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REDVET Rev. Electrón. vet. http://www.veterinaria.org/revistas/redvet 2017 Volumen 18 Nº 9 - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090917.html Prevalencia de Brucella melitensis en cabras de los apriscos de ASOCAPRINOR que se encuentran en el Cantón Ibarra, provincia de Imbabura http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n090917/091727.pdf 1 REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504 Prevalencia de Brucella melitensis en cabras de los apriscos de ASOCAPRINOR que se encuentran en el Cantón Ibarra, provincia de Imbabura Purtschert Barahona, Martin: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA) | Mafla Andrade, Santiago: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA), Laboratorio de Biotecnología. | Mendoza Cadena, Tito: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA), Laboratorio de Biotecnología. | Velástegui Moreno Mónica: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA), Laboratorio de Biotecnología. | Haro Bedón, Luis: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA) Contacto: [email protected] Resumen En la presente investigación se determinó la prevalencia de Brucella melitensis en cabras de los apriscos de ASOCARPINOR que se encuentran en la provincia de Imbabura tomando en cuenta a los apriscos de las localidades de San Guillermo, Urcuquí y Chaltura, muestreando un total de 139 animales. Se utilizaron las pruebas serológicas de Rosa de Bengala y ELISA Indirecto Multiespecies para las muestras de suero sanguíneo, arrojando una prevalencia de 0%, ya que 2 casos positivos a Rosa de Bengala fueron descartados por ELISA Indirecto Multiespecies. ELISA Indirecto en Leche fue utilizado para las muestras de lactosuero, y en este caso el estudio arrojó una prevalencia del 1.2%, confirmando la presencia de la bacteria en los apriscos investigados. Al estudiar las variables edad, raza y presencia de abortos como factores de riesgo para los casos positivos, resultaron no significativas estadísticamente. Palabras claves: Brucella melitensis, prevalencia, Rosa de Bengala, ELISA Indirecto Multiespecies

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REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504

Prevalencia de Brucella melitensis en cabras de los apriscos de ASOCAPRINOR que se encuentran en el Cantón Ibarra, provincia de Imbabura

Purtschert Barahona, Martin: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA) | Mafla Andrade, Santiago: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA), Laboratorio de Biotecnología. | Mendoza Cadena, Tito: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA), Laboratorio de Biotecnología. | Velástegui Moreno Mónica: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA), Laboratorio de Biotecnología. | Haro Bedón, Luis: Pontificia Universidad Católica del Ecuador Sede Ibarra (PUCESI), Escuela de Ciencias Agrícolas y Ambientales (ECAA)

Contacto: [email protected] Resumen En la presente investigación se determinó la prevalencia de Brucella melitensis en cabras de los apriscos de ASOCARPINOR que se encuentran en la provincia de Imbabura tomando en cuenta a los apriscos de las localidades de San Guillermo, Urcuquí y Chaltura, muestreando un total de 139 animales. Se utilizaron las pruebas serológicas de Rosa de Bengala y ELISA Indirecto Multiespecies para las muestras de suero sanguíneo, arrojando una prevalencia de 0%, ya que 2 casos positivos a Rosa de Bengala fueron descartados por ELISA Indirecto Multiespecies. ELISA Indirecto en Leche fue utilizado para las muestras de lactosuero, y en este caso el estudio arrojó una prevalencia del 1.2%, confirmando la presencia de la bacteria en los apriscos investigados. Al estudiar las variables edad, raza y presencia de abortos como factores de riesgo para los casos positivos, resultaron no significativas estadísticamente. Palabras claves: Brucella melitensis, prevalencia, Rosa de Bengala, ELISA Indirecto Multiespecies

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Abstract In the present investigation, the prevalence of Brucella melitensis was determined in goats from the ASOCARPINOR herds found in the province of Imbabura taking into account the herds of the localities of San Guillermo, Urcuquí and Chaltura, sampling a total of 139 animals. Serological tests of Bengal Rose and Indirect Multispecies ELISA were used for blood serum samples, yielding a prevalence of 0%, since 2 cases of Bengal Rose were discarded by Indirect Multispecies ELISA. Indirect ELISA in Milk was used for whey samples, and in this case the study showed a prevalence of 1.2%, confirming the presence of the bacterium in the herds investigated. When studying the variables age, race and presence of abortions as risk factors for positive cases, they were not statistically significant. Introducción La brucelosis es una de las enfermedades zoonóticas más difundidas en el mundo. La enfermedad está presente en todos los países de Latinoamérica. En el caso de México y Perú se estima una prevalencia por encima del 10%, pero en otros países como Uruguay, la prevalencia es menor al 1%, pero aún se presentan pequeños brotes. (Gil & Samartino, 2001). Desde el punto de vista médico, sanitario y económico, la bacteria representa un problema prioritario, principalmente en aquellos países donde la enfermedad es endémica, produciendo costos económicos muy elevados. (Carvajal, 2007) Es por esto que es un asunto de suma importancia y un problema muy grande que no exista información y se desconozca el estado real de la brucelosis en la zona, ya que puede ser una fuente para el contagio de la enfermedad no solo entre los animales, sino también el de las personas que manejan los apriscos y la gente encargada de realizar los análisis al receptar la leche en empresas lácteas. Por otra parte, existe la problemática de los vendedores ambulantes y la gente que consume esa leche sin pasteurizar y sus subproductos, pudiendo entrar en contacto directo con la enfermedad y contraerla. Por tal motivo es de gran interés conocer la situación de la enfermedad en la zona, no solo para la población, sino también para los organismos nacionales competentes, en nuestro caso el MAGAP, exhortando así a que se promuevan proyectos e investigaciones de este tipo, pues son dichos organismos los que pueden vincular a los profesionales más aptos. De este modo se podrán elaborar y ejecutar proyectos coordinados en los temas sanitarios de mayor importancia, aportando directamente al mejoramiento de la salud pública, salud animal, mayor disponibilidad de alimentos y mejora de la calidad de los mismos. (Gil & Samartino, 2001) La presente investigación pretende brindar información clara y detallada de los apriscos estudiados con el fin de promover el control y erradicación de la brucelosis en la provincia de Imbabura.

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Material y métodos En esta investigación se utilizó estadística inferencial, en este caso Chi Cuadrado y Riesgo Relativo ya que se determinó las regularidades y las relaciones cuantitativas entre las variables para calcular la probabilidad de ocurrencia. La investigación se realizó en la provincia de Imbabura, tomando en cuenta a los apriscos activos de ASOCAPRINOR que se encuentran en esta zona distribuidos de esta manera: 1 aprisco en San Guillermo (Cantón Ibarra) con 40 caprinos, 1 en Urcuquí (Cantón Urcuquí) con 60 caprinos, y 1 en Chaltura (Cantón Antonio Ante) con 39 caprinos; cabe recalcar que tanto en San Guillermo como en Chaltura se tomó una muestra poblacional representativa del total de animales existentes, siendo muestreado el 68.9% y 84.7% respectivamente; estas muestras fueron significativas obteniendo un total de 139 animales muestreados de 164 posibles, es decir, se muestreó el 84.7% del total. Toma de muestras Se extrajo 10 ml de suero sanguíneo de cada cabra utilizando agujas de 21 mm y tubos de ensayo de tapa roja en los cuales se colocó una etiqueta como identificación de la muestra con su nombre o número de arete. De igual manera para la extracción de muestras de leche se utilizó frascos estériles de muestras de orina en donde se colocó la leche de las cabras que estaban produciendo con su respectiva etiqueta como identificación. Análisis de muestras con Rosa de Bengala Se centrifugó las muestras en una centrífuga HuMax 4K a 5000 rpm para extraer el suero sanguíneo que es en donde se sitúan las bacterias en el caso de que hubiese positivos, con una pipeta automática cambiando la punta para pipeta eppendorf en cada extracción para no mezclar sueros. Con estos sueros diferenciados se procedió a realizar la prueba Rosa de Bengala; se utilizó el kit comercial ROSE BENGAL (RAPID SLIDE AGGLUTINATION ANTIGEN) del fabricante ID.vet Innovative Diagnostics, la cual consistió en colocar en una placa de vidrio 30 ul de suero problema y 30 ul del antígeno Rosa de Bengala. Dicha placa de vidrio está dividida en cuadrantes los cuales son para diferenciar la reacción de cada suero. En los primeros dos cuadrantes se colocó suero como control positivo y en los cuadrantes 3 y 4 se puso suero como control negativo, esto con el fin de ayudar a diferenciar las reacciones de los sueros problema. Una vez distribuidos los sueros sobre los cuadrantes de la placa de vidrio, se mezclaron los sueros con el antígeno utilizando un palillo estéril de madera diferente para cada mezcla. Se colocaron en la placa de vidrio 20 muestras para un mejor manejo. Una vez realizado esto, se colocó la placa en un agitador Thermoscientific MaxQ 2000 durante 4 minutos para que las mezclas estén homogéneas. Y por último la placa fue superpuesta en un aglutinoscopio de marca Interscience Scan 100, para poder observar con ayuda de la luz las reacciones en cada cuadrante comparando fácilmente con los controles positivos y negativos. Se repitió el proceso tras hacer un lavado de la placa luego de anotar los resultados observados con el resto de muestras de 20 en 20 hasta completar el total de muestras. Análisis de lactosuero con ELISA Indirecto en Leche Al igual que con las muestras de sangre, se centrifugó las muestras de leche a 4100 rpm para obtener el suero de la misma ya que los anticuerpos se encuentran en el

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lactosuero. Para esto, se colocó alrededor de 12 ml de leche en un tubo de ensayo etiquetado para cada muestra, ya que la centrífuga está adecuada para tubos de ensayo. Una vez separado el lactosuero, se lo tomó evitando la crema resultante de la centrifugación con una pipeta, utilizando una punta eppendorf para cada muestra y se distribuyó en los tubos eppendorf etiquetando los mismos. Con estos lactosueros se procedió a la realización de la prueba específica ELISA Indirecto en Leche utilizando el kit comercial ID SCREEN® BRUCELLOSIS MILK INDIRECT del fabricante ID.vet Innovative Diagnostics, siguiendo las instrucciones del mismo de esta manera: Fue necesario equilibrar tanto la solución de lavado como los lactosueros a temperatura ambiente (21°C +/- 5°C) y preparar la solución (1x) diluyendo 1:20 la solución de lavado (20x) en agua destilada. Se distribuyó con una pipeta automática 50 ul de Diluyente 2 en cada posillo de la microplaca sensibilizada con el LPS de Brucella. Luego se colocó 50 ul de control negativo en los pocillos A1 y B1 y 50 ul de control positivo en los pocillos C1 y D1 para luego poner 50 ul de muestra en cada uno de los pocillos restantes y dejar incubando por 45 min a 21°C. Después de la incubación se lavó 3 veces con aproximadamente 300 ul de la solución de lavado para luego con el conjugado 1x ya preparado diluido a 1:10 en el diluyente 3, distribuir 100 ul a todos los pocillos y dejar incubar nuevamente durante 30 min a 21°C. Se realizó el lavado respectivo (3 veces) con la solución de lavado y se colocó 100 ul de solución de revelación en cada pocillo para dejar incubar durante 15 min más a 21°C en la oscuridad. Y por último se distribuyó 100 ul de solución de parada en cada pocillo para detener la reacción y se leyó mediante el lector de microplacas MB100-2A Thermo Shaker conectado a un software a una densidad óptica de 450 nm. Análisis de suero sanguíneo con ELISA Indirecto Multiespecies Esta prueba se realizó como comprobatoria a los casos positivos que dio Rosa de Bengala ya que en la prueba de RB resultó una muestra positiva y otra sospechosa positiva, se decidió realizar una comprobación del total de muestras obteniendo resultados más precisos. Para este análisis se procedió de la misma forma que con el ELISA Indirecto en Leche pero utilizando los sueros sanguíneos y el kit ID SCREEN® BRUCELLOSIS SERUM INDIRECT MULTI-SPECIES del mismo fabricante ID.vet Innovative Diagnostics. Resultados y Discusión De las pruebas serológicas y prevalencia Rosa de Bengala Al efectuarse el test Rosa de Bengala se detectaron dos casos positivos; los individuos 88 y 90. Con estos resultados se calculó la prevalencia de la enfermedad conociendo que el total de muestras fue 139, y de esta forma se obtuvo en base a los porcentajes, 75 % de sensibilidad y 95 % de especificidad de la prueba de Rosa de Bengala. (Corbel et al., 1991; OMS/FAO, 1998; Tizard, 1998, citado por Garro, 2004). Y se halló mediante la siguiente fórmula: Pr = Pa + E – 1 S + E – 1 Dónde: Pa = Prevalencia aparente. Pa = casos Positivos x 100 Total de muestras E = Especificidad de la prueba S = Sensibilidad de la prueba

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Tabla 1. Prevalencia según los resultados de Rosa de Bengala

Como se puede ver en la tabla 1, la prevalencia real de la enfermedad según el test Rosa de Bengala en la provincia de Imbabura fue de 1,98%. No existe información a nivel país por lo que se desconoce la prevalencia de Brucella melitensis en el Ecuador. Aun así, en Quito se determinó la presencia de Brucella sp. en ganglios linfáticos y suero de cabras faenadas en el Camal Metropolitano de Quito. Dicha investigación obtuvo un 17.8% de positividad con el Test Rosa de Bengala. (Zabala, 2013). A nivel internacional, en Perú, en la provincia de Cañete en Lima, se recolectaron 385 muestras de sangre de cabras de tres o más meses de edad, procedentes de 21 hatos, las cuales no estuvieron vacunadas contra brucelosis caprina, en donde se encontraron cuatro cabras seropositivas a la prueba Rosa de Bengala (Toledo, 2007). De esta manera se puede observar que los resultados de la investigación en Lima presentan similitud con este estudio. Debido a que en el test Rosa de Bengala se utiliza un antígeno de B. abortus cepa 19 para detectar anticuerpos (Garro, 2004), esta prueba no se la considera del todo confiable en pequeños rumiantes (OIE, 2004); pero es una buena prueba tamiz por su bajo costo y sencilla realización, siempre y cuando se confirme mediante pruebas específicas y de alta sensibilidad (Norma Oficial Mexicana, 2003), por lo cual se efectuó la prueba confirmatoria ELISA Indirecto Multiespecies. ELISA Indirecto Multiespecies Al realizar la prueba ELISA Indirecto Multiespecies para confirmar los datos arrojados por Rosa de Bengala en suero sanguíneo, se obtuvo un resultado de 0 casos positivos. Se calculó la prevalencia de la misma forma que para el test

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Rosa de Bengala, considerando que la sensibilidad para este test es de 95% y su especificidad es de 98% (Picazo & Fuertes, 2002), de esta manera:

Tabla 2. Prevalencia según los resultados de ELISA Indirecto Multiespecies

Como se observa en la tabla 2, se determinó una prevalencia del 0% en la Provincia de Imbabura, descartando los resultados arrojados por el test Rosa de Bengala para las muestras de suero sanguíneo. Investigaciones realizadas en Colombia indican resultados de acuerdo a los obtenidos en este estudio, en donde el total de las muestras de caprinos en dicha investigación (n=326) procesadas con la técnica ELISA Indirecto resultaron seronegativos. (Tique, et al., 2010) ELISA Indirecto en Leche Al realizarse la prueba serológica ELISA Indirecto en Leche, arrojó 1 caso positivo, el cual fue identificado como el individuo 123 a diferencia de los descartados por ELISA Indirecto Multiespecies detectados con Rosa de Bengala. Se determinó la prevalencia utilizando los resultados obtenidos teniendo en cuenta que el total de animales que se encontraban en producción en el momento del muestreo fue de 88, y la sensibilidad y especificidad para este test es de 95% y 98% respectivamente. (Picazo & Fuertes, 2002).

Tabla 3. Prevalencia según los resultados de ELISA Indirecto en Leche

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Como se observa en la tabla 3, la prevalencia real de la enfermedad según la prueba ELISA Indirecto en Leche en la provincia de Imbabura fue de 1,2%. La seropositividad resultante del test ELISA indirecto en Leche pero la seronegatividad con el test ELISA Indirecto Multiespecies en muestras de suero sanguíneo, puede deberse a que las cabras en su mayoría, se recuperan de la enfermedad con el pasar del tiempo (a veces tardan años), pero algunas quedan como portadoras crónicas de brucelas. Estas se localizan en las ubres, y son las causantes del mantenimiento y propagación de la infección en el rebaño. (García, 1979; publicado en MAGRAMA 2010). Esto quiere decir que algunos animales podrían presentar seropositivadad en muestras de lactosuero, pero podrían ser negativos en muestras de suero sanguíneo. El caso positivo podría identificarse como un animal presentando un posible cuadro de brucelosis crónica, ya que el mismo, por su edad (60 meses de edad) podría ser un claro ejemplo de recuperación de la enfermedad, mas no de la total eliminación de la bacteria, la cual sigue latente en las ubres pero no en la sangre, ya que en los análisis en suero sanguíneo, la cabra resultó seronegativa.

Variable Edad

Tabla 4. Distribución de resultados de “Prueba” en función a la variable Edad (por meses)

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Ho: el valor de P es < 0,05 Ha: el valor de P es = o > 0,05

Se acepta la Ho. Sí existe significancia estadística como se observa en la tabla 5. Se debe principalmente a que al tomar la variable edad por meses, considerando los casos positivos a por lo menos una de las pruebas diagnósticas empleadas en este estudio (2 para RB y 1 para ELISA Indirecto en Leche), los resultados positivos resultan en animales adultos, en este caso, pasados los 26 meses. Según la UNAM (2013) la enfermedad se presenta a cualquier edad pero persiste en animales sexualmente maduros. Existe relación entre la edad y los casos positivos según “Prueba”. Pero se debe considerar que los 2 casos positivos a RB fueron descartados por el test ELISA Indirecto Multiespecies.

Tabla 6. Distribución de resultados de Rosa de Bengala en función a la variable Edad (por meses)

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Ho: el valor de P es < 0,05 Ha: el valor de P es = o > 0,05

Se acepta la Ho. La significancia estadística se evidencia (ver tabla 7) en los resultados de Rosa de Bengala, pero como fue explicado anteriormente estos casos positivos en RB fueron descartados por la prueba ELISA Indirecto Multiespecies.

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Ho: el valor de P es < 0,05 Ha: el valor de P es = o > 0,05

Se rechaza la Ho y se acepta la Ha. En el caso de la prueba ELISA Indirecto, el análisis se torna no significativo estadísticamente (ver tabla 9), es debido a que hay un solo resultado positivo entre los 139 animales. Ya que los casos positivos a RB fueron anulados por los resultados de ELISA Indirecto Multiespecies que pretendían confirmar los mismos, y a pesar de que la UNAM (2013) afirma que la enfermedad se presenta a cualquier edad pero persiste en animales sexualmente maduros, los resultados del análisis para la variable edad como un factor de riesgo según este estudio, son estadísticamente no significativos.

Variable Raza

Tabla 10. Distribución de resultados de “Prueba” en función a la variable Raza

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Ho: el valor de P es < 0,05 Ha: el valor de P es = o > 0,05

Como se observa en la tabla 11, no hay significancia estadística rechazando así la Ho y aceptando la Ha. A pesar de que los 3 casos positivos fueron de la raza Saanen no quiere decir que esta raza sea la más propensa a poseer la enfermedad. Como se puede observar (ver tabla 10), 101 animales son de raza Saanen de 139 posibles, evidenciando que es la raza más común en la región investigada pero no la más vulnerable necesariamente. Díez (2014) señala que en los ovinos se presenta una receptividad variable de acuerdo con las razas, pero no ocurre esto en los caprinos. Por lo tanto, la variable Raza según este estudio no es un factor de riesgo. Variable Presencia de abortos La variable “Presencia de abortos” se lo analizó con el factor Riesgo Relativo al ser éste el síntoma más característico de la brucelosis.

Tabla 12. Distribución de resultados de Rosa de Bengala en función a la variable Presencia de abortos

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El Riego Relativo es de 0,9843 como indica la tabla 13 y se lo interpreta así: Mientras más cerca se encuentre del valor de 1, más ausencia de riesgo existe, es decir, según este estudio y tomando en cuenta los resultados al test Rosa de Bengala (ver tabla 12), la presencia de abortos no es un factor de riesgo.

Tabla 14. Distribución de resultados de ELISA Indirecto en función a la variable Presencia de abortos

Como se observa en la tabla 15, la presencia de abortos no es un factor de riesgo según el test Elisa Indirecto.

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Tabla 16. Distribución de resultados de "Prueba" en función a la variable Presencia de abortos

La tabla 17 indica ausencia de riesgo para la variable presencia de abortos, Díez (2014) resalta que las hembras infectadas presentan una gran cantidad de abortos principalmente en el primer parto, pero como se puede ver en la tabla 16, existieron 6 abortos dentro de una población de 133, pero ninguna de estas hembras presentó seropositividad a las pruebas diagnósticas. Por otro lado, las hembras positivas a brucelosis no presentaron abortos y tampoco fueron primíparas. Por lo tanto, los abortos registrados en este estudio, son resultado de factores externos a la bacteria. Es decir, la presencia de abortos según este estudio no es un factor de riesgo para la presentación de resultados positivos para las pruebas diagnósticas. Bibliografía

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REDVET: 2017, Vol. 18 Nº 9

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