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Planta Piloto de FermentacionesDepartamento de Biotecnología

Biotecnología de enzimas: Inmovilización

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa


Catálisis enzimática heterogénea

Para combinar las ventajas de la catálisis homogénea y heterogénea, se desarrolló la heterogenización de la catálisis homogénea

Las enzimas inmovilizadas son enzimas físicamente confinadas o localizadas en una cierta región definida de espacio con la localizadas en una cierta región definida de espacio con la retención de sus actividades catalíticas, que pueden ser usadas repetidamente y continuamente

Los métodos más comunes de inmovilización de enzimasHeterogenización de enzimas solubles a través del acoplamiento de un soporte insoluble mediante: adsorción o enlace covalente, por entrecruzamiento de la enzima o por atrapamiento en un enrejado o en microcápsulas


Enzima Soporte

Propiedades bioquímicas Características químicas

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas están gobernadas

por las interacciones de las propiedades de la enzima y el material

del soporte

Método de inmovilizaciónRendimiento (%)

Propiedades bioquímicas Características químicas

Tipo de reacción y cinética Propiedades mecánicas

Efectos de transferencia de masaEficiencia (η)

ComportamientoConsumo de enzima (U/kg producto)

Productividad (kg producto/U)

Estabilidad operacional# de ciclos


Inmovilización de enzimas

• Costo de la enzima

• Grado de purificación requerido de la enzima

• Costo del proceso de inmovilización

• Estabilidad de la enzima

• Efectos de inhibición y envenenamiento


Pros y contras de la Inmovilización

PROS

Alta estabilidad y resistencia al esfuerzo cortante y a la contaminación

CO(TRAS

Existencia de la resistencia a la transferencia de masa

contaminación

Fácil de desarrollar procesos continuos

Rápidas tasas de reacción

Fácil separación de los productos

Uso repetitivo del catalizador

Necesidad del proceso de inmovilización

Costos adicionales de reactivos para la inmovilización

Pérdida de actividad durante la etapa de inmovilización


Inmovilización de enzimas

La inmovilización es la restricción espacial de la movilidad de la enzima


Métodos de inmovilización

A: Métodos de enlace a soportes

a) Enlace covalente; b) Adsorpción física;

A

b) Adsorpción física; c) Fuerzas electrostáticas

B: Entrecruzamiento

C: Atrapamiento

Enzyme in Industry: Production and Applications, pg 66.

B C


Atributos ideales de un soporte

• Alta área superficial

• Permeable

• Insoluble• Insoluble

• Alta rigidez

• Regenerable

• Resistente a ataque microbiano y químico

• Estable mecánicamente y térmicamente

• Hidrofobicidad controlada


Métodos de inmovilización claves

• Unión Covalente

– Glutaraldehido– CNBr-activación– Ácidos cíclicos (glicoproteinas)– Carbodimidas

• Adsorción

Más común para enzimas

– Intercambio iónico– Hidrofobicidad

• Entrecruzamiento

• Encapsulación

– Geles poliméricos– Liposomas y otras bicapas

• Métodos emergentes

– Avidin/streptavidin y biotin– Oligonucleótidos-protein fusions– Materiales biocatalíticos– Silicones/silicatos/sol-geles

Más común para células


Métodos de inmovilización: Soportes

Tipos de Soporte

• Inorgánicos: p.ej.

Tipos de enlace

• Enlace covalente • Inorgánicos: p.ej. Sílica, Vidrio poroso

• Orgánicos: p.ej. Poliamida, Poliacrilamida

• Biológicos: p.ej. Celulosa, Quitosano

• Enlace covalente

• Adsorción física

• Enlace iónico


Enlace Covalente

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237

El soporte en este caso es amino alkoxy silano


Enlace Covalente

Handbook of Heterogeneous Catalysis, Vol. 1, pg. 237


Adsorción Física

• Los biocatalizadores enlazan a los soportes por interacciones físicas tales como interacciones hidrofóbicas, fuerzas de van der Waal’s, etc. hidrofóbicas, fuerzas de van der Waal’s, etc.

• Frecuentemente se usan soportes inorgánicos. Actualmente, están disponibles varios materiales naturales que tienen fuertes capacidades de adsorción.


Unión a un soporte por adsorción física

El método se basa en la adorción física de las moléculas de

enzima en la superficie de una matriz sólida, poniendo en enzima en la superficie de una matriz sólida, poniendo en

contacto una solución acuosa de enzima con el soporte.

Procedimiento estáticoElectrodeposiciónProceso de reactorBaño con agitación

Métodos deadsorción física


Métodos de inmovilización : Atrapamiento

El método de atrapamiento de inmovilización está basado en la localización de una enzima dentro de un enrejado de una matriz polimérica o membrana de tal enrejado de una matriz polimérica o membrana de tal forma que previene la liberación de proteina mientras permite la penetración de substrato.

- La enzima no se enlaza de ninguna forma a la matriz

del gel o a la membrana.


Métodos de inmovilización : Entrecruzamiento

Definición: Formación de enlaces covalentes entre las moléculas de enzima, por medio de reactivos bi- o multifuncionales, formando agregados entrecruzados multifuncionales, formando agregados entrecruzados tridimensionales.

Métodos: Adición de una cantidad apropiada de agente entrecruzante a una solución de enzima bajo condiciones que den un aumento en la formación de enlaces covalentes múltiples.


Métodos de inmovilización: Entrecruzamiento (cont…)

Handbook of Enzyme Biotechnology, pg. 585


Limitaciones difusionales en sistemas de enzimas

inmovilizadas

( )

maximum rate of reaction

maximum rate of diffusion

m ss L b s

m s

mDa

V SJ k S S

K S

V�

k S

= − =+

= =maximum rate of diffusionDa

L bk S

�Da<<1 Limitado por reacción

�Da≈1 Reacción y difusión -resistencias comparables

�Da>>1 Limitado por difusión

�Da = �úmero de Damhköler


Factor de efectividad

Para reacciones donde las limitaciones pueden ser importantes, la tasa de reacción aparente es frecuentemente expresada en términos de un factor de efectividad, η

reaction with diffusional limitationsreaction with diffusional limitations

intrinsic reaction rateη =

Para una reacción enzimática que sigue la cinética de Michaelis-Menten

m ssurface

m s

V Sr

K Sη=

+


Limitaciones difusionales para enzimas inmovilizadas

en pellets porosos


Perfil de concentración en estado estacionario en pellets

porososConsideraciones:

Cinética de Michaelis-Menten

Enzima uniformemente distribuida a través del pellet

No hay partición de substrato entre el interior y el exterior del pellet

Ecuaciones gobernantes:

2

2

0

2

( )

0

me

m

s

r

V Sd S dSD

dr r dr K S

S R S

dS

dr =

+ = +

=

=


Adimensionalización

, , m

s s

KS rS r

S R Sβ= = =Definir variables adimensionales:

Introducir en los balances de masa y las condiciones frontera

22

2

0

2

1

(1) 1, 0, m m

er

d S d S S

r d r Sd r

V Kd SS R

Ddr

φ

β

φ=

+ =

+

= = =

A menos que la reacción sea de 1er orden, el sistema no tiene solución analítica con la cinética de Michaelis-Menten


Gráfica η η η η versus φφφφ en el sistema Michaelis-Menten


• Minimizar el radio de partícula dentro las limitaciones mecánicas

Diseño de pellets inmovilizados

• Optimizar la carga de la enzima– Alto contenido de enzima

incrementa la tasa intrínseca de la reacción pero disminuye el factor de efectividad

– Bajo contenido de enzima incrementa el factor de efectividad pero disminuye la tasa intrínseca de la reacción


Reactores enzimáticos

Discontínuos (Enzimas libres einmovilizadas)

Tipos de

reactores

Contínuos (Enzimas inmovilizadas)


Reactores discontínuos

Tipo tanque agitado con paletas Tipo tanque agitado con mamparas

que incluyen enzimas inmobilizadasTipo tanque agitado con paletas

que incluyen enzimas inmobilizadas que incluyen enzimas inmobilizadas

Reactor de lecho empacado

con reciclado total

Reactor de lecho fluidizado

con reciclado total


Reactores contínuos

Tipo tanque agitado con recuperación por ultrafiltración

Reactor de lecho

empacado

Reactor de lecho

fluidizado

Reactor de fibra

hueca


Reactor de tanque agitado contínuo


Reactor de lecho empacado


Reactor de lecho fluidizado


Reactor de membrana


Tecnología de enzimas comerciales

• High fructose corn syrup (xylose isomerase)

• L-Amino acids (amino acylase, amino acid dehydrogenases, lyases)

• D-Amino acids (hydantoinase)

• L-Aspartic acid (aspartase)

• L-Malic acid (fumarase)

• Glycidyl butyrate (lipase)

• Cis-dihydrodiols (dioxygenase)

• Muconic acid, chiral amines (aminotransferase)

• Semisynthetic penicillins and cephalosporins (penicillin amidase)

• Acrylamide (nitrile hydratase)

• Phenolic resins (peroxidase)

• Food applications (many)Industrial enzyme market ca. $1.5 billionChiral market estimated at $5-10 billionDiscovery markets - ??? (pharma spends ca. $15B/yr)


• GI es un tetrámero de 4 unidades idénticas de cerca de 45,000 kDa

Información estructural

Aplicaciones industriales

Glucosa isomerasa inmovilizada

• Compuesto como un dímero de dímeros

• Cada monómero está compuesto de aproximadamente 16 hélices alfa y 15 láminas beta

• La interface monómero-monómero es 3 veces más grande y fuerte que la interface dímero-dímero

• 2 Mn2+ son necesarios para la actividad xilosa y 2 Co2+ para la actividad glucosa isomerasa

From Bacillus Coagulans, Isolated by Novozyme, Inc.




La isomerización de glucosa a jarabes de maíz de alta fructosa (HFCS), exclusivamente como un reemplazo de costo reducido para soluciones de sacarosa y azúcar invertidasoluciones de sacarosa y azúcar invertida

•Background:Altas temperaturas de reacción para altos rendimientos de fructosapH ≥ 7 para la actividad y estabilidad de la enzimaPERO, la glucosa y la fructosa son inestables, fácilmente se descomponen a ácidos orgánicos y subproductos coloreadosEl tiempo de reacción debe ser minimizado




• Condiciones del proceso:

En reactores de lecho fijo contínuosEn reactores de lecho fijo contínuos

Temperatura: 55-60 oC

pH: óptimo pH de la enzima

Los gránulos de la enzima deben ser suficientemente rígidos para prevenir la compactación durante la operación




Método de Inmovilización

Rendimiento

(kg productoseco/ kg enzima)

1. La enzima, después del aislamiento y purificación, es covalentemente inmovilizada sobre un soporte inerte

20,000

2. Entrecruzamiento de células que contienen las enzimas deseadas

2,000-4,000

3. La enzima parcialmente purificada es inmovilizada sobre resinas de intercambio iónico

7,000- 10,000


Conclusiones

• La inmovilización permite el uso repetitivo de la enzima lo que significa un ahorro significativo en los costoslo que significa un ahorro significativo en los costos

• La selección de los métodos de inmovilización deberán estar basados en los requerimientos técnicos específicos y en el marco global de su aplicación comercial

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