planta piloto de fermentaciones departamento de...

Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Rompimiento celular

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa


Productos Extracelulares-Antibióticos-Enzimas extracelulares-Muchos polisacáridos-Mayoría de aminoácidos

Biomasa

Productos Intracelulares-Mayoría de proteínas modificadas

genéticamente-Lípidos-Algunos antibióticos

Esteroides(Se extraen sin romper)


Tipo de producto Ejemplos

Proteínas recombinantes Insulina, HC, Proteína A, Proteína G

Enzimas L-Asparaginasa, Invertasa, Glucosinasa

Plásmidos Terapia génica

Vacunas Tétanos, Meningitis

Otros Mitocondrias, Esporas, Toxinas

Productos que requieren de ruptura celular

Tejeda y col. 2011 Bioseparaciones


Procariotes Gram –(E. coli produce la mayoría de las proteínas recombinantes)

Procariotes Gram +

Membrana externa(Proteínas y lipopolisacáridos)

Polipéptidoglucanos

Espacio Periplasmático(Proteínas)

Membrana de plasma

8 nm

8 nm

Polipéptidoglucanos

Espacio Periplasmático(Proteínas)

Membrana de plasma(Fosfolípidos, proteínas dispersas, iones metálicos)

Fuerza mecánica

Permeabilidad

Esquema de la pared celular de células procariotas


Tomado de “Advances in product release strategies and impact on bioprocess design” (2009)Bangaru Balasundaram, Sue Harrison and Daniel G. Bracewell


Fermentación

Cosecha de células

Rompimiento Celular

Remoción de restos celulares

Concentración y/o

fraccionamiento

Operaciones de alta

resolución

Operaciones finales

Producto

Centrifugación, filtración con vacío,

filtración con membranas

Homogenización, molienda, lisis

(enzimática o química)

Centrifugación, filtración con vacío,

filtración con membranas

Precipitación, extracción, filtración

con membranas, evaporación

Cromatografía, cristalización

Etapas primarias de recuperación

Adaptado de: Sanchez-Ruiz, 1989Studies on cell disruption and cell debrisremoval in downstream processing


Ruptura Celular de Saccharomyces cerevisiae

Antes de la ruptura celular

Después de 2 pasos a 1000 bar dandoun rompimiento celular de 95%


Equipo de ruptura

Industria Alimentaria(Homogenización de la leche)

Industria de la Pintura(Reducción de Pigmentos)

Industria BiotecnológicaAplicación en …


Método Técnica Principio Estrés

sobre el

producto

Costo Ejemplo

Químico Choque osmótico Ruptura osmótica de la

membrana

Suave Barato Ruptura de células de sangre

Digestión

enzimática

Rompimiento por digestión de la

pared celular

Suave Caro Micrococcus lysodeikticus tratado con

lisozima de huevo

Solubilización Detergentes solubilizan la

membrana celular

Suave Moderado

- caro

Sales biliares actuando sobre E.coli

Disolución de

lípidos

Solventes orgánicos se disuelven

en la pared celular y la

desestabilizan

Moderado Barato Ruptura de levadura con tolueno

Tratamiento

alcalino

La saponificación de lípidos

solubiliza la membrana

Fuerte Barato

Mecánico Homogenización

(tipo navaja)

Células cortadas en una

licuadora

Moderado Moderado Tejido animal y células

Molido Ruptura celular por molido con

abrasivos

Moderado Barato

Ultrasonicación Células rotas con cavitación

ultrasónica

Fuerte Caro Suspensión de células a pequeña escala

Homogenización

(tipo orificio)

Se hace pasar células por un

pequeño orificio y se rompen

por estrés

Fuerte Moderado Tratamiento a gran escala de suspensión de

células excepto bacterias

Rompimiento en

molino de perlas

Se aplastan las células entre el

vidrio y perlas de acero

Fuerte Barato Tratamiento a gran escala de suspensión de

células y células de plantas


Dificultad de la ruptura

Esporas

Cocos gram -

Levaduras

Células vegetales

Bacilos gram +

Bacilos gram - y cocos

Micelios

Células animales


Elección del método de ruptura

�Naturaleza de la fuente de la enzima

�Escala de la operación

�Velocidad del método de extracción

�Estabilidad del enzima

�Pureza requerida

�Costo del proceso


Factor inactivante Fuente de

enzima

Frecuencia Modo de

contrarrestarlo

Calor Cualquiera Universal Enfriamiento

Frío Cualquiera Raro Calentamiento

Proteasa Mayoría Común Inhibidores de proteasas o

frío

Productos oxidación de

fenoles

Plantas y hongos Bastante común Agentes reductores

Oxidación Cualquiera Común Agentes reductores

Dilución proteína Cualquiera Bastante común Concentración rápida

Pérdida de estabilidad Cualquiera Bastante común Restauración de ese factor

Inhibidores específicos Plantas y

bacterias

Raro Separación del inhibidor

Metales pesados Cualquiera Raro Agentes quelantes

Cambio de fase Cualquiera Común Mínima agitación

Factores que inactivan las enzimas durante su aislamiento


Choque osmótico1. Suspensión de células en solución tamponada hipertónica (sacarosa 20%)2. Equilibrio osmótico3. Centrifugación: concentración de las células4. Re suspensión en agua (4 ºC)5. Ruptura celular por entrada de agua en el interior

celular

• Mayor sensibilidad en GRAM negativas(GRAM positivas alta presión osmótica interna)

• Ventajas:Extracción de enzimas del espacio periplasmático, simplificación de los procesos de purificación

• NO a gran escala:Grandes volúmenes de medio (400 L/10 kg pasta celular)

Elevado número de pasos de centrifugaciónNecesidad de refrigeración


Tratamiento con lisozima + EDTA

•Digestión de las paredes celulares por ruptura de los enlances beta-(1.4) glicosídicos entre el ácido N-acetilmurámico (NAM) y la N-acetilglucosamina (NAG) del mucopéptido

•Mayor susceptibilidad GRAM +•Combinación con EDTA: quelante del Ca2+

•Otros policationes: GRAM +: quitosano, hidroglutamato, polilisina, antiobióticos GRAM -: lipasas, fosfolipasas, policationesHongos/levaduras: quitinasa/glucanasas

•Necesidad de choque osmótico•No empleo a gran escala :

Alto precio de la lisozimaEliminación de lisozima tras extracción


Tratamiento con detergentes

Tipos:1. Iónicos : provoca desnaturalización

proteicaAniónicos: Lauril sulfato sódico,

colato sódico, SDSCatiónicos: Bromuro de cetil-

trimetil-amonio

2. No iónicos : preservan estructuranativa e interacciones de laenzimaTween, Spam, Triton

Permeabilización de células por solubilización de proteínas de membrana, debido a apertura de poros

Inconvenientes :Precipitación de proteínas y necesidad de eliminación (cromatografía, ultrafiltración)


Tratamiento con álcalis

�Tratamiento de las células con soluciones alcalinas

(KOH, NaOH, pH 11.5-12.5; 20-30 min)� Hidrólisis de la pared celular� Ventajas:

� Simpleza, barato� Fácil aplicación a gran escala

� Desventajas:� Tratamiento fuerte, es un ejemplo extremo de la solubilización (Saponificación de lípidos que se convierten a detergentes)� No selectivo� Aplicación SÓLO si las enzimas a aislar son estables a pH alcalino


�Método tradicional de ataque ( tolueno).

�No se usan a gran escala.

�Inconvenientes:PrecioToxicidadDesnaturalización de proteínasInflamabilidad

Disolventes orgánicos


Homogeneización con abrasivos

•Mortero + abrasivo (cristal, albúmina, kieselgurh)•Dispositivos de funcionamiento continuo:

Agitador Mickle (agitador vibratorio)Dyno-mill (agitador de discos giratorios)

•Efectividad depende de:� Tipo y concentración de abrasivo� Tipo, concentración y edad de las células: levaduras >bacterias� Velocidad de agitación� Cantidad y flujo a través de la cámara� Temperatura� Dispositivo de discos


Sonicación•Aplicación de frecuencia superiores a 20 kHz•Aparición de áreas de compresión/enrarecimiento/cavidades →colapso de cavidades →ondas de choque →daño celular•Aplicación continua o discontinua•Eficacia dependiente de:

Tipo de microorganismo:Gram ->Gram +Bacilos > Cocos

pHTemperaturaFuerza iónica del medioTiempo de exposiciónDensidad de la célula

•Uso a pequeña escala, NO a gran escala:Elevados requerimientos de energíaDificultad de transmisión de la energíaProblemas de disipación del calor producido


Congelación/Descongelación

•Formación y fusión de cristales de hielo � liberación de proteínas

•Combinación con otros métodos: congelación de sedimentos bacterianos

•Ventajas:SimplicidadBajas temperaturas de trabajo

•NO a gran escala:Elevado tiempo de tratamientoResistencia de algunos microorganismosSensibilidad de las enzimas a congelación/descongelación


Cizalla líquida

•Paso de la suspensión de células a elevada presión (>55MPa) a través de un orificio estrecho•Homogeneizador de Manton-Gaulin•Mecanismo:

Ruptura celular por caída brusca de presión y choque

•Modos de uso:Paso único, series de reciclaje, reciclaje continuo con eliminación de sustancia

•Efectividad depende de:Tipo de microorganismos: GRAM -> GRAM +Historia de la materia de partida:Condiciones de crecimiento (fase estacionaria > fase exponencial)Congelación/descongelación


Cizalla sólida

•Paso de células congeladas (-20 ºC) a través de orificio

•Mecanismo:Agitación en presencia de abrasivo

(cristales de hielo) + ruptura por cizalla líquida

Fuerzas de cizalla: paso a través de orificio + desgarro por cristales de hielo

•No produce la desnaturalización de las enzimas

•NO a gran escala:Manejo complicado y costoso


Ecuaciones utilizadas en rompimiento celular

Choque osmótico: El cálculo del gradiente de presión se basa en el equilibrio químico (Ley de van’t Hoff)

iie TRPP c∑⋅⋅−=−

(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)

Ejemplo: Las cianobacterias son capaces de acumular sales de bajo peso molecular en respuesta a un medio con alta presión osmótica. Pueden ser cultivadas en medios con 0.11 M NaCl o en medios con 0.49 M NaCl y 0.01 M CaCl2. Cuando las células son crecidas en el medio más salino y transferidas a agua pura se permeabilizan liberando los carbohidratos y aminoácidos intracelulares en 2 min. Estime la diferencia de presión osmótica para permeabilizar las células a 25 ⁰C (donde: R = 82 cm3 atm mol-1 K-1).

( ) ( )[ ] atm38.5cm1000

L1L

mol11.011.0K27325

Kmolatmcm

82 3

3

−=+∑⋅+⋅⋅

−=∆ NaClP o

o

( ) ( ) ( )[ ] atm68.24cm1000

L1L

mol02.001.049.049.0K27325

Kmolatmcm

82 3

3

2−=+++∑⋅+⋅

⋅−=∆ CaClNaClP o

o


Parámetros operacionales

- Velocidad del agitador

- Velocidad de alimentación de la suspensión celular

- Diseño del agitador

- Tamaño de las perlas de vidrio

- Carga de las perlas de vidrio

- Concentración celular

- Temperatura

Molino de perlas de alta velocidad

Tejeda y col., 2011, Bioseparaciones


Velocidad del Agitador

La Velocidad Periférica Normalizada de los Anillos agrupa varios parámetros relacionados con la velocidad del agitador

� En impulsores concéntricos, Dm = diámetro del impulsor (mm)

� En impulsores excéntricos, Dm = diámetro promedio (mm)

1000x60

πωmDU =

42

22 d

eDm +=

d : diámetro de los anillos del agitador (mm)

e : diámetro de la flecha del agitador (mm)

ω : velocidad angular del agitador (rpm)Dm : diámetro



• El flujo permisible en un molino de perlas depende:�Del volumen del molino�De la carga de perlas�Velocidad del agitador

El proceso resulta más económico

Al aumentar el flujo de

alimentación

Disminuye el grado de desintegración

NOTA: Conviene operar con altos flujos de alimentación y

usar varios pasos para obtener el rendimiento requerido

Flujo de alimentación, F


Diseño del Agitador y Efectos del Mezclado

El comportamiento de un molino de perlas depende del patrón de flujo y mezclado que produce la agitación. La cual es un agitado intermedio a los dos modelos ideales: Flujo tapón (sin mezclado axial) y tanque continuo agitado (100 % agitado)

El tipo de mezclado puede ser determinado por técnicas con trazadores




Molino de Perlas (operación intermitente): El rompimiento celular con perlas agitadas a altas velocidades sigue una cinética de primer orden. El balance de masa de proteína liberada puede ser expresado mediante la ecuación:

( ) MmM VRRkdt

dRV −=

Integrando y re-arreglando

ktRR

R

m

m =−

ln

RR

R

m

m

−ln

kEjemplo 5.2

(Tejeda y col., 1995, Bioseparaciones)

t



Grado de mezclado en un Molino de Perlas (operación continua):El grado de desviación del flujo tapón ideal en los molinos de perlas comerciales, ha sido simulado utilizando el modelo de “Tanques en serie perfectamente agitados”. Esto permite realizar experimentos con pulsos de tinta para determinar el número de tanques equivalentes al grado de mezclado que tiene el molino de perlas utilizado y calcular la eficiencia esperada del rompimiento.

1 2 3 N

FFC0 C1 C2 C3 CN

Al aplicar un pulso de tinta en la primera etapa de una serie de tanques perfectamente agitados de igual volumen, el balance de la masa de tinta para cualquier etapa N es:

( )NNNM CCF

dt

dC

N

V −= −1


Utilizando un tiempo adimensional definido por: RM t

t

V

tF ==θ

El balance de masa de tinta puede expresarse como:

)( 1 NNN CCN

d

dC −= −θIntegrando para cada etapa, se obtiene que para la etapa N la expresión:

( ) ( ) ( )θθθ NN

N

C

CE

NNN −

−==

−

exp!1

1

0

E(θ) es una medida de la distribución de tiempos de residencia del fluido dentro del recipiente. Derivando con respecto θ e igualando el resultado a cero se tiene:

máx

Nθ−

=1

1

Donde θmáx es el tiempo adimensional en el cual E es máxima:


( )N

VRRkFR

dtdR

N

V mm

m11

1 −+−=

Expresando la ecuación en función de un tiempo adimensional e integrando obtenemos

+=

NF

kVNF

kV

R

R

m

m

m 1

1Eficiencia de la etapa !!!

Re-arreglando y generalizando para N etapas, tenemos:N

m

Nm

m

NF

kV

RR

R

+=−

1 Ejemplo 5.3

Eficiencia de un Molino de Perlas (operación contin ua):Para relacionar el número de etapas con la eficiencia de rompimiento es necesario realizar un balance de proteína liberada (células rotas) considerando que el molino consta de N etapas tipo tanque perfectamente agitado en serie y que el rompimiento sigue una cinética de primer orden.

El balance de proteína liberada en la primera etapa está dada por



Homogeneizador de alta presión: La desintegración celular en un homogeneizador de alta presión a una presión fija puede ser descrita mediante una cinética de primer orden respecto al número de pasos, de tal manera que:

( )RRkdN

dRm −= '

Integrando obtenemos la ecuación:

NkRR

R

m

m 'ln =−

Se ha determinado experimentalmente que la constante k’ tiene una dependencia con la presión de la siguiente forma: aPkk "'=

a

m

m NPkRR

R"ln =

−

Combinando las ecuaciones anteriores se tiene:



Microflidizador: En el caso del microfluidizador la cinética de rompimiento presenta una cierta dependencia no lineal con el número de pasos expresada mediante la ecuación:

ab

m

m PNkRR

R"ln =

−

Donde b es un exponente que varía con el tipo de célula y toma valores entre 0.28 y 1

Ejemplo 5.4


Chang and Su, 2006Kinetic model for simultaneous cell disruption and aqueous two-phase

extraction

A = Am[1 − exp(−kt)]


La Ruptura celular, cuando se están procesando cientos o miles de litros de material, represanta un reto diferente a la ruptura celular a

nivel laboratorioFactores claves son: Eficiencia y reproducibilidad

A nivel Industrial sólo se emplean los molinos de perlas agitados y los homogeneizadores a alta presión. El diseño de los molinos está basado en ecuaciones empíricas y en experimentos piloto.

GEA Liquid Processing cell rupture skid for biologic cell lysing. The homogenizer feature the high efficiency sharp profile rupture valve type R which enable cell disruption at lower pressures

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