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Parte IV

Mg. Sc. Alberto Huamani 2

1. Introducción

2. Determinación de proteínas por análisis elemental� Mineralización� Determinación de nitrógeno en forma de NH4 + o NH3� Otros métodos

3. Determinación de proteínas por métodos químicos� Método de Biuret� Método de Lowry� Método de fijación de colorantes

4. Determinación de proteínas por métodos instrumentales

5. Determinación de sustancias nitrogenadas no proteicas

Contenido

1. INTRODUCCIÓN

�Alimentos ………………..punto de vista nutricional : proteínas�El término prótidos incluye:

ProteínasPéptidosAminoácidos

�ImportanciaNutricional (aminoácidos esenciales)Propiedades organolépticas y de textura en productosagroalimentarios y de origen animalControl de calidad: alergías a ciertas proteínas(gluten)

�Punto de vista de análisis de alimentos evaluación delcontenido total de proteínas = principal interés�La mayor parte de los procedimientos de determinación deproteína total se basan en la determinación del nitrógeno +procedimientos de cálculo empíricos aproximados.

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PEPTIDOS Y PROTEINAS

• Péptido: hasta 50 aminoácidos.

• Oligopéptido: péptido pequeño.

• Polipéptido: péptido grande.

• Proteínas oligoméricas: formadas por subunidades idénticas llamadas protómeros.

• Proteínas sencillas y conjugadas (grupoprostético)

CONTENIDO EN PROTEÍNAS EN ALIMENTOS SELECCIONADOS.

ORIGEN ANIMAL PROTEÍNAS

Ternera seca 81-90

Ternera asada 72

Huevos 35-70

Leche descremada 34-38

Leche entera 22-25

ORIGEN VEGETAL PROTEÍNAS

Soja 33-42

Guisantes 22-28

Frutos secos 15-28

Trigo, harina 10-14

Patata 10-13

Arroz 5-9

Maíz 0-9 5

EsencialesValLeuIleThrPheMetTrpLys

Quirales

Apolares

Polares

ÁcidosBásicos

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PROTEINA

Secuencia de aminoácidos en la insulina de vaca

2. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR ANÁLISIS ELEMENTAL (N)

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� Mineralización (método Kjeldahl)

� Método Nessler : Determinación de nitrógeno en

forma de NH4+ ó NH3

� Método Dumas; Electrodos selectivos sensibles a

NH

� Otros métodos (neutrónica y protónica)

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# Los métodos se basan en medidas de la cantidad de nitrógenoliberado por las proteínas:

� El método Kjeldahl� Reactivo de Nessler� Método Dumas

# Las proteínas contienen una cantidad de nitrógeno que sepuede relacionar con la cantidad de proteína por unos factoresde conversión:

� 5.7 para ciertas proteínas vegetales� 6.25 para el resto� Por lo tanto, en las proteínas, por término medio, debe

haber un 16% de nitrógeno (100/16 = 6.25)� La AOAC recomienda el uso del factor 6.25 para todas

las muestras excepto harina y derivados

Alanina, 15.7%NGlicina, 18.6%N

16%Triptofano, 13.7%NHistidina, 26.7%N

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� El contenido de nitrógeno se determina después demineralización o pirólisis de la muestra.

� El método de mineralización fue introducido porKjeldahl (1883) y es el más generalizado yutilizado en métodos de referencia y oficiales.

� Problema: presencia en las muestras de nitrógenono proteico.

� Normalmente, se convierte el amonio formado enamoníaco a pH básico, y se destila recogiéndolosobre un exceso medido de HCl.

2.1 Mineralización (método Kjeldahl)

El fundamento de la etapa de mineralización es la conversión de lamateria orgánica proteica en ión amonio según la reacción:

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El nitrógeno transformado en NH3 se combina con laparte restante del ácido sulfúrico para formar elsulfato de amonio.

322242 2 NHOHSOCOSOHMuestra RCATALIZADO

a) DIGESTION

Este método se basa en la combustión en húmedo de la muestrapor ebullición con ácido sulfúrico concentrado y en presencia decatalizadores metálicos, la materia orgánica se oxida a CO2 y H2O,mientras que la parte de ácido se reduce a SO2

1) DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNA TOTAL ( Kjeldahl)

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Finalmente queda:

244423 )(NHSOSOHNH

2424242 )( SOSONHCOSOHMuestra RCATALIZADO

El nitrógeno transformado en NH3 se combina con la parterestante del ácido sulfúrico para formar el sulfato de amonio

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Digestor DestiladorRecipiente

de soda

Bomba de succión

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b) DESTILACION

El nitrógeno que está en forma de sulfato de amonio, seataca con un álcali fuerte que es la soda caústica(NaOH) para liberar el amoniaco y después de lacondensación lograda con la parte del refrigerante, elhidrato de amonio se recibe en un vaso precipitado.

OH2SONaNH2NaOH2NHSO 2423244 )(

El vaso de precipitado contiene: ácido bórico, con lossiguientes indicadores (Tashiro) de pH rojo de metiloy verde de bromocresol, formándose borato de amonioen el vaso.

En el destilador

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En el condensador

NaOHNHSO 2)( 244

324 )( BOHNH

3NH

3NH

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c) TITULACIONSe hace con ácido sulfúrico ó clorhídrico de normalidad conocida,el ácido clorhídrico reacciona con el borato de amonio. En elpunto final ya no hay borato de amonio y un pequeño exceso deácido clorhídrico provocará un cambio de pH y por consiguiente elviraje de la mezcla (verde a rosado)

ClNH OH NH 433324 BHClBOH

3.1. Materiales

Balanza analíticaBalón de Kjeldahl de 250 mL.Calefactor eléctrico. Para efectuar la digestión.Equipo de destilación.Acido sulfúrico (d:1.84) Exento de nitrógenoSulfato de cobre.Sulfato de sodio anhidro.MorteroTamiz

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2 Preparación de los reactivosMezcla catalizadora: Se usa SO4Cu y el SO4K2 en la siguiente relación (SO4Cu: 0.25 g; y el SO4K2: 1.0 g) ambos previamente triturados mediante un mortero.Solución 0,05 N de ácido clorhídrico o sulfúrico. Diluir 8.5 mL de HCl

concentrado en un volumen de 2 Lt., posteriormente estandarizar con carbonato de sodio previamente secado.Solución de hidróxido de sodio 0,1 N.- La normalidad debe controlarse

periódicamente.Solución de hidróxido de sodio al 80% (p/v): se pesa 80 g de hidróxido de

sodio (NaOH), en un volumen de 100 mL de agua destilada fría por separados. Cuidado que produce una reacción exotérmica (produce calor violento). Hacer esto en una campana de extracción y enfriarla con hielo en una cubeta y almacenarla en un frasco de polietileno.

Indicador: “solución mixta” para 250 mLAcido bórico al 4%: pesar 40 g de ácido bórico en fiola de 1 litro + verde de bromocresol al 1 %: medir 20 mL y añadir a la fiola + rojo de metilo al 0.1 %: medir 8 mL y añadir a la fiola.

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ProcedimientoDigestiónDe acuerdo al contenido de nitrógeno, se pesa una porción de la muestrapreparada que contenga 0.2 - 0,3 g de muestra, luego agregar 1 g delcatalizador de oxidación (mezcla de sulfato de potasio: 1g y sulfato decobre:0,25g) para acelerar la reacción agregar 2.5 a 3.0 mL de ácido sulfúricoconcentrado.Destilación1. Enfriar al aire, agregar 5 mL de agua destilada.2.3. Pasar el contenido del balón digestor al destilador y haciendo un lavado al

balón con 5 a 10 mL de agua y luego agregar 5 mL de la solución de NaOH al 80% con sumo cuidado y cerrar la válvula (en copa debe quedar una pequeña cantidad de NaOH ).

4.5. Conectar el refrigerante y recibir el destilado en un erlemeyer de 125 mL

conteniendo 5 mL de la mezcla de ácido bórico más indicador de pH. La destilación termina cuando ya no pasa más amoniaco y luego de 7 min titular con ácido clorhídrico valorado (aprox 0.05N) y anotar el gasto.

NOTA: En destilación tomar tiempo cuando empieza a virar de rojo a verde7 minutos y termina la destilación.

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Titulación

La muestra recibida en el vaso con la solución de ácido bórico valorar con ácido clorhídrico 0.05N y tomar nota del gasto de HCl obtenido.

Cálculos

%N2 = mL de HCl x Normalidad x meq.del N2 x100 / g (muestra)

%N2 = mL de HCl x 0,05 x 0,014 x100 / g (muestra)

% Proteína bruta = %N2 x Factor

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2.2 METODO NESSLER : determinación del N2 en forma deNH4

+ ó NH3

2.2.1 Reactivo de Nessler

� Basado en medidas colorimétricas sobre la propiamuestra mineralizada

� Genera en presencia de NH4+ (NH3 en medio básico)

un complejo de color entre amarillo y rojo:

OHKIHgOINHKOHHgIKNH 22423 27232

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mg de NH3/100 g de pescado

Especie Fresco

Menos fresco Alterado

Cuplea spratus (lacha) 25 35 240

Engraulis enchrasicholus(boquerón)

20 27 230

Mugil cefalus (lisa) 20 30 215

Mullus barbatus (salmonete) 20 32 235

Scomber scombrus (caballa) 17 33 220

Trachurus trachurus (jurel) 15 25 190

Boops boops (boga) 20 30 225

Gobius paganellus (gobio) 20 25 220

Solea solea (lenguado) 16 30 185

Merluccius merluccius (merluza) 20 20 220

Raja clavata (raya) 30 35 240

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2.2.2 Electrodos selectivos sensibles a NH

Un electrodo que contiene NH4+ y una membrana

permeable a NH3, que la atraviesa y desplaza elequilibrio:

Cuando se alcanza el equilibrio dentro del electrodo, el potencialde éste es proporcional a la concentración de amoníaco en ladisolución de muestra

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OHNHOHNH 424

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Nitrógeno básico volátil- Índice de putrefacción:Aplicación: carne vacuna, pescado

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Fundamento: El pH de músculo de pescado fresco estáentre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el momento de la muerte).Después de muerto se acumula ácido láctico, provocandocaída de pH, pero como en el músculo hay compuestoscon carácter buffer, no permiten que se vea ese descenso.

Por descomposición del músculo se acumulan amoníaco,dimetilamina y trimetilamina. Si en ese momento seproduce contaminación bacteriana, entonces comenzará asubir el pH (primero lentamente y rápido al final), encondiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0.Ocurre un proceso de autolisis que lleva al aminoácido:

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Hay acción sobre el óxido de trimetilamina que existeen algunos peces de agua salada. El láctico en elmúsculo es reductor y actúa sobre el O=N(CH3)3

(precursor).

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� Se basa en la calcinación de la muestra en presencia de oxido decobre, se eliminan posteriormente todos los gases (CO2 y H2O)excepto el nitrógeno (N2) que se mide de forma volumétrica.

� Aplicaciones: como método micro con sistemas que permitenanalizar hasta muestras de 1g en tiempos de análisis cortos (unos5 minutos por muestra).

� Ventajas:o + rápido que Kjeldahl, sin reactivos tóxicos, automatización,

simple.o Tiempo de análisis de unos 4 minutos/muestra.o Resultados comparables a los del Kjeldahl.

� Inconvenientes: coste inicial alto, problemas conrepresentatividad de la muestra

2.2.3 Método de Dumas por pirólisis

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Basados en activación (neutrónica y protónica) yposterior medida de la radiación emitida

� Desarrollos con gran originalidad para ladeterminación de nitrógeno en proteínas:

Son rápidos (unos segundos)SimplesAutomatizadosCoste por muestra bajoEquipamientos muy costosos

2.2.4 OTROS MÉTODOS

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Activación neutrónica:Medida de la radiación gamma emitida cuando elnitrógeno 15 generado vuelve a su estado fundamental

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Activación protónica:

nOHN 14114

� La medida de la radiación gamma liberada por el 140 esproporcional a la cantidad de nitrógeno.

� La medida es muy selectiva al utilizar una energíacaracterística (2.31 MeV)

� Las dos técnicas de activación presentan resultadossemejantes y comparables a Kjeldahl, con mucha rapidez(hasta 10 muestras por minuto).

NO 1414

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� Procedimientos basados en el uso de propiedadesfísicas o químicas de las proteínas

� Problemas:� Interferencias al utilizar propiedades que no sonespecíficas de las proteínas�Las respuestas varían de una proteína a otra

� Etapas previas en los procedimientos químicos:

� Tratamiento de la muestra para solubilizar lasproteínas con una base, p.ej. disolución de KOH(no en muestras líquidas o disoluciones.

� Separación por precipitación (con ácidotrifluoracético o sulfosalicílico,...) ycentrifugación o filtración

� Procedimientos basados en el uso de propiedadesfísicas o químicas de las proteínas

� Problemas:� Interferencias al utilizar propiedades que no sonespecíficas de las proteínas�Las respuestas varían de una proteína a otra

� Etapas previas en los procedimientos químicos:

� Tratamiento de la muestra para solubilizar lasproteínas con una base, p.ej. disolución de KOH(no en muestras líquidas o disoluciones.

� Separación por precipitación (con ácidotrifluoracético o sulfosalicílico,...) ycentrifugación o filtración

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3. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PORMÉTODOS QUÍMICOS

� Método de Biuret

� Método de Lowry

� Método de fijación de colorantes

Colorimetrico

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TITULACION CON FORMOL

Cuando se adiciona formalina a una soluciónacuosa neutralizada, que contiene proteínas, elgrupo –NH2 reacciona para formar el grupometilenoimino –N=CH2 con la liberación de unprotón que puede titularse.

+ -N=CH2

3535

El procedimiento ha sido descrito por Taylor (1957) yse ha usado para la determinación de sólidos de leche enlos helados de crema (Crowhurst, 1956) y con unamodificación potenciométrica por Hill y Stone (1964).

Roeper (1974) ha utilizado la titulación con formol parala estimación del nitrógeno proteínico y de la caseína enla leche descremada.

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Caseína1. Colocar 10 mL de leche (a 17 –18 ºC). en un vaso de

precipitado de 100mL 2. Agregar 1 mL de solución de fenolftaleina. Al 0.5%3. Mezclar y reposar algunos minutos.4. Neutralizar con soda 0,1 N. (hasta el primer tono

rosado)5. Agregar 2 ml de formalina al 40%.6. Reposar algunos minutos.7. Titular con soda 0,1 N y únicamente el gasto de esta

segunda neutralización. Gasto(a).Blanco1. En un vaso colocar 2 ml de formalina2. Agregar 10 ml de agua3. titular con NaOH 0.1 N (gasto b)

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Cálculo:% proteína = 1.95 x(a-b)% sin el uso de oxalato% proteína = 1.7 x(a-b)% con el uso de oxalato

NOTA: para evitar la acción de las sales solublescálcicas, algunos autores le agregan 0,4 mL de unasolución saturada de oxalato de potasio por cada 10 mLde leche.

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� Basado en la reacción entre los enlaces peptídicos ydisoluciones alcalinas de Cu(II), dando un complejode coloración púrpura.

� Procedimiento:� Rápido�Simple� Económico�“Específico” de proteínas: la reacción la dan losenlaces peptídicos

3.1 MÉTODO DE BIURET

coloración púrpura

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� No es un procedimiento absoluto: es necesario haceruna calibración para cuantificar:

� Con patrones (normalmente BSA, Bovine SerumAlbumine)

� Por comparación con procedimientos de referencia,Kjeldhal.

� Longitud de onda de medida: entre 540 y 650 nm,según las proteínas presentes (habitualmente a 550nm)

� Reactivos de Biuret

• Mucha variedad disponible• Disoluciones de Cu(II) en medio alcalino con adición de

un complejante como tartrato para evitar laprecipitación.

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3.1 b) Proteína total (Biuret, Bradford).

� La cuantificación de una proteína requiere un ensayobiológico específico que permita medir su actividad(ej: ensayo de la actividad de un enzima).

� Parámetros más utilizados:

ACTIVIDAD: unidades totales de la proteína(definir 1 U)

ACTIVIDAD ESPECIFICA: nº unidades de laproteína/mg de proteína total.

� A lo largo del proceso de purificación va disminuyendola actividad total y aumentando la actividadespecífica.

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3.2 MÉTODO DE LOWRY (1951, J. Biol. Chem., 193, 265-275)

� Uno de los más conocidos y utilizados para la determinación deproteínas en alimentos (y otras muestras biológicas)

� Basado en la interacción de las proteínas con el reactivo deFolin (tungstato, molibdato y fosfato) en medio alcalino (pH 10-10.5) y con Cu (II)

� Reacción debida principalmente a la presencia de aminoácidosfácilmente oxidables como la tirosina, cisteína y triptófano.

� Reacción entre el enlace peptídico y el cobre (como Biuret) ydespués una oxidación con el reactivo de Folin por parte delgrupo fenol, tiol,... y el fosfomolibdato: color azul (500-750 nm)

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Método con muy alta sensibilidad (hasta 100 vecesmás sensible que el método de Biuret) y una relativaespecificidad: pocas interferencias importantes

Procedimiento empírico: intensidad de color varía conlos aminoácidos presentes y condiciones analíticas(tiempo de incubación, pH,...).

Inconvenientes: método destructivo, largo y querequiere la incubación de la muestra entre la adiciónde los diferentes reactivos.

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MÉTODO DE LOWRYEquipmentIn addition to standard liquid handling supplies a spectrophotometer with infraredlamp and filter is required. Glass or polystyrene (cheap) cuvettes may be used.Reagents1. Reagent A consists of 2 gm sodium potassium tartrate x 4 H20, 100 gm sodiumcarbonate, 500 ml 1N NaOH, H20 to one liter (that is, 7mM Na-K tartrate, 0.81Msodium carbonate, 0.5N NaOH final concentration). Keeps 2 to 3 months.2. Reagent B consists of 2 gm 2 gm sodium potassium tartrate x 4 H20, 1 gm coppersulfate (CuSO4 x 5H20), 90 ml H20, 10 ml 1N NaOH (final concentrations 70 mMNa-K tartrate, 40 mM copper sulfate). Keeps 2 to 3 months.3. Reagent C consists of 1 vol Folin-Ciocalteau reagent diluted with 15 vols water.Assay1. Prepare a series of dilutions of 0.3 mg/ml bovine serum albumin in the samebuffer containing the unknowns, to give concentrations of 30 to 150 micrograms/ml(0.03 to 0.15 mg/ml).2. Add 1.0 ml each dilution of standard, protein-containing unknown, or buffer (forthe reference) to 0.90 ml reagent A in separate test tubes and mix.3. Incubate the tubes 10 min in a 50 degrees C bath, then cool to room temperature.4. Add 0.1 ml reagent B to each tube, mix, incubate 10 min at room temperature.5. Rapidly add 3 ml reagent C to each tube, mix, incubate 10 min in the 50 degreebath, and cool to room temperature. Final assay volume is 5 ml.6. Measure absorbance at 650 nm in 1 cm cuvettes.

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Fundamento: formación de un precipitado (par iónico insoluble) entrela proteína y ciertas moléculas orgánicas coloreadas (colorantesorgánicos)

Separar el precipitado del sobrenadante por centrifugación o filtración ypor comparación entre la absorvancia inicial de la disolución de colorantey la absorvancia del sobrenadante, determinar la concentración decolorante precipitado y relacionarlo con proteínas.

Colorantes ácidos (por ejemplo con grupos sulfónicos) que reaccionan conlos grupos básicos de las proteínas a pH bajo (~ 2) ya que se encuentranprotonados.

Procedimientos totalmente empíricos. Definir y controlar rigurosamentelas condiciones experimentales para garantizar la calidad de losresultados

Principal ventaja: rapidez, con equipos comerciales a 100 muestras porhora, sin necesidad de manipulación experta ni uso de reactivosaltamente corrosivos

3.3 MÉTODO DE FIJACIÓN DE COLORANTE

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Colorantes:

Orange G

Cochineal red(rojo cochinilla)

Amido black

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Método de Bradford,

� Coomasie Brilliant Blue G-250 (comercial desde1980) reactivo absorbe a 465nm, pero cuando seadsorbe sobre la arginina de las proteínas cambia sumáximo de absorción a 595 nm.

� Tres veces más sensible que Amido Black. Menosinterferencias que Lowry. Se trabaja en disolución(no hay que precipitar)

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4. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS PORANÁLISIS INSTRUMENTAL

TÉCNICA CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO

Espe

ctro

foto

met

ria

UV

� Proteínas: absorción en el UV entre 190 y 290 nm� Medida de la absorción a 280 nm (evitar problemas instrumentales a

longitudes de onda más bajas, 200-215 nm muy sensible)� Absorción debida fundamentalmente a: tirosina, triptófano y

fenilalanina, que se encuentran en cantidades semejantes en lasproteínas

� Técnica muy utilizada en bioquímica y en control de fraccionamientode proteínas por LC

� Método simple, rápido y no destructivo

Fluorescencia UV

� Emisión de radiación a 340 nm después de excitación a 275-280 nm (Triptófano)

� Aplicar directamente sobre suspensiones � Rápido y no destructivo

Turbidimetria, nefelometria

� Suspensiones de proteínas con los precipitantes habituales de proteínas (ácido tricloroacètico, ferricianuro o ácido sulfosalicílico

� Los resultados dependen mucho de la reproducibilidad de las condiciones experimentales

Electrodos específicos de proteínas · Un electrodo específico con una membrana de Ag2S mide el contenido

en proteínas con grupos SH en medio alcalino 4848

METODO DE INFARROJO

La radiación infrarroja es la base del amplio usode un rápido equipo automático particularmentepara leche y para granos.

Las series IRMA de NEI Electronics sonabsorciómetros de doble rayo, diseñados para ladeterminación simultánea de proteínas, lactosay grasa en la leche.

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También se dispone de los instrumentos Milko-Scan deFoss.

La reflectancia en el infrarrojo cercano es el desarrollomás moderno para el análisis de cereales molidos y otrosalimentos sólidos. Tanto en Rank Neotec GQA como elTechnicon InfraAlyzer pueden estimar proteínas, aceitey humedad en tan solo unos pocos minutos. Losinstrumentos son calibrados con muestras decomposición conocida. Williams ha realizado unaevaluación de ellos (1975).

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Determinación de la masa de una proteína porespectrometría de masas

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Resultado de una espectrometría de masas

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5. DETERMINACIÓN DE SUSTÁNCIASNITROGENADAS NO PROTEICAS

Interés en la determinación de las sustanciasnitrogenadas presentes en los alimentos diferentes delas proteínas

Este grupo incluye:AminoácidosAminas (heterocíclicas)NitrosaminesDerivados inorgánicos (NH4+, NO3- y NO2-)

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� Contribuir al valor nutricional de los alimentos, etc... (aminoácidos)

� Relacionadas con procesos que pueden modificar la calidad(degradación,...)

� Compuestos tóxicos: N-nitrosamines, Aminas AromáticasHeterocíclicas (HAAs) o Acrilamida con actividad tóxica, mutagénica ocarcinogénica

� Derivados inorgánicos del nitrógeno: amoníaco, nitrato y nitrito

� Primera etapa: eliminar las proteínas de las muestras (o extractos demuestra):

Precipitación (con agentes precipitantes de proteínas como TFA)Dialisis (muy adecuada para obtener muestras representativas de N no proteico)Ultracentrifugación (sedimentar las proteínas)

� Los extractos libres de proteínas se pueden analizar para determinar los compuestos nitrogenados no proteicos

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Nitrosaminas (cancerígenas)

Nitrito + aminas

Nitrato Proteínas

AminasHeterocíclicasAromáticas

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DETERMINACIÓN DE SUSTÁNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

AcrilamidaFormación en frituras, tostados (mg/kg)

Patata fritas Café

Azúcaresreductores

Tº 175-200ºCAcrilamidaMW 71

CH2 = CH – C - NH2IIO

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Determinación de la masa molecular de una proteína porelectroforesis en poliacrilamida-SDS

Patrones