I 4300 20Leverantör 19 O21B O85 Grupp ILeverantör 19 O21C O86 Grupp IIILeverantör 19 O21D O87 Grupp IIILeverantör 19 O21E O88 Grupp IIILeverantör 20 O22A O89 Grupp I 1300 20Leverantör 21 O23A O90 Enterococcus 2900 300-1600Leverantör 21 O23B O91 Arcanobacterium? hemolytisk RestenLeverantör 21 O23C O92 RestenLeverantör 21 O23D O93 Grupp IIILeverantör 21 O23E O94 Grupp ILeverantör 22 O24A O95 Cellulomonas/Microbacterium Grupp VII 1200 20Leverantör 22 O24B O96 Grupp VIILeverantör 22 O24C O97 Grupp VLeverantör 23 O25A O98 Grupp III 2200 20Leverantör 23 O25B O99 Grupp ILeverantör 23 O25C O100 Grupp IIILeverantör 24 O26A O101 Grupp VIII 2000 20Leverantör 24 O26B O102 Grupp IVLeverantör 24 O26C O103 Grupp II

28

Leverantör 25 O27A O104 Cellulomonas/Microbacterium Grupp VIII 7000 60Leverantör 25 O27B O105 Grupp ILeverantör 25 O27C O106 Kocuria kristinaeLeverantör 25 O27D O107 Grupp IILeverantör 25 O27E O108 Grupp ILeverantör 26 O28A O109 Grupp IV 1700 20Leverantör 26 O28B O110 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IVLeverantör 26 O28C O111 Grupp IV

29

Mejeri 3Leverantör Arbets.

nr.Infrysningsnr.

Presumtivt namn Coryneformgrupp

Totalantalcfu/ml

Antal past.överlevandecfu/ml

Leverantör 1 1 G1 Grupp I 8300 10Leverantör 2 2 G2 Grupp VI 4600 30Leverantör 2 2 G3 Grupp VLeverantör 2 2 G4 Grupp ILeverantör 3 3 G5 Grupp I 14000 20Leverantör 3 3 G6 Cellulomonas/Microbacterium Grupp ILeverantör 3 3 G7 StreptococcusLeverantör 3 3 G8 Geobacillus stearotermophilus?

B.sporotermodurans?Leverantör 4 4 G9 Grupp III 199000 50Leverantör 4 4 G10 Grupp VLeverantör 4 4 G11 Arcanobacterium haemolyticum Grupp VIIILeverantör 4 4 G12 Grupp ILeverantör 4 4 G13 Grupp IVLeverantör 4 4 G14 Grupp VILeverantör 5 5 G15 Cellulomonas/Microbacterium Grupp III 2600 30Leverantör 5 5 G16 Grupp IIILeverantör 5 5 G17 Grupp IVLeverantör 5 5 G18 Bacillus licheniformisLeverantör 5 5 G19 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IVLeverantör 6 6 G20 Grupp I 45000 400Leverantör 6 6 G21 Grupp VILeverantör 6 6 G22 StaphylococcusLeverantör 6 6 G23 Grupp ILeverantör 6 6 G24 Grupp VILeverantör 6 6 G25 Grupp IIILeverantör 7 7 G26 Grupp IV 14400 60Leverantör 7 7 G27 Grupp IIILeverantör 7 7 G28 StreptococcusLeverantör 7 7 G29 Grupp VLeverantör 7 7 G30 Grupp VLeverantör 7 7 G31 Grupp IVLeverantör 8 8 G32 Micrococcus luteus 190 30Leverantör 8 8 G33 Cellulomonas/Microbacterium Grupp VLeverantör 8 8 G34 Grupp VLeverantör 8 8 G35 Grupp VLeverantör 9 9 G36 Grupp III 31100 20Leverantör 9 9 G37 Grupp IIILeverantör 9 9 G38 Grupp IIILeverantör 9 9 G39 Bacillus circulans?Leverantör 10 10 G40 Grupp II 4700 90Leverantör 10 10 G41 Grupp IIILeverantör 10 10 G42 Cellulomonas/Microbacterium Grupp VILeverantör 10 10 G43 Grupp ILeverantör 10 10 G44 Grupp VLeverantör 11 11 G45 Streptococcus 21300 40Leverantör 11 11 G46 Arcanobacterium haemolyticum RestenLeverantör 11 11 G47 Paenibacillus polymyxa?Leverantör 11 11 G48 Geobacillus stearotermophilus??Leverantör 11 11 G49 Bacillus pumilusLeverantör 11 11 G50 Brevibacillus brevis? B.chitinosporus?

30

Leverantör 12 12 - 2200 <10Leverantör 13 13 G51 ogrupperad 2600 190Leverantör 13 13 G52 StreptococcusLeverantör 13 13 G53 Grupp VIIILeverantör 13 13 G54 Cellulomonas/Microbacterium?

hemolytiskGrupp VIII

Leverantör 13 13 G55 Bacillus pumilusLeverantör 14 14 - 2100 <10Leverantör 15 15 G56 Grupp VI 53000 4800Leverantör 15 15 G57 Grupp IIILeverantör 15 15 G58 Grupp IVLeverantör 15 15 G59 Grupp VILeverantör 15 15 G60 Grupp IIILeverantör 16 16 G61 Grupp I 6800 130Leverantör 16 16 G62 Kocuria kristinaeLeverantör 16 16 G63Leverantör 16 16 G64 Grupp IIILeverantör 16 16 G65 Grupp IIILeverantör 16 16 G66 Grupp ILeverantör 17 17 G67 Grupp III 39000 1750Leverantör 17 17 G68 Grupp IIILeverantör 17 17 G69 Grupp IIILeverantör 17 17 G70 Grupp ILeverantör 17 17 G71 Grupp IIILeverantör 18 18 G72 Grupp III 6000 60Leverantör 18 18 G73 GruppIIILeverantör 18 18 G74 Micrococcus luteusLeverantör 18 18 G75 Brevibacillus laterosporus?Leverantör 18 18 G76 Grupp IIILeverantör 18 18 G77 Grupp IIILeverantör 19 19 G78 Bacillus circulans? 23300 5Leverantör 20 20 G79 Grupp VI 4900 5Leverantör 21 21 G80 Staphylococcus 700 30Leverantör 21 21 G81 Grupp VLeverantör 21 21 G82 Grupp VIILeverantör 21 21 G83 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IILeverantör 21 21 G84 StreptococcusLeverantör 21 21 G85 Streptococcus

31

Mejeri 4Leverantör. Arbets.nr. Infrysnings

nr.Presumtivt namn Coryneform

gruppTotalantal

cfu/mlAntal

past.överlevandecfu/ml

Leverantör 1 1 U1 Bacillus pumilus 7300 10Leverantör 1 1 U2 Kocuria variansLeverantör 1 1 U3 Grupp VLeverantör 2 2 U4 Kocuria kristinae 2000 90Leverantör 2 2 U5 Micrococcus luteusLeverantör 2 2 U6 Micrococcus luteusLeverantör 2 2 U7 Micrococcus luteusLeverantör 2 2 U8 Micrococcus luteusLeverantör 3 3 U9 Grupp V 2500 20Leverantör 3 3 U10 Grupp IILeverantör 3 3 U11 Grupp VLeverantör 3 3 U12 Kocuria kristinaeLeverantör 4 4 U13 Grupp II 97000 30Leverantör 4 4 U14 Grupp IILeverantör 4 4 U15 Grupp IILeverantör 4 4 U16 Grupp IILeverantör 4 4 U17 Grupp VIILeverantör 5 5 U18 Grupp V 46000 60Leverantör 5 5 U19renad Bacillus licheniformisLeverantör 5 5 U20 Grupp IILeverantör 5 5 U21 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IILeverantör 5 5 U22 Grupp VLeverantör 6 6 U23 Grupp IV 34000 1520Leverantör 6 6 U24 Grupp IILeverantör 6 6 U25 Grupp IILeverantör 6 6 U26 Grupp ILeverantör 7 7 U27 Grupp III 1900 85Leverantör 7 7 U28 Micrococcus luteusLeverantör 7 7 U29 StaphylococcusLeverantör 7 7 U30renad Kocuria kristinaeLeverantör 7 7 U31renad Bacillus licheniformisLeverantör 8 8 4400 <10Leverantör 9 9 U32 Kocuria varians 2400 70Leverantör 9 9 U33 Kocuria variansLeverantör 9 9 U34 Kocuria variansLeverantör 9 9 U35 Kocuria variansLeverantör 9 9 U36 Kocuria variansLeverantör 10 10 U37 Grupp V 4500 20Leverantör 10 10 U38renad Bacillus circulans?Leverantör 10 10 U39 Grupp VLeverantör 10 10 U40renad Cellulomonas/Microbacterium? RestenLeverantör 11 11 U41 Grupp VII 3500 20Leverantör 11 11 U42 Grupp ILeverantör 11 11 U43renad Arcanobacterium haemolyticum RestenLeverantör 12 12 U44 Staphylococcus 50000 120Leverantör 12 12 U45renad Grupp IILeverantör 12 12 U46 Grupp IILeverantör 12 12 U47 Grupp VIILeverantör 12 12 U48 Grupp IILeverantör 13 13 U49renad Grupp III 1800 20

32

Leverantör 13 13 U50 RestenLeverantör 13 13 U51 Arcanobacterium haemolyticum RestenLeverantör 13 13 U52 Grupp ILeverantör 14 14 U53 Grupp V 13300 3200Leverantör 14 14 U54 Grupp ILeverantör 14 14 U55 Grupp VLeverantör 14 14 U56 Grupp VLeverantör 14 14 U57 Grupp IIILeverantör 15 15 U58 Grupp II >200000 50Leverantör 15 15 U59 Grupp IILeverantör 15 15 U60 Grupp IILeverantör 15 15 U61 Grupp IILeverantör 15 15 U62 Grupp IILeverantör 16 16 U63 Bacillus sphaericus 3200 400Leverantör 16 16 U64 Cellulomonas/Microbacterium Grupp VLeverantör 16 16 U65 Grupp VLeverantör 16 16 U66 Arcanobacterium haemolyticum RestenLeverantör 16 16 U67 Grupp VLeverantör 17 17 U68 Grupp II 2400 20Leverantör 17 17 U69 Grupp IVLeverantör 17 17 U70 Grupp IILeverantör 17 17 U71 Grupp IILeverantör 17 17 U72 Grupp IVBil 18 U73 Grupp III 6000 150Bil 18 U74 Grupp IIIBil 18 U75 Grupp IBil 18 U76 Grupp IBil 18 U77 Bacillus subtilisBil 19 U78 Grupp III 8300 560Bil 19 U79 Kocuria variansBil 19 U80 Grupp IIIBil 19 U81 Grupp IBil 19 U82 Grupp IIBil 20 U83 Grupp VIII 10000 410Bil 20 U84 Grupp IIIBil 20 U85 Cellulomonas/Microbacterium Grupp IBil 20 U86 Grupp IIIBil 20 U87 Grupp IIISilo 21 U88 Cellulomonas/Microbacterium Grupp III 13100 250Silo 21 U89 Grupp IVSilo 21 U90 Grupp VSilo 21 U91 Bacillus sphaericusSilo 21 U92 Bacillus licheniformis

33

Bildbilaga

Bild 1. Exempel på mikrokock på BHI-platta. De har oftast någon nyans av gult,matt litet fet yta och växer tjockt på höjdenpå plattan. Stammen på bilden typades tillKocuria varians.

Bild 2. Exempel på coryneform bakterie påBHI-platta. De har oftast någon nyans avgult eller vitgul. Ändrar färg med tiden ochblir mörkare gula. Växer tunnare på plattanän mikrokockerna. Har blank yta ochverkar mer genomskinliga. Stammen påbilden typades till Microbacterium/Cellulomonas. Några stammar växer såtunt att man knappt kan urskilja växt.

Bild 3. Exempel på Bacillus pumilus påblodagarplatta. Observera den grönaktigahemolysen.

34

Bild 4. Exempel på Bacillus licheniformispå blodagarplatta. Observera den slemmigaytan. Äldre kulturer blir torra och skrovligapå ytan med upphöjda papiller, medankanterna fortfarande är slemmiga. Gerhemolys efter 2 dygn på platta.

Bild 5. Exempel på API-Staph somanvändes för att typa kockerna. Kocken påbilden typades som Kocuria varians.

Bild 6. Exempel på API-Coryne somanvändes för att typa de coryneformabakterierna. På bilden syns den API-testsom gjordes för en av referensstammarna,Caseobacter polymorhus.

Bild 7. Exempel på API för Bacillus-arter,CHB50 och 20E. Stammen på bildentypades till Bacillus pumilus.

35

Bild 8. Bilden visar den utrustning somanvändes för avdödningsförsök med värmeoch för diskförsök i suspension. Orörning ikolvarna sker med magnetloppa. En kolvfungerar som temperaturreferens. Entemperaturkännare står i denna kolv och eni vattenbadet. Kolvarna med buffert ellerdisklösning tempereras först ochbakteriesuspension tillsätts därefter underomrörning. Prov tages ut och sättsomedelbart till spädnings- ellerneutraliseringsvätska, som står i isvatten.Då alla prov tagits ut utförs spädning ochspridning. Är det lång tid mellanprovtagningstiderna kan man med fördelsprida tidigare uttagna prov medan manväntar.

Bild 9. Spridning kan ske på färdiggjutnaplattor eller genom ingjutning. Bådametoderna har sina för- och nackdelar.Förbered genom att ha rätt antal plattorframme. Märk alla plattor och lägg ut förhela spädningsserien. Då blir det lättare attha kontroll över att man gjort rätt. Se tillatt allt som behövs för spädning ochspridning finns lätt tillgängligt. Var nogamed att blanda om ordentligt i rören.Använd gärna vortex.

Bild 10. För att få en uppfattning om hurmycket mjölk som kan bli kvar imjölkledningen, om ingen sköljning skerföre disk, fylldes en flaska med mjölk.Därefter hälldes mjölken ut och flaskanfylldes med motsvarande mängd vatten. Enspädningsserie gjordes som jämförelse.Den osköljda flaskan fick en mjölkhalt påmellan 0.5 och 1% då vatten hälldes i.

36

Bild 11. Förmåga att bilda biofilm testadesför några kocker och coryneformabakterier. I den högra raden har mjölkfunnits med i mediet vid odling avbiofilmen. Några av stammarna bildarbiofilm bättre då mjölk inte fanns med.Biofilmen har färgats med kristallviolett.

Bild 12. Objektsglas med biofilm diskadesstående i glasvannor under omrörning. Envanna användes som temperaturreferens.Temperatur mättes också i badet.Objektsglasen togs upp med hjälp avsteriliserad pincett efter behandling i 1, 5respektive 10 minuter och ladesomedelbart i neutraliseringslösning.

Bild 13. De diskade och neutraliseradeobjektsglasen svabbades medbomullssvabbar. Svabbarna stoppades ispädningsrör och vortexades hårt.Spädning och spridning utfördes sedan påsamma sätt som vid värmeavdödningen.