Hidrlisis de una Protena y ensayos para protenas y aminocidos Liliana S. Ramrez ; Roberto C. V. Bocanegra

RESUMEN:PRCTICA 11

Se realiz la hidrlisis de una protena as como su identificacin por medio de distintas pruebas y reacciones, preparando cuatro distintas soluciones con distintas protenas, la primera solucin fue etiquetada como solucin A y fue grenetina con cido clorhdrico concentrado agua destilada a reflujo, la segunda solucin etiquetada como solucin B que fue la grenetina hidrolizada neutralizada con hidrxido de sodio al 10%, la tercera solucin etiquetada como solucin C fue la grenetina sin hidrolizar utilizando agua destilada, la cuarta solucin etiquetada como solucin D, fue la solucin de albmina preparada con clara de huevo, posteriormente se realizaron pruebas de identificacin de aminocidos en las protenas dichas pruebas fueron: Reaccin Xantoproteca, reaccin de precipitacin, reaccin de biuret, reaccin con ninhidrina, reaccin con cido nitroso, la accin reguladora de aminocidos y una cromatografa en placa fina para identificacin de componentes de una protena. INTRODUCCIN:Las protenas son biopolmeros de los -aminocido, llamados as debido a que el grupo amino esta enlazado al tomo de carbono adyacente al grupo carbonilo. Las propiedades fsicas y qumicas de una protena estn determinadas por los aminocidos que la constituyen. Las subunidades individuales de los aminocidos se unen por medio de enlaces de amida llamados enlaces peptdicos.Los aminocidos son compuestos orgnicos que contienen las funciones cido carboxlico y amino. Dos aminocidos se pueden unir en condiciones adecuadas, a travs de un enlace amida, formando un dipptido. El dipptido puede incorporar un tercer aminocido, formando un tripptido. Cadenas con ms de 50 aminocidos se denominan protenas.DISCUSIN DE RESULTADOS:En el desarrollo de la prctica llevamos a cabo distintos procesos, en los cuales pudimos identificar uno por uno los distintos aminocidos que conforman a las protenas, dichos procesos e identificaciones se mencionan a continuacin:I.Hidrolisis de una protena (Solucin A): En un matraz baln de fondo plano colocamos 200mL, 1g de grenetina y 10mL de cido clorhdrico concentrado, y 10mL de agua destilada, a dicho matraz baln le adaptamos un refrigerante en posicin de reflujo y calentamos suavemente por 35 minutos, obtuvimos una mezcla con contaminantes de color y olor, y lo quitamos aadiendo un poco de carbn activado, calentando a ebullicin por 2 minutos y con ayuda de papel filtro, filtramos dicha solucin, obteniendo la solucin A, que fue la grenetina hidrolizada, la protena que en este caso fue la grenetina se separ en sus aminocidos diferentes, que los conforman, con eso pudimos posteriormente realizar las pruebas de identificacin de los aminocidos que conforman la grenetina, en general la reaccin de hidrolisis es la que se muestra a continuacin (Ver esquema 1).Esquema 1. Hidrlisis de una protena

II.Solucin Neutralizada de hidrolizado de Grenetina (Solucin B):Para la neutralizacin de la protena, tomamos 5mL de la grenetina que hidrolizamos en el paso anterior y con hidrxido de sodio al 10%, hasta un pH de 7, con ayuda de papel pH determinamos el punto hasta que se neutraliz la grenetina, obteniendo nuestro compuesto llamado zwitterin que es un aminocido estabilizado por una carga positiva y una negativa (Ver esquema 2). Esquema 2. Grenetina hidrolizada neutra

III.Solucin de Grenetina sin Hidrolizar (Solucin C): En un vaso de precipitados de 100mL colocamos 0.5g de grenetina y agregamos 20mL de agua destilada y agitamos vigorosamente, hasta disolucin total. IV.Solucin de Albmina (Solucin D): Preparamos la solucin e albmina (clara de huevo), agitando la clara por 10 segundos, agregamos 100mL de agua, agitamos y filtramos la solucin con un pedazo de manta de cielo.Dichas soluciones realizadas en el laboratorio, fueron utilizadas para realizar distinta pruebas de identificacin de aminocidos contenidos en la protena de grenetina y en la albmina, a continuacin se menciona cada una de ellas, as como los resultados obtenidos.1) Reaccin Xantoproteca:Esta prueba como sabemos caracteriza a los aminocidos aromticos. Esta reaccin se debe a la presencia de un grupo fenilo en la molcula proteica. Los complejos de la molcula proteica que son de importancia en esta reaccin son la tirosina y el triptfano. En dos tubos de ensayo colocamos en el primero 1mL de solucin de grenetina hidrolizada (Solucin A) y en el otro, 1mL de solucin de albmina (Solucin D), a cada tubo agregamos 2.5mL de cido ntrico concentrado, calentamos lentamente en un bao mara, esto para favorecer la formacin del in nitronio para que se lleve a cabo la reaccin de nitracin, en esta reaccin de identificacin esto nos sirvi para poder identificar en que tubo estaban presentes anillos aromticos, dicha reaccin da positiva mayoritariamente con la tirosina, al reaccionar obtenemos el anillo de benceno nitrado, obteniendo un precipitado amarillo del nitrocompuesto.La reaccin slo dio positiva en la albmina, ya que al analizar la tabla 1, nos damos cuenta que la albmina tiene el aminocido tirosina, y puesto que esta reaccin reacciona mayoritariamente en este, obtuvimos un color naranja intenso en este tubo al aadir el hidrxido de sodio, mientras que en el tubo donde estaba la grenetina, no obtuvimos ninguna coloracin, al no tener aminocidos con anillos aromticos presentes. Tabla 1. Aminocidos de la Albmina

La reaccin que sucede con la tirosina de la albmina fue la siguiente (Esquema 3).Esquema 3. Reaccin Xantoproteca

2) Reaccin de Precipitacin: El enlace disulfuro es un enlace covalente que se produce cuando dos grupos sulfhidrlo (SH) reaccionan para formar un puente disulfuro (SS). Los residuos de cistena pueden formar puentes disulfuro. Pueden unir 2 cadenas peptdicas o una sola para formar un anillo. Dicha prueba identifica los enlaces disulfuro de las protenas, n mayor parte las protenas que contengan un nmero mayor de puentes disulfuro, en la prueba en un tubo de ensayo colocamos 2mL de grenetina hidrolizada, en otro 2mL de albmina y en un tercero 2mL de agua destilada, agregamos 5mL de solucin de hidrxido de sodio al 10% y 1 mL de acetato de plomo, obtuvimos los siguientes resultados:SustratoObservaciones

Solucin A(Grenetina)Negativo (pp. Blanco)

Solucin D (Albmina)Positivo (pp. Caf)

Como podemos darnos cuenta, el plomo reacciona con los puentes disulfuro (esquema 4), formando un precipitado caf, que dio positiva en la almina indicndonos la existencia de dichos puentes disulfuro, reaccionando tanto en la cistena como en la metionina de la albmina que contienen puentes disulfuro. Esquema 4. Reaccin de precipitacin

3) Reaccin de Biuret: Es empleado para detectar la presencia de protenas o polipptidos, ms especficamente, para identificar enlaces peptdicos, cambiando de una coloracin azul cielo a una azul rey, indicndonos que la prueba fue postiva. En seis tubos de ensayo colocamos distintas soluciones, en las cuales colocamos las soluciones A, C y D, los resultados fueron los siguientes.SUSTRATOOBSERVACIONES

Agua DestiladaAzul cielo

Solucin A (Grenetina Hidrolizada)Sin color

Solucin C (Grenetina sin hidrolizarAzul rey

Solucin D Azul rey

Como podemos darnos cuenta, en los tubos donde se encontr la solucin de grenetina sin hidrolizar y en donde estaba la solucin de albmina, dieron la prueba positiva, esto nos quiere decir que en estos tubos las soluciones que tenan existencia de enlaces peptdicos, esto es aminos libres en su estructura, esto se debe a que en esos tubos hubo una desnaturalizacin de dichas protenas, es decir la estructura terciaria de las protenas se rompi dejando libres los aminos formando de nuevo los enlaces peptdicos no se hidrolizaron, por ello haba aminos libres por tanto enlaces peptdicos. (Ver esquema 5).Esquema 7. Reaccin con cido nitrosoEsquema 5. Reaccin de biuret, formacin de complejo de cobre con los aminos libres

4) Reaccin con Ninhidrina: Es una de las reacciones caractersticas del grupo -amino Por calefaccin de un -aminocido con dos molculas de ninhidrina da un producto intensamente coloreado. Aparece un color purpura con todos los aminocidos y pptidos, esto es con los aminocidos que tengan aminos libres, dndonos en esta reaccin con hidrxido de sodio y ninhidrina y al calentar obtenemos una coloracin purpura, esto quiere decir que las protenas con aminos libres reaccionaron con la ninhidrina y el hidrxido de sodio, puesto que en las dems soluciones, no tenan aminos libres primarios con quien reaccionar, los resultados fueron los siguientes:SUSTRATOOBSERVACIONES

Agua DestiladaPrueba negativa, sin color

Solucin BPrueba positiva, color purpura

Solucin CPrueba negativa, sin color

Solucin DPrueba negativa, sin color

Aminocido patrnPrueba positiva, color purpura

Como podemos darnos cuenta, la prueba dio positiva en el tubo con la grenetina neutralizada B, puesto que la ninhidrina reacciona con aminocidos con un pH de entre 4 a 8, y la solucin la tenamos en un pH neutro, por ello dio positiva y en el aminocido patrn, al tener aminos libres primarios pudo reaccionar, esto es un aminocido libre y puede reaccionar libremente. (Esquema 6).Esquema 6. Reaccin con Ninhidrina

5) Reaccin con cido nitroso Esta prueba nos permite determinar la cantidad de hidrogeno liberado de una amina en protenas, con la reaccin de cido nitroso, identificando los grupos aminos libres de los pptidos y las protenas midiendo la cantidad de nitrgeno liberado en la reaccin, las pruebas donde haya un burbujeo continuo, indica la existencia de dichos aminos libres, en la prueba de laboratorio obtuvimos los siguientes resultados.SustratoObservaciones

Agua DestiladaNegativo, no hubo burbujeo

Solucin APositivo, mucho burbujeo

Solucin CNegativo, no hubo burbujeo

Solucin DNegativo, no hubo burbujeo

Como podemos darnos cuenta, la nica prueba donde dio positivo fue en la solucin A, de grenetina hidrolizada, esto quiere decir que la hidrolisis fue parcial en nuestra solucin, ya que quedaron aminos libres con los cuales pudo reaccionar el cido nitroso y liberar ese nitrgeno gas (Ver esquema 7).Esquema 7. Reaccin con cido Nitroso

6) Accin Reguladora de AminocidosEn esta reaccin se pone en manifiesto como un aminocido acta como un cido o una base, ya que los aminocidos son anfteros, utilizamos hidrxido de sodio y cido clorhdrico para las diferentes reacciones. Agregamos a dos tubos de ensayo, en el primero colocamos 2mL de sol.B y en otro 2mL de agua destilada, 6 gotas de rojo congo, primero observamos que ambos mostraron un color rojo intenso, esto quiere decir que nuestras soluciones estaban bsicas, puesto que rojo congo al contacto si sigue rojo significa que nuestras soluciones estn en un pH bsico, al agregarle cido clorhdrico, el tubo 1 y tubo 2 cambiaron la coloracin a morado en diferentes velocidades, el tubo que contena agua cambio rpido al agregar una gota, el cambio fue en cuestin de segundos, mientras que en el tubo que contena la solucin B cambio lento, se le tuvieron que agregar 8 gotas para ello, la diferencia entre las velocidades del cambio de cloracin se debe a que los aminocidos presentes en la solucin B producen un efecto bfer que de alguna manera amortigua o dicho en otras palabras hace que la reaccin se lleve a cabo de manera lenta, con hidrxido de sodio fue lo mismo solo que viraron con fenolftalena a color rojo, los resultados fueron los siguientes (Ver esquema 8) Esquema 8. Accin reguladora de aminocidos

7) Cromatografa en placa fina: En una cromatoplaca colocamos tres puntos, el primero la solucin de grenetina, en el siguiente colocamos muestra de fenilalanina y al final glicina, corrimos la cromatografa en una solucin de isopropanol-agua (7:3) con 2 gotas de hidrxido de amonio para que no se corriera toda la placa en un solo rayo, al ser muy polar el isopropanol con los aminocidos muy polares, la cromatoplaca se corri muy lento, secamos la cromatoplaca y le aplicamos solucin de ninhidrina para revelar la placa, obteniendo distintas machas cuyo resultado se muestra a continuacin. Cromatografa en capa fina.

MuestrasDistancia recorridaFrente del solventeRf

SOLUCION B240.5

Fenilalanina2.940.725

Glicina240.5

Con estos resultados nos dimos cuenta que la grenetina por prueba de cromatografa, est compuesta en su mayor parte por glicina y no por fenilalanina.CONCLUSIN: Se llev a cabo la hidrolisis de una protena BIBLIOGRFIA:

1. Wade, Leroy. Qumica Orgnica, Volumen 2. Sptima. Mxico: PEARSON EDUCACION, 2011.pp: 1153-1161

2. Voet, voet, Bioqumica 3 edicin, Mxico, editorial panamericana, 2006, pp:71-100