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Processos Biotecnológicos Aplicados à Área da
Saúde Humana
Leda Castilho
Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ)COPPE – Programa de Engenharia Química
Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares (LECC)
Seminário em FarManguinhos – 27 de maio de 2010
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Resumo da apresentação
Introdução
Aplicações de produtos biotecnológicos para a saúde humana
Proteínas recombinantes de uso terapêutico: biofármacos
Aspectos de mercado
A seleção da célula hospedeira: um aspecto tecnológicoimportante
O processo de produção
Aspectos regulatórios
O Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares daCOPPE/UFRJ
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Introdução
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Definição:
Emprego de células ou componentes celulares para a obtenção de produtos de utilidade para o homem
Biotecnologia
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Produtos biotecnológicos para a saúde
ProteinsPolypeptides
VP 2
VP 1
VirusesCapsidsCapsidomers
DNAPlasmids
Antibiotics and othersecundary metabolites
O
N
H
N
S CH3
MeOO
H H
Células(células-tronco embrionárias em frascos T e em MCs, marcadas com DAPI e OCT-4)
Antibióticos e outros metabólitos secundários
Proteínas Ácidos nucleicos
Vírus Partículas pseudo-
virais
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Produtos da Biotecnologia Moderna para a saúde
ProteinsPolypeptides
VP 2
VP 1
VirusesCapsidsCapsidomers
DNAPlasmids
Células(células-tronco embrionárias em frascos T e em MCs, marcadas com DAPI e OCT-4)
Proteínasrecombinantes
Ácidos nucleicos
Vírus Partículas
pseudo-virais
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Síntese química x biossíntese
A
B
C D E F
Matéria-prima Intermediários Produto
A F
Matéria-prima Célula Produto
Moléculas obtidas por conversão química
Produtos biotecnológicos
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Exemplos de fármacos obtidos por síntese químicaParacetamol (analgésico) MM = 151,16 DaCetamina (anestésico) MM = 237,74 DaAciclovir (anti-viral) MM = 225,20 DaZidovudine (anti-viral) MM = 267,20 DaMisoprostol (anti-úlcera) MM = 382,50 Da
Exemplos de biofármacos produzidos por via biotecnológicaInsulina tratamento de diabetesEnzimas agentes trombolíticos, digestivos, etc.Fatores sanguíneos tratamento de hemofiliaAnticorpos tratamento de diferentes tipos de
câncer
Fármacos x biofármacos
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Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40(fórmula da sequência de aminoácidos)
(MM = 146.000)
O
O
OH
O
Ácido acetil salicílico C9H8O4
(MM = 180)
O
O H
O
Fármacos x biofármacos
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Aplicações de produtos biotecnológicos para a saúde humana
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Aplicações de produtosbiotecnológicos para a saúde
Vacinas
Terapia gênica Terapias celulares e células-tronco
Diagnóstico (in vitro e in vivo)
Biofármacos
Biotecnologia para Saúde
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Proteínas recombinantes de uso terapêutico: biofármacos
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Definição mais usada (Walsh, 2002):“A biopharmaceutical is a protein or nucleic acid based pharmaceutical substance used for therapeutic or in vivo diagnostic purposes, which is produced by means other than direct extraction from a native (non-engineered) biological source’’
Walsh G (2002), Biopharmaceuticals and biotechnology medicines: an issue of nomenclature, European Journal of Pharmaceutical Sciences 15, 135–138
Biofármacos
Biofármacos em comercialização proteínas terapêuticas:avanços no entendimento da base molecular das doenças revelaram a existência de proteínas com potencial terapêuticoproduzidas naturalmente pelo organismo em mínimas quantidades inicialmente desincentivou a sua produção para aplicação médica em larga escala
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O desenvolvimento das técnicas da Biotecnologia Modernapossibilitou sua produção em grande escala:
tecnologia do DNA recombinantee/outecnologia de hibridomas(ex.: anticorpos monoclonais terapêuticos)
Usados no tratamento de doenças importantes:diabetes (insulina)câncer (anticorpos monoclonais)anemia (eritropoetina, EPO)hemofilia (fatores de coagulação VIII e IX recombinantes)neutropenia (G-CSF e GM-CSF)infarto agudo do miocárdio (t-PA)
Biofármacos
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Permite expressar genes que codificam proteínas humanas em diferentes células hospedeiras, tais como microrganismos e células animais
Permite a produção destas proteínas em larga escala
Tecnologia do DNA recombinante
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Tecnologia de hibridomas para obter anticorpos monoclonais
Tecnologia de hibridomas: fusão de linfócitos B finitos com células contínuas de mieloma (tumorais) para a obtenção de linhagens contínuas secretoras de anticorpos
Tamashiro e Augusto (2008), In: Moraes, Augusto eCastilho, Tecnologia do Cultivo de Células Animais: deBiofármacos a Terapia Gênica. Cap. 17. Editora Roca, SãoPaulo.
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Biofármacos em comercialização: o exemplo da insulina
Proteína simples! (exceção…)
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EGF-1 EGF-2
O exemplo do Fator IX humano
γ-carboxi-lação (Gla)
Glicosilação (CHO), sulfatação (SO3) e fosforilação (PO3)
Hidroxilação (OH)
DOMÍNIO SERINA-PROTEASE
PEPTÍDEO DE ATIVAÇÃODOMÍNIO
GLA
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O exemplo da eritropoetina (EPO)
Eritropoetina
N-Glicosilação: Asn (24,38,83)
Nac-Glc
Nac-Glc
β1-4Fuc
α1-6
β1-4
Man
ManMan
α1-6 α1-3
Nac-Glc
Nac-Glc Nac-Glc
Nac-Glc
β1-2 β1-2
Gal Gal
Gal Gal
β1-4
β1-4β1-4
β1-4
S
S S
S
α2-3
α2-3 α2-3
α2-3
Fonte: Kratje (2004)
O-Glicosilação:Ser (126)
Nac-Gal
Gal
S
α2-3
β1-3S
α2-6
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Biofármacos de primeira vs.de segunda geração
Primeira geração:Proteínas com idêntica sequência de aminoácidosVoltadas para a reposição ou aumento do nível de proteínas endógenas
Segunda geração:Fração crescente dos biofármacos aprovados recentementeEngenharia de proteínas propriedades terapêuticas planejadas
Geração de um produto de ação mais rápida ou mais lentaAlteração do tempo de meia vida do produtoAlteração da imunogenicidade do produtoDesenvolvimento de proteínas terapêuticas híbridas
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Estratégias usadas em engenharia de proteínas e exemplos:
Alteração da sequência de aminoácidos
Insulina e t-PA
Remoção de domínios da proteína
Fator VIII modificado (Refacto) e t-PA
Obtenção de moléculas híbridas (anticorpos) e proteínas de fusão
Infliximab – anticorpo quimérico
Enbrel – proteína fusionada
Engenharia pós-traducional
Glicosilação: EPO Aranesp
Adição de PEG: interferon α2 peguilado
Biofármacos de segunda geração
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O exemplo da insulina
Molécula Início da Meia-vidaação
Insulina 0,5 – 1 h 6 –10 h
Lispro 5–15 min 4 – 5 h
Aspart 5–15 min 4 – 5 h
Glargine 1 – 2 h ~24h
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O exemplo da insulina
INSULINA LISPRO (em rosa): Níveis séricos de insulina (ng/ml) após uma injeção subcutânea em voluntários saudáveis ( n=10 ).
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O exemplo do Refacto (Fator VIII modificado)
Remoção do domínio B namolécula recombinante
Manutenção da atividade coagulante
Maior estabilidade
Fator VIII completo
Fator VIII ativo (FVIIIa)
Fonte: Bowen (2002)
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O exemplo da EPO hiperglicosilada
Meia vida: 8,5 h 25,3 h
Eritropoetina nativa Aranesp: 2 sítios de N-glicosilação extras
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O exemplo do PegIntron
Frasco: R$ 12 R$ 650 a R$ 850
24% dos recursos do Programa de Medicamentos
Excepcionais em 2004
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Aspectos de mercado
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Vendas mundiais de US$ 79 bilhões em 2007, com crescimento anual de ~15%
Número crescente de moléculas aprovadas a cada ano
Expectativa de representar em 2010:
50% dos novos produtos aprovados pelo FDA17% de todas as prescrições
Novos biofármacos evacinas aprovados
Aspectos de mercado
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Produtos aprovados e em desenvolvimento
1
Fonte: Walsh (2003)
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Produtos em desenvolvimento clínico por tipo de molécula
Total: ~370
Fonte: Walsh (2003)
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A seleção da linhagem hospedeira: aspecto tecnológico relevante
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Sistemas de expressão
Os principais produtos de desenvolvimento recente da indústria biofarmacêutica são produzidos com base na tecnologia do DNA recombinante
Vários sistemas de expressão podem ser empregados:Leveduras e fungos filamentososE. coli e outros procariotosCélulas de mamíferosCélulas de insetosCélulas vegetaisPlantas transgênicasAnimais transgênicos (ex.: ovelhas, cabras)
mais empregados
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Espécie mais largamente empregada: E. coli
Vantagens:fácil cultivo em larga escalameios de cultivo simples e de baixo custoespécie bem caracterizada e facilidade de manipulaçãogenéticaaltos níveis de expressão podem ser obtidos:
interferon γ: 25% da proteína celular totalinsulina: 20% da proteína celular totalinterferon β: 15% da proteína celular totalinterleucina 2: 10% da proteína celular totalhormônio do crescimento humano:
5% da proteína celular total
Produção de biofármacos emmicrorganismos recombinantes
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Limitações:presença de lipopolissacarídeos de natureza pirogênica em suasuperfície, tornando necessário removê-los posteriormente, durante as etapas de separação e purificação do produtoincapacidade de realizar corretamente as modificações pós-traducionais, especialmente a glicosilação, necessárias paraconferir atividade biológica a muitas proteínas
em glicoproteínas, a glicosilação influencia fortemente a atividade biológica da proteína, a sua eficácia in vivo e o seuperfil terapêuticobactérias em geral não glicosilam e leveduras têm padrõesdistintos de glicosilaçãonenhum sistema heterólogo de expressão realiza a glicosilaçãode modo absolutamente idêntico ao da fonte original daproteína
Produção de biofármacos emmicrorganismos recombinantes
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Limitações (cont.)acúmulo de proteínas heterólogas intracelularmente
necessidade de estágios de processamento adicionais pararomper as células e remover os debris celularesmaiores gastos com a purificação da proteína de interessedevido à necessidade de separá-la das milhares de proteínashomólogas intracelulares produzidas por E. coliformação de agregados insolúveis de proteínas heterólogasparcialmente enoveladas, os chamados corpos de inclusão
Produção de biofármacos emmicrorganismos recombinantes
corpos de inclusão
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Formação de corpos de inclusãonecessidade de emprego de agentes desnaturantes (uréia, detergentes e solventes) para solubilizar o corpo de inclusãonecessidade de posterior remoção do agente desnaturante pordiálise ou diafiltração, de modo a permitir um reenovelamentoda proteína na sua conformação ativaconsequência: baixos rendimentos nos processos de purificação
Produção de biofármacos emmicrorganismos recombinantes
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Produto Proteína Indicação AprovaçãoHumulin insulina diabetes 1982
Humatrope hormônio do cresc. hum.
deficiências no crescimento
1987
Ecokinase t-PA doenças cardíacas 1996
Intron A interferon α leucemia e outras 1986
Actimmune interferon γ CGD* 1990
Filgrastima G-CSF neutropenia 1991
Proleukin interleucina2 carcinoma renal 1992
* chronic granulomatous disease
Exemplos de produtos comerciais obtidos em E. coli recombinante
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Células complexas…
http://www.d.umn.edu/cla/faculty/troufs/anth1602/images/Turn80301_cell1.jpg
Endoplasmic reticulum (ER)
Golgiapparatus
Produção de biofármacos emcélulas animais recombinantes
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Proteínas terapêuticas: muitas são proteínas complexasGrandes, com várias modificações pós-tradução, as quais afetam
Atividade biológicaEstabilidadeImunogenicidade
Por isso células de mamíferos
Anticorpo C225C6466 H9982 N1726 O2024 S40
(fórmula da sequência de aminoácidos)(MM = 146000)
EPO
Para produzir moléculas complexas…
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Sistema de expressão atualmente majoritário para a produção de proteínas recombinantes:
secretam a proteína no meio de cultivofacilidade de purificação
modificações pós-traducionaiscarboxilação, hidroxilação, sulfatação, fosforilação e especialmente a glicosilação
atividade biológica, estabilidade, imunogenicidade
Célula hospedeira mais usada: células CHO (Chinese hamster ovary cells)
padrão de glicosilação adequadobaixa susceptibilidade a vírus que afetam humanos CHO.K1
Células animais como sistema de expressão
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Linhagens celulares comumente empregadas
vacinas
vacinas
biofármacos
biof. e vacinas veter.biofármacos e ter. gên.
antic. monoclonais rec.
passíveis de adaptação aocrescimento em suspensão
Léo P, Galesi ALL, Suazo CAT, Moraes AM (2008), In: Moraes AM, Augusto EFP & Castilho LR (eds.), Tecnologia do Cultivo de Células Animais: de Biofármacos a Terapia Gênica, Cap. 2. Editora Roca, São Paulo.
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Células CHO aderentes
Células CHOadaptadas ao cultivo em suspensão
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Exemplos de produtos comerciais obtidos em células animais
Produto Indicação Célula Aprov.
Avonex (β-interferon) esclerose múltipla CHO 1996
Benefix (fator IX) hemofilia B CHO 1997Epogen (EPO) anemia CHO 1989
Activase/Alteplase (t-PA) infarto CHO 1986
Herceptin/Trastuzumab (MAb) câncer de seio CHO 1998
Refacto (fator de coagulação) hemofilia A CHO 2000
ProstaScint (MAb, diagn. in vivo) câncer de próstata hibridoma 1996Simulect/Basiliximab (MAb) rejeição de órgãos Sp2/0 1998Campath (MAb) leucemia CHO 2001Avastin/Bevacizumab (MAb) câncer coloretal CHO 2004Xolair/Omalizumab (MAb) asma CHO 2003Soliris/Eculizumab (MAb) hemoglobinuria (PNH) NS0 2007
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O processo de produção
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O processo de produçãoDesenvolvimento dalinhagem celular
Cultivo celularem biorreatores
Downstream processing(separação das células, purificação do produto)
Formulação
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Desenvolvimento da linhagem celular
Cultivo celular
Purificação
Formulação e envase
Clonagem e expressão do gene de interesseSeleção do clone mais adequadoBanco mestre e de trabalho
Formulação do meio de cultivoTipo de biorreator e modo de operação
Técnicas a serem empregadasNúmero de etapas e combinação entre elasMaximização do rendimento x grau de pureza
AdjuvantesNovas formas de administração
Permeando todas as fases:- registro de dados- controle de qualidade de matérias-primas e produto- garantia da qualidade, aspectos regulatórios
O processo de produção
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O processo de produção Linhagens produtoras
Desenvolvimento de linhagens alta-mente produtoras
Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade
Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento
Polylinker
Digestion
pCR2.1-FIX
Digestion
PCR
CDNA FIX
Primer 1
Primer 2
pCMV5FIX, digested
Neo AmpR P CMV
Ligation
pCI-Neo-FIX FIX
pg cel-1 dia-1
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O processo de produção Linhagens produtoras
Desenvolvimento de linhagens alta-mente produtoras
Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade
Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento
0 2 4 6 8 10
days
FIX CMV-FIX CMV-FIX.kozCMV-FIXINT1 CMV-FIXINT1.koz FIXINT1.kozEGFP WT (control)
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1 μl de reagente lipídico
0.2 μg pCMV.Sport-β-gal
3.5 μl de reagente lipídico
1.2 μg pCMV.Sport-β-gal
Expressão de um gene repórter em células BHK-21• influência de diferentes concentrações de DNA
(plasmídeo) e de reagente lipídico
O processo de produção Linhagens produtoras
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Desenvolvimento de linhagens alta-
mente produtoras
Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade
Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento
O processo de produção Condições de cultivo
Sousa PM, Freire DMG, Medronho RA, Castilho LR (2009), Braz. Arch. Biol. Technol. (subm.).
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Exemplo de desenvolvimento de meios quimicamente definidos isentos de soro animal:
Estudo do metabolismo de células CHO para selecionar suplementos a serem adicionados a meios basais clássicosEmprego de ferramentas de planejamento estatístico de experimentos
O processo de produção Meios de cultivo
Castilho LR et al. (2006), Pedido de patente submetido ao INPI.
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Biorreatorescom bolsasdescartáveis
Células capazes de crescer em suspensão
Frascos agitados(spinner flasks)
Biorreatores detanque agitado
O processo de produção Biorreatores
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Predomínio em larga escala dos tanques agitados
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O processo de produção Modos de operação
Batelada Batelada alimentada Contínuo simples Perfusão
Alimentação Suspensãode células
Perfundido
Equipamentode retençãocelular
Alimentação Alimen-tação
Batelada
Batelada alimentada Contínuo
Perfusão
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Desenvolvimento de linhagens alta-
mente produtoras
Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade
Desenvolvimento de processos de purifica-çãodealto rendimento
Estratégia de desenvolvimento de inóculoAmpliação de escala
O processo de produção Ampliação de escala
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Desenvolvimento de linhagens alta-
mente produtoras
Estabelecimento de processos de cultivo de alta produtividade
Desenvolvimento de processos de
purificaçãodealtorendimento
Cultivo celular
Separação de células
Ultrafiltração
Crom.afinidade
Crom. tr. iônica
Ultrafiltração Diafiltração
Cromat.gel filtr.
Liofilização
Ex.:
100%
85%
85%
85%
85%
85%
85%
85%32%
O processo de produção Purificação
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Grandes demandas, ainda nodesenvolvimento clínico
1
10
100
1000
10000
100000
Pre-clinical Phase I/II Phase II/III Commercial I Commercial II
Stage of development
Dem
and
.(g)
Demanda por um anticorpo monoclonal ao longo do desenvolvimento clínico e fase comercial:
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O objetivo final: um processoeconomicamente viável
Filling
Cultivation
ACTIVEINGREDIENT
FINALPRODUCT
Purification
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Desenvolver linhagens celulares mais produtivas
Desenvolver processos de cultivo mais eficientes
Desenvolver processos de purificação de alto rendimento
1
10
100
1000
100 1000 10000 100000
10 mg/L/day
3050100300500
Pro
duçã
o an
ual (
kg)
Volume de biorreator (L)
t*V*adeprodutividanualprodução biorreator=
Desafios
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Aspectos regulatórios
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http://pubs.acs.org/cen/coverstory/8038/8038biogenerics3.html
V. 80 (38), p. 61-6523/09/2002
Expiração de patentes de biofármacos
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Expiração de patentes no início do século XXI
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Considerações relacionadasa produtos biológicos
Produtos biológicos são geralmente complexoscaracterização mais difícilqualidade do produto altamente dependente do processo produtivomudanças no processo produtivo podem acarretar alterações no perfil de eficácia e segurança
Expiração de patentes“second-entry biologicals”, “biossimilares”, “não-novos”controvérsia sobre aspectos regulatóriosmaiores possibilidades de produção no Brasilincentivo à otimização de processos para redução de custos
Desenho: Visser J (2009), Palestra dada na COPPE/UFRJ. Slides disponíveis em
www.peq.coppe.ufrj.br/biotec
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Biossimilares segundo palestrante da Sandoz
Fonte: Visser (2009), Palestra dada na COPPE/UFRJ. Slides disponíveis em www.peq.coppe.ufrj.br/biotec
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Documentos de interesse
EMEA: legislação completa, vários biossimilares já aprovadosGuia superior:“Guideline on similar biological medicinal products”(http://www.emea.europa.eu/pdfs/human/biosimilar/043704en.pdf)
Guias gerais para proteínas produzidas por biotecnologiaavaliação de segurança/eficáciaconceitos de qualidade, não clínico/clínico
Guias específicos indicando requerimentos específicos por produtoEPO, hGH, insulina, G-CSF e interferon-α (anticorpos monoclonais em discussão) estudos de comparabilidade usando as técnicas mais avançadas disponíveis (biofármaco de referência vs. biossimilar)requerimentos específicos em termos de ensaios clínicos
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Documentos de interesse
De uma forma geral: todas as normas gerais do ICH, EMEA e FDA referentes à qualidade e segurança de produtos biológicos se aplicam igualmente a biofármacos inovadores e biossimilares
FDA: workshops públicostransferência dos biofármacos para o CDERScientific Considerations Related to Developing Follow-On Protein Products, 14-16 de fevereiro de 2005http://www.fda.gov/cder/meeting/followOn/followOnPresentations2_2005.htm
Scientific Considerations Related to Developing Follow-On Protein Products, 14-15 de setembro de 2004http://www.fda.gov/cder/meeting/followOn/followOnPresentations.htm
Nature Biotechnology, vol. 22, no. 11, nov/2004http://www.nature.com/nbt/focus/bioprocessing/index.html
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Panorama no Brasil
No Brasil: legislação vigente em 2009/2RDC 315, 10/26/05 – Registro de produtos biológicos
RDC 233, 08/17/05 (extratos alergênicos)RDC 323, 11/10/03 (probióticos)RDC 46, 05/18/00 (hemoderivados)
Revisão da RDC 315/05: iniciada em 2009/2
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Revisão da RDC 315*
RDC 315Mesmo check-list para todas as categorias de produtos biológicos
PerspectivaTratamento diferente para categorias distintas de produtos biológicosCheck-list específico para produção e controle de qualidade de: vacinas, hemoderivados, biotecnológicos (biomedicamentos e anticorpos monoclonais) e soros hiperimunesPossibilidade de Instruções Normativas específicas por produto, determinando requisitos de produção e controle de qualidade e requisitos não clínicos e clínicos
* Reproduzido de: Thees MF (2009), Palestra da representante da ANVISA no SINAFERM 2009.
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Revisão da RDC 315*
Relatório de Experimentação Terapêutica
RDC 315Estudos pré-clínicosEstudos Clínicos Fase I, II e IIIEstudos de não inferioridade para os produtos biológicos não novos
PerspectivaMaior detalhamento dos requisitos de estudos de não inferioridade e como deve ser a apresentação do relatório de experimentação terapêutica
* Reproduzido de: Thees MF (2009), Palestra da representante da ANVISA no SINAFERM 2009.
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O Laboratório de Engenharia de Cultivos Celulares da COPPE/UFRJ
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O Laboratório de Enga. de Cultivos Celulares da COPPE/UFRJ
PSDI_600x2300 PSEI_600x2300 PSDI_600x2300
BA
NC
O
PSD
I_60
0x23
00 PSEI
_600
x230
0
PBEVI_(800+300)x2300
PBD
VI_
(800
+300
)x23
00
- 150 m2
- 70 m2
de salaslimpas
Class ISO 8 (100.000)
Class ISO 7 (10.000)
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O Laboratório de Enga. de Cultivos Celulares da COPPE/UFRJ