Métodos hidrodinámicos

Técnicas que involucran el transporte, movimiento, de macromoléculas biológicas en un fluído (agua)

• Sedimentación (velocidad y equilibrio)• Electroforesis (nativa y desnaturalizante)• Gel filtración, SEC• Dispersión de luz, light scattering (clásica y dinámica)

Obtenemos información de estructura cuaternaria, peso molecular, composición de subunidades, agregados, forma, grado de solvatación

SEDIMENTACIÓN

Transporte de una partícula en solución sometida a una fuerza (gravitacional o centrífuga)

Para sedimentar una partícula sólo por acción de la gravedad, deben ser partículas grandes.

Para separar macromoléculas biológicas en suspensión por sedimentación debemos usar fuerza centrífuga (CENTRIFUGACIÓN)

Y aceleraciones altas!

Particula en suspensión en medio fluído, en tubo de centrífuga, contenido en un rotor, que gira alrededor de su eje A a una velocidad angular ω, rad/s (=2π/60 rpm)

Simplificando, podemos decir que la partícula está sometida a 3 fuerzas:

Fc =fuerza centrífuga

Fb = fuerza de empuje

Ff = fuerza de friccción

Fc = m ω2 r m = masa partícula

ω = vel. angular rotor

r = radio rotor

Fb = mo ω2 r mo = masa del solvente desplazado

mo = m ν ρ ρ = densidad del solvente

ν = volúmen específico parcial

Ff = f v f = coeficiente de fricción

v = velocidad de la partícula

La partícula alcanza una velocidad constante (v) cuando la fuerza neta es cero: Fc + Fb + Ff = 0

v = ω2 r m (1 - ν ρ)

f

VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (v)

Definimos COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN (S):

S = v = m (1 - ν ρ)

ω2 r f

Multiplicando por el número de Avogadro N: m N = M (peso molecular)

S = M (1 - ν ρ)

N f

M = peso molecular

(1- ν ρ) = factor de empuje

f = coeficiente de fricción

S = M (1 - ν ρ)

N f

Relación de Svedberg

D = coeficiente de difusión:

D = k T/f = R T/N f

Relación entre coeficiente de sedimentación S y coeficiente de difusión D

S = D M (1 - ν ρ)

RT

Determinación de peso molecular M, en forma absoluta (sin estándares de peso molecular) pero hay que conocer S o D.

1 Svedberg, 1 S = 10-13 s

Experimento de velocidad de sedimentación. Solución de una proteína a determinada concentración, c, la sometemos a centrifugación. Se empieza a mover hacia el fondo del tubo y se genera una zona clara, sólo solvente cerca del menisco y un frente móvil que limita solvente de solución

Si seguimos la velocidad con que se mueve ese frente móvil (en una ultracentrífuga analítica), podemos determinar S, coeficiente de sedimentación para esa proteína

v = dr/dt = ω2 r S

Integrando: ln r/ro = ω2 S (t – to)

El frente de sedimentación es bien definido al principio pero se va deformando a medida avanza, por la difusión de las partículas en el frente. Partículas de alto M, difunden poco y el frente es más definido.

Determinación de S

Factores que afectan S

• Temperatura (S20,w)

• Masa a mayor M ═> mayor S, para ADN: M½

para proteínas: M2/3

• Forma S es inversamente proporcional a fPara partícula esférica no hidratada: fo = 6 π η ro

• Grado de solvatación

• ConcentraciónCon la concentración f aumenta ═> S disminuye con la conc.S = So (dil)/ 1 + k conc.

• Carga

S varía con el coeficiente de fricción, que a su vez depende de la concentración de la macromolécula utilizada, más fuertemente para moléculas extendidas

Se agrega a altas conc.

Proteína compacta

Molécula extendida

S = M (1 - ν ρ)

N f

f = coeficiente de fricción, depende de tamaño, forma, hidratación de la macromolécula

Relación entre coeficiente de sedimentación S y tamaño, forma, hidratación

S = M (1 - ν ρ)

N f

f = coeficiente de fricción, depende de tamaño, forma, hidratación de la macromolécula

Para macromolécula esférica y no hidratada: f = 6 π η ro

η = viscosidad del medio

ro = radio de la partícula, que está relacionado con su pero molecular, M:

Vo = 4/3 π ro3 = M ν /N

Relación entre coeficiente de sedimentación S y tamaño, forma, hidratación

ν = volumen específico parcial ≈ 1/ρ (partícula) ≈ Vo / m ≈ Vo N/ M

S = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012

ν1/3

S = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012

ν1/3

So = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012

ν1/3

A partir de la determinación de S, puedo inferir algo sobre la forma o el grado de hidratación de mi macromolécula en estudio

Primero, si conozco el M y asumo forma esférica, puedo calcular So

Por otro lado determino experimentalmente S, S20,w

Si S20,w > So ═> oligómero

Si S20, w < So ═> monómero con forma extendida

So = M2/3 (1 - ν ρ) x 0.012

ν1/3

A partir de la determinación de S, puedo inferir algo sobre la forma o el grado de hidratación de mi macromolécula en estudio

Ejemplo: Proteína de 50 kDa, ν = 0.73 mg/ml ═> So = 4.93

Por otro lado determino experimentalmente S, S = 5.67 S (PBS, 30ºC)

═> S20,w = 5.87 S

S20,w = 5.87 > So = 4.93 oligómero?

Calculo So para el dímero So = 7.75

Para el dímero: S20,w = 5.87 < So = 7.75

El resultado sugiere se trata de un dímero con forma extendida, f/fo >1

Valores de S de varias biomoléculas, organelos subcelulares y organismos

S

CENTRIFUGACIÓN

Diferencial (sobrenadante + sedimento “pellet”)

• La idea es sedimentar al fondo del tubo, el componente de mayor S • Se usa para separar una mezcla compleja en los distintos

componentes en base a sus diferencias de tamaño y/o masa• Diferencias grandes de S para lograr separación• En general se realiza en sistema homogéneo, pero se puede hacer

a través de gradiente de densidad

Frente móvil (frente de sedimentación)

• Las partículas se mueven a una velocidad determinada por su S, pero se detiene la centrifugación antes de que el componente más pesado alcance el fondo del tubo

• Para separar partículas que difieren en tamaño pero no en densidad (ej. proteínas)

• Puede ser en sistema homogéneo o en gradiente de densidad

ULTRACENTRIFUGACIÓN EN SOLVENTE HOMOGÉNEO (SIN GRADIENTE)

1) VELOCIDAD DE SEDIMENTACIÓN (FRENTE DE SEDIMENTACIÓN)

• Las partículas se mueven a una velocidad determinada por su S, se separan por diferencia en su tamaño

• Se forma un frente de sedimentación• Se usan velocidades altas (> 100.000 g)• Se registra variación de concentración a lo largo del tubo (dC vs dr)

2) EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN • Las partículas se separan por diferencia en su densidad• Se deja alcanzar el equilibrio entre sedimentación y difusión• Se forma un gradiente de concentración a lo largo del • Se usan velocidades bajas (100 – 10.000 g)• Se registra variación de concentración a lo largo del tubo (dC vs dr)

y se linealiza: lnC vs r2

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN

Desventajas de los experimentos velocidad de sedimentación:

• Instrumento caro y especializado: ultracentrífuga analítica

• Registro de la concentración, necesita compuesto que absorba y concentrado

• Dificultad en resolver mezclas

• Analítica, no preparativa

ULTRACENTRIFUGACIÓN ZONAL (SOBRE GRADIENTE DE DENSIDAD)

• La solución de la macromolécula se coloca sobre el gradiente

• Se usa alta velocidad

• Se forman bandas (zonas) y no un frente de sedimentación

• Mejor separación (y recuperación) de los componentes

• Se puede hacer preparativa

Partícula Densidad (ρ) Gradienteg/ml

RNA 2 Cs2SO4

DNA 1.7 CsCl

Ribosomas 1.55 CsCl

Proteínas 1.3 Glicerol, sacarosa, Ficoll

Organelos 1 – 1.3 Sacarosa, Ficoll, Percol

Lipoproteínas 1 KBr

EQUILIBRIO DE SEDIMENTACIÓN en gradiente

CENTRIFUGACIÓN ISOPÍCNICA

En ro:

ρ(gradiente) = ρ(particula) = 1/ ν