Nora Dwi Saputri / 121810301021

Prosedur analisa N total menggunakan metode Kjeldahl

Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Prinsip kerja dari metode Kjeldahl adalah protein dan komponen organik dalam sampel didestruksi dengan menggunakan asam sulfat dan katalis. Hasil destruksi dinetralkan dengan menggunakan larutan alkali dan melalui destilasi. Destilat ditampung dalam larutan asam borat atau larutan asam klorida. Selanjutnya destilat yang terbentuk dititrasi dengan menggunakan larutan HCl atau larutan NaOH.Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro. Cara makro Kjeldahl digunakan untuk sampel yang sukar dihomogenisasi dan besar sampel 1-3 g, sedang semimikro Kjeldahl dirancang untuk sampel ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen.Analisa protein menggunakan metode Kjeldahl dibagi menjadi tiga tahapan yaitu:

Tahap pertama yaitu destruksi merupakan tahap dekomposisi nitrogen dalam sampel menggunakan asam pekat. Tahap ini disempurnakan dengan mendidihkan sampel pada asam sulfat pekat. Hasil akhir destruksi merupakan larutan amonium sulfat. Sebelum memulai tahap destruksi, sampel terlebih dahulu ditimbang sebanyak 0,5 - 1 gram dan dihaluskan untuk kemudian dimasukkan kedalam labu kjedahl 500 mL. Selanjutnya ditambahkan 7,5 gram kalium sulfat (K2SO4.) dan 0,35 g raksa (II) oksida (HgO) kedalam labu kjedahl untuk memulai tahap destruksi. Penambahan K2SO4 berfungsi sebagai katalisator yang dapat meningkatkan titik didih. Satu gram K2SO4 dapat meningkatkan titik didih hingga 30C (Sudarmadji dkk., 1996). Peningkatan titik didih akan mengefektifkan reaksi antara asam sulfat dengan sampel (destruksi berjalan efektif). Hal tersebut disebabkan oleh lamanya waktu yang dibutuhkan oleh asam sulfat untuk menguap (semakin tinggi titik didih, maka waktu yang dibutuhkan asam sulfat untuk menguap akan semakin lama).Setelah itu, ditambahkan H2SO4 sebanyak 15 mL dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan diteruskan pemanasan sampai mendidih sehingga cairan menjadi jernih. Kemudian dilanjutkan dengan pemanasan kurang lebih 30 menit. Pada tahapan ini sampel yang dipanaskan dalam asam sulfat pekat akan mangalami destruksi menjadi unsur-unsurnya. Destruksi sampel bertujuan untuk mempercepat reaksi dan hidrolisis protein menjadi unsur C, H, O, N, S dan P. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Adapun persamaan reaksinya adalah sebagai berikut:HgO + H2SO4 HgSO4 + H2Hg2SO4 + 2 H2SO42 HgSO4 + 2 H2O + SO2(CHON) + On + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4Selain penambahan katalisator K2SO4 maupun CuSO4 yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium berfungsi untuk mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya. Sampel yang sudah didestruksi, akan dibiarkan sampai dingin yang kemudian akan dilanjutkan dengan proses destilasi. Destilasi merupakan suatu proses memisahkan cairan maupun larutan yang berdasarkan pada perbedaan titik didih. Sebelumnya, sampel hasil destruksi ditambahkan dengan 100 mL aquades dalam labu Kjeldahl agar endapan dapat larut. Kemudian ditambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida (NaOH) 50% sebanyak 75 mL yang telah didinginkan dalam lemari es untuk mempercepat pelepasan ammonia dengan cara menciptakan suasana basa (reaksi tidak dapat berlangsung dalam kondisi asam). Selanjutnya campuran dipanaskan kedalam labu Kjeldahl yang sudah dipasang pada alat destilasi perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur kemudian dipanaskan dengan cepat sampai mendidih. Agar selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Tujuan dari proses destilasi adalah memisahkan zat yang akan dianalisa dengan cara memecah ammonium sulfat menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH. Adapun persamaan reaksinya sebagai berikut: ( NH4)2SO4 + 2NaOH2NH3 + Na2SO4 + 2H2ONH3 dihasilkan dalam destilat berupa gas. Gas ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh larutan baku asam klorida (HCl) 0,1 N sebanyak 50 mL atau asam borat (H3BO3) 3% sebanyak 15 mL yang telah diisi ke dalam erlenmeyer sebagai tempat destilat. Selain itu ditambah kedalam destilat indikator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes. Adapun persamaan reaksi untuk larutan baku yang menggunakan asam borat (H3BO3) 3% sebagai berikut:4NH3 + 2H3BO32(NH4)2BO3 +H2Sedangkan persamaan reaksi untuk larutan baku yang menggunakan asam klorida (HCl) 0,1 N sebagai berikut:2NH3 + 2H2SO4 (NH4)2SO4 + H2SO4Asam klorida atau asam borat yang digunakan untuk destilasi dalam jumlah berlebihan, agar kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP.Tahapan terakhir dalam proses analisis n total yaitu titrasi. Apabila penampung destilat digunakan asam klorida maka sisa asam klorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP. Persamaan reaksinya yaitu:(NH4)2SO4 + H2SO4 + 2NaOH > (Na)2SO4 + (NH4)2SO4 + 2H2OSetelah melakukan titrasi, dapat diketahui kadar proteinnya yang tertuang dalam bentuk persen kadar nitrogen. Berikut adalah rumus kadar nitrogen :%N = N. NaOH 14,008 100%Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam klorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda.NH4H2BO3 + H2SO4 > (NH4)2SO4 + 2H3BO3Setelah melakukan titrasi, dapat diketahui kadar proteinnya yang tertuang dalam bentuk persen kadar nitrogen. Berikut adalah rumus kadar nitrogen :%N = N.HCl 14,008 100 %Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.

Prosedur analisa N totalTahap 1 Destruksi Sampel larutan berprotein

Ditimbang sebanyak 0,5 - 1 gram dan dihaluskan Dimasukkan ke dalam labu kjeldahl Ditambahkan 0,35 gram raksa (II) oksida (HgO) dan 7,5 gram kalium sulfat (K2SO4) Ditambahkan 15 mL H2SO4 Dipanaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap Diteruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan menjadi jernih Ditambahkan pemanasan kurang lebih 30 menit kemudian dimatikan pemanasan Didinginkan sampel kemudian dilanjutkan dengan proses destilasi.Hasil

Tahap 2 DestilasiSampel hasil destruksi

Ditambah 100 mL aquades dalam labu Kjeldahl Ditambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida (NaOH) 50% sebanyak 75 mL yang telah didinginkan dalam lemari es untuk membuat larutan bersifat basa kuat Ditambah beberapa lempeng zink (Zn) agar selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan Dipanaskan kedalam labu Kjeldahl yang sudah dipasang pada alat destilasi perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur kemudian dipanaskan dengan cepat sampai mendidih. Destilat ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida (HCl) 0,1 N sebanyak 50 mL atau asam borat (H3BO3) 3% sebanyak 15 mL Ditambah kedalam destilat indikator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes Dipastikan ujung pipa kaca destilator masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N atau atau asam borat (H3BO3) 3% Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 mL. Dilakukan uji lakmus terhadap sampelHasil

Tahap 3 Titrasi Proses titrasi dibagi menjadi 2 yaitu titrasi balik (apabila penampung destilat digunakan asam klorida) dan titrasi langsung (apabila penampung destilat digunakan asam borat).a. Titrasi balikSisa HCl 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat

Dititrasi dengan NaOH 0,1N Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP Dihitung kadar nitrogenHasil

b. Titrasi langsungH3BO3 3% yang bereaksi dengan destilat

Dititrasi dengan HCl 0,1N Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda bila menggunakan indikator BCG + MR Dihitung kadar nitrogenHasil