plagiat merupakan tindakan tidak terpuji - core.ac.uk file“dan selama ribuan langkah kaki kita...
TRANSCRIPT
AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH
MERAH (Piper crocatum Ruiz & Pav.) PADA CHORIOALLANTOIC
MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Ketut Noveryka Lendra
NIM : 108114171
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
AKTIVITAS ANTIANGIOGENESIS EKSTRAK ETANOL DAUN SIRIH
MERAH (Piper crocatum Ruiz &pav.) PADA CHORIOALLANTOIC
MEMBRANE YANG DIINDUKSI bFGF
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu SyaratMemperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh :
Ketut Noveryka Lendra
NIM : 108114171
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2014
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
"Kaki yang berjalan lebih jauh dari biasanya,
tangan yang akan berbuat lebih banyak dari biasanya,
mata yang akan menatap lebih lama dari biasanya,
leher yang akan sering melihat keatas,
lapisan tekad yang seribu kali lebih keras dari baja,
hati yang akan bekerja lebih keras dari biasanya,
serta mulut yang akan selalu berdoa,"
“Dan selama ribuan langkah kaki kita melangkah, selama hati yang berani inibertekad hingga semuanya bias terwujud sampai di sini, jangan pernah sekalipunkita menyerah mengejar mimpi-mimpi kita, berjuang, berusaha dan bercita-cita
untuk kehidupan yang lebih baik bagi tanah tempat kita berpijak ini”
Donny Dirgantoro - 5 cm
Skripsi ini kepersembahkan untuk :Tuhan Ida Sang Hyang Widhi Wasa,
Papa dan Mama tercinta,Saudara-saudaraku tersayang,
Teman-temanku,Dan Almamaterku...
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
PRAKARTA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa ”Ida
Sang Hyang Widhi Wasa” atas segala anugerah dan bimbingan-Nya sehingga
penulis dapat menyelesaikan penelitian serta penulisan skripsi yang berjudul
“Aktivitas Antiangiogenesis Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper
crocatumRuiz &pav.) Pada Chorioallantoic Membrane yang Diinduksi bFGF”.
Skripsi ini disusun guna memenuhi persyaratan dalam penyelesaian jenjang studi
untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Keberhasilan penelitian dan penyusunan skripsi ini tidak terlepas dari
bantuan, bimbingan serta dukungan dari berbagai pihak baik secara moril maupun
materiil. Untukitu, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan ucapan
terimakasih yang sebesar- besarnyakepada :
1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Drh. Sitarina Widyarini, MP, Ph.D. selaku Dosen Pembimbing I skripsi
yang telah meluangkan banyak waktu, tenaga dan pikirannya,
sertamemberikan perhatian, kesabaran, bimbingan, masukan dan motivasi
kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.
3. Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt.selaku Dosen Pembimbing II skripsi
yang telah meluangkan banyak waktu, tenaga dan pikirannya, serta
memberikan perhatian, kesabaran, bimbingan, masukan dan motivasi
kepada penulis dalam proses penyusunan skripsi ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
4. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dosen Penguji skripsi yang telah
banyak memberikan koreksi serta saran untuk kesempurnaan penulisan
skripsi ini.
5. Yohanes Dwiatmaka, M.Si selaku Dosen penguji yang telah memberikan
kritik dan saran yang membangun selama proses pembuatan skripsi.
6. Papa (I Wayan Lendera, Dipl. PT.) dan Mama (Eriana Herlisanti, S. Pd.)
yang tidak henti-hentinya memberikan doa, semangat, dukungan dan
bantuan finansial hingga akhirnya skripsi ini dapat terselesaikan.
7. Saudara-saudaraku tersayang, Gede Ayusari Lendra, S.T., M.Eng., Made
Dody Lendra, SST.FT., M.Fis., dan Nyoman Valida Lendra, S.Farm.,
Apt., terima kasih atas kebersamaan, doa, semangat dan nasehat yang
diberikan selama penulis menyelesaikan skripsi ini.
8. Pak Wagiran selaku laboran Farmakognosi Fitokimia dan Mas Agung
selaku laboran Farmasi Steril yang telah banyak membantu sehingga
penelitian dan penyusunan skripsi ini dapat terselesaikan.
9. Pak Iwan selaku laboran mikrobiologi Universitas Gadjah Mada yang
telah banyak membantu sehingga penelitian dan penyusunan skripsi ini
dapat terselesaikan.
10. Teman-teman seperjuangan skripsi Stien Dwiny, Retno Pamungkas, dan
Pande Putu Krisna Wedana terima kasih atas kebersamaan, semangat dan
kerjasamanya selama penelitian dan penyususnan skripsi hingga akhirnya
skripsi ini dapat terselesaikan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
11. Sahabat-sahabatku tercinta Kezia, Naomita, Bakti, Aji, Rosi, dan Lilin
yang telah memberikan semanagat serta canda tawa kepada penulis selama
penyusunan skripsi ini.
12. I Putu Edy Rapiana, S.T.,yang selalu meluangkan waktunya untuk
menemani penulis serta kesabaran, doa dan semangat yang tiada hentinya
diberikan kepada penulis selama menyelesaikan skripsi ini.
13. Teman-teman FSM D 2010 dan FKK B 2010, terima kasih atas
kebersamaannya dan pengalaman yang tak terlupakan selama menjalani
kuliah dan praktikum bersama peneliti selama penyusunan skripsi.
14. Teman-teman kost odilia yang telah memberikan semangat kepada penulis
hingga terselesaikannya skripsi ini.
15. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, baik secara
langsung maupun tidak langsung telah banyak membantu terselesaikannya
skripsi ini.
Penulis menyadari bahwa tidak ada manusia yang sempurna. Demikian
juga dengan tugas akhir ini yang belum sempurna dan masih banyak kekurangan.
Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun
dari semua pihak agar skripsi ini dapat menjadi lebih baik. Akhir kata, penulis
berharap semoga tugas akhir ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama
demi kemajuan pengetahuan di bidangFarmasi.
Yogyakarta, 23 Juli 2014
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL................................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN..................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................. iv
HALAMAN PERNYATAAN PUBLIKASI .............................................. v
PRAKARTA ............................................................................................... vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ..................................................... ix
DAFTAR ISI............................................................................................... x
DAFTAR TABEL....................................................................................... xiv
DAFTAR GAMBAR .................................................................................. xv
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................... xvi
INTISARI.................................................................................................... xviii
ABSTRACT.................................................................................................. xix
BAB I. PENGANTAR................................................................................ 1
A. Latar Belakang ................................................................................. 1
1. Perumusan masalah .................................................................... 5
2. Keaslian penelitian ..................................................................... 6
3. Manfaat penelitian ...................................................................... 7
a. Manfaat teoritis..................................................................... 7
b. Manfaat metodologi ............................................................ 7
c. Manfaat praktis..................................................................... 7
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
B. Tujuan Penelitian.............................................................................. 8
1. Tujuan umum ............................................................................. 8
2. Tujuan khusus............................................................................. 8
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA......................................................... 9
A. Obat Tradisional ............................................................................... 9
B. Sirih Merah ...................................................................................... 10
1. Taksonomi tumbuhan ................................................................. 10
2. Deskripsi tanaman ..................................................................... 10
3. Kandungan kimia ...................................................................... 11
4. Khasiat dan penggunaan ............................................................ 14
C. Ekstraksi .......................................................................................... 15
D. Kanker ............................................................................................. 16
a. Karsinogenesis............................................................................ 17
b. Angiogenesis .............................................................................. 19
c. basic Fibroblast Growth Factor (bFGF).................................... 22
E. Chorioallantoic Membrane .............................................................. 24
F. Landasan Teori ................................................................................. 25
G. Hipotesis ........................................................................................... 27
BAB III. METODE PENELITIAN............................................................. 28
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...................................................... 28
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional .................................. 28
1. Variabel utama ........................................................................... 28
a. Variabel bebas ...................................................................... 28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
b. Variabel tergantung .............................................................. 28
2. Variabel pengacau ...................................................................... 28
a. Variabel pengacau terkendali ............................................... 28
b. Variabel pengacau tak terkendali ......................................... 28
3. Definisi operasional.................................................................... 29
C. Bahan Penelitian .............................................................................. 29
D. Alat Penelitian ................................................................................. 29
E. Tata Cara Penelitian ........................................................................ 30
1. Determinasi tanaman.................................................................. 30
2. Pengumpulan bahan uji .............................................................. 30
3. Preparasi ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.)........................................................................................ 30
4. Orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) ............................................................... 31
5. Sterilisasi alat ............................................................................. 31
6. Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth
Factor (bFGF) ............................................................................ 31
a. Preparasi bFGF sebagai induktor angiogenesis.................... 31
b. Preparasi sediaan larutan uji................................................. 32
7. Uji antiagiogenesis ..................................................................... 32
F. Analisis Data .................................................................................... 35
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 38
A. Determinasi Tanaman ...................................................................... 38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
B. Preparasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.).............................................................................................. 38
C. Hasil Uji Angiogenesis Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.) Pada Chorioalantoic Membrane (CAM).... 41
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN..................................................... 57
A. Kesimpulan....................................................................................... 57
B. Saran................................................................................................. 57
DAFTAR PUSTAKA ................................................................................. 58
LAMPIRAN ............................................................................................... 64
BIOGRAFI PENULIS ................................................................................ 86
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR TABEL
Tabel I. Rerata jumlah pembuluh darah baru dan standardeviasi
pada kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol
daun sirih merah ................................................................. 46
Tabel II. Hasil Uji Statistik pertumbuhan pembuluh darah baru
antar kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol
daun sirih merah .................................................................. 48
Tabel III. Persentase Pertumbuhan pembuluh darah baru
pada kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol
daun sirih merah .................................................................. 52
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xv
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Memperlihatkan Tahapan Kerja Uji CAM.......................... 35
Gambar 2. Skoring Semikuantitatif Respon Angiogenesis Secara
Mskroskopik ........................................................................ 36
Gambar 3. Respon Angiogenesis Pada CAM Secara Makroskopis
Yang Diberi Berbagai Perlakuan......................................... 45
Gambar 4. Diagram batang rata-rata jumlah pembuluh darah
baru pada kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak
etanol daun sirih merah ....................................................... 46
Gambar 5. Persentase Pertubuhan Pembuluh Darah Baru pada
kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih
merah .................................................................................. 53
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)... 62
Lampiran 2. Foto serbuk daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) 63
Lampiran 3. Hasil Determinasi Tanaman Sirih Merah ............................ 64
Lampiran 4. Data perhitungan rendemen ekstrak etanol daun ririh merah 65
a. Penimbangan .................................................................. 65
b. Rendemen ekstrak etanol daun sirih merah ................... 65
Lampiran 5. Data Perhitungan Pengenceran bFGF ................................. 66
a. Pengenceran bFGF.......................................................... 66
b. Kontrol bFGF.................................................................. 66
c. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah .................. 67
Lampiran 6. Perhitungan berat ekstrak etanol daun sirih merah dan
volume DMSO..................................................................... 68
a. Berat konsentrasi ekstrak untuk masing-masing
konsentrasi etanol daun sirih merah .............................. 68
b. Volume DMSO............................................................... 68
Lampiran 7. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis
Pada kelompok control dan perlakuan ekstrak etanol
Daun sirih merah. ................................................................ 69
a. Kontrol paper disc (PD) ............................................... 69
b. Kontrol pelarut ............................................................. 70
c. Kontrol bFGF ............................................................... 71
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xvii
d. Konsentrasi etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml......... 72
e. Konsentrasi etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml........... 72
f. Konsentrasi etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml........... 73
Lampiran 8. Rerata jumlah pembuluh darah baru dan standar deviasi .... 69
a. Mean dan standar deviasi pembuluh darah baru dari
masing-masing perlakuan............................................. 69
lampiran 9. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru ................... 70
Lampiran 10. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru pada
Kelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun
sirih merah ........................................................................... 71
Lampiran 11. Diagram batang pertumbuhan pembuluh darah baru pada
Kelompok kontrol dan kelompok konsentrasi ekstrak etanol
daun sirih merah........................................................................... 71
Lampiran 12. Uji Statistik dengan SPSS 16.0............................................. 72
a. Uji normalitas ................................................................. 72
b. Uji homogenitas.............................................................. 73
c. Uji Tukey......................................................................... 74
Lampiran 13. Diagram batang Jumlah Pembuluh Darah Baru Rata-Rata
Dari Masing-Masing Perlakuan.......................................... 76
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xviii
INTISARI
Daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz &pav.) memiliki manfaat untukmengobati berbagai macam penyakit, salah satunya adalah sebagai antikanker.Senyawa fitokimia yang diduga berpotensi sebagai antikanker adalah senyawaflavonoid. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesisekstrak etanol daun sirih merah terhadap Chorioallantoic Membrane (CAM) yangdiinduksi bFGF dan juga untuk mengetahui hubungan antara peningkatankonsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah dengan aktivitas antiangiogenesis.
Penelitian ini termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancanganlengkap pola searah. Telur ayam yang digunakan adalah telur ayam berembrioyang berusia 9 hari dalam kondisi terinkubasi. Uji antiangiogenesis dilakukandengan member perlakuan terhadap CAM telur ayam berembrio yang diinduksibFGF yang kemudian ditambahkan ekstrak etanol70% daun sirih merah dengankonsentrasi 0,05; 0,1dan 0,2 mg/ml. Pengamatan dilakukan secara makroskopisdengan menghitung jumlah pembuluh darah baru pada CAM. Data yang didapatkemudian dianalisis menggunakan analisis satu arah Anova yang dilanjutkandengan uji Tukey untuk melihat adanya perbedaan yang bermakna antar kelompokperlakuan.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan didapatkan hasil bahwa ekstraketanol daun sirih merah mampu menghambat angiogenesis pada CAM dimanatidak adanya kekerabatan antar konsentrasi. Respon angiogenesis untukkonsentrasi 0,05; 0,1 dan 0,2 mg/ml masing-masing secara berurutan adalahsebesar (%) 62,83± 2,30; 52,85± 1,52; 44,27 ± 0,577. Kesimpulan dari penelitianini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah memiliki efekantiangiogenesis pada telur ayam berembrio dengan konsentrasi optimal adalah0,05 mg/ml.
Kata kunci : Piper crocatum Ruiz & pav., CAM, aktivitas antiangiogenesis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xix
ABSTRACT
Celebes pepper leave (Piper crocatum Ruiz &pav.) has many medicinalactions, one of them is anticancer. Compounds as potential anticancer isflavonoids.The aim of this research is to investigate the antiangiogenic activity ofethanol extract celebes pepper leaves on Chorioallantoic Membrane(CAM)induced bFGF and to know the correlation between increasing concentrations ofethanol extract celebes pepper leaves with antiangiogenic activity.
This is an experimental research following complete random ofunidirectional pattern. Chicken eggs used are embryonated chicken eggs 9 daysold and incubated. Antiangiogenic test had been done by giving treatment toCAM embryonated chicken eggs induced bFGF with the ethanol 70 % extract ofcelebes pepper leaves with level 0.05; 0.1and 0.2 mg/ml. Macroscopic observationwas done by counting the number of new blood vessels in the CAM.Antiangiogenis test result was analyzed using one-way ANOVA and thenproceeded to Tukey test to see the significant difference between treatmentgroups.
The results showed that the ethanolic extract of celebes pepper couldinhibit angiogenesis and did not correlation between concentration.concentration0.05; 0.1 and 0.2 mg/ml gave antiangiogenic response of (%) 62.83± 2.30; 52.85±1.52; 44.27 ± 0.577respectively. These results indicate a potential antiangiogeniceffect of the extract at the embryonated chicken eggs and optimum concentrationis 0.05 mg/ml
Keywords : Piper crocatum Ruiz & pav., CAM, Angiogenic Activity
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Penyakit kanker masih merupakan masalah besar bagi dunia yang
menyumbangkan penyebab kematian tertinggi setelah penyakit kardiovaskuler
dan infeksi, baik pada laki-laki maupun pada perempuan. Di Indonesia, kanker
merupakan penyebab kematian nomor lima setelah penyakit kardiovaskuler,
infeksi, pernafasan dan pencernaan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan
Makanan, 2000). Di AS dan beberapa negara berkembang lainnya, sekitar 25%
kematian disebabkan oleh kanker (Anonim,2005). Data dari U.S. National Health
Institute menyebutkan bahwa sepanjang tahun 2009 ini telah dilaporkan sebanyak
1.479.350 kasus kanker di AS, dengan angka kematian akibat kanker mencapai
562.340 atau 38,01 % dan angka ini belum termasuk kanker non-melanoma kulit.
American cancer society menyebutkan kanker menyumbangkan 13 % penyebab
kematian manusia di seluruh dunia atau sekitar 7,6 juta kematian akibat kanker
terjadi sepanjang 2007. Tingkat kejadianya pun semakin meningkat disebabkan
pola hidup instan yang dilakukan hampir semua penduduk dunia, bahkan World
Health Organization (WHO) memperkirakan pada tahun 2030 tingkat kematian
akibat kanker mencapai 12 juta orang. Pada tahun 2007, 72% angka kematian
akibat kanker ditemukan di negara berkembang (Anonim, 2009). WHO juga
melaporkan bahwa 1 penderita kanker meninggal setiap 11 menit dan muncul
1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
penderita kanker baru setiap 3 menit. Diperkirakan setiap tahun ada 11 juta kasus
kanker baru dan 7 juta orang meninggal akibat kanker (Sankaranarayanan, 2008).
Kanker adalah suatu pertumbuhan sel yang abnormal dan bersifat ganas.
Sel kanker tumbuh dan berkembang dengan mengambil nutrisi dan oksigen dari
inang (host) dengan cara membentuk pembuluh darah baru (angiogenesis) dari
pembuluh darah yang sudah ada. Sel-sel kanker akan berkembang dengan cepat,
tidak terkendali, dan akan terus membelah diri, selanjutnya menyusup ke jaringan
sekitarnya (invasive) dan terus menyebar melalui jaringan ikat, darah, dan
menyerang organ-organ penting serta syaraf tulang belakang (Hanahan dan
Weinberg, 2000; Siswandono dan Soekardjo, 2000).
Angiogenesis merupakan proses pembentukan pembuluh darah baru yang
terjadi secara normal dan sangat penting dalam proses pertumbuhan dan
perkembangan. Angiogenesis juga merupakan langkah yang sangat penting dalam
karsinogenesis atau pertumbuhan sel kanker, sehingga terjadi perkembangan sel
kanker yang tidak terkendali dan bersifat ganas. Angiogenesis juga berkembang
menjadi sesuatu yang bersifat patologis dan berhubungan dengan kanker,
inflamasi, penyakit kulit dan penyakit mata. Kondisi patologi angiogenesis ini
dikarakterisasi oleh pembentukan pembuluh darah baru dan penghancuran sel
normal yang ada di sekitarnya. Terapi menggunakan inhibitor angiogenesis
merupakan suatu pendekatan yang relatif baru untuk terapi anti kanker. Hal ini
karena sel-sel tersebut umumnya stabil sehingga memungkinkan mereka kurang
berkembang menjadi obat yang resisten secara cepat (Kerbel dan Folkman, 2002).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
Berbagai macam upaya untuk mengatasi kanker sudah banyak dilakukan
tetapi kurang efektif, sehingga dibutuhkan suatu usaha dalam menekan angka
pertumbuhan kanker, salah satunya adalah dengan menghambat proses
angiogenesis.Sejauh ini, berbagai macam cara untuk mengobati kanker belum
menunjukkan hasil yang memuaskan. Sampai saat ini, pembedahan dan
kemoterapi masih merupakan pilihan yang terbaik untuk terapi antikanker, namun
tingkat keberhasilannya masih rendah. Pembedahan tidak lagi efektif bagi sel
yang telah bermetastase. Radio terapi dan kemoterapi bekerja tidak selektif dan
tidak aman untuk sel normal. Agen antiangiogenesis sebagai terapi anti kanker
dapat berlaku spesifik dengan hanya menghambat pertumbuhan sel yang
terinduksi angiogenesis dan tidak berpengaruh pada sel dorman (King,2000).Oleh
karena itu, adanya penemuan obat baru sebagai senyawa antiangiogenesis, dengan
mengekplorasi bahan alam, sangat berpotensi untuk dikembangkan dengan
melalui perkembangan obat herbal secara tepat(Walaszek, Hanausek, dan Slaga,
2004).
Indonesia termasuk negara yang memiliki kekayaan flora nomor 2 di
dunia. Indonesia diyakini memiliki berbagai macam tumbuhan yang dapat
dimanfaatkan sebagai obat termasuk untuk pengobatan kanker. Kenyataannya
Indonesia masih tergolong rendah terutama dalam pemakaian tumbuhan sebagai
obat yang diintegrasikan dalam pelayanan kesehatan. Namun saat ini, popularitas
terapi herbal sudah mulai meningkat (Kamienski dan Keogh, 2006), salah satu
tanaman obat yang secara empiris biasa digunakan sebagai obat tradisional adalah
sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.). Selama ini penelitian yang banyak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
dilakukan masih terbatas pada sirih saja, yang memiliki aktivitas sebagai
antiinflamasi dan imuno modulator. Sampai saat ini sirih merah lebih banyak
dikenal sebagai tanaman hias dan tumbuh merambat dipagar atau dipohon
(Pramono, 2002).
Sampai saat ini, penelitian tentang kemampuan daun sirih merah sebagai
antikanker belum banyak dipublikasikan. Namun di lingkungan masyarakat, daun
sirih merah ini sudah banyak digunakan sebagai obat tradisional dan telah diyakini
sebagai obat antikanker, dapat dilihat dari cukup banyaknya penderita kanker
yang sudah mengkonsumsi daun sirih merah baik dalam bentuk rebusan maupun
dalam bentuk lainnya (Pramono, 2002). Hal tersebutlah yang mendasari
dilakukannya penelitian ini dengan tujuan untuk melihat efek ekstrak etanol daun
sirih merah terhadap pertumbuhan pembuluh darah baru pada CAM telur ayam
berembrio yang diinduksi bFGF.Berdasarkan penelitian Neritika (2008), ekstrak
etanol daun sirih merah terbukti memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel
kanker payudara T47D. Pada Uji sitotoksisitas fraksi etanol daun sirih merah
terhadap kultur sel raji yang dilakukan oleh Frandita (2009), menunjukkan bahwa
fraksi etanol daun sirih merah kemungkinan memiliki efek sitotoksisitas terhadap
kultur sel raji. Hal inilah yang mendasari pemilihan pelarut etanol pada penelitian
ini. Etanol mampu menarik senyawa aktif yang bersifat polar, dan diharapkan
mampu menarik senyawa flavonoid dari daun sirih merah karena seperti yang
telah diketahui, senyawa flavonoid mampu menghambat kanker dan diantaranya
melaui penghambatan angiogenesis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
Metode CAM dipilih pada penelitian ini karena membran korio alantois
merupakan membran yang sangat kaya dengan pembuluh darah dimana hal ini
berhubungan dengan sirkulasi embrionik melalui arteri dan vena alantois. Korio
alantois juga merupakan metode yang sangat sederhana untuk mempelajari
angiogenesis in vivo. Uji ini banyak digunakan untuk studi angiogenesis dan
invasi tumor dari kanker (Lokman, Elder, Ricciardeli dan Oehler, 2012).
Metode CAM memiliki beberapa kelebihan, antara lain adalah telur ayam
berembrio mudah didapatkan, relatif murah, mudah dikerjakan dan lebih praktis
(Ribatti,dkk., 1997). Selain memiliki kelebihan, penelitian menggunakan media
CAM juga mempunyai beberapa kelemahan yaitu keberadaan pembuluh darah
asal dan reaksi inflamasi yang tidak spesifik (Ribatti, dkk., 1997). Selain itu,
kuantifikasi hasil sering sangat subyektif sehingga sulit untuk membandingkan
hasil yang didapat.
1. Perumusan masalah
a. Apakah ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas
antiangiogenesis pada chorioallantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio
yang diinduksi bFGF dan pada konsentrasi berapa didapat konsentrasi
optimalnya?
b. Adakah kekerabatan antara konsentrasi ekstrak etanol daun sirih
merah dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM telur ayam berembrio yang
diinduksi bFGF?
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
2. Keaslian penelitian
Adapun beberapa penelitian yang berhubungan dengan aktivitas sirih
merah yang pernah dilakukan, antara lain:
a. Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &
Pav.) Terhadap Kultur Sel Kanker Payudara T47D. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa ekstrak etanolik daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) memiliki
efek sitotoksisitas terhadap kultur sel T47D, dengan LC50 sebesar 587,7 µg/ml
(Neritika, 2008).
b. Uji Antiinflamasi Ekstrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &
Pav.) Pada Tikus Putih. Hasil penelitian pada penelitian ini adalah ekstrak metanol
daun sirih merah memiliki aktivitas antiinflamasi pada tikus putih yang diinduksi
karagenin dimana dosis yang digunakan adalah 25, 50 dan 100 mg/kg BB
(Fitriyani, Winarti Muslichah dan Nuri, 2011).
c. Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Sebagai Agen Anti
Bakterial Terhadap Bakteri Gram Positif dan Gram Negatif. Hasil penelitian
menunjukkan bahwa ekstrak etanol sirih merah memiliki kemampuan antibakteri
terhadap bakteri gram positif dan bakteri gram negatif khususnya terhadap
Staphylococcus aureus dan Escherichia coli (Juliantina, Citra, Nirwani,
Nurmaaitoh dan Bowo, 2009).
d. Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &
Pav.) Terhadap Kultur Sel Raji. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etanol
daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) kemungkinan memiliki efek
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
sitotoksisitas terhadap kultur sel raji dengan nilai LC50 sebesar 174,16 µg/ml
(Frandita, 2009).
e. Efek Antiproloferatif Estrak Metanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.) Terhadap Kultur Sel Kanker Payudara T47D Secara In vitro. Hasil
penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun sirih merah mampu
menghambat sel kanker payudara T47D (Wicaksono, dkk., 2009).
Sejauh pengetahuan penulis, belum pernah dilakukan penelitian
mengenai uji antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih merah pada
Chorioallantoic Membrane (CAM) telur ayam berembrio yang diinduksi bFGF.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis. Dapat memperkaya ilmu pengetahuan mengenai
adanya aktivitas anti angiogenesis pada daun sirih merah.
b. Manfaat metodologi. Dapat memberikan pengetahuan mengenai tata
cara pengujian aktivitas antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih merah
mengunakan metode chorioallantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio
yang diinduksi bFGF.
c. Manfaat praktis. Dapat memberikan informasi mengenai adanya
aktivitas antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz
& Pav.) sebagai pengobatan kanker.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
B. Tujuan Penelitian
1. Tujuan Umum. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak
etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis.
2. Tujuan Khusus.
a. Untuk mengetahui aktivitas antiangiogenesis dari ekstrak etanol
daunsirih merah.
b. Untuk mengetahui hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak
etanol daun sirih merah dengan aktivitas antiangiogenesis.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Obat Tradisional
Obat tradisional Indonesia merupakan warisan budaya bangsa sehingga
perlu digali, diteliti dan dikembangkan agar dapat digunakan lebih luas oleh
masyarakat. Definisi obat tradisional ialah bahan atau ramuan bahan yang berasal
dari tumbuhan, hewan, mineral, sediaan sarian (galenik) atau campuran dari bahan
tersebut, yang secara turun temurun telah digunakan untuk pengobatan
berdasarkan pengalaman (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,
2000).
Keamanan dan mutu obat tradisional tergantung dari bahan baku,
prosedur dan pelaksanaan pembuatan, peralatan yang digunakan, pengemasan
termasuk bahan serta personalia yang terlibat dalam pembuatan obat tradisional
(Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1994). Bahan-bahan ramuan
obat tradisional seperti bahan tumbuh-tumbuhan, bahan hewan, sediaan sarian
atau galenik yang memiliki fungsi, pengaruh serta khasiat sebagai obat, dalam
pengertian umum kefarmasian bahan yang digunakan sebagai simplisia. Simplisia
adalah bahan alamiah yang dipergunakan sebagai obat yang belum mengalami
pegolahan apapun juga dan kecuali dinyatakan lain berupa bahan yang
dikeringkan (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1999).
WHO merekomendasikan penggunaan obat tradisional termasuk herbal
dalam pemeliharaan kesehatan masyarakat, pencegahan dan pengobatan penyakit,
terutama untuk penyakit kronis, penyakit degeneratif dan kanker. WHO juga
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
mendukung upaya–upaya dalam peningkatan keamanan dan khasiat dari obat
tradisional (WHO,2003).
B. Sirih Merah
1. Taksonomi tumbuhan
Divisi : Spermatophyta
Anak Divisi : Angiospermae
Kelas : Dicotyledonae
Bangsa : Piperales
Suku : Piperaceae
Marga : Piper
Jenis : Piper crocatum Ruiz & Pav
(Backer and Van Der Brink, 1965).
2. Deskripsi tanaman
Tanaman sirih merah tumbuh menjalar. Batangnya bulat berwarna hijau
keunguan dan tidak berbunga. Daunnya bertangkai membentuk jantung dengan
bagian atas meruncing, bertepi rata, permukaannya mengkilap dan tidak berbulu.
Panjang daunnya bisa mencapai 15-20 cm. Warna daun bagian atas hijau bercorak
putih keabu-abuan bagian bawah daun berwarna merah hati cerah. Daunnya
berlendir, berasa sangat pahit, dan beraroma wangi khas sirih. Batangnya beruas
dengan jarak buku 5-10 cm. Di setiap buku tumbuh bakal akar. Sirih merah bisa
tumbuh dengan baik di tempat yang teduh dan tidak terlalu banyak terkena sinar
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
matahari, Jika terkena sinar matahari langsung pada siang hari secara terus
menerus warna merah daunnya bisa menjadi pudar, buram dan kurang menarik
(Pramono 2002; Sudewo,2005).
3. Kandungan kimia
Penelitian yang pernah dilakukan sebelumnya adalah penelitian
pemeriksaan skrining fitokimia daun sirih merah dan hasilnya menunjukkan
bahwa sirih merah mengandung flavonoid, alkaloid, saponin, senyawa polifenolat,
tanin, dan minyak atsiri sebagai hasil metabolit sekunder yang tidak penting bagi
kelangsungan hidup tanaman, namun memiliki fungsi untuk berkompetisi dengan
tanaman lainnya. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Subarnas,
Susilawati, Mulyasari, (2008) sirih merah mengandung flavonoid, saponin,
alkaloid, polifenol, tanin, kuinon, steroid dan mono-seskuiterpen. Senyawa
flavonoid dan polifenolat bersifat antioksidan, antidiabetik, antikanker, antiseptik
dan antiinflamasi. Senyawa alkaloid mempunyai sifat antineoplastik yang juga
ampuh menghambat pertumbuhan sel-sel kanker (Sudewo,2005).
Kandungan kimia lainnya yang terdapat pada daun sirih merah adalah
hidroksikavikol, kavikol, kavibetol, karvakrol, eugenol, p-simen, sineol,
kariofilen, kadimen, estragol, terpenena dan fenil propanoid (Anonim, 2007).
Karena banyaknya kandungan senyawa kimia bermanfaat inilah daun sirih merah
memiliki manfaat yang sangat luas sebagi bahan obat. Karvakrol bersifat
desinfektan, antijamur, sehingga bisa digunakan untuk obat antiseptik pada bau
mulut dan keputihan, eugenol dapat digunakan untuk mengurang rasa sakit,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
sedangkan tanin dapat digunakan untuk mengobati sakit perut (Anonim,2007).
Menurut Robinson (1995) flavonoid berfungsi sebagai antioksidan dan antibakteri
dengan cara membentuk senyawa kompleks dengan protein ekstraseluler, protein
terlarut, serta mengganggu integritas membran sel bakteri.
Alkaloid merupakan komponen organik yang mengandung nitrogen yang
biasanya bersifat basa serta mempunyai aktivitas biologi (Pringgoutomo, 2007;
Sudewo,2005). Beberapa alkaloid diketahui memiliki aktivitas antikanker melalui
interaksi dengan RNA polimerase dan DNA topoisomerase. Senyawa alkaloid
seperti vinkristina dan vinblastina dapat menghambat RNA polimerase,
vinblastina berperan dalam penghambatan pembelahan sel, yaitu pada tahap
metafase (Grotewold,2006). Alkaloid juga memiliki kemampuan sebagai
antibakteri dengan cara mengganggu komponen penyusun peptidoglikan pada sel
bakteri, sehingga lapisan dinding sel tidak terbentuk secara utuh dan
menyebabkan kematian sel tersebut (Juliantina, dkk., 2009).
Flavonoid merupakan kandungan khas dari tumbuhan hijau, hampir
selalu ada di seluruh bagian tumbuhan termasuk daun karena diketahui sebagai
pigmen yang bertanggung jawab pada warna daun, akar, tepung sari, kulit kayu,
bunga, nektar, buah dan biji. Flavonoid terdapat pada seluruh dunia tumbuhan dan
saat ini flavonoid sedang banyak diperbincangkan karena peran aktifnya dalam
efek pencegahan konsumsi makanan yang berasal dari tumbuh-tumbuhan terhadap
penyakit-penyakit kronik, termasuk tumor solid (Fotsis, dkk., 1997;
Markham,1988).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Beberapa penelitian tentang flavonoid merekomendasikan kemungkinan
aksinya sebagai senyawa kimia yang mampu menghambat kanker dan diantaranya
melaui penghambatan angiogenesis. Beberapa diantaranya adalah resveratrol dan
kuersetin. Keduanya mampu mengahambat aspek-aspek angiogenesis proliferasi,
migrasi sel endotelial dan pembentukan pipa pembuluh darah (Igura, Otha, Kroda
dan Kaji, 2001).
Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol umumnya
terikat pada gula sebagai glikosida dan aglikon (Harborne, 1987). Flavonoid telah
menunjukkan peran umumnya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik,
antivirus, antihistamin, antihipertensi, dan aktivitas vasodilatator. Potensi
antioksidan flavonoid dapat digunakan untuk mencegah kerusakan oksidatif pada
pengendalian sejumlah penyakit. Beberapa senyawa flavonoid dapat menghambat
monoamin oksidase (MAO), protein kinase, DNA polimerase, hipoksigenase serta
terlihat efektif menaikkan antikanker dan agen kemopreventif kanker
(Robinson,1995; Grotewold,2006).
Tanin merupakan salah satu senyawa metabolit sekunder yang terdapat
pada tanaman dan disintesis oleh tanaman. Tanin tergolong senyawa polifenol
dengan karakteristiknya yang dapat membentuk senyawa kompleks dengan
makromolekul lainnya. Tanin dibagi menjadi dua kelompok yaitu tanin yang
mudah terhidrolisis dan tanin terkondensasi. Tanin yang mudah terhidrolisis
merupakan polimer gallic atau ellagic acid yang berikatan ester dengan sebuah
molekul gula, sedangkan tanin terkondensasi merupakan polimer senyawa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
flavonoid dengan ikatan karbon-karbon (Westendarp, 2006; Sofyan, Ahmad,
danJayanegara, 2008).
Minyak atsiri adalah cairan jernih berbau seperti tanaman asalnya.
Biasanya terdapat dalam kelenjar minyak, pembuluh-pembuluh sekresi atau
rambut kelenjar dari kelenjar aromatis. Kegunaan minyak atsri bagi tanaman
sendiri adalah menolak kehadiran binatang. Kebanyakan minyak atsiri bersifat
anti bakteri dan anti jamur yang kuat. Minyak atsiri berperan sebagai antibakteri
dengan cara mengganggu proses terbentuknya membran atau dinding sel sehingga
tidak terbentuk atau terbentuk tidak sempurna (Juliantina, dkk., 2009).
4. Khasiat dan kegunaan
Tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) merupakan salah
satu tanaman obat yang daunnya telah lama dikenal mempunyai khasiat obat
untuk menyembuhkan berbagai macam penyakit atau tanaman multifungsi. Di
daerah Jawa khususnya Yogyakarta, secara turun temurun dapat digunakan untuk
menyembuhkan berbagai macam penyakit seperti diabetes melitus, asam urat,
hepatitis, batu ginjal, hipertensi, radang liver, radang prostat, radang mata, maag,
kelelahan, kanker, nyeri sendi, menurunkan kadar kolesterol, mencegah stroke dan
memperhalus kulit.
Daun sirih merah dapat diremas-remas dan kemudian dioleskan pada
perut, dapat mengurangi sakit panas dan sakit empedu. Pada penyakit empedu
cairan hasil perasan juga diminum. Cairan ini mungkin juga dapat menyembuhkan
penyakit dysiria (sukar buang air kecil) dan penyakit gonorrhoe (kencing nanah)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
(Heyne,1987). Secara empiris sirih merah telah digunakan untuk mengobati
berbagai macam penyakit berbahaya, seperti kanker. Di daerah kalimantan barat
sirih merah telah lama digunakan dalam pengobatan kanker (Wicaksono, dkk.,
2009).
C. Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut
sehingga terpisah dari bahan yang tidak larut dengan pelarut cair. Senyawa aktif
yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan
minyak atsiri, alkaloid, flavonoid, dan lain-lain. Dengan diketahuinya senyawa
aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara
ekstraksi yang tepat (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 2000).
Cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif yang
berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa lainnya
dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa berkhasiat
yang diinginkan (Anonim, 2000). Pelarut etanol walaupun memiliki harga yang
cukup mahal, tetapi dapat dipertimbangkan sebagai penyari karena lebih efektif
(kapang, khamir dan kuman lebih sulit tumbuh dalam etanol di atas 20 %), tidak
beracun, netral, absorbsinya baik, dapat bercampur air dengan segala
perbandingan. Dan memerlukan waktu yang cukup singkat untuk pengeringan
(Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986).
Maserasi adalah proses penyarian simplisia menggunakan pelarut dengan
perendaman dan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
ruangan (kamar). Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam
rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut, karena adanya perbedaan
kosentrasi larutan zat aktif didalam sel dan diluar sel maka larutan terpekat
didesak keluar. Cairan penyari yang digunakan dapat berupa air, etanol, metanol,
etanol-air atau pelarut lainnya. Remaserasi berarti dilakukan penambahan pelarut
setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya. Remaserasi
berarti dilakukan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat
pertama, dan seterusnya (Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan,
2000).
Selain maserasi, proses ekstraksi lainnya dapat dilakukan dengan cara
perlokasi, refluks, sokletasi, digesti, infus, dekok, destilasi uap.
D. Kanker
Kanker adalah suatu penyakit sel dengan ciri gangguan atau kegagalan
mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostatis lainnya pada organisme
multiseluler. Sel kanker mempunyai ciri khusus yang membedakan dengan sel
normal (Hanahan dan Weinberg,2000). Kanker ditandai dengan poliferasi sel yang
tidak terkontrol dengan mengarah pada invasi jaringan di sekitarnya serta
menyebar ke bagian lain dalam tubuh (metastasis). Mutagen yang menyebabkan
kanker adalah karsinogen.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
a. Karsinogenesis
Karsinogenesis adalah suatu proses terjadinya kanker melalui mekanisme
multitahap yang menunjukkan perubahan genetik dan menyebabkan transformasi
progresif sel normal menjadi sel maligant (ganas) (Hanahan dan Weinberg, 2000).
Perubahan basa DNA (mutasi) merupakan perubahan seluler mendasar yang
menyebabkan terjadinya kanker. Kanker tidak berasal dari mutasi tunggal, namun
dibutuhkan akumulasi dari beberapa mutasi (3-20 mutasi) dalam karsinogenesis
(King, 2000; Lodish, dkk., 2000).
Karsinogenesis merupakan perubahan sel sehinggga sel dapat
melepaskan diri dari mekanisme pengaturan tubuh normal. Perkembangan sel-sel
kanker diawali oleh adanya klon sel yang telah mengalami perubahan genetik
pada gen-gen pengatur pertumbuhan. Sel-sel kanker pada stadium lanjut
umumnya telah mengalami perubahan genetik dalam jumlah yang relatif banyak
yang memacu sel-sel tersebut menjadi kehilangan kendali dalam
perkembangbiakannya (Dean, 1998).
Proses perkembangan kanker (karsinogenesis) terbagi menjadi 4 tahap
utama yaitu tahap inisiasi, tahap promosi, tahap progresif dan metastatis
(Schneider, 2000).
Inisiasi merupakan tahap awal dan cepat, pada tahap ini terjadi perubahan
genetik yang menetap akibat rangsangan bahan atau agen inisiator yang
menimbulkan proses inisiasi (Dalimartha,1999). Agen inisiator berupa suatu
senyawa kimia elektrofil atau senyawa yang dimetabolisme menjadi elektrofil,
kemudian setelah teraktivasi akan mengikat DNA menjadi bentuk yang tetap,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
selanjutnya sel yang terinisiasi akan diaktivasi oleh tumor promoting agent dan
menyebabkan pertumbuhan tumor (Levi,2000).
Tahap promosi tidak melibatkan perubahan struktural dalam genom
secara langsung, tetapi perubahan ekspresi gen dari sel yang terinisiasi. Perubahan
ini diduga terjadi dari interaksi perubahan genetik pada stadium inisiasi dan faktor
lingkungan yang disebut promoting agents yang berfungsi untuk pertumbuhan
stadium promosi dan menghantarkan tumbuh lebih lanjut menjadi stadium
progresi (King, 2000).
Stadium progresi lebih sering terjadi dari sel promosi, ditandai
munculnya neoplasma ganas diikuti perubahan genetik nyata yang melibatkan
perubahan struktur dalam inti sel/pada fase ini juga akan terjadi aktivasi onkogen
dan kehilangan fungsi dari enzim topoisomerase sehingga akan menyebabkan
karsinoma dan metastasis (Meiyanto,1999).
Tahap selanjutnya adalah metastasis meliputi beberapa langkah,
termasuk penyebaran sel kanker dari tumor primer, memasuki sistem sirkulasi
atau sistem lymphatik dan pencapaian pada permukaan jaringan yang baru dan
berkembang di situ. Dengan cara ini sel kanker berpotensi untuk dibawa kesemua
tempat dalam tubuh dan berkembang dimanapun diseluruh tubuh
(Schneider,2000).
Hubungan angiogenesis dengan metastasis disebutkan sebagai salah satu
cara penyebaran tumor secara hematogen dan limfogen. Sel-sel tumor
mengadakan penetrasi dengan cepat dan ikut aliran darah ke seluruh tubuh dan
menyebar ke organ lain (Folkman,1976). Lebih lanjut dilaporkan bahwa
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
metastasis tumor sangat tergantung pada angiogenesis yang dikaitkan dengan
urutan penyebarannya, yaitu sel yang akan menjadi anak sebar tidak dapat keluar
dari tumor primer, sebelum tumor primer dialiri pembuluh darah. Sesudah
mencapai organ yang dituju, sel anak sebar harus mengalami angiogenesis agar
dapat tumbuh mencapai ukuran yang secara klinis dapat dideteksi (
Folkman,1996).
b. Angiogenesis
Konsep utama dari perkembangan tumor adalah ketergantungannya pada
angiogenesis. Angiogenesis atau neovaskularisasi merupakan pertumbuhan
pembuluh-pembuluh darah baru pada jaringan tubuh. Pada keadaan fisiologi
normal seperti pada penyembuhan luka, perkembangan embrio, reproduksi dan
menstruasi, proses angiogenesis ini sangat bermanfaat. Pada pertumbuhan
penyakit salah satunya penyakit kanker, proses ini juga sangat penting karena
angiogenesis memungkinkan sel mendapatkan suplai nutrisi dan oksigen sehinga
dapat terus bertahan hidup (Papetti dan Herman, 2002).
Salah satu strategi penghambatan perkembangan kanker adalah dengan
menghambat proses angiogenesis. Sel kanker tumbuh dan berkembang dengan
mengambil nutrisi dan oksigen dari inang (host) dengan cara membentuk
pembuluh darah baru (angiogenesis). Penghambatan proses angiogenesis dari
kanker menyebabkan sel kanker mengalami penghambatan pertumbuhan,
kelaparan, dan akhirnya mati (Hanahan dan Weinberg, 2000).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
Angiogenesis juga berkembang menjadi sesuatu yang bersifat patologis
dan berhubungan dengan kanker, inflamasi, penyakit kulit dan penyakit mata.
Kondisi patologi angiogenesis ini dikarakterisasi oleh pembentukan pembuluh
darah baru dan penghancuran sel normal yang ada di sekitarnya. Terapi
menggunakan inhibitor angiogenesis merupakan suatu pendekatan yang relatif
baru untuk terapi anti kanker. Hal ini karena sel-sel tersebut umumnya stabil
sehingga memungkinkan mereka kurang berkembang menjadi obat yang resisten
secara cepat (Kerbel dan Folkman, 2002).
Secara umum angiogenesis dikontrol secara seimbang oleh faktor
proangiogenetik dan antiangiogenetik (Jain dan Carmeliet, 2001). Pada keadaan
sel yang normal, faktor-faktor ini berjalan seimbang, sedangkan pada sel yang
abnormal, faktor pemicu angiogenesis melampaui jumlah yang seharusnya.
Angiogenesis diketahui dapat diaktivasi oleh bermacam-macam pemicu fisiologis
seperti gangguan keseimbangan oksigen dan diregulasi oleh faktor hormonal.
Faktor-faktor pertumbuhan utama yang mengarahkan terjadinya angiogenesis
adalah Vascular Endhotelial Growth Factor (VEGF) dan basic Fibroblast Growth
Factor (bFGF). Regulator positif lainnya adalah Angiopoetin-1, Angiotropin,
Angiogenin, Epidermal Growth Factor, Granulocyte Colony-Stimulating Factor,
Interleukin-1 (IL-1) IL-6, IL-8, Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Tumor
Necrosis Factor- α (TNF-α) (Gupta dan Qin, 2003).
Tubuh yang sehat mengatur secara sempurna keseimbangan dari
modulator-modulator angiogenesis. Secara umum angiogenesis ‘dimatikan’,
dengan lebih banyak memproduksi inhibitor daripada stimulator angiogenesis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
(Anonim, 2009). Stimulator angiogenesis dapat dibagi dalam 7 kategori :
1).Growth factors, 2). Proteases, 3). trace element, 4). oncogenes, 5).cytokines,
6). signal transduction molecules dan7). endogenous inducers (Brem,1999).
Faktor pertumbuhan mengontrol pembelahan sel yang dibutuhkan secara
cepat baik pada perkembangan CAM maupun pertumbuhan tumor yang
berhubungan dengan angiogenesis. Pada proses angiogenesis tersebut, faktor
angiogenesis akan merangsang ekspresi COX-2. Cyclooxygenase-2 (COX-2) akan
mengkatalisis perubahan asam arakhidonat menjadi prostaglandin (PG),
selanjutnya PG akan merangsang proliferasi sel endotelial (Leahy, Koki dan
Masferrer, 2003).
Proses angiogenesis terjadi dalam tiga fase. Fase yang pertama yaitu
produksi faktor perumbuhan oleh kanker yang akan berikatan dengan reseptornya
di sel endothelial pertumbuhan darah lama. Inisiasi ini menstimulasi terjadinya
destabilisasi dari pembuluh darah lama oleh angiopoetin. Fase kedua yaitu fase
proliferasi sel endothelial lokal yang kemudian bermigarasi dari faktor-faktor
pertumbuhan yaitu kanker dimana pada fase ini membutuhkan perubahan model
yang luas dari matriks ekstra seluler (MES) melalui digesti protease terhadap
glikoprotein. Apabila MES kontak dengan sel endothelial (yang telah menjadi
aktif) maka akan mengahasilkan khemotaksis, yang kemudian mengarahkan sel
endhotelial menuju kanker, sehingga terbentuk kapiler-kapiler baru di dalam dan
di sekitar kanker. Fase yang terakhir ialah maturasi dan differensiasi dari sel-sel
endothelial serta pembentukan basalis dan pengarahan sel-sel pendukung (King,
2000; Ng dan D’Amore, 2001).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
Inhibitor angiogenesis dibagi menjadi dua kelas yaitu inhibitor secara
langsung dan tidak langsung. Inhibitor agiogenesis secara langsung dapat
mencegah sel-sel vaskular endotelial berpoliferasi dan bermigrasi atau
menghindar dari kematian sel pada respon spektrum dari protein proangigenik.
Contoh protein proangiogenik yaitu VEGF, bFGF, IL-8, plateled-derived growth
factor (PDGF) dan PD-EGF. Inhibitor angiogenesis langsung tidak begitu
menimbulkan resistensi karena targetnya adalah sel endotelial yang stabil secara
genetik. Contoh inhibitor angiogenesis secara langsung adalah vitaxin, angiostatin
dan yang lainnya. Inhibitor angiogenesis yang tidak langsung, umunya dapat
mencegah ekspresi atau menghambat aktivitas dari protein tumor yang
mengaktifkan angiogenesis, atau juga menghambat ekspresi reseptor protein
tumor pada sel endotelial seperti bFGF, VEGF dan TGF. Protein-protein yang
dihasilkan oleh sel tumor merupakan produk dari ongkogen yang mengarahkan
pada angiogenesis (Kerbel dan Folkman, 2002).
c. basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)
Basic fibroblast grow factor (bFGF) disebut juga FGF-2 adalah suatu
polipeptida yang menginduksi proliferasi, migrasi dan produksi protease pada
kultur sel endothelial sel dan neovaskularisasi in vivo. bFGF mampu berinteraksi
dengan sel endothelial melalui reseptor FGF tirosin kinase dan reseptor heparan
sulphate proteoglycan (HSPGs) di permukaan sel dan di matriks ekstraseluler.
Jadi, bFGF berkaitan dengan matriks ekstraseluler endothelial in vitro dan in vivo
(Ribatti, dkk., 1997).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
bFGF produksinya sedikit pada sel normal namun meningkat pada
keadaan kanker dan pada sel normal yang beroksigen rendah. Faktor pertumbuhan
VEGF dan FGF mempunyai efek sinergis pada sel endothelial dan dapat disimpan
sebagai kompleks inaktif dengan proteoglikan matriks ekstraseluler seperti
heparan dan bentuk aktifnya akan dilepaskan oleh digesti matriks ekstraseluler.
Angiogenesis tidak hanya berkaitan dengan proliferasi tapi juga proteolisis dan
kemotaksis, sehingga FGF merupakan suatu faktor angiogenik yang poten,
mampu menstimulasi proliferasi, sekresi protease, dan kemotaksis sel endothelial
(King,2000).
Fibroblast Growth Factor (FGF) merupakan faktor angiogenik yang juga
dapat membentuk kompleks dengan heparin. Kompleks heparin-FGF membentuk
suatu struktur yang tahan terhadap panas dan protease. Ikatan dengan heparin juga
menyebabkan terjadinya bentuk dimer dan oligomer dari FGF, yang akan
meningkatkan efisiensi aktivasi sel menyusul terjadinya ikatan antara FGF dengan
reseptornya. b-FGF terdapat pada membran basal, matriks ekstraseluler sub
endotel pembuluh darah. b-FGF berperan dalam pembentukan tumor, memediasi
proses angiogenesis, dan juga penyembuhan luka (King, 2000).
Protein Vascular Endothelial Growth Factor Recetor (VEGFR) dan
Cyclooxygenase 2 (COX-2)adalah protein yang berperan penting dalam proses
angiogenesis. COX-2 terbukti diekspresikan berlebihan pada sel kanker. Enzim ini
memacu pembentukan prostaglandin yang akan menstimulasi sintesis Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF) sehingga dapat berikatan dengan reseptornya
yaitu Vascular endothelial Growth factor Receptor (VEGFR) untuk menginduksi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
proses angiogenesis (OtaBamba, Kato, Kawamoto, Yoshida dan Fujiwara, 2003).
Oleh karena itu, penghambatan terhadap kedua protein ini dapat menghambat
pembentukan pembuluh darah baru pada sel kanker.
E. Chorioallantoic Membrane
Alantois merupakan salah satu membran ekstra embrionik. Membran ini
mempunyai fungsi yang cukup penting karena dapat membantu keperluan selama
perkembangan janin embrional tetapi tidak tergabung dalam tubuh hewan dewasa
karena akan mati pada saat penetasan tiba. Alantois terbentuk dari lapisan
endoderma dan mesoderma splanchnis ekstra embrional. Dalam
perkembangannya akan bergabung dengan korion membentuk membran korio
alantois (Patten danCarlson, 1978).
Membran korio alantois akan muncul pada hari ke-4 atau hari ke-5 yang
diikuti dengan pertumbuhan pembuluh darah yang meluas diatas permukaan
kuningtelur dan segera menutupi seluruh daerah tersebut (Kninghton, Ausprunk,
Tapper, dan Folkman, 1977). Membran yang sangat kaya dengan pembuluh darah
ini berhubungan dengan sirkulasi embrionik melalui arteri dan vena alantois.
Karena adanya sirkulasi ini, maka pertukaran oksigen dan karbon dioksida yang
dibutuhkan oleh embrio akan berlangsung. Selain berfungsi sebagai sistem
sirkulasi, tempat pernapasan dan bertanggung jawab terhadap perkembangan
embrio, bagian ini juga berfungsi sebagai tempat pembuangan dan pencernaan
(Patten dan Carlson, 1978).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
Chorioallantoic Membrane (CAM) merupakan metode yang sangat
sederhana untuk mempelajari angiogenesis in vivo. Uji ini banyak digunakan
untuk studi angiogenesis dan invasi tumor dari kanker kolorektal, prostat, otak
dan rahim (Lokman, dkk., 2012).
Penelitian tentang angiogenesis menggunakan metode CAM memiliki
beberapa kelebihan, yaitu pada membran ini terdapat banyak pembuluh darah,
sehingga pengamatan terhadap angiogenesis mudah dilakukan metodenya
sederhana dan tidak mahal. Namun demikian terdapat pula kelemahan pada
metode ini seperti keberadaan pembuluh darah asal yang dapat mengganggu
pengamatan (Ribatti, dkk., 1997).
F. Landasan Teori
Salah satu cara penghambatan perkembangan kanker adalah dengan
menghambat proses angiogenesis. Sel kanker tumbuh dan berkembang dengan
mengambil nutrisi dan oksigen dari inang (host) dengan cara membentuk
pembuluh darah baru. Penghambatan proses angiogenesis dari kanker inilah yang
menyebabkan sel kanker mengalami penghambatan pertumbuhan, kelaparan dan
akhirnya mati (angiogenesis) (Hanahan dan Weinberg, 2000).
Berdasarkan penelitian Neritika (2008), ekstrak etanol daun sirih merah
terbukti memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel kanker payudara T47D. Pada
Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah Terhadap Kultur Sel Raji yang
dilakukan oleh Frandita (2009), menunjukkan bahwa fraksi etanol daun sirih
merah kemungkinan memiliki efek sitotoksisitas terhadap kultur sel raji. Hal
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
inilah yang mendasari pemilihan pelarut etanol pada penelitian ini. Etanol mampu
menarik senyawa aktif yang bersifat polar, dan diharapkan mampu menarik
senyawa flavonoid dari daun sirih merah karena seperti yang telah diketahui,
senyawa flavonoid mampu menghambat kanker dan diantaranya melaui
penghambatan angiogenesis.
Pada penelitian ini, pelarut etanol digunakan karena etanol dapat
dipertimbangkan sebagai penyari dimana etanol memiliki sifat yang lebih efektif
(kapang, khamir, dan kuman lebih sulit tumbuh dalam etanol di atas 20%), tidak
beracun, absorpsinya baik, dapat bercampur air pada segala perbandingan, dan
dibutuhkan waktu yang singkat untuk pengeringan. Etanol dapat melarutkan
alkaloid, minyak atsiri, glikosida, kurkumin, kumarin, antrakinon, flavonoid,
steroid, dammar, klorofil, lemak, tannin, dan saponin. Dengan demikian zat
pengganggu yang larut hanya terbatas (Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan
Makanan, 1986).
Metode CAM dipilih karena pada metode ini terdapat banyak pembuluh
darah, sehingga pengamatan terhadap angiogenesis mudah dilakukan (Patten dan
Carlson, 1978). Daun sirih merah telah diketahui memiliki berbagai khasiat yang
disebabkan oleh kandungan senyawa aktif antara lain flavonoid, alkaloid, tanin
dan minyak atsiri. Beberapadari flavonoid terlihat efektif sebagai antikanker dan
agen kemopreventif kanker, sedangkan beberapa senyawa alkaloid diketahui
memiliki aktivitas antikanker melalui interaksi dengan RNA polimerase dan DNA
topoisomerase (Sudewo,2005).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
G. Hipotesis
1. Ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis pada
chorioalantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio yang diinduksi bFGF.
2. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak daun sirih merah pada CAM telur ayam
berembrio yang diinduksi bFGF maka aktivitas antiangiogenesisnya semakin
besar.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan
rancangan lengkap pola searah. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium
Farmakognosi-Fitokimia dan Laboratorium Steril Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Gadjah Mada.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel utama
a. Variabel bebas. Variabel bebas berupa konsentrasi ekstrak etanol daun
sirih merah.
b. Variabel tergantung. Variabel tergantung berupa banyaknya pembuluh
darah baru.
2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali
yaitutempat tumbuh tanaman, cara panen, cara pengeringan dan pembuatan
simplisia, serta jumlah (gram) daun segar yang digunakan.
b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali
yaitu cuaca, musim, dan kelembaban ruangan.
28
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
3. Definisi Operasional
a. Pembuluh darah baru adalah pembuluh darah yang tipis disekitar
paper disc.
b. Antiangiogenesis adalah pengahambatan pertumbuhan pembuluh
darah baru.
C. Bahan Penelitian
Bahan-bahan yang digunakan antara lain : daun sirih merah (Piper
crocatum Ruiz & Pav.), Chorioallantoic Membrane (CAM) yang berasal dari
telur ayam Standard Patogen Free (SPF) dalam kondisi terinkubasi, larutan
bFGF, Phosphate Buffer Saline (PBS), Dimethyl Sulfoxide (DMSO), aquadest
steril, aquabidest steril, etanol 70%, larutan yodium, kertas payung, kapas, cotton
buds, paper disc berisi ampisilin, kertas Whatman filter.
D. Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain : oven, ayakan,
bejana maserasi, rotary evaporator, shaker, corong Buchner, chamber, labu alas
bulat, Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, mikropipet, inkubator, lampu spiritus,
teropong telur, mini drill, gunting bengkok, gunting bedah, pinset, scalpel,
kamera, kaca pembesar dan alat-alat gelas.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan bahan yang
digunakan benar-benar ekstrak daun sirih merah dengan cara mencocokkan
tanaman dengan kunci determinasi (Backer dan Brink, 1965).
2. Pengumpulan bahan uji
Bahan uji penelitian ini adalah simplisia daun sirih merahyang diperoleh
dari Sleman, Yogyakarta. Pemanenan dilakukan pada bulan November 2013.
3. Preparasi ekstrak etanol daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.).
Daun sirih merah yang telah dikumpulkan, dibersihkan di bawah air
mengalir untuk menghilangkan kotoran yang menempel pada daun tersebut.
Setelah itu dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 500C. Tujuan
pengeringan yaitu untuk mengurangi kandungan air dan mencegah pertumbuhan
mikroba yang mungkin terjadi. Simplisia yang kering kemudian digiling dengan
blender hingga menjadi serbuk halus, kemudian di ayak dengan ayakan. Serbuk
simplisa daun sirih merah ditimbang sebanyak 100 gram dan dituang kedalam
bejana maserasi. Kemudian ditambah etanol 200 mL dan dicampur homogen.
Campuran dimaserasi pada suhu ruangan selama 2 hari. Kemudian disaring
dengan kertas Whatman filter dengan corong Buchner. Lalu filtrat diuapkan
pelarutnya dengan suhu 500C hingga diperoleh ekstrak kental daun sirih merah.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
4. Orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih merah
Orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih merah dilakukan dengan
menggunakan pelarut Dimethyl Sulfoxide (DMSO). Pelarut ini umum digunakan
sebagai pelarut untuk uji antiangiogenesis menggunakan metode CAM, dapat
disterilkan dan toksisitasnya rendah. DMSO ditambahkan pada beberapa mg
ekstrak sampai ekstrak larut, kemudian diencerkan dengan aquabidest steril.
Konsentrasi DMSO yang digunakan sekecil mungkin <2% (konsentrasi sitotoksik
DMSO 2%). Pada penelitian ini konsentrasi yang digunakan adalah 0,2 %
(Lampiran 6).
5. Sterilisasi alat
Alat-alat yang digunakan untuk uji antiangiogenesis dicuci bersih dan
dikeringkan kemudian dibungkus dengan kertas payung dan disterilkan dengan
pemanasan basah dalam autoklaf, suhu 121oC selama 15-30 menit.
6. Pembuatan larutan uji dan larutan basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)
a. Preparasi bFGF Sebagai Induktor Angiogenesis. bFGF yang
digunakan sebanyak 25 ng/µl menggunakan larutan Phosphate Buffer Saline(PBS)
pH 7,4 kemudian diencerkan sehingga didapat kadar 1 ng/µl. Preparasi bFGF ini
dilakukan secara aseptis di dalam Laminar Air Flow (LAF). Kadar bFGF yang
diberikan untuk setiap telur perlakuan terinduksi adalah 10 ng.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
b. Preparasi Sediaan Larutan Uji. Ekstrak etanol daun sirih merah
dilarutkan dengan DMSO – aquabidest steril kemudian dibuat seri konsentrasi
(0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml dan 0,2 mg/ml). Konsentrasi pelarut (DMSO – aquabidest
steril) disesuaikan dengan hasil orientasi kelarutan ekstrak etanol daun sirih
merah. Preparasi dilakukan secara aseptis dalam Laminar Air Flow.
7. Uji antiangiogenesis
Satu atau beberapa hari sebelum diberi perlakuan telur diinkubasi dalam
inkubator laboratorium pada suhu 37oC agar dapat menyesuaikan diri dengan
lingkungan barunya. Telur ayam usia 9 hari diberikan perlakuan. Tahap awal
perlakuan yaitu dengan membersihkan telur dari kotoran yang menempel di
cangkang telur menggunakan alkohol 70%. Telur diberi tanda pada kerabang telur
yang meliputi batas ruang udara, lokasi embrio dan daerah yang akan dibuat segi
empat (jendela) berukuran 1x1 cm di atas embrio menggunakan pensil. Lokasi
embrio diketahui melalui candling mengunakan cahaya lampu pada telur.
Kerabang telur pada bagian kutub yang mengandung ruang udara dan kerabang di
atas embrio dibersihkan dengan larutan yodium. Selanjutnya pada ruang udara
tersebut dibuat lubang kecil dan pada daerah yang dibuat segi empat (jendela)
dibuat luka dengan menggunakan mini drill dan scalpel.
Udara dari ruang udara diaspirasi dengan bola karet penghisap sampai
berpindah dari kutub kerabang bagian atas telur. Perlakuan ini dilakukan dengan
posisi telur horizontal, di ruang gelap, dan melalui candling, sehingga ruang udara
buatan yang terbentuk di atas embrio dapat terlihat.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
Kerabang telur di atas embrio dipotong dengan mini drill untuk
membuat lubang segiempat dengan luas 1x1 cm. Melalui lubang ini bFGF dan
ekstrak uji diimplantasi ke dalam paper disc. Subyek uji berupa telur dibagi secara
acak dalam 6 kelompok (masing-masing perlakuan terdiri dari 3 telur), sebagai
berikut :
a. Kelompok I adalah telur dengan implantasi paper disc.
b. Kelompok II adalah kelompok dengan implantasi paper disc + pelarut
(DMSO – aquabidest steril).
c. Kelompok III kelompok kontrol bFGF + pelarut adalah kelompok
telur dengan implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + pelarut (DMSO –
aquabidest steril) sebanyak 10µl.
d. Kelompok IV, V dan VI merupakan telur yang digunakan untuk
melihat efek penghambatan ekstrak etanol daun sirih merah dengan 3 variasi
konsentrasi (0,05 mg/ml, 0,1 mg/ml dan 0,2 mg/ml). Kelompok ini adalah
kelompok telur implantasi paper disc termuati bFGF 10 ng + larutan ekstrak
etanol daun sirih merah dengan masing-masing konsentrasi sebanyak 10µl.
Setelah diberi perlakuan implantasi paper disc sesuai kelompok
perlakuan, lubang kecil pada daerah kutub dan lubang segiempat ditutup dengan
paraffin solidum yang dicairkan. Kemudian telur diinkubasi pada suhu 37oC
dengan kelembaban relatif 60% selama 3 hari atau 72 jam dengan inkubator,
kemudian telur dimasukkan ke dalam kulkas selama 24 jam. Telur dibuka (umur
12 hari) pada dengan cara menggunting cangkang telur menjadi dua bagian
dimulai dari cangkang yang dekat dengan rongga udara menggunakan gunting
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
bedah secara hati-hati agar tidak merusak membran korio alantois telur, setelah itu
membran korio allantois dibersihkan secara hati-hati dengan aquabidest steril.
Membran korio allantois yang melekat pada bagian cangkang yang terdapat paper
disc diamati secara makroskopik. Pengamatan makroskopis dilakukan secara
langsung dan tidak langsung. Pengamatan makroskopik secara langsung
dilakukan dengan bantuan kaca pembesar dan dikuantifikasi dengan menghitung
jumlah pembuluh darah baru yang terbentuk pada paper disc dan di sekitar paper
disc dan secara tidak langsung dengan foto kamera hasil CAM. Pembuluh darah
baru yang dihitung yaitu pembuluh darah yang tipis pada paper disc dan di sekitar
paper disc.Gambar 1. (a-g) memperlihatkan cara kerja uji angiogenesis dengan
metode CAM.
(a) (b) (c) (d)
(e) (f) (g)
Gambar 1. Memperlihatkan tahapan kerja uji CAM. (a). Telur ayam berembriodalam inkubator, (b). Prosescandling, (c). Menyedot rongga udara, (d).Membuat jendela pada telur, (e). Mengimplankan ekstrak uji dan bFGFke dalam paper disc, (f). Memasukkan paper disc, (g). Menutup jendeladengan parafin (Chrisnanto, 2009).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
F. Analisis Data
Analisis hasil uji penghambatan angioenesis pada CAM terinduksi bFGF
dilakukan secara makroskopis dengan mengamati respon penghambatan dari
ekstrak etanol daun sirih merah pada paper disc dan disekitar paper disc yang
melekat pada CAM.
Efek penghambatan tersebut diamati secara deskriptif berdasarkan
pemberian skor dengan menghitung banyaknya jumlah pembuluh darah baru yang
terbentuk pada paper disc dan disekitar paper disc menggunakan bantuan kaca
pembesar (lup). Setiap pembuluh darah baru diberi nilai satu. Kondisi
pertumbuhan pembuluh darah dapat dilihat pada gambar (Gambar 2.), dimana
skor 0 merupakan pertumbuhan pembuluh darah yang tidak mengalami
perubahan, skor 1 merupakan keadaan dimana terjadi sedikit peningkatan
kepadatan pembuluh darah baru, dan skor 2-5 merupakan pertumbuhan pembuluh
darah yang mengalami peningkatan secara bertahap. Untuk mengurangi
subyektifitas hasil pengamatan, maka pengamatan dilakukan oleh 4 orang
sehingga hasilnya berupa rata-rata pengamatan yang dilakukan 4 orang.
Pengamatan terhadap pembuluh darah baru yang terbentuk padapaper disc dan
disekitar paper disc harus dibedakan dengan pembuluh darah utama/asal dari
CAM. Pembuluh darah utama pada CAM mempunyai ukuran yang lebih besar,
sedangkan pembuluh darah baru merupakan pembuluh darah yang lebih
halus/kecil (Ribatti, Nico, Vacca dan Presta, 2006).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Gambar 2. Skoring semikuantitatif respon angiogenesis secara makroskopik.Skor 0. Menggambarkan kondisi pembuluh darah yang tidakberubah, skor 1. Terjadi sedikit peningkatan kepadatanpembuluh darah baru, skor 2, 3, 4, dan 5, menunjukkan adanyapeningkatan yang terjadi secara bertahap (Ribatti, dkk.,2006).
Data berupa persentase terbentuknya pembuluh darah baru
(angiogenesis) pada CAM dengan ekstrak etanol daun sirih merah. Selanjutnya
dihitung sebagai persentase pertumbuhan relatif terhadap kontrol bFGF + pelarut
dengan menggunakan rumus:
% pertumbuhan pembuluh darah = x 100%
Dimana :
a = jumlah rata-rata pembuluh darah baru pada perlakuan ekstrak
b = jumlah pembuluh darah baru pada kontrolbFGF + pelarut
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Data penelitian uji antiangiogenesis berupa banyaknya pembuluh darah
baru pada dan sekitar paper discdianalisis menggunakan analisis satu arah Anova
yang kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat adanya perbedaan
yang bermakna antar kelompok perlakuan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman sirih merah dilakukan untuk mengetahui dan
memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian ini sehingga
dapat menghindari terjadinya kesalahan dalam pengambilan tanaman uji.
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Fakultas
Biologi, Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, dengan cara mencocokkan
tanaman dengan kunci determinasi (Backer dan Brink, 1965). Hasil determinasi
menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah
tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) (Lampiran 3).
B. Preparasi Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
Daun sirih merah yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari
tanaman yang tumbuh di daerah Sleman, Yogyakarta. Pemanenan pada tanaman
dilakukan dalam waktu dan tempat yang sama, hal ini dilakukan untuk
meminimalkan variasi kandungan kimia yang ada. Daun sirih merah yang diambil
adalah daun sirih merah pada usia tertentu yakni tidak terlalu tua dan tidak terlalu
muda dengan harapan dapat memiliki kandungan kimia yang optimal.
Daun sirih merah yang telah terkumpul kemudian dibersihkan dengan air
mengalir untuk menghilangkan kotoran-kotoran yang menempel seperti tanah,
debu, serangga, mikroba dan benda asing lainnya karena dapat mempengaruhi
kemurnian daun sirih merah.
38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
39
Setelah daun sirih merah dicuci bersih, kemudian daun ditiriskan dan
dikeringkan dengan menggunakan lemari pengering. Suhu pengeringan dan lama
pengeringan harus diperhatikan yaitu 500C untuk menghindari rusaknya
kandungan kimia yang terdapat dalam simplisia. Pengeringan ini bertujuan untuk
mengurangi kadar air yang terdapat pada simplisia. Jika masih terdapat kandungan
air yang banyak pada simplisia, ini dapat menyebabkan terjadinya pertumbuhan
mikroorganisme dan dapat dimungkinkan simplisia akan ditumbuhi kapang yang
dapat menghasilkan toksin. Selain itu, air juga merupakan media terjadinya reaksi
enzimatik. Reaksi enzimatik ini dapat menyebabkan kandungan metabolit
sekunder yang terdapat pada daun akan dipecah menjadi senyawa baru.
Pengeringan dengan menggunakan oven lebih menguntungkan dibandingkan
pengeringan dengan menggunakan sinar matahari. Keuntungan pengeringan
dengan oven antara lain suhunya dapat diatur dan waktu yang dibutuhkan untuk
pengeringan lebih cepat karena tidak tergantung oleh cuaca. Menurut Monoi
(2006) sirih merah yang dikeringkan dengan menggunakan oven memiliki kadar
air dibawah 10%. Ini dapat diartikan bahwa daun sirih merah aman disimpan
karena kadar air dibawah 10% dapat mencegah terjadinya proses enzimatik dan
kerusakan oleh mikroba sepeti kapang, khamir dan bakteri.
Daun yang telah kering kemudian diserbuk dengan tujuan untuk
memperluas area kontak antar bahan yang akan disari dengan cairan penyari
sehingga kandungan kimia yang terkandung dapat tersari secara maksimal.
Setelah dilakukannya penyerbukan kemudian dilakukan pengayakan untuk
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
40
memisahkan partikel atau material yang didasarkan pada perbedaan ukuran. Hal
ini dilakukan agar proses ekstraksi semakin efektif dan efisien.
Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi. Penekanan utama
pada maserasi adalah tersedianya waktu kontak yang cukup antara pelarut dan
jaringan yang akan diekstraksi. Proses ekstraksi dilakukan secara maserasi dengan
menggunakan etanol 70% sebagai larutan penyari. Etanol 70% diharapkan dapat
menyari secara optimal seluruh kandungan zat aktif serbuk daun sirih merah. Pada
penelitian sebelumnya diketahui bahwa penggunaan ekstrak etanol 70% sirih
merah dapat memberikan efek sitotoksik terhadap beberapa kultur sel kanker
(Neritika, 2008). Selain itu, etanol merupakan penyari universal yang dapat
melarutkan banyak senyawa dalam sampel. Beberapa kelebihan etanol sebagai
pelarut penyari adalah lebih selektif, kapang dan kuman sulit tumbuh dalam etanol
20% keatas, tidak beracun, netral, absorbansinya baik, dapat bercampur dengan
air pada segala perbandingan, dan panas yang diperlakukan untuk pemekatan
lebih selektif (Hargono, dkk., 1986).
Maserasi merupakan salah satu cara penyarian yang sangat sederhana.
Prinsip maserasi yaitu proses penyarian dan perendaman simplisia menggunakan
pelarut yang sesuai dengan beberapa kali penggijogan/pengadukan pada
temperatur ruangan (suhu kamar 250C). Perendaman menyebabkan larutan
penyari menembus dinding sel sehingga zat aktif akan terlarut. Zat aktif di dalam
sel akan terdesak ke luar sel akibat adanya perbedaan konsentrasi zat aktif. Proses
ini akan terus berulang sampai terjadi keseimbangan konsentrasi di dalam dan di
luar sel (Hargono, dkk., 1986). Pengadukan pada proses maserasi, dilakukan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
41
dengan bantuan shaker. Fungsi pengadukan adalah untuk meratakan cairan
penyari yang sudah jenuh oleh komponen terlarut, sehingga akan terjadi gradien
konsentrasi. Selain itu, penyarian juga dapat berlangsung lebih efektif akibat
meningkatnya kontak antara cairan penyari dengan sampel yang terjadi pada
proses pengadukan. Perendaman dilakukan dalam waktu 2 hari kemudian ekstrak
diuapkan agar larutan penyari menguap pada suhu 600C-650C dengan
menggunakan waterbath sehingga nantinya dapat diperoleh ekstrak kental.
Rendemen ekstrak etanol daun sirih merah kemudian dihitung, dimana bobot
ekstrak yang didapat dibagi bobot bahan yang digunakan kemudian dikalikan
100%. Hasil rendemen ekstrak etanol daun sirih merah yang diperoleh adalah
15,68%.
Keuntungan metode maserasi adalah cara pengerjaan dan peralatan yang
digunakan sederhana. Metode ini juga tidak menggunakan panas sehingga zat
aktif yang tidak tahan panas tidak mudah rusak dan dapat terekstraksi.
Kekurangannya adalah membutuhkan waktu pengerjaan yang lama tergantung
waktu perendaman dan juga membutuhkan pelarut yang cukup banyak.
C. Hasil Uji AngiogenesisEkstrak Etanol Daun Sirih Merah Pada
Chorioallantoic Membrane (CAM)
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah ekstrak etanol daun
sirih merah mempunyai aktivitas antiangiogenesis melalui penghambatan
angiogenesis yang dilakukan dengan mengunakan metode CAM yang terinduksi
bFGF dan untuk mengetahui hubungan antara peningkatan konsentrasi ekstrak
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
42
etanol daun sirih merah dengan aktivitas antiangiogenesisnya. Membran korio
alantois telur ayam berembrio merupakan salah satu media yang paling umum
digunakan untuk mempelajari respon angiogenesis karena memiliki banyak
kelebihan dibandingkan dengan media yang lain.
Kelebihan menggunakan media CAM antara lain adalah telur ayam
berembrio mudah didapatkan, relatif murah, mudah dikerjakan di laboratorium
dan lebih praktis (Ribatti, dkk., 1997). Kelebihan lainnya adalah dalam telur ayam
berembrio terdapat lingkungan tertutup dan terlindungi oleh cangkang telur,
sehingga aman, mudah dipegang dan mudah dipelihara selama masa inkubasi di
laboratorium. Lingkungan tertutup pada telur menjadi lebih konstan karena
adanya cairan ekstra embrionik dan beberapa membran pembungkus dalam telur
ayam berembrio (Evans, 1991). Selain kelebihan yang telah disebutkan tadi,
penelitian menggunakan media CAM juga mempunyai beberapa kelemahan yaitu
keberadaan pembuluh darah asal dan reaksi inflamasi yang tidak spesifik (Ribatti,
dkk., 1997). Selain itu, kuantifikasi hasil sering sangat subyektif sehingga sulit
untuk membandingkan hasil yang didapat.
Telur ayam berembrio yang digunakan untuk uji respon angiogenesis
dapat dilakukan setelah terbentuknya CAM pada hari ke-4 dan implantasi larutan
uji ke dalam CAM dapat dilakukan pada telur ayam berembrio yang berumur 5-16
hari (Patten dan Carlson, 1978). Pada penelitian ini, telur ayam berembrio dibeli
pada hari ke-4 dan kemudian diinkubasikan didalam inkubator dengan suhu 37-
400C. Hal ini dilakukan agar telur ayam tersebut dapat menyesuaikan diri dengan
lingkungan barunya sebelum diberi perlakuan. Perlakuan pada telur ayam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
43
berembrio dilakukan pada umur 9 hari, hal ini sesuai dengan pendapat Folkman
(1998) bahwa pada umur 9 hari, rongga udara telur sudah terlihat lebih jelas dan
embrio sudah tidak rentan terhadap pengaruh dari luar sehingga pengamatan
aktivitas antiangiogenik dapat dilakukan.
Pelarut yang digunakan pada penelitian ini adalah Dimethyl Sulfoxide
(DMSO). DMSO digunakan sebagai pelarut karena merupakan pelarut yang
umum digunakan pada rute pemberian in vivo dari substansi yang tidak larut air
(Santos, 2003). Pelarut ini memiliki toksisitas yang rendah, dapat disterilkan dan
umum digunakan sebagai pelarut untuk uji antiangiogenesis. Konsentrasi
sitotoksik dari pelarut DMSO adalah 2%, oleh karena itu sebisa mungkin
konsentrasi yang digunakan sekecil mungkin atau <2%. Pada penelitian ini,
konsentrasi DMSO yang digunakan adalah 0,2% (Lampiran 6).
Inhibitor angiogenesis yang digunakan adalah basic Fibroblast Growth
Factor (bFGF) yang kemudian diinduksi ke CAM. Mekanisme yang terjadi
adalah bFGF akan berinteraksi dengan sel endotelial melalui reseptor tirosin
kinase dan reseptor heparan sulfate proteoglycan (HSPGs) di permukaan sel.
Keseimbangan antara penyimpanan dan pelepasan bFGF di matriks ekstra seluler
mungkin adalah suatu pengaturan efek biologi dari faktor pertumbuhan ini di
endotelium. bFGF yang digunakan pada penelitian ini memiliki konsentrasi 25
ng/µl kemudian diencerkan dengan mengunakan larutan Phosphate Buffer
Saline(PBS) pH 7,4 sehingga didapat kadar 1 ng/µl, dan kadar yang akan
diberikan untuk setiap telurnya adalah 10 ng (Lampiran 5).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
44
bFGF merupakan salah satu faktor pertumbuhan yang sangat penting
dalam menginisiasi terjadinya angiogenesis dan telah banyak dipakai sebagai
induktor angiognesisdalam berbagai penelitian sebelumnya (Ribatti, dkk., 1997).
Dalam hal ini bFGF yang digunakan merupakan recombinanthuman bFGF yang
merupakan protein rekomendasi antara bFGF manusia dengan suatu protein
tertentu sebagai penanda. bFGF ini dapat menstimulasi angiogenesis dari jaringan
hospes dengan cara bekerja secara langsung pada endotel pembuluh darah yaitu
dengan mempengaruhi migrasi, poliferasi dan pembentukan dinding pembuluh
darah. Pada membran korio alantois itu sendiri, terdapat bFGF yang berperan
penting dalam pertumbuhan pembuluh darah selama perkembangan embrio ayam
(Ribatti, dkk., 2006). Pemberian bFGF pada penelitin ini dimaksudkan untuk
menginduksi terjadinya angiogenesis, sebagaimana yang terjadi pada keadaan
kanker, sehingga pengamatan efek antiangiogenesis ekstrak etanol daun sirih
merah lebih jelas dan kemungkinan mekanismenya lebih terarah.
Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah yang akan digunakan adalah
0,05; 0,1; dan 0,2 mg/ml. Ekstrak etanol yang digunakan kemudian dilarutkan
dengan DMSO – aquabidest steril sesuai dengan perhitungan (Lampiran 6).
Paper disc dalam penelitian ini digunakan sebagai media untuk
mengimplankan induktor angiogenesis dan ekstrak etanol daun sirih merah.
Penggunaan paper disc memiliki kelemahan terutama berkaitan dengan daya
serapnya, oleh sebab itu volume implantasi sediaan uji disesuaikan dengan daya
serap paper disc yang digunakan. Pengamatan pembuluh darah baru juga dapat
terganggu dengan adanya pembuluh darah asal dimana paper disc diimplankan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
45
dan adanya reaksi inflamasi non-spesifik sehingga menyulitkan ketika dilakukan
kuantifikasi respon angiogenesis. Namun kelemahan-kelemahan tersebut sedapat
mungkin dikontrol dengan adanya kelompok kontrol paper disc.
Uji ini dilakukan pada membran korio alantois telur ayam berembrio
dengan enam kelompok perlakuan dan masing-masing kelompok terdiri dari tiga
telur/replikasi. Enam kelompok perlakuan tersebut adalah kelompok I : kontrol
paper disc, kelompok II : kontrol pelarut+ paper disc, kelompok III : kontrol
bFGF+ pelarut+ paper disc, kelompok IV-VI : ekstrak etanol daun sirih merah +
paper discdengan konsentrasi berturut-turut adalah 0,05;0,1; dan0,2 mg/ml.
Pengamatan dilakukan secara makroskopis pada membran korio alantois
embrio ayam berumur 12 hari dimana sebelumnya telah diinkubasi terlebih dahulu
dalam inkubator selama 3 hari dengan suhu 37-400C dan dimasukkan ke freezer
selama 24 jam pada hari berikutnya dengan tujuan mematikan embrio
ayam.Pengamatan secara makroskopis ini dilakukan dengan menghitung jumlah
pembuluh darah baru yang terbentuk radial pada paper disc dan di sekitar paper
disc. Pembuluh darah yang terbentuk merupakan pembuluh darah percabangan
dari pembuluh darah asal/pembuluh darah utama yang secara makroskopis terlihat
sangat halus. Gambar 3 merupakan contoh gambaran makroskopis respon
angiogenesis pada korio alantois membran baik pada kelompok kontrol maupun
pada kelompok perlakuan.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
46
Gambar 3. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah.
Pengamatan secara makroskopis ini dilakukan oleh 4 orang dengan
tujuan untuk mengurangi subyektifitas pengamatan dan hasil perhitungan jumlah
pembuluh darah dari beberapa orang tersebut kemudian di rata-ratakan (Tabel I.).
Tabel I. Rerata jumlahpembuluh darah barudan standar deviasi padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah
Kelompok Perlakuan(n= 3)
Rerata Jumlah pembuluh darahbaru ± SD
Kontrol paper disc 14,33± 1, 15
Kontrol pelarut 13,00 ± 2,00
Kontrol bFGF + pelarut 23,33± 0,58Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 14,66± 2,30Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 12,33± 1,52Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 10,33± 0,57
Ekstrak etanol daunsirih merah 0,05
mg/ml + PD
Ekstrak etanoldaun sirih merah0,1 mg/ml + PD
Ekstrak etanoldaun sirih merah0,2 mg/ml + PD
paper disc (PD) pelarut + PD pelarut + PD bFGF+ pelarut + PD
46
Gambar 3. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah.
Pengamatan secara makroskopis ini dilakukan oleh 4 orang dengan
tujuan untuk mengurangi subyektifitas pengamatan dan hasil perhitungan jumlah
pembuluh darah dari beberapa orang tersebut kemudian di rata-ratakan (Tabel I.).
Tabel I. Rerata jumlahpembuluh darah barudan standar deviasi padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah
Kelompok Perlakuan(n= 3)
Rerata Jumlah pembuluh darahbaru ± SD
Kontrol paper disc 14,33± 1, 15
Kontrol pelarut 13,00 ± 2,00
Kontrol bFGF + pelarut 23,33± 0,58Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 14,66± 2,30Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 12,33± 1,52Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 10,33± 0,57
Ekstrak etanol daunsirih merah 0,05
mg/ml + PD
Ekstrak etanoldaun sirih merah0,1 mg/ml + PD
Ekstrak etanoldaun sirih merah0,2 mg/ml + PD
paper disc (PD) pelarut + PD pelarut + PD bFGF+ pelarut + PD
46
Gambar 3. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah.
Pengamatan secara makroskopis ini dilakukan oleh 4 orang dengan
tujuan untuk mengurangi subyektifitas pengamatan dan hasil perhitungan jumlah
pembuluh darah dari beberapa orang tersebut kemudian di rata-ratakan (Tabel I.).
Tabel I. Rerata jumlahpembuluh darah barudan standar deviasi padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah
Kelompok Perlakuan(n= 3)
Rerata Jumlah pembuluh darahbaru ± SD
Kontrol paper disc 14,33± 1, 15
Kontrol pelarut 13,00 ± 2,00
Kontrol bFGF + pelarut 23,33± 0,58Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 14,66± 2,30Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 12,33± 1,52Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 10,33± 0,57
Ekstrak etanol daunsirih merah 0,05
mg/ml + PD
Ekstrak etanoldaun sirih merah0,1 mg/ml + PD
Ekstrak etanoldaun sirih merah0,2 mg/ml + PD
paper disc (PD) pelarut + PD pelarut + PD bFGF+ pelarut + PD
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
47
Gambar 4. Diagram batang rata-rata jumlah pembuluh darah baru padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah
Data yang diperoleh kemudian diuji statistik menggunakan analisis satu
arah Anova yang kemudian dilanjutkan dengan uji Tukey untuk melihat adanya
perbedaan yang bermakna antar kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan.
Langkah pertama yang dilakukan pada uji statistik adalah menentukan apakah
kelompok uji tersebut terdistribusi normal atau tidak. Data dikatakan terdistribusi
normal apabila p>0,05.
Berdasarkan hasil uji tersebut data yang didapat menunjukkan bahwa
data terdistribusi normal dengan nilai masing-masing kelompok adalah kontrol
paper disc 0,766; kontrol pelarut 1,00; kontrol bFGF+ pelarut 0,766; konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah 0,05; 0,1; dan 0,2 mg/ml secara berturut-turut
adalah 0,766; 0,991 dan 0,766.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
48
Apabila data sudah terdistribusi normal, maka dapat dilanjutkan dengan
uji homogenitas dimana data dikatakan homogen apabila (p>0,05). Hasil yang
didapat menunjukkan bahwa data mempunyai varian yang homogen dengan hasil
0,176 sehingga analisis statistik dapat dilanjutkan dengan uji Tukey (Tabel II).
Tabel II. Hasil uji statistik pertumbuhan pembuluh darah baru antarkelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah
Kelompokperlakuan
(n= 3)
Kontrolpaperdisc
Kontrolpelarut
KontrolbFGF+pelarut
Ekstraketanol daunsirih merah0,05 mg/ml
Ekstraketanol daunsirih merah0,1 mg/ml
Ekstraketanol daunsirih merah0,2 mg/ml
Kontrol paperdisc - TB BB TB TB TB
Kontrol pelarut TB - BB TB TB TB
KontrolbFGF+pelarut
BB BB - BB BB BB
Ekstrak etanoldaun sirih
merah 0,05mg/ml
TB TB BB - TB BB
Ekstrak etanoldaun sirihmerah 0,1
mg/ml
TB TB BB TB - TB
Ekstrak etanoldaun sirihmerah 0,2
mg/ml
TB TB BB BB TB -
Keterangan :TB : Berbeda Tidak Bermakna (p > 0,05)BB : Berbeda Bermakna (p < 0,05)
Pengamatan makroskopis terhadap CAM kelompok kontrol paper
disc(Gambar 3) menunjukkan bahwajumlah pembuluh darah di dalam paper disc
maupun pada daerah di sekeliling paper disc merupakan pertumbuhan pembuluh
darah secara normal denganrerata jumlah pembuluh darah baru ± SD14,33 ± 1,15
(Tabel I). Berdasarkan hasil pengamatan tersebut, maka paper disc dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
49
digunakan sebagai pembawa dalam metode ini, karena penggunaan paper disc
tidak mempengaruhi angiogenesis pada CAM dankontrol paper disc juga dapat
digunakan sebagai pembanding dengan kelompok perlakuan.
Pada kelompok kontrol pelarut (Gambar 3), menunjukkan hasil rerata
jumlah pembuluh darah baru ± SD adalah 13,00 ± 2,00 (Tabel I). Berdasarkan
hasil pengamatan tersebut, dapat dilihat bahwa kelompok kontrol pelarut memiliki
perbedaan yang tidak bermakna dengan kelompok kontrol paper discdengan hasil
statistik 0,879 (p>0,05) (Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa pelarut yang
digunakan tidak memberikan efek angiogenesis pada CAM yang artinya pelarut
dapat terus digunakan sebagai pelarut ekstrak.
Selanjutnya pada pengamatan kelompok kontrol bFGF+ pelarut (Gambar
3), tampak banyak sekali pertumbuhan pembuluh darah baru atau neovaskularisasi
yang terbentuk baik didalam paper disc maupun pada daerah disekitar/disekeliling
paper disc dengan rerata jumlah pembuluh darah baru ± SDadalah 23,33 ± 0,58
(Tabel I). Pertumbuhan pembuluh darah baru yang terbentuk, membentuk pola
radial menuju ke arah paper disc yang telah dimuati bFGF, disekitar paper disc
sendiri juga banyak terdapat percabangan pembuluh darah baru dari pembuluh
darah yang telah terbentuk sebelumnya/pembuluh darah utama. Kelompok kontrol
bFGF menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan kelompok kontrol paper
disc dan kontrol pelarut dengan hasil statistik 0,000 (p<0,05) (Tabel II). Hal ini
menunjukkan bahwa pemberian bFGF dapat memicu pertumbuhan pembuluh
darah baru atau memicu terjadinya angiogenesis pada CAM.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
50
Pada kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml
menunjukkan hasil rerata jumlah pembuluh darah baru ± SD adalah 14,66 ± 2,30
(Tabel I). Dilihat secara statistik, konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05
mg/ml menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan kelompok kontrol bFGF
dengan hasil statistik 0,000 (p<0,05) dan menunjukkan perbedaan tidak bermakna
dengan kontrol paper disc dimana hasil statistik adalah 1,000 (p>0,05) (Tabel II).
Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 memberikan
respon antiangiogenesis pada CAM dimana keadaannya hampir sama dengan
kontrol paper disc.
Selanjutnya pada kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah
0,1 mg/ml, hasil rerata jumlah pembuluh darah baru ± SDyaitu 12,33 ± 1,52
(Tabel I). Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml dengan kontrol
bFGF menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan hasil statistik 0,000
(p<0,05). Dibandingkan dengan kontrol paper disc, konsentrasi ekstrak etanol
daun sirih merah 0,1 mg/ml menunjukkan perbedaan tidak bermakna dengan hasil
statistik adalah 0,600 (p>0,05) (Tabel II). Hasil ini menunjukkan bahwa
konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml memberikan respon
antiangiogenesis pada CAM. Dilihat dari rerata ekstrak etanol daun sirih merah
0,1 mg/ml dengan kontrol paper disc didapatkan penurunan jumlah pembuluh
darah baru dimana jumlah pembuluh darah baru pada ekstrak etanol daun sirih
merah 0,1 mg/ml lebih sedikit dibandingkan dengan kontrol paper disc.
Hasil rerata jumlah pembuluh darah baru ± SD pada kelompok
konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/mladalah 10,33 ± 0,57 (Tabel
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
51
I). Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml dengan kontrol bFGF
menunjukkan adanya perbedaan bermakna dengan hasil statistik 0,000 (p<0,05)
dan menunjukkan perbedaan tidak bermakna dengan kontrol paper disc dimana
hasil statistik adalah 0,060 (p>0,05) (Tabel II). Hal ini menunjukkan bahwa
ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml memberikan respon antiangiogenesis
pada CAM. Dilihat dari rerata ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml dengan
kontrol paper disc didapatkan penurunan jumlah pembuluh darah baru dimana
jumlah pembuluh darah baru pada ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml lebih
sedikit dibandingkan dengan kontrol paper disc.
Pada kelompok perlakuan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah
0,05 mg/ml dengan kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1
mg/ml terdapat perbedaan tidak bermakna dengan hasil statistik 0,450 (p>0,05)
(Lampiran 13). Hal ini menunjukkan bahwa tidak adanya kekerabatan antara
konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml dengan konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml.
Pada kelompok perlakuan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah
0,05 mg/ml terdapat perbedaan bermakna dengan kelompok perlakuan konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml dimana hasil statistiknya adalah 0,038
(p<0,05). Hasil statistik ini menunjukkan bahwa adanya kekerabatan antar
konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml dengan konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml.
Pada kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml
terdapat perbedaan tidak bermakna dengan kelompok konsentrasi ekstrak etanol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
52
daun sirih merah 0,2 mg/ml dengan hasil statistik 0,600. (Lampiran 6). Hasil ini
menunjukkan tidak adanya kekerabatan antara konsentrasi ekstrak etanol daun
sirih merah 0,1 mg/ml dengan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2
mg/ml.
Hasil statistik yang didapat pada kelompok perlakuan menunjukan
adanya responpenghambatan pembuluh darah baru (antiangiogenesis) terhadap
kontrol bFGF, apabila dibandingkan dengan kelompok kontrol paper disc. Hal ini
membuktikan bahwa pemberian ekstrak etanol daun sirih merah dapat
menghambat pertumbuhan pembuluh darah baru. Dari ketiga konsentrasi yang
diberikan, konsentrasi yang paling efektif/bagus adalah ekstrak etanol daun sirih
merah dengan konsentrasi 0,05 mg/mL. Hal ini dilihat dari hasil rerata yang
ditunjukkan oleh konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/mL
mendekati hasil rerata dari kontrol paper disc.Hasil rerata pada konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 dan 0,2 mg/mL mengalami menurunan jumlah
pembuluh darah baru jika dibandingkan dengan kontrol paper disc sehingga dapat
dikatakan untuk kedua konsentrasi ini menunjukkan hasil yang kurang optimal.
Hasil antar konsentrasi menunjukkan tidak adanya kekerabatan dengan
aktivitas antiangiogenesis pada CAM. Hal ini mungkin dikarenakan sampel yang
digunakan terlalu sedikit, sehingga nilai dari standar deviasi masing-masing
konsentrasi menjadi sangat tinggi sehingga perbedaan antar konsentrasi menjadi
tidak bermakna. Oleh karena itu, perlu pengembangan lebih lanjut dengan
menggunakan varian konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah agar nantinya
didapat kekerabatan antar konsentrasi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
53
Tabel III. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompokkontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirih merah
KelompokPerlakuan(n= 3)
Pertumbuhan pembuluhdarah baru (%)
Kontrol paper disc 61,42
Kontrol pelarut 55,72
Kontrol bFGF + pelarut 100Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 62,83Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 52,85Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 44,27
Tabel III menunjukkan respon angiogenesis relatif menggunakan rata-
rata pertumbuhan pembuluh darah baru dari masing-masing kelompok konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah dibandingkan dengan rata-rata kelompok kontrol
bFGF + pelarut.
Gambar 5. Persentase pertumbuhan pembuluh darah barupada kelompok kontroldan kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah.
0
20
40
60
80
100
120
kontrol blankkontrol pelarutkontrol bFGFKonsentrasi 0,05 mg/mlKonsentrasi 0,1 mg/mlKonsentrasi 0,2 mg/ml
pers
enta
se p
embu
luh
dara
h ba
ru
61,42 55,72
100
62,8352,85
44,27
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
54
Dapat dilihat pada tabel III dan gambar 4 bahwa persentase pertumbuhan
pembuluh darah baru dari ekstrak etanol daun sirih merah 0,05; 0,1 dan 0,2 mg/ml
secara berturut-turut adalah 62,83%; 52,85% dan 44,27%. Aktivitas angiogenesis
dari larutan uji pada CAM embrio ayam dilihat dari proses pembentukan
pembuluh darah baru (neovaskularisasi) pada paper disc maupun disekitar paper
disc. Semakin besar presentase pertumbuhan pembuluh darah baru maka aktivitas
antiangiogenesisnya semakin kecil. Hasil pada penelitian ini menunjukkan bahwa
konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis
dilihat dari semakin kecilnya persentase pertumbuhan pembuluh darah baru yang
diperoleh yang ditandai dengan berkurangnya densitas pembuluh darah baru pada
paper disc maupun disekitar paper disc.
Sirih merah diketahui memiliki banyak kandungan senyawa yaitu
flavonoid, alkaloid, saponin, senyawa polifenolat, tanin, dan minyak atsiri
(Sudewo, 2005). Ekstrak etanol daun sirih merah kemungkinan mengandung
senyawa-senyawa yang bertindak sebagai inhibitor angiogenesis yang dapat
menurunkan jumlah pertumbuhan pembuluh darah baru. Beberapa kandungan
senyawa yang digunakan pada proses angiogenesis adalah senyawa golongan
flavonoid dan alkoloid (Igura, dkk.,2001; Grotewold, 20006). Diduga senyawa
flavonoid yang terkandung dalam sirih merah inilah yang berperan dalam proses
antiangiogenesis. Flavonoid diketahui mempunyai aktivitas sebagai antikanker.
Salah satu mekanisme flavonoid dalam menghambat pertumbuhan sel kanker
adalah dengan menghambat angiogenesis (Igura, dkk.,2001). Pada penelitian ini,
penyari yang digunakan bukan merupakan penyari murni yaitu etanol 70%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
55
sehingga kandungan senyawa aktif yang dapat larut dan tertarik dari ekstrak
tersebut belum diketahui secara pasti. Oleh karena itu, perlunya pengembangan
lebih lanjut untuk melakukan isolasi senyawa agar nantinya kandungan spesifik
pada sirih merah dapat diketahui secara pasti dan mekanisme aktivitas
antiangiogenesis dari senyawa tersebut juga dapat diketahui.
Rao, Gaikwad dan Barik (2010) juga melaporkan salah satu senyawa dari
tumbuhan yang memiliki potensi sebagai antikanker adalah flavonoid. Flavonoid
diketahui secara luas memiliki efek antikanker dan dapat menginduksi apoptosis.
Salah satu mekanisme flavonoid dalam menghambat pertumbuhan sel kanker
adalah dengan menghambat angiogenesis. Pada penelitian yang dilakukan Fotsis
dkk.,(1997) diketahui bahwa flovonoid yang terhidroksilasi mampu menghambat
angiogenesis secara in vitro. Tumbuhan dari spesies piper juga sangat potensial
untuk dikembangkan sebagai agen antikanker. Beberapa penelitian yang telah
dilakukan menunjukkan bahwa tumbuhan dari genus piper memiliki efek
sitotoksik. Ekstrak klorofom piper aborescens terbukti memiliki efek sitotoksik
terhadap kultur sel payudara , sel kanker prostat, dan sel kanker leukimia (Parmar,
dkk.,1997; Tsai dan Ho, 2005; Tabudravudan Jaspars, 2005). Minyak atsiri daun
Piper gaudichaudianum juga memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker (Peres,
dkk.,2009). Peperomia sui juga dilaporkan memiliki efek sitotoksik secara in vitro
(Cheng dan Chen, 2008).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
56
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa ekstrak etanol 70 % daun sirih
merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) dengan konsentrasi 0,05; 01 dan 0,2 mg/ml
mempunyai aktivitas antiangiogenesis, dimana konsentrasi yang paling bagus
ditunjukkan oleh konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml dengan
hasil rerata yang hampir sama dengan kontrol paper disc.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
57
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
1. Ekstrak etanol daun sirih merah memiliki aktivitas antiangiogenesis pada
chorioalantoic membrane (CAM) telur ayam berembrio yang diinduksi bFGF
dengan konsentrasi 0,05; 0,1 dan 0,2 mg/ml, dengan konsentrasi optimal
adalah 0,05 mg/ml.
2. Tidak adanya kekerabatan antara konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah
dengan aktivitas antiangiogenesis pada CAM telur ayam berembrio yang
diinduksi bFGF.
B. Saran
Dari hasil penelitian uji aktivitas antiangiogenesis ekstrak etanol daun
sirih merah yang diinduksi bFGF dengan metode CAM, maka disarankan untuk :
1. Melakukan penelitian lebih lanjut dengan memberikan variasi konsentrasi
ekstrak etanol daun sirih merah.
2. Melakukan isolasi senyawa untuk mengetahui senyawa spesifik yang
memiliki aktivitas antiangiogenesis dalam daun sirih merah.
57
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
58
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, DepartemenKesehatan Republik Indonesia.
Anonim, 2005, Kanker, http://www.groups.or.id/kanker.html, Diakses tanggal 9September 2013.
Anonim, 2007, Sirih Merah Sebagai Tanaman Obat Multifungsi,http://balitro.litbang.deptan.go.id, diakses tanggal 5 Juni 2014.
Anonim, 2009, Cancer, World Health Organization,http://www.who.int/cancer/en/, diakses tanggal 2 Agustus 2013.
Backer and Brink, V.B., 1965, Flora of Java, Wolters Mood Hoff N. V.,Netherlands, pp 167-173.
Brem, S., 1999, Angiogenesis and Cancer Control : From Concept to TherapeuticTrial, Moffitt Cancer Center & Reserch institute(http://www.medscape.com/cancercontrol/1999//v06.n02.brem/cc0605.02.brem-01.html), diakses tanggal 1 Agustus 2013.
Cheng, M., and Chen, I., 2008, Secondary Metabolites from Peperoma Sui, Chil,Chem, Soc, 53, 1539-1542.
Chrisnanto, E., 2008, Efek Antiangiogenesis Ekstrak Etanolik Kulit Buah JerukKeprok (Citrus reticulata) Terhadap Membran Korio Alantois (CAM)Ayam Terinduksi bFGF,Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Dalimartha, S., 1999, Ramuan Tradisional untuk Pengobatan Kanker, CetakanKedua, Penebar Swadaya Press, Jakarta.
Dean, M., 1998, Cancer as a Complex Developmental Disorder, CancerRes,58:5633-5636.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1986, Sediaan Galenik,Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1994, Petunjuk PelaksanaanPembuatan Obat Tradisional Yang Baik (CPOTB), Departemen KesehatanRepublik Indonesia, Jakarta.
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 1999, Pengujian BahanKimia Sintetik Dalam Obat Tradisional, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
59
Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan, 2000, Pedoman PelaksanaanUji Klinik Obat Tradisional, Departemen Kesehatan Republik Indonesia,Jakarta.
Evans, C. W., 1991, The Metastatic Cell, 1st ed., Champman and Hall, London,pp. 191-289.
Fitriyani, A., Winarti, L., Muslichah, S., & Nuri, 2011, Uji Antiinflamasi EkstrakMetanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.) Pada TikusPutih, Majalah Obat Tradisisonal, pp. 16(1), 34-42.
Folkman, J., 1976, The vascularization of Tumors, Scientific American, 6: 59-73
Folkman, J., 1996, Fighting Cancer by Attahing its Blood Supply, SciAmerican, 9:116-119.
Folkman, J. 1998. Angiogenic Therapy of the Human Heart Circulation. Vol.97.pp. 628–9.
Fotsis, T., Pepper, M., Aktas, E., Breit, Rasku, Wahala, K., dan Schweigere, L.,1997, Flavonoids, dietary-derived inhibitors of cell proliferation and invitro angiogenesis, Cancer Res, 57, 2916-2921
Frandita, E., 2009, Uji Sitotoksisitas Fraksi Etanol Daun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav.) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, FakultasFarmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Gritter & Roy, 1991, Pengantar Kromotografi,Edisi 2, ITB, Bandung.
Grotewold, E., 2006, The Science of Flavonoids, Springer Science_BussinessMedia Inc., USA
Gupta, K. M., dan Qin, R. Y., 2003, Mechanism and its Regulation of Tumor-induced Angiogenesis, World Journal Gastroenterol, 9(6), 1144-1155.
Hanahan, D and Weinberg, R.A., 2000, The Hallmark of Cancer, Cell.,100:57-68.
Harborne, J. B., 1987, Metode Fitokimia, ITB, Bandung, pp. 156.
Hargono, D., Farouq, Sutarno, S., Pramono, S., Rahayu, T., Tanuatmadja, U.,Sumarsono, 1986, Sediaan Galenik, Departemen Kesehatan RepublikIndonesia, Jakarta.
Heyne, K., 1987, Tumbuhan Berguna Indonesia, Jilid 3, Fepertemen Kehutanan,Jakarta.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
60
Igura ,K., Otha T., Kuroda, Y., Kaji K., 2001, Resveratrol and Quercetin inhibitangiogenesis in vitro,Cancer Lett, 171 (1): 11-6
Jain, R.K., and Carmeliet,P.F., 2001, Vessel of Death,Sci Am., 28-30
Juliantina R. F., Citra, D. A., Nirwani, B., Nurmasitoh, T.,Bowo, E. T., 2009.“Manfaat Sirih Merah (Piper crocatum) Sebagai Agen Anti BakterialTerhadap Bakteri Gram positif dan Gram Negatif”, Jurnal Kedokteran danKesehatan Indonesia.
Kamienski, M., Keogh, J., 2006, Pharmacology Demystifieda Self-TeachingGuide, New York : The McGraw-Hill Companies, Inc.s
Kerbel, R., Folkman, J., 2002, Clinical Translation of Aniogenesis Inhibitors,Nature, Vol 2
King, R. J.B., 2000. Cancer Biology Ed. 2, Person Education. England.
Kninghton, D., Ausprunk, D., Tapper, and Folkman, 1997, Avascular andVascular Phases of Tumor Growth in The Chick Embrio, Br.J.Cancer 35,pp 347-356.
Leahy, K.M., Koki, A.T., and Masferrer, J.L., 2003, Role of Cyclooxygenase inAngiogensis,http://Bentham.org/cmcsample/masferner/masferner.htm,diakses pada tanggal 3 Februari 2014.
Levi, E.P., 2000, Chronic Toxicity: Carcinogenesis, Mutagenesis, Teratogenesis,in Hodgson, E., dan Levi, E.P. (Ed) A Text book of Modern Toxicology,Mc. Graw Hill international Edition, Singapore.
Lodish, H., Berk, S., Zipursky, Lawrence, S., Matsurada, Baltimore and Darnel,J., 2000, Molekuler Cell Biology Fouth Ed., W. H. Freeman andCompany, New York, pp. 1054-1062.
Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Ricciardelli, C., and Oehler, M. K., 2012, ChickChorioallantoic Membrane (CAM) Assay as an In Vivo Model to Studythe Effect of Newly Identified Molecules un Ovarian Cancer Invasion andMetastasis, Int J Mol Sci, 13(8), 9959-9970.
Markham, K.R., 1988, Cara Mengidentifikasi Flavonoida.Terjemahan KosasihPadmawinata. ITB, Bandung.
Meiyanto, M., 1999, Kurkumin Sebagai Obat Kaner : Menelusuri MekanismeAksinya, MFI, 10(4), 224-236.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
61
Manoi, F., 2006, Pengaruh Cara Pengeringan Terhadap Mutu SimplisiaSambiloto, Buletin Littro, Vol.17(1),1-5.
Neritika, K., 2008, Uji Sitotoksisitas Ekstrak Etanolik Daun Sirih Merah (Pipercrocatum Ruiz & Pav.) terhadap Kultur Sel Kanker Payudara T47D,Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Ng, Y.S., dan D’Amore, P., 2001, Review Therapeutic angiogenesis forcardiovascular disease Curr Control Trials Cardiovasc Med., 2, 278-285.
Ota, S., Bamba, H., Kato, A., Kawamoto, A., Yoshida, Y. Dan Fujiwara, K.,2003, iiReview article : COX-2, prostanoids and colon cancer, AlimentPharmacol Ther 2002., 16 (Suppl.2), 102-106.
Papetti, M., dan Herman, I.M., 2002, Mechanism of Normal and Tumor-derivedAngiogenesis, Am J Physiol Cell Physio, 282, 947-970.
Parmar, V., Jain, S., Bisht, K., Jain, R., Taneja, P., Tyagi, O., Prasad, A., Wengel,J., Olsen, C., Boll, P., 1997, Phytochemistry of the genus Piper.Phytochem, 46(4);597-673.
Patten , B.M. and Carlson, B.M., 1978, Extraembryonic Membranes inFoundations of Embryology, Tata McGraw-Hill Publishing CompanyLTD, New Delhi.
Pramono, E., 2002, The commercial use of traditional knowledge and medicinalplants in Indonesia. Submitted for multi-stakeholder dialoque on trade,intellectual property and biological resources, Asia.
Pringgoutomo, S., 2007, Riwayat perkembangan pengobatan dengan tanamanobat di dunia timur dan barat. Buku ajar Kursus Herbal Dasar untukDokter, Balai Penerbit FKUI Jakarta, pp.1-5.
Rao, B., Gaikwad, P., and Barik, A., 2010 Antioxidant Activities of Phenols inDifferent Solvents Using DPPH Assay, Res Chem Intermed, 36: 1927-1933.
Ribatti, D., Gualandris, A., Bastaki, M., Vacca, A., Lurlaro, M., Roncali, L. andPresta, M., 1997, New Model for The Study of Angiogenesis andAntiangiogenesis in The Chick Embryo Chorioallantoic Membrane: TheGelatin Sponge/Chorioallantoic Membrane Assay, Vascular Res, pp. 34,455-463.
Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., & Presta, M., 2006, The Gelatin Sponge-Chorioallantoic Membrane Assay, Nature Publishing Group, pp. 88-89.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
62
Robinson, T., 1995, Kandungan Organik Tumbuhan Tingkat Tinggi, ITB,Bandung, pp. 152-154.
Rohman, A., 2007, Kimia Farmasi Analisis, Cetakan I, Penertbit Pustaka Pelajar,Yogyakarta, pp. 353-354
Sankaranarayanan, R., 2008, Cervical Cancer: scope of the problem,WHO,International Agency for Reserch on cancer, recorder Presentationin Bangkok, Thailand for the 12th Biennial Meeting of InternationalCancer Society (IGCS), 25028.
Santos, N. C., 2003, Multidiciplinary Utilizator of Dimetil Sulfoxide :Pharmacological, cellular and Molecular Aspec, InstitodeBioquimical/Institode Medicina Molekular, Portugal
Schneider, A. K., 2000, Cancer Genetics, Encyclopedia of Human Biology,EdisiII, 312-315, Academic Press, London.
Siswandono, Soekardjo, B., 2000. Kimia Medisinal. Surabaya: AirlanggaUniversity Press.
Sofyan, Ahmad, Jayanegara, A., 2008. “Penentuan Aktivitas Biologis TaninBeberapa Hijauan Secara In Vitro Menggunakan ‘ Hohenheim Gas Test’dengan Polietilen Glikon Sebagai Determinan”. Jurnal Media PeternakanVol. 31 No. 1 tahun 2008.
Stahl, E., 1985, Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi, edisi II,diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang sudiro, ITB,Bandung.
Subarnas, A., Susilawati, Y., Mulyasari, E., 2008, Aktivitas Antiinflamasi EkstrakEtanol Daun Sirih Merah Pada Tikus Putih Jantan, Laporan Penelitian,Fakultas Farmasi, Universitas Padjajaran, Jatinangor.
Sudewo, B., 2005, Basmi Penyakit dengan Sirih Merah, edisi I, PT. AgromediaPustaka, Jakarta, pp.39-42.
Tabudravu, J., and Jaspars, M., 2005, Anticancer Activities od Constituents ofKava (Piper methysticum), South Pasific Nature Sci, 23: 26-29.
Tsai, T., Ho, S., 2005, Antioxidan and anti-inflammatory Activities of SeveralCommonly Used Species, J. Food Sci, 70: (1) C93-C97.
Walaszek,Z., Hanausek, M., dan Slaga, T.J., 2004, Mechanisms ofChemoprevention, Suppl.Am.Coll.Phys., 125,128-133.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
63
Westendarp, H., 2006, Effects of Tannins in Animal Nutrition, Dtsch, Tierarztl,Wochenschr, pp. 113: 264-268.
Wicaksono, B.D., Handoko, Y.A., Arung, E.T., Kusuma, I.R., Yulia, D.,Pancaputra, A.N., dkk., 2009, Antiproliferasi Effect of the MethanolExtract of Piper crocatum Ruiz & Pav Leaves on Human Breast (T47D)cellsin-vitro, Trop J of Pharmaceut Res, 8(4): 345-352.
WHO, 2003, Traditional medicine,http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs134/en/, diakses tanggal 12Agustus 2013.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
64
LAMPIRAN
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
65
Lampiran 1. Foto tanaman sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
66
Lampiran 2. Foto serbuk daun sirih merah (Piper crocatum Ruiz & Pav.)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
67
Lampiran 3. Hasil Determinasi Tanaman Sirih Merah
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
68
Lampiran 4. Data Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
a. Penimbangan bobot ekstrak daun sirih merah
Bobot cawan = 43,18 gram
Bobot cawan + ekstrak = 58,86 gram
Bobot ekstrak = 15,68 gram
Bobot daun sirih merah yang digunakan = 100 gram
b. Rendemen Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah
Rendemen ekstrak etanol daun sirih merah = 100%= , 100%= 15,68 %
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
69
Lampiran 5. Data Perhitungan Pengenceran bFGF
a. Pengenceran bFGF
Konsentrasi awal bFGF (C1) adalah 25 ng/µl
Konsentrasi bFGF yang diinginkan (C2) adalah 1 ng/µl
Dosis setiap telur adalah 10 ng.
== / = 10 µl
Setiap telur diinduksi dengan volume induksi bFGF sebesar 10 µl.
Telur yang digunakan untuk masing-masing perlakuan adalah 3 telur.
b. Kontrol bFGF
Total telur = 10 telur
Volume bFGF yang dibutuhkan =
= 10 10 μl = 100 μl1 1 = 2 21 25ng/μl = 100 μl 1 ng/μl1 = 100 μl 1 ng/μl25 ng/μl1 = 4 μl
Larutan bFGF (25 ng/µl) diambil 4 µl kemudian ditambah dengan pelarut
bFGF yaitu PBS.
Volume PBS yang ditambahkan = 100µl – 4 µl = 96 µl.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
70
Lampiran 6. Perhitungan Berat Ekstrak Etanol Daun Sirih Merah dan
Volume DMSO
a. Berat Ekstrak Untuk Masing-Masing Konsentrasi Ekstrak Etanol Daun
Sirih Merah Konsentrasi 0,05 mg/ml== 0,05mgml 100= 5 = 0,05 ditambah 0,2 ml DMSO add sampai 100 ml
Konsentrasi 0,1 mg/ml== 0,1mgml 100= 10 = 0,1 ditambah 0,2 ml DMSO add sampai 100 ml
Konsentrasi 0,2 mg/ml== 0,2mgml 100= 20 = 0,2 ditambah 0,2 ml DMSO add sampai 100 ml
b. Volume DMSOKonsentrasi awal DMSO (C1) adalah 99,5%.
Konsentrasi yang diinginan (C2) adalah 0,2%.1 1 = 2 21 99,5% = 100 0,2%1 = 100 0,2%99,5%1 = 0,2Untuk membantu melarutkan ekstrak, setiap konsentrasi ekstrak ditambahkan
0,2 ml DMSO.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
71
Lampiran 7. Respon angiogenesis pada CAM secara makroskopis padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah.
a. Kontrol paper disc (PD)
(Replikasi I) (Replikasi II)
(Replikasi III)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
72
b. Kontrol pelarut
(Replikasi I) (Replikasi II)
(Replikasi III)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
73
c. Kontrol bFGF
(Replikasi I) (Replikasi II)
(Replikasi III)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
74
d. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml
(Replikasi I) (Replikasi II)
(Replikasi III)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
75
e. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml
(Replikasi I) (Replikasi II)
(Replikasi III)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
76
f. Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml
(Replikasi I) (Replikasi II)
(Replikasi III)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
77
Lampiran 8. Rerata jumlah pembuluh darah baru dan standar deviasi
a. Mean dan Standar Deviasi Pembuluh Darah Baru dari Masing-MasingPerlakuan
Kelompok JumlahPengamatan
Jumlah Mean( )
StandarDeviasiPembuluh
Darah
Kontrol paper disc 315
14,33 1,151513
Kontrol Pelarut 313
13 21115
Kontrol bFGF 324
23,33 0,582323
Konsentrasi I(0,05 mg/ml) 3
1614,66 2,3012
16
Konsentrasi II(0,1 mg/ml) 3
1412,33 1,5211
12
Konsentrasi III(0,2 mg/ml) 3
1010,33 0,5711
10
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
78
Lampiran 9. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru
ℎ ℎ ℎ = 100%Dimana :
a = jumlah pembuluh darah baru rata-rata konsentrasi ekstrak etanol daun
sirih merah
b = jumlah pembuluh darah baru rata-rata kontrol bFGF
Konsentrasi I (0,05 mg/ml)
Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = ,, 100 % = 62,83%
Konsentrasi II (0,1 mg/ml)
Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = ,, 100 % = 52,85%
Konsentrasi III (0,2 mg/ml)
Persentase Pertumbuhan Pembuluh Darah Baru = ,, 100 % = 44,27%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
79
Lampiran 10. Persentase pertumbuhan pembuluh darah baru padakelompok kontrol dan perlakuan ekstrak etanol daun sirihmerah
KelompokPerlakuan(n= 3)
Pertumbuhan pembuluhdarah baru (%)
Kontrol paper disc 61,42
Kontrol pelarut 55,72
Kontrol bFGF + pelarut 100Ekstrak etanol daun sirih merah 0,05 mg/ml 62,83Ekstrak etanol daun sirih merah 0,1 mg/ml 52,85Ekstrak etanol daun sirih merah 0,2 mg/ml 44,27
Lampiran 11. Diagram batang pertumbuhan pembuluh darah baru pada kelompokkontrol dan kelompok konsentrasi ekstrak etanol daun sirih merah.
61.42 55.72
100
62.8352.85
44.27
kontrolblank
kontrolpelarut
kontrolbFGF
Konsentrasi0,05 mg/ml
Konsentrasi0,1 mg/ml
Konsentrasi0,2 mg/ml
Persentase pertumbuhan pembuluhDarah Baru (%)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
80
Lampiran 12. Uji Statistik dengan SPSS 16.0
a. Uji Normalitas
NPar Tests
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
kontrolpaperdisc
Kontrolpelarut
KontrolbFGF
konsentrasi_I
konsentrasi_II
konsentrasi_III
N 3 3 3 3 3 3NormalParametersa
Mean 14.3333 13.0000 23.3333 14.6667 12.3333 10.3333Std.Deviation
1.15470 2.00000 .57735 2.30940 1.52753 .57735
Most ExtremeDifferences
Absolute .385 .175 .385 .385 .253 .385Positive .282 .175 .385 .282 .253 .385Negative -.385 -.175 -.282 -.385 -.196 -.282
Kolmogorov-Smirnov Z .667 .303 .667 .667 .438 .667Asymp. Sig. (2-tailed) .766 1.000 .766 .766 .991 .766
a. Test distribution isNormal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
81
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
kontrolpaperdisc
Kontrolpelarut
KontrolbFGF
konsentrasi_I
konsentrasi_II
konsentrasi_III
N 3 3 3 3 3 3NormalParametersa
Mean 14.3333 13.0000 23.3333 14.6667 12.3333 10.3333Std.Deviation
1.15470 2.00000 .57735 2.30940 1.52753 .57735
Most ExtremeDifferences
Absolute .385 .175 .385 .385 .253 .385Positive .282 .175 .385 .282 .253 .385Negative -.385 -.175 -.282 -.385 -.196 -.282
Kolmogorov-Smirnov Z .667 .303 .667 .667 .438 .667Asymp. Sig. (2-tailed) .766 1.000 .766 .766 .991 .766
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
82
b. Uji Homogenitas
OnewayTest of Homogeneity of Variances
Jumlah pembuluh darah baru
LeveneStatistic df1 df2 Sig.
1.859 5 12 .176
ANOVAJumlah pembuluh darah baru
Sum ofSquares df Mean Square F Sig.
BetweenGroups
306.667 5 61.333 26.927 .000
Within Groups 27.333 12 2.278Total 334.000 17
DescriptivesJumlah pembuluh darah baru
N MeanStd.
DeviationStd.
Error
95% ConfidenceInterval for Mean
Minimum
Maximum
LowerBound
UpperBound
kontrol paperdisc 3 14.3333 1.15470 .66667 11.4649 17.2018 13.00 15.00
kontrol pelarut 3 13.0000 2.00000 1.15470 8.0317 17.9683 11.00 15.00kontrol bFGF 3 23.3333 .57735 .33333 21.8991 24.7676 23.00 24.00konsentrasi I 3 14.6667 2.30940 1.33333 8.9298 20.4035 12.00 16.00konsentrasi II 3 12.3333 1.52753 .88192 8.5388 16.1279 11.00 14.00konsentrasi III 3 10.3333 .57735 .33333 8.8991 11.7676 10.00 11.00Total 18 14.6667 4.43250 1.04475 12.4624 16.8709 10.00 24.00
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
83
c. Uji TukeyPost Hoc Tests
Multiple Comparisons
Jumlah pembuluh darah baruTukey HSD
(I) perlakuan (J) perlakuan
MeanDifference
(I-J)Std.
Error Sig.
95% ConfidenceInterval
LowerBound
UpperBound
kontrol paperdisc
kontrol pelarut 1.33333 1.23228 .879 -2.8058 5.4725
kontrol bFGF -9.00000* 1.23228 .000 -13.1391 -4.8609
konsentrasi I -.33333 1.23228 1.000 -4.4725 3.8058
konsentrasi II 2.00000 1.23228 .600 -2.1391 6.1391
konsentrasi III 4.00000 1.23228 .060 -.1391 8.1391
kontrol pelarut kontrol paper disc -1.33333 1.23228 .879 -5.4725 2.8058
kontrol bFGF -10.33333* 1.23228 .000 -14.4725 -6.1942
konsentrasi I -1.66667 1.23228 .752 -5.8058 2.4725
konsentrasi II .66667 1.23228 .993 -3.4725 4.8058
konsentrasi III 2.66667 1.23228 .320 -1.4725 6.8058
kontrol bFGF kontrol paper disc 9.00000* 1.23228 .000 4.8609 13.1391
kontrol pelarut 10.33333* 1.23228 .000 6.1942 14.4725
konsentrasi I 8.66667* 1.23228 .000 4.5275 12.8058
konsentrasi II 11.00000* 1.23228 .000 6.8609 15.1391
konsentrasi III 13.00000* 1.23228 .000 8.8609 17.1391
konsentrasi I kontrol paper disc .33333 1.23228 1.000 -3.8058 4.4725
kontrol pelarut 1.66667 1.23228 .752 -2.4725 5.8058
kontrol bFGF -8.66667* 1.23228 .000 -12.8058 -4.5275
konsentrasi II 2.33333 1.23228 .450 -1.8058 6.4725
konsentrasi III4.33333* 1.23228 .038 .1942 8.4725
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
84
konsentrasi II kontrol paper disc -2.00000 1.23228 .600 -6.1391 2.1391
kontrol pelarut -.66667 1.23228 .993 -4.8058 3.4725
kontrol bFGF -11.00000* 1.23228 .000 -15.1391 -6.8609
konsentrasi I -2.33333 1.23228 .450 -6.4725 1.8058
konsentrasi III 2.00000 1.23228 .600 -2.1391 6.1391
konsentrasiIII
kontrol paper disc -4.00000 1.23228 .060 -8.1391 .1391
kontrol pelarut -2.66667 1.23228 .320 -6.8058 1.4725
kontrol bFGF -13.00000* 1.23228 .000 -17.1391 -8.8609
konsentrasi I -4.33333* 1.23228 .038 -8.4725 -.1942
konsentrasi II -2.00000 1.23228 .600 -6.1391 2.1391*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
Homogeneous Subsetsjumlah_pembuluh_darah_baru
Tukey HSD
perlakuan N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3
konsentrasiIII
3 10.3333
konsentrasi II 3 12.3333 12.3333kontrol pelarut 3 13.0000 13.0000kontrol paperdisc
3 14.3333 14.3333
konsentrasi I 3 14.6667kontrol bFGF 3 23.3333Sig. .060 .450 1.000Means for groups in homogeneous subsets aredisplayed.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
85
Lampiran 13. Diagram batang Jumlah Pembuluh Darah Baru Rata-RataDari Masing-Masing Perlakuan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
86
BIOGRAFI PENULIS
Penulis skripsi yang berjudul “Aktivitas AntiangiogenesisEkstrak Etanol Daun Sirih Merah (Piper crocatum Ruiz &Pav.) Pada Chorioallantoic Membrane yang Diinduksi bFGF”memiliki nama lengkap Ketut Noveryka Lendra. Penulis lahirdi Tabanan pada tanggal 8 November 1992 yang merupakananak keempat dari empat bersaudara. Lahir dari pasangan IWayan Lendera, Dipl. PT dan Eriana Herlisanti, S. Pd.Pendidikan formal yang pernah ditempuh penulis adalahdimulai dari TK Immaculata (1997-1998), SD Negeri 6 Delod
Peken (1998-2004), SMP Negeri 3 Tabanan (2004-2007), SMA Negeri 1 Tabanan(2007-2010), dan pada tahun 2010 penulis menempuh pendidikan S1 di FakultasFarmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Selama menempuh kuliah, penulis aktif dalam berbagai kepanitiaan.Penulis tergabung dalam UKM KMHD Swastika Taruna USD. Selain itu, penulispernah menjadi seksi Kesehatan Dies Natalis Keluarga Putra Bali (KPB)Purantara (2010), Bendahara Seminar Nasional Pemberdayaan Pasien Dalam SelfManagement Diabetes Melitus untuk Meningkatkan Kualitas Hidup (2011),Bendahara kegiatan Tirta Yatra KMHD (2012), dan menjadi Bendahara AcaraPelepasan Wisuda Fakultas Farmasi (2012).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI