PLATELIA™ LYME IgG96 PRUEBAS 72952DETECCIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS IgGANTI-BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO, ENSUERO O PLASMA HUMANO, POR MÉTODOINMUNOENZIMÁTICO

IVD

1- CAMPO DE APLICACIÓNPlatelia™ Lyme IgG es una prueba inmunoenzimática de tipo ELISA indirectopara la detección cualitativa de anticuerpos IgG producidos contra Borreliaburgdorferi sensu lato en suero o plasma humano.

2- INTERÉS CLÍNICOLa borreliosis de Lyme, o enfermedad de Lyme, es una enfermedad infecciosano contagiosa causada por una bacteria de la familia Spirochetaceae,Borrelia burgdorferi, transmitida por garrapatas del género Ixodes (2).El reservorio del germen está constituido por gran variedad de animales. Latransmisión al hombre se produce mediante la mordedura de las garrapatas,y el riesgo de transmisión es más alto cuanto más dura la mordedura.La enfermedad de Lyme está ampliamente extendida en las regionestempladas y frías del hemisferio norte, desde China hasta América del Nortey desde Escandinavia hasta el Norte de África. El número de casos anualesse estima en 17.000 aproximadamente en los Estados Unidos (3) y en másde 50.000 en Europa, donde parece existir un gradiente positivo de oeste aeste (4). Se ha demostrado que la bacteria Borrelia burgdorferi, descrita en 1984como una especie única, constituye un complejo de varias especies de lascuales tres tienen un efecto patógeno confirmado para el hombre: Borreliaburgdorferi sensu stricto (ss), Borrelia garinii y Borrelia afzelii (7). Las tresespecies patógenas circulan en Europa, mientras que en Estados Unidos sólocircula B. burgdorferi sensu stricto.Los síntomas de la enfermedad de Lyme son varios y a veces son difíciles dereconocer (6). La evolución clínica se desarrolla en tres fases diferenciadas.La fase precoz (Estadio I) puede ser asintomática o manifestarse como uncuadro pseudo-gripal. En 50 a 80% de los casos se observa la aparición,varios días o semanas después de la mordedura de la garrapata, de unaerupción cutánea inflamatoria con expansión centrífuga de un aspecto muypeculiar, denominada eritema migrans (EM). En ausencia de tratamiento ladiseminación de Borrelia por vía sanguínea se manifiesta varias semanas mástarde con la aparición de artritis inflamatorias, con afectación neurológica ymeníngea, con manifestaciones cutáneas o cardíacas (Estadio II). Después devarios meses o años la enfermedad evoluciona hacia una forma crónica,asociando en diversos grados la acrodermatitis crónica atrofiante, laencefalopatía, la encéfalo-mielitis y la artritis crónica (Estadio III) (1).

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Existe un tropismo orgánico particular a cada una de las especies. Si laprimera fase del eritema migrans se asocia indistintamente a las tres especies,la evolución hacia una forma neurológica está asociada preferentemente a laespecie B. garinii, las artritis se asocian fundamentalmente a B. burgdorferiss, mientras que la acrodermatitis crónica atrofiante es específica deB. afzelii.La enfermedad de Lyme debe diagnosticarse sólo tras una evaluaciónrigurosa de los antecedentes del paciente, de sus patrones clínicos ybiológicos y del riesgo de contaminación. Debido a las dificultades delexamen directo, del cultivo bacteriano y de la aplicación de técnicas debiología molecular, la serología resulta el elemento clave del diagnóstico dela enfermedad de Lyme (1,5,8). Los anticuerpos IgM anti-Borrelia burgdorferiaparecen en general de 3 a 6 semanas después del comienzo de la infeccióny pueden persistir durante la evolución de la enfermedad. La respuesta IgG esmás tardía y alcanza su pico después de varios meses, o incluso años.Aunque menos útil en la fase precoz, el diagnóstico serológico resulta sinembargo indispensable durante la segunda y tercera fase, especialmente enausencia de eritema migrante. Cuando la serología es negativa y el cuadroclínico es sugestivo, debe realizarse una nueva serología 3 semanas despuésde la primera extracción de muestra. La presencia de IgM específicas no essinónimo de infección reciente, como tampoco la presencia de IgG es señalsiempre de una infección anterior.La naturaleza de los antígenos y anticuerpos utilizados en los reactivosPlatelia™ Lyme IgM (Ref. 72952) y Platelia™ Lyme IgM (Ref. 72951)permiten respectivamente la detección de los anticuerpos específicos IgG eIgM dirigidos contra varias cepas americanas y europeas de Borreliaburgdorferi sensu lato (B. burgdorferi ss, B. garinii, B. azfelii).

3- PRINCIPIOPlatelia™ Lyme IgG es una prueba que permite la detección cualitativa de losanticuerpos IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato en suero o plasmahumano mediante un método inmunoenzimático de fase sólida, conocidocomo "ELISA indirecto". Se utilizan antígenos de Borrelia burgdorferi inactivados para sensibilizar lamicroplaca. Se utiliza como conjugado un anticuerpo monoclonal marcadocon peroxidasa y específicamente dirigido contra las cadenas gammahumanas (anti-IgG). La aplicación de la prueba consta de las etapassiguientes:

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• Etapa 1Las muestras a estudiar y los controles se diluyen en proporción 1/101 y sedepositan en los pocillos de la microplaca. Durante la incubación de 1 horaa 37ºC, las IgG anti-Borrelia burgdorferi presentes en la muestra se unen alantígeno de Borrelia fijado a los pocillos de la microplaca. Las IgG noespecíficas de Borrelia burgdorferi y el resto de las proteínas séricas soneliminadas mediante lavados al final de la incubación.

• Etapa 2Se coloca el conjugado (anticuerpo monoclonal específico de las cadenasgamma humanas marcado con la peroxidasa) en todos los pocillos de lamicroplaca. Durante esta incubación de 1 hora a 37ºC, el anticuerpomarcado se une a las IgG séricas que han reaccionado con el antígenoBorrelia. El conjugado que no se une es eliminado mediante lavados al finalde la incubación.

• Etapa 3La presencia de los complejos (Ag Borrelia, IgG anti-Borrelia burgdorferi,conjugado anti-IgG) que se forman eventualmente es revelada mediantela adición de una solución enzimática de revelado en cada pocillo.

• Etapa 4Tras incubación a temperatura ambiente (+18-30ºC) la reacción enzimáticase detiene mediante la adición de una solución de ácido sulfúrico 1N. Ladensidad óptica leída a 450/620 nm es proporcional a la cantidad de IgGanti-Borrelia burgdorferi presente en la muestra probada.

4- COMPOSICIÓN DEL KITLos reactivos son suministrados en cantidad suficiente para realizar96 determinaciones en un máximo de 6 series. Todos los reactivos estándestinados para utilizarse únicamente en el diagnóstico in vitro.

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Etiquetado Naturaleza de los reactivos Presentación

R1 Microplate Microplaca (lista para usar) : 12 tiras de8 pocillos separables, sensibilizadas con elantígeno Borrelia inactivado

1

R2 ConcentratedWashingSolution

Solución de lavado (10x) :TRIS-NaCl (pH 7,4), 1% Tween® 20.Conservante: 0,01% ProClin™ 300

2 x 100 mL

R3 NegativeControl

Control Negativo :Suero humano negativo a IgG anti-Borreliaburgdorferi, a antígeno HBs y a anticuerpos anti-VIH1, anti-VIH2 y anti-VHCConservante: 0,15% ProClin™ 300

1 x 0,75 mL

R4 Cut-off Control

Control de Valor Umbral :Suero humano reactivo a las IgG anti-Borreliaburgdorferi, y negativo al antígeno HBs y aanticuerpos anti-VIH1, anti-VIH2 y anti-VHCConservante: 0,15% ProClin™ 300

1 x 0,75 mL

R5 PositiveControl

Control Positivo :Suero humano reactivo a las IgG anti-Borreliaburgdorferi, y negativo al antígeno HBs y aanticuerpos anti-VIH1, anti-VIH2 y anti-VHCConservante: 0,15% ProClin™ 300

1 x 0,75 mL

R6 Conjugate(51x)

Conjugado (51x) : Anticuerpo monoclonal deorigen murino, anti-cadenas gammahumanas, acoplado a la peroxidasaConservante: 0,15% ProClin™ 300

1 x 0,7 mL

R7 Diluent Diluyente para muestras y conjugado : (listopara usar) : Tris-NaCl (pH 7,7), suero fetal deternero, 0,1% de Tween® 20 y rojo de fenol.Conservante: 0,15% ProClin™ 300

2 x 65 mL

R9 ChromogenTMB

Cromógeno (listo para usar) : 3,3’,5,5’ tetrametilbencidina (< 0.1%), H2O2 (<1%)

1 x 28 mL

R10 StoppingSolution

Solución de parada (lista para el uso) :Solución de ácido sulfúrico 1N

1 x 28 mL

Películas adhesivas 4

Consultar las indicaciones que aparecen en la caja para conocer lascondiciones de conservación y la fecha de caducidad de los reactivos.

5- PRECAUCIONES DE USOLa calidad de los resultados depende del respeto de las siguientes BuenasPrácticas de Laboratorio:• No utilizar los reactivos después de la fecha de caducidad.• No mezclar, ni asociar durante una misma serie, reactivos procedentes de

kits con números de lote diferentes.OBSERVACIÓN : Es posible utilizar otros lotes de Solución de Lavado(R2 identificado 10x en color naranja), de Cromogen (R9 identificado TMBen color turquesa) y de Solución de Parada (R10 identificado 1N en colorrojo) que los que se suministran en el kit, a condición de utilizar reactivosestrictamente equivalentes de un mismo y único lote en el transcurso de unamisma serie.• Antes de utilizar, esperar 30 minutos a que los reactivos adquieran la

temperatura ambiente (+18-30°C).• Reconstituir o diluir minuciosamente los reactivos, evitando cualquier

contaminación.• No realizar el test en presencia de vapores reactivos (ácidos, alcalinos,

aldehídos) o de polvos que pudieran alterar la actividad enzimática delconjugado.

• Utilizar preferentemente material de un solo uso. En su defecto, utilizarartículos de cristal lavados y enjuagados con agua destilada.

• El lavado de las cúpulas de los pocillos es una etapa esencial de lamanipulación: respetar el número de ciclos de lavado prescrito yasegurarse de que todas las cúpulas se rellenan perfectamente y luego sevacían por completo. Un mal lavado puede provocar resultadosincorrectos.

• No dejar secar la microplaca entre el final de los lavados y la distribuciónde los reactivos.

• No utilizar nunca el mismo recipiente para distribuir el conjugado y lasolución reveladora.

• La reacción enzimática es muy sensible a todos los metales o ionesmetálicos. Por consiguiente, ningún elemento metálico debe entrar encontacto con las diferentes soluciones que contienen el conjugado o elcromógeno.

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• El Cromógeno (R9) debe ser incoloro. La aparición de un color azul indicaque el reactivo no es utilizable y debe reemplazarse.

• Utilizar un cono de distribución nuevo para cada muestra.• Comprobar la exactitud de las pipetas y el correcto funcionamiento de los

aparatos utilizados.

INSTRUCCIONES DE HIGIENE Y SEGURIDADLos componentes de origen humano que se utilizan en la preparación de losreactivos se han sometido a tests y han resultado no reactivos para elantígeno de superficie de la hepatitis B (Ag HBs), los anticuerpos dirigidoscontra el virus de la hepatitis C (anti-VHC) y los anticuerpos dirigidos contra elvirus de la inmunodeficiencia humana (anti-VIH1 y anti-VIH2). Dado queningún método es capaz de garantizar de manera absoluta la ausencia deagentes infecciosos, ha que considerar los reactivos de origen humano y lasmuestras de los pacientes como potencialmente infecciosos y manipularloscon las precauciones habituales:• Considerar el material que está directamente en contacto con las muestras

y los reactivos de origen humano así como las soluciones de lavado, comoproductos contaminados.

• Utilizar guantes de un solo uso para manipular reactivos y muestras.• No pipetear con la boca.• Evitar las salpicaduras de muestras o de soluciones que las contengan.

Limpiar las superficies manchadas con lejía diluida al 10%. Si el líquidocontaminante es un ácido, neutralizar previamente con bicarbonato sódicolas superficies manchadas y a continuación limpiar con lejía y secar conpapel absorbente. El material utilizado para la limpieza deberádesecharse en un contenedor especial para desechos contaminados.

• Eliminar las muestras, los reactivos de origen humano y el material y losproductos contaminados después de su descontaminación:- ya sea mediante inmersión en lejía a una concentración final de 5% de

hipoclorito de sodio durante 30 minutos.- o bien mediante autoclave a 121ºC durante al menos 2 horas.

CUIDADO : no introducir en el autoclave soluciones que contenganhipoclorito de sodio

• Evitar todo contacto del Cromógeno y de la Solución de Parada con la piely las mucosas.

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• La manipulación y la eliminación de desechos químicos y biológicos debenhacerse siguiendo las Buenas Prácticas de Laboratorio.

• Todos los reactivos del kit están destinados a un solo uso diagnóstico invitro.

Cuidado: ciertos reactivos contienen ProClin™ 300 ≤≤ 0,15%

R43: Posibilidad de sensibilización en contacto con la piel.S28-37: En caso de contacto con la piel, lávese inmediata yabundantemente con agua y jabón. Úsense guantes adecuados.

6- MUESTRAS1. Las pruebas se realizan sobre muestras de suero o de plasma recogido

sobre anticoagulante de tipo EDTA, heparina o citrato.2. Respetar las instrucciones siguientes para la extracción, el tratamiento y la

conservación de las muestras de sangre:• Extraer una muestra de sangre siguiendo las prácticas en uso.• Para los sueros, dejar que se forme el coágulo totalmente antes de

centrifugar.• Conservar los tubos cerrados.• Después de la centrifugación, extraer el suero o el plasma y conservarlo

en tubo cerrado.• Si la prueba se realiza en el plazo de 7 días, las muestras se

conservarán a +2-8°C.• Si la prueba no se realiza en el plazo de 7 días, o para cualquier envío,

las muestras se congelarán a -20°C (o más frío).• Se recomienda no proceder a más de cinco ciclos de congelación/

descongelación. Las muestras deberán homogeneizarse minuciosamente(vortex) después de descongelar y antes de realizar la prueba.

3. Los resultados no se ven afectados por muestras que contengan 90 g/l dealbúmina o 100 mg/l de bilirrubina no conjugada, las muestras lipémicasque contengan el equivalente de 36 g/l de trioleína (triglicérido) omuestras hemolizadas que contengan 10 g/l de hemoglobina.

4. No calentar las muestras.

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Xi - Irritante

7- MODO DE ACTUACIÓN

7.1. MATERIAL NECESARIO NO SUMINISTRADO• Agitador tipo vortex.• Lector de microplacas equipado con filtros 450/620 nm (*).• Incubador de microplacas que admite termostato a 37°C (*).• Sistema de lavado automático, semiautomático o manual para microplacas

(*).• Agua destilada o desionizada estéril.• Guantes de un solo uso.• Gafas de protección.• Papel absorbente.• Pipetas o multipipetas, automáticas o semiautomáticas, ajustables o fijas,

que pueden medir de 10 µl a 1.000 µl, y 1 ml, 2 ml y 10 ml.• Probetas graduadas de 25 ml, 50 ml, 100 ml y 1.000 ml.• Hipoclorito de sodio (lejía) y bicarbonato de sodio.• Contenedor de desechos contaminados.• Tubos de un solo uso.(*) Para obtener una información más detallada sobre los aparatos validadospor nuestros servicios técnicos, consúltennos.

7.2. RECONSTITUCIÓN DE LOS REACTIVOS• R1: Esperar 30 minutos a que adquiera la temperatura ambiente

(+18-30°C) antes de abrir la bolsa. Sacar el soporte y volver a ponerinmediatamente en la bolsa las tiras no utilizadas, comprobando que estépresente el secante. Volver a cerrar minuciosamente la bolsa y poner denuevo a +2-8°C.

• R2: Diluir a 1/10 la solución R2 con agua destilada: 100 ml de R2 en900 ml de agua destilada. Se obtiene de este modo la solución lista parausar. Tener previstos 350 ml de solución de lavado diluida para una placaentera de 12 tiras en modo de lavado manual.

• R3, R4, R5: Diluir a 1/101 en el Diluyente (R7) (ejemplo: 10 µL R3 + 1 ml R7)• R6+R7: El Conjugado R6 se presenta en forma líquida concentrado 51

veces. Homogeneizar antes de usar. Diluir a 1/51 en el Diluyente (R7).Para una placa completa diluir en el momento en que se necesite 0,5 mlde Conjugado (R6) en 25 ml de Diluyente (R7). Dividir los volúmenes por5 para dos tiras.

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7.3. CONSERVACIÓN Y VALIDEZ DE LOS REACTIVOS ABIERTOSY/O RECONSTITUIDOS

El kit debe conservarse a +2-8°C. Cada elemento del kit conservado a +2-8°C antes de la apertura puede utilizarse hasta la fecha de caducidadindicada en el envase.• R1: Después de abrir, las tiras conservadas correctamente de nuevo en la

bolsa cerrada permanecen estables durante 1 mes a +2-8°C (comprobarque esté presente el secante).

• R2: Después de la dilución, la Solución de Lavado se conserva 2 semanasa +2-8°C. Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, laSolución de Lavado concentrada puede conservarse a +2-25°C hasta lafecha indicada en la etiqueta.

• R3, R4, R5, R6, R7: Después de abrir y si no hay presencia decontaminación, los reactivos conservados a +2-8°C son estables durante1 mes.

• R6+R7: Después de diluir, la solución de trabajo del conjugado es estable8 horas a temperatura ambiente (+18-30°C) o 24 horas a +2-8°C.

• R9: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivoconservado a +2-8°C es estable durante 2 meses.

• R10: Después de abrir y si no hay presencia de contaminación, el reactivoconservado a +2-8°C es estable hasta la fecha de caducidad indicada enla etiqueta.

7.4. MODO DE ACTUACIÓNSeguir al pie de la letra el protocolo propuesto y aplicar las Buenas Prácticasde Laboratorio.Antes de usar, esperar a que todos los reactivos se pongan a temperaturaambiente (+18-30°C).Utilizar los sueros de controles en cada dosificación para validar la calidadde la prueba.1. Establecer cuidadosamente el plan de distribución y de identificación de

los sueros de control y de las muestras de pacientes.2. Preparar la Solución de Lavado diluida (R2) [Consultar el Capítulo 7.2].3. Sacar el soporte y las tiras (R1) del envase protector [Consultar el Capítulo

7.2]

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4. Disolver los sueros de control R3, R4, R5 y las muestras de pacientes asometer a prueba (S1, S2, etc.) a 1/101 en el Diluyente (R7), es decir10 µl de muestra y 1,0 ml de Diluyente (R7). Homogeneizar correctamente(vortex).

5. Distribuir en cada cúpula 200 µl de los sueros de control y de las muestrasdiluidas según el esquema siguiente:

6. Cubrir la microplaca con una película adhesiva apoyando bien sobre todala superficie para garantizar la estanqueidad, a continuación incubarinmediatamente la microplaca al baño maría con termostato o en unaincubadora seca de microplacas durante 1 hora ± 5 minutos a 37°C ±1°C

7. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar elcontenido de todos los pocillos en un contenido para desechoscontaminados (que contienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavadoscon 350 µl de la Solución de Lavado (R2). Secar las tiras empapándolasen una hoja de papel absorbente y golpear ligeramente para eliminar latotalidad de la Solución de Lavado.

8. Preparar la solución de trabajo del conjugado (R6+R7) [Consultar elCapítulo 7.2]. Distribuir inmediatamente 200 µl de la solución de trabajodel conjugado (R6+R7) en todas los pocillos. Agitar delicadamente estasolución antes de usarla.

9. Tapar la microplaca de un film adhesivo apoyando bien sobre toda lasuperficie para garantizar la estanqueidad. Incubar la microplaca al bañomaría con termostato o en una incubadora seca de microplacas durante1 hora ± 5 minutos a 37°C ± 1°C.

49

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A R3 S5 S13

B R4 S6

C R4 S7

D R5 S8

E S1 S9

F S2 S10

G S3 S11

H S4 S12

10. Al final de la primera incubación, retirar el film adhesivo, aspirar elcontenido de todas las cúpulas en un contenido para desechoscontaminados (que contienen hipoclorito de sodio) y proceder a 4 lavadoscon 350 µl de la Solución de Lavado (R2). Secar las tiras empapándolasen una hoja de papel absorbente y golpear ligeramente para eliminar latotalidad de la Solución de Lavado.

11. Distribuir rápidamente, y al abrigo de la luz fuerte, 200 µl del Cromógeno(R9) en todos los pocillos. Dejar la reacción desarrollarse en la oscuridaddurante 30 ± 5 minutos a temperatura ambiente (+18-30°C). Durante estaincubación, no utilizar el film adhesivo.

12. Detener la reacción enzimática añadiendo 100 µl de la Solución deParada (R10) en cada cúpula. Adoptar la misma secuencia y el mismoritmo de distribución que para la solución de revelado.

13. Secar minuciosamente la parte de abajo de las placas. Leer la densidadóptica a 450/620 nm con ayuda de un lector de placas en los 30 minutosque siguen a la parada de la reacción. Las tiras deben conservarsesiempre al abrigo de la luz antes de la lectura.

14. Asegurarse, antes de la transcripción de los resultados, de la concordanciaentre la lectura y el plan de distribución de las placas y de las muestras.

8- CÁLCULO E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

8.1. CALCULO DEL VALOR UMBRAL (VU)El valor umbral VU corresponde a la media de las densidades ópticas (DO)de los duplicados del Control Valor Umbral (R4):VU = media DO R4

8.2. CALCULO DE LA RATIO DE LA MUESTRALos resultados para una muestra dada se expresan bajo forma de una ratiocon ayuda de la fórmula siguiente:Ratio Muestra = DO muestra/VU

8.3. CONTROL DE CALIDADAnalizar los resultados de DO obtenidos con los sueros de control en cadamicroplaca y para cada serie. Para validar la manipulación, hay querespetar los criterios siguientes:

• Valores de las densidades ópticas:- VU > 0,200

50

- 0,80 x VU < DO R4 Repl.1 < 1,20 x VU- 0,80 x VU < DO R4 Repl.2 < 1,20 x VU

(La DO individual de cada uno de los duplicados del Control R4 no debesepararse más de 20% del Valor Umbral)

• Informes de las densidades ópticas:- Ratio R3 (DO R3 / VU) < 0,5- Ratio R5 (DO R5 / VU) > 2,0

Si estos criterios no se cumplen, volver a empezar la manipulación.

8.4. INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

En caso de sospecha de infección, pueden ser útiles tests serológicoscomplementarios tales como la búsqueda de las IgM anti-Borrelia pueden serútiles para confirmar el diagnóstico. En caso de serología positiva o dudosa,se recomienda poner a prueba las muestras mediante un método deconfirmación de tipo Western-Blot (8).

8.5. POSIBLES CAUSAS DE ERROREl origen de las reacciones no validadas o no reproducibles guarda amenudo en relación con las causas siguientes:• Lavado insuficiente de las microplacas.• Contaminación de las muestras negativas por un suero o un plasma que

contenga un título elevado de anticuerpos.• Contaminación puntual de la solución de revelado por agentes químicos

oxidantes (lejía, iones metálicos, etc.).• Contaminación puntual de la Solución de Parada.

51

Ratio muestra Resultado InterpretaciónRatio < 0,80 Negativo La muestra se considera negativa para la presencia de

anticuerpos IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato.0,80 ≤ Ratio < 1,2 Dudoso La muestra se considera dudosa para la presencia de

anticuerpos IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato. Elresultado debe ser confirmado por una nueva pruebarealizada en una nueva muestra extraída como mínimo3 semanas después de la fecha del 1er examen.

Ratio ≥ 1,2 Positivo La muestra se considera positiva para la presencia deanticuerpos IgG anti-Borrelia burgdorferi sensu lato.

8.6. EJEMPLO DE CALCULONota: Los datos siguientes no constituyen más que un ejemplo y no debenutilizarse en lugar de datos obtenidos por el usuario.

• Valor Umbral:- VU = (0,502+0,498)/2 = 0,500

• Valores de las densidades ópticas:- DO VU = 0,500 (N > 0,200)- DO R4 Repl.1 = 0,502 (0,80 DO VU < DO R4 Repl.1 < 1,20 DO VU)- DO R4 Repl.2 = 0,498 (0,80 DO VU < DO R4 Repl.2 < 1,20 DO VU)

• Informes de las densidades ópticas:- Ratio R3 = 0,29 (N < 0,5)- Ratio R5 = 2,88 (N > 2,0)

• Control de calidad: Conforme

9- RESULTADOS9.1. PREVALENCIASe ha evaluado un panel de 295 muestras, obtenidas a partir de donantes desangre del norte de Francia, con el fin de determinar la prevalencia deanticuerpos IgG dirigidos contra Borrelia burgdorferi sensu lato en suerohumano. Los resultados obtenidos son los siguientes: 291 sueros negativos,1 suero dudoso y 3 sueros positivos. La prevalencia medida mediante elanálisis Platelia™ Lyme IgG se establece entonces en 1,02% (3/295).

52

Controles yMuestras de pacientes

DO (450/620 nm) Ratio Resultado

R3 0,144 0,29 NegativoR4 0,502 / /R4 0,498 / /R5 1,440 2,88 Positivo

Muestra 1 1,650 3,30 PositivoMuestra 2, etc... 0,120 0,24 Negativo

9.2. ESPECIFICIDAD

9.2.1 Especificidad en zona no endémicaLa especificidad fue determinada para un panel de 279 sueros recogidos apartir de donantes de sangre que viven en la zona no endémica del norte deFrancia. Dichas muestras se seleccionaron en base a la negatividad de losresultados obtenidos con un kit de análisis EIA comercializado en Europa(marca de identificación UE), que servía de referencia.

9.2.2 Especificidad en zona endémicaLa especificidad se ha determinado también para un panel de 193 suerosrecogidos a partir de donantes de sangre que viven en la zona endémica deleste de Francia, los cuales no presentaban ningún antecedente que pudieraindicar una enfermedad de Lyme (ausencia de síntomas clínicos a favor deuna borreliosis y ausencia de indicios de picadura de garrapata). Dichasmuestras se seleccionaron en base a la negatividad de los resultadosobtenidos con un kit de análisis EIA comercializado en Europa (marca deidentificación UE), que servía de referencia.Los resultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla:

(1) Los resultados dudosos fueron excluidos de los cálculos de especificidad.(2) La muestra que resultó positiva con la prueba Platelia™ Lyme IgG resultó negativa

con Western-blot.(3) IC 95%: intervalo de confianza del 95%.

9.3. SENSIBILIDADLa sensibilidad del análisis Platelia™ Lyme IgG se ha estudiado comocomplemento a la del análisis Platelia™ Lyme IgM (Ref. 72951) en unapoblación de 70 muestras, de pacientes que padecían diversas formas de laenfermedad de Lyme en diferentes estadios clínicos. Los resultados obtenidosse presentan en la siguiente tabla y se comparan con los obtenidos con kitsde análisis EIA comercializados en Europa (marca de identificación UE), yque sirven como referencia:

53

Panel de sueros Negativo Dudoso (1) Positivo (2) Especificidad

Zona no endémica(n=279)

[IC 95%] (3)

278 1 0100,0%

(278/278)[98,9%-100,0%]

Zona endémica(n=193)[IC 95%]

278 2 199,5%

(190/191)[97,1%-99,9%]

(1) Los resultados dudosos fueron excluidos de los cálculos de sensibilidad.La sensibilidad del análisis Platelia™ Lyme IgG se ha estudiado también paraun panel documentado suministrado por el CDC (Center for Disease Control)y se ha comparado con las obtenidas con kits de análisis EIA comercia-lizados en Europa (marca de identificación UE) y en los Estados Unidos(aprobados por la FDA). Los resultados se presentan en la siguiente tabla:

(1) Los resultados dudosos fueron excluidos de los cálculos de sensibilidad.

54

Estadio Clínico

Númerode

Sueros

Platelia™ Lyme (1) ReferenciaEuropa (1)

ReferenciaEE.UU. (1)

IgG IgM IgG + IgM IgG + IgM IgG + IgM

Eritema migrante[IC 95%]

2838,5%[20,2%-59,5%]

73,7%[48,8%-90,9%]

86.4%[65.1%-97.1%]

70.4%[49.8%-86.3%]

87.0%[66.4%-97.2%]

Artritis/Artralgia[IC 95%]

6100,0%[60,7%-100,0%]

40,0%[5,3%-85,3%]

100.0%[60.7%-100.0%]

100.0%[60.7%-100.0%]

100.0%[60.7%-100.0%]

Indeterminado[IC 95%]

4100.0%[36,8%-100,0%]

100,0%[0,05%-100,0%]

100.0%[47.3%-100.0%]

100.0%[19.4%-99.9%]

73.7%[36.8%-100.0%]

Estadio ClínicoNúmero

deSueros

Platelia™ Lyme (1) ReferenciaEuropa (1)

IgG IgM IgG + IgM IgG + IgMEritema migrante

(Estadio I)[IC 95%]

1766,7%

[38,4%-88,2%]58,8%

[32,9%-81,6%]82,4%

[56,6%-96,2%]93.3%

[68.1%-99.8%]

Neuroborreliosis(Estadio II)

[IC 95%]33

96,9%[83,4%-99,9%]

36,7%[19,9%-56,1%]

96,9%[83,4%-99,9%]

97.0%[84.2%-99.9%]

Acrodermatitiscrónica atrofiante

(Estadio III)[IC 95%]

5100,0%

[54,9%-100,0%]20,0%

[0,05%-71,6%]100,0%

[54,9%-100,0%]100.0%

[54.9%-100.0%]

Artritis de Lyme(Estadio III)

[IC 95%]

15100,0%

[81,9%-100,0%]0,0%

[0,0%-18,1%]100,0%

[81,9%-100,0%]100.0%

[81.9%-100.0%]

9.4. PRECISION• Precisión intra-análisis (repetibilidad):Con el fin de evaluar la repetibilidad intra-análisis, una muestra negativa, unamuestra dudosa y dos muestras positivas han sido testadas en 30 ocasiones,en una misma serie. Se ha determinado para cada muestra la proporción(DO muestra/VU). En el cuadro siguiente se presentan las medias de lasproporciones, la desviación estándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV)para cada muestra.

Precisión intra-análisis (repetibilidad):

• Precisión inter-análisis (reproducibilidad):Con el fin de evaluar la reproducibilidad inter-análisis se han testado unamuestra negativa, una muestra dudosa y dos muestras positivas, cada una enduplicado y en dos series al día, durante un periodo total de 20 días. Se hadeterminado para cada muestra la proporción (DO muestra/VU). En elcuadro siguiente se presentan las medias de las proporciones, la desviaciónestándar (DS) y el coeficiente de variación (%CV) para cada muestra.

Precisión inter-análisis (reproducibilidad):

9.5. REACTIVIDAD CRUZADASe han testado con el kit Platelia™ Lyme IgG un total de 384 muestras concaracterísticas susceptibles de conducir a reacciones no específicas. Losresultados obtenidos se presentan en la siguiente tabla:

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N=30MuestraNegativa

Muestra dudosa

Muestra positiva débil

Muestrapositiva fuerte

Proporción (DO Muestra/Valor Umbral)Media 0.10 0.95 1.38 6.31

DS 0.007 0.082 0.116 0.134% CV 6.0% 8.6% 8.4% 2.1%

N=80MuestraNegativa

Muestra dudosa

Muestra positiva

Muestrapositiva fuerte

Proporción (DO Muestra/Valor Umbral)Media 0,19 0.85 3.92 6.67

DS 0,032 0.115 0.335 0.650% CV 17,3% 14.8% 8.4% 9.7%

(1) Los resultados dudosos fueron excluidos de los cálculos de reacciones cruzadas.(2) No difiere significativamente del porcentaje de prevalencia en la zona endémica

(prueba de Fisher, p>0,05)Los 2 sueros de CMV y Malaria que han resultado positivos con el análisisPlatelia™ Lyme IgG fueron también positivos con el kit de análisis EIAcomercializado en Europa (marca de identificación UE), pero no han sidoconfirmados por el método Western-Blot. El suero de Factor reumatoide que ha resultado positivo con el análisisPlatelia™ Lyme IgG ha sido confirmado positivo con el kit de análisis EIA ypor el método de Western-Blot.El suero de Leptospirosis positivo con el análisis Platelia™ Lyme IgG ha dadoresultado dudoso con el kit de análisis EIA y se ha confirmado negativo por elmétodo de Western-Blot.El suero de Sífilis que ha resultado positivo con el análisis Platelia™ Lyme IgGha sido confirmado negativo con el kit de análisis EIA y por el método deWestern-Blot.

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PanelNúmero deMuestras

Dudosas (1) Positivas% de reacciones

cruzadasSífilis 83 4 1 1.3% (2)

CMV 50 1 1 2.0% (2)

EBV 22 1 0 0.0%Leptospirosis 15 1 1 7.1% (2)

Malaria 20 1 1 5.3% (2)

Anticuerposantinucleares (ANA)

22 0 0 0.0%

Anticuerposheterófilos (HAMA)

10 0 0 0.0%

Factor reumatoide 44 1 1 2.3% (2)

HSV 30 0 0 0.0%Toxoplasmosis 38 0 0 0.0%

Rubeola 10 0 0 0.0%Sarampión 10 0 0 0.0%

Paperas 10 0 0 0.0%HIV 10 0 0 0.0%VZV 10 0 0 0.0%

TOTAL 384 9 5 1.33%

10-LÍMITES DE USOEl diagnóstico de infección por Borrelia burgdorferi no puede establecersedefinitivamente más que en un conjunto de datos clínicos y biológicos.El resultado de un único test de investigación de los anticuerpos IgG anti-Borrelia burgdorferi no constituye en sí una prueba suficiente para undiagnóstico de infección por Borrelia burgdorferi sensu lato. En caso deserología positiva o dudosa, se recomienda poner a prueba las muestrasmediante un método de confirmación de tipo Western-Blot (8).

11-CONTROL DE CALIDAD DEL FABRICANTETodos los productos fabricados y comercializados por la sociedad Bio-Radestán bajo un sistema de garantía de la calidad desde la recepción de lasmaterias primas hasta la comercialización de los productos acabados. Cadalote de producto acabado es objeto de un control de calidad y sólo secomercializa si cumple con los criterios de aceptación. La documentaciónrelativa a la producción y al control de cada lote queda en manos delfabricante.

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8 REFERENCES 1. Aguero-Rosenfeld, M. E., Wang, G., Schwartz, I., Wormser, G. 2005. Diagnosis

of Lyme borreliosis. Clin. Microbiol. Rev. 18: 484-509. 2. Burgdorfer, W., Barbour, A. G., Hayes, S. F., Benach, J. L., Grunwaldt, E.,

Davis, J.P. 1982. Lyme disease – a tick-borne spirochetosis? Science. 216: 1317-1319.

3. Center for Disease Control and Prevention. 2004. Lyme disease – United States, 2001-2002. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 53: 365-369.

4. Hubalek, Z., Halouzka, J. 1997. Distribution of Borrelia burgdorferi sensu lato genomic groups in Europe, a review. Eur. J. Epidemiol. 13: 951-957.

5. Reed, K. D. 2002. Laboratory testing for Lyme disease: possibilities and practicalities. J. Clin. Microbiol. 40: 319-324.

6. Stanek, G., Strle, F. 2003. Lyme borreliosis. Lancet. 362: 1639-1647. 7. Wang, G., Van Dam, A. P., Spanjaard, L., Dankert, J. 1999. Molecular typing of

Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. Clin. Microbiol. Rev. 12: 633-653.

8. Wilske, B. 2003. Diagnosis of Lyme borreliosis in Europe. Vector Borne Zoonotic Dis. 3: 215-227.

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Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 10/2006Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880080