praćenje fermentacije domaćeg bijelog vina iločkog vinogorja
TRANSCRIPT
Praćenje fermentacije domaćeg bijelog vina Iločkogvinogorja
Inkret, Ines
Undergraduate thesis / Završni rad
2015
Degree Grantor / Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: University of Zagreb, Faculty of Food Technology and Biotechnology / Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet
Permanent link / Trajna poveznica: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:594887
Rights / Prava: In copyright
Download date / Datum preuzimanja: 2021-10-28
Repository / Repozitorij:
Repository of the Faculty of Food Technology and Biotechnology
SVEUČILIŠTE U ZAGREBU
PREHRAMBENO-BIOTEHNOLOŠKI FAKULTET
Preddiplomski studij Biotehnologija
Ines Inkret
6259/BT
Praćenje fermentacije domaćeg bijelog vina
Iločkog vinogorja
ZAVRŠNI RAD
Modul: Biotehnološki aspekti proizvodnje vina
Mentor: dr. sc. Vesna Zechner - Krpan, red.prof.
Zagreb, 2015
DOKUMENTACIJSKA KARTICA Završni rad
Sveučilište u Zagrebu
Prehrambeno-biotehnološki fakultet
Preddiplomski studij Biotehnologija
Zavod za biokemijsko inženjerstvo
Laboratorij za biokemijsko inženjerstvo, industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju slada
i piva
Praćenje fermentacije domaćeg bijelog vina Iločkog vinogorja
Ines Inkret, 6259/BT
Sažetak: Cilj završnog rada bio je proizvesti bijelo vino od sorti Graševina bijela i Rajnski
rizling bijeli, pri čemu je korišteno grožđe s područja Iločkog vinogorja. Nakon vinifikacije u
privatnoj obiteljskoj vinariji Kočet provedena je kemijska analiza proizvedenog domaćeg vina
u laboratoriju Prehrambeno – biotehnološkog fakulteta. Određeni su osnovni parametri
kakvoće: šećer, ukupne i hlapljive kiseline, slobodni, vezani i ukupni sumpor, alkohol,
glicerol te jabučna, vinska, mliječna i limunska kiselina. Laboratorijske metode koje su pritom
bile korištene su: RS-metoda za određivanje šećera, neutralizacija s NaOH za ukupne kiseline,
polumikro postupak za hlapljive kiseline, titracija s NaOH za određivanje slobodnog i
vezanog sumpora, kemijska i denzitometrijska metoda za određivanje alkohola, enzimsko
određivanje glicerola te papirna kromatografija za određivanje jabučne, vinske, mliječne i
limunske kiseline. Rezultati analiziranog domaćeg bijelog vina su u skladu s vrijednostima
Pravilnika o vinu iz 1996. godine.
Ključne riječi: Graševina, Ilok, kemijska analiza, proizvodnja bijelih vina, Rizling
Rad sadrži: 35 stranica, 14 slika, 3 tablice, 14 literaturnih navoda
Jezik izvornika: hrvatski
Rad u tiskanom i elektroničkom (pdf format) obliku pohranjen u: Knjižnica
Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta, Kačićeva 23, Zagreb
Mentor: Dr. sc. Vesna Zechner-Krpan, red. prof.
Rad predan: rujan, 2015.
BASIC DOCUMANTATION CARD Final work
University of Zagreb
Faculty of Food Technology and Biotechnology
Undergraduate studies Biotechnology
Department of Biochemical Engineering
Laboratory of Biochemical Engineering, Industrial Microbiology, Malting and Brewing
Technology
Monitoring the fermentation of local white wine from vineyards of Ilok
Ines Inkret, 6259/BT
Abstract: The aim of final work was to produce white wine from Graševina and Rizling
varieties in private family winery Kočet. Used grapes were from Ilok wine region. After
production, various chemical procedures were applied in order to analyze produced domestic
wine at the Faculty of Food Technology and Biotechnology. So, basic wine quality
parameters such as: sugar, total and evaporative acidity, free, bounded and total sulfur,
alcohol, glycerol and malic, tartaric, lactic and citric acid were determined. Laboratory
methods that were used are: RS - method for determination of sugars, neutralization with
sodium hydroxide for total acidity, halfmicro procedure for the determination of evaporative
acidity, titration with NaOH for the determination of free and bound sulfur, chemical and
densitometric method for determination of alcohol, enzymatic determination of glycerol and
paper chromatography for the determination of malic, tartaric, lactic and citric acid. The
results of analyzed domestic white wine were in accordance with the Croatian wine
regulations from year 1996.
Keywords: chemical analysis, Graševina, Ilok, Rizling, white wine production
Thesis contains: 35 pages, 14 figures, 3 tables, 14 references
Original in: Croatian
Final work in printed and electronic (pdf format) version is deposited in: Library of the
Faculty of Food Technology and Biotechnology, Kačićeva 23, Zagreb
Mentor: PhD Vesna Zechner-Krpan, Full Prof.
Thesis delivered: September, 2015.
Sadržaj str.
1. Uvod ....................................................................................................................... 1
2. Teorijski dio ............................................................................................................ 2
2.1. Vino ................................................................................................................. 2
2.2. Vinska sorta Graševina bijela ........................................................................... 3
2.3. Vinska sorta Rajnski rizling bijeli ..................................................................... 4
2.4. Iločko vinogorje ............................................................................................... 5
2.5. Proizvodnja bijelih vina .................................................................................... 7
2.5.1. Muljanje i runjenje ................................................................................... 7
2.5.2. Cijeđenje i prešanje .................................................................................. 7
2.5.3. Sumporenje i bistrenje mošta.................................................................... 8
2.5.4. Alkoholno vrenje...................................................................................... 9
2.5.4.1. Kvasac Saccharomyces cerevisiae .................................................. 9
2.5.4.2. Burno vrenje ................................................................................... 10
2.5.4.3. Tiho vrenje i jabučno – mliječna fermentacija................................. 11
2.5.5. Bistrenje i filtracija vina .......................................................................... 12
2.5.6. Stabilizacija i dozrijevanje vina ................................................................ 13
3. Eksperimentalni dio ................................................................................................. 14
3.1. Materijali, aparature i metode .......................................................................... 14
3.1.1. Materijali ............................................................................................... 14
3.1.2. Aparature ............................................................................................... 14
3.1.3. Metode................................................................................................... 15
3.1.3.1. Određivanje koncentracije šećera RS-metodom ............................... 15
3.1.3.2. Određivanje ukupnih kiselina u vinu ............................................... 16
3.1.3.3. Određivanje hlapljivih kiselina po polumikro postupku ................... 17
3.1.3.4. Određivanje sumpora ...................................................................... 18
3.1.3.4.1. Određivanje slobodnog sumpora (20 min bez grijanja) ......... 18
3.1.3.4.2. Određivanje vezanog sumpornog dioksida ............................ 19
3.1.3.4.3. Određivanje ukupnog sumpora ............................................. 19
3.1.3.5. Određivanje alkohola kemijskom metodom ..................................... 20
3.1.3.6. Određivanje alkohola denzitometrijski ............................................ 21
3.1.3.7. Enzimsko određivanje glicerola ....................................................... 22
3.1.3.8. Određivanje jabučne, vinske, mliječne i limunske kiseline
papirnom kromatografijom .............................................................. 25
4. Rezultati .................................................................................................................. 27
4.1. Dnevnik fermentacije i dozrijevanja vina .......................................................... 27
4.2. Kemijska analiza domaćeg bijelog vina ............................................................ 29
4.3. Papirna kromatografija ..................................................................................... 30
5. Rasprava ................................................................................................................. 31
6. Zaključci ................................................................................................................. 34
7. Literatura................................................................................................................. 35
1. Uvod
1
Jedan od najstarijih i najvažnijih proizvoda tradicionalne biotehnologije je vino, čija je
proizvodnja karakteristična i posebice značajna za područje Republike Hrvatske. Povoljni
geografski položaj i umjerena klima glavni su razlozi za dugu tradiciju proizvodnje vina i
uzgoja plemenite vinove loze Vitis vinifera na ovom podneblju, koja je započela još u 6.
stoljeću. S vremenom su tradicionalne metode vinifikacije proučavane, testirane i potom
zamjenjivane novijim i modernijim metodama i postupcima, sve u svrhu optimizacije
postupka proizvodnje vina i dobivanja konačnog proizvoda bolje kvalitete.
Pravilnikom o vinu područje Republike Hrvatske podjeljeno je na 2 vinogradarske
regije, s time da sam se odlučila za proizvodnju i praćenje postupka fermentacije domaćeg
vina proizvedenog iz grožđa porijeklom iz regije kontinentalne Hrvatske (iz vinogradarske
zone C1 koja obuhvaća područje Slavonije i Podunavlja). Bijele sorte karakteristične za tu
vinogradarsku zonu su Graševina bijela, Pinot bijeli, Chardonnay bijeli, Traminac mirisavi,
Sauvignon bijeli i Rajnski rizling bijeli, od kojih sam izabrala dvije sorte za proizvodnju vina;
Graševinu i Rizling. Grožđe korišteno za vinifikaciju je porijeklom iz okolice Iloka, čije je
vinogorje poznato po odličnoj kvaliteti grožđa i vrhunskim vinima, zahvaljujući plodnom tlu i
idealnoj klimi za uzgoj vinove loze. Prije same fermentacije grožđe navedenih dviju sorti je
sljubljeno (kupažirano), kako bi se unaprijed osigurala zadovoljavajuća kvaliteta vina, s
obzirom na to da je godina 2014. bila vrlo kišna i vinogradarski nepovoljna za sazrijevanje
grožđa.
Cilj ovog rada je opis procesa vinifikacije, što uključuje postavljanje procesa, detaljno
praćenje svake faze fermentacije i dozrijevanja vina u privatnoj obiteljskoj vinariji Kočet te
kemijska analiza dobivenog vina u laboratoriju Prehrambeno – biotehnološkog fakulteta,
Zavoda za biokemijsko inženjerstvo, kako bi mu se odredili osnovni parametri kakvoće. Na
temelju dobivenih rezultata analize mogu se donijeti zaključci o izboru i kvaliteti grožđa,
provedenom procesu fermentacije, postupku dozrijevanja vina i najvažnije, zadovoljava li ovo
domaće vino kriterije propisane Pravilnikom.
2. Teorijski dio
2
1.1. Vino
Zakon o vinu iz 1996. godine (ZOV, NN 96/2003) propisuje da se vinom naziva
poljoprivredno prehrambeni proizvod dobiven alkoholnom fermentacijom mošta ili masulja
od svježeg ili prosušenog grožđa plemenite vinove loze Vitis vinifera L. ili njenih križanaca s
drugim vrstama roda Vitis namijenjenih proizvodnji vina ili drugih proizvoda od grožđa i
vina, s tim da je u soku takva grožđa sadržaj šećera najmanje 64°Oechsla (što odgovara
količini od 133 g/L). Vina se u užem smislu riječi dijele na mirna, pjenušava, biser i gazirana,
a specijalna vina se dijele na desertna, aromatizirana i likerska. Mirna vina se razvrstavaju u
suha, polusuha, poluslatka i slatka, a pjenušava, biser i gazirana u vrlo suha, suha, polusuha,
poluslatka i slatka (na temelju sadržaja neprevrelog šećera). Ovisno o raznim parametrima
poput kakvoće grožđa, uroda po hektaru, zrelosti, načina prerade, korisnog učinka
(randmana), sadržaja prirodnog etanola te organoleptičkim (senzornim) svojstvima, mirna
vina se razvrstavaju u stolna bez oznake zemljopisnog podrijetla, stolna s oznakom
kontroliranog zemljopisnog podrijetla (k.z.p.), kvalitetna s oznakom k.z.p., vrhunska s
oznakom k.z.p. i ograničenog vinorodnog područja, vrhunska s k.z.p. i ograničenih
specifičnih vinorodnih područja, te predikatna vina s k.z.p. Predikatna vina mogu biti: vina
kasne berbe, izborne berbe, izborne berbe bobica, izborne berbe prosušenih bobica i ledeno
vino. Po boji vina djelimo na bijela, ružičasta (koja mogu nositi još i oznaku rosé i opolo) i
crna (koja se mogu označavati i kao crvena). Kemijski sastav vina, kao i grožđa i mošta iz
kojeg se ono proizvodi, raznovrstan je i složen, pa nije moguće pouzdano utvrditi broj svih
sastojaka. Broj kemijskih spojeva u vinu poznatog sastava veći je od 600, a broj onih
kemijskih spojeva što vinu daju aromu procijenjen je na više od 3000. O kemijskom sastavu
vina ovisi njegova kakvoća, pa se zbog toga neki sastojci (npr. etanol i šećer) obvezno
označuju na naljepnici, neki se stalno nadziru radi očuvanja zdravstvene ispravnosti, a neki se
povremeno ispituju radi zaštite potrošača od mogućih zloporaba. Kakvoća se vina, uz
odgovarajuća objektivna mjerenja fizikalnih veličina, procjenjuje i subjektivno (kušanjem,
degustacijom, ocjenjivanjem boje, bistroće, mirisa i okusa). Taj posao obavljaju degustatori
(Anonimus 1).
3
2.2. Vinska sorta Graševina bijela
Graševina je u vinogradarskom sortimentu Republike Hrvatske (RH) zacijelo
najzastupljenija vinska sorta bijeloga grožđa (Slika 1). Pravilnikom o vinu (NN 159/04.)
uvrštena je među preporučene kultivare u svim podregijama regije Kontinentalna Hrvatska,
zbog toga što kontinentalna Hrvatska ima klimu sličnu Francuskoj iz koje sorta potječe.
Slika 1. Grozd sorte Graševina bijela
http://vinopedia.hr/wiki/index.php?title=Datoteka:Grassevina.jpg
Kvaliteta sorte Graševina varira, ovisno o kraju, pa je primjerice u istočnim
vinogradarskim područjima Hrvatske (npr. Podunavlje) njen mošt u prosjeku za 2 i više %
bogatiji šećerom i s nešto manjim ukupnim kiselinama, dok je u zapadnim vinogorjima taj
odnos obrnut. Vina Graševine se stoga u sastavu čak i znatnije razlikuju, ovisno o podrijetlu,
ali im je zajednička prepoznatljiva ugodna aroma, zelenkastožuta boja i svjež i skladan
(harmoničan) okus. U Hrvatskoj je Graševina najviše štićeno vino. Kao što je u ZOV-u
propisano, vina proizvedena iz grožđa ovog kultivara (ovisno o kakvoći prerađenog grožđa,
urodu po ha, stupnju zrelosti grožđa, načinu preradbe i njege, korisnom učinku-randmanu,
količini prirodnog alkohola i drugih sastojaka te organoleptičkim svojstvima) razvrstana su u
kvalitetne kategorije (stolna bez oznake zemljopisnog podrijetla i stolna s k.z.p., kvalitetna s
k.z.p. i vrhunska vina s k.z.p.. U svim kontinentalnim vinogradarskim podregijama proizvode
se kvalitetne Graševine s kontroliranim zemljopisnim podrijetlom. Najveći broj kvalitetnih
vina Graševine proizvodi se u podregiji Slavonija, upola manji u podregijama Plešivica i
4
Zagorje-Međimurje, zatim redom u podregiji Prigorje-Bilogora, Moslavina i na kraju u
Podunavlju. Najveći broj vrhunskih Graševina dolazi iz podregije Slavonija (vinogorja
Kutjevo, Slavonski Brod, Đakovo, te Daruvar). Prije agresije na RH štićene su kao vrhunske
(tada označavane kao čuvene) Graševine iz podregije Podunavlje (vinogorje Erdut, Srijem-
Ilok i Pajzoš te vinogorje Baranja), no zbog ratnih zbivanja one su se prestale proizvoditi.
Neka su se od tih vina, nakon mirne reintegracije tog dijela RH, ponovno pojavila na tržištu. I
za stolno vino s oznakom zaštićenog podrijetla najviše proizvođača je registrirano u podregiji
Slavonija, a manje u ostalih pet podregija (Zagorje-Međimurje, Moslavina i Plešivica i
Prigorje-Bilogora). U podregiji Podunavlje za sada se ne štiti ni jedno vino Graševine iz
kategorije stolno vino s oznakom k.z.p. (Anonimus 2).
2.3. Vinska sorta Rajnski rizling bijeli
Rajnski rizling najpoznatija je i najcjenjenija bijela vinska sorta sjevernih vinorodnih
područja (Slika 2). Vjeruje se da sorta dolazi iz doline Rajne u Njemačkoj, iako Austrijanci
sortu nazivaju svojom, jer je 1301. godine u okolici Wachaua postojao vinograd zvan
Ritzling. Vino Rajnski rizling je svjetložute do slamnatožute boje, profinjene arome i bukea,
skladna puna i svježa okusa. U Hrvatskoj se (u skladu Pravilnika o Nacionalnoj listi priznatih
kultivara) uzgoj ove sorte preporuča se u svim podregijama kontinentalne Hrvatske
(Podunavlje, Slavonija, Moslavina, Prigorje-Bilogora, Plešivica, Pokuplje i Zagorje-
Međimurje). S tih podregija na tržište stižu vrhunska i kvalitetna vina Rajnskog rizlinga s
oznakom kontroliranog zemljopisnog podrijetla. Vrhunska vina Rajnskog rizlinga proizvode
se u vinogorjima Kutjevo, Feričanci, Plešivica-Okić i Međimurje. Broj zaštićenih vina
kvalitetne kategorije od istog kultivara višestruko je veći, dok je broj vina Rajnskog rizlinga iz
kvalitetne kategorije stolno vino upola manji. Podregija Podunavlje je zbog poznatih ratnih
stradanja bila duže vrijeme bez mogućnosti nastavka proizvodnje svih kategorija vina, pa tako
i Rajnskog rizlinga, ali je ta proizvodnja nakon mirne reintegracije ponovo obnovljena
(Anonimus 3).
5
Slika 2. Grozd sorte Rajnski rizling bijeli
http://www.loznicijepovi.hr/images/proizvodi/rajnski%20rizling.jpg
Boja ovog vina je zelenkasto-žuta, koja starenjem prelazi u zlatno-žutu. Karakteristike
sorte su naglašena kiselost, punoća i elegantna aroma te plemeniti, diskretni miris. Vino od
Rajnskog rizlinga je puno, zaokruženo, sa značajnim mirisom i aromom i ima dugi životni
vijek. Starenjem njegova vrijednost u pravilu raste. Rajnski rizling je i dobra podloga
plemenitoj plijesni, koja se razvija na već zrelim bobicama, što daje osnovu za odlična suha,
ali i slatka vina s prirodnim neprovrelim šećerom (Anonimus 4).
2.4. Iločko vinogorje
Područje Iloka pripada srijemskom vinogorju, odnosno podregiji Podunavlje, regije
Kontinentalna Hrvatska. Povijest vinogradarstva u Iloku izuzetno je duga s neprekinutom
tradicijom od gotovo 1800 godina, i to od kako su Rimljani posadili prve čokote na
srijemskim obroncima Fruške Gore koji se valovito spuštaju prema Dunavu. «Srijemsko vino
je tako ugodno, da bi isto, ili slično njemu na cijeloj zemlji bilo teško naći», zabilježio je još u
15.st. knjižničar kralja Matije Korvina. A da je tako svjedoči prošlost i sadašnjost, jer od Ilira
i Rimljana pa sve do danas, vinogradarstvo i vinarstvo su konstanta u životu stanovništva
iločkog kraja. Izuzetni mikroklimatski uvjeti i reljef kojim dominiraju blagi obronci Fruške
gore bili su podloga, a rad ljudi i njihovo znanje pokretači današnje bogate vinarske
proizvodne baštine (Slika 3). Rimski car Probus (276.-282.) je prvi uočio i isticao prednosti
6
koje ovaj kraj ima za uzgoj vinove loze, te uveo nove, kvalitetnije sorte podrijetlom iz Grčke.
Nakon oslobođenja od Turaka, kneževska obitelj Odescalchi obnovom dvorca nadograđuje,
proširuje i modernizira podrumarstvo i vinogradarstvo te sam vinski podrum koji je prvotno
građen u 15.st. Ovi napredni talijanski plemići u 17.st. donose u Ilok između ostalog i sorte
Traminac te Zeleni silvanac i podižu nove nasade. Danas je iločki Traminac prema rječima
struke ponajbolji u Hrvatskoj i šire, čemu u prilog govori činjenica da je poslužen na
svečanosti krunidbe engleske kraljice Elizabete II., a i prije toga je bio uvršten među vina koja
se poslužuju na engleskom kraljevskom dvoru. Pored Traminca tu su i Graševina, Rajnski
rizling, Chardonnay, Pinot, Frankovka, Cabernet sauvignon, Merlot i brojne druge sorte. U
drugoj polovici 20. stoljeća vinogradarstvo, voćarstvo i vinarstvo većim dijelom su bili
predmet aktivnosti zadruga, kada se podižu prvi i najveći plantažni nasadi vinograda na
prostorima bivše države. Nakon povratka Iločana iz progonstva 1998 g., obnovom,
privatizacijom i društvenom reorganizacijom sve je veći broj manjih, privatnih vinogradara i
vinara. Podignuto je oko 600 hektara novih nasada, te je sada pod vinogradima oko 1700
hektara zemlje koja trenutno broji oko 300 vinogradara i 17 vinarija (Anonimus 5).
Slika 3. Iločko vinogorje
http://www.agroklub.com/upload/slike/ilo%C4%8Dko-vinogorje.jpg
7
2.5. PROIZVODNJA BIJELIH VINA
Prilikom proizvodnje bijelih vina potrebna je iznimna pažljivost i stručnost, jer bijela
vina su za razliku od crnih podložnija procesu oksidacije, tako da i najmanja nepoželjna
promjena može nepovratno negativno utjecati na kvalitetu proizvedenog vina. Redoslijed
tehnoloških postupaka u vinifikaciji bijelih vina razlikuje se od onih u proizvodnji crnih vina i
naveden je u nastavku.
2.5.1. Muljanje i runjenje
Prerada grožđa započinje muljanjem. Obavlja se na strojevima runjača – muljača gdje
se bobica odvaja od peteljke runjenjem u bubnju s rupicama, a zatim se na valjcima mulja
(gnječi) bobica tako da se dobiva smjesa soka i krutih dijelova bobice (sjemenka i kožica)
koja se naziva masulj. Muljanjem se grožđe gnječi kako bi se iz njega oslobodio grožđani sok
(mošt) i započelo izrazito važno međudjelovanje mošta i kožica. U ovoj fazi bitno je izbjeći
ekstremno kidanje ili drobljenje bobica, jer to može rezultirati brzim oslobađanjem
prekomjerno gorkih i oštrih tanina iz kožica i sjemenki (Law, 2006.).
2.5.2. Cijeđenje i prešanje
Cijeđenje je faza u preradi grožđa koja nastupa nakon muljanja, gdje prirodnom
gravitacijom dolazi do oslobađanja grožđanog soka. Mošt koji smo dobili iz ocjeđivača naziva
se samotok i daje vino znatno bolje kvalitete od vina dobivenog prešanjem. U tijeku prerade
grožđa 40 – 70 % mošta dobijemo postupcima muljanja i cijeđenja, a preostali sok u masulju
oslobađa se prešanjem. Postoje preše različite izvedbe; mehaničke, hidraulične ili
pneumatske. U principu prešanje bi trebalo obaviti pod manjim pritiskom, kako bismo dobili
veću kvalitetu mošta (Muštović, 1985.).
Mošt se najvećim dijelom sastoji od vode (75 do 80 %), šećera (glukoza i fruktoza) i
kiselina (vinska, limunska, jabučna, jantarna itd.). Ostali sastojci prisutni u vinu su: dušične
tvari, mineralne tvari, tvari boje, tvari arome i vitamini (Zoričić, 1996.).
8
2.5.3. Sumporenje i bistrenje mošta
Nakon prešanja mošt se sumpori kako bi se ubrzalo taloženje nečistoća (čestica zemlje,
plijesni, sitnih ostataka lišća, sredstava za prskanje vinove loze itd.). Koriste se pomoćna
enološka sredstva poput Sumpovina (Slika 4.a) i Pyrovina (Slika 4.b) u skladu sa uputama
proizvođača, kako bi se osigurala potrebna koncentracija SO2 u moštu.
Slika 4. Sredstva za sumporenje
a) Sumpovin b) Pyrovin
Primarna uloga sumpornog dioksida je da sprječava rad štetnih bakterija i kvasaca, ali
usput pospješuje i proces taloženja, jer koagulira koloide koji se tada lakše i brže talože. Osim
toga, sumporov dioksid djeluje antioksidacijski (jer ne dopušta prijenos kisika na pojedine
sastojke masulja, mošta i vina posredstvom katalizatora enzima) te kao antiseptik jer na
određeno vrijeme odgađa početak alkoholne fermentacije. Sumpor i njegovi spojevi su našli
najširu primjenu u proizvodnji vina. Bez primjene sumpor (IV) oksida za vrenje mošta,
masulja i u tijeku njege vina nemoguće je proizvesti zdravo vino i sačuvati vrhunsku kakvoću
(Muštović, 1985.). Sumpor se u procesu vinifikacije najčešće koristi u obliku kalijevog
metabisulfita (K2S2O5). Ukoliko se nestručno primjenjuje i dodaje u prevelikoj količini može
nepovoljno djelovati na okus i kvalitetu vina pa čak i na ljudsko zdravlje (u krvi veže kisik i
vitamin B1). Da bi taloženje bilo efikasno, pored sumporenja potrebno je sniziti i temperaturu
9
mošta koja bi trebala iznositi od 6 – 10 °C, te na vrijeme provesti pretakanje kako bi se
izbjegle neželjene promjene na moštu. Ovakav vid prirodnog taloženja uglavnom se
primjenjuje u malim i srednjim vinarijama, dok se kod velikih proizvođača proces
pročišćavanja vina može ubrzati strojevima kao što su centrifuge, filteri, flotatori ili
kombinacija spontanog taloženja i strojeva (Muštović, 1985.).
2.5.4. Alkoholno vrenje
Prvi znanstveni podaci o alkoholnoj fermentaciji potječu od Louisa Pasteura prije oko
140 godina, kad je Pasteur prvi dokazao da su kvasci odgovorni za alkoholnu fermentaciju
mošta u proizvodnji vina. Fermentacija i proizvodnja vina složeni je biokemijski proces u
kojem sudjeluje veći broj mikrobnih vrsta, najviše kvasaca, mliječnih i octenih bakterija, a
ponekad nekih vrsta bakterija iz rodova Bacillus, Clostridium i Streptomyces. Neke vrste
imaju pozitivan, a neke negativan učinak na tijek fermentacije i zato je neophodno shvaćanje
tog osnovnog procesa u vinarstvu (Grba, 2010.).
ŠEĆER → ETANOL + UGLJIČNI DIOKSID + TOPLINA
C6H12O6 →2CH3CH2OH + 2CO2 + Q
2.5.4.1. Kvasac Saccharomyces cerevisiae
Kvasac Saccharomyces cerevisiae koristi energiju iz šećera prisutnih u moštu putem
respiracije i fermentacije. Respiracijom kvasac razlaže šećer u prisutnosti kisika i to koristi
prilikom svog razmnožavanja. Pri fermentaciji koja se odvija bez prisutnosti kisika kvasac za
svoje potrebe koristi samo kisik iz šećera prilikom njegovog razlaganja. Faza disanja nastupa
uglavnom prije i u početku alkoholne fermentacije, a značajna je za razmnožavanje kvasaca,
dok faza fermentacije bez prisutnosti kisika nastupa kasnije tj. kad su se kvasci namnožili, a
mošt i posuda u kojoj se odvija vrenje su prezasićeni ugljičnim dioksidom, uslijed čega su
stvoreni anaerobni uvjeti za kvasce. U takvim uvjetima, kvasci da bi si osigurali uvjete za
život moraju razlagati mnogo veće količine šećera. Reakcije respiracije i fermentacije se
smjenjuju u ovisnosti o prisutnosti kisika tj. uvjeta pod kojima se odvija vinifikacija
(Muštović, 1985.).
10
Uvaferm CM je komercijalni pripravak kvasca Saccharomyces cerevisiae, kojeg su
selekcionirali Sveučilište Davis i Lallemand (Slika 5). Uvaferm CM-a karakteriziraju snažan
početak vrenja, ravnomjerno završno vrenje, dobra tolerancija temperature, dobar kapacitet
vrenja (6,8 g šećera/L daje 1 vol. % alkohola), osrednje pjenjenje te činjenica da ne stvara
sumoprovodik ni hlapljive kiseline. Fermaid E je kompleksna hrana za kvasce koja sadrži
stanične stjenke kvasca (hranu potrebnu za razmnožavanje), kako bi se alkoholna fermentacija
odvijala što efikasnije, posebno kada je dušik ispod optimalne razine. Korištenje adekvatne
hrane za kvasac spriječava presporu fermentaciju i zastoj iste. Najčešći uzroci zastoja
fermentacije su: temperaturni stres, slaba adaptacija populacije kvasca, visoki alkohol,
nedostatak hrane i faktora neophodnih za preživljavanje kvasca (Anonimus 6).
Slika 5. Uvaferm CM
2.5.4.2. Burno vrenje
Burnim vrenjem nazivamo fazu alkoholne fermentacije koja traje 5 – 6 dana u
vinifikatoru (Slika 6) te predstavlja razdoblje s najintenzivnijom pretvorbom šećera u etanol i
CO2 koji izlazeći izaziva turbulentna kretanja mošta. Kako bi se ostvarilo zadovoljavajuće
burno vrenje potrebno je izabrati vrstu kvasca koja imaju visoku sposobnost previranja šećera
iz grožđa u alkohol. Ukoliko koncentracija prirodno prisutnih mikroorganizama u moštu nije
dovoljna za uspješnu provedbu vrenja, potrebno je inokulirati mošt selekcioniranim vinskim
kvascima. U proizvodnji vina, piva i jakih alkoholnih pića danas se upotrebljavaju sojevi
kvasca Saccharomyces cerevisiae. Njegovo svojstvo visoke fermentacijske aktivnosti i dobro
11
podnošenje različitih ekstremnih uvjeta okoline, prisutnih u industrijskim pogonima, dovelo je
do selekcije nekoliko stotina sojeva ovog kvasca s poznatim karakteristikama (Grba, 2010.).
Nakon završene fermentacije kvasci vrste S. cerevisiae brzo izumiru, tako da se rijetko
susreću u vinu i nemaju velikog značaja za pojavu naknadne fermentacije (Radovanović,
1986.).
Slika 6. Vinifikator
2.5.4.3. Tiho vrenje i jabučno – mliječna fermentacija
Tiho vrenje je faza alkoholne fermentacije koja traje obično 10, a ponekad i 20 i više
dana, ovisno o vanjskim uvjetima poput temperature procesa. Ono je od velikog značaja za
vino, jer se osim završetka fermentacije odigravaju i drugi procesi važni za buduća svojstva
vina. Zbog povećanog sadržaja alkohola i smanjenog sadržaja šećera smanjuje se aktivnost
kvašćevih stanica. U toj fazi izumire značajan broj kvaščevih stanica (20 – 30 %) što rezultira
opadanjam intenziteta fermentacije. Veliki dio grubih čestica vina kao i mrtve kvaščeve
stanice počinju sedimentirati i počinju se zapažati i prvi znaci spontanog bistrenja vina
(Muštović, 1985.).
12
U ovoj fazi započinje odvijanje procesa malolaktične fermentacije. U procesu biološkog
smanjenja kiselosti vina, mliječno – kisele bakterije metaboliziraju jabučnu kiselinu u
mliječnu kiselinu i CO2, čime se postiže deacidifikacija i mikrobiološka stabilizacija vina, a
dolazi i do modifikacije okusa vina (jabučna kiselina oštrijeg okusa prelazi u mliječnu
kiselinu blažeg okusa). Spontane bakterije dospjele iz grožđa (Oenococcus oeni,
Lactobacillus i Pediococcus) prisutne u vinu nakon alkoholnog vrenja provode malolaktičnu
fermentaciju. One neće u svim uvjetima provesti jabučno – mliječno vrenje, posebno ne u
teškim uvjetima kada je pH vrijedost manja od 3,2, količina alkohola veća od 13 vol. %,
ukupni SO2 veći od 30 mg/L i temperatura vrenja 16 °C (Boulton, 1996,).
2.5.5. Bistrenje i filtracija vina
Prilikom bistrenja vinu dodajemo bistrilo u prikladnom obliku (organsko, mineralno ili
sintetski proizvedeno), kako bi se fizikalno – kemijskim ili mehaničkim djelovanjem
potpomognulo izdvajanje nestabilnih tvari vina. Od organskih sredstava široko je
rasprostranjena uporaba želatine i tanina, ali i bjelanjka jajeta, albumina, kazeina itd. Od
mineralnih bistrila najčešće se koristi bentonit, silicijev dioksid i soli silicijeve kiseline.
Najveći broj bistrila djeluje na elektrostatičkom principu (električni naboj nekih tvari vina i
električni naboj bistrila utječu na to hoće li doći do njihove koagulacije, flokulacije i
precipitacije). Bistrilo mora biti drugog naboja (pozitivnog ili negativnog) u odnosu na čestice
mutnoće koje su u vinu uglavnom pozitivnog naboja. Sredstvo za bistrenje treba biti takvo da
njegov talog poslije koagulacije bude veće specifične težine od one koju ima vino koje želimo
bistriti. Uspjeh kod bistrenja vina bilo kojim sredstvom u velikoj je mjeri pod utjecajem
kiselosti vina na način da se vina sa višim pH vrijednostima lakše bistre (Sokolić, 2004).
Filtracija je postupak odstranjivanja nečistoća iz vina zadržavanjem čestica na
filtracijskom sloju kroz koji prolazi vino. Do pročišćavanja zadržavanjem dolazi kada su pore
filtra manje od čestica, pa se one zadržavaju na površini i u unutrašnjosti filtra. Čestice koje se
zadržavaju na filtru su veličine 50 - 200 µm i uglavnom su to dijelovi grožđane pulpe,
kvaščeve stanice i bitartaratni kristali (Boulton, 1996.). Najčešće korišteno filtracijsko
sredstvo korišteno za filtraciju vina je dijatomejska zemlja, koja se naplavljuje na filter u
nekoliko slojeva. Takvi naplavni filteri se upotrebljavaju za filtraciju vina s većim
zamućenjem. Osim filtera sa nasutim slojem u proizvodnji vina se koriste i filteri sa ulošcima
i membranski filteri, pogotovo u srednjim i većim vinarijama.
13
2.5.6. Stabilizacija i dozrijevanje vina
Cilj stabilizacije vina je spriječiti mutnoću i taloženje pojedinih sastojaka vina koje
mogu uzrokovati dušične tvari, bjelančevine, polifenoli, mikroflora, kiseline i soli kiselina.
Najvažniji uzročnici fizikalne nestabilnosti vina su kalcijevi tartarati i kalijevi bitartarati.
Kako bi se pospješilo njihovo taloženje, vino se izlaže niskim temperaturama od -4 do -6 °C
tijekom 5 – 7 dana, ovisno o količini alkohola i ukupnog ekstrakta vina. Biološku nestabilnost
vina mogu uzrokovati mikroorganizmi, kao što su kvasci i bakterije koje možemo preventivno
ukloniti iz vina pravilnom primjenom sumporova (IV) oksida kod prerade grožđa i taloženja.
(Zoričić, 1996.)
Termolabilne bjelančevine nestabilnost vina uzrokuju promjenom temperature. Njihovo
uklanjanje iz vina provodi se bentonitom jer ima vrlo veliku sposobnost apsorpcije
bjelančevina. Polifenoli u vinu postoje kao tvari boje antocijani i tanini, a podložni su
oksidaciji, pa time dolazi do nestabilnosti vina koja se očituje u promjeni boje od svijetložute
do smeđe. Tu pojavu zovemo posmeđivanje vina, a sprječavamo ju upotrebom sumporova
(IV) oksida. (Sokolić, 2004.)
Vina su nakon vrenja mutna, bez arome, neskladna i uglavnom mirišu na kvasac.
Prilikom dozrijevanja vina se bistre i dolazi do razvijanja tercijarne arome vina zbog
međusobnog usklađivanja svih tvari koje su tijekom vrenja proizvedene u vinu. Vino u dobro
zatvorenim tankovima od nerđajućeg čelika nije u kontaktu sa zrakom pa ono u njima vrlo
sporo dozrijeva. Dozrijevanjem se vino poboljšava do određene granice kada ono postigne
optimum kvalitete, nakon čega vino stari i kvaliteta mu se smanjuje.
3. Eksperimentalni dio
14
3.1. Materijali, aparature i metode
3.1.1. Materijali
0,1 M NaOH
0,01 M NaOH
25 % H3PO4
30 %-tni KI
26 %-tna H2SO4
1 %-tni škrob
0,1 M Na2S2O3
1 %-tna glukoza
Standard za papirnu kromatografiju (po 3 g/L jabučne, vinske, mliječne
i limunske kiseline)
Octena kiselina
n-butanol
Fehling I (69,3 g/L CuSO4×5 H2O)
Fehling II (346 g/L K,Na-tartarata)
Destilirana voda
Indikatori: -fenolftalein
-bromfenol-plavi se otopi u etanolu uz dodatak 1 M NaOH
3.1.2. Aparature
Laboratorijska aparatura za određivanje šećera
Laboratorijska aparatura za određivanje alkohola
Laboratorijska aparatura za određivanje sumpora
Laboratorijska aparatura za određivanje hlapljivih kiselina
Laboratorijska aparatura za određivanje ukupnih kiselina
Laboratorijska aparatura za određivanje jabučne, mliječne, vinske i
limunske kiseline
Kit K-GCROL (Megazyme) za enzimsko određivanje glicerola
15
ENO - VIN komplet (Jurana d.o.o.) za kemijsko određivanje ukupnih
kiselina i slobodnog SO2
pH metar
3.1.3. Metode
3.1.3.1. Određivanje koncentracije šećera RS-metodom
(Određivanje reducirajućih supstanci)
Postupak:
Vino: 2 mL vina uz dodatak 23 mL destilirane vode se uzme za uzorak. Doda se 10 mL
otopine A (Fehling 1) i 10 mL otopine (Fehling II). Kuha se točno 2 minute u tikvici s
okruglim dnom od 250 mL uz povratno hladilo, zatim se ohladi pod vodom i doda 10 mL
otopine C (30 %-tni KI) i 10 mL otopine D (26 %-tne H2SO
4). Sve se dobro izmiješa i doda 2
mL škroba (1 %-tna otopina) te titrira s 0,1 M Na2S
2O
3 do prelaza tamno smeđe boje u boju
puti koja se treba zadržati 1 minutu.
GLUKOZA TEST (kontrola): uzme se 5 mL 1 %-tne glukoze i 20 mL destilirane vode
(ukupan volumen 25 mL) i ponovi gore opisani postupak.
SLIJEPA PROBA: uzme se 25 mL destilirane vode i ponovi gore opisani postupak.
IZRAČUNAVANJE KONCENTRACIJE ŠEĆERA:
RS = 50*(a-b)/(a-c)*d
RS = reducirajuće supstance (g/l)
a = mL 0,1 M Na2S
2O
3 utrošeni za slijepu probu
b = mL 0,1 M NaS20
3 utrošeni za uzorak
c = mL 0,1 M Na2S
20
3 utrošeni za kontrolu (glukoza test)
d = mL uzorka uzeti za analizu
16
3.1.3.2. Određivanje ukupnih kiselina u vinu
a) Laboratorijsko određivanje ukupnih kiselina
Princip određivanja ukupnih kiselina:
Sve slobodne organske i anorganske kiseline i njihove kisele soli te druge kisele tvari
neutraliziraju se otopinom natrijevog hidroksida, iz čijeg se utroška računa količina ukupnih
kiselina. Ukupna kiselost izražava se kao vinska kiselina u g/L.
Kako se natrijev hidroksid troši na neutralizaciju svih spomenutih kiselina, količina
ukupnih kiselina mora se izraziti u jednoj od kiselina koje se nalaze u moštu. Obzirom da je u
moštu najvažnija vinska kiselina, u većini zemalja se preko nje izražava količina ukupnih
kiselina. U nekim zemljama, npr. Francuskoj, ukupne kiseline izražavaju se kao sumporna.
Postupak:
Prije analize potrebno je baždariti pH metar. Nakon toga trbušastom pipetom uzeti 25
mL vina i staviti u čašu od 100 mL te odrediti pH.
Vino se zagrije do vrenja da se ukloni CO2, a zatim se dobro ohladi i pristupi titraciji s
0,1 M NaOH uz pH – metar. NaOH se dodaje sve do pH 7.
y = V*0,3*f
γ = masena koncentracija ukupnih kiselina, izraženih kao vinska kiselina [g/L]
V = volumen otopine natrij hidroksida koncentracije 0,1 mol/L [mL]
f = faktor otopine natrij hidroksida koncentracije 0,1 mol/L (f = 1,0000)
1 mL NaOH koncentracije 0,1 mol/L odgovara 0,3 g/L vinske kiseline.
b) Određivanje ukupnih kiselina pomoću ENO - VIN kompleta (Slika 7.a)
Komplet se sastoji od epruvete, pipete i VINI 1 reagensa (1 %-tni NaOH). Uzorak vina
ulijemo u epruvetu do označene 0 na skali. Reagens VINI 1 dodajemo u epruvetu uz pomoć
kapaljke. Svaki put kad dodamo reagens u epruvetu palcem začepimo otvor epruvete,
nagnemo je i dobro protresemo, kako bi se uzorak vina i reagens izmješali. U početku titracije
17
boja će biti žuto – zelena. Mjerenje je završeno kada se sadržaj epruvete oboji u plavu boju
(Slika 7.b). Rezultat očitamo na skali (jedinica je g/L).
Slika 7.
a) ENO – VIN komplet b) Rezultat mjerenja ukupnih kiselina
3.1.3.3. Određivanje hlapljivih kiselina po polumikro postupku
Princip određivanja hlapljivih kiselina:
Hlapljive kiseline određuju se tako da se destilacijom vina prevode u destilat, a zatim
neutraliziraju otopinom natrijevog hidroksida, na temelju čijeg utroška se izračuna količina
hlapljivih kiselina. Octena kiselina isparava teže od alkohola i vode, pa se destilacija provodi
u struji vodene pare, čime se omogućava da cjelokupna količina octene kiseline pređe u
destilat.
Postupak:
Za određivanje hlapljivih kiselina uzima se trbušastom pipetom 5 mL uzorka, stavi se
u tikvicu kruškastog oblika i doda se 1 mL 25 % H3PO
4. Pri tome treba paziti da površina
vode u Erlenmayer tikvici za proizvodnju pare bude uvijek iznad nivoa tekućine u kruškastoj
18
tikvici. Za vrenje vode u Erlenmayer tikvici treba ubaciti nekoliko komadića porozne gline ili
staklene kuglice. Od probe treba predestilirati 60 mL, a dobiveni destilat zagrijati do početka
vrenja i titrirati uz fenolftalein s 0,1 M natrij hidroksidom.
Izračunavanje:
y = V*1,2
γ = masena koncentracija hlapljivih kiselina, izraženih kao octena kiselina [g/L]
V = volumen otopine natrij hidroksida koncentracije 0,1 mol/L [mL]
1 mL NaOH koncentracije 0,1 mol/L odgovara 1,2 g/L octene kiseline.
3.1.3.4. Određivanje sumpora
(uobičajena metoda)
3.1.3.4.1. Određivanje slobodnog sumpora (20 minuta bez grijanja)
a) Laboratorijsko određivanje slobobnog SO2
U tikvicu za kuhanje otpipetira se preko lijevka 10 mL vina koje analiziramo i 5 mL
fosforne kiseline (w = 25 %). U manju, apsorpcionu tikvicu treba dodati već pripremljeni
reagens tako da nivo bude do proširenog grla apsorpcijske tikvice. Obavezno otvoriti vodu
koja struji kroz hladilo te vodu u vakuum sisaljci do pojave mjehurića u menzuri na jednoj
strani i u tikvicama aparature. Nakon 20 minuta skinuti tikvicu s reagensom i titrirati s 0,01 M
NaOH. Utrošene mL 0,01 M NaOH treba pomnožiti s 32 da bi se dobili mg slobodnog SO 2
u
1 litri vina.
b) Određivanje slobodnog SO2 pomoću ENO - VIN kompleta (Slika 7.a)
Komplet se sastoji od epruvete, pipete i ENO - VIN 1 reagensa. Uzorak vina ulijemo u
epruvetu do označene 0 na skali. Reagens ENO – VIN 1 dodajemo u epruvetu uz pomoć
kapaljke. Svaki put kad dodamo reagens u epruvetu palcem začepimo otvor epruvete,
nagnemo je i dobro protresemo, kako bi se uzorak vina i reagens izmješali. Mjerenje je
19
završeno kada se sadržaj epruvete oboji u ljubičasto - plavu boju koja je postojana bar 10
sekundi (Slika 7). Rezultat očitamo na skali (jedinica je mg/L).
3.1.3.4.2. Određivanje vezanog sumpornog dioksida
Vino koje je nakon određivanja slobodnog sumpora ostalo u tikvici za kuhanje ostaje i
dalje u toj tikvici. Mijenja se reagens u maloj apsorpcionoj tikvici, a zatim se pod tikvicu za
kuhanje stavi plamenik sa što manjim plamenom, pa se grije se uz lagano vrenje točno 10
minuta. Utrošene mL 0,01 M NaOH pomnožimo s 32 i dobijemo mg vezanog SO2
u 1 litri
vina.
3.1.3.4.3. Određivanje ukupnog sumpora
Ukupni SO2dobije se zbrajanjem vrijednosti slobodnog i vezanog SO
2.
Priprema indikatora u otopini H2O
2
U 100 mL destilirane vode dodati 2 mL vodikovog peroksida i indikatora po potrebi
do prljavo sivoplave boje (2-3 mL).
INDIKATOR: Smjesa otopine A i B (100 mL A + 15 mL B)
OTOPINA A: 0,03 g metilnog crvenila u 100 mL 96 % alkohola
OTOPINA B: 0,1 g metilnog plavila u 100 mL destilirane vode
Otopine A i B mogu se koristiti dulje vrijeme, a otopina peroksida mora svaki dan biti
svježa. Ukoliko je indikator ljubičaste boje, reakcija je kisela i treba ga neutralizirati lužinom,
a ako je zelene boje, reakcija je lužnata i treba ga neutralizirati kloridnom kiselinom. Ovo se
provodi tako da se reagens promiješa staklenim štapićem uronjenim u kiselinu odnosno
lužinu.
20
3.1.3.5. Određivanje alkohola kemijskom metodom
Postupak:
Vino se razrijedi u odnosu 1:10, tako da se u odmjernu tikvicu od 50 mL stavi 5 mL
vina i dopuni destiliranom vodom do oznake. U postupak se uzima 5 mL ovako razrijeđenog
vina koje se stavi u tikvicu za destilaciju od 50 mL, doda još 5-6 mL destilirane vode i sadržaj
neutralizira s 0,1 M NaOH uz univerzalni indikator.
U Erlenmayerovu tikvicu od 100 mL, u koju će se hvatati destilat, stavi se točno 10
mL otopine kalijevog bikromata i 5 mL koncentrirane H₂SO₄. Destilat se preko hladila i lule
uvodi u otopinu kalijevog bikromata u Erlenmeyerovu tikvicu od 100 mL, koja mora biti u
rashlađenoj vodi. Destilacija treba biti polagana i postepena i traje dok se sadržaj u tikvici za
destilaciju ne smanji na približno 3 mL (za to vrijeme je alkohol predestilirao).
Po završetku destilacije lula se ispere iznutra s nekoliko mlazova destilirane vode u istu
Erlenmeyerovu tikvicu u koju se hvatao destilat. Sadržaj Erlenmeyerove tikvice se promućka,
začepi gumenim čepom i ostavi stajati 5 minuta radi potpune oksidacije alkohola.
Tijekom oksidacije alkohola utroši se jedan dio bikromata, dok drugi ostane u suvišku.
Zatim se sadržaj kvantitativno prebaci u Erlenmeyerovu tikvicu od 500 mL (isperemo
tikvicu), doda se oko 200 mL destilirane vode radi razrijeđenja i 10 mL 20 %-tne otopine KI
(radi određivanja preostale količine kalijevog bikromata) i ostavi začepljeno 5 minuta. Tada
dolazi do oksido-redukcijskog procesa preostalog kalijevog bikromata i KI: krom se iz
šesterovalentnog reducira u trovalentni, a jod iz KI se oksidira u elementarni jod, zbog čega
otopina dobije tamniju boju. Pritom se elementrni jod oslobađa u količini ekvivalentnoj
kalijevom bikromatu. Titrira se 0,1 M otopinom natrijevog tiosulfata, pri čemu dolazi do
oksidoredukcije između joda i natrijevog tiosulfata, u kojoj se jod reducira, a tiosulfat
oksidira. Kad boja postane svijetlija doda se 5 mL 1%-tne otopine škroba i titracija nastavi do
pojave tirkizno-zelene boje. Prijelaz boje je vrlo jasan i nastaje čim nestanu posljednje
količine joda.
IZRAČUNAVANJE KOLIČINE ALKOHOLA:
Alkohol (vol %) = (10 - 𝑎
6,9)×2
a = utrošak 0,1 M otopine Na2S2O3
21
3.1.3.6. Određivanje alkohola denzitometrijski
Princip:
Količina alkohola u vinu odredi se pomoću piknometra, na osnovi specifične težine
destilata. To je tzv. denzitometrijska metoda.
1. Određivanje specifične težine vina
Piknometar se ispere 2-3 puta s malo vina koje se ispituje. Pomoću specijalnog lijevka
napuni se tako da nivo bude iznad oznake na grliću. Temperira se se u vodenoj kupelji pri 20
°C / 20 minuta, a zatim se višak vina iznad oznake odstrani pomoću filter papira. Piknometar
se dobro obriše i važe da bi se dobila masa pinometra s vinom. Specifična težina vina odredi
se na slijedeći način:
γ = (A – B) / C
A - masa piknometra s vinom (destilatom ili ostatkom od destilacije)
B - masa praznog piknometra
C - vodena vrijednost piknometra
Vrijednosti B i C potrebne za računanje određene su ranije za svaki pojedini
piknometar.
2. Određivanje količine alkohola u vinu
Nakon određivaja specifične težine, vino se iz piknometra prenese u tikvicu za
destilaciju od 250 mL. Važno je pritom isprati piknometar 2-3 puta s nekoliko mililitara
hladne destilirane vode i to sve preliti u tikvicu za destilaciju. Prilikom destilacije, destilat se
hvata u isti piknometar preko specijalnog lijevka, koji služi za punjenje piknometra. U
piknometar se ulije malo destilirane vode tako da je vrh lijevka uronjen u nju. Destilacija traje
dok se piknometar ne napuni destilatom do ¾ njegovog volumena. Tada se piknometar napuni
destiliranom vodom do ispod oznake i stavi u vodenu kupelj na 20 °C / 20 minuta, a zatim
nadopuni do oznake destiliranom vodom, obriše i važe. Specifična težina destilata izračunava
se kao pod 1.
22
Specifična težina destilata je uvijek manja od specifične težine vina i to utoliko manja ukoliko
ima više alkohola.
Na osnovi specifične težine destilata iz tablice (po Windischu) očita se količina
alkohola u g/L vina, a iz ove vrijednosti volumni postoci etanola.
3.1.3.7. Enzimsko određivanje glicerola
Princip:
Glicerol se fosforilira pomoću adenozin-5´-trifosfata (ATP) u L-glicerol-3-fosfat
reakcijom koju katalizira glicerokinaza. Adenozin-5´-difosfat (ADP) koji nastaje u reakciji
ponovo se konvertira u ATP uz nastajanje piruvata. U reakciji s ADP još sudjeluje
fosfoenolpiruvat (PEP), a katalizirana je enzimom piruvat kinaza (PK).
Djelovanjem enzima L-laktat dehidrogenaze (L-LDH), piruvat se reducira u L-laktat pomoću
reduciranog nikotinamid-adenin dinucleotida (NADH) uz nastajanje NAD+.
Pri 340 nm mjeri se smanjenje apsorbancije zbog potrošnje NADH. Nastali NAD+ je u
stehiometrijskom odnosu s količinom glicerola u uzorku.
Ova je metoda specifična za glicerol. Linearna je u rasponu 0,8 - 35 μg glicerola u
uzorku. Pri provođenju analize dopuštene su razlike apsorbancije dvaju istovjetnih
uzorakakoje iznose 0.005 - 0.010, što odgovara koncentraciji glicerola od otprilike 0,086-
0,171 mg/L u uzorku. Ukoliko je konverzija glicerola završena unutar 5 minuta, može se
zaključiti da nije bilo interferencija. Ovo se može dalje provjeriti dodavanjem glicerola u
kivetu nakon završetka reakcije (oko 20 μg u 0,1 mL), što treba dovesti do značajnog
povećanja apsorbancije. Vrijeme analize je 10-ak minuta, a količina kemikalija u kitu je
dovoljna za 70 određivanja. Sadržaj kita, kao i upute za čuvanje navedeni su u tekstu koji
slijedi.
Za određivanje glicerola koristimo komercijalno dostupni enzimski kit koji sadži
reagense potrebne za 70 određivanja (kit K-GCROL, Megazyme, Irska).
SADRŽAJ KITA ZA ODREĐIVANJE GLICEROLA:
• Bočica 1: Tris/HCl pufer (20 mL, 1 M, pH 7,4) i magnezijev klorid (30 mM M), uz natrijev
azid (0,02 % w/v) kao konzervans. Stabilnost preko 2 godine pri 4 ºC.
23
• Bočica 2: 14 tableta koje sadrže NADH, ATP i PEP. Stabilnost preko 2 godine pri 4 ºC.
Maksimalna trajnost ovih tableta postiže se čuvanjem u zabrtvljenom kontejneru u prisutnosti
siilkagela pri 4 ºC ili pri -20 ºC.
• Bočica 3: sadrži 1,5 mL suspenzije piruvat kinaze (600 U/mL) i L-laktat dehidrogenaze (550
U/mL). Stabilnost preko 2 godine pri 4 ºC.
• Bočica 4: suspenzija glicerokinaze (1,5 mL, 85 U/mL). Stabilnost preko 2 godine pri 4 ºC.
• Bočica 5: standard glicerola (5 mL otopine, 0,20 mg/mL) uz natrijev azid (0,02 % w/v) kao
konzervans. Stabilnost preko 2 godine pri 4 ºC. Standard glicerola analizira se samo kad
postoji sumnja u točnost spektrofotometra ili kad se sumnja u inhibiciju zbog nekog sastojka
uzorka.
PRIPREMA REAGENSA ZA ANALIZU GLICEROLA:
Bočica 1 i bočica 5 koriste se bez pripreme.
Priprema Bočice 2: Prije vađenja tableta iz bočice zagrijte bočicu na sobnu temperaturu (po
mogućnosti u eksikatoru) radi sprečavanja kondenzaciju vlage na kontejneru. Ukoliko se
otvori bočica dok je još hladna onda tablete apsorbiraju vlagu i smanjuje se stabilnost
komponenata sadržanih u tabletama Procijenite koliko analiza treba provesti da bi prema tome
otopili potrebu količinu reagensa. Da bi dobili volumen reagensa koji je potreban za 5
planiranih analiza otopite jednu tabletu iz bočice 2 u 1,1 mL (tj. 2 puta po 550 μL) Tris/HCl
pufera (bočica 1) i otapajte 1-2 minute. Otapanje možete poboljšati nježnim mućkanjem ili
miješanjem. Nakon otpanja će se s vremenom apsorbancija otopljenog NADH postepeno
smanjivati, ali je ovako pripremljen reagens prikladan za upotrebu otprlike 4 dana ukoliko se
čuva pri 4 ºC, odnosno oko 4 tjedna ako se čuva pri pri -20 ºC.
Priprema bočica 3 i 4: koriste se bez pripreme, osim što se prije prvog otvaranja moraju
protresti da se ukloni ostatak enzima koji se mogu istaložiti na gumenom čepu. Nakon toga
čuvajte bočice u uspravnom položaju. Vrtloženjem bočica homogenizirajte sadržaj prije
upotrebe. Stabilno preko 2 godine pri 4 ºC. Koncentracija glicerola određuje se iz
ekstinkcijskog koeficijenta NADH.
24
POSTUPAK ODREĐIVANJA GLICEROLA:
Valna dužina: 340 nm
Kiveta: širina 1 cm
Temperatura: oko 25 ºC
Volumen uzorka (0,1 – 2 mL) koji sadrži 0,8 - 35 μg L-jabučne kiseline.
Određivanje glicerola u uzorcima bijelih i crnih vina može se provesti bez prethodne obrade
uzorka, pa se uzorak samo razrjeđuje i to obično u omjeru 1:20 te se uzima 0,1 mL uzorka.
Mjeriti prema zraku (bez kivete u spektrofotometru) ili prema vodi. Konačni volumen u kiveti
iznosi 2,34 mL.
RAČUNANJE KONCENTRACIJE GLICEROLA:
Odredite razliku apsorbancija (A1-A2) za slijepu probu i za uzorak. Potom razliku
apsorbancija za slijepu probu oduzmite od razlike apsorbancija za uzorak tako da se dobije
ΔAglycerol. Ova vrijednost bi u pravilu trebala iznositi najmanje 0,1. Koncentracija glicerola
može se dalje izračunati prema jednadžbi:
25
gdje je:
c – koncentracija glicerola (g/L)
V – konačni volumen (mL) = 2,34 mL
MW – molarna masa glicerola (g/mol) = 92,01
ε – ekstinkcijski koeficijent NADH pri 340 nM = 6300 (l mol-1
·cm-1
)
d- put svjetlosti (1 cm)
v- volumen uzorka (mL) = 0,1 mL
Ako je uzorak bio razrijeđen, rezultat treba množiti s faktorom razrijeđenja (za
razrijeđenje 1:20 množi se faktorom 20).
3.1.3.8. Određivanje jabučne, vinske, mliječne i
limunske kiseline papirnom kromatografijom
Postupak za određivanje jabučne, vinske, mliječne i limunske kiseline u vinu
papirnom kromatografijom:
Pri rukovanju s kromatografskim papirom potrebno je raditi s kirurškim rukavicama.
Za određivanje kiselina u uzorku vina koristi se kromatografski papir Whatman No 1, koji se
izreže na odgovarajuće dimenzije (55 x 192 mm). Na kromatografskom papiru povuče se
grafitnom olovkom startna linija po širini papira na visini od 2,5 cm od osnove. Na liniji se
obilježe točke na udaljenosti 1,5 cm od ruba papira i na ta obilježena mjesta nanosi se po 50
μL smjese standarda (koja sadrži po 3 g/L jabučne, vinske, mliječne i limunske kiseline)
odnosno uzorka vina. Nanosi se kap po kap, a mrlje odmah suše toplim zrakom (fenom) tako
da promjer mrlja bude maksimalno 3 mm. Nakon nanošenja i sušenja, radi razvijanje
kromatograma papir se stavlja u kadu za kromatografiju u kojoj se nalazi ranije pripremljena
smjesa otapala ovog sastava:
octena kiselina 10 mL
n - butanol 40 mL
destilirana voda 50 mL
26
Vrijeme razvijanja kromatograma je 2-3 sata, nakon čega treba označiti frontu otapala
grafitnom olovkom prije nego se kromatogram počne sušiti. Zatim slijedi sušenje na zraku,
uranjanje u otopinu indikatora i ponovo sušenje na zraku.
Na temelju položaja mrlja na kromatogramu u odnosu na poznatu smjesu standarda, Rf
vrijednosti se izračunavaju prema izrazu:
Rf = udaljenost sredine mrlje od starta/udaljenost fronte otapala od starta
Rf srednja za jabučnu kiselinu (standard) = 0,56
Rf srednja za vinsku kiselinu (standard) = 0,38
Rf srednja za mliječnu kiselinu (standard) = 0,69
Rf srednja za limunsku kiselinu (standard) = 0,45
Priprema smjese za razvijanje kromatograma: Smjesa octene kiseline, n-butanola i destilirane
vode stavlja se u lijevak za odjeljivanje i promućka, a kao razvijač koristi se gornja bistra
faza. Nakon razvijanja i sušenja kromatograma, on se uroni u otopinu indikatora (bromfenol –
plavo).
Volumen otapala u kadi za kromatografiju: (10 + 40 + 50) x 2
Priprema otopine indikatora: 100 mg bromfenol-plavog otopi se u apsolutnom etanolu u
odmjernoj tikvici od 100 mL, te doda 2-3 kapi 1M NaOH za postizanje lagano lužnate
otopine.
4. Rezultati
27
4.1. Dnevnik fermentacije i dozrijevanja vina
Tablica 1. Podaci o procesu
Masa grožđa 550 kg 300 kg grožđa sorte Graševina bijela i
250 kg grožđa sorte Rajnski rizling bijeli
iz okolice Iloka (zona C1)
Volumen
fermentora
250 L Slika 6
Temperatura
fermentacije
15-16 °C Fermentor je od inoxa, zato je tijekom
fermentacije bio zamotan u deku kako
temperatura ne bi bila preniska za
optimalan rad kvasca, a nakon završetka
je deka uklonjena kako bi se kvasci i
druge nečistoće brže istaložili
Volumen mošta 270 L 2014. godina je bila dosta kišna, zbog
toga je manji volumen dobivenog mošta
nego prijašnjih godina (ista masa grožđa)
Količina kvasca 100 g Selekcionirani vinski kvasac
Saccharomyces cerevisiae
(Uvaferm CM)
Tablica 2. Dnevnik vinifikacije
25.09.2014.g Berba, muljanje, prešanje,
odstajalo u plastičnoj posudi i
dodano V (sumpovina: 5 – 6 %
otopina SO2) =0.4 L
Slika 4.a
Inače se dodaje oko 100 mL sumpovina po
hL vina, dodano više zbog slabije kvalitete
grožđa
27.09.2014.g Pretakanje u fermentor,
dodavanje kvasca i hrane za
kvasac
Slika 5
28.10.2014.g Dodano 15 g kalijevog
metabisulfita
Slika 4.b
Još sumporimo zbog loše kvalitete grožđa i
male količine ukupnih kiselina
01.11.2014.g Prvi pretok Slika 8.a; Slika 9.
20.11.2014.g Analiza: 16 mg/L SO2 i 8.5
g/L ukupnih kiselina
Slika 7.a.
25.11.2014.g Analiza: 18 mg/L SO2 Dodajemo 5 g kalijevog metabisulfita da
postignemo koncentraciju iznad 20 mg/L
02.02.2015.g Analiza: 20 mg/L SO2 i 8 g/L
ukupnih kiselina, pH =2.7
Slika 7.b
Dodajemo 10 g kalijevog metabisulfita
08.02.2015.g Drugi pretok Slika 8.b; Slika 9; Slika 10.
Pretočeno vino se dodatno zaštićuje
parafinskim uljem kako bi se spriječio
kontakt vina sa zrakom
28
Slika 8. Bistrenje vina
a) poslije prvog pretoka b) poslije drugog pretoka
Slika 9. Oprema za pretakanje vina Slika 10. Parafinsko ulje
29
4.2. Kemijska analiza domaćeg bijelog vina
Prilikom kemijske analize vina rađena su tri paralelna mjerenja kako bi izmjereni
podaci bili točniji. U Tablici 3. prikazana je srednja vrijednost kemijske analize domaćeg
bijelog vina.
Tablica 3. Dobivene vrijednosti laboratorijske analize domaćeg bijelog vina
Mjereni parametri Srednja vrijednost
RS metoda (g/L) 0,03617
pH 2,81
Ukupne kiseline (g/L) 7,89
Hlapljive kiseline (g/L) 0,54
Sumpor
Slobodni (mg/L) 17,6
Vezani (mg/L) 30,4
Ukupni (mg/L) 48
Alkohol
Kemijska metoda (%) 11,46
Denzitometrijska metoda (%) 11,53
Glicerol (g/L) 8,0058
30
4.3. Papirna kromatografija
Na kromatogramu (Slika 11.) mogu se vidjeti pet fronti; 4 standarda i jedan uzorak
domaćeg bijelog vina. Analizirano vino sadrži jabučnu (Rf 0,59), vinsku (R
f 0,40),
mliječnu (Rf 0,77) i limunsku (R
f 0,50) kiselinu.
Slika 11. Izgled kromatograma
Standard
jabučne
kiseline
(Rf 0,56)
Standard
vinske
kiseline
(Rf 0,38)
Uzorak Standard
limunske
kiseline
(Rf 0,45)
Standard
mliječne
kiseline
(Rf 0,69)
Linija otapala
Linija starta
Vinska kiselina (Rf 0,40)
Jabučna kiselina (Rf 0,59)
Limunska kiselina (Rf 0,50)
Mliječna kiselina (Rf 0,77)
5. Rasprava
31
Prilikom proizvodnje domaćeg bijelog vina provođena je sustavna analiza određenih
parametara bitnih za praćenje procesa fermentacije, kako bi se proces mogao nadzirati,
usmjeravati u željenom smjeru, a nakon provedene analize i donijeti zaključak jesu li postupci
za vrijeme vinifikacije rezultirali zadovoljavajućom kvalitetom konačnog proizvoda.
Samostalna analiza provođena je na prostoru vinarije za vrijeme procesa vinifikacije te je u
nekoliko navrata intervernirano dodatnim sumporenjem, jer je to bilo potrebno zbog loše
kvalitete grožđa. Nakon proizvodnje vino je laboratorijski analizirano.
Prema Pravilniku o vinu Ministarstva poljoprivrede i šumarstva vinogradarsko područje
Republike Hrvatske razvrstano je u vinogradarske zone proizvodnje. Iločko vinogorje pripada
vinogradarskom području kontinentalne Hrvatske, podregiji Podunavlje, točnije zoni C1. Za
svaku zonu su zasebno određene vrijednosti nekih kemijskih veličina koje vino s tog
podneblja mora zadovoljiti da bi moglo biti plasirano na tržištu. Istaknula sam samo veličine
koje su određivane u ovom završnom radu te koje se odnose na stolno vino u zoni C1.
Članak 39.
Najmanji sadržaj stvarnog alkohola u vinu u prometu mora biti (u volumnim %): 9,5.
Izmjerena koncentracija alkohola u volumnim postocima iznosi 11,46 %
(uzmemo li obzir kemijsku metodu određivanja alkohola u uzorku domaćeg bijelog
vina), što je više od propisanog minimuma. Koncentracija alkohola izmjerena
denzitometrijskom metodom iznosi 11,53 %, što također odgovara zahtijevima
Pravilnika. Iako je 2014. godina bila loša za vinogradare zbog brojnih kiša i male
količine sladora u grožđu, sljubljivanjem dviju sorti grožđa prije fermentacije ipak je
postignut odgovarajući stupanj pretvorbe šećera glukoze u etanol i zadovoljavajuća
koncentracija alkohola u domaćem bijelom vinu.
Članak 46.
Vino u prometu mora sadržavati:
1. ukupnih kiselina, izraženih kao vinska kiselina, najmanje 4,5 g/L i najviše 14
g/L;
32
Koncentracija ukupnih kiselina izmjerena u laboratoriju Prehrambeno –
biotehnološkog fakulteta iznosi 7,89 g/L, a na prostoru vinarije 8 g/L. Srednja vrijednost
od 7,945 g/L odgovara postavljenim granicama koje su propisane Pravilnikom. Vino iz
kontinentalne Hrvatske sadrži veću količinu kiselina i manje količine šećera nego vina
sa Jadrana, gdje prevladava toplije i sunčanije vrijeme, a za vina su karakteristične
manje količine kiselina i veće količine šećera.
U domaćem bijelom vinu je izmjereno 0,54 g/L hlapljivih kiselina. Koncentracija
je vrlo niska što je dobar rezultat. Hlapljive kiseline se uglavnom odnose na octenu
kiselinu, čiji reski okus i miris nisu poželjni u vinu u većim koncentracijama.
2. šećera (u gramima na litru; g/L):
- suho vino sadrži u pravilu najviše 4 g/L neprevrelog šećera. Suho vino s visokim
prirodnim kiselinama može imati i veću količinu neprevrelog šećera, koja može biti
jednaka sadržaju kiselina (izraženih kao vinska kiselina u g/L), povećan za 2 g/L, a
najviše može imati 9 g/L.
Količina reducirajućih šećera u vinu je u skladu sa Pravilnikom. RS-metodom je
izmjerena koncentracija šećera od 0,03617 g/L stoga zaključujem da se radi o suhom
vinu sa izrazito niskom koncentracijom šećera, što i jest tipično za domaća bijela vina.
3. sadržaj sumporovog dioksida u vinima, osim kod pjenušavih, gaziranih i
specijalnih vina u prometu ne smije biti veći od 160 mg/L, od toga slobodnog najviše 30
mg/L.
U uzorku je laboratorijski izmjereno 17,6 mg/L slobodnog sumpora i 30,4 mg/L
vezanog sumpora. Na prostoru vinarije provedena je i dodatna analiza slobodnog SO2 u
vinu, kojom je izmjereno 20 mg/L slobodnog SO2 u vinu. Srednja vrijednost
koncentracije slobodnog SO2 iznosi 18,8 mg/L. Zbrajanjem koncentracija slobodnog i
vezanog sumpora dobivamo da je koncentracija ukupnog sumpora 49,2 mg/L.
4. sadržaj glicerola mora biti minimalno 5,0 g/l.
Koncentracija glicerola u uzorku iznosi 8,0058 g/L, što je u skladu sa Pravilnikom
o vinu.
33
Svi navedeni rezultati pokazuju da su mjereni parametri u skladu sa zakonskom
regulativom. Izmjerena koncentracija SO2 je mnogo manja od maksimalne dozvoljene
količine slobodnog i vezanog sumpora tj. u području je optimalnih vrijednosti. Prisutnost SO2
u vinima je poželjna, ali prevelike količine djeluju negativno na okus i kakvoću vina te na
ljudsko zdravlje. Koncentracije ukupnih i hlapljivih kiselina u skladu su s dozvoljenim
koncentracijama u bijelim vinima. Papirnom kromatografijom dokazano je prisustvo jabučne,
vinske, mliječne i limunske kiseline u analiziranom domaćem bijelom vinu, zbog čega
zaključujem da je došlo do spontane malolaktičke fermentacije. Rezultati analize ukupnih
kiselina i slobodnog SO2 dobiveni kemijskom analizom potvrđuju rezultate dobivene
titracijskom analizom u vinariji, zbog čega zaključujem da je korištenje gotovih kompleta za
analize opravdano pa čak i poželjno. Mali vinari često nemaju sredstva i mogućnosti za
nošenje uzoraka vina na analize, stoga korištenjem ovih jednostavnih i brzih metoda mogu
nadzirati fermentaciju i po potrebi pravovremeno intervenirati.
Proveden proces vinifikacije bio je uspješan, jer je dobiven konačni proizvod koji
zadovoljava kriterije propisane Pravilnikom o vinu.
6. Zaključci
34
Analizirano domaće bijelo vino je sadržavalo:
1. 11,46 vol % alkohola izmjereno kemijskom metodom i 11,53 vol % alkohola
izmjereno denzitometrijskom metodom,
2. 7,945 g/L ukupnih kiselina,
3. 0,54 g/L hlapljivih kiselina,
4. 18,8 mg/L slobodnog SO2, 30,4 mg/L vezanog SO2, 49,2 mg/L ukupnog SO2,
5. 0,03617 g/L reducirajućih šećera izmjereno RS-metodom,
6. 8,0058 g/L glicerola,
7. Svi izmjereni parametri odgovaraju onima koji karakteriziraju bijelo stolno
vino iz vinogradarske zone C1, čime je dokazano da proizvedeno bijelo
domaće vino odgovara zahtjevima Pravilnika o vinu iz 1996. godine te da je
proveden postupak vinifikacije bio uspješan.
7. Literatura
35
Anonymus 1 http://www.enciklopedija.hr/Natuknica.aspx?ID=64729
Pristupljeno 14.8.2015.
Anonymus 2 http://vinopedia.hr/wiki/index.php?title=gra%C5%A1evina
Pristupljeno 16.8.2015.
Anonymus 3 http://vinopedia.hr/wiki/index.php?title=rizling_rajnski
Pristupljeno 18.8.2015.
Anonymus 4 http://www.vino-kerman.com/vinograd-i-vino/
Pristupljeno 19.8.2015.
Anonymus 5 http://www.hucrowinestories.eu/hr/grad-ilok
Pristupljeno 21.8.2015
Anonymus 6 http://www.uvaferm.com/
Pristupljeno 21.8.2015
Boulton, R.B., Singleton, V.L., Bisson, L.F., Kunkee, R.E. (1996.): Principles
and practices of winemaking, Chapman and Hall, International Thomson
Publishing, New York
Grba, S. (2010.), Kvasci u biotehnološkoj proizvodnji, Plejada, Zagreb
Law, J. (2006.): Od vinograda do vina, Veble commerce, Zagreb
Muštović, S. (1985.), Vinogradarstvo s enokemijom i mikrobiologijom,
Privredni pregled, Beograd
PRAVILNIK O VINU ( 1996. ), na temelju članka 56. stavka 1. Zakona o
vinu ("Narodne novine", br. 34/95)
Radovanović, V. (1986), Tehnologija vina, 2. Izdanje, IRO „Građevinska
knjiga“, Beograd
Sokolić, I. (2004.): Vino, sunca i čovjeka rod, vlast. nakl. Ivan Sokolić, Novi
Vinodolski
Zoričić, M. (1996.), Podrumarstvo, Nakladni zavod Globus, Zagreb