presentacion elisa
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Presentacion ELISAElaborada por: Leomar Alexandra PalaciosTRANSCRIPT
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E.L.I.S.A
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Elaborado por:
Br. Leomar Palacios
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Antecedentes
• El nombre enzyme-liked immunosorbent assay, luego abreviado como ELISA, fue acuñado por los investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perimann, los cuales describieron el procedimiento, publicado en 1971.
• Las aplicaciones mas interesantes se iniciaron en el campo de la microbiología y parasitología.
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ELISA
Ensayo de InmunoAbsorción Ligado a Enzimas.
• Se considera ligado a enzima porque una enzima se une químicamente a un anticuerpo en las dos versiones de la prueba (indirecta y directa)
• El inmunoabsorvente, se refiere al hecho de que los antígenos o anticuerpos son adsorvidos a un plástico.
ELISA puede investigar la presencia de un antígeno o de un anticuerpo.
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ELISADEFINICIÓN
• El ELISA se basa e el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad
tanto inmunológica como enzimática.
• Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e
insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-
anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un
substrato especifico
• El cual al actuar la enzima, producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
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Antígenos• Los antígenos son, por definición, generadores de
anticuerpos. • Incluyen proteínas, polisacáridos y varias moléculas
pequeñas, que estimulan la producción de anticuerpos.• Los antígenos son, a menudo, moléculas que se definen
como <no propias> o extrañas, para el organismo. • Hay <antígenos propios> que actúan como etiquetas de
identificación
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Anticuerpo• Son la respuesta del organismo ante la presencia de un agente
infeccioso.• Los anticuerpos son moléculas proteicas secretadas por los
plasmocitos, y tienen una altísima afinidad por sus antígenos correspondientes.
• Anticuerpos se caracterizan por:– Ser Defensa natural– Tener Utilidad terapéutica– Tener Utilidad Diagnóstica
Marcador de Infección o exposición.Detección de antígenos
• Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son de origen monoclonal o policlonal.
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Anticuerpo
• Anticuerpos PoliclonalesHeterogéneosReconocen epítopes diferentes del AgProducidos por numerosos clones de
Linfocitos B• Anticuerpos Monoclonales
HomogéneosEspecificidad únicaProducidos por un único clon de Linfocitos
B
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Controles
Se utilizan para asegurar que la prueba esta funcionando correctamente
• Control POSITIVO Incluyen una sustancia que se sabe que
reaccionara positivamente, proporcionando así, un patrón sobre el cual basar los resultados.
• Control NEGATIVOIncluyen sustancias que no deben
reaccionar .
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Fundamento del ELISA
Ag o Acfijado auna faseSólida
Ag o Acen laMuestra
Conjugado:Ac unido aENZIMA
SUSTRATO
CAMBIODE
COLOR
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Elementos del ELISA
• FASE SÓLIDA• Antígeno o Anticuerpo• Conjugado: ENZIMA• SUBSTRATO
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Fase SólidaSE PUEDEN UTILIZAR DOS TIPOS DE SUSTANCIAS
• Las que favorecen la adsorción física (por fuerzas electroestáticas) de las moléculas de Ags o Acs: poliestireno, cloruro de polivinilo, polipropileno, nylon y silicona.
• Las que permiten la fijación covalente de esos reactivos: acrilamida, celulosa y isoticianato
• Los mejores resultados se obtienen con el peliestireno y el polvinilo, por su rigidez, transparencia y propiedades adsortivas.
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Conjugado: EnzimaLa enzima escogida como marcador debe:
• Unirse fácilmente a antígenos y anticuerpos,• Encontrarse en estado puro a un precio razonable y
• Tener un substrato cromogénico o fluorogénico conveniente y de fácil preparación.
Las enzimas más utilizadas son fosfatas alcalina,
peroxidasa de rábano y ß-galactosidas
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SubstratoLa elección del substrato es de gran importancia para la estandarización del método ELISA y hay que tener
varios factores en cuenta, como son sensibilidad, especificidad, facilidad de lectura, así
como estabilidad después de lareacción.
Requerimientos del sustrato
• Solubles en agua• Fácil de manipular• No tóxicos, no mutagénicos• Bajo costo
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Tipos de ELISALos métodos de ELISA dependiendo de la actividad
enzimática se dividen en dos tipos: • Competitivos • No competitivos • ELISA COMPETITIVO:
En este método, el anticuerpo de la muestra va a competir con el conjugado por un número limitado de sitios de unión del antígeno. Habrá ausencia de color en una muestra positiva debido a que el sustrato no encontrará a la enzima porque el conjugado ha sido desplazado por el anticuerpo presente en la muestra.
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Tipos de ELISA• ELISA NO COMPETITIVO:
Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color
Dentro de los no competitivos tenemos:
• Los directos que detectan antígenos • Los indirectos que detectan anticuerpos
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Tipos de ELISA
• Si la prueba se diseña para detectar un antígeno, es un ELISA DIRECTO porque esta buscando directamente, como su nombre lo dice, la sustancia extraña.
• En cambio, un ELISA INDIRECTO, por su parte, se diseña para detectar los anticuerpos que el paciente ha creado contra el antígeno
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ELISA INDIRECTO
El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado
contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una
amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos secundarios por cada primario.
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MaterialesMateriales Orgánicos
• Las Muestras del Paciente (Saliva, orina, heces, sangre, etc.)• Antígenos• Anticuerpos• Enzimas
Materiales No Orgánicos
• Microplacas de 96 pocillos de plástico con fondos de pocillo ópticamente claros, pipeta multicanal, pipeta de 100µ.
• Espectrofotómetros de lectura de placas (lectores ELISA).
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Fases del ELISA Indirecto• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los
anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
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Fases del ELISA Indirecto• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los
cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado
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Leyenda
Antígeno
Anticuerpo Primario
AnticuerpoLigado a Enzima
Sustrato
Prueba ELISA Indirecta
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Aplicaciones del ELISA
• Detección de antígenos o anticuerpos:
VirusHongos ParásitosBacterias.
• Detección de autoanticuerpos:
IgG(Factor reumatoideo)DNA Proteína del núcleo
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Aplicaciones del ELISA
• Medición de Hormonas:
Progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, testosterona, gonadotropina coriónica humana, TSH.
• Detección de antígenos tumorales:
Antígeno prostáticoAlfa-fetoproteína Antígeno del ovario Antígeno carcinoembrionario
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Importancia
• En estudios serológicos, hematológicos, endocrinológicos, oncológicos, en los transplantes, la medicina forense y la antropología.
• Con propósitos médicos se han aplicado en la determinación de hormonas y proteínas plasmáticas, antígenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parásitos, hongos, bacterias, virus)
• Los resultados aportan elementos diagnósticos, información de una enfermedad y coadyudan en la planificación del tratamiento