DAYA HAMBAT FRAKSI ETIL ASETAT DAUN KEMBANG BULAN

(Tithonia diversifolia) TERHADAP PROLIFERASI SEL KANKER

PAYUDARA MCF-7

I LATAR BELAKANG

Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) adalah salah satu tumbuhan yang

jumlahnya sangat banyak di daerah Hulu Sungai Selatan. Kandungan kimia yang

terdapat dalam tumbuhan Kembang Bulan adalah flavonoid, saponin, triterpenoid

dan polifenol (Lingga et al, 2010). Dengan adanya senyawa flavonoid yang

terkandung dalam tumbuhan Kembang Bulan, maka diduga tumbuhan tersebut

juga memiliki kemampuan untuk menghambat proliferasi sel kanker payudara

MCF-7. Karena adanya dugaan tersebut maka dilakukan penelitian secara ilmiah

terhadap daya hambat dari fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia

diversifolia) terhadap proliferasi sel kanker payudara MCF-7.

II RUMUSAN MASALAH

Rumusan masalah yang diangkat pada penelitian ini adalah apakah fraksi

etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) memiliki kemampuan

untuk menghambat proliferasi sel kanker payudara MCF-7?

III TUJUAN PENELITIAN

3.1. Tujuan Umum

Secara umum, penelitian ini dilakukan untuk

3.2. Tujuan Khusus

Penelitian ini secara khusus bertujuan untuk :

1

(1). Mengetahui daya hambat fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia

diversifolia) terhadap proliferasi sel kanker payudara MCF-7.

(2). Membandingkan daya hambat dari beberapa konsentrasi fraksi etil asetat

daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) proliferasi sel kanker payudara

MCF-7.

IV MANFAAT PENELITIAN

Manfaat penelitian ini untuk memberikan informasi mengenai kemampuan

fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) dalam menghamat

proliferasi sel kanker payudara MCF-7 serta dapat digunakan sebagai landasan

untuk penelitian selanjutnya.

V TINJAUAN PUSTAKA

5.1. Tumbuhan Kembang Bulan (Tithonia diversifolia)

5.1.1. Klasifikasi

Klasifikasi tumbuhan Kembang Bulan adalah sebagai berikut:

Domain : Eukaryota

Kingdom : Plantae

Phylum : Tracheophyta

Class : Magnoliopsida

Order : Asterales

Family : Asteraceae

Genus : Tithonia

Specific epithet : diversifolia

2

Botanical name : Tithonia diversifolia

(The BayScience Foundation Inc, 2009).

5.1.2. Deskripsi

Habitus tumbuhan Kembang Bulan berupa perdu dengan tinggi ± 5 m.

Daunnya tegak, bulat, berkayu, dan berwarna hijau. Daun Kembang Bulan berupa

daun tunggal, berseling, panjang 26-32 cm, lebar 15-25 cm, ujung dan pangkal

runcing, pertulangan daun menyirip, dan warnanya hijau. Bunganya majemuk,

terletak di ujung ranting, tangkai bulat, kelopak berbentuk tabung, berbulu halus,

dan berwarna hijau. Mahkota bunga lepas, bentuk pita, halus, kuning. Benang sari

berbentuk bulat, warna kuning, sedangkan putik melengkung dan warnanya

kuning. Buah kotak, bulat, masih muda hijau dan setelah tua menjadi coklat. Biji

bulat, keras, dan warnanya coklat. Akar tumbuhan Kembang Bulan berbentuk

tunggang dengan warnanya putih kotor (Steenis, 2003).

Gambar 1. Tumbuhan Kembang Bulan (The BayScience Foundation Inc, 2009)

5.1.3. Kandungan Kimia dan Khasiat

Tumbuhan Kembang Bulan memiliki kandungan kimia berupa flavonoid,

saponin, triterpenoid dan polifenol (Lingga et al, 2010). Berdasarkan kandungan

kimia tersebut, tumbuhan ini memiliki beberapa khasiat diantaranya sebagai obat

3

sakit perut kembung, peluruh haid, antidiabetes, serta diduga sebagai peluruh batu

ginjal.

5.2. Flavonoid

Senyawa flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol yang terbesar

ditemukan di alam. Flavonoid terdapat dalam tumbuhan sebagai campuran, jarang

ditemukan dalam bentuk tunggal. Flavonoid merupakan turunan senyawa induk

flavon yang mempunyai sejumlah sifat sama. Pada tumbuhan, aglikon flavonoid

terdapat dalam berbagai bentuk struktur. Semuanya mengandung atom karbon

dalam inti dasarnya yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6, yaitu dua cincin

aromatik yang dihubungkan oleh satuan tiga karbon yang dapat atau tidak dapat

membentuk cincin ketiga (Fengel, 1995).

Gambar 2. Struktur kimia flavonoid (Rohyami, 2008)

Flavonoid yang terkandung dalam tumbuhan dapat diekstraksi dengan

berbagai macam pelarut. Pemilihan pelarut biasanya didasarkan atas kepolaran

pelarut yang disesuaikan dengan flavonoid. Flavonoid bersifat polar sehingga

mudah larut dalam pelarut polar misal: air, etanol, aseton, butanol, dan lain-lain

(Robinson, 1995).

5.3. Kanker Payudara

5.3.1. Definisi

5.3.2. Penyebab kanker payudara

4

5.3.3. Penanganan

5.4. Ekstraksi

Ekstraksi adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan

kelarutannya terhadap dua cairan immiscible yang berbeda, biasanya air dan yang

lainnya pelarut organik. Ekstraksi cair-cair merupakan proses yang umum

digunakan, baik itu skala laboratorium maupun skala industri. Tujuan ekstraksi

adalah untuk mengambil sebagian atau seluruh zat tertentu yang ada dalam

tumbuhan, sehingga memudahkan dalam pengaturan bentuk sediaan, dosis yang

tepat, mudah dalam penyimpanan, praktis dalam penyajian dan menjaga keawetan

bahan untuk jangka waktu yang lebih lama (Voigt, 1994).

Gambar 4. Alat soxhlet (Wikimedia Foundation Inc, 2007)

Salah satu metode ekstraksi senyawa organik bahan alam yang umum

digunakan adalah soxhletasi. Soxhletasi merupakan penarikan komponen kimia

yang dilakukan dengan cara serbuk simplisia ditempatkan dalam klonsong yang

telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa, cairan penyari dipanaskan dalam labu

alas bulat sehingga menguap dan dikondensasikan oleh kondensor bola menjadi

molekul-molekul cairan penyari yang jatuh ke klonsong menyari zat aktif dalam

simplisia dan jika cairan penyari telah mencapai permukaan sifon, seluruh cairan

akan turun kembali ke labu alas bulat melalui pipa kapiler hingga terjadi sirkulasi.

5

Ekstraksi sempurna ditandai bila cairan disifon tidak berwarna, tidak tampak noda

jika di KLT, atau sirkulasi telah mencapai 20-25 kali (Harborne, 1987).

5.5. Fraksinasi

Fraksinasi adalah salah satu usaha yang dilakukan dalam rangka

memperoleh senyawa yang sederhana melalui metode yang tepat. Fraksinasi dapat

dilakukan dengan menggunakan corong pisah, press kolom, KK, ataupun SC.

Tujuan dari dilakukannya fraksinasi adalah melakukan pemisahan senyawa kimia

sesuai dengan tingkat kepolarannya. Pelarut yang ideal adalah pelarut yang

selektif terhadap beberapa senyawa yang diharapkan. Dengan kata lain fraksinasi

adalah suatu proses memisahkan beberapa senyawa sehingga keberadaan senyawa

lebih sederhana. Digunakan pelarut campuran agar senyawa dapat terlarut sesuai

dengan tingkat kepolaran pelarut yang digunakan (Harborne, 1987).

5.6. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran

senyawa menjadi senyawa murninya atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi.

Bahan adsorben sebagai fase diam dalam KLT digunakan silika gel, alumina dan

serbuk selulosa. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai

(Gritter, 1991). Kromatografi lapis tipis memiliki berbagai keunggulan antara lain

sederhana, relatif murah, memungkinkan penggunaan pereaksi agresif, merupakan

satu-satunya teknik yang dapat menganalisa berbagai campuran komponen secara

serempak (Kantasubrata, 1991).

Identifikasi senyawa yang tidak berwarna pada kromatogram dilakukan di

bawah sinar UV (254 & 366 nm), ditandai dengan ada tidaknya fluoresensi untuk

6

menampakkan senyawa yang hampir tidak nampak atau hanya nampak lemah di

bawah lampu UV digunakan bahan penyemprot (Autherhoff & Kovar, 2002).

Menurut Yunas (Wagner & Bladt, 1996) keberadaan flavonoid ditandai dengan

pemadaman pada UV 254 sedangkan di bawah sinar UV 366, flavonoid akan

berfluorosensi kuning, biru atau hijau tergantung dari strukturnya. Flavonoid juga

akan memberikan noda warna kuning yang sangat jelas jika diuapi dengan uap

ammonia. Selain itu dengan pereaksi sitroborat akan memberikan bercak kuning

berfluoresensi di bawah sinar UV 366 nm.

Menurut pengalaman, pemakaian pereaksi semprot yang paling

menguntungkan adalah dalam meningkatkan kepekaan mendeteksi bercak

flavonoid. Ada empat penyemprot yang biasa digunakan untuk tujuan ini adalah

larutan AlCl3 5%, kompleks difenil-asam borat-etanolamin, asam sulfanilat yang

terdiazotasi, dan larutan vanilin 5% dalam etanol dicampur dengan HCl pekat

(Markham, 1988).

VI HIPOTESIS

Berdasarkan latar belakang dan permasalahan yang telah dijabarkan maka

dapat dikemukakan suatu hipotesis yaitu fraksi etil asetat daun Kembang Bulan

(Tithonia diversifolia) diduga mempunyai kemampuan dalam menghambat

proliferasi sel kanker payudara MCF-7.

VII METODOLOGI PENELITIAN

7.1. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental. Variabel bebas adalah

fraksi etil asetat daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) yang diperoleh dari

7

proses fraksinasi terhadap ekstrak etanol daun Kembang Bulan. Variabel

tergantung adalah konsentrasi hambat (IC50) terhadap sel kanker payudara MCF-7,

dan variabel kendali adalah sel kanker payudara MCF-7, media biakan, waktu

inkubasi, dan suhu.

7.2. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2010 sampai bulan

Januari 2011 di Laboratorium Mikrobiologi, Sub Laboratorium Farmasi

Laboratorium Dasar Fakultas MIPA Unlam Banjarbaru.

7.3. Alat dan Bahan Penelitian

7.3.1. Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan adalah neraca analitik (Ohauss Explorer Pro dan

GF-3000), vacum rotary evaporator (Ika-Werke), seperangkat alat soxhletasi,

alat-alat gelas (Pyrex Iwaki Glass), waterbath (Memmert), oven (Mammert), box

lampu UV, penjepit kayu, pipet tetes, pipet volume, pengaduk, blender, sendok

tanduk, bejana kromatografi, cawan petri, mikroskop, inkubator, microplate

reader, mikropipet.

7.3.2. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan adalah sampel daun Kembang Bulan, serbuk daun

Kembang Bulan, sel MCF-7 koleksi Cancer Chemoprevention Research Center

(CCRC) Fakultas farmasi UGM yang dirawat dan ditumbuhkan pada medium

DMEM (Gibco) dengan 10% FBS (Gibco) dan 1% Penicillin-Streptomycin

(Gibco), aquades (H2O), etanol (C2H5OH) teknis, n-heksana (C6H14) pa, etil asetat

(C4H8O2) pa, plat KLT silika gel GF 254, isopropanol, HCl 4N, MTT [3-(4,5-

8

dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida], asam asetat (CH3COOH), n-

butanol (C4H9OH), ammonia (NH3), sitroborat, aluminium foil, kapas dan kertas

label serta tissu gulung.

7.4. Cara Kerja

7.4.1. Pengambilan Bahan

Tumbuhan Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) diambil di desa Hulu

Banyu Kecamatan Loksado Kabupaten Hulu Sungai Selatan Kalimantan Selatan.

Pengambilan bahan dilakukan dengan mengambil tumbuhan secara utuh meliputi

akar, batang dan daun. Kemudian hanya mengambil daunnya sebanyak ± 5 kg.

7.4.2. Determinasi Tumbuhan Kembang Bulan

Determinasi sampel tumbuhan Kembang Bulan (Tithonia diversifolia)

dilakukan di Laboratorium Dasar Fakultas MIPA Universitas Lambung

Mangkurat.

7.4.3. Pengolahan Bahan

Daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) yang sudah diambil dicuci

terlebih dahulu untuk membersihkan daun dari kotoran yang melekat. Jika sudah

bersih dilakukan perajangan, kemudian dikeringkan di tempat yang tidak terkena

sinar matahari langsung (hanya diangin-anginkan). Sampel kering disortasi kering

dengan cara dipisahkan dari partikel asing. Sampel yang telah disortasi kering

dinamakan haksel. Haksel selanjutnya dihaluskan menjadi serbuk. Serbuk yang

terbentuk diayak dengan menggunakan ayakan 5/8 agar diperoleh serbuk homogen

yang akan digunakan pada proses ekstraksi.

7.4.4. Identifikasi Fraksi Etil Asetat Daun Kembang Bulan

9

a. Ekstraksi Daun Kembang Bulan

Ekstraksi daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) dilakukan dengan

cara soxhletasi melalui 2 tahap. Tahap pertama dengan menimbang sebanyak 50

gram serbuk daun Kembang Bulan, kemudian dimasukkan dalam wadah soxhlet

dan ditambahkan pelarut n-heksana hingga serbuk terendam. Wadah soxhlet

dihubungkan dengan kondensor. Alat dinyalakan dan diatur agar terjadi 4

sirkulasi/jam dengan suhu 70-80oC. Perendaman dilakukan selama 5 hari yang

berguna untuk menghilangkan lemak serta komponen pengganggu lain (Rohyami,

2008). Ekstrak n-heksana diambil dan residu dikeringkan, kemudian residu

diekstraksi dengan etanol 96%. Proses ekstraksi dilakukan selama 5 hari dengan 4

sirkulasi/jam pada suhu 70-80oC. Ekstrak cair yang diperoleh diuapkan hingga

diperoleh ekstrak kering daun Kembang Bulan.

b. Fraksinasi Ekstrak Daun Kembang Bulan

Ekstrak kering daun Kembang Bulan (Tithonia diversifolia) disuspensikan

dengan air, kemudian dimasukkan ke dalam corong pisah, ditambahkan pelarut

etil asetat sebanyak 50 ml, digojog perlahan sampai uapnya hilang dan didiamkan

selama 30 menit agar terjadi pemisahan. Akan terbentuk lapisan etil asetat dan

lapisan air, kemudian lapisan etil asetat dipisahkan dan ditampung di dalam

wadah. Melakukan proses fraksinasi secara berulang sampai diperoleh sejumlah

fraksi etil asetat. Fraksi etil asetat yang didapat diuapkan sampai terbentuk fraksi

kering etil asetat.

c. Identifikasi Flavonoid menggunakan Kromatografi Lapis Tipis

10

Melakukan optimasi eluen yang akan digunakan untuk mendapatkan profil

kromatogram dengan menggunakan plat KLT silika gel GF 254. Eluen yang

digunakan adalah n-butanol : asam asetat : air (9:2:6) (Rohyami, 2007).

Sebelumnya dilakukan penjenuhan eluen dengan cara memasukkan eluen

ke dalam chumber dengan ketinggian kurang dari 1 cm. Kemudian meletakkan

kertas saring ke dalam chumber, didiamkan selama kurang lebih 15 menit. Elusi

dilakukan setelah chumber KLT penuh dengan uap eluen (jenuh). Setelah itu

dilakukan penotolan bercak dengan cara menotolkan fraksi etil asetat di atas

lempeng KLT hingga terbentuk noda. Lempeng KLT tersebut dimasukkan ke

dalam chumber yang berisi eluen yang telah dijenuhkan. Lempeng KLT hasil

penotolan kemudian dikeluarkan dari chumber setelah eluen naik mendekati garis

batas atas sebesar 0,5 cm. Noda yang terbentuk diamati di bawah sinar UV dengan

panjang gelombang 254 dan 366 nm. Noda pada lempeng KLT kemudian diuapi

dengan uap ammonia (NH3) akan memberikan warna kuning sehingga noda

terlihat jelas. Noda yang terbentuk diamati kembali di bawah sinar UV dengan

panjang gelombang 254 dan 366 nm. Selain itu digunakan pereaksi sitroborat

yang akan memberikan bercak kuning berfluoresensi di bawah sinar UV 366 nm.

Hasil kromatogram didokumentasikan dan kemudian menentukan harga Rf.

7.4.5. Uji Sitotoksik

Sel MCF-7 ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh

kepadatan 5 x 103 sel/sumuran dan diinkubasi selama 48 jam untuk mendapatkan

pertumbuhan yang baik. Setelah itu medium diganti dengan yang baru kemudian

ditambahkan fraksi etil asetat pada berbagai konsentrasi dengan cosolvent DMSO

11

(Sigma) dan diinkubasi pada 37ºC dalam inkubator CO2 5% selama 48 jam. Pada

akhir inkubasi, media dan ekstrak dibuang kemudian sel dicuci dengan PBS

(Sigma). Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100μL media kultur dan

10μL MTT (Sigma) 5 mg/mL. Sel diinkubasi kembali selama 4-6 jam dalam

inkubator CO2 5%, 37ºC. Reaksi MTT dihentikan dengan HCl 4N-isopropanol

(1:100), digoyang di atas shaker selama 10 menit. Serapan dibaca dengan ELISA

reader (Bencmark Bio Rad) pada panjang gelombang 595 nm.

7.4.6. Uji kinetika proliferasi sel

Sel MCF-7 ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga diperoleh

kepadatan 5 x 103 sel/sumuran dan diinkubasi selama 48 jam. Ekstrak dengan

berbagai seri kadar ditambahkan ke dalam sumuran dan dilakukan sampling pada

jam ke-1, 6, 12, 24, 48 dan 72. Proliferasi sel diamati dengan metode MTT seperti

halnya yang dilakukan pada uji sitotoksik.

7.4.7. Analisis Data

Hasil yang diperoleh dari pengukuran serapan sampel dianalisis statistik

menggunakan SPSS 17.0. Untuk uji distribusi dan homogenitas adalah shapiro

wilk dan Levena. Jika data terdistribusi normal dan homogen dilakukan analisis

one way anova pada tingkat kepercayaan 95%. Jika terdapat perbedaan yang

signifikan dilanjutkan dengan analisis Post Hoc Tukey. Jika data tidak terdistribusi

normal atau tidak homogen maka dilakukan analisis non parametrik dengan uji

Kruskal-Wallis pada tingkat kepercayaan 95%. Jika terdapat perbedaan yang

signifikan dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney.

12

VIII JADWAL PROGRAM KEGIATAN

Penelitian ini direncanakan kurang lebih selama 4 bulan

No Jenis KegiatanBulan Ke-

1 2 3 4

1 Persiapan

a. Administrasi dan perizinan penggunaan laboratorium

b. Pengadaan bahan dan alat

2 Pelaksanaan

a. Pengambilan sampel

b. Pembuatan simplisia

c. Pembuatan fraksi

d. Pelaksanaan penelitian

3 Penyelesaian

a. Analisis data

b. Penyusunan dan penggandaan laporan

c. Seminar Hasil

13