practica nº2
TRANSCRIPT
PRÁCTICA DE LABORATORIO N° 02
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATRO. CÁLCULO DEL Km DE LA FOSFATASA
ALACALINA
I. INTRODUCCION
En las reacciones no catalizadas, la velocidad de reacción no es proporcional a la
concentración de cada uno de los reactantes. Esto consiste con el hecho de que la
velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno
de ellos. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferente. Cuando se mide el
efecto de la concentración en presencia de una cantidad constante de enzima, se
encuentra a muy baja concentración de sustrato, cantidades incrementadas de este
causan velocidades marcadamente incrementadas.
A altas concentraciones, la adicción de más sustrato tiene solamente un pequeño efecto.
Mediciones cuantitativas de la actividad enzimática, son necesarias para comprender su
función biología y para determinar la cantidad presente en una muestra. Una descripción
cuantitativa completa es compleja desde el punto de vista matemático a causa de los
muchos pasos intermediarios en una reacción enzimática, pero pueden hacerse
simplificaciones útiles. Una de las más efectivas es asumir que solo los sustratos y no los
productos están presentes, de modo que la reacción transcurre sólo en una dirección.
Bajo este supuesto se pueden hacer estimaciones de la velocidad máxima (Vmax)
alcanzables por cantidades dadas de enzimas y las concentraciones de sustrato
necesarias para conseguir la mitad de esta velocidad máxima. Esta concentración se
conoce como la constante de Michaelis-Mentem (Km) para enzima.
El conocimiento de la constante de Michaelis es útil para determinar cuanto sustrato
habrá de agregarse cuando se desea medir una enzima y lo que es mas importante, es
una guía para determinar cuan efectivamente una enzima particular está funcionado en
los tejidos de un organismo vivo. Este es uno de los parámetros que frecuentemente se
determinan en las enzimas.
El propósito del presente experimento, es estudiar la influencia de la concentración del
sustrato sobre la velocidad de un reacción enzimática, para lo cual se utilizara la enzima
fosfatasa alcalina de Oryctologus cuniculus “conejo “y como sustrato p-nitrofenilfosfato.
II. MATERIALES.
1. Material biológico :enzima fosfatasa alcalina
2. Materiales y equipo de laboratorio
Gradilla para tubos. Tubos de ensayo de 1.6 +125m Baño María a 37° Pizeta de agua destilada
3. Reactivos:
Buffer alcalino pH 10.5: Glicina (7.5 g) cloruro de magnesio (0.095 g.) agua
destilada (750 ml), hidróxido de sodio 0.1 N (85 ml), y agua destilada (c.s.p.
1 L )
Sustrato bufferado alcalino 0.012 M p-nitrofenilfostato disódico (0.436),
buffer alcalino pH 10.5 (c.s.p 100 ml).
Solución de hidróxido de sodio 0.02 N.
III. PROCEDIMIENTO
A. SISTEMA DE INCUBACIÓN:
COMPONENTES (ml) Y
PROCESO
TUBOS DE ENSAYO
1 2 3 4 5 6 7 8
Sustrato bufferado alcalino 0.012 M --- 0.0
2
0.04 0.06 0.1 0.5 1.0 1.0
Buffer alcalino pH10.5 1.1 1.0
8
1.06 1.04 1.0 0.6 0.1 0.2
Mezclar e incubar a 37° C por 5 minutos
Solución de enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 ----
Incubar a 37° C por 5 minutos
NaOH 0.02 N 10 10 10 10 1.0 10 10 10
B. VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ALCALINA:
Restar la lectura del tubo 8 de las lecturas de los demás tubos. Luego determinar la
actividad enzimática en cada uno de los tubos de incubación (del 1 al 7), para lo
cual comparar la lectura corregida de cada tubo con las lecturas de la curva de
calibración que será proporcionada, o también, multiplicar tales lecturas por el
factor de calibración que también será proporcionado.
Finalmente, utilizando la concentración molar del sustrato en cada tubo de
incubación y su correspondiente actividad enzimática, graficar de acuerdo a la
Ecuación de Michaelis Mentem y la Ecuación de Lineweaver-Burk, y empleando
dichas graficas calcular el Km y la Vmax.
IV. CUESTIONARIO.
1. ¿Cuál es el significado de Km?
El Km se define como aquella concentración de sustrato que permite a los enzimas trabajar a la mitad de su velocidad máxima (velocidad semi-máxima).
2. ¿Todas las enzimas presentan el mismo valor numérico de Km?
No, el valor de km para cada enzima es diferente, esto depende de cada sustrato y de los factores
ambientales como pH, temperatura y fuerza iónica.
3. ¿Cuál es el significado de un Km alto y un Km bajo?
Un km alto indica poca afinidad de la enzima por su sustrato.
Un km bajo significa alta afinidad de la enzima por su sustrato.
4. ¿A qué se denomina velocidad máxima de una reacción enzimática?
Es aquella que revela o da el número de recambio de una enzima, que es el número de moléculas
de sustrato convertidas en productos por unidad de tiempo por una molécula de enzima cuando
éste está totalmente saturado de sustrato.
5. ¿A que se denomina velocidad inicial de una reacción enzimática?
Se denomina velocidad inicial (V0) como la velocidad de incremento de producto en función del
tiempo cuando [P] es baja.
6. Utilizando la ecuación final obtenida por Michaelis-Mentem;
a) Despejar el valor de Km en función de las otras variables.[pic]luego de los arreglos respectivos:
[pic]
b) Despejar el valor de [S] en función de las otras variables.[pic]luego de los arreglos respectivos:
[pic]
c) Despejar el valor de Vmax en función de las otras variables.[pic]luego de los arreglos
respectivos:[pic]
7. ¿En qué unidades se expresa el Km?
La Km se expresa en unidades de micromoles (M).
8. ¿Qué importancia tiene la determinación del Km de una enzima?
Es importante para determinar cuánto sustrato habrá que agregar cuando se desea medir una
enzima y para determinar cuan efectivamente una enzima está funcionando en los tejidos de un
organismo vivo.
Es una característica para cada enzima; la Km nos da más información, pues
también nos indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato y a partir de
ellas podemos hallar la V.
9. ¿Qué parámetros deben conocerse para determinar la Km de una enzima?
Enzima
Sustrato
Temperatura (T°)
PH
Tiempo
Cofactor
10. ¿Cómo deben tabularse los datos para calcular el Km por el método de Lineweaver-Burk?
Para este método se necesita tabular de la siguiente manera:
Tubos 1/Sutrato (mM) 1/Velocidad
#1 [S] 1 V1
#2 [S] 2 V2
#3 [S] 3 V3
#4 [S] 4 V4
Para la grafica en el eje de las “x” va la inversa de la concentración de sustrato y el eje de las “y” la
inversa de la velocidad.
