perfil preliminar de bacterias sulfato reductoras en...
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TUTOR: PhD. VolCJo íñi9U~%. Rojal. umsnMESOR currnnco, PhD. mare Roul~l. mn
nUTOR: OSe. RUddlJ luna Barrón. umsn
. ~OO.IJ
Institut de recherchepour le développement
TESIS DE GRADONIVEL UCENCIATURA
BIOLOGíA
PERFIL PRELIMINAR DE BACTERIAS SULFATOREDUCTORAS EN SEDIMENTOS DE LAGUNA "LA
GRANJA" (BENI-BOLIVIA)
INVESTIGACiÓN REALIZADA DENTRO DEL PROYECTO "HIDROLOGIA Y GEODINÁMICA DE LACUENCA AMAZÓNICA" DEPENDIENTE DEL IRD Y DIRIGIDO POR EL PhD. MARC ROULET EN
COLABORACiÓN CON UMSA-SENAMHI
DESARROLLADA EN LAS INSTALACIONES DEL INSTITUTO DE BIOLOGíA MOLECULAR YBIOTECNOLOGíA DE LA CARRERA DE BIOLOGíA (UMSA), LP-SOL
TUTOR: PhD. Valga íniguez Rojas, UMSAASESOR CIENTíFICO: PhD. Mare Roulet, IRD
AUTOR: BSe. Ruddy Luna Barrón
MAYO 2004
PERFIL DE SRa EN "LA GRANJA"
3
R. LUNA-BARRÓN
Cíñete. pues. corno varón tus lomos.
Vaya preguntarte para que me instruyas.
¿Dónde estabas al fundar yo la Tierra?
iIndícamelo, si tanto sabes ...!
JOB 38
PERFIL DE SRB EN i..A GRANJA' R. UJNA·BARRON
Es mi sincero deseo dedicar este pequeño esfuerzo
a toda mi Familia...
4
PERFIL DE SRB EN -LA GRANJA'
AGRADECIMIENTOS
R. LUNA-BARRÓN
Quiero dirigir mi más sincero agradecimiento a mi tutora la PhD. Valga Iñiguez R., de quien
considero un privilegio haber recibido la valiosa instrucción inicial. al encaminar mis estudios
en la investigación científica.
Así mismo agradezco la oportuna intervención del PhD. Richard Devereux durante el
desarrollo de la parte experimental de mi trabajo, y las observaciones y sugerencias del PhD.
Marc Roulet del IRD. sin cuyo apoyo en el marco,del proyecto "Hidrologíay Geodinárnica de
la Cuenca Amazónica (UMSA-SENA1vIHI)" no habría podido llevarse a cabo la presente
investigación.
Quiero agradecer a las instituciones que han aportado significativamente en mi formación: la
Universidad Mayor de San Andrés. la Carrerade Biología y el Instituto de Biología Molecular
y Biotecnología (IBMB), y con esto a las personas involucradas en mi preparación académica
y personal, docentes e investigadores. auxiliares y administrativos. compañeros-y amigos.
verdaderoespíritu de las mismas. .
Debo reconocer de manera especial el entusiasmo de mi compañero de trabajo Daría AcM
Cordero con quien en esfuerzo combinado se ha llevado a conclusión este trabajo, y a su vez
resaltar el irremplazable aporte de Susy Fuentes Bazán (BSc.) por todo su apoyo y lealtad.
Finalmente, quiero agradecer el esfuerzo que han hecho mis padres por la oportunidad de una
vida llena de los consejos sabios y oportunosde mi padre Rudy, llena de la voz dulce y
comprensiva de mi madre Betty, y llena de la fuerza y visión de mi hermana Beatriz.
5
•
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA"
CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN
2. FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA2.1. ECOLOGÍA MICROBIANA Y VISION MOLECULAR
2.1. TÉCNICAS MOLECULARES DE ESTUDIO1 •
2.1.1. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)2.1.2. HIBRlDIZACIÓN MOLECULAR
2.2, EL 16s DNAr
R. LUNA-BARReN
9
1111
191920
21
2•.3. LAS BACTERIAS REDUCTORAS DE SULFATO2.3.1. SUBGRUPO DFM (GI) - DESULFOTOMACULUM2.3.2. SUBGRUPO DBB (G2) - DESULFOBULBUS .2.3.3. SUB-GRUPO DBM (G3) - DESULFOBACTERlUM2.3.4. SUB-GRUPO DSB (G4)- DESULFOBACTER2.3.5. SUB-GRUPO DCC (G5) - DESULFOCOCCUS-DESULFONEMA-DESULFOSARCINA2.3.6. SUB-GRUPO DSV (G6) - DESULFOVIBRlO-DESULFOMICROBIUM
2A. LASULFITO REDUCTASA DISIMILATORIA
2.5. IMPORTANCIA ECOLÓGICA DE LAS SRB
.3. OBJETIVO GENERAL
.3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
252930~..,
.)-
.).)
3335
37
.tI
.ti
47
.t. METODOLOGÍA .t74.1. ÁREA DE ESTUDIO 474.2. OBTENCIÓN DE MUESTRAS - MEDICIÓN DE pH YEh 494.3. EXTRACCIÓN DE.DNA A PARTIR DESEDIMENTOS 514.4. DETECCIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRB MEDIANTE PCR-anidado DEL 16S DNAr 534.5. DIVERSIDAD DESUB-GRUPOS DESRB 544.6. DETECCIÓN DE LA SULFITO REDUCTASA DISIMILATORlA (DSR) POR PCR 544.7. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRB MEDIANTE HIBRlDIZACIÓNMOLECULAR 55
5. RESULTADOS 565.1. CARACTERÍSTICAS FISICOQuiMICAS GENERALES DE LAS MUESTRAS 565.2. EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DESEDIMENTOS 575.3. AMPLIFICACIÓN DELGEN DEL 165 RJ'IAr Y DETECCIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRBMEDIANTE PCR-anidado 595.4. DETECCIÓN DE LA SULFITO REDUCTASA DISIMILATORlA (DSR) POR PCR 645.5. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DESUB-GRUPOS DE SRB MEDIANTE HIBRlDIZACIÓNMOLECULAR 64
6
PERFIL DE SRB EN "LAGRANJA" R. LUNA-BARRON
6. DISCUSION 696.1. EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DE SEDIMENTOS 716.2. DETECCIÓN DE SUB·GRUPOS DE SRB EN EL PERFIL SEDIMENTARIO 736.3. DISTRIBUCIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRB EN LOS PUNTOS MUESTREADOS 756.4. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LOS SUB.GRUPOS DETECTADOS DESRB 816.5. CONSIDERACIONES SOBRE LA METODOLOGÍA DECUANTIFICACIÓN 836.6. APRECIACIONES ECOLÓGICAS DERIVADAS DELACUANTIFICACIÓN RELATIVA DESRB
86
7. CONCLUSIONES
8. RECOMENDACIONES PARA FUTURAS INVESTIGACIONES
9. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
7
98
100
103
PERFILDE SRB EN "LA GRANJA-
RESUMEN
R. LUNA·BARRON
Las bacterias sulfato-reductoras (SRB) comprenden un grupo microbiano parafilético de gran
importancia en ecosistemas principalmente acuáticos. tanto para el ciclo global del azufre
como para la industria, siendo a su vez responsables de la producción del neurotóxico
monometilmercurio en varios sistemas hídricos.
Mediante PCR-anidadoe hibridización sobre el gen del 16S DNA ribosomal, se ha
investigado la distribución vertical de seis sub-grupos filogenéticos de bacterias sulfato
reductoras (SRB: Desulfotomaculum, Desulfobulbus, Desulfobacter, Desulfobacterium,
DesulJococcus-DesuIfonema-DesuIfosarcina y Desulfovibrio-Desulfomicrobiumí, en los.primeros 10 centímetros de profundidad de tres perfiles sedimentarios extraídos del punto
central (CEN). del bosque inundado (SrN) y bajo la capa rizosférica (SRl). del primer
meandro abandonado ("La Granja") del río Beni en la amazonía boliviana.
Los resultados del PCR muestran la consistente ubicuidad de cinco de los seis sub-grupos.
Desulfovibrío-Desulfomicrobium y DesuIfococcus-DesuIfonema-Desulfosarcina han sido
detectados a lo largo de los tres perfiles sedimentarios. mientras que Desulfotomuculum y
Desulfobulbus presentan una distribución vertical irregular en CEN. mis regular en SRl y
uniforme en SIN. En contraste, Desulfobacter se halla a profundidad media (4.5 cm) en todos
los casos. El sub-grupo Desulfobacterium no ha sido detectado en ninguno de los puntos.
El análisis cuantitativo mediante sondas de DNA. da cuenta de una estructura microbiana
vertical dé SRB influenciada por el tipo de sedimento (micro hábitat). Los puntos CEN y SRl. .
muestran semejanzas entre sí' en el perfil cuantitativo, mientras que el punto SIN (de origen
edáfico) es distante de ambos. Se ha visto que la correlación de la estructura cuantitativa de
SRB en relación a la comunidad eubacteriana es mayor en los puntos CEN y SRl, pero que la
correlación de la estructura entre sub-grupos de SRB es mayor entre los puntos SIN y SRl.
Investigaciones moleculares más detalladas son necesarias para apoyar la limitada información
disponible sobre la microbiología de la amazonía boliviana.
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PERFIL DE SRB EN "lA GRANJA"
1. INTRODUCCIÓN
R. LUNA-BARRÓN
Una .importante cantidad de ecosistemas ha sido estudiada durante la caracterización de las
bacterias sulfato-reductoras (SRB), pero los múltiples ecosistemas .del territorio boliviano
carecen de estudios en ecología microbiana, y la gran mayoría de estos entornos no han sido
incluso preliminarmente caracterizados. La amazonía boliviana en general posee un gran;
potencial de recursos genéticos aun no explorado, y por lo tanto es importante iniciar y
continuar estudios microbiológicos ambientales basados principalmente en metodologías de.análisis genético molecular, en este sentido es importante mencionar que las SRB conforman
uno de los grupos microbianos más importantes y numerosos de la biosfera.
Desde el punto de vista ecológico, la importancia de las SRB en el ambiente se enmarca
dentro del ciclo global del azufre y sus derivados. En conjunción con otros grupos
microbianos (ej. Bacterias del nitrógeno), las SRB son responsables de mantener los niveles
naturales de sulfatos, sulfitos y sulfuros especialmente en ambientes acuáticos sedimentarios.
tanto marinos como continentales. Pero, además del mecanismo característico de reducción de
sulfatos (y derivados) a sulfuros, existen procesos geoquímicos asociados que eventualmente
han permitido el desarrollo de técnicas de biorernediación en zonas contaminadas con metales
pesados, lo cual explica el interés de la industria en estos microorganismos, A su vez. las SRB
parecen ser principales responsables de la producción del neurotóxico monometilmercurio en
sistemas acuáticos natur~les de la arnazonía. lo que por otro lado es de sumo, i.nterés en áreas"
de conservación ambiental y salud.
La reducción bioquímica de sulfatos ha sido observada comúnmente en ambientes anóxicos.·
por lo que la mayor parte de las comunidades microbianas de SRB han sido encontradas en
ambientes naturales con concentraciones de oxígeno próximas a cero, especialmente en
sedimentos acuáticos marinos y continentales, lacustres y ribereños, naturales o artificiales.
Sin embargo, la necesidad de anoxia no es lirnitante para el desarrollo de los distintos sub
grupos de SRB en ambientes menos anóxicos. Bacterias sulfato-reductoras han sido detectadas
en un amplio rango de ambientes, por ejemplo, es común encontrar comunidades de SRB
9
PERFIL DE SRB EN "lA GRANJA" R. LUNA·BARReN
asociadas al entorno rizosférico de varias especies vegetales flotantes, o en reservonos
industriales de hidrocarburos, o en perfiles de roca sólida a distintas profundidades, e incluso
en el sistema digestivo de artrópodos y mamíferos.
La distribución espacial de las SRB está íntimamente relacionada a las aptitudes metabólicas
características de cada sub-grupo de SRB. La concentración de oxígeno es inicialmente el;
factor 'prepcnderante, pero para las SRB lo es también el potencial oxido-reductor (Eh). Es
común que en sedimentos acuáticos, el ordenamiento vertical de los sub-grupos de SRB
muestre un patrón más o menos regular en los primeros 10 cm. Este ordenamiento determina
la manera en que las múltiples actividades bioquímicas de estos microorganismos, influirán en
el entorno biótico y abiótico circundante tanto sedimentario como lacustre.
El presente trabajo de investigación se ha enfocado en la identificación,de seis sub-grupos de
SRB tDesulfotomaculum. Desulfobulbus, Desulfobacter. Desulfobacterium. Desulfococcus
Desulfonema-Desulfosarcina y Desulfovibrio-Desulfomicrobium) en tres perfiles
sedimentarios de 10 cm de profundidad a intervalos de 0.5 cm, perfiles extraídos de un
meandro abandonado ("La Granja") del río Beni, ubicado en el departamento del Beni.
provincia Ballivián de la amazonía boliviana. La detección fue realizada mediante PCR
anidado con cebadores sobre el 16S DNA ribosornal específicos a los seis sub-grupos, y
confirmado mediante hibridización por puntos (dot-blot). Adicionalmente, se realizó una
cuantificación relativa de los sub-grupos en los tres perfiles sedimentarios con el .objctivo de
obtener información tanto cualitativa como cuantitativa de las SRB yacentes.
El texto a continuación describe algunas aplicaciones sobresalientes de la biología molecular
en trabajos de ecología microbiana, y describe las características más importantes de cada sub
grupo de bacterias sulfato-reductoras y su importancia ecológica, luego se expone la
metodología utilizada para obtener los perfiles cualitativos y cuantitativos sedimentarios de
SRB en laguna "La Granja", para concluir con una discusión fundamentada en los hallazgos.
10
PERFILDE SRB EN "LA GRANJA"
2" FUNDAMENTACIÓN TEÓRICA
2.1. ECOLOGÍA MICROBIANA Y VISION MOLECULAR
R. LUNA-BARRÓN
La taxonomía clásica .organizó a los seres vivientes en CinCO grandes Reinos: Animalia,
Plantae, Protista, Fungi y Mónera (Ville et al., 1992). En la última década, esta noción tuvo
que sufrir un cambio trascendental. Recientes descubrimientos a nivel genético molecular en
organismos integrantes del ahora extinto Reino Mónera, han obligado a los científicos a
reconsiderar la posición taxonómicade las comúnmente llamadas bacterias.
Microorganismos carentes de una estructura nuclear, carentes de sub-compartimentos,
protoplásmicos, inferiores a 10 um en longitud, y poseedores de una pared celular de diversa
composición, eran sencillamente incorporados dentro de este antiguo Reino. Sin embargo. al
analizar y comparar porciones de las secuencias génicas de varios microorganismos
procarióticos, se ha comprendido que la clasificación de bacterias y arqueas, basada
únicamente en fisiología y/o morfología, no es ciertamente acertada (Boivin-Jahns et al..
1995). En menos de 20 años de investigación, el análisis genético molecular ha conseguido
reflejar con más precisión la evolución implícita en la naturaleza de la vida.
A raíz de estos hallazgos la clasificación de los microorganismos procarióticos se halla en
medio de disputas teóricas y reordenamientos cladísticos constantes (Dalevi et al., 2001). No
obstante. esta misma información ha permitido convenir en una clasificación general al nivel
superior de Dominio, que agrupa a todos los seres vivos en tres grandes ciados: Archaea,
Bacteria y Eucarya (Woese c., 1990; Head et al., 1998). Microorganismos procarióticos,
comúnmente llamados bacterias, se encuentran dentro de los dominios Archaea y Bacteria,
mientras que el resto de seres vivientes se agrupa en el Dominio Eucarya.
Ciertamente los organismos eucariontes poseen características estructurales y
comportamenta1es evidentemente complejas (cornpartimentalización, ordenación cromosomal,
p1uricelularidad y demás...), mientras que. la diversidad de las menos complejas bacterias y
11
PERFIL DE SR8 EN 'LA GRANJA" R. LUNA.BARRÓN
arqueas se expresa en términos de fisiología y metabolismo, más que de estructura y
comportamiento. Las estrategias metabólicas, reproductivas y evolutivas de los organismos
procarióticos son diferentes a las del resto de los seres vivos (Levin y Bergstrom, 2000), por lo
que la aparente insignificancia microscópica de estos organismos se o ve refutada por varias
razones:
1) S/estima que existen 4-6 x 1036 células bacterianas sobre la tierra, muchas veces más que
la clase Arthropoda o el reino Vegetal, los siguientes más numerosos.
2) Las células microbianas a nivel global albergan entre 85 y 130 pg de nitrógeno y entre 9 y
14 pg de fósforo, es decir 10 veces más que los niveles existentes en células vivas del
Reino Plantae. (Whitman et al., 1998). .3) La tasa de producción microbiana se estima en 1,7 x 10JO células al año, la más alta en la
naturaleza.
4) La mayor parte de los ciclos biogeoquímicos que ocurren en los ecosistemas, están
directamente ligados al metabolismo microbiano (ej. Metanogénesis, reducción y
oxidación del azufre, nitrificación, desnitrificación, fijación de nitrógeno) (Rittman y
McCarty, 2001).
5) Se estima que se conoce menos del 5% de la bicdiversidad microbiana. En contraste, entre
el 85 Yel 90% de plantas y vertebradosya se ha descrito (Staley et al., 1997).
6) En promedio, cada nuevo estudio molecular de diversidad microbiana. encuentra entre 60
y 75% de nuevas especies (Kuske et al., 1997).
7) El estudio de las propiedades metabólicas y funcionales de los microorganismos son de
gran beneficio para la industria, la medicina, la biotecnología y el medio ambiente. Son
responsables en gran medida de la degradación de desechos naturales y antropogénicos, de
la producción de nuevos fármacos, de estrategias de biorernediación en accidentes
químico-industriales, del incremento en la producción agrícola y otros.
8) Las propiedades metabólicas de los diversos grupos microbianos, basadas en estrategias
heterótrofas y/o autótrofas, les permiten subsistir en ambientes extremos y considerados
hostiles para los demás seres vivos (temperaturas extremas, ambientes muy ácidos o
12
PERFIL DESRB EN"LA GRANJA" R. LUNA·BARRÓN
básicos, carentes de oxígeno, carentes de moléculas orgánicas complejas como fuente de
energía, bajo elevados niveles de radioactividad,...).
9) La ubicuidad de las bacterias es muy diversa. Nuevas investigaciones geológicas dan
evidencia de su gran importancia en la producción de oxígeno en ambientes marinos
(Hunter-Cevera, 1998), y su influencia en el ciclo hidrológico global (Staley et al., 1997).
la) Los microorganismos hanestablecido, hace más de 3000 millones de años, las condiciones
biogeoquírnicas para el desarrollo de plantas y animales. Son la base de la vida, sin ellos
ninguna forma viviente podría haber evolucionado jamás.
Arqueas y Bacterias pueden encontrarse donde el ambiente lo permita, siendo tal vez la
temperatura el único factor limitante de su expansión y colonización (entre -20°C a 120 "C:
Madigan et al., 1998). Se han hallado diversos .grupos presentes en furnarolas volcánicas de
abismos marinos (14000 m de profundidad), cuerpos acuíferos oceánicos y continentales (en
promedio 1 millón de células por litro), acuíferos rocosos y del subsuelo (a más de 4
kilómetros en roca sólida; Freund et al., 2002), en suelos y sedimentos (aprox, 1 millón de
células por gramo), zonas volcánicas y glaciares (Madigan et al., 1998), y últimamente se
investigan en otros cuerpos planetarios del sistema solar como Marte y Europa (Luna-Barrón
R., 2001; Kempe y Kazrnierczak, 2002).
Sin embargo, comprender la verdadera magnitud de la influencia que estos dos grupos de
microorganismos ejercen sobre el medio ambiente, solo es posible si se accede a sus micro
hábitats in-situ, y se estudian las intrínsecas interrelaciones entre las mismas comunidades
microbianas, y entre éstas y el complejo entorno que las rodea.o .
"Microorganismos abundantes en el medio que pueden ser aislados y cultivados en laboratorio,
bajo condiciones ambientales diferentes pueden no ser viables para el cultivo (ej. Dormancia),
aun con los mejor elaborados medios de cultivo (Angle et al., 1991), por lo que son necesarias
metodologías de análisis que permitan acceder a estas comunidades en condiciones naturales.
A saber, se estima que apenas entre 0,1 Y el 0,5% de esta la diversidad microbiana es
13
PERFIL DE SRB EN oLA GRANJA" R. LUNA.BARRÓN
cultivable (Klappenbach et al., 2001), Y se cree haber caracterizado por metodologías
alternativas entre el 2 y el 5% de la biodiversidad microbiana.
La identificación de cepas microbianas debidamente aisladas, cultivadas y mantenidas en
laboratorio mediante métodos morfofisiológicos, permitió describir y catalogar
aproximadamente 5000 especies de bacterias hasta 1995 (Amman et al., 1995). Sin embargo,
este número solo representa el 1% de la diversidad total estimada hasta entonces (Bornernan et
al., 1997), y entre el 0,1 Y el 10% de bacterias y arqueas que pueden ser visualizadas por
conteo directo (Head et al., 1998). Incrementar estos datos, requirió inicialmente acceder a los
grupos bacterianos in-situ (Rondan et al., 2000), y simultáneamente desarrollar y perfeccionar
técnicas de análisis genético molecular (Tabla-'I), basadas principalmente en moléculas
orgánicas inherentes a los microorganismos como los ácidos nucleicos (ONA y RJ.'SA),
proteínas celulares. marcadores quimiotaxonórnicos (Braker et al., 2001) Yalgunas moléculas
estructurales r:vandamme et al., 1996).
Pero no es suficiente conocer la composición microbiana existente., se debe comprender
fundamentalmente la plasticidad metabólica y regulación de las comunidades para poder
entender cómo estas pueden reaccionar a diferentes condiciones. Las poblaciones microbianas
son parte funcional de los ecosistemas, y no un mero componente que reacciona ante cambios
en éstos (Hunter-Cevera, 1998).
Al realizar investigaciones con ácidos nucleicos, fue posible apreciar que la información
almacenada en el genoma (ONA) de cada microorganismo, no solo contiene instrucciones
para el normal desarrollo del mismo, sino también contiene un registro sobre la historia
evolutiva de la especie. El análisis adecuado de este registro, grabado en la secuencia de
nucleótidos, ha inducido a la reorganización de la cladística de muchos seres vivos en forma
más natural.
14
1 PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA· R. LUNA-BARRÓN
Tabla-l: Resolución taxonómica de algunas técnicas moleculares. Adaptado de Vandamrne et al. (1996).
TECNICA I .....Polimorfismo en longitud de fragmentos derestricción (RFLP)R'[botip¡ffcación ------
A-m-p-lifica-CiÓ-ñ'deAD'Ñ(AFLP. AP:-PCR:rep~PCR~ DAF. RAPD.ARDRA)
técnicas serológicas
ZymogramasPatrones etectroforenccs de erotemas
totalesHIbrid"I"Zacrenes- 6NA-:-::~D:-:-N-:-:A"------~/() de G.C 0- ---.--------
Patrones de' áCld-OS grasos celulares
E'structüradela'pared celular
F'iñotipo (método cláSICO)Secueñclaclón d-e·-r-=-R-NA------
Eiectrofores is"e'ñ'geiesd"egradlente
des naturauz anta (DGGE)Sondas de ADN (Hrbncrz acrón. PCR)Secuenciacrón de ADN
FAMILIA
En síntesis. una secuencia dada existente en una porción del genoma, puede ser característica
de un filo. como Dominio, Reino, Phyla, Familia, Especie, Subespecie u otro ciado, lo cual
permite, al menos en teoría, identificar el filo en cualquier entorno ambiental donde se
encuentre el microorganismo que posea la secuencia.
Por ejemplo, en un tipo de suelo agrícola de Norteamérica, la diversidad microbiana presente
fue preliminarmente caracterizada mediante la amplificación 124 secuencias distintas del gen
de la sub-unidad pequeña del ribosorna procariote (l6s DNAr, SSU rDNA) (Bomeman et al.,
1996). Los resultados mostraron que solo 2 de las 124 secuencias correspondían a eucariontes.
Con apenas 4% de probable duplicidad entre las secuencias, se dedujo que un 98,4% de la
diversidad correspondía a bacterias, 0,8% a hongos y 0,8% a vegetales. No se encontraron
secuencias de arqueas (Arqueobacterias),
15
Este tipo de reportes sobre diversidad en distintos macro y micro ambientes, son comunes y
constantes en el entorno actual. En 1999 un grupo alemán de, ecología molecular, utilizó
técnicas moleculares para evaluar la diversidad microbiana de sedimentos marinos árticos en
la región de Sptisbergen (los cuales jamás superan los 3 "C; Ravenschlag et al., 1999). Se
estudiaron 353 secuencias que revelaron 43,4% de bacterias asociadas a los ciclos del azufre
(potencia.les sulfato-reductoras y sulfuro-oxidantes), y el resto distribuido entre
Proteobacreries tipo Desulfotae/a, Myxobacterias y Bdellovibrios. El estudio demostró
también que investigaciones previas realizadas en el mismo lugar mediante análisis de
restricción (RFLP), habían subestimado la enorme diversidad detectada por los nuevos
patrones moleculares de evaluación (ARDRA) aplicados sobre las secuencias obtenidas.
,111
r,
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA.BARRON
La misma técnica de secuencíación del 16s DNAr fue aplicada sobre la rnicrobiota bacteriana
presente en la rizósfera de árboles de pino silvestre en el desierto de Arizona (Nortearnérica)
(Kuske et al., 1997). El 64% de las secuencias estaban relacionadas filogenéticarnente con
Acidobacterias (Acidobacteriumy; pero ninguna de estas secuencias correspondía a algún clado
conocido, por lo que [os autores propusieron la creación de 5 nuevos grupos taxonómicos.
La aparición de nuevos grupos taxonómicos se ha convertido en un fenómeno muy común
desde las primeras investigaciones moleculares con microorganismos (Hugenholtz P., 1998:
Miskin et al., 1999), especialmente aquellas basadas en la secuenciación del gen del 16s
rR..i\fA. Un buen ejemplo es el descubrimiento de una nueva "División" de microorganismos
llamada temporalmente WS6, en un estuario marino en la bahía de San Francisco (EUA) en
2000 (Dojka et al., 2000).
Sin embargo, estudios basados en genes como el 16s rDNA, no se han limitado a la taxonomía
o la filogenia. La aplicación más importante está en relación con los procesos ecológicos. Por
ejemplo, el estudio comparativo de la diversidad de secuencias del 16s rDNA en tres lagos
europeos en 2000 (Austria, Alemania y Rusia ), mostraron la distribución de 16 grupos
presentes a nivel global en aguas dulces y suelos, pero ninguno tenía relación con secuencias
de origen marino, por lo que se dedujo que el origen de tales organismos lacustres en el
16
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA·BARRÓN
pasado, tuvo que estar ligado a grupos bacterianos continentales (Glockner et al., 2000) y no
mannos.
La mayor parte de las investigaciones microbiológicas moleculares hasta hoy se han llevado a
cabo en ecosistemas acuáticos (Varnam y Evans, 2000). Tal es el caso de cuerpos de agua
continentales alcalinos (carbonatos en elevada concentración), característicos de latitudes
subtropicales desérticas, donde la producción fotosintética primaria es consecuencia de la
interacción de múltiples grupos bacterianos. Más del 90% de la actividad relacionada a ciclos
del carbono, del azufre y del nitrógeno (Jones y Grant, 1999)son dependientes del desarrolloy
establecimiento de las comunidades microbianas.
El análisis de la composición microbiana que se realizó en suelos de las recientemente
formadas islas "Hawai", contrario a lo esperado. mostró una enorme diversidad de grupos
bacterianos presentes en muestras de suelo (63% de filotipos dominantes globales) (Nüslein y
Tiedje, 1998). Para explicar tal fenómeno, se tuvieron que rastrear granos de arena desde el
desierto de Gobi hasta las islas, y estudiar el comportamiento de aves migratorias y el efecto
del viento sobre la dispersión de semillas, entre otros aspectos ecológicos.
De igual manera. es posible estudiar el cambio de las comunidades microbianas relacionadas a
procesos ambientales como la sucesión vegetal (Borneman y Triplett, 1997). De estos análisis,
se puede concluir por ejemplo que grupos bacterianos de requerimientos nutricionales
versátiles y rápido crecimiento, anteceden en pastizales a la aparición de Proteobacterias, un
grupo más numeroso a nivel global con un ecotipo ampliamente relacionado a vegetación
secundaria (Nüsslein K. y Tiedje J., 1999). La variación de las comunidades microbianas
relacionadas al tipo de suelo, rizósfera y rizoplana, en respuesta a cambios producidos en
épocas de cosecha en áreas agrícolas, ha mostrado una gran relación entre el tipo de plantas,el
tipo de suelo y la composición microbiana, pero no así entre ésta composición y el desarrollo
mismo de las plantas, sean estas cosechadas o no (Wieland et al., 200 1)."
17
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA' R. LUNA·BARRON
Fluctuaciones de la diversidad microbiana en relación a cambios climáticos es un tema de
amplio interés (Conrad R., 1996). Hoy se sabe sobre la importancia de la producción de
núcleos de condensación (pequeñas moléculas azufradas) producidos por microorganismos
marinos, generalmente sulfato-reductores, que conforman los principios estructurales para la
formación de lluvias en la atmósfera (Smit et al., 2001; MacGregoret al., 2001).
I
Sin embargo, como es propio de toda metodología, las técnicas moleculares tienen limitantes
inherentes a sus mecanismos metodológicos. La diversa variabilidad taxonómica es
comparable a la variabilidad funcional y de comportamiento en los microorganismos, de tal
forma que son necesarias nuevas técnicas que permitan acceder a los aspectos fisiológicos.
Tales técnicas han comenzado a ser propuestas, basándose no solo en patrones comparativos
taxonómico-funcionales (Staley et al., 1998; Head et al., 1998; Duineveld et al., 1998; Rondon
et al., 2000; Sass et al., 2001; Lehman et al., 2001), sino más específicamente en el estudio de
la regulación de las funciones metabólicas (proteómica), mediante mecanismos que permitan
acceder a los parrones filogenético-funcionales (filogenómica) (Tekaia et al., 1999; Sicheritz
Pontén y Andersson. 2001), especialmente sin destruir o matar al organismo (Osada et al.,
2003). Afortunadamente, la interacción de las nuevas tecnologías con criterios in-silico.
extienden aun más las perspectivas científicas (Augen, 2003; Illin et al., 2003; Lenhard et al.,
2003);
Actualmente sería imposible tratar de comprender el comportamiento; influencia e.r
importancia de los microorganismos sobre nuestro medio ambiente, sin la ayuda de técnicas
moleculares que permitan acceder al registro genético almacenado en este basto grupo de seres
vivientes.
En este sentido el presente trabajo de investigación se ha enfocado en uno de los grupos de
microorganismos de mayor importancia ecológica y mejor estudiados en los pasados 20 años,
el de las bacterias reductoras de sulfato, sulfato-reductoras o SRB. La ubicuidad y fisiología de
este antiguo grupo de bacterias y arqueas, demuestra su importancia principalmente porque el
18
PERFIL DE SRa EN "LA GRANJA· R. LUNA-BARRÓN
ciclo biogeoquímico global del azufre esta directamente ligado y es dependiente del
metabolismo de estos microorganismos (Madigan et al., 1998).
Se ha investigado cualitativa y cuantitativamente la distribución de las SRB en sedimentos
lacustres mediante PCR e hibridización molecular, haciendo de este trabajo un ejemplo más de
las aplicaciones de la biología molecular en la ecología microbiana.
2.1. TÉCNICAS MOLECULARES DE ESTUDIO
La taxonomía y distribución de las SRB han sido estudiadas bajo una variedad de
metodologías de análisis molecular. Algunas utilizadas con menos frecuencia corresponden a
patrones de restricción del genoma RFLP, a la amplificación al azar de fragmentos RAPO o en
base a moléculas estructurales como el PLFA (Macaíady et al., 2000a; Macalady et al.,
2000b). Pero la mayoría se han enfocado en el marcador taxonómico 16S ON:\r. que
comprende el gen de la sub-unidad pequeña de R.!\[A ribosomal de carácter universal."
Normalmente el pnncipio de complementariedad del PCR y sus variantes, han sido las
técnicas más explotadas, ya sea mediante retrotranscripción (MacGregor et al., 2001) Y
secuenciación (Loy et al., 2002), como por hibridización molecular (Daly et al.. 2000). En
consecuencia ha sido posible obtener librerías de clones de SRB basadas en el 16S
(Ravenschlag et al.. 1;999), cuya información permite estudiarlas en cualquier entorno
ambiental.
Considerando las técnicas utilizadas en este trabajo (PCR e Hibridización) para investigar a las
SRB, es importante mencionar algunos aspectos importantes sobre las mismas.
2.1.1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
19
PERFIL DE SRBEN "LA GRANJA' R. LUNA.B.A.RRÓN
Las aplicaciones del PCR se extienden a un basto campo, desde la medicina aplicada hasta la
biotecnología industrial (Voet et al., 1999); no obstante el impacto en la microbiología, como
ya se ha establecido, es evidente. Su aplicación en microbiología fue desarrollada
gradualmente, contrastando en principio con técnicas clásicas de cultivo celular y
eventualmente con la aplicación de múltiples variantes (RT-PCR, T-PCR, nested-PCR, AP
PCR, rep-PCR, y otras) tanto en estudios microbiológicos a nivel taxonómico y filogenético
como .ecológico (Boivin-Jahns et al., 1995; Rose et al., 2003). El principio funcional se basa. .
~n la generación de copias de, una determinada porción del genoma (DNA) de un organismo,. ..
mediante una reacciónenzirnáticacontrolada.
La secuencia de nucleótidos de los cebadores determinará su especificidad y eventualmente el
tamaño en longitud del producto final de la reacción. Este tamaño es hecho visible durante una
electrofóresis en contraste con un marcadorde peso molecular.
Conceptualmente la técnica aparenta bastante sencillez. Sin embargo, para poder llevar a cabo
con éxito este proceso. es ha sido necesaria la cuidadosa optimizaciónde dos aspectos previos:
la obtención de DNA (molde) en cantidad suficiente, lo menos degradado posible y
suficientemente purificado para poder ser sometido al PCR~ y segundo, la calibración de las
concentracionesde cada reactivo y el ajuste del ciclaje para los cebadores de interés.
2.1.2. HIBRlDIZACIÓN .MOLECULAR.!
Se basa en la detección de una secuencia dentro del genoma, mediante el reconocimiento
químico (complementariedad) correspondiente entre pares de bases de una "sonda"
(oligonucleótido) y el DNA investigado de un organismo.
La utilización de sondas de DNA fue indispensable durante los primeros estudios ambientales
microbianos, tanto para la caracterización de grupos taxonómicos como para estudios
cuantitativos de interés biológico (Hazen y Jiménez, 1988). No obstante, a diferencia del PCR,
20
PERFILDE SRB EN "lA GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
no requiere de ningún proceso enzimático y solo se fundamenta en principios químicos de
afinidad molecular y solubilidad.
En la aplicación de la técnica de hibridización molecular se han considerado tres aspectos
fundamentales: 1) el método de hibridización (dot-blot, southem-blot, in-situ y otros); 2) las
condiciones fisico-quimicas que involucren la especificidad de la sonda; y 3) el sistema de
detección de la sonda que permitiráverificar si ésta ha encontrado su objetivo en el DNA.
Tanto 'el PCR como la hibridización molecular se basan en el principio de la
cornplementariedad de ácidos nucleicos, y permiten estudiar el DNA bacteriano siempre y
cuando éste último haya sido adecuadamente obtenido de las células. aislado de los
componentes circundantes y purificado para ser 'utilizable en pruebas moleculares (Pcters,
1998).
2.2. EL 165 DNAr
Las estructuras subcelulares responsables de la síntesis de proteínas en el protoplasma celular
son los ribosornas (Voet et al., 1999). Tal vez el aspecto más sobresaliente de los ribosornas
sea su composición genética. estructural y funcional, que se ha conservado casi invariable:
desde su establecimiento funcional en los primeros microorganismos procariotes habitantes
del planeta, probablemente hace 3600 millones de años. Esta propiedad conservativa ha hecho
a los ribosornas excelentes candidatos para estudios de filogenia y taxonomía molecular
(Amann et al., 1995).
Los ribosornas presentes en Eucarya, Archaea y Bacteria. están compuestos estructuralmente
de tres sub-unidades de RNA y sus proteínas asociadas. En procariotes, dos cadenas de RNA
con coeficientes de sedimentación de 23 y 5 respectivamente, componen. más sus proteínas
asociadas, la sub-unidad mayor de coeficiente 50S; mientras que la sub-unidad menor es
conocida como 30S (Figura-l A). Esta sub-unidad menor esta organizada estructuralmente por
21
PERFIL DE SRB EN OLA. GRANJAo R LUNA·BARRÓN
21 proteínas (cúmulos SI, S2. S3) asociadas a una molécula de RJ'lA de aproximadamente
1540 bases. molécula que se conoce como el "16s RNAr" (Figura 2; Griffiths et al., 1998;
Wuyts et al., 2002).
Figura-lA: Estructura terciaria delribosoma procariótico. La moléculadel 16S DNA ribosornal (marcadormolecular para estudios de filogenia,Figura-I B), más 21 proteianasestructurales, componen la subunidad 30S (Voet el al., 1999).
\..fC\'DlS.IJ.~~
Flgurn-I B: Distancia evolutiva de los tres linajes de seres vivientes en el planeta (Madigan y Marrs,1997), determinada mediante el análisis filogenético del 16SD~A ribosomal.
Dada la notable conservación en composición, estructura y función de las moléculas de RJ'\[A
que forman el ribosorna, no es sorprendente la aparición de innumerables investigaciones. . .
basadas en el análisis comparativo de las secuencias de pares de bases que lo componen. Los
primeros trabajos fueron realizados en los años 80 con la sub-unidad 5S (Head et al., 1998), no
obstante su tamaño reducido ha limitado su alcance en estudios de taxonomía. La sub-unidad
23S, la mayor de las tres, representa una opción ideal para análisis moleculares (Frahrn y Obst,
2003), pero aun existen pocos trabajos que hayan obtenido secuencias completas y hayan
trabajado con del mismo. Así, en los pasados 10 a 20 años ha sido de gran utilidad el l6S
rRNA, cuyo tamaño intermedio, estructura y composición han permitido elaborar el árbol
tilogenético de la vida conocida. el cual localiza a los tres grandes dominios taxonómicos,.
según su distancia evolutiva en el tiempo (Figura 1; Madigan y Marrs, 1997).
1I
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA-BARRON
Pero la utilización del 165 no se restringe al estudio de la evolución. En la microbiología
moderna ha sido la base de las primeras investigaciones referentes a la ecología de los
microorganismos in situ, desde la detección y filogenia de nuevos gruP.os (Muyzeret al., 1993;
Thornhill et al., 1995; Eder et al., 2001) hasta el estudio de su comportamiento y distribución
espacialIf'erris et al.; 1996; Rudolph et al., 2001; MacGregor et al., 2001; Alfreider et al.,
2002)!i.
ARQEUC BAC
lIlI
..
~~~1--;~o'. :1: :(1 .J
IV.. '1MrJ
EUC
Figu ra-2: Estructura secundara del 16S RNA ribosomal. Los recuadros señalan las regiones presentessolo en Archaea (ARQ), en Bacteria (BAC) y en Eucarya (EUC), (Wuyts et al., 2002).
La importancia de este "marcador molecular", ha permitido el desarrollo de bases de datos a
nivel mundial. Cuatro de estas poseen la mayor cantidad de información: la "National Cerner
')"'--'
PERFIL DE SRB EN 'LA. GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
for Biotechnology Information" en Estados Unidos (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).la
"Ribosornal Data Project" (http://www.rdp.cme.msu.eduJhtml/).la "European Database on
Srnall Subunit RJ~A" (http://rrna.uia.ac.be/ssuD y la "Ribosornal RJ~A Operon Copy Number
Database' (http://rrndh.cme.msll.edu; Klappenbach et al., 2001; WUj1S et al., 2002). Las bases
de datos de los cuatro grupos están ligadas digitalmente, generando una completa red de
información actualizada permanentemente, lo que coadyuva a un rápido y contundente avance
de lasaplicaciones del 16s RNAren la biología molecular.
Las diferencias estructurales entre la sub-unidad pequeña del ribosorna de Arqueas (16s
Ri\lAr), Bacterias (16s Rl'\¡Ar) y Eucarias (18s RNAr) (Figura 2), normalmente son adiciones o
deleciones de porciones de RNA, en las regiones vi. V4 YV7 de la cadena. Las regiones VI,
V3. V5, V6, V8 y V9 se mantienen invariables en todos los organismos. por lo que ha sido
posible desarrollar sondas y cebadores de oligonucJeótidos que, alineadas sobre las sub
regiones 1 y 50 de la cadena. permitan mediante PCR. amplificar la mayor parte del gen del
1··6s RNAr (Wuyts er al., 2002).
Existen varios pares de cebadores diseñados para la amplificación del 16s DNAr mediante
PCR (Wieeler er al., 1996). Una vez obtenido el producto inicial buscado en muestras
ambientales por ejemplo, es posible utilizar sondas adicionales para detectar. secuencias
internas mediante un 1 'nuevo PCR (PCR-anidado), una hibridización molecular u otra
metodología, y confirmar resultados.
En el presente trabajo se utilizó un par de cebadores que amplifican la mayor parte del 165
ONAr bacteriano (aprox. 1504 pb), para obtener al menos una copia de cada grupo microbiano
presente en muestras ambientales sedimentarias, y detectar dentro de estos amplificados la
presencia de secuencias específicas correspondientes a seis sub-grupos filogenéticos de
bacterias reductoras de sulfato o SRB.
24
PERFIL DE SR8 EN "lA GRANJA"
2.3. LAS BACTERIAS REDUCTORAS DE SULFATO
El fraccionamiento isotópico de compuestos sulfurados es un fenómeno químico característico
de la actividad microbiana relacionada con compuestos azufrados, especialmente de bacterias
reductoras de sulfato y sulfuro-oxidantes (Detmers et al., 2001); el estudio de este fenómeno
ha permitido elaborar una perspectiva general sobre las condiciones en las que se desarrollaron
ancestrales comunidades microbianas de sulfato-reductores durante el precámbrico (Pavlov y
Kasting, 2002).
Un interesante experimento enfocado en
estrategia de supervivencia.
especialmente sulfato-reductores de Jos
DeSlllfolomaculllm,.Destllfovibrio,
Desulfomicrobium y Desulfobacter
(Cowen et al., 2003), lo cual permite
desarrollar teorías sobre el origen y
desarrollo de la sulfato reducción como
bajo
pero
nitrato-
Archaeoglobus,
Ammonifex,
. .microorganismos
. .rrucroorgamsmos
tiporeductores
cultivar
desarrollarse
condiciones arqueanas simuladas, en
fluidos de 3500 millones de años de
antigüedad, conservados a - ¡00 "C y
extraídos a 48 metros de la corteza del
fondo marino, encontró que aun podían
géneros
av1
OM
504 -'-;'-'SOJ·~S-:2H- 6H-
Figura-3: Modelo de funcionamiento del complejoenzimático para el transporte de electrones desde
hidrógeno hasta sulfato en las SRB (basado enDesulfovibrio sp.). OM: membrana externa; 1M:
membrana interna (Voordow, 1995).
Citoplasma
La visión del precámbrico plantea que entre el 2400x l06 A.e. y el 21 OOx 106 A.e. la atmósfera
terrestre estuvo saturada de metano, de gases azufrados y con menos del 5% del oxígeno
presente actualmente. Esta composición de gases habría generado un efecto de invernadero 23
25
PERFIL DE SRB EN ·LA GRANJA· R. LUNA-BARRÓN
veces mayor al producido por el actual CO~, y habría mantenido una temperatura promedio
muy elevada en todo el planeta (Wiechert, 2002). En los océanos precámbricos,
microorganismos metanógenos competían c~n microorganismos sulfato-reductores por la
supervivencia, y si bien ambos grupos habían desarrollado estrategias fisiológicas distintas
1000 millones de años atrás. los metanógenos predominaban en los continentes y saturaban la
atmósfera con metano, limitando drásticamente el abastecimiento de sulfato a los mares
(Habieht et al., 2002), mares que fueron el hábitat de las primeras bacterias sulfato-reductoras
oSRB.
A tres mil millones de años de evolución posterior, la primera bacteria sulfato-reductora
identificada como tal fue observada por W. M. Beyerinck en 1895. mientras estudiaba la,
formación del llamado "fermento sulfúrico" en canales de desagüe urbano en Alemania. El
microorganismo observado y aislado por Beyerinck. fue clasificado como Spirillum
desulfuricans (actualmente Desulfovibrio desulfuricans; Voordouw, 1995). Hoy se reconocen
más de 50 especies de SRB incluidas en 16 familias (httpv/www.rnicrobial
ecology.de/srp.htrnl), la mayoría descubiertas en los pasados 20 años.
La reacción bioquímica que caracteriza a este importante grupo de microorganismos. es la
reducción metabólica disimilatoria de sulfato (SO/-) hasta sulfuro (S~') en el peripiasrna
celular, sulfuro que eventualmente puede reaccionar en el ambiente para formar sulfuros
derivados (Steed et aL 2000), o formar parte del metabolismo de microorganismos
antagonistas (Farras y Gimenez, 1997). En las bacterias reductoras de sulfato, o SRB, el
sulfato es utilizado como aceptar final de electrones durante la respiración, con la
concomitante eliminación del sulfuro formado (Figura 3, Ecuación 1).
4Hz+ SO.t --------------7 S~- + 4HzO
4H2 ---------------7 8H+ + Se"
26
(1)
PERFIL DE SRBEN "lA GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
Un sistema enzimático compuesto de cuatro proteínas realiza la conversión gradual de sulfato
a sulfito (o a bisulfito), y finalmente a sulfuro. Este sulfuro es normalmente precipitado como
FeS o pirita, utilizando comúnmente hierro como ion secuestrante (Finster et al., 1998).
Si bien la utilización de sulfato es la característica metabólica que unifica a este basto grupo de
microorganismos, el análisis genético del 16S DNAr ha mostrado una gran diversidadr
filogenética, existiendo SRB arqueas y bacterias, tennofilicas y mesofilicas, grarn-negativas y
gram-positivas (Castro et al., 2000)., distribuidas en distintos taxa.
Por ejemplo, el análisis filogenético realizado por Daly y sus colaboradores (2000) con
secuencias de SRB recuperadas de las bases de datos "GenBank", "EMBL" y "RDP", ordenóI
a los géneros más representativos y mejor conocidos de SRBs bacterianos, en seis sub-grupos
filogenéticos:
Subgrupo-DFM: Desulfotomaculum.
Subgrupo-DBB: Desulfobulbus.
Subgrupo-DBM: Desulfobacterium.
Subgrupo-DSB: Desulfobacter.
Subgrupo-DCC: DesulfococclIs-Deslllfonema-Deslllfosarcina.
Subgrupo-DSV: Desulfovibrio-Desulfomícrobium..
Cada uno de los cuales es fundamentalmente distinto, y sin embargo ninguno correspondiente
a grupos de SRB termofilicas o arqueas. El análisis de Daly et al. (2000) se restringió a
géneros mesofilicos dentro de la subdivisión delta-proteobacteria y gram-(+) (Figura-a),
géneros distribuidos ampliamente en diversos ecosistemas y variados micro ambientes
(Balows et al., 1994).
27
'¡
PERFIL DE SRB EN·LA GRANJA· R. LUNA·BARRON
G4
.-----lIOO
,....----ooooolIOO
,....----- Oesu/(ooac(cr 4acl1
L.- Desulfobac(ar tetus
'---- DesulfoblJc(er 3ac1 O
'----- Desu/fobacler hydrogenophllus
'---- OesuJfobacter curvetus'---- Desutfobaeter postgalei
,....-----f---- "Oesuifobsetet1um vscuotstum"'--__G~3...; "Oesulfobseterium nmciru"
'----- Desul(obacterlum Itutntro"hlcllm
,.----- Oesulfonema tirmcote
'----- Oe$ulfonema megnum
1..- "Oesu/fonema is/l/m%ei·
'----- OtuulfocOCt:lJ:I mullivorans
'---- Desulf~arcin8varl.bilis
'---- Oesu/fovlbrlo UPOV017JllS
r----- Oesulfobulbus lIIongatus'--__G_2..;---t OesuJfobulbus proplOlllCUS
'---- Desulfobulbus Jpr10
,----! 16
~.
,.----- "Oesulfovibno bastinii·
'----- Desulfovibrlo ss/exigens'----- "Oesulfovibrio CJJledonienS/s·
'---- Oesulfovibrlo halophJIus
r---- "Desu/foVlbno graCJb'S"'----...;
'----- Oesulfovibno longus
.----- DesuIfOVlbnogabonen!~
'---"1. Oesulfovibrlo gl1]as
'----- Oesulfovibrio tJfricanus
,..----- OesuJ(ovibno tcrmuttusr---~
I Oesulfovibno tonqreecnensis'1 G6 '---- Oesulfovibno vu/gans
U, -Oesu/(ovlbrlo desulfuncans
·Oesulfovlbrio 18irfiu/dansis·
L=I Oesulfomierobium bacu/allJm
---- Desulfomierobium eSC8lTlbitHlse
Oesulfovlbrio ecryücus
Oasulfotomacu/um tnermocisternurn
Otlsulfotomacu/um eustmucum"mscu/um IhefTTlob'enzoicum
mscutum geothefTTlicum
maculum tnermoseoovorens
nigrific8nS
rominis
r
I1 Desulfolo
GI Dasulloro
Oesu/foto
Desulfolomacu/um100
Desullotomacu/um
Beciüus: subtiü»
Escharichia coli
Figura-r: Árbol filogenético con los linajes de los seis sub-grupos de SRB según K. Daly R., R. J. Sharp y J,McCanhy (1000). El árbol fue elaborado mediante el método de Jukes & Cantor (1969) en base a 135 l
nucleótidos sobre el 16S ONAr. Los sub-grupos han sido asignados de G1 a G6. (Daly et al., 2000).
28
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
2.3.1. SUBGRUPO DFM (Gl) - DESULFOTOMACULUM
Figura-S: Células SRB gram-(+) termofllicas delgénero Desulfotornaculurn. Linea- IOum
(Bakermans y Madsen, 2002)
Dos géneros son destacables en este
subgrupo: . Desulfotomaculum y
Desulfoesporosinus. El primero ha sido
ampliamente estudiado. Las diferencias
fundamentales ante los otros cinco sub
grupos, es la composición de la pared
celular; es decir, siendo bacterias
semiesféricas mesófilas o termófilas rnótiles,
son las únicas SRB grarn-positivas de bajo
contenido GC, anaerobias estrictas y que
además forman esporas (Figura 5. flecha)
(Londryet al., 1997; Castro et al., 2000).
-
--'" --\~
..."
1--
.... "I
Algunas especies recientemente descubiertas pueden ser consideradas termofílicas. por
ejemplo Desulfotomaculum thermocisternum puede encontrarse a temperaturas próximas a los
100 "C en el subsuelo minero (Irnachi et al., 2000; Nakagawa et al., 2002). Representantes de
este género se han hallado en todos los ambientes naturales, tanto en suelos como en aguas.
continentes y mares, y también en el tracto digestivo de animales neonatos, específicamente en
el estomago más no en los intestinos (Deplancke et al., 2000).
Generalmente se hallan conjuntamente a metanógenas en diversos ambientes continentales
polucionados (Kenglen et al., 1999), e interaccionan con estas arqueas en la degradación de
tolueno, aunque son capaces de vivir con etanol, propionato, butirato, lactato y especialmente
con compuestos aromáticos como el benzoato (Ficker et al., 1999).
Fuente de carbono + SO.t -------7 C02 + S2- + 2H20 (2)
29
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA' R LUNA-BARRÚN
También se han encontrado en perfiles de lignito cuaternario (Detrners et al., 2001), en
depósitos de petróleo crudo (Nilsen et al., 1996 en Imachi et al., 2000) y se les reconocen
propiedades de utilizar hidrógeno como fu~nte de energía. lo que sugiere quirniolitotrofía
(Imachi er al., 2000). Por otro lado, representantes de este sub-grupo, a diferencia de otras
SRB, son capaces de reducir arsénico a AS203 y precipitarlo durante el metabolismo del S(VI)
de forma intra y extracelular (Newman et al., 1997) Y realizan un proceso bioquímico
recientemente estudiado, la 'dismutación de tiosulfato, es decir, la conversión simultánea de
tiosulfato (S20 / ) en sulfato y sulfuro (Ec. 3), reacción sumamente importante en el ciclo
global'del azufre (Jackson y McInerney, 2000):
(3)
De acuerdo al análisis de Daly (2000), la localización filogenética de Desulfotomaculum y
Desulfoesporosinus, muestra una gran distancia en relación a los cinco grupos restantes
(Figura 4). Su localización taxonómica es apartada de los otros grupos de SRB. estando
estrechamente emparentada con el orden clostridiales.
2.3.2. SUBGRUPO DBB (G2) - DESULFOBULBUS
Figurn-6: Microforografía de laSRB Destdfobulbus sp. (Harmsen
et al., (996)
El género Desulfobulbus comparte estrecha relación con
los géneros Desulfocapsa. Desulforhopalus y
Desulfofustis dentro de la familia Desulfobacteriaceae,
por lo que ocupa. junto a los siguientes cuatro sub-grupos
de SRB. una posición dentro de la subclase delta de las
proteobacterias. Sin embargo, las secuencias del 16S
correspondiente a estos cuatro géneros. ha dado
suficientes razones para proponer una familia
independiente (Castro et al., 2000) (Figura 4).
30
PERFIL DE SRB EN "lA GRANJA" R. LUNA-BARRON
Estructuralmente las bacterias de este género pueden ser de forma esférica. semiesférica o
alimonada. pueden ser mótiles o no mótiles. A diferencia del primer sub-grupo
DeslIlfotomaculum, Desulfobulbus es mesofilica gram-negativa, al igual que todos los demás
sub-grupos de SRB (Balows et al., 1994). Los integrantes de este sub-grupo son mesofilicos
(20-40 OC), oxidando de manera incompleta preferencialmente el propionato a lactato; no
obstante se ha visto que son capaces de subsistir con lactato. etanol, H2, acetato, formiato y
bicarbonato (Bendit et al., 2001; Ito et al., 2002a) como substratos, utilizando alguno de estos1
compuestos incluso en ausencia de sulfato (Balows et al., 1994)..Además de la reducción de sulfatos, estos microorganismos son capaces de utilizar
sorprendentemente nitrato y oxígeno como aceptor final de electrones (Ita et al., 2002b), lo
que los convierte en aerotolerantes y probablemente sulfato-reductores facultativos y
caracteriza de manera singular a este sub-grupo (Ito et al., 2002a). En relación con este tipo de
fenómeno, se ha observado también la disrnutación de azufre (Ec, 4), sulfuro (Ec. 5), sulfito y
tiosulfato (Euseler y Cypionka, 1995: Finster et al., 1998), con azufre elemental como
compuesto intermediario.
2HS' + 402 ---------7 2S0.¡2· + H2
(4)
(5)
Por otro lado. Desulfobulbus (Figura 6) es un grupo ubicuo y presente tarnbiénén depósitos de
plantas petroleras yaguas contaminadas con tóxicos industriales. Una investigación detallada
de las comunidades de SRB en lodos activos (polucionados), encontró que Desulfobulbus
representa un 4,8% de la población microbiana, siendo uno de los géneros más importantes en
la comunidad (Ita et al., 2002a). La sucesión microbiana evaluada en rnicrocapas (biofilms),
evidenció que el efecto de oxígeno durante la formación de la microcapa, produce etapas de
latencia que preceden una composición predominante de Desulfobulbus y Desulfovibrio, lo
cual remarca la presencia dominante de estos géneros en múltiples ambientes debido a su
adaptabilidad a la química de su entorno (Santegoeds et al., 1998). Al realizar la reducción de
31
PERFIL DE SRa EN 'LA GRANJA' R. LUNA-BARRON
nitratos, Desulfobulbus es capaz de competir con bacterias nitrificantes, pero se ha visto que
no existe relación sintrófica con rnetanógenas, lo cual remarca una característica importante de
este grupo (Harmsen et al., 1996).
2.3.3. SUBGRUPO DBM (G3) - DESULFOBACTERlUM
Este género esta incluido en al familia¡
Desulfobacteriaceae y comparte estrecha
relación con los géneros Desulfobacter,
Desulfobacula y Desulfospira (Castro et al.,
2000) (Figura-r). Sin embargo, la característica
más importante es que hasta ahora
Desulfobacteriurn solo se ha encontrado en
aguas marinas (Balovvs et al., 1994).
,- ""'*: . '-.i' .'.. li...·--"'1
•.~.•
.r
...)
.' .
Figura-": Microfotografia de microorganismosaislado de campos petrolíferos pertenecientes al
sub-grupo DBM (Harrns el al., (999).Linea=5um.
Las células de Desulfobacteriurn (Figura 7) pueden ser ovaladas o semiesféricas. son
rnesofílicas grarn-negativas, motiles y no motiles (Castro et al., 2000). Pueden metabolizar
acetato luego de la fermentación del butirato (Janssen et al., 1995), y son capaces de obtener
carbono y energía de compuestos orgánicos aromáticos (Harms et al., 1999), derivados del
tolueno, benzoato, furnarato, tóxicos como el cresol, algunos ácidos grasos. alcoholes. H2 y, a
diferencia de Desulfotomaculum que solo puede degradar el aminoácido Cysteina,
Desulfobacterium puede utilizar isovaleriato. isoleucina, leucina y utilizar aspartato y
amoniaco como fuente de nitrógeno (Rees et al., 1998; Muller et al., 2001), lo cual es muy
importante en la mineralización de compuestos orgánicos en mares (Ec. 6).
Entre las demás SRB. este género ha sido muy utilizado para varios estudios sobre el ciclo del
azufre, la mineralización de aminoácidos. y el fraccionamiento isotópico deuterio/hidrógeno
en sedimentos marinos (Morasch et al., 2001). Sin embargo, no se han encontrado hasta ahora
PERFIL DE SRa EN -LA GRANJA" R. LUNA·BARReN
representantes en continentes, tal vez debido a su elevado requerimiento de NaCl (> 150 mM)
y MgClz (>5 mM), lo cual diferencia espacialmente a este género del las demás SRB (Balows
et al., 1994).
2.3.4. SUBGRUPO OSB (G4) - OESULFOBACTER
•.'-, .
•...... "L-,'__...
Figura-S: Células de probableDesulfobacter asociadas al ciclo delDMS (Van Der Maarel et al., 1996)
Linea = IOum.
Las SRB de este género (Figura 8) corresponden
probablemente a las bacterias mejor adaptadas a los
cambios del medio. Son capaces de metabolizar con
mayor eficiencia el acetato debido a que poseen toda la
maquinaria funcional para realizar el ciclo del ácido.cítrico (Balows et al., 1994). No obstante pueden
subsistir con una gran variedad de substratos como es
característico de la familia Desulfobacteriaceae.
Morfológicamente pueden ser ovoides a semiesféricas.
normalmente mótiles y rnesofilicas. Los requerimientos salinos y su localización. hicieron
creer que era un género marino al igual que Desulfobacterium. Sin embargo. Desulfobacter
postgatei fue aislada a partir de sedimentos lacustres (Balows et al.. 1994). aunque en bajo
número.
La composición de Desulfobacter en referencia a Desulfovibrio. el género más diverso y
expandido, es variable según el ambiente. De manera general, se ha visto que en sedimentos
marinos es mayor el porcentaje de Desulfovibrio, pero en sedimentos lacustres salinos la
relación es inversa (Fry et al., 1997; Macalady et al., 2000: Zhang y Fang, 2001).
2.3.5. SUBGRUPO
DESULFOSARCINA
OCC (G5)
..,..,
.).)
DESULFOCOCCUS-DESULFONEMA-
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA'
Estructuralmente los géneros Desulfococcus,
Desullonema y Desulfosarcina, son distintos. De
manera general, Desulfococcus se agrupa en células
cocoides virtualmente inmóviles. Desulfosarcina
puede ser ovoide o cocoide agrupada. mientras que
Desulfonema es el único género de SRB multicelular
filamentosa rnotil por deslizamiento. Sin embargo, el¡
análisis del 16S las relaciona estrechamente,'<
agrupándolas dentro de la familia Desulfobacteriaceae
en' el orden Desulfosarcinales, que comparten con los
géneros Desulfobacterium, Desulfobacter y de manera
más distante con Desulfobulbus, que ya se han descrito
(Figura 4).
R. LUNA·BARRON
Figur:J.-9: Microfotografíaelectrónicade la SRB
Desulfococcus sp. (Drzyzgaet al.,1996).
La característica metabólica de la familia implica la oxidación completa de substratos (Harms
et al., 1999; Castro et al., 2000), entre los cuales pueden incluirse forrniato, acetato. acetona
(Ec. 7: Janssen y Schink, 1995), propionato. butirato, isobutirato. valeriato. metilbutirato.
caproato, malato, piruvato, succínato, furnarato. malato. benzoato, etanol. propanol. butano! e
hidrógeno más CO~ (Drzyzga et al., 1996; Fukui et al., 1999). No obstante. todos los
compuestos no son utilizados indistintamente por los tres géneros.
CH3COCHJ + SO.t --------7 HCOJ' + HS' + H" (7)
La oxidación completa realizada por estas SRB, puede tener relación con la actividad
sintrófica entre éstas y las bacterias rnetanógenas, de manera semejante a Desulfobacterium,
especialmente en sedimentos marinos a más de un metro de profundidad (Thomsen et al..
2001), donde se han detectado los tres géneros. La oxidación del metano en anaerobiosis (Ec.
8) parece estar relacionada a la utilización del hidrógeno formado (Ec. 9), principalmente por
bacterias sulfato-reductoras de estos tres géneros (Orphan et al., 2001), proceso importante
para mantener los niveles de metano volátil en los océanos.
34
PERFIL DE SRB EN oLA GRANJA" R. LUNA-BARRON
(8)
(9)
Por otro lado se sabe sobre la capacidad de algunas SRB de utilizar alcanos (Ec, 10),
principales pesados hidrocarburos componentes del petróleo, y acelerar procesos de
degradación de este compuesto y ser responsables de la corrosión de los reservorios a causa de•
la producción de sulfuros de hierro (Ming So y Young, 1999)."
C16HnOz + 0,18NH) + 11,0"5S042- + 22.lH" -7 15,lC02 + 0,18CJH¡02N + 11,05H2S +
15,6H20 (10)
De los tres géneros, Desulfonerna es el único filamentoso y que hasta ahora solo se ha
encontrado en sedimentos marinos. Este género posee cierta similitud estructural con bacterias
oxidantes del azufre de los géneros Beggiatoa y Thioploca, por 10 que es fácil confundirlas.
Sin embargo. su fisiología es clara acerca de [asulfato-reducción (Fukui et al., 1999).
2.3.6. SUBGRUPO DSV (G6)- DESULFOVIBRlO-DESULFOMICROBIC~1
Figura-Iü: Microfotografía electrónicade laSRa Desulfovibrio sp. (Drzyzga et al., 1996).
La familia Desulfovibrionaceae contiene el
género mejor conocido y mis estudiado de las
SRB Desulfovibrio (Figura lO), junto a
Desulfomicrobium, Desulfomonas,
Desulfohalobium y Desulfonatronum (Figura
4). Morfológicamente son por lo general
vibrioides, espiralados u ovoides. Al igual que
Desulfotomaculum la mayoría son
completamente motiles, pero a diferencia son
grarn-negativas mesofílicas y no forman
esporas (Castro et al., 2000).
35
PERFil DE SRBEN .u\ GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
Sin embargo, las características más sobresalientes corresponden a los múltiples hábitats en
los que se han encontrado, y las intrincadas estrategias metabólicas que les permiten subsistir
incluso como verdaderos parásitos.
Metabólicamente se diferencian de la familia Desulfobacteriaceae por realizar una oxidación
incompleta de los substratos (Ec. 11) con la formación final de acetato durante la fermentación
(Voordoow et al., 1995). Los substratos pueden ser lactato, piruvato (Tsu et al., 1998), etanol y•
otros alcoholes, malato, fumarato (Balows et 0.1.,1994), propionato, butirato, isobutirato,
valeriato, rnetilbutirato, caprotato, 'malato, piruvato, succinato, fumarato, malato, benzoato,
etanol, propanol, butanol, hidrógeno más C02 (Fukui et al., 1999) e incluso cisteato (Ec, 12;
Lave et al., 1997).
2Lactato + SO.? --------~ 2Acetato + 2C02 + HS· (11)
Durante su metabolismo pueden utilizar como aceptar final de electrones a sulfato. sulfito.
bisulfito, azufre elemental, O2, y bajo ciertas condiciones furnarato (Krekeler et al., 1997). Son
importantes en los procesos de disrnutación de compuestos azufrados. y al igual que algunas
Desulfobacteriaceae, son capaces de subsistir bajo estrés oxidante en presencia de incluso 20
uM de O2 (la mayoría no sobrevive por encima de 0.24 a 0,48 uM) en el torrente sanguíneo
humano (Schoenborn .et al., 2001), reaccionando inicialmente con quimiotaxis de
aglomeración (Krekeler et al., 1997), y con actividad superoxidasa mediante proteínas tipo
rubcreritrina y ruberedoxina (Bonomi et al., 1996; Lummopio et al., 2001), neelaredoxina
(Silva et al.. 2000) y otros mecanismos aun no estudiados en profundidad (Dos Santos et al.,
2000).
Más aun, la amplia distribución de este grupo a permitido realizar investigaciones mas
detalladas acerca de la estructura y funcionalidad de muchas proteínas presentes en todos los
grupos de SRB. Sedimentos marinos son los ambientes donde más estudios se han realizado
36
PERFILDE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA·BARRON
con este grupo, y con las SRB en general. El desarrollo en medios saturados de hidrógeno
como única fuente de electrones (H2), han demostrado inducir con más fuerza la reducción
disimilatoria dependiente de la sulfito-reductasa-disimilatoria (OSR), enzima calve de la
sulfato reducción y presente en todas las SRB, mientras que el crecimiento con substratos de
carbono acentúan la actividad de la hidrogenasa periplásmica (Steger et al., 2002).
Si bien' se han encontrado' y estudiado en sedimentos mannos, micro ambientes rocosos
(K.rumholz et al., 1999), suelos, ambientes lacustres y tanques de petróleo (Orphan et al.,
2000), entre otros, Desulfovibrio se ha hallado también en el torrente sanguíneo de animales y
seres humanos con problemas peritoníticos inflamatorios (Ozierzewicz et al., 1996;
McDougall et al., 1997; Shukla et al., 2000), en el tracto urinario (La Scola y Raoult, 1998), yI
recientemente en el cerebro de pacientes con abscesos cerebrales (Lozniewski et al., 1999).
presentando resistencia a algunos antibióticos como la penicilina (Lozniewski et al.. 2001).
Dos géneros asociados fílogenétícamente a esta familia, Lawsonia y Bilophia. son parásitos en
mamíferos (Schoenbom et al., 2001). Sin embargo no poseen la capacidad de sulfato-reducir.
aunque presentan las dos sub-unidades A y B de la DSR, por lo que pueden reducir sulfito
pero no sulfato. La enorme diversidad de Desulfovibrio ha hecho dificil el diseño y uso de
marcadores moleculares basados en el l6S, para su detección en los distintos ecosistemas
(Daly et al., 2000). Sin embargo, nuevas estrategias se están diseñando con éxito. las cuales se
basan en genes funcionales del metabolismo energético como los de la DSR (Hipp et al..
1997).
2.4. LA SULFITO REDUCTASA DISIMILATORIA
La reducción de sulfatos, llevada a cabo durante el metabolismo de las SRB. puede resumirse
estequiométricamente en dos reacciones bioquímicas independientes: 1) la reducción de
sulfato (SO/) a sulfito (S03 =; Ec.13), y 2) la reducción dísimilatoria de sulfito (SO]:) a
sulfuro (S=; Ec.14) (Farras y Giménez, 1997). La primera reacción es catalizada
37
PERFIL DE SRO EN "LA GRANJA· R. LUNA·BARRÓN
principalmente por una "adenosina-S' -fosfosulfato reductasa" (APS-reductasa) presente en
múltiples grupos bacterianos en diversas variantes; la segunda es llevada a cabo
principalmente por una "reductasa disimilatoria de (bi)sulfito" (DSR); ambas proteinas son
consideradas enzimas fundamentales durante la sulfato-reducción microbiana, pero la DSR
cataliza la conversión final de sulfito durante éste proceso, lo cual es característico de la
reducción no asimilativa de sulfatos.
Sin embargo en la biología molecular, la APS a adquirido mayor importancia en el estudio de
bacterias asimiladoras de azufre (ej. sulfuro-oxidantes) (Bick et al., 2000; Sánchcz et al.,
2000), mientras que la DSR ha sido mejor caracterizada en las bacterias reductoras de sulfato
(SRB), debido principalmente a que los genes que codifican esta enzima, poseen una
secuencia y estructura muy conservadas dentro de' este grupo de bacterias y arqueas (Hipp et
al., 1997).
ATP + SO,¡- + 2H" -----~ AMP + S03- + HzO (l3)
(14)
La comparación filogenética, estructural y funcional de la APS vs. la DSR, supone una
evolución convergente de ambas proteínas, y por lo tanto un origen evolutivo distinto (Bick et
al., 2000). De acuerdo con esto, la DSR es funcionalmente considerada como un indicador de
anaerobiosis obligada (Perkins, 2000), no obstante es estructuralmente semejante a versiones
homólogas de DSR presentes en otros grupos de microorganismos del azufre pero no
funcionalmente (Hipp et al., 1997).
La estructura terciaria de la DSR ha mostrado que ésta se compone de dos sub-unidades
proteínicas principales llamadas dsrA y dsrB, organizadas en dos grupos formando un
tetrámero, con un siro-hemo en el dominio dsrA y dos grupos prostéticos Fe-S en ambos
dominios A y B (Friedrich y Schinck, 1995; Morse et al., 2000). Se ha propuesto por lo tanto
38
PERFILDE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA·BARRÓN
que la sub-unidad dsrB, probablemente se ha originado a partir de un desdoblamiento de la
dsrA en una OSR primitiva (Lave et al., 2001).
Al profundizar en el estudio de la estructura secundaria y el ordenamiento de los genes que
codifican la OSR. Larsen y colaboradores (2001) observaron que el grupo de genes en
Thermodesulfbrhabdus norvegica se ordenaba en seis ORC's subsecuentes: dsrD-A-B-N-C
fdx. hh mayor parte de la proteína ensamblada corresponde a las sub-unidades A y B, con
pesos correspondientes de 49kD y.43kD, (Morse et al., 2000), mientras que las sub-unidades~ , "
O. C y N son mucho más Jivianas (aprox, 13kD) y sus funciones aun no han sido bien
estudiadas.
Puesto que genes. estructura, composición y función de la OSR, son muy distintos a los
encontradas en el grupo más cercano de microorganismos. es decir las bacterias asirniladoras
de azufre (sulfuro-oxidantes. por ejemplo la fotótrofa Chromatium vinosum: Hipp et al., 1997:
Wagner et al., 1998), y aun más distantes a los encontrados en otros grupos menos afines
(Cottrell y Gary, 1999; Larsen et al.. 1999), el desarrollo de marcadores moleculares basados
en la DSR para el estudio de la ecología de las SRB fue propuesto inicialmente por Karkhoff
Shweizer y colaboradores en 1995. con el estudio preliminar de similitudes entre la
composición de la OSR de la SRB arquea Archaeoglobus sp. y la SRB bacteria
Desulfotomaculum sp. (Karkhoff-Shweizer et al., 1995).
Debido a la importancia de la función metabólica de este complejo proteínico en el ciclo
global de azufre, se conoce la secuencia completa de las sub-unidades A y B de al menos un
género de cada división microbiana donde está presente la sulfato-reducción (Klein et al.,
200 1), por lo que fue posible realizar análisis comparativos del ordenamiento filogenético de
las SRB, basados en secuencias del 16S, de la OSR y de la APS (Friedrich, 2001).
Se estima que el origen de la OSR data de hace aproximadamente 2800 millones de años. y
que la divergencia entre dominios ocurrió aproximadamente hace 3100 millones de años.
39
PERFIL DE SR8 EN 'LA GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
J I
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Figura-II: Filogenia comparativa de las SRB entre los árboles de la OSR y del 16S ONAr. elaborada en baseal software PAUP* 4.02b2a, ARB o PHYLIP. Los linajes no coincidentes entre ambos están indicados (de ahasta e). Las barras indican 0.1 cambios por nucJeótido o aminoácido respectivamente. (Klein et al., 200 1).
40
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R LUNA·3ARRÓN
Klein y colaboradores (2001) demostraron que existen suficientes evidencias en el análisis
filogenético comparativo de la DSR y el 16S, para suponer que la habilidad de reducir sulfato
fue transmitida mediante un proceso de transferencia horizontal antes o durante la divergencia
de los dominios Arquea y Bacteria, de la línea bacteriana a la línea arqueana. y posteriormente
entre grupos bacterianos gram(+) y SRB terrnofilicas (Larsen et al., 1999; Klein et al., 2001;
Friedrich, 2001).
~omo puede verse en el árbol de .I,a Figura 11, conclusiones sobre la filogenia de las SRB
basadas en la secuencia de la DSR deben hacerse con cautela. Pese a esto. la DSR ha sido una
de las primeras proteínas de importancia ecológicaque se ha utilizado en estudios moleculares
para inferir información sobre la ecología, composición, estructura. fisiología y metabolismo
de las SRB en muestras ambientales de diverso origen (Chang et al., 2001; Smit et al., 2002).
además de ser considerada como potencial "sistema biológico" en la biorernediación de
ambientes contaminados (Perkins, 2000). Basados en el estudio de los sistemas proteórnicos.
es posible comprender mejor la el funcionamiento. la estructura. influencia e importancia de
las comunidades microbianas en el medio ambiente. La información puede accederse bajo
modelos biogeoquírnicos. basados en el estudio del genorna microbiano. los cuales han
comenzado a desarrollarse gradualmente. siendo un ejemplo pionero el estudio de la DSR en
las SRB (Perkins, 2000; Newrnan y Bantield. 2002; Srnit, 2002).
2.5. IMPORTANCIA ECOLÓGICA DE LAS SRB
Las reservas más importantes de azufre en la naturaleza se encuentran en los océanos. Un litro
de agua de mar contiene 19 gramos de sulfato, siendo el sulfato el segundo soluta más
abundante entre todos los aniones y cationes disueltos en al agua. Más aun. existe 1 millón y
50 mil toneladas de azufre total por cada kilómetro cúbico de agua de mar, por lo que éste
elemento es superado en concentración solo por el cloro,el sodio y el magnesio (Ruza, 1993).
41
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA· R. LUNA-BARRON
Tanto los sulfatos metálicos (X2S0~) como el azufre elemental (S,\ son sustancias químicas
extremadamente estables en la naturaleza. Sin embargo, es posible encontrar en distintos
sustratos, niveles significativos de sulfuros (S') y sus derivados, debido principalmente a la
actividad metabólica de dos grupos microbianos ubicuos: las bacterias "oxidantes del azufre",
y las bacterias "reductoras de sulfato" (Madigan et al., 1998) que por ejemplo, son capaces de
remover incluso el sulfato componente de la barita en rocas, un compuesto totalmente
insoluble (Baldi et al., 1996), Ambos grupos son responsables antagónicos exclusivos de la
remoción y reciclaje de tales cantidades de sulfatos y sulfuros, formando parte fundamental
del ciclo del azufre en el planeta desde épocas arqueanas.
La influencia de las bacterias reductoras de sulfato (SRB) en los procesos naturales que
involucran al azufre es casi absoluta, de tal forma'que incluso es posible reconstruir la historia
natural del pasado evolutivo del planeta en base a las marcas biogeoquímicas que las SRB
ancestrales han dejado sobre sustratos marinos, y continentales, antiguos (Habicht et al., 2002;
Wiechert, 2002).
Más aun, la actividad microbiana de las SRB se ha extendido hasta los límites impuestos por
la industria. Estos microorganismos con capaces de incluir en los ciclos ambientales.
compuestos residuales tóxicos derivados del azufre (Muller et al., 2001), por lo general
acompañados de metales pesados de riesgo (Santodomingo et al., 1998; Spear et al., 2000; De
Luca et al., 2001), Yde compuestos organosulfurados y derivados (Cook y Denger, ~002).
,.Desde el punto de vista fisiológico reductor, algunos grupos de SRB han desarrollado
esenciales niveles de sintrofía con un grupo más joven de microorganismos. las bacterias y
arqueas del ciclo del nitrógeno (Ita et al., 2002); y de manera semejante lo han hecho con sus
contemporáneas las arqueas rnetanógenas y las oxidantes del metano (Orphan et al., 2001),
aunque esto no es sorprendente, ya que la cantidad de interacciones naturales entre
microorganismos en la naturaleza es casi incalculable y en igual proporción indispensable para
el ecosistema global.
42
PERF!L ce SRB EN LA GRANJA· R. LUNA·BARRÓN
Un ejemplo notable es la formación de dimetilsulfuro (DMS), asociado al fenómeno de
disrnutación en las SRB, el cual es el principal compuesto volátil azufrado en los mares y a
partir del que se forman núcleos de condensación que, posteriormente, permitirán la formación
de nubes y consecuentemente de precipitaciones pluviales (Van Deer Maarec et al., 1996).
Durante el metabolismo de las SRB, diversos compuestos son utilizados como fuente de
carbono orgánico en procesos de fermentación y respiración, entre los cuales son notables los
carbohidratos aromáticos, normalmente dificiles de metabolizar (Harrns et al., 1999; Schink et
al., 2000). De manera semejante, la obtención de energía se basa preferencialmente en el
hidrógeno molecular (Hz; Sonne-Hansen et al., 1999), de uso muy frecuente entre
microorganismos quimiolitótrofos (Madigan et al., 1998).
Si bien la mayor parte de las SRB se encuentran en sedimentos marinos (más del ..W% del total
de bacterias en micro capas; Zhang y Fang, 2001), su importancia ecológica no ha sido aun, , " .
bien definida en ecosistemas continentales. Si se procede en un .orden arbitrario para
describirlas. representantes de éste diverso grupo se han encontrado en simbiosis con algunos
artrópodos (Ohkuma et al., 1996), en el tracto digestivo de varios mamíferos (Morvan et al.,
1996: Dzierzewicz et al., 1996; Schoenborn et al., 2001) asociadas o no a procesos infecciosos
(McDougall et al., 1997), en el sistema circulatorio (Shukla y Reed. 2000), ji se han
encontrado conjuntamente con metanógenas en la nora bacteriana de la cavidad bucal de
humanos (Robichaux et al., 2003), y recientemente en el sistema nervioso de pacientes con
abscesos cerebrales, probablemente transmitidas por el aire a través de los conductos nasales
(Lozniewski et al., 1999; Loubinoux et al., 2000).
No es clara la función de las SRB en simbiosis con organismos superiores. Si bien la mayor
parte de las comunidades de SRB en el tracto digestivo de mamíferos, utilizan ácidos grasos
como fuente de carbono y energía (Dzierzewicz et al., 1996), al inhibir la sulfato-reducción se
acumula etanol (Willis et al., 1997) eventualmenteperjudicial para el organismo hospedero.
43
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA' R. LUNA·BARRÚN
Existe mayor cantidad de información sobre las SRB y distintos eco ambientes,
principalmente por estudios basados en comunidades de SRB presentes en sedimentos y suelos
continentales. No ha sido dificil detectar SRB en depósitos petrolíferos o nucleares
(Santodomingo et al., 1998). Aunque la producción de H2S induce la corrosión de los
depósitos metálicos, las SRB han mostrado cierto potencial parala biorernediación en áreas de
derrame de hidrocarburos pesados (Cohen, 2000).
\ Si bien durante mucho tiempo se ha considerado a las SRB como anaerobias estrictas, la
múltiple variedad de las estrategias metabólicas que gradualmente se están descubriendo en
este grupo (Reichenbecher y Shink, 1997; Baungarten et al., 2001), muestran a las SRB
poseen un gran potencial bioquimico aun no bien entendido, y con formidables perspectivas en,
biorernediación. El desarrollo de microorganismos transgénicos para subsanar múltiples
descuidos industriales es aparentemente una estrategia útil (Pazirandeh et al., 1998), pero
existen muchos esfuerzos para demostrar que sistemas naturales son mucho más eficientes
(Lovely y Coates. 1997; Stepheny Macnaughton, 1999).
La actividad fisiológica de las SRB, que ejerce notable influencia en el entorno que las rodea.
se ha detectado en un basto rango de temperaturas, desde próximas a los O°C (Ravenschlag et
al., 1999), hasta casi los 100 "C (Castro et al., 2000). en ambientes normalmente anaerobios
pero también en condiciones aerobias (Sigalevich y Cohen, 2000; Shoenborn et al., 2001), en
el ambiente natural y en los tejidos de otros organismos (La Scola y Raoult, 1998), enI
condiciones salinas normales, pero también en ambientes halofílicos hasta con 12% de NaCI
(Brandt et al., 2001), bajo un pH entre 5 y 8 (Rarnlal et al., 1985),
Aunque las SRB pueden ser ciertamente problemáticas en ciertos aspectos industriales como
el almacenamiento de combustibles en depósitos metálicos, la interacción con grupos
microbianos antagónicos que inhiben la reducción de sulfatos puede evitar la corrosión de los
mismos (Jayararnan et al., 1999). Sin embargo, la producción de sulfuro de hidrógeno por
estas bacterias es un proceso muy valorado en áreas polucionadas con desperdicios mineros,
44
PERFIL DE SRB EN '"lAGRANJA· R. LUNA-BARRCN
donde la biolixiviación ha demostrado ser una solución para la remoción de metales pesados
disueltos (Cowling et al., 1992; Du Preez et al., 1992; Elliort et al., 1998; Steed et al., 2000; ).
Sin embargo, existe una preocupante faceta oscura inherente a las propiedades metabólicas de
las SRB. Durante los procesos oxídativos normales de estos microorganismos, la actividad
catalítica de la acetil-Co.A, indispensable para la obtención de materia y energía (Voet et al.,
1999), parece estar muy relacionada a la metilación "accidental" de algunos metales en estado,
iónicoque ingresan al protoplasma celular, de los cuales el más relacionado a las SRB es
probablernente el mercurio (Benoit et al., 2001).
Normalmente, la producción de sulfuros por las SRB permite la formación concomitante de
sulfuros metálicos dependientes de los iones disueltos alrededor, de tal forma que el mercurio
iónico puede ser convertido en HgS que es muy estable en la naturaleza (F. Baldi en Sigel y
Sigel, 1997). Sin embargo, el mercurio que ingresa al protoplasma celular de las SRB es
rnetilado. sr bien algunos metales metilados son menos tóxicos que sus versiones no metiladas
(Hamasaki et al., 1995), el monometilmercurio (CH3Hg) es un compuesto orgánico bio
acumulable extremadamente tóxico para organismos superiores, y especialmente preocupante
para el hombre (Lebel et al., 1998; Amorim et al.. 2000).
Aunque la voz de alerta fue dada en los años 60 a causa de la deposición industrial de
mercurio en playas japonesas (Harnasaki et al., 1995), la problemática del mercurio fue
recientemente asociada a la actividad microbiana. especialmente a la de las SRB (Cornpeau y
Bartha, 1984; Cornpeau y Bartha, 1985; Pak. YBartha, 1998a; King et al., 1999). No obstante,
los procesos fisiológicos asociados al ciclo del mercurio (Wotruba et al., 1998) y la
metilación, parecen estar asociados a las interacciones sintróficas entre las distintas
comunidades de microorganismos y macroorganisrnos de los ecosistemas, y no solamente a un
grupo metabólicarnente unificado (Barkay et al., 1997; Smith et al., 1998: Pak y Bartha,
1998b; King et al., 2000).
45
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA' R. LUNA-8ARRON
Recientes investigaciones realizadas en sistemas hídricos de la cuenca amazónica, han
demostrado la presencia de preocupantes niveles de mercurio en suelos y sedimentos
(Maurice-Bourgouin et al., 2000; Roulet et al., 2000; Roulet et al., 2001), Y de los efectos
negativos que este compuesto está generando en el ecosistema después de su metilación, y en
la salud de asentamientos humanos ribereños que normalmente viven de la pesca (Lebel et al.,
1997)'1 ~
Resultapor lo tanto muy importante comprender. inicialmente. la distribución de los grupos de
bacterias reductoras de sulfato presentes en los sistemas hídricos de la amazonía,
especialmente siguiendo un patrón biogeoquímico elaborado de acuerdo a la distribución,
origen y comportamiento del mercurio en la amazonía.
Al respecto. es importante notar que en Bolivia existe información muy limitada referente a la
microbiología ambiental, y a la ecología microbiana. Un trabajo pionero basado en el cálculo
de la densidad microbiana por DAPI. fue realizado por Rejas y colaboradores (2002). en
lagunas de várzea en el extremo sur de la amazonía boliviana (Dtpo. Cochabarnba). Sin
embargo. dada la enorme diversidad estimada no descrita aun en la amazonía (Borneman y
Triplett. 1997), la caracterización preliminar de comunidades de SRB en sedimentos lacustres
de la cuenca del río Beni es el primer paso en el estudio de la microbiología de las SRB.
46
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA'
3. OBJETIVO GENERAL
R. LUNA-BARRÓN
El objetivo general de la presente investigación es iniciar estudios de ecología microbiana,
utilizando métodos de biología molecular, para contribuir al conocimiento sobre la
composición y ecología de las bacterias sulfato-reductoras (SRB) en sedimentos de laguna "La
Granja" de la cuenca amazónica del rio Beni en Bolivia.1
3.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la distribución vertical de S1,U3 en tres muestras sedimentarias con micro
hábitats distintos de laguna "La Granja" (centro laguna, bosque inundado y bajo
rizósfera).
Elaborar un perfil cuantitativo preliminar vertical de los sub-grupos DSV, DSB, DBB.
DFM Y DCC de bacterias sulfato-reductoras presentes en las tres muestras
sedimentarias de laguna "La Granja".
Evaluar las relaciones cualitativas y cuantitativas, en composición y estructura. de la
distribución vertical y horizontal de SRB en los tres puntos sedimentarios muestreados
en "La Granja".
4. METODOLOGÍA'
4.1. .Á.REA DE ESTUD10
Laguna "La Granja" es un cuerpo de agua pequeño que forma parte del sistema de lagunas
meándricas en la llanura de inundación que acompañan el curso del río Beni de la amazonía
boliviana; está localizada a 14 km 74° NO de la población de Reyes, al oeste limítrofe de la
provincia Gral. Ballivián del Depto. del Beni, a los 14°16' S y 67°28' O sobre 200 msnm
(Figura 12B.). Aproximadamente a 30 km hacia el sur de la laguna se encuentra la zona de
47
PE.~FIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
transición cordillerana de las praderas benianas, De acuerdo con el análisis comparativo de las
marcas dejadas por antiguos cursos del río, esta pequeña laguna alguna vez formó parte de un
curso antiguo del río. Actualmente se conecta de manera ocasional con el río Beni durante
épocas de inundación.
B)
67~29'
14°16'-.-1rH--'-'-"'~-ll\'
AN
Figura-12: A) Localización geográfica de la zona de acceso a "La Granja". El recuadro izquierdo muestra elárea correspondiente a la transición cordillera-llano en la parte norte del territorio boliviano a escala 1:20000000.El recuadro derecho es una ampliación fotográfica satelital de la zona de transición cordillera-llano; la poblaciónde Rurrenabaque al extremo sur marca el punto de transición; los caminos carreteros de acceso a laguna la "LaGranja" (ubicada al norte) son claramente visibles; al este se muestra la población de Reyes como referencia;nótese que "La Granja" es el primer meandro abandonado de la cuenca del río 8eni en etapa de senectud. B)
Localización geográfica de laguna "La Granja" en latitud y longitud según el meridiano de Greenwich a escala1:I00000. La población de Reyes localizada al este como referencia.
48
PERFIL DE SRB EN -LA GRANJA' R. LUNA·BARRÓN
Los tres puntos analizados (CEN, SIN y SRl) están localizados en el extremo noroeste de "La
Granja" (Figura 13). La elección de esta parte de la laguna está principalmente asociada a la
dirección de la corriente del Río Beni característica de sur a norte. y a la antigüedad
relativamente intermedia de la laguna, en comparación a los demás meandros abandonados.
Figura-l3: Puntos de muestreo de sedimentos en laguna"La Granja". A) Localización espacial de cada punto(CEN = centro laguna, SIN = bosque inundado, SR! = bajo rizósfera) en el extremo nor-oeste de "L J
Granja". B) Esquemahorizontal de la localización y profundidad de cada punto muestreado.'
4.2. OBTENCIÓN DE MUESTRAS - MEDICIÓN DE pH YEh
El área aproximada de la laguna comprende de 1.3 a 1.5 krrr', pero las muestras fueron
colectadas dentro de un área perirnetral no mayor a los 0.25 km'. Durante la época de
muestreo, el nivel de las aguas cubría los depósitos de albardones semilunares sobre
aproximadamente los 30 cm.
49
PERFIL DE SRB EN ·lA GRANJA· R. LUNA-BARRÓN
La colecta se realizó la segunda semana del mes de marzo del 2002. Se obtuvieron tres
muestras de sedimento correspondientes a tres puntos distintos del extremo norte de la laguna,
en cilindros plásticos de 5 cm de diámetro y 20 cm de alto (Figura 13):
1) La primera muestra (centro de laguna, CEN) fue extraída en la zona media de "La Granja",
a una profundidadaproximada de 2.3 metros.
2) La segunda (bosque inundado, BIN) fue obtenida en a una profundad aproximada de 0.3 m
en la zona boscosa del albardón del meandro, que es inundada estacionalmente.
3) La' tercera (bajo rizósfera, BRl) se obtuvo del extremo norte de la laguna, cubierto por
macrófítas flotantes, a una profundidad aproximada de 1.8 metros.
permite un volwnen de muestra de 6.25
cm) por cada sección de 1 cm de alto y
cubre un área horizontal de 15.71 crn' (
en términos microbiológicos, por demás
suficiente-, Devereux R., com.pers.).·
Una colecta con tubos más delgados
habría producido un efecto de borde
capaz alterar la composición vertical de
los microorganismos presentes durante
la manipulación de las muestras.
BIN BRI
IIIDDDDD
,,-;:-,1
Ph
Figura-14: Esquema de la campana plásticaportátil,sellada y saturada de nitrógeno en el campo, para elseccionamiento de lasmuestras sedimentarias cadamedio centímetroen condiciones estériles. Antes de
retirar los tubos con las muestras seccionadas seprocedióa medirel pH.
Considerando las dimensiones y estructura en matas, que las comunidades microbianas
establecen en un micro hábitat
sedimentario dado (Varnarn y Evans,
2000), fue extraída una sola muestra
por punto tomando en cuenta el
diámetro de 5 cm de cada cilindro, que
Inicialmente se realizaron las mediciones del perfil de Eh de cada cilindro mediante
microsondas de platino y un "Eh-meter Consort@" calibrado. Luego los cilindros fueron
50
colocados en una cámara portátil sellada y saturada de nitrógeno. y se seccionaron
manualmente sub-muestras de 0.5 cm de espesor (Figura 14). Se obtuvieron 19secciones en la
muestra CEN, 19 secciones en BR! y 15 en BIN. Las secciones obtenidas de los primeros 10
cm de profundidad, fueron colocadas en tubos plásticos estériles saturados de nitrógeno, en los
que se realizó la medición de pH con un "pH-meter Consortf" de campo, para finalmente
sellarlos y conservarlos a -15 "C en un congelador portátil Wacco~. En estas condiciones
fueron transportadas hasta el laboratorio en el lapso de 5 días.
4.3. EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIRDE SEDIMENTOS
Todas las secciones fueron sometidas inicialmente al método Zhou (Zhou et al., 1996),
modificado y ajustado a las condiciones de cada muestra (Achá y Luna-Barrón, en
preparación), tal como se describe a continuación: ,
A 600 mg de suelo o sedimento. se adicionaron 810 ul de buffer de lisis (Tris-Cl 100 rnivl,
Na2EDTA 100 mM. fosfato de sodio 100 mM, NaCI 1.5 M, Bromuro de hexadecil-trirnetil
amonio "CTAB" 1 - 1.5 %) Y6 ul de proteinaza-K (10 mglml). La mezcla fue sometida a
Tabla-Z: Cebadores utilizados para la detección de SRB mediante PCR-anidado. FD1 YRP:2, universalespara amplificar el 16S DNA ribosornal: DFM. Desulfotomaculum; DBB, Desulfobulbus: DBM.
Desulfobacterium; DSB. Desulfobacter; DCC. Deslllfococcus-Deslllfonema-Deslllfosarcina; DSV.Desulfovibrto-Desulfomicrobium (Dalyet al., :2000).
R-G,A, Y-C, T,K-G, T,M-A,C,S-G,C,VV=A, T.
Cebador Región SECUENCIA (S'·3') Sub-grupo Alín. oC Tamaño pb
FD1 165 inicial AGAGTTTGATCCTGGCTCAG - 55 1503RP2 165 terminal ACGGTCACCTTGTTACGACTTDFM140 140-158 TAGMCYGGGATAACR5YKG OFM 58 700OFM842 842-823 ATACCCSC'M/IICWCCTAGCAC088121 121-142 CGCGTAGATAACCTGTCYTCATG 088 66 " 11200881237 1237-1215 GTAGKACGTGTGTAGCCCTGGTC08M169 169-183 CTAATRCCGGATRAAGTCAG 08M 64 840D8M1006 1006-986 ATTCTCARGATGTCAAGTCTG058127 127-148 GATAATCTGCTTCAAGCCTGG 058 60 1150OS81273 1273-1252 CYYYYYGCRRAGTCGSTGCCCTOCC305 305-327 GATCAGCCACACTGGRACTGACA OCC 65 860OCC1165 1165-1144 GGGGCAGTATCCTYACATTAGCOSV230 230-248 GRGYCYGCGTYYCATTAGC OSV 61 610OSV838 838-818 SYCCGRCAYCTAGYRTYCATC
- - - - -
. 51
PERFIL DE SRa EN "LA GRANJA' R. LUNA-8ARRÓN
agitación (vórtex) por 40 min, y se agregaron 180 ul de SDS (10%) para luego incubar a 65 "C
por 2 hrs con agitación suave cada 15 mino Luego los tubos se centrifugaron a 6000 g por 10
mino se recuperó el sobrenadante (aprox. 600 ul), yal precipitado residual se agregaron 408 ul
de buffer de lisis y 60 ul de SDS (10%), incubando a 65°C por 10 min, posteriormente se
centrifugó a 6000 g por 10 min y recuperó el sobrenadante. A ambos sobrenadantes se
agregaron 0.8 volúmenes de isopropanol y acetato de sodio en concentración final de 0.3 M,
dejando reposar verticalmente 1 hora. Luego se centrifugo uno de los tubos a 10000 g por 20,
mino ~e desechó el sobrenadante y combinó la pastilla con el contenido del segundo tubo,
centrifugando nuevamente a 10000 g por 20 mino Se desechó el sobrenadante por inversión y
se agregó 1 ml de etanol (70%), centrifugando a 10000 g por lO mino Finalmente se descartó
el sobrenadante por evaporación y redisolvió el precipitado con 55 ul de agua bidestilada o
amortiguador TE, por incubación entre 4 a 10 ,oC durante 24 horas hasta su disolución
completa.
Las muestras más contaminadas con sustancias húmicas (generalmente de color amarillento a
marrón) fueron sometidas a un nuevo ciclo de purificación que consistió en adicionar al
producto final 2.7 volúmenes de buffer de extracción. realizando una suave agitación manual...
adicionando posteriormente I volumen de cloroformo isoarnil-alcohol y centrifugando a
10000 g por I minuto. El sobrenadante fue precipitado con 0.8 volúmenes de isopropanol y
acetato de sodio en concentración final de 0.3 M. Posteriormente la mezcla fue precipitada
mediante centrifugación a 10000 g por 20 min, descartando el sobrenadante y resuspendiendo
la pastilla con 50 ul de agua bidestilada o amortiguador TE.
En el punto BIN y algunas secciones del punto BRI, se utilizó el sistema comercial MoBio de
extracción y purificación de DNA a partir de suelos y sedimentos (httpv/wvvw.mobio.com),
ligeramente modificado para optimizar el rendimiento con las muestras respectivas. Por
razones comparativas, se aplicaron ambos métodos en secciones seleccionadas al azar en los
tres puntos.
52
PERFIL DE SRB EN -LA GRANJA' R. LUNA-BARRÓN
Los extractos de DNA obtenidos con cada protocolo, fueron verificados mediante
electroforesis en geles de agarosa (EEO estándar) al 1% Y0,25 rng/rnl de bromuro de etidio, y
cuantificados comparativamente con la banda de 23130 pb del marcador de peso molecular
"Lambda HindIII", que representa el 48.7 % de la masa total del marcador.
4.4. DETECCIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRB MEDlANTE PCR-anidado DEL 16S DNAr•
El DNA obtenido de todas las secciones fue diluido 11600 y sometido a PCR utilizando
cebadores específicos para amplificar la mayor parte del gen del 16S RNAr (fd1 5'
AGAGTITGATCCTGGCTtAG-3'; rp2 5' -ACGGTCACCTTGTTACGACTT-3'; tamaño
aprox.1500 pb; La Scola y Raoult, 1998), en un termociclador Hybaid-Touchdown con tapa
fria. El volumen final de reacción fue de 20 ul bajo las siguientes condiciones: Buffer 1X,
MgCl2 1.5 mM. dNTPs 0.2 mM, Ceb FDl 0.5 uM. Ceb RP2 0.5 uM, BSA 0.25 ng/ul y
Taql'olirnerasa 0.05 U/u!.
Posteriormente, el producto de esta primera amplificación, fue sometido a un nuevo PCR
(PCR-anidado) utilizando una dilución 111 O del DNA blanco, se evaluaron seis pares de
cebadores específicos para los grupos de SRB de interés (Tabla 2). Las condiciones de la
reacción para un volumen final de 20 ul fueron: Buffer 1X, MgClz 1.5 mívl. dNTPs 0.5mM,
Ceb-l 0.5 uM, Ceb-2 0.5 uM, BSA 0.25 ng/ul y TaqPolimerasa0.025 U/u!.
En ambas amplificaciones el esquema de ciclos siguió el siguiente orden: desnaturalización
inicial a 94 "C 5 minutos; 30 ciclos de: 94 "C 1 min., temperatura de alineación de cada
cebador (ver Tabla 2, columna "Alin.oC") 2 mino y 72 -c 5 min.; y extensión final 72 -c 10
minutos. Todos los productos fueron evaluados mediante electroforesis en geles de agarosa
(EEO estándar) al 1% y 0,25 mg/ml de bromuro de etidio como tinción reveladora, y
confirmados con el marcador de peso molecularpGEM® .
53
PERFILDE SRB EN "LAGRANJA"
4.5. DIVERSIDAD DE SUB-GRUPOS DE SRB
R.. LUNA·BARRON
La diversidad relativa de los seis sub-grupos de SRB fue determinada mediante el índice de
diversidad de Shannon (if), de acuerdo a la ecuación:
s
H= - I (nIIN) Log (nIIN).,-/ (1S)
Los valores asignados para ni corresponden a la abundancia relativa de cada sub-grupo, N
representa la abundancia total de todos los sub-grupos, y S es el número total de sub-grupos
(Hofle et al., 1999).
4.6. DETECCIÓN DE LA SULFITO REDUCTASA DISIMILATORlA (DSR) POR PCR
La presencia del gen de la sulfito reductasa disimilatoria (DSR) fue evaluada en todas las
secciones sedimentarias de los tres puntos (CEN, BIN y BRl) mediante PCR COIl los
cebadores DSRl F (S'·ACSCACTGGAAGCACG-3') y DSR4F (5'·
GTGTAGCAGITACCGCA-3') (Wagner et al., 1998), que permiten amplificar la mayor
Tabla-3: Sondas utilizadas para la detección y cuantificación de SRB mediante hibridizacion por puntos (Dotbíot: Oaly et al., 2000). OFM. Desulfotomaculum; OBB, Desulfobulbus; OBM. Desulfobacterium; OSB.
Desulfobacter; OCC, DeslllfococclIs-Desl/lfonema-Desulfosarcina: OSV, Desulfovibrio-Desulfomicrobium.
SONDA HIBR1D1ZACION CONCENTRACION
Nombro Secuencia Cepa TmoC T uso -c SALINA"
S-" -Osv-06B6-a-A-l B TACGGATTICACTCCT DSV desulfuncans 40.8 36.0 O.BX
TGTTTCAAGTGCACTICCGGGG DS81atus..
S-" -Osb-0623-a-A-1 B 55.3 53.0 0.6X,DS81atusS-"-Osb-0623-a-A-l B TGTTTCAAGTGCTCTICCGGGG 55.3 53.0 0.6X
S-"-Osbb-0660·a-A-18 GAATICCACTTTCCCCTCTG 088 propionicus 50.4 52.0 0.5X
S-' -Ofml-0227-a-A-18 GGGACGCGGACCCAT OFM nigrificans 50.0 45.0 1.0X
S-' ·Ofml-0227-b-A-18 GGGACGCGGATCCAT OFM nigrificans 47.2 45.0 1.0X
S-' -Osb-086B-a-A·18 CAGGCGGATCACTIAATG OCC multivorans 47.4 45.0 0.5X
• 1X=0.0 15M Na¡Cllra[o y O.15MNaCI
parte del gen que codifica las sub-unidades A y B de esta proteina.ien un volumen final de 20
ul de mezcla de reacción bajo las siguientes condiciones: Buffer 1X. MgCh 1.5 rnívl. dNTPs
54
PERFIL DE SRB EN ·LA GRANJA" R. LUNA·BARRÓN
0.5 mM, DSRI F 0.5 uM, DSR4R 0.5 uM, BSA 0.25 ng/ul y TaqPolimerasa 0.025 U/u!. Se
utilizó un terrnociclador Hybaid-Touchdown con tapa fría y el siguiente programa de ciclos:
desnaturalización inicial a 94 "C por 5 minutos; 30 ciclos de 94 "C 1 min., 55 "C 2 mino y 72
"C 5 rnin.; extensión final a 72 "C 10 minutos.
Los productos fueron comparados con el marcador de peso molecular pGEM® mediante
electroforesis en geles de agarosa (EEO estándar) al 1% Y0,2 ug/rnl de bromuro de etidio. La•
especificidad fue evaluada utilizando DNA extraído de las cepas SRB descritas en la Figura 16
como controles positivos, y se utilizó DNA de cepas E. coli como controles negativos.
4.7. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRB MEDIANTE
HIBRIDIZACIÓN MOLECULAR
Los productos del PCR-anidado correspondientes a los sub-grupos de SRB fueron
confirmados mediante una hibridización por puntos (dot-blot), utilizando las sondas descritas
en la Tabla 3, mediante el sistema de hibridización por puntos de Amersham Biosciences
RPN5770 acoplado al sistema revelador de Amersham Pharmacia Biotech RPN35 lO.
Entre 50 a 100 ng del producto de PCR-anidado (correspondiente a cada sub-grupo de SRB)
fueron colocados (en un volumen de 7.5 ul) sobre una membrana de nylon "Hybond-Nr"
(Amersham Pharrnacia Biosciences RPN2020B). La hibridización fue desarrollada según las
instrucciones del fabricante, optimizando para cada sonda la temperatura de hibridización y la
concentración de sales durante el lavado selectivo de estringencia (ver Tabla 3, columna
"CONCENTRACIÓN SALINA"). La especificidad de cada sonda fue evaluada utilizando
DNA extraído de cultivos de cepas control de SRB tDesutfovibrío desulfuricans,
Desulfovibrío gigas, Desulfovibrío vulgaris, Desulfococcus multivorans y Desulfobulbus
propionicus), y de cepas liofilizadas iDesulfotomaculum nigrificans, Desulfobacter lacto y
Desulfobacterium sp.), gentilmente proporcionadas por el Dr. Richard Devereux (EPA
Pensacola, USA).
55
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA· R. LUNA·BARRÓN
La cuantificación de los sub-grupos de SRB, fue realizada mediante hibridización por puntos.
La proporción de cada sub-grupo de SRB se evaluó con las sondas descritas en la Tabla 3, y se
utilizó como referencia la sonda general para el Dominio Eubacreria EUB338 (5'
GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'; Loy et al., 2002). Aproximadamente 300 ng del producto de
PCR del gen del 16s DNAr de las muestras de sedimentos fueron colocados en la membrana
"Hybond-Nf-", en un volumen final de 2.5 ul, y se desarrollaron las pruebas de hibridización
según! las instrucciones del fabricante, y de acuerdo con los valores. optimizados de
~emperaturn y de concentración de,sales (Tabla-3). Para el análisis cuantitativo digital de las
fotografías obtenidas, se utilizó el software de distribución libre en la intemet "Scionímage
4.0.2" (http://www.scioncorp.com).
5. RESULTADOS
5.1. CARACTERÍSTICAS FISICOQuiMICAS GENERALES DE LAS MUESTRAS
Las muestras obtenidas en los tres puntos muestreados se diferencian en cuanto a localización.
estructura granular y matiz. La muestra sedimentaria del punto central (CEN), mostró una
superficie levemente irregular con fase acuosa enturbiada por la suspensión de partículas del
mismo sedimento. de un color marrón claro y de textura granular lodosa. con zonas puntuales
al azar de color plomizo.
La muestra obtenida bajo la rizósfera (BRl) de las rnacrófitas flotantes, mostró una textura
mucho más lodosa y menos granular, con un color oscuro semejante al encontrado en lodo de
pantano. La fase líquida presente sobre la superficie sedimentaria era bastante clara pero
rápidamente enturbiada' bajo cualquier perturbación del material granu,~ar oscuro encontrado
en el sedimento. El cilindro obtenido se encontraba bajo una densa capa de raíces de casi
metro y medio de largo desde la superficie de la laguna perteneciente a la comunidad de
macrófítas flotantes.
56
PERFIL DE SRB EN -LA GRANJA· R LUNA·BARReN
La muestra obtenida en el bosque inundado (BIN), presentó una textura lodosa granular
semejante al sedimento encontrado en el centro (CEN), de un color marrón claro y un fuerte
aroma fétido. Una capa de hojas secas en putrefacción de más o menos 10 cm de altura. cubría
el sedimento.
El análisis del perfil en profundidad de los tres puntos analizados, muestra diferencias en los
valores .del potencial oxido-reductor. El perfil en profundidad de Eh del punto bajo rizósfera1 ,
(BRl) presenta un valor promedio de -134.48 mV que refleja un ambiente reductor, además de
estar oscurecido por la cobertura rizosférica. Por otro lado, el perfil de Eh en la muestra del
bosque inundado (BIN), da un valor promedio de -133.15 mV que es próximo al encontrado
en SR!. La ausencia de un ambiente oxidativo en la superficie sedimentaria de SIN parecen
estar asociadas al origen edáfico y la cobertura de hojas en descomposición de estos
sedimentos.
El promedio de -18.32 mV del potencial oxido-reductor en el centro de la laguna (CEN)
evidencia un ambiente oxidativo, con un valor máximo de 250 mV en la superficie
sedimentaria y una zona de transición reductora aproximadamente localizada en el primer
centímetro de profundidad, el perfil de CEN muestra un comportamiento gradual de
disminución del valor de Eh con la profundidad de manera semejante al perfil de SRl. En
contraste a CEN y SR!. el perfil de SIN tiende a ser más lineal (Gráficas l., 2 Y3).
En el análisis de pH de-cada punto muestreado, existe una relación más próxima entre los
. valores de SIN y BRl cuyos promedios respectivos son 6.31 y 6.35, mientras que el pH en
CEN, de promedio 6.91 Y más próximo a la neutralidad tiende a incrementar su valor
gradualmente con la profundidad.
5.2. EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DE SEDIMENTOS
De acuerdo a la cuantificación realizada con el marcador de peso molecular "Lambda
Hindlll", a partir de 600 mg de sedimento, se obtuvo un promedio de 118.65 (+/- 24.9\) nz de. -
57
PERFlL DE SRB EN "LA GRANJA" R LUNA·BARReN
DNA del punto CEN mediante el método modificado de Zhou, y 153,52 (+/- 31,13) ng de
DNA del punto BrN mediante el método ajustado de MoBio (Figura 15). Se ha considerado
una eficiencia del 50% de acuerdo con Edgecomb y colaboradores (1999). Las extracciones. .
simultaneas con ambos métodos realizadas con las secciones 2.0 cm, 6.5 cm (BfN) 1.5 cm y
5.5 cm (BRl), no mostraron diferencias significativas en la cantidad final de DNA (datos no
presentados). No obstante, se observó una cantidad mayor de DNA obtenido entre los 4 y 6,5
cm deprofundidad en CEN y entre 1 y 3,5 cm en BIN (Figura 15).
Ambas técnicas permitieron obtener en general un extracto de DNA óptimo para las
posteriores pruebas de PCR, mediante las cuales se obtuvo, en todos los puntos yen todas las
58
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA' R. LUNA-BARRÓN
secciones, el producto de amplificación del gen del 16S R.L\fAr, y del gen de la sulfito
reductasa disirnilatoria (DSR).
Sin embargo. los extractos de DNA del punto BIN, obtenidos mediante el protocolo
modificado de Zhou (1996), no fueron útiles para las pruebas de PCR; en contraste, los
extractos de DNA obtenidos con el kit MoBio del mismo punto permitieron la amplificación
del 16SpNAr en diluciones11100 y 11300 (Figura 15).¡ ..
El DNA obtenido de las muestras del punto CEN, procesadas con el método Zhou (1996).
permitieron desarrollar los ensayos de PCR con un factor de dilución 11300 (Figura 15). En
contraste. los extractos de DNA del punto (BR!) obtenidos mediante el método de Zhou no
permitieron el desarrollo de los ensayos de PCR en diluciones entre l/50 y 111000, debiendo
utilizar ambos métodos de extracción alternativamente (MoSio y Zhou) en distintas secciones
del perfil sedimentario para obtenerel producto esperado de PCR.
5.3. AMPLIFICACIÓN DEL GEN DEL 16s RNAr Y DETECCIÓN DE SUB-GRUPOS DE
SRB MEDIANTE PCR-anidado
Los productos de PCR obtenidos mediante la amplificación del 16S DNAr. presentaron el
peso aproximado esperado de 1500 pb. Los ensayos del PCk-anidado para la detección de los
sub-grupos de SRB a partir del producto amplificado del 16S DNAr, fueron estandarizados
utilizando cepas de SRB control (Achá, 2004), características de cada sub-grupo (Figura-Zl)..,
En las Gráficas 1, 2 Y 3, se presentan los grupos detectados en cada pertil sedimentaría,
acompañados de los valoresde pH y Eh respectivos.
El análisis de la distribución vertical de los sub-grupos SRB en el punto CEN (Gráfica 1)
muestra que DSV y DCC están presentes a lo largo de los 9 primeros centímetros del
sedimento. En contraste, no se observó señal positiva para DBM, mientras que DSB es un sub
grupo minoritario localizado entre 4.5 y 5.0 centímetros de profundidad. Los sub-grupos DFM
59
PERFILCE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA.BARRÓN
y DSS muestran una distribución menos uniforme a lo largo del perfil. El Eh promedio en
CEN muestra un valor de -18.32 mV con un coeficiente de diversidad H = 0.606 (Gráfica 1).
En el punto sedimentario BIN, la distribución de los sub-grupos de SRB es más uniforme. Los
sub-grupos DSV, DCC y OFM están presentes en todas las secciones a lo largo de los 7.5 cm
de profundidad (Gráfica 2). El sub-grupo OBM no ha sido detectado, y OSS se halla
localizado entre los 1.5 y 5.5 cm de profundidad, en un rango más amplio que el detectado en
CEN. El'sub-grupo OSB aparece entre Oy 5 cm de profundidad. El promedio de Eh en BIN.:muestra un valor de -133.15 con un H= 0.689 (Gráfica 2).
La composición de SRB en et" punto sedimentario BR! (Gráfica3) muestra que, al igual que en
CEN y SIN, los sub-grupos OSV y OCC están presentes a lo largo de los 8.5 cm de
profundidad. El sub-grupo DFM está ausente solamente entre los 5.5 y 6.0 cm. mientras que
OBS no ha sido detectado entre 0.0 y 0.5 cm y entre 7.0 y 8.0 cm. El sub-grupo OBM no ha
sido detectado en el perfil. y OSS se localiza entre 4.5 y 5.5 cm de profundidad. El Eh
promedio en SRl es igual a -134.48 mV, y el valorH= 0.639 (Gráfica 3).
Los valores del "coeficiente de diversidad de Shannon" (H), en los tres puntos muestreados. se
hallan en el intervalo relativo de 0.600 < H < 0.700 (Gráficas 1, 2 Y3). El perfil sedimentario
CEN posee la correlación "Eh vs. composición de SRB" más elevada (0.04) y el coeficiente H
más bajo (0.606), en contraste al perfil de SIN que presenta la correlación más baja (-0.1 i) Y
el coeficiente H más alto (0.684) (Gráficas 1, 2 Y3).
60
PERF1LDE SRB EN 'LA GRANJA'
Profundidad pH
(cm I 1 1~
o.o-c.s Z 2500.5-10 Z 1971.0-1.S Z ·2315-2.0 Z ·232.0-2.5 Z ·592.5-3.0 Z ·1430-3.S Z -463.5-4 O Z ·5440-4 S Z ·945-5.0 Z -47So-S.5 Z ·125.5-a.0 Z -56 0-6.S Z 1216.5-70 Z 6970·75 Z .1675-8 O Z .a8.0-8.S Z ·5085·9 O Z -329.0·9.5 Z -'O
9.5-10.0 NE NE NE NE I NE NE NE NE -16100-10.5 NE NE NE HE I NE NE NE NE -4310.5-110 NE NE NE NE NE NE NE NE -3911.0-11 S NE NE NE HE NE NE NE NE ·27115-12.0 NE NE NE NE NE filE NE NE .a712.0-12.5 NE NE NE NE NE NE NE filE -8412.5·13.0 NE NE NE NE NE NE NE NE .134
13.0·13.5 NE NE NE NE I NE I NE NE NE .14413.5·14.0 NE NE NE NE ."lE NE NE filE ·158
I691
H = 0.606 -18.320.04
R. LUNA·BARRÓN
Gr:ífica-l: Pertil vertical de la composición de SRB en sedimentos del puntocentral (CEN) de "La Granja". Lacolumna"ONA" indica el método de extracción de ONAutilizado (Z = Zhou; M =Mobio). OSV, Desulfovibrio
Desulfomicrobium; OSB, Desulfobacter; OBM, Desulfobacterium; OBB. Desulfobulbus: OFM.Desulfotomaculum; OCC, Deslllfococclls-DeslIlJonema-DeslllJosarcina; OSR, sulfito reductasa disimilatoria. El
coeficiente de diversidad de "Shannon"(H) ha sido calculado según el sesgo establecido por OSB. La"Correlación Eh" se obtuvo comparando el perfil ajustado de Ehcon el número total de sub-grupos de SRB en
cada sección.
61
PERFIL DE SRa EN "LA GRANJA" R. LUNA.BARReN
Profundidad(cm)
H = 0.684 I
.,...
Eh
.122
·116 .XlO
·124.120·123·121·117·130·115.104
-172·117.179·1n.139-80·87
·172.164
·1646.31
·133 15-0.17
pH
M
M
M
M
MMM
M
M
M
M
M
M
MNE NENE I NE
MZ
MZ
10-1 5
2.5-3.02.0-2.5
3.0-3.5
1.5-2.0
50·55
35-4.0
ol 5-5.0
0.5-100.0-0.5
7 5·8.0a.0-8.5
70·75
60-655.5-6.0
6.5-7 O
-0.5-0.0
.1.5-1.0
.1.0-0.5
Gráfica-Z: Perfil vertical de la composición de SRB en sedimentos del punto bosque inundado (BIl'<) de "LaGranja". La columna "DNA" indicael método de extracciónde DNA utilizado (Z = Zhou: M = Mobio). DSV,Desulfovibrio-Desutfomicrobtum; DSB. Desulfobacter; DBM.Desulfobacterium; DBB. Desulfobulbus; DFM.
Desulfotomaculum; DCC. Deslllfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina; DSR, sulfito reductasadisimilatoria. Elcoeficiente de diversidad de "Shannon"(H) ha sido calculadosegún el sesgo establecido porQSB 'enCEN. La
'''Correlación Eh" se obtuvo comparando el perfil ajustado de Ehcon el número total de sub-grupos de SRBen. , .. cada sección.
62
PERFIL DE SRB EN OLA GRANJA· R. LUNA·BARRÓN
Eh
25·9
·30-68-89·109·126.128·133·125·126·123·143·171·170·141·172-180·160·153·247 .. -
·156·150.154.154·267-172
0.35·13448
~.1S
pH
==
9.0-9.5 NE
75-8.0 M8.0·6.5 Z65·9.0 NE
5~0 MZ60-6.5 Z6.5-70 M70-7.5 M
95-10.0 NE
50-55 Z45·5 O M40-45 Z35-40 Z
10.0·105 NE
·15-10 NE·1.0-0.5 Z.Q.5-<l.O Z
0.0-0.5 Z0.5-1.0 M1.0-1.5 Z15-2.0 MZ2.0-2.5 Z2.5-3.0 Z3.0-3.5 Z
10.5·1 i.o NE110-11.5 NE
·2.0-15 NE
H = 0.639 [
,: Profundidad CNA 18. OSVOSB OBM OBB OFM occ OSRt-...,..-..:;,;,;...--+--,r-.....;;~----1(cml
Gráfica-S: Perfil vertical de la composición de SRa en sedimentos del puntobajo rizósfera (BR!) de "LaGranja", La columna "DNA'''indica el método de extracción de DNA utilizado (Z = Zhou: M = Mobio). OSV.Desulfovibrio-Desulfomicrobium; osa, Desulfobacter; OBM, Desulfobacterium; OSB, Desulfobulbus; OFM.
Desulfotomaculum; DCC, Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina; DSR.sulfito reductasa disirnilatoria. Elcoeficiente de diversidad de "Shanon" (H) ha sido calculadosegún el sesgo establecido por osa en CEN. La
"Correlación Eh" se obtuvo comparando el perfil ajustado de Eh con el número total de sub-grupos de SRB encana sección (en nrofundidad).
63
PERFIL DE SRB EN·LO. GRANJA· R. LUNA-BARRÓN
"Cle e e e e e elID U1 -n ID n U1 111OJ ID ~ ~ n < ~
.prolL ' ~__• 2645 pb
L9lcpb· - -- - .. ~.....,. __ -1605pb_ .• 1199 pb
Flgura-Iñ: Electroforesis en gel de agarosa 1%del productode PCR del gen de la "sulfito reductasadisimilatoria" (DSR)
con DNAde cepascultivadas de SRB control:DSV=Desulfovibrio vulgaris; DCC=Desulfococcus
multivorans; DBM=Desulfobacterium sp.:DFM=Desulfotomaculum nigrlficans; DSB=Desulfobacter
intum; DBB=Desulfobulbus propionicus.
5.4. DETECCIÓN DE LA SULFITO REDUCTASA OISIMILATORlA (DSR) POR PCR
Las amplificación del gen de la
"sulfito reductasa disimilatoria"
(DSR) con DNA obtenido a partir1
de cepas control, dio como
resultado el producto esperado de
1.9 kpb para los seis géneros
evaluados (Figura 16). El análisis
de este gen mediante PCR, en los
tres puntos muestreados, demostró
su presencia en todas las secciones
en profundidad (Gráficas I. 2 Y 3), confirmando de forma independiente la presencia de
microorganismos sulfato-reductores y del potencial (bi)sulfito reductordel entorno.
5.5. DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRB MEDIANTE
HIBRlDIZACIÓN MOLECULAR
En el ensayo de hibridización por puntos, inicialmente se estandarizaron para cada sonda las
condiciones específicas de temperatura y salinidad descritas en la Tabla-S (Figura 17). Los
resultados del ensayo de PCR para la detección de sub-grupos de SRB, fueron verificados
mediante la hibridización por puntos con los productos del PCR-anidado de cada punto
sedimentario de "La Granja" (CEN, BIN y BRl) Ylas sondas de la Figura 17. Los resultados
confirmaron los datos de distribución de SRB detallados en las Gráficas 1, 2 Y3.
64
PERFIL DE SRB EN"LA GRANJA' R. LUNA·BARRÓN
A) B)
......f -., :-: t;;. .~~~~
o;; DO:
c-:
01lM
r,.t "L-_DBII DFM
C) O)DII~
DIW
;~
~Das Da:
E)
~. - "
.:~~.. -- ..-'. ...
OIUI oa:: 01lM O~ OFM
Figu ra-I i: Hibridización por punto (dot-blot) durante la estandarización de las condiciones para cadasonda utilizada. Cada una de las cinco membranas (A - E) ha sido evaluada con una sonda especifica para
un sub-grupo de SRB: A) OSV687, Desulfovibrio-Desulfomicrobium ( fam, Desulfovibrionaccae) ; B)OSS623, Desulfobacter: e) OSB660, Desulfobulbus; D) OFM228. Desulfotomaculum; E) OCC36S:
Desl//fococcus-Desll/fonema-Desu/fosarcina (Daly et al., 2000).El ONA colocado en cada punto de las membranas, corresponde a los productos del PCR-anidado de las
cepas control: OSB=Desu/fobu/bl/s propionicus; OCC=Desl//fococcus multivorans;OBM=Desl//fobacrerillln sp.: OSS=Desu/fobacrer intum; OSV(d) y OSV(~)=Desu//ovibrio desulfuricans;
OSVv=Desll/fovibrio vulgaris; OSVg=Desu/fovibrio gigas: OFM=Desl/(fotomacll/um nigr ificans .
1 2 3cel< • o cm 1111< - o cm aRI· o cm
A .,~ e • • ~J ;§ ~- -Ó:
SJr . ; '.~.
eUB osv OS8 O!lft DI'M occ eUII osv OSII 000 OI"M oce eUB osv OSB OBa OFM DCC
. .SIN· 3.5 cm eRI· 3..~ cm
B ;} e @ .q • @eUII osv OS8 OB8 O,.". oce osv OSII 01111 o,.... oee eUII osv OSII 0118 O"M oee
ceN .. 7 cm llll<· 7 cm BRlo. 7 cm
e • e • • ~'! • ~
eUB osv O"B 01111 O,.". oee eUB osv OSB OBa OFM oee euB osv 05B OBB OFM oee
Figura-18: Fotografla figital resultante de la hibridización cuantitativa de las secciónes Ocm (fila A), 3.5 cm(fila S) y 7 cm (fila C), en sedimentos del centro (CEN. columna 1). bosque inundado (SIN. columna 2) y
bajo riz ós tera (BRI. columna 3) de laguna "La Granja". Cada punto ha sido digitalmente aislado de lafotografía original de la membrana hibridizada para compensar el efecto natural de fondo (interferencia).
EUB, señal referencia para El/bacteria; OSV, Desll/fovibrio-Deslllfomicrobillll/; OSB, Desulfobacter; DeS,Desulfobulbus; OFM, Desulfotomacutum; OCC, Desu/fococclls-Desu/fonema-Desll/fosarcina.
65
PERFIL DE SRB EN oLA GRANJA- R. LUNA·BARRON
Tabla-s: Porcentaje relativo ajustado aEUB338 de los cinco sub-grupos de SRBdetectados en "La Granja" . EUB, señal
referencia para Eubacteria; OSV.Desulfovibrio-Desulfomicrobium; OSB,
Desulfobacter; OBB, Desulfobulbus; OFM.Desulfotomaculum; OCC. Desulfococcus
Desulfonema-Desulfosarcina. (S =desviación).
(S)
0.001.841.791.811.181.78
100.0015.296.759.203.9512.83
TOTALEUBOSVOSBOBBOFMoee
En la Gráfica 4 se presentan esquemáticamente l?s
valores de la intensidad luminosa resultante del
ensayo de hibridización cuantitativa de los sub
grupos de SRB (Figura 18). Al sobreponer los
valores de cada sub-grupo sobre el valor referencial
de EUB338, es posible apreciar que el perfil
cuantitativo del conjunto de . sub-grupos de SRB
alcanza en promedio el 48.02% del 100%
establecido por la sena! de EUB (Tabla 4). El perfil
cuantitativo de cada sub-grupo de SRB es..
característico en cada punto (CEN, BIN o BRl). El
perfil del punto CEN muestra que la mayor cantidad de señal luminosa para EUB se halla a los
3.5 cm de profundidad, al igual que los valores correspondientes a la surnatoria total de las
SRB analizadas y EUB. El factor de correlación entre la proporción de EUB y la de los sub
grupos de SRB, da un valor en CEN de r = 0.639. En el punto BIN, tanto la señal de EUB
como el valor aditivo de las
Gr áfica-u: Intensidad luminosa (a escala relativa por rastreo de pixeles)producida por cada una de las sondas en cada sección (O. 3.5 Y7 cm) y
perfil (CEN, BIN y BRl) estudiados. EUB. señal referencia paraEl/bacteria; OSV, Desulfov íbrío-Desulfomicrobium; OSB,
Desulfobacter; OBS, Desulfobulbus; OFM, Desulfotomaculum; OCC.DesI ilfo COCC liS - DesulfoneIna-Desulfosarcina
correlación muestra un
0.771. Estos valores de
de
permiten
factorelpero
valor r = 0.009. En
señales de SRB y EUB son
los más altos a los 3.5 cm,
contraste, en el punto SRl
el valor más alto de las
con una correlación r =
correlación
señales luminosas, tanto
para EUB como para EUB
+ SRB, ocurre a los 7.0 cm
comparar la estructura
IO EUB I.osv i
:O OSB I
'I
O OBBI
I·OF~ IliJOCC
PtDII pIoC1_II-..1wl
I ca ::00 :lOO 400 lOO lIOQ /00 IIOQ oca¡ ,
Oon I 1#3 II : !z
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66
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA-aARRON
Gráfica-S: Intensidad luminosa porcentual por cada una de las sondasajustada a EUB 100% en cada sección (O. 3.5 Y7 cm) y perfil (CEN,SIN y SRI) estudiados. EU8, señal referencia para Eubacteria; OSV,
Desutfovibrio-Desntfomicroblum; OS8, Desulfobacter; 088,Desulfobulbus; OFM. Desulfotomaculum; OCC, Desulfococcus
Desulfonema-Desulfosarcina
I :.w+ 1J~'¡' ;l ,J:f '. . o ' . ,~ ,)I
I I I I !
I ,.U " I~"H
i I I I II
I . ,;;&l.l1
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r I I I,_ 1 1. r . . .
o ....l , I I_ 1
I I I I I- I ... .. . .¡ I I .. I I
I
I,I I I ,
I ,
I i! . ;::L{~1
obtiene la Gráfica 5 que
Al ajustar los valores de
intensidad luminosa.
detectados para cada sub-
grupo de SRB, a su
correspondiente valor de
EUB338 (como 100%), se
la
cuantitativa
compararpermite
distribución
cuantitativa vertical de las
SRB detectadas, en relación
a la proporci ón de la
comunidad de eubacterias
representada por la señal de
la sonda EUB338..DSVODSBODBB.DFM.DCCElEUB
100 00
,r
aooo
¡rI
0000-«:1.0020,00000
Ocm
zw 3.5U
7
Ocm
z 3.5ii3 •
7'.Ocm
intrínseca de [as SRB en
relación a Bacteria. La
información cuantitativa
Cráfica-ó: Abundancia relativa porcentual de SRB en profundidad ensedimentos de " La Granja" (Eubacteria = 100%); DSV, DesulfovibrioDesulfomicrobium; DSB. Desulfobacter; DSS. Desulfobulbus; OFiV1,
Desulfotomacuhun; OCC, Desulfococcus-DesulfonemaDesulfosarcina.
20.00 1
is.co j_ 115.00 1a14.00 1~ 12.00 1
..~ 10.00I] s.ootU 6.00 ]
4.00 I
2.00 i0.00 +-. ....L......';':;:'
OSV OS8 088
00,5 cm
rnl3.5cm• 7cm
OFM OCC
obtenida a partir de los datos
de las Gráficas .¡. y 5.
permitió elaborar dos tipos de
análisis .. comparando los tres
perfiles muestreados en "La
Granja": uno enfocado al
perfil horizontal, que evalúa
la estructura de los cinco sub-
grupos de SRB estudiados él
una misma profundidad
(Gráfica 6) en los tres puntos
67
PERFIL DE 3RB EN "LAGRANJA" R. LUNA-BARRÓN
sedimentarios (CEN. SeN y25.00 1
IJCEN BRl); y otro enfocado al perfil20.00 _SIN
;¡ _SRI vertical sedimentario, que.a] 15.00
evalúa la estructura~ 10.00
cuantitativa de los sub-gruposIU
5.00entre puntos sedimentarios
0.00 (Gráfica 7).1
oSV OS8 088 oFM OCC"
El análisis del perfil horizontal
de la distribución cuantitativa
Cráflca-": Abundancia relativa porcentual de SRB en profundidad ensedimentos de "La Granja" (Eubacteria = 100%); OSV,
Desulfovibrio-Desulfomicrobium; OS8, Desulfobacter: 088,Desulfobulbus: OFM. Desulfotomaculum: OCC. Desulfococcus
Desulfonema-Desulfosarcina. de sub-grupos de SRB. muestra
que, en general. la abundancia
relativa es porcentualmente menor cerca de la superficie sedimentaria (O cm), más elevada a
3.5 cm de profundidad y mayor a los 7 cm. El análisis entre puntos muestra que existe menor
abundancia de sub-grupos de SRB en BIN. En contraste. los sub-grupos OSV, OBE y OCC no
poseen diferencias significativas de abundancia entre los puntos CEN y BRl, mientras que
OSB es significativamente más abundante en CEN (Gráfica 7).
El análisis conjunto de la distribución
cuantitativa de SRB en los perfiles
horizontal y vertical de los tres puntos
sedimentarios estudiados, muestra la
variabilidad de la abundancia para los
cinco sub-grupos de SRB en "La
Granja" (Gráfica 8). Ésta es mayor
para DSV, DSB, DFM y DCC entre
los distintos microambientes (CEN,
BIN y BRl), mientras que en el caso
del sub-grupo DBB no se observan
diferencias significativas.
251Xllem. oVertíca
l;noo 11 H:::riza1tai"O
~1~00":...,.!!oc 10.00
"~ 5.00UJ
0.00
EU3 r:sv osa cm a:M cee
Gráfica-S: Variabilidad de la abundancia relativa de SR8 en"La Granja", representada por las amplitud de las líneas de
dispersión sobre cada barra. EU8, señal referencia paraEubacteria (no a escala); OSV, Desulfovibrio
Desulfomicrobium; OS8, Desulfobacter; 088, Desulfobulbus;OFM, Desulfotomaculum; OCC, Desulfococcus-Desulfonema
Desulfosarcina.
68
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA"
6. DISCUSION
R. LUNA·BARRÓN
Es importante considerar que existen diferencias en la estructura del micro ambiente en cada
uno de los tres perfiles de sedimento muestreados. Por ejemplo, el sedimento de CEN
corresponde a una zona libre de comunidades vegetales, afectada principalmente por cambios
producidos a causa del movimiento interno de las masas de agua, influenciadas por el viento y
los ciclos pluviales, que normalmente pueden remover las capas superiores del sedimento
arenoso. enturbiando el medio líquido. Por lo tanto, la disponibilidad de substratos orgánicos e"
inorgánicos y la estructura de las comunidades sedimentarias se verán afectadas por estos
cambios.
En contraste, en BRI, los sedimentos están ubicados bajo frondosas matas de rnacrófitas
flotantes de al menos dos géneros distintos (Eichornia y Polygonum: Achá, 2004). cuya
propagación rizosférica permite mantener de forma más estable los sedimentos, no
observándose turbidez ni perturbación. Por otro lado. esta rizósfera produce cambios en la
composición fisicoquímica del medio líquido sobre la superficie del sedimento, ya que los
productos de la exudación radicular. la descomposición de materia orgánica asociada. y el
desarrollo de comunidades microbianas o protozoarias adheridas y no adheridas. influyen
sobre las condiciones bioquímicas que finalmente alcanzarán los sedimentos. y que
eventualmente podrían generar mayor variedad y cantidad de substratos disponibles para las
SRB.
En el perfil del punto BIN, el de más reciente formación debido a las inundaciones periódicas
de la región, el Eh es más reductor que en CEN, con un valor promedio de -133.15 mV que es
semejante al del punto BRI de -134.48 mV. A diferencia de BIN, BRI es el sedimento que
menos modificaciones o perturbaciones ha sufrido a causa de su localización y características
circundantes.
Tanto en HIN como en BRI, el pH (6.31 Y 6.35 respectivamente; Gráficas 2 y 3) es
ligeramente más ácido respecto a CEN (6.~1; Gráfica 1). La curva de pH en BIN tiende a
69
PERFIL DE SRB EN "LAGRANJA" R. LUNA.BARReN
decrecer desde Ocm hasta 3 cm y luego alcanzar un valor promedio y permanente a los 4 cm
de profundidad, similar al decremento en BRl desde O a 1 cm, alcanzando luego cierta
estabilidad entre 2 y 8 cm. En contraste, el perfil de CEN es antagónico a los dos anteriores ya
que tiende a incrementarse alcanzando el equilibrio aparente a los 2.5 cm.
Por ejemplo, el Eh detectado a los Ocm de profundidad en BRl (-89 mV) en contraste al de
CEN (250 mV), puede reflejar condiciones más reductoras, asociadas a la ausencia de luz yl' .
ausencia de remoción de sedimentos. Por una parte, esto podría generar algún efecto en el
micro ambiente y las comunidades de SRB especialmente próximas a la oxiclina. Sin
embargo. se observa que la composición química de cada sección por debajo de la oxiclina
parece ser el factor más influyente en la estructura de las comunidades de SRB. ya que la zona
de transición de un ambiente oxidante a uno reductor ocurre entre los 0.5 y 1 cm en CEN. Así.
es posible observar secciones donde el Eh es reductor y donde se encuentra la presencia
diferencial de algunos sub-grupos de SRB (Gráfica 1).
Los puntos sedimentarios CEN y BRl se encontraban aproximadamente a 2 m de profundidad.
mientras que el punto BIN se encontraba a 30 centímetros de profundidad. Sobre BIN se
depositaba una capa de aproximadamente 10 cm de hojas secas en descomposición.
procedentes de los árboles del bosque localizado en el albardón de la laguna. Los procesos
degradativos naturales de estas hojas. probablemente influyen en las condiciones
fisicoquimicas que afectan el comportamiento de la oxiclina, y las condiciones
oxidoreductoras, En contraste a CEN y BRl. el Eh en BIN a Ocm de profundidad fue de -120
mV, el más reductor de los tres, lo que es curioso considerando la profundidad del sedimento.
pero concordante con la deposición y descomposición de materia orgánica en la superficie
sedimentaria aun a 30 cm de la superficie lacustre.
Si bien el nivel de Eh ideal para las SRB es inferior a -200 mV, la variación de este factor
fisicoquímico en los tres puntos (CEN, BIN y BRl), en general no parece ser muy influyente
para la colonización de los sub-grupos de SRB investigados. Por otro lado. el pH encontrado
70
PERFILOE SR8 EN ·LA GRANJA" R. LUNA·BARRÓN
en todos los niveles está cerca del valor medio ideal para las SRB (4 a 8; Compeau y Bartha,
1984, 1985; Steffan et al., 1988).
6.1. EXTRACCIÓN DE DNA A PARTIR DESEDIMENTOS
El método modificado de Zhou et al. (1996), se basa en un mecanismo de lisis enzimática en
presencia de un detergente (Proteinaza K + SOS) que produce la debilitación gradual de la
integridad de la membrana celular, atacando principalmente las proteínas estructurales de
membrana. La lisis final ocurre por acción del detergente SOS (65 "C) sobre la composición
estructural de la bicapa lipidica. Una vez liberado, el ONA se halla en una suspensión
balanceada de múltiple composición orgánica, que incluye contaminantes (ej. sustancias
húmicas), propias del micro ambiente que rodea de forma natural a los microorganismos.
La eliminación de un elevado porcentaje de compuestos contaminantes no iónicos se logra
mediante el uso de una mezcla cloroformo-isoamilalcohol. Posteriores lavados con
isopropanol y etanol, permiten eliminar moléculas anfipáticas y algunos residuos moleculares
orgánicos, según la afinidad soluta-solvente. Sin embargo. los extractos finales obtenidos de
los sedimentos. disueltos en agua bidestilada. presentan por lo general un color amarillento a
marrón translúcido, que es dependiente de la composición y propiedades tisicoqu,ímicas del
sedimento.. En este caso, las muestras SR! y SIN mostraron la coloración amarillo-marrón
más acentuada, la cual es en gran parte debida a contaminantes orgánicos de bajo peso
~olecular y en descomposición, propios del sedimento.
La purificación de ONA, obtenido a partir de muestras de suelo o sedimento, representa por lo
general un reto individual en cada tipo de ambiente a estudiar. Los lavados utilizados por el
método de Zhou et al. (1996) no representan un real mecanismo de purificación. Esto lo
demuestran diversos trabajos que han adaptado varios métodos de purificación a este y otros
protocolos de extracción (Leff et al., 1995; Volossiouk et al., 1995; Jackson et al., 1997;
71
PERFIL DE SRB EN "LAGRANJA" R. LUNA-BARRÓN
Kuskc et al., 1998; Prescott, 1999; Miller et al., 1999; Griffiths et al., 2000); por lo general.
estos métodos de purificación se han basado en colwnnas de geles de Sepharosa ®, de
Sephadex ® u otros.
Al no obtener resultados positivos con la muestra BIN. se utilizó el kit comercial MoBio. En
contraste al método enzimáticode Zhou, el sistema de lisis de este kit se basa en la disrupción
mecánica por impacto de esferas de sílice sobre las células bacterianas. y un posterior.' .tratamiento con el detergente SOS. El sistema incluye un paso de purificación basado en
columnas filtradoras de fibra sintética, que a diferencia de los geles de Sephadexw o
semejantes. en los que las sustancias contaminantesquedan atrapadas por la matriz, es el DNA
el que queda inicialmente atrapado en la membrana cargada eléctricamente, y las sustancias
contaminantes fluyen arrastradas por un eluente nd polar. Un lavado final con agua o una
solución de Tris-EDTA (pH 8.0) liberael ONA de la matriz.
La utilización selectiva de ambos métodos de extracción de DNA de sedimentos (Zhou
modificado yel kit MoBio), indica que la calidad del DNA extraído de los puntos CEN y BrN.
ret1ejan indirectamente el efecto de las condiciones fisicoquímicas propias de los sedimentos
del bosque inundado (BIN), que probablemente posea elevados niveles de sustancias húmicas
y otros contaminantes orgánicos. Es importante mencionar que, a diferencia de CEN y BRI.
los sedimentos de BIN son estacionalmente inundados, y la estructura de las comunidades
naturales presentes están sujetas a bruscos cambios inducidos por el cambio de un ambiente
edáfico a uno sedimentario.. Las múltiples condiciones fisicoquímicas generadas en'un entorno
sujeto a tales condiciones, pueden hacer más dificultoso obtener DNA suficientemente puro
para ensayos de PCR.
Por otro lado, el factor de diluciónde DNA utilizado para obtener resultados positivos durante
[os ensayos de PCR con el DNA extraído de los sedimentos. es un indicador de la calidad del
extracto. En el caso del punto CEN (Zhou), este factor fue en todos las secciones igual a
11300, mientras que los extractos del punto BIN con el método de Zhou no fueron útiles a las
diluciones testadas (1150 a 111000). En contraste, los extractos de DNA del punto BIN
72
PERFIL DE SRB EN'lA GRANJA' R. LUNA·8ARRÓN
obtenidos con el kit MoBio, han permitido ensayos de PCR en dilución de 111 00 en 8 de las 14
secciones del perfil, yen las restantes en dilución de 11300. La necesidad de utilizar una o otra
dilución en estas secciones, no tiene relación alguna con la cantidad de DNA obtenido (Figura
15), por lo que el factor que determina la elección de la dilución óptima, está asociado a la
naturaleza química del entorno sedimentario antes que a la cantidad deDNA obtenido.
6.2. DETECCIÓN DE SUR·GRUPOS DE SRB EN EL PERFIL SEDIMENTARlO,
El gen de las sub-unidades A y B de la sulfito reductasa disimilatoria (DSR), fue detectado en
los tres puntos muestreados, yen todas las secciones analizadas (Gráficas 1,2 Y3); estos datos
confirman la presencia de potenciales microorganismos sulfato-reductores asociados a los
sedimentos, y a la vez permite tener una idea sobre la actividad inherente a esta proteína en los
sedimentos estudiados, es decir la producción microbiana de sulfuros por la actividad
metabólica sulfato-reductora de las comunidades presentes en las muestras analizadas (CEN,
BIN YBRl).
Por otro lado, el índice de diversidad relativa de Shanon (H), calculado a partir de los datos del
PCR-anidado de los sub-grupos de SRB en "La Granja" y la ecuación (15) (Gráficas 1,2 Y3;
CEN = 0.606; BlN = 0.684; BRl = 0.639), muestra una variación de 3.9%. lo que sugiere
cierta uniformidad en la composición de SRB. Es así que cinco de los seis sub-grupos de SRB
fueron detectados en todos los puntos. pero no en todas las secciones verticales. El sub-grupo
DBM del género Desulfobacterium no fue detectado en ninguna muestra -analizada. Al
respecto, es importante resaltar que Desulfobacterium sp. es un género con requerimientos
salinos muy elevados, y que se ha encontrado principalmente en ambientes marinos y rara vez
en sistemas continentales. Estos datos, dado el nivel de sensibilidad del PCR-anidado,
refuerzan lo observado en otros estudios (Balows et al., 1994).
Si se consideran los valores del coeficiente H, que expresa uniformidad relativa de los sub
grupos de SRB, es posible suponer que la sensibilidad y eficiencia del PCR-anidado. han
permitido caracterizar un número mínimo representativo de las comunidades de SRB. Sin
73
PERFILDE SR.B EN "LA GRANJA" R. LUNA·BARRÓN
embargo, si bien en algunas secciones de los perfiles no se han detectado algunos de los sub
grupos, esto no significaría necesariamente que no estén presentes; sería posible suponer que
la cantidad de los mismos estaría por debajo del nivel detectable del ensayo de PCR-anidado.
Respecto a la estructura vertical detectada de las SRB, la variación en la distribución de cada
sub-grupo de SRB en profundidad ha sido observada en otros estudios (Devereux et al., 1996~... '
Sass <ir al., 1997~ Ravenshclag et al., 2000). La estructuración vertical variable de las
comunidades en matas, sedimentos, suelos, rnicrocapas y lodos activados, es dependiente de'.las interacciones sintróficas y no sintróficas entre distintos grupos microbianos, definidas en
relación a sus requerimiento de luz, oxígeno, carbono, energía, etc. (Varnam y Evans, 2000).
En sistemas lacustres de poca profundidad, es factible esperar que la mayor parte de estas
interacciones ocurra en las "capas microbianas" superiores.
No existen reportes hasta hoy de un comportamiento gradual o progresivo del desarrollo de
comunidades de SRB en perfiles verticales naturales, ni siquiera en condiciones controladas de
laboratorio (Fortin et al., 2000; King et al., 2002). La distribución de SRB dependiente de la
profundidad se ha visto en perfiles de hasta 200 micrómetros de espesor (Schrarnrn et al.,
1999). Las SRa pueden encontrarse a varias profundidades según el ambiente (Fortin et al.,
2000; Lehmann et al., 2001), en sedimentos lacustres es común encontrar a la mayor parte de
las comunidades microbianas de SRB en los primeros lOa 20 centímetros de profundidad
(Sass et al., 1997), especialmente porque los productos de la oxidación de comunidades
aerobias, son los substratos que abastecen a las comunidades anaerobias, ya que porque los
productos del metabolismo fotosintético son substratos de los sistemas aerobios heterótrofos y
anaerobios en general (Minz et al., 1999a).
Considerando que las SRB se desarrollan óptimamente entre los -200 a -250 mV y un pH de
4 a 8, es importante analizar su distribución en los puntos sedimentarios muestreados, que
presentan diferencias en el perfil de Eh. El Eh promedio en CEN fue de -18,32 mV, y es en
este punto donde más variabilidad en la distribución de SRB se ha detectado (Gráfica 1),
mientras que en SIN (-133.15 mV), y SRI d~ (-134.48 mV), existe mayor semejanza.
74
PERFIL DE SRB EN -LA GRANJA' R. LUNA·BARRON
6.3. D[STRIBUCIÓN DE SUB-GRUPOS DE SRB EN LOS PUNTOS :Y1UESTREADOS
La mayoría de [as diferencias en la distribución vertical de sub-grupos, se encontraron en el
perfil del centro (CEN) de laguna "La Granja". Es muy probable que el elevado potencial
rédox detectado en CEN, influya en la proporción de [as SRB presentes a lo largo del perfil,
disminuyendo la misma. de tal forma que es posible apreciar la distribución vertical de los
cinco sub-grupos mediante PCR. Esto concuerda con los datos encontrados en BIN y BRl. en
los que se observa una distribución más uniformes, lo que indicaría un incremento
proporcional de cada sub-grupo asociado a un potencial oxido-reductor siete veces mis
reductor que en CEN.
Si bien se han visto diferencias en la composición vertical de los cinco sub-grupos estudiados
en los sedimentos de "La Granja", estas diferencias corresponden específicamente a la
distribución vertical de los sub-grupos Desulfobacter (OSB), Desulfobulbus (DBBl v
Desulfotornaculurn (OFM). En contraste, los grupos Desulfovibrio-Desulfornicrobium (OSV),
y Oesulfococcus-Oesulfonema-Desulfosarcina (DCC), han mostrado una comportamiento más
uniforme J lo largo de todos los perfiles (Gráficas 1. 2 Y3). Los datos cuantitativos obtenidos
mediante hibridización confirman las observaciones sobre la predominancia de DSV y DCC
en los sedimentos de laguna "La Granja".
Es importante considerar que los cebadores utilizados para detectar el sub-grupo OSV, poseen
un amplio rango que abarca el orden Desulfovibrionales de SRB, lo cual puede asociarse a la
predominancia observada de este sub-grupo en los perfiles sedimentarios (CEN, BIN y BRl;
Gráficas 1, 2 y 3). Hecho que es semejante en el caso de los cebadores para el sub-grupo OCC,
que pueden detectar cuatro géneros conocidos de SRB además de los propios del sub-grupo.
En contraste, los cebadores para los sub-grupos OBB. OFM Y OSB son mucho más
específicos para sus géneros correspondientes (Desulfobulbus, Desulfotomaculum y
Desulfobacter; Loy et al., 2002). Por [o que hasta disponer de información taxonómica más
75
PERFIL DE SRB EN 'LA GRP-.NJA" R LUNA·BARRON
detallada de las comunidades de SRB en los sistemas acuáticos de la amazonia boliviana. será
muy útil considerar los datos obtenidos en "La Granja". como preliminares.
En relación a su metabolismo, los grupos DSV (Desulfovibrio-Desulfomicrobiurn), DFM
(Desulfotomaculum) y DBB (Desulfobulbus), comparten la característica metabólica de no
oxidaracetato. y por lo tanto de utilizar lactato en mayor proporción. El sub-grupo DSV es el
más .ampliamente distribuido y aparentemente el mejor adaptado a diversas condiciones
fisicoquímicas. Desde las primeras investigaciones en sedimentos (Devereux ct al.. 1996)
hasta recientes cuantificaciones detalladas (King et al., 2002). la familia Desulfovibrionaceae
ha sido el grupo encontrado en mayor proporción. sin importar el origen o profundidad de la
muestra. En cuanto a los otros sub-grupos (Desulfobactcr, DSB y Desulfococcus
Desulfonerna-Desulfosarcina. DCC), a diferencia de DSV. DFM y DBB poseen la
característica de oxidar un amplio rango de substratos de forma completa. es decir hasta CO~.
Dentro del sub-grupo DCC, el género Dcsulfonerna parece tener cierta afinidad por ambientes
salinos. de manera semejante a DSB y DBM. por lo que existen razones para creer que la
distribución de DCC en ambientes continentales está más relacionada a los géneros
Desulfococcus y Dcsulfosarcina. Por otra parte. DFM es el único sub-grupo gram-t-) con
capacidad de formar esporas.
Siendo Ia reducción de sulfato un proceso que requiere ausencia de oxígeno. es de suponer que
la concentración del mismo afectará la composición de los sub-cruces de SRS. En~. .
sedimentos, la quimioclína normalmente se ha detectado hasta los 2 primeros Centímetros de
profundidad, donde la concentración de oxígeno decae hasta casi extinguirse (Sass et al.,
1997). Sass y colaboradores (I997) encontraron a DSV en sedimentos de un lago oligotrófico
en dos picos cuantitativos importantes: en la oxiclina (O a I cm) y en la región anóxica (2 a ..¡.
cm). La habilidad de DSV para soportar niveles elevados de oxígeno ha sido previamente
documentada (Dos Santos et al., 2000).
No existen reportes sobre la tolerancia de DFM a condiciones óxicas, por lo cual DSV tendría
ventaja sobre este sub-grupo. Tomando e.n cuenta que DSV se ha detectado en todos los
76
PERFIL DE SRB EN 'lA GRANJA" R. LUN,A·aARRÓN
niveles. es posible suponer que en las secciones del punto CEN donde OFM está por debajo
del nivel de detección (3.5 a 5.5 cm; Gráfica 1), podría ocurrir un desarrollo más acentuado de
OSV, el que competiría por los substratos con Desulfotornaculum (OFM) y Desulfobulbus
(OS8). Pese a que Oesulfobulbus es un grupo adaptable a condiciones consideradas adversas
para el desarrollo de SRB (Ita et al., 2002b). ya que incluso puede reducir nitratos y oxígeno
en ausencia de sulfatos. los resultados muestran que OSS en el punto CEN estaría superado
por la familia Desulfovibrionaceae(OSV).I
En niveles de profundidad donde O·SV probablemente presentaría un desarrollo más acentuado
(Devereux et al., 1996), en este caso entre 3.5 a 5.5 cm en el punto CEN. este podría disminuir
la cantidad de sulfato disponible para otros sub-grupos de SRB. Sin embargo. es importante
notar que el sub-grupo OSS podría competir eventualmente con bacterias. por ejemplo del
nitrógeno (por nitratos). lo cual explicaría el incremento aparente del número de OS8 en las
secciones a entre 4.0 y 5.0 cm de profundidad (Gráfica 1). aspecto que seria similar para el
sub-grupo OCc. que puede utilizar varios receptores no derivados de sulfato. por Jo que no se
vería muy afectado por la actividad de un número mayor de especies de OSV (Drzyzga et al.,
1996).
En cuanto a OFM. Sass y colaboradores (1997). encontraron que la distribución de OF~f es
específica con la profundidad. En la oxiclina detectaron mayor proporción de esporas (50%)
de OFM. a Ocm OFM era casi inexistente. mientras que en la región anóxica se encontró la
mayor parte del sub-grupo. En el punto CEN, la distribución de. OFM-estariaafcctada por la.
actividad de otros sub-grupos de SRB (OSV y DBB). Ypor el estado natural dorrnante de sus
células. Es decir que. dado el nivel de sensibilidad. el PCR probablemente haya podido
detectar. en los niveles superiores del perfil. endosporas de OFM. Suponiendo que a medida
que desciende el perfil las condiciones se hacen más favorables para el desarrollo de OFM.
podría esperarse un decaimiento en el número de endosporas, y a la vez un enriquecimiento
gradual del número de células bacterianas (Gráfica 1). Una alternativa a la hipótesis de las
. endosporas, es que probablemente en las secciones superiores del perfil CEN (0.5 a 3.5 cm)
77
PERFIL DE SRB EN -Lr.. GRANJA" R. LUNA-aARRON
podrían haberse detectado especies de DFM con estrategias metabólicas aun no establecidas.
supuesto que es válido para todos los grupos detectables en sedimentos amazónicos.
En contraste a lo observado en CEN, la distribución de DSS en el punto SIN muestra cierta
inclinación por las secciones superiores entre los Oy 5.0 cm. La localización de este sub-grupo
en la región superior del perfil podría estar asociada. por un lado. a la fuerte relación sintrófíca
que existe entre las SRB (no OSS) y arqueas rnetanógenas (Ficker et al.. 1999). que
probablemente representan otro componente mayoritario de la comunidad microbiana propia
del sedimento SeN de transición edáfica: y por otro, a la capacidad de DSB para utilizar una
gran variedad de sustratos durante su metabolismo.
Ya que la composición biogeoquímica de las secciones superiores en el punto SIN puede ser
afectada por la descomposición de hojas y por el desarrollo considerable de hongos (Gulis y
Suberkropp. 2003). cuyos rnetabolitos actúan como sustratos para las comunidades
microbianas. coadyuvando a mantener un ambiente reductor distinto al existente en SR! o en
CE:--J. es posible suponer que puede generarse un entorno más adecuado para el desarrollo de
arqueas rnetanógenas asociadas sintróficamente a muchas SRB (no DSS). especialmente dd
sub-grupo DFM. A causa de esto. el desarrollo de DSS podría ser independiente. pero
indirectamente estimulado. tanto por la actividad de comunidades rnetanogénicas como por
otros sub-grupos de SRB asociados sintróficamente a estas últimas. ya que D8B dispone de
los rnetabolitos de origen fúngico de la superficie. y de la capacidad para met~bolizar1os.
Además. es importante resaltar que DSS prefiere propionato como substrato. el cual es
oxidado hasta lactato que eventualmente puede ser utilizado por la familia
Desulfovibrionaceae (OSV), por los géneros Desulfotornaculum (OF\.-1) y Desulfobacter
(OSB). y por el sub-grupo Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina (DCC). es decir los
restantes cuatro sub-grupos de SRB.
Si bien en CEN y SRl, DSS parece no ser el sub-grupo más influyente. en BIN muestra un
comportamiento peculiar al tender a ubicarse próximo a la superficie sedimentaria: esto es
concordante con el criterio de que a medi.da que el perfil desciende. en el caso de SIN, los
78
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA' R. LUNA·BARRaN
metabolitos pueden disminuir en concentración (Minz et al., 1999). Sin embargo. es necesario
indagar detalladamente sobre las habilidades metabólicas de DBB, y conocer mejor las
condiciones del entorno para poder comprender este comportamiento, lo que a su vez es un
principio válido para los tres micro hábitats estudiados.
Puesto que, aparentemente DBB no posee relación sintrófica con metanógenas (Harmsen et
al., 199'6) y que las demás SRB si están relacionadas a las mismas. especialmente en
ambientes más cálidos (sup, 30°C; Nakagawa et al., 2002); y además. siendo laguna "La'. ~ .
Granja" un ambiente mesofílico, es factible esperar que la distribuciór:, de DBB sea limitada.. .
porque la ausencia de comunidades de metanógenas, y de condiciones reductoras como las del
punto BIN. disminuyen las probabilidades para el desarrollo de sulfato-reductoras (ej. DFM),
y. directa o indirectamente. el de sub-grupos como DBB. Es interesante notar que esta
hipótesis podría explicar también la aparente localización de esporas de DF\! en las secciones
superiores del punto CEN. donde las condiciones fisicoquimicas son mucho más oxidantes por
Jo que es probable que no existan comunidades significativas de rnetanógenas.
En relación a la salinidad. si bien DBM es un sub-grupo con preferencia por ambientes salinos
que no se ha encontrado en esta investigación. DSB es otro sub-grupo con preferencia por
elevados niveles de sales que ha sido detectado en sedimentos continentales (Edgcornb et al.,
1999). En el punto CEN, DSB se ha encontrado localizado a una profundidad de 4.5 a 5.0 cm.
en coincidencia con el probable pico de desarrollo de DSV discutido previamente., que podría
afectar el desarrollo de 'DFM y no así el de DBB. y en este caso tampoco el 'de aSB. En el
punto CEN. DSB parece estar muy restringido a la región (4,5 a 5 cm) que de acuerdo con la
evidencia de otros trabajos (Sass et al., 1997), es la profundidad a la cual la mayoría de las
SRB encuentran mejores condiciones de desarrollo. En contraste a los perfiles de CEN y BRl,
en el punto sedimentario BIN el sub-grupo DSB se presenta en un intervalo de 4 centímetros a
partir de 1.5 cm de profundidad. lo cual sugiere que las condiciones selectivas para su
desarrollo favorecen la proliferación de DSB en estos sedimentos de reciente formación. En
BRI, el sub-grupo DSB aparece únicamente en una fracción del perfil (4.5 a 5.5 cm), lo que
79
sugiere la existencia de las condiciones fisicoquímicas específicas para su desarrollo. Sin
embargo. el punto BIN parece poseer las condiciones más adecuadas para OSB.
Una investigación llevada a cabo en sedimentos salinos de residuos de minería. encontró que
OSB formaba parte de las comunidades bacterianas en más del 30% en relación a DSV
(Macalady et al., 2000), mientras que en lodos artificiales de bioremediación. se encontró un
desarrollo muy variable de OSB, con una presencia acentuada a los 2 cm'y en muy bajas
cantidades a los 10 cm, donde DSV. DBB y DCC dominaban el entorno (King et al., 2002).
Por otro lado. Minz y colaboradores (1999), en sedimentos marinos encontraron una mayor
distribución de Desulfonerna (relacionado a OCC) y una menor de DCC y OSB. En
sedimentos marinos parece predominar el grupo DCC, mientras que en continentales OSV.
Considerando que los sub-grupos DBB. DSB y DFM son aparentemente minoritarios en las
comunidades estudiadas de SRB, en CEN. a los O cm, éstos podrían existir en muy bajos
números. o incluso no estar presentes. lo cual puede asociarse al elevado potencial rédox que
alcanza los 250 mV, y es extremadamente oxidante. En contraste. en BRl y BIN. a la misma
profundidad. la distribución es mucho más uniforme para los 5 sub-grupos de SRB.
Considerando los valores reductores de -89 mV y -120 mV respectivamente para estos puntos
sedimentarios. es posible suponer que DFM. DBB YDSB son más susceptibles a cambios en
el Eh que DSV y DCC (Gráfica 2).
La disminución de DBB a partir de los 5 cm en BIN y a los 8 cm en CEN. y a 7 cm en BRl.
podría estar relacionada a la reducida disponibilidad de substratos, tanto para la oxidación
como para la reducción. y a la actividad de DSV y DCC que competirían con DBB. Es
importante recordar que DSV, DFM y OBB no oxidan acetato, lo que podría representar una
ventaja para OCC y OSB. King y colaboradores (2002), encontraron picos de desarrollo para
DSV y OCC a los 10 cm de profundidad, mientras que OBB, en cantidad inferior, aparecía a
SO
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R LUNA·8ARRON
los 8 cm en tanques artificiales con macrófitas flotantes de Spartina sp.. En este caso, los
perfiles parecen estar más influenciados por condiciones fisicoquirnicas de los sedimentos, y
no tanto por la presencia vegetal como en los sedimentos del perfil BRI.
Es importante considerar que los sedimentos en BIN están sujetos a cambios en épocas de
inundación, durante las estaciones cálidas entre los meses de diciembre y abril (época de
lluvias). Las muestras fueron colectadas en el mes de marzo de 2002. Por lo tanto la formación
.y estructura de las comunidades microbianas, podrían experimentar una transición entre
comunidades de bosque y suelo húmedo, a comunidades mayormente acuáticas y anaerobias
aerotolerantes como es el caso de los sub-grupos de SRB. Si bien en BIN los 5 sub-grupos
están presentes de manera uniforme a lo largo del perfil, el análisis cuantitativo realizado
mediante hibridización muestra que en éste punto'está presente el menor número de SRB.
De manera general, y de acuerdo con el análisis cuantitativo a discutir más adelante. la
información obtenida mediante PCR permite suponer que en ambientes más reductores y
asociados a descomposición orgánica, como los sedimentos de BIN, la composición de las
SRB investigadas muestra mayor uniformidad a lo largo de los 8 primeros centímetros de
profundidad, lo cual aparentemente está asociado a la reciente formación d~1 ambiente
sedimentario. Por otro lado, los puntos CEN y BRl evidencian uno. estructuración más
variable, probablemente asociada a la estabilidad espacio-temporal de los sedimentos. Las
necesidades metabólicas de cada sub-grupo respecto al aporte fisicoquímico del micro
ambiente. como la cobertura rizosférica de BRl que genera un ambiente oscu;ü. más orgánico
v reductor sobre los sedimentos lacustres. o la remoción v sedimentación ondulante de. '.material fino que caracteriza al punto CEN, acompañados de los efectos de la luz diurno. sobre
comunidades autótrofas, son factores que probablemente influyen en la estructura y
composición de las comunidades microbianas de estos ambientes sedimentarios, y en este caso
en el de las SRB.
6.4. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LOS SUB-GRUPOS DETECTADOS DE SRB
81
PERFIL DE SRa EN 'LA GRANJA' R. LUNA·BARRÓN
Al observar la composición vertical de cinco tipos de SRB (OFM, 088, OS8. OCC y OSV),
determinada mediante el PCR-anidado, los resultados muestran una asociación entre el
potencial oxido-reductor, el origen del sedimento, la localización del mismo y la variabilidad
de los sub-grupos de SRB. Las muestras obtenidas de tres puntos con micro hábitats distintos
(CEN, 8IN y 8R!) en un mismo cuerpo de agua (laguna "La Granja"), posibilitan expandir el
análisis vertical de los sedimentos, a un análisis horizontal multilateral, para el cual
información biogeoquímica detallada sería muy valiosa. Sin embargo la información aun no
~stá disponible en esta laguna, y es mínima en otros cuerpos de agua de la amazonía boliviana.
Con el objetivo de extender el análisis de la distribución de sub-grupos de SRB en "La
Granja", se realizaron ensayos de cuantificación mediante hibridización por puntos.
Tabla-S: Cornplementariedadrelativa de las sondas utilizadasdurante la detección y la cuantificación de subgrupos de: SRB. OSV, Desulfovibrio-Desulfomicrobium: OSS, Desulfobacter: OSS. Desulfobulbus; OF~I,
Desulfotomaculum; OCc. Desulfococclls-Des/llfonema-Do!sulfosarcina. Tm =temperatura de: hibridación teórica;Tu = temperatura utilizada en el ensayo.
SONDA COMPLEMENTARIEDAD HIBRIDIZACION
Nombre S-euencla Cepa OSV oee oee DFM cee Tm "C Tu "C
S-'·Dsv-0686-a·A·18 TACGGATTTCACTCCT oSV desuttuncans 1000 0.813 0.750 0.813 0813 -108 36 os-'·DsD-0623-a·A- 18 TGTTTCAAGTGCACTiCCGGGG osa latus 0682 0.955 o.rra 0638 0818 553 53.0
s-··DsD-0623·a-A·18 TGTTTCAAGTGCiCTiCeGGGG osa tatus 0638 1000 0.743 0.591 o8ó-I 553 53 oS· ··Dsbl>-0660-a-A. 18 GAATiCCACTTTCCCCTCTG oaa propionicus 0650 07'50 1.0c0 0700 o.eco 50.01 52 oS·'·Dtml-0227·a-A. 18 GGGACGCGGACCCAT oFM nignficans 0933 0.733 0800 0933 0800 50.0 .:5 oS-'·Dtml-0227·I>-A·18 GGGACGCGGATCCAT oFM nignficans 0867 0667 07:13 leca 07'33 -172 45 os-'·DsD-0868·a-A·18 CAGGCGGATCACTiAATG DCC rnuttivorans o i22 0.889 o5~ 0:78 • OCO 47 -1 -15 o
Las variantes de las sondas DSB y DFM se utilizaron en cantidad ecu.moiar.
El principio de cuantificación por captura digital de la señal luminosa producida durante la. ..
hibridización molecular, ha sido utilizado para obtener información tanto cualitativa como
cuantitativa de las comunidades microbianas en muestras ambientales (Hazen y Jiménez,
1988). Sin embargo, al utilizar sondas de oligonucIeótidos para este procedimiento. es
necesario considerar algunos sesgos inherentes a la técnica, que afectan la interpretación de los
resultados. La especificidad de las sondas utilizadas (el rango de detección), está en directa
relación a la cornplernentariedad teórica de las mismas. en este caso con secuencias
bacterianas conocidas del 16S DNAr. Es importante determinar la especificidad en términos
numéricos (Tabla 5) para poder realizar una optimización adecuada de los protocolos de
aplicación. En este caso, la optimización fue realizada utilizando cepas de SRB de referencia,
82
PERFIL DE SRB EN'lA GRANJA" R. LUNA·BARRQN
por lo que los valores de complernentariedad calculados para cada sonda. con cada uno de los
cinco géneros detectados por PCR, han permitido reducir significativamente e! rango de
inespecificidad (Tabla 6).
6.5. CONSIDERACIONES SOBRE LA METODOLOGÍA DE CUANTIFICACIÓN
Si bien, al utilizar la amplificación del producto de la amplificación de! 1.65 DNAr como
molde para estimar la proporción de sub-grupos de 5RB presentes en las muestras analizadas
(en lugar del DNA o R..l\1A directamente), disminuye la probabilidad de obtener datos
cuantitativos más directos de las comunidades bacterianas. es posible reflejar de manera
relativa las tendencias de desarrollo de cada sub-grupo. Ravenschlag y colaboradores (1999).
utilizaron un principio semejante de cuantificación mediante hibridización con dos de las
cinco sondas de 5RB de interés. la diferencia con el método empleado en la presente
investigación radica en que con las copias del 165 DNAr. realizaron una biblioteca de clones.
a partir de la cual finalmente obtuvieron los datos cuantitativos de distribución.
El trabajo realizado por estos investigadores reconoce el alcance limitado del ensayo util izado.
donde se utilizaron como mínimo 34 ciclos de amplificación para obtener suficiente cantidad
de copias antes de elaborar la biblioteca. En el proceso, los autores aclaran sobre la necesidad-
de disminuir este número, para a su vez disminuir las probabilidades de error (ej. quimeras.
heteroduplex) durante el PCR. En la presente investigación no fue necesario elaborar una. ~ .
biblioteca de las secuencias del l6S ONAr pues la cantidad de copias iniciales fue suficiente
para la detección con la sonda EUB338, y con las sondas específicas que mostraron suficiente
intensidad de señal luminosa.
En el presente trabajo, por un lado, al utilizar las copias de 16S ONAr directamente para la
cuantificación, se ha suprimido el probable número adicional de errores de copia y
amplificación que conlleva elaborar una biblioteca de clones; por otro lado. se utilizaron solo
30 ciclos de amplificación para obtener cantidad suficiente del producto molde. lo que ha
disminuido en parte el sesgo creado por el p.roceso de PCR.
83
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA·BARRÓN
Adicionalmente, es importante considerar que la hibridización sobre ONA, y en este caso
indirectamente a través de una amplificación previa del 16S ONAr, permite obtener datos
cuantitativos de las copias genórnicas de células activas e inactivas. ?e sabe por ejemplo que
Desulfovibrio gigas posee de 4 a 17 copias genórnicas por célula (Edgcornb, 1999), lo cual
incrementaría el sesgo sobre la información cuantitativa, ya que las sondas utilizadas
expresarían para una sola célula, una intensidad multiplicada por el número de copias del 16S.. .
,ONAr. De cualquier forma, la cu~tificación indirecta mediante sondas de oligonucleótidos
sobre muestras ambientales, presenta información del número de copias del ONA presente en
células bacterianas de los diferentes sub-grupos de SRB, reflejada por la amplificación previa
del 16S ONAr. Por esto los datos de la hibridización cuantitativa obtenidos en laguna "La
Granja", en el presente análisis, han sido u-atados como indicadores ecológicos de la
distribución de SRB, y no como datos cuantitativos reales de las comunidades bacterianas
presentes de SRB.
En relación a la especificidad de las sondas utilizadas, de acuerdo con las bases de datos
consultadas (Tabla 6), la sonda 088660 incluye varias especies del género Desulfobulbus y JI
menos 12 grupos bacterianos no SRB. La sonda OCC868 posee cierta inespccificidad con
OS8 y al menos detecta II grupos no SRB, mientras que OSB623 es altamente específico. Sin
embargo, la mayoría de estos grupos no SRB detectables, corresponden a microorganismos
patógenos, endosimbiontes o minoritarios, y restringidos a condiciones muy específicas de
crecimiento. Por otro lado, la especificidad y fiabilidad de las sondas utilizadas ha sido
confirmada recientemente (Loyet al., 2002).
La suma de los porcentajes relativos de los sub-grupos de SRB analizados, alcanzan el
48.02% de la señal referencial de la sonda EUB338, lo cual puede parecer algo exagerado
considerando que solo se está analizando un grupo microbiano (SRB) cuya representatividad
en el ambiente estudiado es desconocida, aunque estos datos podrían sugerir que las SRB son
un grupo numéricamente importante en los micro hábitats estudiados de "La Granja".
84
PERFIL DE SRB EN "LAGRANJ"'". R. LUNA-BARRON
En la hibridización cuantitativa realizada por Sahrn y colaboradores (1999) sobre RJ\¡ A total
de sedimentos árticos, utilizando las sondas OSV687 y 088660, los resultados mostraron
valores máximos de 36% para la primera y de 1.7% para la segunda. ~n referencia a EUB338
en el intervalo de 27 a 30 cm de profundidad. Adicionalmente utilizaron la sonda Sval428 para
Desulfotaela sp. que mostró un valor de 20.9%. a la misma profundidad. Otro estudio
sernejdnte realizado por Zhang y Fang (2001), determinó que OSV comprendía el 33% Yosael 13.4% de la comunidad microbiana total en microcapas marinas. En contraste a estos dos
trabajos. Fry y colaboradorest lss'z) encontraron una proporción de OSV687 igual al 2.7%. Y
de OS8 igual al 0.3%, sobre un 92% de EUB338.
Tabla-S: Grupos bacterianos no SRB detectables con las sondas utilizadas y bajo las condiciones optimizadasdurante la cuantificación.
En tallos los casos se presentan los grupos con los valores mas aproximados, En negrilla lo; valores de grupo; por encuna lle lacornplementariedad mínima optimizada.
Comp. OSVU7 Compl OSBe23 Compl 088"0 Compl OFM221 Compl OCCIU
0.113 0,15-4 O.BOO 0.933 0.U9
, B*'Pl'lIla 0.62S Runnococcus 0.929V~ OBIA , Nauonoanaeroous 10e_OOac:enun
, Onul'lIomusa 0.562 Onul'OIlacula 0.929 PelOOeaer , PelOlomea.a.m , Oesutomusa
, P3leoDaeter 0,562 Pelospcra 0.929 CloWKlum , SPQrOComaa.u-n , OesurOOact.Jm
, MaIOmonas O,50~ 0,929 AIisoneIa 0.119 Heoooao-.s , Clo.lt'<1lUll1
, G..oollCler 0,5 SynlrOPtlJS 0.157 Call1llalus 0,189 HeoooadeRJm 1 WSJ (PlanaomyCt!l...e.)
, SulfllOSPnun 0.5 CloslndaJm 0,557 T!'Ioll~s O,SS9 HeloO<est1l 0.917 IIoollac:er
, TncNo<oDaeter 0.5 Syn!tOP';lnoSPOfa 0,457 Psewomonas O." 7 Propono<;¡ en"""
0,9 Naulllia 0.5 SynlrOPllomonas 0.557 OeSUlfllOtnusa 0.911 SlreploDaCJl.,.
0,1 CaIlolOQa 0.5 P..elkJla 0,557 Ga6COla 0.911 Let>\OlrlOba
0,8 GeoloQa 0,857 Hetoe:ocClJS 0,911 S......al"'.
0,8 Thermo .. pho 0,857 EuDaclenun 0,917 Cetobectemsn
0.1 COlllella 0.157 Pa.....baoIus 0,833 Oe.ulfOCo1psa
0,1 CampytoDacler 0,786 Azospt'AJ'n 0,833 ~ynlropHoDacl'"
0,8 AtcoDaeter , 0,78& 1A8Qt>eIOspulBun O.!33 Plánctomyc.ele.
0,8 Oet'lalosp..,'1um 0,786 Zymomona. 0,833 BdenoY>tlno
0,8 Geo.p",lIum 0,786 M'll~la
0,& HetiCOOaeter 0,786 HaIorhodosprn
0,8 CIo.lt1dlum 0.788 Th.oalkahprf8
0,786 AJleromonu
0.788 CalyplOQena
0,786 Oe.ulfuromona.
0,786 Gaollacler
0,786 Anaerococeu.
0.786 Oenalooacter
0.786 VeiUonela
0,786 ThermanaeroVlDno
0,786 GuggenhellT1la
0.786 Halcnacteroides
18 TOTAL O TOTAL 12 TOTAL 6 TOTAL 15 TOTAL, ,
85
PERFIL DE SRa EN "LA GRANJA" R. LUNA-BARRÓN
Estos resultados muestran una distribución variable de los sub-grupos de SRB en relación a la
comunidad de eubacterias, y muestran que [a sonda OSV687 puede revelar señales por encima
del 30% en determinados ambientes. Además. estos trabajos solo han caracterizado dos de: los
cinco sub-grupos analizados en la presente investigación. Al carecer de datos cuantitativos
simultáneos con sondas como la OCC868, no es posible comparar .Ios resultados de estos
trabajos con los datos obtenidos en "La Granja". Como ya se ha planteado, los resultados
encontrados, tanto cualitativos (PCR-anidado) como cuantitativos (hibridización), podrían
sugerir que las SRB representan un grupo significativamente numeroso en perfiles
.sedirnentarios amazónicos de la laguna estudiada (Tabla 4).
6.6. APRECIACIONES ECOLÓGICAS DERIVADAS DE LA CUANTIFICACIÓN
RELATIVA DE SRB
El análisis de la hibridización cuantitativa con la sonda de referencia EUB338. universal para
Bacteria. muestra valores distintos entre los puntos sedimentarios estudiados (CEN, BrN y
BRI; Gráfica 7). yen profundidad dentro de los mismos (O, 3.5 Y7 cm; Gráfica 6). El análisis
de varianza de la señal de EUB entre los puntos CEN, BrN y BR!. da un valor F = 2.061
(79%), lo que indica que las diferencias en la proporción de eubacterias entre los tres puntos
muestreados. son más significativas que la varianza en el análisis en profundidad (O. 3.5 Y 7
cm) que muestra un valor de F =0.356, lo cual sugiere la ausencia de diferencias relevantes en
la composición general de eubacterias asociada a la profundidad de cada sedimento.
El comportamiento de"'EUB entre puntos permite suponer que aparentemente existe mayor
proporción de eubacterias en los sedimentos de BIN (91.06% +/-10.66) Y menor en BRl
(76.39% +/-10.87) y CEN (80.66% +/-4.12; Gráfica 4, considerando el valor de EUB a 3.5 cm
de profundidad de BrN como 100%), por lo que existiría mayor cantidad de bacterias en los
sedimentos recientemente inundados (BrN), y una menor en los sedimentos normalmente
cubiertos por la masa de agua como BRl o CEN, considerando los valores de EUB como..
relativos entre sí en los tres puntos sedimentarios. La cantidad total promedio de los sub-
grupos de SRB estudiados (OSV687, OBB660, OCC868, OSB623 y OFM228) se relaciona de
86
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA' R LUNA·BARRON
forma inversa. siendo menor en BlN (i.0 I% +/·3.62), Y mayor en BRI (10.95% ~/-5 .11) Y
CEN (11.07% +/-5.48: Gráfica 5).
Si bien por una parte. es importante considerar que el análisis de la señal EUB de los tres
puntos es incompleto al carecer de una señal de referencia más general (ej. VNIVI390). y por
otro. la hibridización sobre el t6S ONAr previamente amplificado. la especi ficidad de las
sondas para los sub-grupos dc SRB y la intensidad de la señal de la sonda EUB338. podrían
estar reflejando algún fenómeno secundario. inherente a las propiedades de cada sonda bajo. .las condiciones del ensayo. ya las limitaciones de cada técnica utilizada.
Por otra parte. la correlación de los datos cuantitativos de sub-grupos de SRB con la señal
EUB en el punto BlN (Tabla i) muestra valores negativos para 4 de los 5 sub-grupos. lo cual
corroboraría la confiabilidad de la señal de EUB obtenida. dado que. en general. se espera que
las comunidades microbianas presentes en sedimentos del bosque inundado (BI:-';). sean
cualitativa y cuantitativamente mucho más diversas que en sedimentos de los otros dos puntos
(CE:..J y BR!). especialmente considerando el origen edáfico de Br-.:. que previamente fue
suelo del bosque amazónico poblado por otro tipo de comunidades bacterianas, IJS que: habrían
sido afectadas por la reciente inundación que ha transformado el suelo en sedimento lagunar.
Evidentemente. información complementaria sobre la proporción de microorganismos totales.
el~cariotcs (hongos) y arqueas. brindaría un panorama mas amplio en el análisis de sedimentos
sujetos a inundación.
De cualquier forma. es más objetivo considerar al comportamiento de la sonda ÉUB338 como
referencial para los sub-grupos de SRB si se pretende obtener información cuantitativa. por lo
que todos los datos de EUB se han ajustado a un 100% referencial (Gráfica 5). especialmente
porque no es posible afirmar que las condiciones de PCR del 16s DNAr han sido exactamente
las mismas para cada punto analizado. 10 que de ninguna manera disminuye la fiabilidad la
información cuantitativa. Los probables sesgos de la técnica de hibridización
(complementariedad de sondas, digitalización y análisis de la señal) hacen más apropiado
realizar un análisis general de la distribución cuantitativa de los sub-grupos de SRB
87
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R. LUNA·8ARRON
detectados. los que probablemente no sean los únicos sub-grupos de SRB presentes en los
sedimentos lacustres amazónicos estudiados.
La Grafica-l muestra la cuantificación porcentual de sub-grupos de SRB en los tres perfiles
(CEN, BIN y BRI) Y en cada sección evaluada (O. 3.5 Y 7 cm); Es evidente que en BIN la
proporción de SRB es la menor en contraste a CEN y BRl. Más aun. dentro del perfil BIN la
menor proporción de sub-grupos ocurre a los O cm y gradualmente se incrementa con la
profundidad, fenómeno que es apreciable también en CEN. mas no en BRI a causa del efecto
que ejerce la señal cuantitativa del sub-grupo OCc.
La variación del nivel cuantitativo de OSV y OCC a los 0.5 cm de profundidad. determinada
al comparar los tres puntos (CEN. BIN y BRI) es elevada (Gráfica 6). debido probablemente a,
que a esta profundidad es factible encontrar fenómenos biogccquimicos asociados a la
oxiclina. y por [o tanto están en juego las estrategias de resistencia que estos grupos presenten
a elevados niveles Eh y de oxígeno, Por ejemplo Minz et al. (1999) encontró que bacterias
sulfato-reductoras como OSV tenían preferencia por la oxiclina en contraste a
microorganismos eucariontes, y que además la variación cuantitativa a esta profundidad es
influenciada por las condiciones ambientales sobre la superficie del sedimento (Higushino ct
al.. 2004).
Es interesante notar que la menor vanacion en OSV ocurre a la aparente profundidad
preferencial de esta fami,lia (3.5 a 4.5 cm: Devereux et al., 1996). mientras que ~C( es menos
variable a los 7.5 cm. King (2002) determinó que uno de los picos de presencia de DCC en
pantanos se encontraba a los 8 cm de profundidad. Tomando en cuenta que la Gráfica 6
muestra la variación entre los tres puntos muestreados (CEN. BI~ y BRI). es probable que la
reducida variación responda al comportamiento preferencial de Dee por mayores
profundidades en sedimentos de "La Granja", Nótese además que cee presenta un
incremento gradual en la cantidad de células. y un decremento en la variabilidad, con la
profundidad. mientras que OSV. el otro grupo dominante. no presenta una variabilidad
88
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJA' R LUNA·BARRON
significativamente diferente entre los niveles 0.5 y 7.0 cm. aunque también incrementaría el
número de sus células con la profundidad (Gráfica 6).
El análisis comparativo entre puntos muestra que la distribución de los cinco sub-grupos es
relativamente uniforme: La Gráfica 7 muestra que la proporción de SRB es menor en el punto..BIN. Yen general mayor en CEN cuya diferencia con BRI no es significativa.
¡
Por Id'que se puede observar en la distribución de sub-grupos de SRB en CI;N (Gráfica 1). Y
en el comportamiento cuantitativo entre puntos de las comunidades de SRB (Gráfica 7). el Eh
aparentemente no es el factor fundamental para la colonización y establecimiento de las
comunidades. Es decir. tanto BrN como BRI poseen un Eh promedio próximo a los -133 rnV.
y sin embargo en BeN la proporción relativa de t?dos los grupos es menor a la de BR!. Por
otro lado, las proporciones en CEN y I3RI son muy parecidas. pese al oxidante Eh promedio
de -18 mV de CEN.
En el análisis de la proporción de sub-grupos de SRB en profundidad (Gráfica 6). DSV y DCC
parecen ser los grupos mayoritarios. Más aun. de acuerdo a la variación de los datos
cuantitativos de cada sub-grupo. las SRB presentan una tendencia preferencial por una
profundidad específica (3.5 y 7 cm respectivamente). En el análisis horizontal entre puntos
(Gráfica 7). DSV y DCC también tienden a ser dominantes y el plinto BfN parece ser el micro
ambiente menos preferido por las comunidades de SRB estudiadas .
..Para poder comprender mejor el patrón de distribución se realizó un análisis de correlación
entre los niveles detectados de cada sub-grupo y la señal referencial de EUB338 (Tabla 7).
El análisis de simetría muestra que el punto BRf es más proxrrno a coincidir con' el
comportamiento de todas las comunidades bacterianas (0.771) seguido de CEN (0.639).
mientras que BIN es el más alejado (0.009). Esto evidentemente puede sustentar la hipótesis
sobre la influencia de la perturbación de cada sedimento en la conformación de las
comunidades de SRB. SRl. el punto sedimentario menos perturbado. posee la correlación más
89
PERFILDE SRB EN -LA GRtl,NJA" R. LUNA·BARRQN
reciente. es próxima a cero. Los
valores de correlación de cada
alta entre la proporción "le: sub-
grupos de SRB v la S1.:ñal de
EUB. mientras qul.: la
correlación de BIN. el
sedimento de origen edáfico
por JJ .
SIMETRIA HORIZONTAL SIMETRIA VERTICAL
CEN BIN BRI Ocm 3.5cm 7cm
EUB 1,000 1,000 1.000 EUB 1.000 1.000 1.000DSV 0.857 0,151 1.000 DSV -0.631 -0.486 0,873DSa 0,094 -0.003 0,996 DSa -0,096 -0.003 -0.168DBB 0.145 -0,044 0.995 Daa -0.504 0.339 -0.110DFM 0.941 -0.552 0.647 DFM -0.941 -0.803 0,974DCC 0,799 -0,499 -0.012 DCC -0.978 -0.026 0,986
Media 0.639 0.009 0,771 Media -0.358 0.004 0.592
Tabla-": Simetría de los datos cuantitativos de SRB en relación a laseñal de EUS33S. Datos más próximos a + 1.000 indican una
distribución cuantitativa mejor aproximada a la estructura definidaEUS~~8
sub-grupo (Tabla 7) podría
indicar que la distribución
cuantitativa de los sub-grupos OSV. OSB. OSB y OFM. es más influyente en la composición
eubacteriana de ambientes permanentes y de un Eh más reductor como BR!. v IlL)
necesariamente para OCC que es más correlativo :1 los valores del punto CE~.
El análisis de simetría de las tres secciones evaluadas (0.3.5 Y7 cm: Tabla 7). muestra que la
distribución cuantitativa de las SRB a los 7 cm es la más relacionada al perfil general de ECB
(0.592). Esta asociación es menor a [os 0.5 cm (-0.358). Los valores son bajos en este análisis.
lo que supone una variabilidad más acentuada en los perfiles en profundidad. en contraste a los
perfiles cuantitativos entre puntos (Tabla 7). Esto es confirmado con trabajos que han
mostrado diferencias en la localización y organización de distintas SRB en perfiles e:1
profundidad (Devereux ct al.. 1996: Sass et al.. 1999; Minz ct al., 1999: Ravenschlag ct al..
2000: King et al.. 2002: Koizumi et al., 2003). Más aun. es posible contrastar esto con un
análisis de asimetría en relación a los perfiles de Eh encontrados en lis secciones de
cuantificación (Tabla 8).
Como puede verse (Tabla 8). BRl es el perfil más asimétrico y por 10 tanto el que:
aparentemente mejor responde al efecto que el potencial oxido-reductor ejerce sobre las
comunidades de SRB. mientras que CEN (el más oxidativo) es el menos asimétrico. Nótese
que el valor de OCC ejerce notable influencia en el promedio general. si excluimos este grupo.
la asimetría estaría influenciada por el comportamiento más asimétrico de OSV. OSB y OBB.
90
~ERFIL DE SRB EN "LA GRANJA' R LUNA·BARReN
En el análisis de asimetría vertical 1.:11 relación al Eh (Tabla 8l. el nivel mas asimétrico es 3.5
cm. coincidente con el nivel preferencial de algunas SRB encontrado por otros investigadores
(Devcreux et al., 1996), sin embargo no es coincidente con el nivel preferencial estimado por
la correlación en referencia a EUB (Tabla 7). que indica 7 cm. Esto reflejaría el supuesto de
que el Eh no es el factor más influyente en la organización vertical de las SRB. Cerca de la
superficie (0.5 cm) aparece la relación menos asimétrica. y por lo tanto las SRB presentes en
este ~livel son agudamente afectadas por múltiples condiciones propias de la oxiclina. Por
debajo de esta región, la distribución de cada sub-grupo de SRB está asociada a las
interacciones sintróficas entre sub-grupos y entre microorganismos del entorno. siendo el Eh
solamente un factor que definiría de forma general las condiciones para el desarrollo de SRB.
Tabla-S: Asimetria de SRB en relación ;li Eh. Valores mispróximos J -1.000 indican una disrribucion cuantitativa meror
aproximada J 1:1 estructura esperada en rclac.on JI potencial <¡,¡JIl
reductor,ASIMETRIA HORIZONTAL ASIMETRIA vERnCAL
I CEN I BIN 1 BRI I Ocm I J.S cm I 7cm
EUB -0.386 I 0.232 ! -1.000 EUB I -v 098 I 0.679 I -0.589DSV 0.145 -0.926 I -1.000 DSV I e 334 1 -0.9721 -o 119DSB -0.955 -0.973 i -0.994 DSB I 1COO ¡ -0.736 I 0.896DBB -0.969 -0.982 I -0.993 DBB I 0909 t -0';6110.863DFM -0.052 -0.939! -0.662 DFM I -0.24'; 1-0.107 I ·0.757DCC I -0.863 -0.959 I 0.031 DCC I 0.303 ! -0.751 1·0.716
Media I -0,513 I -0,758 I -0,770 Media I 0,451 i -0,391 I -0,069
al
general
antagonista
La asimetría a 3.5 cm muestra
claramente que e! valor L1e ELJB
comportanuento
encontrado en las SRB
EUB en el punto BIN (Tabla 8).
Ambos fenómenos podrían estar
asociados a la influencia de una elevada proporción de otros grupos microbianos cubactcrianos
cuantificadas. v ocurre algo
semejante: con la asimetría de
. ..no SRB presentes en I3'IN ya 3.5 cm de profundidad. y a la vez puede interpretarse como un
indicativo de que las SRB no son la comunidad más influyente numéricamente en BI~.
contrario a lo observado parla asimetría de EUB en el punto BRl. donde las SRB están mejor
correlacionadas simétricamente a EUB (Tabla 7) y asirnétricamente al Eh (T~lblas-11 ).
El hecho de suponer que la asimetría de EUB más los cinco sub-grupos de SRB respecto al
Eh. permita inferir si las SRB son el grupo microbiano mayoritario en BR!. se basa en Jos
resultados eh: la correlación simétrica de las SRB en relación a EUB (Tnbla 7). Es decir, si se
observa cierta simetría entre el comportamiento de los sub-grupos más la señal de EUB. y a su
91
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA' R LUNA·6ARRON
vez asimetría entre ELlB y el valor correspondiente de Eh. entonces es factible suponer que las
SRB son probablemente el grupo microbiano mayoritario en BR!. Por ejemplo Zepp Falz et al.
e1999), en un estudio sobre la distribución vertical de rnetanógenos en sedimentos mediante
hibridización directa con Rl'\lAr, encontró un comportamiento muy distinto al de las SRB. Los
cambios cuantitativos en profundidad se dieron de manera alternante a profundidades
preferenciales. sino que existe una notable uniformidad cuantitativa vertical. especialmente a
partir.de los 3 a 4 cm. Al correlacionar los datos de la sonda ARCI-/915 con EUB333 y los
conteos OAPI en relación a la profundidad. Zepp Falz (1999) encontró valores superiores a
0.600 para ELiB338. En contraste. "los datos del presente trabajo (Tablas 10 Y 1\) plantean una
correlación de 0.771 entre los sub-grupos de SRB detectados y EUB338. y de -0.770 entre
ELlB y el Eh de los perfiles sedimentarios.
Tornando en cuenta que los sedimentos estudiados por Zcpp Falz (Rotse. Suiza) poseen
condiciones ambientales características de comunidades metanógcnas, la correlación es
aparentemente un indicador indirecto de la dominancia de rnetanógenas sobre otros grupos.
Considerando estos datos. en "LJ Granja" los valores de simetría encontrados entre la
proporción de sub-grupos de ,SRB y [LiB (Tabla 7), y los valores de asimetría entre las SR8 y
el Eh (Tabla 8). sugieren que comunidades de sulfato-reductores podrían ser mayoritarias en
sedimentos asociados a ambientes rizosféricos (BR]). especialmente los sub-grupos OSV.
OSB y OSB, mientras que OSV, OCC y OFM serian dominantes en CE);: en BI?\ no se
observó. aunque OSV presenta el único valor de correlación positivo (0.151: Tabla 71. lo cual
podría estar relacionado con a las características de ubicuidad de esta familia.
Si bien los datos de simetría de los sub-grupos en relación a ELlB señalan a la profundidad de
7 cm como la más correlativa a la distribución de las SRB (Tabla 7). la asimetría en relación JI
Eh sugiere los 3.5 cm (Tabla 8). No obstante. es claro que la superficie sedimentaria (0.5 cm)
no ofrece las mejores condiciones para el desarrollo de las SRB. Es necesario empero tomar en
cuenta que los valores correlativos más influyentes en el análisis a los 3.5 cm (en relación al
92
PERFIL DE SRB EN -LA GRANJA- R. LUNA·BARRON
Eh: Tabla 8). corresponden a OSV, OSB y OCC, mientras que a los 7 cm (en relación a EUB:
Tabla 7) corresponden a OSV. OFM y OCc. Por esto. es factible plantear que diferentes
condiciones tisicoquimicas afectan de manera distinta al desarrollo de cada sub-grupo. Indagar
en cuestiones fisiológicas más específicas requiere de mayor cantidad de información
fisicoquírnica y molecular. por lo que los datos obtenidos en este trabajo parecen ser más útiles
para evaluar el comportamiento de las SRB estudiadas entre los diferentes micro ambientes
como,CEN. BlN y BRI.
simétricos de CEN y 8["N en
referencia a BR! (ya que la
proporción & SRB en BRI es la
más corrclati\41 a la señal Je EL' B.
___--_R'_'a 0.45
Si comparamos los perfiles
además de ser el sedimento menos
perturbado v cuya estructura
microbiológica para las SRB sea
probablemente la más estable). es
posible apreciar' la tendencia de
desarrollo de CE:'; Y 8[\ en un
análisis de dispersión (Gratica 9).
Claramente la curva del ,Punto B[)\;
muestra una estructura intrinscca de
A SR!• SIN
- f'oInomc.l (CEN) - Poinomc.l (SiN)
....~-~
• CEN
- Lll'Ieal (SRI)
Crúfica-S: Dispersión de simetría vertical de los datoscuantitativos de CEN y SIN en referencia a SR!. La distancia
relativa de cada curva en relación a la ordenada 1.000 indica unaasociación más fuerte entre la distribución cuantitativa de los
sub-grupos de SRI3 y la comunidad eubactcriana. La pendienten.:lJlIV:I de cada curva (R~) indica la semejanza de la estructurainterna de los sub-grupos d~ SRI3 en referencia a la definida en
el micro hábitat de SR!. los sub-grupos de SRB próxima a la
definida por el punto BR! (R~ =
0.95::8). es decir que la estructura cuantitativa de los sub-grupos es semejante en ambos
puntos sedimentarios. Sin embargo. la posición de BIN por debajo del limite correlativo
establecido por SRI (0.000 < BIN < -0.600) sobre el eje horizontal. indica la baja relación
entre la estructuración vertical general de las comunidades eubacterianas (EUB33S) y la de los
sub-grupos de SRB.
93
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA- R. LUNA·BARRON
La tendencia y posición de BfN son antagónicas a las de BRl. y las de CE:': (0.400 < CE:': <
1.000). lo cual responde al comportamiento esperado como sedimento perturbado (bosque
inundado) y de reciente formación (Gráfica 9). En contraste. el punto CEN es semejante a BRI
(ambas curvas se hallan sobre el eje X) en la relación entre la comunidad cubacteriana total y
la estructuración cuantitativa' de sub-grupos de SRB. pero el [actor co;,relativo de R: = 0.45.
Por una parte esto podría ser indicativo de un comportamiento estacional de las comunidades
microbianas en CEN. el cual no tiene un origen reciente como BIN, pero más perturbado que
el punto BRI ya que no existe cobertura de ningún tipo sobre los sedimentos de CEN. siendo
removidos por las corrientes acuáticas y la actividad de algunos rnacroorganismos, Por otro
lado. este resultado es concordante con los resultados del PCR-anidado (Gráfica 1). lo que
induce a creer que además del efecto climático. la composición fisicoquirnica de CEN (Eh =
18.3: mV) podría ser lo suficientemente diferente: en comparación a BN o BR!. para inducir
un ordenamiento distinto reflejado por el análisis de dispersión (R"' = 0.-1.5) :' la correlación con
el perfil de Eh (r = 0.04). que son los mis alejados del comportamiento esperado en los tres
puntos sedimentarios analizados.
G rúflca-I O: Dispersión de simetría horizontal de los datoscuantitativos obtenidos a Ocm y 3.5 cm en referencia a 7 cm. Laposición relativa de cada curva en relación a la ordenada 1.000
indica una asociación más fuerte entre la distribucióncuantitativa de los sub-grupos de SRI3 y la comunidad
eubacteriana. La pendiente relativa de cada curva (R~) indica lasemejanza de la estructura interna de los sub-grupos de SRB en
referencia a la definida en el punto a 7 cm de profundidad.
- A:Jlinórnca (J,5 cm) - A:Jbnórnca (O cm)
x Ocm
- Lineal (7 cm)
• J,5 cm + 7cm
Al realizar un análisis de dispersión
semejante con los datos en
profundidad. v tomando como
referencia el perfil de SRB a 7 cm (el
más correlativo en' relación a la
proporción de sub-grupos de SRB y
EUB). vemos que: en general no
existe una correlación positiva entre
las profundidades de O cm (0.000 <
CEN < -1.000) y 3.5 cm (\.000 <
1.000) con la referencial de 7 cm
(Grútica 10).
94
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA' R. LUNA·BARRON
Evidentemente la tendencia de las curvas a los O y 3.5 cm se distancia de la estructura
cuantitativa establecida por las comunidades de SRB a los 7 cm. No obstante, a los 3.5 cm
parece existir una ligera tendencia a cambiar su dirección en favor de la simetría (Gráfica 10).
Ni a los O cm ni a los 3.5 cm se encuentran valores medios positivos. En general. la
comparación de las curvas de dispersión entre puntos muestreados (Gráfica 9) y entre las
secciones analizadas en profundidad (Gráfica 10). confirmarían que la naturaleza del micro
ambiente sedimentario (CEN. BrN o BRl) influye sobre la proporción y distribución las
comunidades de SRB en los sedimentos estudiados. pero que los factores fisicoquimicos
intrínsecos de cada perfil sedimentario (reflejados por el análisis en profundidad) no generan
un efecto en similar magnitud sobre los sub-grupos de SRB estudiados. Es muy probable que
en los primeros 3.5 cm de profundidad. el aporte de otras comunidades bacterianas sea mucho
mayor que a los 7 cm. lo cual es reflejado por los patrones de correlación encontrados (Gráfica
10).
PCR E HIBRIDIZ.-\CIÓN
Para poder comparar la información cualitativa obtenida por PCR. COI1 la cuantitativa
(Hibridización). es necesario recurrir a comparaciones estadísticas. :\1 igual que en el caso de
los datos cuantitativos de hibridización. la información obtenida mediante la detección por
PCR-anidado. permite realizar un análisis de asimetría entre el número total de sub-grupos. ~
detectados en cada punto muestreado en referencia al Eh. Es imcrcsarue 110[:lr que en este
análisis. el punto 8lN es el más asimétrico (-0.170) seguido de BRI (-0.150) YCE~ (0.0-1-0).
En contraste. el mismo análisis con los datos cuantitativos (Tablas 10 Y 11) da cuenta del
punto BRI (y no BIN) como el más asimétrico. Por otro lado. ambos análisis de asimetría son
coincidentes en mostrar al punto CEN como el menos asimétrico. Esto induce a pensar que. de
acuerdo con los criterios vertidos previamente, los datos de PCR muestran a Be\ como el
perfil con la distribución de los sub-grupos de SRB más correlativos al nivel de Eh. mientras
que los datos de la hibridización sugieren a la muestra BRI. Esto podría estar asociado al
hecho de que, por un lado. el análisis de asi.metría en relación al Eh es mucho más relativo que
95
PERFIL DE SRa CN -LA GRANJA" R. LUNA·2 ..;RRON
el realizado por hibridización, debido a que el rango de Eh para el desarrollo de SRB parece
ser muy amplío. y por otro lado. porque utilizar como patrón de referencia un factor
fisiccquimico (único) es mucho menos representativo que utilizar un patrón mus amplio y
ccológicarncnre establecido como el detectado por la sonda ECB33S.
Los valores del coeficiente de diversidad de Shannon (H). calculados para cada punto
analizado en "La Granja" (Gráficas 1. 2 Y3). muestran que el punto 131); iH = 0.68-Q posee el
coeficiente más elevado. Esto es coincidente con los datos de correlación de asimetría con los
resultados del PCR-anidado '! el perfil de Eh de cada punto (discutido en el párrafo anterior).
Sin embargo. si se utilizan los datos del PCR-anidado para un análisis de varianza. los
resultados muestran que entre los puntos sedimentarios (F = 1..3~7). las diferencias son menos
significantes que en el análisis de varianza en profundidad IF = 1.8~3l. En contraste. los datos
de la hibridización cuantitativa. diferencian los perfiles cuantitativos de sub-grupos de SRB
entre puntos iF = 2.(61) Y en profundidad (F = 0.356). Es decir LJlIe los Jatos cuantitativos
(hibridización) reflejarían mejor las características ecológicas de la distribución de los sub..
grupos de SRB. especialmente porque se espera que el valor F obtenido de las comunidades en
cada punto sedimentario (CE~. BIN y BRI). sea mayor al valor F calculado a partir de 1:1
distribución en profundidad independiente entre los puntos.
Por otro lado. es importante notar que a diferencia de la hibridizacióu cuantuativn. las pruebas
de rCR no han detectado a los 5 sub-grupos en todos los niveles analizados (O. 3.5 Y 7 cm).
Tal es el caso del sub-grupo OSB. que mediante peR solo se ha detectado a_ora profundidad
media de ~.5 (+/- 3.0). según 10 cual se esperaría encontrar muy bajas cantidades de este subo.
grupo a O y 7 cm en los tres puntos. lo que no se observó en el enS:1YO de hibridización. No
obstante. el comparar esta información con los datos cuantitativos de OSB. puede verse que
este sub-grupo se halla en mayor cantidad a los 3.5 cm los puntos CEN y 13E\. Ya 7.0 cm en el
punto sedimentario BRL
U rungo de detección de las sondas elegidas para la cuantificación. es amplio entorno a los
sub-grupos de SRB (Loy et al., 2002), mie~ltras que los cebadores son mucho más específicos
96
PERFil DE SRB EN 'LA GRANJA' R. lUNA·BARRON
1Daly et al.. 2000). Los investigadores que han diseñado los cebadores y sondas utilizadas en
este estudio (Daly et al., 2000), utilizaron 36 cepas cultivables conocidas de SRB para evaluar
la especificidad de los cebadores y sondas. de las que el 30.6% presentaron patrones de
inespecificidad mínima pero significativa. A causa de esto, los autores sugieren la utilización
simultánea de ambas técnicas para poder detectar con cierta precisión a los cinco sub-grupos
de SRB.
Dada la carencia de estudios microbiológicos moleculares de filogenia en ambientes lacustres
amazónicos. es probable que la especificidad de las sondas durante la hibridización esté más
influenciada por la presencia de nuevos grupos bacterianos naturales aun no descritos ni
catalogados.
Tomando en cuenta que tanto el PCR como la hibridización poseen SI.'S~~)s ya discutidos. es
posible considerar que. siendo el PCR un sistema mucho más preciso que ¡J hibridización para
la detección. y a causa de esto que los cebadores probablemente no son capaces JI.' detectar
algunos géneros o especies de SRB probablemente presentes en las muestras sedimentarias
analizadas. y que el presente trabajo JI.' investigación ha utilizado estos cebadores y sondas en
un ambiente microbiológicaruentc desconocido. es muy probable que las sondas. durante la
hibridización cuantitativa, hayan detectado grupos nuevos (géneros o especies en número
considerable) de SRB. o nuevos grupos bacterianos no SRB tilogcnctican-emc emparentados."especial mente si consideramos que las comunidades microbianas nuevas. detectadas en suelos
de la amazonía. corresponden J más del 90% del total (Bornernan el al.. 1t)L)7),
Kcswani y Whitman (200!). determinaron empiricamente que la similaridad de secuencias
entre el 16S DNAr y la hibridización DNA-DNA en procariotes, planten al 16S como un
indicador molecular pobre para estudios entre grupos taxonómicos cercanos, Los resultados
obtenidos en el presente trabajo de investigación. dan cuenta de que la utilización simultánea
ele: cebadores "específicos" para la detección de sub-grupos de SRB mediante PCR. y la
utilización de sondas "especificas" de hibridización con el mismo propósito. I1l)
necesariamente muestran resultados coincidentes.
97
PERFIL DE SRB EN -LA GRANJA'
Es importante considerar que las diferencias metodológicas de ambas técnicas presentan
sesgos independientes. razón por la que probablemente no existen muchas investigaciones que
intenten combinar estas dos técnicas en estudios ambientales cualitativos y cuantitativos. y es
aparentemente suficiente obtener información a través una de las dos técnicas (PCR o
hibridización). Por lo tanto, el análisis de los datos obtenidos en el presente trabajo mediante
PCR e 'hibridización molecular. ha sido enfocado desde un punto de vista ecolóuico1 -
~omparati\'o, proponiendo una estructura preliminar de la distribución en profundidad de cinco
sub-grupos filcgcnéticos de bacterias sulfato-reductoras. en tres puntos sedimentarios con
micro hábitats distintos dentro de un mismo cuerpo de agua lacustre. y no así desde un punto
de vista taxonómico con los datos de cada sub-grupo de forma independiente. porque la
conjunción de los datos de ambas técnicas sugieren que es necesario el desarrollo de
investigaciones más detalladas J cerca de las comunidades microbianas i Encurva. Archue« y
Bacteria l presentes en los sedimentos amazónicos estudiados.
7. CONCLUSIONES
En el presente trabajo se optimizaron Jos técnicas moleculares independientes Jel cultivo
microbiano. para detectar bacterias sulfato-reductoras (SRB) mediante PCfc-anidado e
hibridización molecular. en tres muestras sedimentarias de origen lacustre amazónico. de
puntos localizados al c~ntro del cuerpo de agua estudiado (CE~l. en el bosque in'undado por
las mismas aguas (BlN), y en la zona cubierta por macrófitas flotantes (SR!),
Los métodos de extracción de DNA (Zhou. 1996 y \loBio) utilizados en las muestras
sedimentarias de laguna "La Granja", han demostrado eficiencia selectiva dependiente de las
caracteristicas fisicoquímicas del sedimento. siendo el método de MoBio el más óptimo en
cuanto a la calidad del DNA extraído.
98
PERFIL DE SRB E~J -LA GRANJA' R LUNA-BARRON
la cantidad de 00:.-\ extraído (mediante Zhou y/o Mollio) a partir de 600 m~ de muestra, luc
en promedio de 136 ng +/- 28 ng. y fue efectivo en diluciones de 1/100 y L~lJO para obtener el
fragmento amplificado de 1.5 kpb del l6S ONAr y el de 1.9 kpb del gen de la sulfito rcductasa
disirnilatoria (OSR).
la detección de SRB mediante PCR del l6S ONAr y de la OSR. demuestran consistentcmente
la ubicuidad de las SRB en los micro ambientes estudiados. Mediante el ensayo de PCR
anidado. se encontraron en los tres perfiles sedimentarios analizados (CE!'. SIN Y BRI) cinco
de los seis sub-grupos de SRB investigados (OF~'I: Desulfotomuculum: OBB: Desultobulbus.:
OSB: Desultobacter; OCC: Desuljococcus-Desultonc111(/- Desultosurci I tu:, ,
OSV:
DeslIlti)\·ihrio-Dl!.wltiJlllicrohiul11). El sub-grupo OB7Y1: Desultobacterium. no fue detectado en,
ninguno de los tres puntos pese a su semejanza ecológica con OSI3.
El análisis del gen de la (bi isulfito rcductasa disimilatoria (OSR) mediante PCR en los tres
perfiles sedimentarios evidenció la presencia de SRI3 en todas las secciones en profundidad de
los tres puntos muestreados. confirmando de forma independiente la presencia de
microorganismos sulfato reductores y del potencial sulfato reductor de! entorno.
la detección de sub-grupos de SRI3 muestra que OSV y OCC son los SUD-grupos presentes
con más frecuencia. El sub-grupo OSI3 se halla localizado a profundidad media en cada punto.
mientras que 01313 y OfM presentan una distribución vertical rnuv irregular en .CE\. 111~IS
regular en BR! y uniforme en BIN.
[1 índice de diversidad de los sub-grupos de SRI3 en los tres puntos sedimentarios en "La
Granja" se halla en el intervalo 0.600 < 1-1 < 0,690 (con una mínima variación del 3,9%).
siendo los puntos de muestreo del bosque inundado (BIN) y del centro de 1~1 laguna (('EN) los
que poseen el mayor y 111~l1or valor H correspondiente. LJ correlación entre estos valores y el
perfil promedio de Eh (1' = 0.813). indica que el potencial oxido-reductor es un factor
inlluycntc sobre la divcrsidad relatíva de los sub-grupos de SRI3 estud indos en cada PUI1 to
muestreado.
99
PERFIL DE SRB EN 'LA GRANJl\' R LU~IA·a;'RRCN
El análisis de correlación entre los dalas cuantitativos de los sub-grupos de SR13 v la
comunidad cubacteriana total. evidencia la asociación de los sub-grupos de SR13 \' la
comunidad de eubacterias en sedimentos establecidos (CEN v SRl), En contraste. en
sedimentos sometidos a inundaciones estacionales (SIN). la estructura cuantitativa de sub
grupos de SRS es menos asociada cuantitativamente a la comunidad cubactcriana. indicativo
de la presencia signi ficativa de otros grupos bacterianos presentes en el punto 81:-':, Por otro
lado. c.1: análisis correlativo en profundidad. intrínseco entre sub-grupos de SRB y en relación a
eubactcria. muestra que la asociación entre la estructura cuantitativa de las SRB y la estructura"
de eubacterias totales. se incrementa positivamente con la profundidad.
En el análisis comparativo entre los perfiles sedimentarios de CE~. Bl~ y BRI. la tendencia
general de las comunidades de SR13 reveló Jlinida~ por ambientes normalmente cubiertos por
la masa de agua como los sedimentos localizados bajo rizósfcra (BRI l. La correlación en
sedimentos recientemente formados del bosque inundado (Bl~). está alejada (O,ul)}) eh: los
valores alcanzados por BRI (0,771) Y e t:N (0,639).
En simesis. el comportamiento observado de los sub-grupos oc SI~B evidencia que la
distribución cualitativa y cuantitativa de 1:1S comunidades bacterianas. pueden ser diferentes en
un mismo cuerpo de agua que posca condiciones de micro hábitat diferentes, La distribución
de SRB en el perfil horizontal comparada al vertical no es uni lorme. Entre !L)S puntos
sedimentarios existe mayor variabilidad de la abundancia que entre las secciones en
proíundidad de un mismo' perf 1.
S. RECOMENDACIONES PARA FUTUR-\S INVESTIGACIONES
En 1:1 marco del proyecto "Hidrología y Gcoquímica de la Amazonia", la información
presentada establece datos preliminares sobre la presencia de bacterias reductoras de sulf.uo en
sedimentos de laguna "La Granja". Indagar con más detalle al respecto. permitirá obtener
100
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R LUNA·BARRON
mejores datos sobre la ecología microbiana de las SR8 en la investigación de la problemática
del monometilmercurio en la arnazonia.
El comportamiento horizontal observado plantea la necesidad e importancia de considerar
cuidadosamente la predominancia de un tipo determinado de micro ambiente. dentro de un
sistema hidrológico sedimentario como el estudiado en laguna "La Granja". Una laguna
cubierta. completamente de organismos vegetales flotantes presenta una estructura;.' .microbiológica general. y sedimentaria. distintas a otra carente de tal cobertura. y por ende. los
'procesos fisiológicos microbianos asociados a fenómenos fisicoquimicos del sistema
ostentarán diferencias en' proporción relativa a la estructura de las comunidades
microbiológicas en el perfil sedimentario. Esto resulta muy importante si es necesario elegir
un punto denominado "representativo dentro JI.: un sistema lagunar que presente marcas
gcoquimicas y ambientales oc interés.
La intormación obtenida a partir de la hibridización cuantitativa ha revelado problemas
inherentes al método basado en el producto 01.:1 16S ON:\r como marcador cuantitativo. Es por
lo tanto recomendable realizar estudios de cuantificación basados directamente en el R:\:\
microbiano total antes que en el O:.i:\ (Osada ct al.. 2003).
Por otra parte. es muy importante indagar la distribución o~ las SRl3 en su ordenamiento
natural en las micro capas (biofilmes) más próximas a la superficie sedimentaria (1 a 2 cm).
especialmente de la oxiclina (Minz el al., 1999: Shramm et al.. !99l)l. ya que.es :dlÍ donde se:t
encuentran [as comunidades microbianas que mayor relación poseen con el cuerpo de agua,
CUII especial interés en la composición' y distribución de SR8 e:.n la matas oxiclinalcs
sedimentarias y la micro capas de SRB asociadas a la rizósfcra superior (Burke et al.. 2002),
Pero por otro lado. es necesario continuar el estudio macro de los perfiles sedimentarios
amazónicos de SR8 a mayor profundidad, siguiendo la distribución 0(' los sub-grupos hasta su
desaparición. y contrastando esta información con mayor variedad de: datos Iisicoquimicos
relativos a la cstacionalidad de la región (pl-l, Eh. sulfatos. sulfitos. carbono. nitratos. nitritos.
metales traza. metales pesados. mercurio) y a otros factores ambientales. Tomando en cuenta
la¡
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA" R LUNA·BARReN
el interés global por el compuesto tóxico monornetilmercurio. es ncccsar:o adicionar Jatos
biogeoquimicos relativos a procesos de mctilación y dernetilación de mercurio. arsénico v
metano propios de los sistemas hídricos de la arnazonía boliviana.
Así mismo. es necesario extender estudios moleculares en sistemas hidricos amazónicos. no
solo para comprender la ecología microbiana del lugar hasta ahora inexplorado. sino también
para elaborar bibliotecas taxonómicas que permitan obtener más información de los nuevos
grupos presentes. que podrían repr.esentar más del 95% de las comunidades naturales de la
aruazonia (Bornernan et al., 1997).
102
PERFIL DE SRB EN "LA GRANJA'
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