pd-l1 ihc 22c3 pharmdx sk006 50 testova za …...ushodna regulacija pd-1 liganda odvija se u nekim...

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 1/14

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 testova za korišćenje sa instrumentom Autostainer Link 48 Predviđena namena Za in vitro dijagnostičku upotrebu. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je kvalitativni imunohistohemijski test koji sadrži monoklonski mišji Anti-PD-L1, klon 22C3 namenjen za detekciju proteina PD-L1 u tkivu nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC) fiksiranog u formalinu i ukalupljenog u parafinu (FFPE) putem sistema za vizuelizaciju EnVision FLEX na instrumentu Autostainer Link 48. Ekspresija proteina PD-L1 se utvrđuje primenom skora proporcije tumora (TPS), koji predstavlja procenat vijabilnih tumorskih ćelija sa delimičnim ili potpunim bojenjem membrane. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je indikovan kao pomagalo pri identifikaciji pacijenata koji boluju od NSCLC karcinoma radi lečenja lekom KEYTRUDA® (pembrolizumab). Sažetak i objašnjenje Vezivanje PD-1 liganda, PD-L1 i PD-L2, za receptor PD-1 pronađen u T-ćelijama inhibira proliferaciju T-ćelija i proizvodnju citokina. Ushodna regulacija PD-1 liganda odvija se u nekim tumorima pa komunikacija tom putanjom može da doprinese inhibiciji aktivnog imunog nadzora tumora T-ćelija. KEYTRUDA je humanizovano monoklonsko antitelo koje se vezuje za receptor PD-1 i blokira njegovu interakciju sa PD-L1 i PD-L2, ujedno dovodeći do inhibicije imunog odgovora putem putanje PD-1, uključujući i antitumorski imuni odgovor. Kod singeničnih modela tumora miša, blokiranje aktivnosti PD1 je dovelo do smanjenja rasta tumora (1). Princip procedure Komplet testova PD-L1 IHC 22C3 pharmDx sadrži optimizovane reagense i protokol potreban da se dovrši procedura IHC bojenja uzoraka FFPE koristeći instrument Autostainer Link 48. Nakon inkubacije sa primarnim monoklonskim antitelom za PD-L1 ili reagensom za negativnu kontrolu (NCR), uzorci se inkubiraju sa linker antitelom specifičnim za domaćinsku vrstu primarnog antitela, pa se zatim inkubiraju sa reagensom za vizuelizaciju koji je spreman za upotrebu, a sastoji se od molekula sekundarnog antitela i molekula peroksidaze iz rena u kombinaciji sa osnovnim lancem polimera dekstrana. Enzimatska konverzija naknadno dodatog hromogena dovodi do precipitacije vidljivog proizvoda reakcije na mestu antigena. Na boju hromogenske reakcije utiče reagens za pojačavanje hromogena. Uzorak se potom može kontrastno obojiti ili staviti pod pokrovno staklo. Rezultati se tumače putem svetlosnog mikroskopa. Isporučeni materijali Svaki komplet sadrži 19,5 ml primarnog antitela PD-L1 (približna koncentracija proteina od 3 µg/ml), kao i reagense neophodne da se izvrši 50 testova u najviše 15 zasebnih ciklusa. Dolenavedeni materijali su dovoljni za vršenje 50 testova (50 pločica inkubiranih sa primarnim antitelom za PD-L1 i 50 pločica inkubiranih sa odgovarajućim reagensom za negativnu kontrolu, odnosno ukupno 100 pločica). Broj testova je zasnovan na upotrebi 2 x 150 µl po pločici svakog od reagensa, osim DAB+ i rastvora za demaskiranje cilja. Komplet sadrži materijal dovoljan za najviše 15 pojedinačnih ciklusa bojenja. Količina Opis 1 x 34,5 ml Reagens za blokiranje peroksidaze

Puferovani rastvor koji sadrži vodonik-peroksid, deterdžent i 0,015 mol/l natrijum-azida.

1 x 19,5 ml

Primarno antitelo: Monoklonski mišji anti-PD-L1, klon 22C3

Monoklonski mišji (IgG1) anti-PD-L1 u puferovanom rastvoru, sa proteinom za stabilizaciju i 0,015 mol/l natrijum-azida.

1 x 15 ml

Reagens za negativnu kontrolu

Monoklonsko mišje kontrolno IgG antitelo u puferovanom rastvoru, sa proteinom za stabilizaciju i 0,015 mol/l natrijum-azida.

1 x 34,5 ml Mišji LINKER

Sekundarno antitelo kunića za mišje imunoglobuline u puferovanom rastvoru, sa proteinom za stabilizaciju i 0,015 mol/l natrijum-azida.

1 x 34,5 ml Reagens za vizuelizaciju HRP

Dekstran spojen sa molekulima peroksidaze i molekuli sekundarnog antitela koze protiv imunoglobulina kunića i miša u puferovanom rastvoru koji sadrži stabilizujući protein i antimikrobni agens.

VISUALIZATION REAGENT-HRP

LINKER, ANTI-MOUSE

NEGATIVE CONTROL REAGENT

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 2/14

15 x 7,2 ml Supstratni pufer DAB+

Puferovani rastvor koji sadrži vodonik-peroksid i antimikrobni agens.

1 x 5 ml Hromogen DAB+

3,3’-diaminobenzidin tetrahidrohlorid u organskom rastvaraču.

1 x 34,5 ml DAB pojačivač

Bakar-sulfat u vodi.

6 x 30 ml Rastvor za demaskiranje cilja EnVision FLEX, sa niskom pH vrednošću, 50x

Puferovani rastvor, pH 6,1, koji sadrži deterdžent i antimikrobni agens.

15 pločica Kontrolni preparati PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Svaki preparat sadrži isečke dve peletirane ćelijske linije fiksirane u formalinu i ukalupljene u parafinu: NCI-H226* sa umerenom ekspresijom proteina PD-L1 i MCF-7 sa negativnom ekspresijom proteina PD-L1.

P

D-L

1 IH

C 2

2C3

ph

arm

Dx

XX

XX

X

*Dr AF Gazdar i dr JD Minna sa američkog Nacionalnog instituta za zdravlje (NIH) su dobili priznanja za svoj doprinos u razvoju NCI-H226 (ATCC broj: CRL-5826™) (2). Napomena: Svi reagensi koji se nalaze u pakovanju su specifično formulisani za upotrebu sa ovim kompletom. Kako bi se test sproveo u skladu sa specifikacijama, nisu dozvoljene nikakve supstitucije, osim rastvora za demaskiranje cilja sa niskom pH vrednošću EnVision FLEX, 50x (šifra K8005). PD-L1IHC 22C3 pharmDx je osmišljen za korišćenje sa instrumentom Autostainer Link 48. Više informacija potražite u korisničkim priručnicima za instrumente Autostainer Link 48 i PT Link Potrebni materijali koji se ne isporučuju PT Link modul za predtretman (šifra PT100/PT101) Autostainer Link 48 (šifra AS480) Pufer za ispiranje EnVision FLEX, 20x (šifra K8007) Hematoxylin (šifra K8008) Destilovana ili dejonizovana voda (voda kvaliteta za reagens) Tajmer Pozitivno i negativno tkivo koje će se koristiti kao kontrola procesa (pročitajte odeljak „Kontrola kvaliteta“) Mikroskopske pločice: Mikroskopske pločice Dako FLEX IHC (šifra K8020) ili Fisherbrand Superfrost Plus pločice sa nabojem Pokrovna stakla Trajni medijum za poklapanje i pomoćni reagensi potrebni za poklapanje pokrovnih stakala Svetlosni mikroskop (uvećanje objektiva od 4x do 40x) Mere opreza 1. Za in vitro dijagnostičku upotrebu. 2. Za stručne korisnike. 3. Ovaj proizvod sadrži natrijum-azid (NaN3), izuzetno toksičnu hemikaliju u čistom obliku. U koncentracijama u kojima se nalazi u

ovom proizvodu, iako nije klasifikovan kao opasan, NaN3 može da reaguje sa olovnim i bakarnim cevima i dovede do nakupljanja izuzetno eksplozivnog taloga metalnih azida. Po odlaganju, isprati velikim količinama vode da bi se sprečilo taloženje metalnih azida u cevima (3).

4. Primarno antitelo, reagens za negativnu kontrolu, linker i reagens za vizuelizaciju sadrže materijal životinjskog porekla. 5. Uzorcima, pre i nakon fiksacije, kao i svim materijalima koji su bili izloženi njima, treba rukovati kao da su prenosnici infekcije i

odlagati ih na otpad poštujući odgovarajuće mere opreza (4). 6. Trajanje, temperatura ili načini inkubacije koji se razlikuju od navedenih mogu da dovedu do netačnih rezultata. 7. Reagensi su optimalno razblaženi. Dodatno razblaženje može da dovede do gubitka bojenja antigena. 8. Ukoliko se reagens za vizuelizaciju, tečni DAB+ hromogen i pripremljeni DAB+ supstrat-hromogen rastvor izlože prekomernoj jačini

svetlosti, može doći do umanjenja njihovih svojstava. Nemojte da čuvate komponente sistema, niti da vršite bojenje pri jakoj svetlosti, poput direktne sunčeve svetlosti.

9. Ostaci parafina mogu da dovedu do lažno negativnih rezultata. 10. Primena količine reagensa koja ne odgovara preporučenoj može da dovede do gubitka vidljive imunoreaktivnosti PD-L1. 11. Rezultati male studije su ukazali na sličan dinamički opseg ekspresije PD-L1 u primarnim i metastatskim parovima uzorka NSCLC.

Moguće je da će biti razlika u ekspresiji PD-L1 između primarnih tumora i mesta metastaze kod istog pacijenta.

CONTROL SLIDES

EnVision™ FLEXTARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

DAB ENHANCER

DAB+ CHROMOGEN

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

MCF-7: PD-L1 negativan

NCI-H226: PD-L1 pozitivan

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 3/14

12. Moguće je da će za veće isečke tkiva biti potrebno 3x150 µl reagensa. 13. Opšte je pravilo da licima mlađim od 18 godina nije dozvoljeno da koriste ovaj proizvod. Korisnike treba pažljivo uputiti u ispravne

procedure rada, opasna svojstva proizvoda i neophodna uputstva u vezi sa bezbednošću. Više informacija potražite u Bezbednosnom listu (SDS).

14. Nositi odgovarajuću ličnu zaštitnu opremu da ne bi došlo do kontakta sa očima i kožom. 15. Nepotrošen rastvor treba da se odloži u skladu sa lokalnim, regionalnim i državnim propisima. 16. Bezbednosni list je dostupan stručnim licima na zahtev.

Opasnost Hromogen DAB+: 1–5% bifenil-3,3',4,4'-tetrailtetraamonijum-tetrahlorid H350 Potencijalno kancerogen. H341 Sumnja se da izaziva genetska oštećenja. P201 Pre upotrebe potražite posebna uputstva. P202 Nemojte da rukujete pre nego što pročitate i razumete sve mere opreza u vezi sa bezbednošću. P280 Nosite zaštitne rukavice. Nosite zaštitu za oči ili lice. Nosite zaštitnu odeću. P308 + P313 U slučaju izloženosti ili nedoumica: Potražite pomoć lekara. P405 Čuvajte pod ključem. P501 Odložiti sadržaj i ambalažu u skladu sa lokalnim, regionalnim, državnim i međunarodnim propisima.

Upozorenje Rastvor za demaskiranje cilja EnVision FLEX, sa niskom pH vrednošću (50x): 1–5% limunska kiselina H319 Izaziva ozbiljnu iritaciju očiju. H411 Otrovan za vodene organizme sa dugotrajnim posledicama. P280 Nosite zaštitu za oči ili lice. P273 Sprečiti oslobađanje u okolnu sredinu. P264 Temeljno operite ruke nakon rukovanja. P305 + P351 + P338

UKOLIKO DOĐE U KONTAKT SA OČIMA: Nekoliko minuta oprezno ispirajte vodom. Skinite kontaktna sočiva ako ih imate i ako se lako skidaju. Nastavite sa ispiranjem.

P337 + P313 Ako je iritacija očiju i dalje prisutna: Potražite pomoć lekara. P501 Odložiti sadržaj i ambalažu u skladu sa lokalnim, regionalnim, državnim i međunarodnim propisima.

Čuvanje Čuvajte sve komponente kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, uključujući i kontrolne preparate, na mračnom mestu, na temperaturi od 2 do 8 °C, kada se ne koriste u instrumentu Autostainer Link 48. Nemojte da koristite komplet nakon datuma isteka roka trajanja odštampanog na spoljašnjoj strani kutije kompleta. Ako se reagensi čuvaju u uslovima drugačijim od propisanih u uputstvu priloženom u pakovanju, korisnik mora da potvrdi da su oni validni. Nema jasnih znakova koji ukazuju na nestabilnost ovog proizvoda, pa pozitivnu i negativnu kontrolu treba sprovesti istovremeno sa uzorcima pacijenta. Priprema uzorka Uzorcima je potrebno rukovati tako da se očuva tkivo namenjeno za IHC bojenje. Na sve uzorke treba primeniti standardne metode obrade tkiva. Parafinski preseci Tkivo fiksirano u formalinu i ukalupljeno u parafinu je prikladno za korišćenje. Alternativna sredstva za fiksiranje nisu potvrđena i mogu da dovedu do pogrešnih rezultata. Preporučuje se da fiksacija traje od 12 do 72 sata u 10% neutralnom puferovanom formalinu (NBF), međutim studija sa ograničenim brojem uzoraka je pokazala da trajanje fiksacije od 4 do 168 sati u 10% NBF-u nije sistematski promenilo detekciju PD-L1. Trajanje fiksacije kraće od 3 sata može da dovede do promenljive detekcije PD-L1. Uzorke treba seći na blokove debljine od 3 do 4 mm, fiksirati u formalinu, pa dehidrirati i pročistiti u seriji alkohola i ksilola, nakon čega sledi infiltracija otopljenim parafinom. Temperatura parafina ne sme da prekorači 60 °C. Blokovi FFPE tkiva stari 5 ili više godina mogu da dovedu do gubitka imunoreaktivnosti PD-L1. Isečeni tkivni uzorci treba da imaju debljinu 4–5 µm. Nakon isecanja, tkivo treba postaviti na pločice Fisherbrand Superfrost Plus ili mikroskopske pločice Dako FLEX IHC (šifra K8020), a zatim ih staviti u pećnicu na temperaturu 58 ± 2 °C na 1 sat. Kako bi se očuvala antigenost, isečke tkiva, nakom postavljanja na pločice, treba čuvati na mračnom mestu, na temperaturi od 2 do 8 °C (poželjno) ili na sobnoj temperaturi do 25 °C i obojiti u roku od 6 meseci od isecanja. Temperatura čuvanja i rukovanja pločicama ne sme da premaši 25 °C ni u jednom trenutku nakon postavljanja na pločicu, kako bi se obezbedili integritet i antigenost tkiva.

Primena kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx na dekalcifikovanom tkivu nije potvrđena i ne preporučuje se. Priprema reagensa Pre bojenja potrebno je pripremiti sledeće reagense: Rastvor za demaskiranje cilja EnVision FLEX, sa niskom pH vrednošću, 50x Pripremite dovoljnu količinu 1x rastvora za demaskiranje cilja sa niskom pH vrednošću tako što ćete razblažiti rastvor za demaskiranje cilja sa niskom pH vrednošću, 50x, u odnosu 1:50, destilovanom ili dejonizovanom vodom (vodom kvaliteta za reagense). pH vrednost 1x rastvora za demaskiranje cilja mora da iznosi 6,1 ± 0,2. 1x rastvor za demaskiranje cilja sa pH vrednošću nižom od 5,9 može da proizvede netačne rezultate. Jedna bočica od 30 ml rastvora za demaskiranje cilja sa niskom pH vrednošću, 50x, razblažena u odnosu od 1:50, daće 1,5 l 1x reagensa, što je dovoljno da se ispuni jedan rezervoar instrumenta PT Link, kojim se tretiraju najviše 24 pločice po korišćenju. 1x rastvor za demaskiranje cilja bacite nakon tri korišćenja i nemojte ga koristiti 5 dana nakon razblaživanja. Ukoliko vam je potreban, dodatni rastvor za demaskiranje cilja EnVision FLEX sa niskom pH vrednošću, 50x, je dostupan pod šifrom K8005.

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 4/14

Pufer za ispiranje EnVision FLEX, 20x Pripremite dovoljnu količinu pufera za ispiranje tako što ćete razblažiti pufer za ispiranje 20x, u odnosu 1:20, destilovanom ili dejonizovanom vodom (vodom kvaliteta za reagense) radi koraka ispiranja. Neiskorišćen 1x rastvor čuvajte na temperaturi od 2 do 8 ºC, ne duže od mesec dana. Ukoliko pufer izgleda zamućeno, bacite ga. Više informacija potražite u korisničkom priručniku za instrument Autostainer Link 48.

Pufer za ispiranje EnVision FLEX, 20x je dostupan pod šifrom K8007.

Supstrat hromogen rastvor DAB+ Ovaj rastvor temeljno promešajte pre upotrebe. Ukoliko se u rastvoru stvori precipitat, to neće imati uticaja na kvalitet bojenja.

Da biste pripremili supstrat hromogen rastvor DAB+, dodajte 1 kap tečnog DAB+ hromogena po ml pufera supstrata DAB+, pa promešajte. Pripremljeni supstrat hromogen je stabilan 5 dana ukoliko se čuva na mračnom mestu i na temperaturi od 2 do 8 C.

Važne napomene: Ako ćete da koristite celu bočicu pufera supstrata DAB+, dodajte 9 kapi hromogena DAB+. Iako na etiketi stoji 7,2 ml,

to predstavlja upotrebljivu zapreminu i ne obuhvata „mrtvu zapreminu“ u bočici. Boja tečnog DAB+ hromogena u bočici može da varira od bezbojne do ljubičasto-smeđe. To nema uticaja na učinkovitost

ovog proizvoda. Razblažite po gorenavedenim smernicama. Dodavanje više tečnog hromogena DAB+ puferu supstrata DAB+ će dovesti do umanjenja pozitivnog signala.

Procedura bojenja u instrumentu Autostainer Link 48 Proceduralne napomene Korisnik bi trebalo pažljivo da pročita ova uputstva i upozna se sa svim komponentama i instrumentacijom pre korišćenja (pročitajte odeljak „Mere opreza“).

Svi reagensi moraju da se uravnoteže na sobnu temperaturu (od 20 do 25 °C) pre imunološkog bojenja. Isto tako, sve inkubiranje mora da se vrši na sobnoj temperaturi.

Nemojte dozvoliti da se isečci tkiva osuše tokom procedure bojenja. Suvi isečci tkiva mogu da prikažu povećano nespecifično bojenje.

Svi potrebni koraci i trajanje inkubacije za bojenje su unapred programirani u softveru Dako Link. Dodatne informacije o programiranju protokola i postavljanju pločica potražite u korisničkim priručnicima za Autostainer Link 48 i PT Link.

Napomena: Reagensi i uputstva dostavljena uz ovaj sistem su osmišljena tako da se postigne optimalni učinak pri korišćenju sa preporučenim reagensima i materijalima. Dalje razblaživanje reagensa ili izmena trajanja inkubacije ili temperature može da proizvede netačne ili neusklađene rezultate.

Protokol bojenja U okviru opcija padajućeg menija softvera Dako Link izaberite protokol bojenja PD-L1 IHC 22C3 pharmDx.

Svi potrebni koraci i trajanje inkubacije za bojenje su unapred programirani u instrumentu Autostainer Link 48. Ukoliko se odgovarajući protokoli PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ne nalaze na vašem serveru, obratite se lokalnom predstavniku tehničkog servisa da biste dobili protokole.

1. korak: Procedura deparafinizacije, rehidratacije i demaskiranja cilja (3 u 1)

Više detalja potražite u korisničkom priručniku za instrument PT Link.

Podesite zagrevanje i hlađenje na PT Link-u (šifra PT100/PT101) na 65 °C. Podesite grejanje na 97 °C u trajanju od 20 minuta.

►Napunite rezervoare instrumenta PT Link sa 1,5 l po rezervoaru 1x radnog rastvora za demaskiranje cilja, sa niskom pH vrednošću da biste prekrili isečke tkiva.

►Zagrejte rastvor za demaskiranje cilja na 65 °C. ►Potopite ramove uređaja Autostainer, u kojima se nalaze postavljeni isečci FFPE tkiva, u zagrejani rastvor za demaskiranje cilja sa

niskom pH vrednošću (1x radni rastvor) u rezervoaru instrumenta PT Link. Inkubirajte 20 minuta na temperaturi od 97 °C. ►Po završetku inkubacije za demaskiranje cilja i smanjenja temperature na 65 °C, uklonite sve Autostainer ramove sa pločicama iz

rezervoara instrumenta PT Link i odmah postavite Autostainer ram sa pločicama u rezervoar (npr. stanicu za ispiranje instrumenta PT Link, šifra PT109) koji sadrži razblaženi pufer za ispiranje sobne temperature (šifra K8007).

►Pločice inkubirajte u razblaženom puferu za ispiranje sobne temperature 5 minuta.

2. korak: Procedura bojenja Nakon procedure deparafinizacije, rehidratacije i demaskiranja cilja (3 u 1), Autostainer ramovi sa pločicama se postavljaju u instrument Autostainer Link 48. Instrument će obaviti proceduru bojenja tako što će primeniti odgovarajući reagens, pratiti trajanje inkubacije i ispirati pločice između reagensa. Trajanje reagensa se prethodno programira u okviru softvera Dako Link.

3. korak: Kontrastna boja Pločice treba izložiti kontrastnom bojenju na 5 minuta uz Hematoxylin (Link) (šifra K8008). Trajanje inkubacije hematoksilina je unapred programirano u protokolu.

4. korak: Pravljenje preparata Potreban je bezvodni trajni preparat kao podloga.

Napomena: Može da dođe do određenog izbleđivanja obojenih pločica, u zavisnosti od nekoliko faktora uključujući, između ostalih, kontrastno bojenje, materijale i metode poklapanja i uslove čuvanja pločica. Da biste izbleđivanje sveli na najmanju moguću meru, pločice čuvajte na mračnom mestu, na sobnoj temperaturi (od 20 do 25 °C).

Kontrola kvaliteta Nad reagensima u okviru kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je sprovedena imunohistohemijska kontrola kvaliteta pomoću procedura demaskiranja cilja i bojenja prethodno opisanih u tekstu. Odstupanja od preporučenih procedura fiksiranja tkiva, obrade i ukalupljavanja u laboratoriji korisnika mogu da dovedu do znatnih variranja rezultata. Svaki ciklus bojenja bi trebalo da obuhvata i kontrole kvaliteta. Te kontrole kvaliteta su navedene u tabeli 1 i obuhvataju: uzorak tkiva pacijenta obojen hematoksilinom i eozinom, pozitivno i negativno kontrolno tkivo iz laboratorije i pločicu sa kontrolnom ćelijskom linijom dobijenu od kompanije Dako (5). Ako se nalazite u SAD, više

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 5/14

informacija potražite u smernicama za kontrolu kvaliteta Akreditacionog programa za imunohistohemiju Koledža za američke patologe („College of American Pathologists“, odn. CAP), kao i Proveru kvaliteta u imunohistohemiji instituta CLSI, Odobrene smernice (5, 6, 7). Verifikacija analize Pre prvog korišćenja sistema za bojenje u dijagnostičkoj proceduri, korisnik bi trebalo da izvrši verifikaciju izvođenja analize tako što će je testirati na seriji tkiva iz laboratorije sa poznatim karakteristikama izvođenja IHC-a, koje predstavljaju poznata pozitivna i negativna tkiva. Pročitajte procedure kontrole kvaliteta opisane u gorenavedenom odeljku o kontroli kvaliteta. Ove procedure kontrole kvaliteta bi trebalo ponoviti za svaku novu partiju antitela ili kada god dođe do promene parametara analize. Opcije identifikovanja i uklanjanja grešaka za potencijalne probleme, njihovi uzroci i sugerisano korektivno delovanje navedeni su tabeli 10. Interpretacija rezultata – NSCLC Potrebno je proceniti sve vijabilne tumorske ćelije na celoj pločici i uključiti ih u procenu rezultata PD-L1. Na obojenoj PD-L1 pločici mora da bude prisutno najmanje 100 vijabilnih tumorskih ćelija da bi se uzorak smatrao adekvatnim za procenu PD-L1. Da biste uspešno ocenili uzorke obojene sa kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, od suštinske je važnosti da se procene odgovarajuće ćelije, da se identifikuje odgovarajuća ćelijska lokalizacija i da se intenzitet bojenja ispravno interpretira. Procenu pločice treba da vrši patolog pomoću svetlosnog mikroskopa. Za procenu imunohistohemijskog bojenja i ocenjivanja, prikladno uvećanje objektiva je od 10 do 40x. U ocenjivanje treba uključiti sve primetno bojenje membrane tumorskih ćelija. Utvrdite rezultat za parcijalno ili celokupno bojenje ćelijske membrane (≥1+) koje se razlikuje od citoplazmatskog bojenja. Citoplazmatsko bojenje se smatra nespecifičnim bojenjem i nije obuhvaćeno procenom intenziteta bojenja. Normalne ćelije i imunološke ćelije povezane sa tumorom, kao što su infiltrirajući limfociti ili makrofagi ne treba uključivati u utvrđivanje rezultata radi određivanja pozitivnosti na PD-L1. Uzorci tumora obojeni reagensom za negativnu kontrolu moraju da imaju specifično bojenje 0 i pozadinsko bojenje <1+. Skor proporcije tumora (TPS) predstavlja procenat vijabilnih tumorskih ćelija sa delimičnim ili potpunim bojenjem membrane (≥1+). Uzorak treba da se smatra pozitivnim na PD-L1 ako je TPS ≥1% vijabilnih tumorskih ćelija sa bojenjem membrane bilo kog intenziteta (npr. ≥1+). Pri svakom ciklusu bojenja, pločice moraju da se pregledaju redosledom navedenim u tabeli 1, da bi se utvrdila validnost ciklusa bojenja i omogućila procena bojenja uzorka tkiva. Dodatne smernice potražite u Priručniku za interpretaciju iz kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Dodatne preporuke u vezi sa interpretacijom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx bojenja 1. Da biste verifikovali bojenje ćelijske membrane, primenite uvećanje objektiva od 10 do 40x. 2. Različiti elementi koji nisu ciljni, poput imunoloških ćelija povezanih sa tumorom (npr. makrofaga) i strome mogu takođe da se oboje

pozitivno na PD-L1, mada ih ne treba uključivati u određivanje rezultata. Tabela 1. Preporučeni redosled ocenjivanja pločica

Uzorci Objašnjenje Zahtevi 1. Hematoksilin i eozin (Dostavlja laboratorija)

Prvo se procenjuje obojenost tkivnog uzorka putem hematoksilina i eozina (H&E), da bi se procenila histologija tkiva i kvalitet očuvanosti.

Bojenje kompletom PD-L1 IHC 22C3 i hematoksilinom i eozinom bi trebalo izvršiti na serijskim isečcima iz istog parafinskog bloka uzorka. U uzorku mora da bude prisutno najmanje 100 vijabilnih tumorskih ćelija da bi se on smatrao adekvatnim za procenu PD-L1. Tkivni uzorci moraju da budu netaknuti, dobro očuvani i treba da potvrde indikaciju tumora.

2. Pločica sa kontrolnom ćelijskom linijom (Dostavlja kompanija Dako)

Pločica sa kontrolnom ćelijskom linijom obojena PD-L1 primarnim antitelom iz kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx se pregleda da bi se utvrdilo da svi reagensi ispravno funkcionišu. Pločica sa kontrolnom ćelijskom linijom sadrži pelet PD-L1 pozitivne ćelijske linije i pelet PD-L1 negativne ćelijske linije.

Jednu pločicu sa kontrolnom ćelijskom linijom bi trebalo obojiti primarnim antitelom za PD-L1 u svakom ciklusu bojenja. Kriterijumi za prihvatanje NCI-H226 (kontrolne ćelijske linije pozitivne na PD-L1): Bojenje ćelijske membrane ≥70% ćelija prosečnim intenzitetom bojenja od ≥2+. Nespecifično bojenje intenziteta <1+. Kriterijumi za prihvatanje MCF-7 (kontrolne ćelijske linije negativne na PD-L1): Nespecifično bojenje. Nespecifično bojenje intenziteta <1+. Imajte na umu da se povremeno može

primetiti bojenje nekoliko ćelija u MCF-7 ćelijskom peletu. Važe sledeći kriterijumi prihvatljivosti: prihvatljivo je prisustvo ukupno ≤10 ćelija sa jasnim bojenjem ćelijske membrane ili bojenje citoplazme sa intenzitetom ≥1+ u okviru ćelijskog peleta MCF-7.

Ako bilo koja od kontrolnih ćelijskih linija ne ispunjava te kriterijume, svi rezultati uzoraka pacijenta treba da se smatraju nevažećim.

3. Pločice sa pozitivnim kontrolnim tkivom (Dostavlja laboratorija)

Zatim se pregledaju pločice sa pozitivnim kontrolnim tkivom obojene PD-L1 primarnim antitelom i reagensom za negativnu kontrolu. Te pločice potvrđuju da su metod fiksacije i proces demaskiranja epitopa

Kontrolno tkivo treba da predstavlja biopsijske/hirurške uzorke iste indikacije tumora kao što je uzorak pacijenta, fiksirane, obrađene i ukalupljene što je pre moguće, na isti način kao što je to urađeno sa jednim ili više uzoraka pacijenta. Koristite netaknute uzorke za interpretaciju rezultata bojenja, jer se nekrotične ili degenerisane ćelije često boje nespecifično. Tkivo izabrano da se koristi kao pozitivno kontrolno tkivo treba da pruži slabo do

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 6/14

uspešni. Poznato pozitivno kontrolno tkivo sme da se koristi samo za nadzor ispravnog rada obrađenog tkiva i reagensa za testiranje, a NE kao pomoć pri uspostavljanju konkretne dijagnoze uzoraka pacijenta.

umereno pozitivno bojenje kada se oboji sa PD-L1, kako bi pomoglo u detekciji suptilnih promena osetljivosti analize. Svaki ciklus bojenja treba da sadrži dve pločice sa pozitivnim kontrolnim tkivom. Pločica obojena sa PD-L1: Trebalo bi da se primeti prisustvo smeđeg bojenja ćelijske membrane. Nespecifično bojenje treba da iznosi ≤1+. Pločica obojena reagensom za negativnu kontrolu: Nema bojenja membrane. Nespecifično bojenje treba da iznosi ≤1+. Ako pozitivno kontrolno tkivo ne pokaže odgovarajuće pozitivno bojenje, rezultate test uzoraka treba smatrati nevažećim.

4. Pločice sa negativnim kontrolnim tkivom (Dostavlja laboratorija)

Potom se pregledaju pločice sa negativnim kontrolnim tkivom (poznato da su PD-L1 negativna) obojene PD-L1 primarnim antitelom i reagensom za negativnu kontrolu, kako bi se utvrdila specifičnost označavanja ciljnog antigena putem primarnog antitela. Druga mogućnost je da negativni delovi pozitivnog kontrolnog tkiva posluže kao negativno kontrolno tkivo, ali korisnik to mora da potvrdi.

Kontrolno tkivo treba da predstavlja biopsijske/hirurške uzorke iste indikacije tumora kao što je uzorak pacijenta, fiksirane, obrađene i ukalupljene što je pre moguće, na isti način kao što je to urađeno sa jednim ili više uzoraka pacijenta. Svaki ciklus bojenja treba da sadrži dve pločice sa negativnim kontrolnim tkivom. Pločica obojena sa PD-L1: Nema bojenja membrane tumorskih ćelija. Nespecifično bojenje treba da iznosi ≤1+. Pločica obojena reagensom za negativnu kontrolu: Nema bojenja membrane. Nespecifično bojenje treba da iznosi ≤1+. Ukoliko dođe do specifičnog bojenja ćelijske membrane na pločicama sa negativnim kontrolnim tkivom, rezultate dobijene iz uzoraka pacijenta treba smatrati nevažećim.

5. Pločica tkiva pacijenta obojena reagensom za negativnu kontrolu

Pregledajte uzorke pacijenta obojene reagensom za negativnu kontrolu iz kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Reagens za negativnu kontrolu se koristi umesto primarnog antitela i pomaže pri interpretaciji specifičnog bojenja na mestu antigena.

Odsustvo bojenja ćelijske membrane potvrđuje specifično označavanje ciljnog antigena primarnim antitelom. Nespecifično bojenje treba da iznosi ≤1+.

6. Pločica tkiva pacijenta obojena PD-L1 primarnim antitelom

Pregledajte celu pločicu uzoraka pacijenta obojenu PD-L1 primarnim antitelom iz kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Specifične informacije u vezi sa imunoreaktivnošću kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx potražite u odeljcima „Sažetak i objašnjenje“, „Ograničenja“ i „Karakteristike izvođenja“.

Intenzitet pozitivnog bojenja treba proceniti u kontekstu sveg nespecifičnog pozadinskog bojenja primećenog na pločici sa reagensom za negativnu kontrolu u okviru istog ciklusa. Kao i kod svih imunohistohemijskih testova, negativni rezultat znači da antigen nije detektovan, ne nužno da antigen nije prisutan u analiziranim ćelijama/tkivu. Potrebno je proceniti sve vijabilne tumorske ćelije na celoj pločici tkiva pacijenta obojenoj sa PD-L1 i uključiti ih u procenu rezultata PD-L1. U uzorku mora da bude prisutno najmanje 100 vijabilnih tumorskih ćelija da bi se on smatrao adekvatnim za procenu PD-L1.

Opšta ograničenja 1. Imunohistohemija je dijagnostički proces u više koraka koji zahteva stručnu obuku za odabir odgovarajućih reagensa, tkivnih

uzoraka, fiksacije i obrade, pripremu imunohistohemijske pločice i tumačenje rezultata bojenja. 2. Bojenje tkiva zavisi od rukovanja tkivom i njegove obrade pre bojenja. Neodgovarajuća fiksacija, zamrzavanje, otapanje, ispiranje,

sušenje, zagrevanje, isecanje ili kontaminacija drugim tkivima ili tečnostima može da dovede do stvaranja artefakata, zarobljavanja antitela ili lažno negativnih rezultata. Na nedoslednost rezultata mogu da utiču promene u metodima fiksacije i kalupljenja ili bitne neregularnosti unutar tkiva.

3. Prekomerno ili nepotpuno kontrastno bojenje može da dovede do nepouzdanosti ispravnog tumačenja rezultata. 4. Klinička interpretacija svakog pozitivnog bojenja ili njegovog odsustva mora da se proceni u kontekstu kliničke prezentacije,

morfologije i drugih histopatoloških kriterijuma. Klinička interpretacija svakog bojenja ili njegovog odsustva mora da se dopuni morfološkim ispitivanjem i odgovarajućim kontrolnim i drugim dijagnostičkim testovima. Za tumačenje obojenog preparata odgovoran je kvalifikovani patolog koji je upoznat sa antitelima, reagensima i metodima koje treba koristiti. Bojenje mora da se obavlja u ovlašćenoj licenciranoj laboratoriji pod nadzorom patologa koji je odgovoran za pregledanje obojenih preparata i osiguravanje adekvatnosti pozitivnih i negativnih kontrola.

5. Kod tkiva osoba koje su zaražene virusom hepatitisa B i sadrže hepatitis B površinski antigen (HBsAg) može se ispoljiti netipično bojenje peroksidazom rena (7).

6. Reagensi mogu pokazati neočekivanu reakciju na prethodno netestirane tipove tkiva. Mogućnost neočekivanih reakcija, čak i kod testiranih tipova tkiva, ne može u potpunosti da se zanemari zbog biološke varijabilnosti ekspresije antigena u neoplazmi ili drugim patološkim tkivima. Obratite se Dako tehničkoj podršci sa dokumentovanim neočekivanim reakcijama.

7. Lažno pozitivni rezultati mogu se uočiti zbog neimunološkog vezivanja proteina ili proizvoda reakcije sa supstratom. Može da ih uzrokuje i aktivnost pseudoperoksidaze (eritrociti) i aktivnost endogene peroksidaze (citohrom C) (7).

8. Reagensi i uputstva dostavljena uz ovaj sistem su osmišljena za optimalnu učinkovitost. Dalje razblaživanje reagensa ili izmena trajanja inkubacije ili temperature može da proizvede netačne ili neusklađene rezultate.

Ograničenja specifična za proizvod 1. Do nastanka lažno negativnih rezultata može da dođe usled degradacije antigena u tkivima tokom vremena. Uzorci moraju da se

oboje u roku od šest meseci od poklapanja tkiva na pločicama, koje se čuvaju na mračnom mestu, na temperaturi od 2 do 8 °C (poželjno) ili na sobnoj temperaturi od najviše 25 °C.

2. Da bi se dobili optimalni i ponovljivi rezultati, protein PDL1 zahteva predtretman u vidu demaskiranja cilja kada su tkiva rutinski fiksirana (neutralni puferovani formalin) i ukalupljena u parafinu.

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 7/14

3. Nemojte menjati reagense sa drugim brojem partije ovog proizvoda, niti iz kompleta drugih proizvođača. Jedini izuzetak je rastvor za demaskiranje cilja EnVision FLEX, sa niskom pH vrednošću 50x, koji je dostupan pod šifrom K8005 ukoliko vam je potreban.

4. Obojene kontrolne ćelijske linije smeju da se koriste samo za validaciju ciklusa bojenja i ne smeju da se koriste za određivanje rezultata reakcije bojenja na isečcima tkiva.

5. Primena kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx na tkivima fiksiranim sredstvima izuzev formalina nije potvrđena. 6. Primena kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx na aspiratima tankom iglom nije potvrđena. Ocenjivanje kliničkih rezultata Klinička prednost kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je proučavana u okviru multicentrične otvorene randomizovane kliničke studije sprovedene radi procene bezbednosti i efikasnosti leka KEYTRUDA kod pacijenata sa uznapredovalim karcinomom NSCLC (9). Pacijenti su bili pozitivni na PD-L1 na kliničkom probnom testu (CTA) i kod njih je došlo do progresije bolesti nakon lečenja hemoterapijom koja sadrži platinu. Kod pacijenata sa genomskim aberacijama tumora EGFR i ALK je došlo do progresije bolesti nakon terapije odobrene od strane FDA za te aberacije, pre primanja leka KEYTRUDA. Pacijenti su randomizacijom raspoređeni u grupe (1:1:1) i primali su 2 mg/kg (n=344) ili 10 mg/kg (n=346) leka KEYTRUDA svake 3 nedelje ili 75 mg/m2 docetaksela svake 3 nedelje (n=343). Procena statusa tumora vršena je svakih 9 nedelja. Primarne kranje tačke efikasnosti su bile ukupno preživljavanje (eng. Overall Survival, odn. OS) i preživljavanje bez progresije (eng. Progression-Free Survival, odn. PFS) u odnosu na kriterijume za procenu odgovora kod čvrstih tumora verzije 1.1 (eng. Response Evaluation Criteria on Solid Tumors, odn. RECIST 1.1) na osnovu slepe analize nezavisnih radiologa. Na osnovu CTA analize, u okviru studije su randomizovana 1033 pacijenta sa karcinomom NSCLC. Da bi se procenila klinička korist kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, u američkoj referentnoj laboratoriji su retrospektivno testirani arhivirani uzorci iz kliničke studije, koristeći komplet PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Od 1033 pacijenta, retrospektivno je testirano tkivo 529 pacijenata korišćenjem testova PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Uzorci od 413 pacijenata bili su pozitivni na ekspresiju PD-L1 (≥1% vijabilnih tumorskih ćelija je pokazalo bojenje membrane bilo kog intenziteta) i uzorci od 94 pacijenta su bili negativni na ekspresiju PD-L1 (<1% vijabilnih tumorskih ćelija je pokazalo bojenje membrane bilo kog intenziteta). Od tih 413 pacijenata sa pozitivnom ekspresijom PD-L1, uzorci od 163 pacijenta su imali visoku ekspresiju PD-L1 (≥50% vijabilnih tumorskih ćelija je prikazalo bojenje membrane bilo kog intenziteta). Nivo podudaranja postignut između CTA analize i kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx prikazan je u tabeli 2. Tabela 2: Slaganje CTA i PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Stope slaganja PD-L1 Granična vrednost

Procenat negativnog slaganja (95% intervala pouzdanosti (engl. confidence interval, odn. CI))

Procenat pozitivnog slaganja (95% intervala pouzdanosti (CI))

CTA u poređenju sa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1% 94,5% [91,4%–96,6%] 80,0% [76,9%–82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1%–99,0%] 73,2% [67,9%–77,9%]

U grupi randomizovanih pacijenata pozitivnih na testu kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, demografske i druge osnovne karakteristike između grana lečenja bile su dobro uravnotežene. Medijana starosti iznosila je 63 godine (44% pacijenata je imalo 65 ili više godina). Većina pacijenata je bila evropeidne rase (77%) i muškog pola (58%); osnovni ECOG status učinka je bio 0 (29%) ili 1 (71%). Sedamdeset osam procenata (78%) pacijenata bili su bivši/trenutni pušači. Dvadeset dva procenta (22%) pacijenata je imalo skvamoznu histologiju, a 69% neskvamoznu. Osnovne i demografske karakteristike su bile slično dobro uravnotežene između grupe sa pembrolizumabom i docetakselom u celoj kliničkoj studiji. Rezultati efikasnosti su sažeti u tabeli 3. Lek KEYTRUDA je pokazao izdržljivu kliničku korist kod pacijenata sa karcinomom NSCLC sa pozitivnom ekspresijom PD-L1 uz TPS 1%, što je pojačano kod pacijenata sa visokom ekspresijom PD-L1 uz TPS 50%, što je utvrđeno kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Opseg koristi se mogao porediti sa onim postignutim kod celokupnog kliničkog ispitivanja. U tabeli 2 su sažete ključne mere efikasnosti u ukupnoj PD-L1 pozitivnoj populaciji (TPS 1%) i u podgrupi sa visokom ekspresijom PD-L1 (TPS 50%) za celo kliničko ispitivanje (PD-L1 pozitivno na osnovu analize CTA) i u populaciji pozitivnoj na osnovu analize kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Na slici 1 je prikazana Kaplan-Majerova kriva za OS (TPS 1%, na osnovu analize kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx).

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 8/14

Tabela 3: Odgovor na lek KEYTRUDA kod pacijenata sa karcinomom NSCLC koji su prethodno lečeni: Ukupna klinička studija i pacijenti pozitivni na test PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: PD-L1 TPS 1% i TPS 50%

Krajnja tačka KEYTRUDA 2 mg/kg svake 3 nedelje

KEYTRUDA 10 mg/kg svake 3 nedelje

Docetaksel 75 mg/m2 svake 3 nedelje

Kliničko ispitivanje

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx





TPS 1%

Broj pacijenata 344 140 346 142 343 131 OS Smrtni ishodi (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Stopa rizika* (95% CI)

0,71 (0,58, 0,88)

0,54 (0,37, 0,78)

0,61 (0,49, 0,75)

0,57 (0,39, 0,82)

--- ---

p-vrednost† <0,001 <0,001 <0,001 0,00115 --- ---

Medijana u mesecima (95% CI)

10,4 (9,4, 11,9)

11,8 (9,6, nije primenljivo)

12,7 (10,0, 17,3)


8,5 (7,5, 9,8)

7,5 (6,3, 9,9)

PFS‡ Događaji (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Stopa rizika* (95% CI)

0,88 (0,73, 1,04)

0,68 (0,50, 0,92)

0,79 (0,66, 0,94)

0,79 (0,59, 1,06)

--- ---

p-vrednost† 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- Medijana u mesecima (95% CI)

3,9 (3,1, 4,1)

4,9 (4,1, 6,2)

4,0 (2,6, 4,3)

4,0 (2,2, 4,6)

4,0 (3,1, 4,2)

3,8 (2,2, 4,2)

Ukupna stopa odgovora‡

ORR %§ (95% CI)

18% (14, 23)

24% (17, 32)

18% (15, 23)

20% (14, 28)

9% (7, 13)

5% (2, 11)

TPS 50%

Broj pacijenata 139 56 151 60 152 47 OS Smrtni ishodi (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Stopa rizika* (95% CI)

0,54 (0,38, 0,77)

0,45 (0,24, 0,84)

0,50 (0,36, 0,70)

0,29 (0,15, 0,56)

--- ---

p-vrednost† <0,001 0,00541 <0,001 <0,001 --- ---



Nije postignuto (9,3, nije primenljivo)


Nije postignuto (8,3, nije primenljivo)

8,2 (6,4, 10,7)

7,2 (4,4, 8,3)

PFS‡ Događaji (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Stopa rizika* (95% CI)

0,58 (0,43, 0,77)

0,47 (0,28, 0,80)

0,59 (0,45, 0,78)

0,41 (0,24 0,70)

--- ---

p-vrednost† <0,001 0,00221 <0,001 <0,001 --- ---


5,2 (4,0, 6,5)

5,9 (4,2, 9,0)

5,2 (4,1, 8,1)


4,1 (3,6, 4,3)

3,9 (2,0, 4,3)

Ukupna stopa odgovora ‡

ORR %§ (95% CI)

30% (23, 39)

37% (25, 52)

29% (22, 37)

28% (18, 41)

8% (4, 13)

4% (1, 15)

* Stopa rizika (KEYTRUDA u poređenju sa docetakselom) na osnovu stratifikovanog Koksovog modela proporcionalnog rizika † Na osnovu stratifikovanog „log rank“ testa ‡ Procenjeno pomoću BICR koristeći RECIST 1.1 § Svi odgovori su bili delimični odgovori ¶ Na osnovu pacijenata sa najboljim ukupnim odgovorom, kao što je potvrđeno potpunim ili delimičnim odgovorom

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 9/14

Slika 1: Kaplan-Majerova kriva ukupnog preživljavanja po grani lečenja (TPS 1% na osnovu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, populacija predviđena za lečenje)

Dodatne analize robusnosti su sprovedene da bi se razmotrio potencijalni uticaj podataka koji nedostaju, a koji potiču od pacijenata sa pozitivnim rezultatom na testu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, ali za koje je CTA analizom možda utvrđeno da su negativni. Pacijenti sa takvim rezultatima testa su deo populacije predviđene za ispitivanje namene / i populacije predviđene za dijagnostiku (ITD) za komplet PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Međutim, oni su isključeni iz kliničkog istraživanja zbog negativnog rezultata na CTA skriningu. Da bi se nadoknadili ti podaci koji nedostaju, sprovedena je analiza osetljivosti, kako bi se razumeo moguć opseg stope rizika (HR) procenjen na osnovu kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx kod potpopulacija sa vrednošću TPS 1% i TPS 50% pod okvirom ITD-a, da bi se potvrdila doslednost sa primećenom stopom rizika zasnovanom na uključivanju u studiju nakon CTA analize. Rezultati analize osetljivosti HR su pokazali da su procene HR robusne u odnosu na svaku pretpostavljenu atenuaciju efekta lečenja u okviru ITD-a.

Vreme u mesecima n pod rizikom

Docetaksel 75 mg/m2 Q3W

MK – 3475 2 mg/kg Q3W

MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Docetaksel 75 mg/m2 Q3W MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Uku

pno

prež

ivlja

vanj

e (%

)

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 10/14

Ocenjivanje nekliničkih rezultata Analitička osetljivost/specifičnost Analitička osetljivost testa PD-L1 IHC 22C3 pharmDx je ispitana na 127 FFPE uzoraka jedinstvenih slučajeva nesitnoćelijskog karcinoma pluća (NSCLC), stepena od I do IV, koristeći proizvedenu partiju. Procena ekspresije PD-L1 prikazala je bojenje u opsegu od 0 do 100% pozitivnih tumorskih ćelija i intenzitet bojenja od 0 do 3. Normalna tkiva: U tabeli 4 dat je pregled imunorekativnosti monoklonskog mišjeg anti-PD-L1, klon 22C3 na preporučenom panelu normalnog tkiva. Bojenje ćelijske membrane je uočeno na imunim i epitelnim ćelijama. Bojenje citoplazme je uočeno na nekim tipovima ćelija ali nije zabeležno kao pozitivno bojenje. Sva tkiva su fiksirana u formalinu, ukalupljena u parafinu i obojena kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, u skladu sa instrukcijama u priloženom uputstvu. U ispitivanim tipovima ćelija i tipovima tkiva nisu zabeleženi neočekivani rezultati. Uočeno bojenje bilo je konzistentno sa izveštajima u literaturi za PD-L1 IHC ekspresiju u normalnom tkivu (10, 11). Tabela 4: Sažetak reaktivnosti normalnog tkiva na komplet PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Tip tkiva (br. testiranih)

Pozitivno bojenje ćelijske membrane: Elementi tkiva

Pozitivno bojenje citoplazme: Elementi tkiva

Netipično bojenje

Adrenalno (3) 0/3 1/3 medularne ćelije 0/3 Bubreg (3) 1/3 tubularnih epitela 0/3 0/3 Cerviks (3) 1/3 epitela 0/3 0/3 Debelo crevo (3) 2/3 makrofaga 0/3 0/3 Dojka (3) 0/3 0/3 0/3 Hipofiza (3) 1/3 prednji režanj hipofize

1/3 zadnji režanj hipofize 1/3 prednji režanj hipofize 1/3 zadnji režanj hipofize

0/3

Jajnik (3) 0/3 0/3 0/3 Jednjak (3) 0/3 0/3 0/3 Jetra (3) 1/3 makrofaga

1/3 hepatocita 0/3 0/3

Koštana srž (3) 3/3 megakariocita 3/3 megakariocita 0/3 Koža (3) 0/3 0/3 0/3 Krajnik (3) 2/3 germinativnog centra

(makrofagi) 3/3 kriptnog epitela

0/3

0/3

Mali mozak (3) 0/3 0/3 0/3 Materica (3) 0/3 0/3 0/3 Mezotelne ćelije (2) 0/2 0/2 0/2 Mišić, skeletni (3) 0/2 0/2 0/2 Mišić, srčani (3) 0/3 0/3 0/3 Nerv, periferni (3) 0/3 1/3 vezivnog tkiva / krvnih sudova 0/3 Pankreas (3) 0/3 0/3 0/3 Paratireoida (3) 1/3 žlezdanih epitela 0/3 0/3 Plućno krilo (3) 3/3 alveolarnih makrofaga 0/3 0/3 Pljuvačna žlezda (3) 0/3 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 epitela 0/2 0/2 Slezina (3) 2/3 makrofaga 0/3 0/3 Tanko crevo (3) 0/3 0/3 0/3 Testis (3) 0/3 0/3 0/3 Timus (3) 3/3 medularnog epitela 0/3 0/3 Tireoidea (3) 0/3 0/3 0/3 Veliki mozak (3) 0/3 0/3 0/3 Želudac (3) 1/3 gastrične žlezde

2/3 limfocita 1/3 gastrične žlezde

0/3

Neoplastično tkivo: U tabeli 5 dat je pregled imunoreaktivnosti monoklonskog mišjeg anti-PD-L1, klon 22C3 na panelu neoplastičnog tkiva. Bojenje ćelijske membrane je uočeno na imunim i epitelnim ćelijama. Bojenje citoplazme je uočeno na nekim tipovima ćelija ali nije zabeležno kao pozitivno bojenje. Sva tkiva su fiksirana u formalinu, ukalupljena u parafinu i obojena kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, u skladu sa instrukcijama u priloženom uputstvu. U ispitivanim uzorcima tumora nisu zabeleženi neočekivani rezultati. Uočeno bojenje bilo je konzistentno sa izveštajima u literaturi za PD-L1 IHC ekspresiju u neoplastičnom tkivu (10-13). Tabela 5: Sažetak reaktivnosti neoplastičnog tkiva na komplet PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Tip tumora Lokacija PD-L1 pozitivno/ukupno N=159

Adenokarcinom

Apendiks 0/1 Cerviks, endocervikalni tip 0/1 Debelo crevo 0/5 Debelo crevo, mucinozni 0/1 Debelo crevo, sa metastazom na jetri 0/1 Dojka, DCIS 0/2 Dojka, invazivni duktalni 0/7 Dojka, sa invazivnom duktalnom metastazom limfnih čvorova

0/1

Gastrointestinalni, sa metastazom na plućima

0/1

Glava i vrat, tvrdo nepce 0/1

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 11/14


Jajnik 0/1 Jajnik, endometriozni 0/1 Jajnik, mucinozni 0/1 Jajnik, ozbiljni 0/1 Jednjak 0/1 Materica, endometrijum 0/3 Materica, svetle ćelije 0/1 Pankreas 0/2 Pankreas, duktalni 0/3 Plućno krilo 1/4 Pljuvačna/doušna žlezda 0/2 Prostata 0/5 Rektum 0/4 Tanko crevo 0/2 Tireoidea, folikularni 0/1 Tireoidea, folikularno-papilarni 0/1 Tireoidea, papilarni 0/3 Želudac 0/6 Želudac, mucinozni 0/1 Žučna kesa 1/5

Adenokortikalni karcinom Adrenalno 0/1 Astrocitom Veliki mozak 0/3 Embrionalni karcinom Testis 0/1 Ependimom Mozak 0/1 Feohromocitom Adrenalno 0/1 Glioblastom Mozak 0/1 Hepatoblastom Jetra 0/1 Hepatocelularni karcinom Jetra 0/5 Hondrosarkom Kosti 0/1 Hordom Karlična duplja 0/1

Intersticijalni karcinom Debelo crevo 0/1 Rektum 0/1 Tanko crevo 0/1

Karcinom Nazofaringealni, NPC 0/1 Karcinom bazalnih ćelija Koža 0/1

Karcinom ćelija pečatnog prstena Debelo crevo 0/1 Karcinom ćelija pečatnog prstena debelog creva sa metastazom na jajnicima

0/1

Karcinom prelaznih ćelija Bešika 0/6 Bubreg 0/1

Karcinom renalnih ćelija Papilarni Bubreg 0/1 Svetle ćelije Bubreg 0/6 Karcinom sitnih ćelija Plućno krilo 0/1

Karcinom skvamoznih ćelija

Cerviks 2/5 Glava i vrat 0/2 Jednjak 0/7 Karcinom skvamoznih ćelija ezofagusa sa metastazom na limfnim čvorovima

0/1

Koža 0/2 Materica 0/1 Plućno krilo 1/2

Lejomiosarkom Bešika 0/1 Meko tkivo, zid grudnog koša 0/1

Limfom Anaplastični krupnoćelijski Limfni čvor 0/1 Difuzni B-ćelijski Limfni čvor 0/4 Hočkinov Limfni čvor 2/2 Nije Hočkinov Limfni čvor 1/1 Medularni karcinom Tireoidea 0/1 Meduloblastom Mozak 0/1

Melanom Nosna duplja 0/1 Rektum 0/1

Meningiom Mozak 0/2 Mezoteliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Meko tkivo, donji deo leđa 0/1 Osteosarkom Kosti 0/2 Primitivni neuroektodermalni tumor (PNET)

Retroperitoneum 0/1

Rabdomiosarkom Meko tkivo, embrionalni 0/1 Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1

Seminom Testis 0/2

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 12/14


Sinovijalni sarkom Karlična duplja 0/1 Spermatocitom Testis 0/2 Timom Medijastinum 1/1 Tumor ostrvskih ćelija Pankreas 0/1 Ponovljivost / eksterna reproducibilnost Ponovljivost i reproducibilnost kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx procenila je kompanija Dako i tri eksterne ustanove za testiranje. Podaci o učinkovitosti su dati u tabelama 6–9. Kod ispitivanja ponovljivosti u kompaniji Dako, procenat negativnog slaganja (NPA), procenat pozitivnog slaganja (PPA) i ukupno slaganje (OA) su određeni za ≥ 1% granične vrednosti i ≥ 50% granične vrednosti, kao što je prikazano u tabelama 6 i 7. Budući da su ispitivanja ponovljivosti pokazala 100% slaganja, intervali pouzdanosti su izračunati metodom Vilsonovog skora, na osnovu broja nezavisnih poređenja parova. Kod eksternih ispitivanja reproducibilnosti, prosečan procenat negativnog slaganja (ANA), prosečan procenat pozitivnog slaganja (APA) i procenat ukupnog slaganja (OA) su određeni za ≥ 1% granične vrednosti i ≥ 50% granične vrednosti, kao što je prikazano u tabelama 8 i 9 u nastavku. Prosečna slaganja su izračunata budući da ne postoji prirodna referenca u parametrima reproducibilnosti, kao što su lokacija i ocenjivač. Intervali pouzdanosti za prosečna slaganja izračunati su koristeći procentualni metod ponovnog uzorkovanja. (Imajte na umu da studije ponovljivosti nisu analizirane koristeći intervale pouzdanosti ponovnog uzorkovanja, jer se to ne može izračunati na osnovu podataka sa nultim odstupanjem.) Tabela 6: Ponovljivost testiranja kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ispitana na jednoj lokaciji (≥1%)

Ispitivanje ponovljivosti

Dijagnostička granična vrednost Dizajn studije % slaganja (95% CI)

Različiti instrumenti

≥1% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testiran je na svakom od šest instrumenata Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2–100%) PPA 100% (91,2–100%) OA 100% (95,4–100%)

Različiti rukovaoci

≥1% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirao je svaki od šest analitičara na jednom instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,0–100%) PPA 100% (91,2–100%) OA 100% (95,4–100%)

Različiti dani

≥1% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je šest neuzastopnih dana na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2–100%) PPA 100% (91,2–100%) OA 100% (95,4–100%)

Različite partije ≥1% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je trima replikatima i svakom od tri partije reagensa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 98,6% (96,0–100%) PPA 98,6% (95,7–100%) OA 98,6% (95,8–100%)

U okviru istog ciklusa ≥1% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je korišćenjem šest replikata u okviru jednog ciklusa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2–100%) PPA 100% (91,2–100%) OA 100% (95,4–100%)

U okviru istog dana ≥1% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je u dva ciklusa u okviru istog dana, što je ponavljano tri dana, na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,0–100%) PPA 100% (91,2–100%) OA 100% (95,4–100%)

NPA = procenat negativnog slaganja; PPA = procenat pozitivnog slaganja; OA = ukupno slaganje Tabela 7: Ponovljivost testiranja kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testirana na jednoj lokaciji (≥50%)



Različiti instrumenti

≥50% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testiran je na svakom od šest instrumenata Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9–100%) PPA 100% (88,6–100%) OA 100% (95,4–100%)

Različiti rukovaoci

≥50% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirao je svaki od šest analitičara na jednom instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,7–100%) PPA 100% (88,6–100%) OA 100% (95,4–100%)

Različiti dani

≥50% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je šest neuzastopnih dana na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9–100%) PPA 100% (88,6–100%) OA 100% (95,4–100%)

Različite partije ≥50% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (8 PD-L1 negativnih i 8 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je trima replikatima i svakom od tri partije reagensa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,6–100%) PPA 100% (92,6–100%) OA 100% (96,2–100%)

U okviru istog ciklusa ≥50% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je sa šest replikata u okviru jednog ciklusa na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9–100%) PPA 100% (88,6–100%) OA 100% (95,4–100%)

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 13/14



U okviru istog dana ≥50% Svaki od 16 NSCLC uzoraka (10 PD-L1 negativnih i 6 PD-L1 pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testirano je u dva ciklusa u okviru istog dana, što je ponavljano tri dana, na instrumentu Autostainer Link 48.

NPA 100% (88,3–100%) PPA 100% (82,4–100%) OA 100% (92,4–100%)

NPA = procenat negativnog slaganja; PPA = procenat pozitivnog slaganja; OA = ukupno slaganje Tabela 8: Reproducibilnost testiranja kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx ispitana na tri eksterne lokacije (≥1%)

Studija o reproducibilnosti


Različite ustanove ≥1% Svaki od 36 NSCLC uzoraka (16 PD-L1-negativnih i 20 PD-L1-pozitivnih) sa opsegom ekspresije PD-L1 IHC testiran je pet neuzastopnih dana. Analiza u različitim ustanovama je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 2700 poređenja parova.

ANA 94,8% (90,3–98,4%) ANA 95,5% (91,2–98,7%) OA 95,2% (90,8–98,6%)

U okviru iste ustanove ≥1% Svaki od 36 NSCLC uzoraka (16 PD-L1-negativnih i 20 PD-L1-pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testiran je pet neuzastopnih dana na svakoj od tri lokacije ispitivanja. Analiza u okviru iste ustanove je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 1080 poređenja parova.

ANA 96,2% (94,1–97,5%) ANA 96,7% (95,0–97,9%) OA 96,5% (95,2–97,4%)

Različiti posmatrači ≥1% Ocenjivanje 62 NSCLC uzorka (28 PD-L1 negativnih i 34 PD-L1 pozitivna) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije, obojena pomoću kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, po jedan na svakoj lokaciji studije, tri neuzastopna dana. Analiza od strane različitih posmatrača je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 1674 poređenja parova.

ANA 85,8% (79,3-91,8%) ANA 88,2% (82,2-93,3%) OA 87,1% (81,0 -92,6%)

Isti posmatrač ≥1% Ocenjivanje 62 NSCLC uzorka (28 PD-L1 negativnih i 34 PD-L1 pozitivna) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije, obojena pomoću kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, po jedan na svakoj lokaciji studije, tri neuzastopna dana. Analiza od strane jednog posmatrača je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 558 poređenja parova.

ANA 93,7% (90,0-96,1%) ANA 94,8% (91,6-96,7%) OA 94,3% (92,0 -95,9%)

ANA = prosečno negativno slaganje; APA = prosečno pozitivno slaganje; OA = ukupno slaganje Tabela 9: Reproducibilnost testiranja kompletom PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testirana na tri eksterne lokacije (≥50%)

Studija o reproducibilnosti


Različite ustanove ≥50% Svaki od 36 NSCLC uzoraka (21 PD-L1-negativnih i 15 PD-L1-pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testiran je pet neuzastopnih dana. Analiza u različitim ustanovama je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 2700 poređenja parova.

ANA 90,3% (84,4–95,2%) ANA 85,2% (75,6–92,9%) OA 88,3% (81,4–94,3%)

U okviru iste ustanove ≥50% Svaki od 36 NSCLC uzoraka (21 PD-L1-negativnih i 15 PD-L1-pozitivnih) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije testiran je pet neuzastopnih dana na svakoj od tri lokacije ispitivanja. Analiza u okviru iste ustanove je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 1080 poređenja parova.

ANA 91,9% (88,8–94,8%) ANA 87,6% (82,5–92,2%) OA 90,2% (86,3–93,7%)

Različiti posmatrači ≥50% Ocenjivanje 62 NSCLC uzorka (30 PD-L1 negativnih i 32 PD-L1 pozitivna) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije, obojena pomoću kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, po jedan na svakoj lokaciji studije, tri neuzastopna dana. Analiza od strane različitih posmatrača je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 1674 poređenja parova.

ANA 92,6% (87,8–96,7%) ANA 92,8% (88,1–96,8%) OA 92,7% (88,1–96,8%)

Isti posmatrač ≥50% Ocenjivanje 62 NSCLC uzorka (30 PD-L1 negativnih i 32 PD-L1 pozitivna) sa opsegom PD-L1 IHC ekspresije, obojena pomoću kompleta PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, izvršila su tri patologa, po jedan na svakoj lokaciji studije, tri neuzastopna dana. Analiza od strane jednog posmatrača je sprovedena na tri lokacije, na ukupno 558 poređenja parova.

ANA 96,4% (94,0–98,5%) ANA 96,5% (94,3–98,6%) OA 96,4% (94,3–98,6%)

ANA = prosečno negativno slaganje; APA = prosečno pozitivno slaganje; OA = ukupno slaganje

P03928RS_03/SK00621-2/2016.11 str. 14/14

Identifikovanje i uklanjanje grešaka Tabela 10: Identifikovanje i uklanjanje grešaka Problem Moguć uzrok Sugerisano delovanje 1. Nema bojenja pločica 1a. Greška u programiranju.

1a. Potvrdite da je za programiranje pločica izabran program PD-L1 IHC 22C3 pharmDx.

1b. Izostanak reakcije sa DAB+ supstrat hromogen rastvorom (DAB)

1b. Potvrdite da je supstrat hromogen rastvor DAB+ ispravno pripremljen.

1c. Natrijum-azid u puferu za ispiranje. 1c. Koristite samo Dako pufer za ispiranje (šifra K8007).

1d. Degradacija kontrolnog preparata 1d. Proverite datum isteka roka trajanja kompleta i uslove čuvanja kompleta na spoljašnjosti ambalaže.

2a. Slabo bojenje pločica sa uzorkom. 2a. Primenjen je neodgovarajući metod fiksacije.

2a. Pobrinite se za to da se koriste samo odobreni fiksativi i metodi fiksacije.

2b. Slabo bojenje pločica sa uzorkom ili pozitivne ćelijske linije na kontrolnom preparatu kog dostavlja kompanija Dako.

2b. Neadekvatno demaskiranje cilja. 2b. Proverite da li je pravilno obavljena procedura predtretmana „3 u 1“.

3. Prekomerno pozadinsko bojenje pločica.

3a. Parafin nije uklonjen u potpunosti. 3a. Potvrdite da je procedura predtretmana 3-u-1 ispravno obavljena.

3b. Pločice su se osušile prilikom postavljanja u instrument Autostainer Link 48.

3b. Pobrinite se za to da pločice ostanu navlažene puferom dok ih postavljate i pre nego što pokrenete ciklus.

3c. Nespecifično vezivanje reagensa na isečak tkiva.

3c. Proverite da li je uzorak ispravno fiksiran i/ili da li postoji nekroza.

4. Tkivo se odvojilo od pločica. 4. Primena neodgovarajućih mikroskopskih pločica.

4. Koristite Dako FLEX IHC mikroskopske pločice (šifra K8020) ili pločice sa nabojem (poput Fisherbrand Superfrost Plus).

5. Prejako specifično bojenje. 5a. Primenjen je neodgovarajući metod fiksacije.

5a. Pobrinite se za to da se koriste samo odobreni fiksativi i metodi fiksacije.

5b. Primenjen je neodgovarajući pufer za ispiranje.

5b. Koristite samo Dako pufer za ispiranje (šifra K8007).

6. Rastvor za demaskiranje cilja se zamućuje pri zagrevanju.

6. Rastvor za demaskiranje cilja postaje zamućen pri zagrevanju.

6. Ovo je normalna pojava i ne utiče na bojenje.

NAPOMENA: Ako problem ne može da se pripiše nijednom od gorenavedenih uzroka ili ako sugerisano korektivno delovanje ne reši problem, obratite se Dako tehničkoj podršci radi dalje pomoći. Dodatne informacije o tehnikama bojenja i pripremi uzroka možete da potražite u edukativnom vodiču kompanije Dako: Metodi imunohistohemijskog bojenja (5) (može se nabaviti od kompanije Dako). Reference 1. Keytruda® package insert. 2. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91. 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures

for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976.

4. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000.

5. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.

6. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999. .

7. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626.

8. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28.

9. Herbst RS, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online 2015 Dec 19.

10. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. 11. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic

Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003; 170:1257. 12. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor

in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. 13. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and Virus-

Associated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473.

Kataloški broj Ograničenja temperature Medicinski uređaj za in vitro dijagnostiku

Proizvođač Kôd serije Sadrži dovoljnu količinu za <N> testove

Upotrebljivo do Pročitajte uputstvo za upotrebu Ovlašćeni predstavnik u Evropskoj zajednici

PT0020/ Rev C

Dako North America, Inc.6392 Via RealCarpinteria, California 93013 USA

Tel 805 566 6655Fax 805 566 6688Technical Support 800 424 0021Customer Service 800 235 5763

Dako Denmark A/SProduktionsvej 42DK-2600 Glostrup Denmark

Tel +45 4485 9500Fax +45 4485 9595

www.dako.com

Izdanje 11. 2016.

pd-l1 ihc 22c3 pharmdx sk006 50 testova za …...ushodna regulacija pd-1 liganda odvija se u nekim...

Documents