proteínas - parte 2.pdf

7/26/2019 Protenas - Parte 2.pdf

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EXTRACCIN,

CUANTIFICACIN EIDENTIFICACIN DEPROTENAS

GENTICA MOLECULAR 2016 UNIVERSIDAD DE MORN


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Ciencia dedicada al estudio de la expresin de las

protenas y de sus cambios en dependencia del

contexto biolgico

Proteoma:

conjunto de protenas expresadas por un organismo (o

por una parte de l, por ejemplo un tipo de tejido) en

un momento dado. 2

PROTEMICA


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Aplicaciones:

1. Caracterizacin del proteoma de un organismo (identificacin delmayor nmero de protenas expresadas por un organismo en una

condicin biolgica particular).

2. Protemica comparativa (evaluar los cambios en la expresin deprotenas de un organismo sometido a dos o varias condicionesbiolgicas diferentes).

3. Interaccin de protenas entre s y con otras molculas (aislamiento decomplejos de protenas y posterior identificacin de las protenascomponentes; establecimiento de mapas de interaccin yesclarecimiento del mecanismo de determinadas funciones biolgicas

)

.

PROTEMICA


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Las protenas son las molculas orgnicas ms abundantes en la clula,constituyendo ms del 50% del peso seco de la clula.

Una clula de un organismo superior contiene en un instante de tiempo

millones de molculas de protenas, correspondientes a unas 5000especies diferentes de ARNm en promedio.

4000 de ellas existen en un nmero muy bajo de copias (una o dosmolculas por clula) y dan lugar a protenas poco abundantes o muyescasas.

Se estima que una secuencia de aminocidos puede dar lugar a unas 20variantes moleculares o especies, con lo cual 5000 ARNm diferentesseran responsables por unas 100000 especies moleculares diversas a nivelde protenas.

PROTEMICA


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PROTEMICA

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Luego de ser sintetizadas por la clula, las protenas pueden tener distinta

solubilidad en el medio:

- una protena rica en aminocidos polares es en general ms soluble que

una rica en aminocidos hidrofbicos;

- las protenas fibrosas (alfa-queratina, colgeno) son en general menos

solubles que las globulares;

- los principales factores del entorno de la protena que pueden afectar su

solubilidad son la temperatura, la constante dielctrica del medio y el pH

del mismo y la fuerza inica.


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CUERPOS DE INCLUSIN

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Agregacin proteica: fenmeno que aparece frente a una situacin deestrs celular, tal como el que se da cuando las clulas son forzadas a

producir una protena fornea en concentraciones elevadas (conpromotores fuertes).

Debido a que los chaperones celulares que se encargan de ayudar a lasprotenas a adoptar su forma nativa se encuentran en cantidad limitanterespecto de la cantidad de protena sintetizada, las protenas que se vanproduciendo se pliegan en forma incompleta y se acumulan en forma de

agregados insolubles denominados cuerpos de inclusin.

Los mismos han sido descriptos como agregados proteicos densos,refrctiles, resistentes a algunos detergentes, cilndricos y de medida

variable, y que contienen protena activa y funcional.


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EXTRACCIN DE PROTENAS

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La extraccin de protenas comienza siempre con una ruptura celular o lisis:

rganos u otros tejidos animales: es necesario disgregarlos antes de

proceder a la lisis celular, ya que las clulas se encuentran rodeadas de

tejido conectivo. En general se utilizan enzimas como la colagenasa y/o

una ruptura mecnica grosera con morteros, homogeneizadores elctricos,

tijeras o tamices metlicos.

Cultivo celular: la extraccin puede realizarse adicionando un detergente,

realizando un shock osmtico o por sonicacin.


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a) Mtodos fsico-mecnicos: agitacin con abrasivos, homogeneizacin

a alta presin o extrusin por presin;

b) Mtodos fsicos no mecnicos: shock osmtico, ciclos de congelacin-

descongelacin, sonicacin o secado;

c) Mtodos qumicos: tratamiento con lcali, solventes, detergentes,

cidos o sustancias caotrpicas.


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Destruccin fsica mcanica: homogeneizacin: hacer pasar las clulas entre un tubo y un pistn de vidrio que ajustan

casi totalmente. moler en un mortero con arena. molino con perlas de vidrio.

prensa de French, que hace pasar las clulas a gran velocidad a travs de un pequeoorificio.

Destruccin fsica no mcanica: sonicacin: someter las clulas a vibraciones de ultrasonido. congelacin-descongelacin: la rotura se produce al someter las clulas a un cambio

brusco de temperatura, congelando primero a -196 C (con nitrgeno lquido) ypasndolas rpidamente a temperatura ambiente (25 C).

lisis celular: para clulas sin pared celular como las de tejidos animales (para clulasvegetales o bacterias no es suficiente) se suspenden las clulas en una solucinhipotnica y debido a la diferencia osmtica el agua difunde al interior de la clula,causando su hinchamiento y rotura.


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Durante el proceso de rotura, se

utilizan buffers de extraccin para

solubilizar las protenas, quepueden ser disoluciones acuosas

de buffers especficos para

protenas solubles o bien que

adems contengan detergentes si

se pretende purificar protenasasociadas a membranas.

PRENSA

FRENCH


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FRACCIONAMIENTO DEL

EXTRACTO CRUDO

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Centrifugacin diferencial para obtener fracciones subcelulares o para

aislar organelas especficas


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FRACCIONAMIENTO DEL

EXTRACTO CRUDO

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MTODOSCROMATOGRFICOS PARASEPARACIN DE PROTENAS

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Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de carga,

tamao o afinidad de las diferentes protenas.

Filtracin o exclusin molecular

Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa hidrofbica Cromatografa de afinidad

FPLC (cromatografa lquida de separacin rpida de protenas)


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FILTRACIN EN GEL O

CROMATOGRAFA DE

EXCLUSIN

MOLECULAR

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CROMATOGRAFA DEINTERCAMBIO INICO


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MTODOS DE CUANTIFICACIN

DE PROTENAS

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Absorcin a 280 nm: es proporcional a la concentracin de la protena.

Ensayos colorimtricos: el cambio de color en la solucin es cuantificado

mediante absorbancia. Son ms sensibles que la cuantificacin directa a

280 nm, pero involucran la adicin de una sustancia qumica que es

capaz de reaccionar con determinados residuos aminoacdicos.

Anlisis de resultados: se interpolan las mediciones a una curva de

calibracin construida con una protena estndar de concentracin

conocida como la albmina srica bovina (BSA).


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DE PROTENAS

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DE PROTENAS

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Ensayo de Bradford (595nm)

Es uno de los ms sensibles, rpido y muy sencillo y adems no presenta

interferencia con sustancias reductoras como el DTT y el -mercaptoetanol,que s interfieren con los ensayos de Lowry y BCA.

Desventaja: altamente sensible a detergentes y lpidos.


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MTODOS

ELECTROFORTICOS

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PAGE nativa

SDS-PAGE

SDS-PAGE +condiciones reductoras

Isoelectroenfoque

Electroforesis

bidimensional


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MTODOS

ELECTROFORTICOS

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Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de lasprotenas es un campo elctrico, y el gel acta como filtro

molecular, ralentizando la migracin de las protenas en funcin de

su relacin carga/masa.


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PAGE NATIVA VS. SDS-PAGE

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Electroforesis en condiciones nativas: las protenas se separan en funcin

de su carga/masa.

En condiciones desnaturalizantes la electroforesis se realiza en presencia

de un detergente aninico, el SDS (dodecilsulfato sdico), que se une a

todas las protenas en la misma proporcin formando una especie de

micela cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS

enmascara la carga intrnseca de las protenas, con lo que stas seseparan solo en funcin de su masa e independientemente de su carga.


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SDS-PAGE

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Dodecilsulfato sdico: desnaturaliza a las protenas y se une a ellas en una

proporcin masa/masa constante (1.4 g SDS/g de protena).

Como resultado, las molculas de protena quedan completamente desplegadas y

recubiertas de una carga negativa uniforme, y por ello su movilidad electrofortica

es inversamente proporcional a su nmero de aminocidos.


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SDS-PAGE + CONDICIONES

REDUCTORAS

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Agentes reductores

Compuestos qumicos capaces de reducir los enlaces disulfuro de las

protenas (-S-S-) a grupos sulfhidrilo (-SH). Permiten desplegar completamente una protena y separar las

subunidades de una protena multimrica; ambos efectos son necesarios

para que la movilidad de la protena en una electroforesis SDS-PAGE sea

acorde con su masa molecular. Los ms habituales son el beta-

mercaptoetanol, el ditiotreitol (DTT) y la urea.

El SDS desnaturaliza a las protenas en sus estructuras 2ria. y 3ria.,mientras que los agentes reductores lo hacen en la 3ria. y la 4ria.


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ESTRUCTURAS DE LAS

PROTENAS

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http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1//commons.wikimedia.org/wiki/File:Estructura_prote%C3%ADnas.pnghttp://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_1//commons.wikimedia.org/wiki/File:Estructura_prote%C3%ADnas.png


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La electroforesis con SDS en condiciones reductoras -adems de permitircalcular el peso molecular de las cadenas polipeptdicas- nos indica las

distintas subunidades que posee la protena

PAGE NATIVA VS. SDS-PAGE +CONDICIONES REDUCTORAS

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Es un proceso de separacin e identificacin de protenas en dosdimensiones, orientando los frentes de corrida en ngulo recto uno de

otro

1) Las molculas primero son separadas por su carga o punto isoelctrico (pI)

por la tcnica de enfoque isoelctrico o IEF (Isoelectric Focusing).

2) Posteriormente, las protenas son separadas de acuerdo a su tamao o pesomolecular por electroforesis en SDS-PAGE.

Electroforesis en una dimensin: se puede resolver cerca de 50 bandas.Electroforesis de dos dimensiones: permite resolver 2500 manchas de

polipptidos.

ELECTTROFORESISBIDIMENSIONAL

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ISOELECTROENFOQUE

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BIDIMENSIONAL


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BIDIMENSIONAL


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La electroforesis de protenas es discontinua y desnaturalizante

Es discontinua porque est conformada por dos geles de poliacrilamida(uno de empacamiento y otro de resolucin) que presentan diferenteconcentracin, composicin y pH.

Ambos geles se encuentran unidos pero limitados por una fase deseparacin visible a trasluz.

Debido a que en estado lquido ambos geles pueden mezclarsefcilmente, deben ser preparados por separado esperando la total

polimerizacin del primero para continuar con la polimerizacin del otro.

PREPARACIN DE GELES DEPOLIACRILAMIDA

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El gel de empacamiento, apilamiento o concentracin se localiza en laparte superior del sistema formando los pocillos donde se depositarnlas muestras: posee baja concentracin de acrilamida (4%) en tampn

ligeramente cido (Tris/HCl 1M pH 6,8), de forma que ofrezca pocaresistencia a la mezcla de protenas sometidas a electroforesis; por esolo atraviesan con relativa rapidez.

El gel de resolucin o de separacin forma el cuerpo del gel por donde

migrarn y se separarn las protenas: debe tener mayor concentracinde acrilamida (10% o ms) y pH ms bsico (8,3-8,8) de manera queofrezca mayor resistencia en la corrida a los polipptidos.

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Dato importante: la metilbisacrilamida es uncompuesto qumico neurotxico, mientras que la

poliacrilamida no lo es


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SDS-PAGE

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La electroforesis termina cuandose haya producido la mximaseparacin de los componentes

de la muestra, pero sin sobrepasarlos lmites del gel.

Para evitar que se sobrepasenestos lmites, se utilizan molculascoloreadas con una movilidadelectrofortica superior a la decualquier componente de la

muestra (poseen elevada carga

respecto a su tamao).

Entre los ms utilizados seencuentran la dinitrofenil-lisina

(DNP-Lys) y el azul de bromofenol.

SDS-PAGE


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Marcadores moleculares: permiten determinar el pesomolecular de la cadena polipeptdica

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SDS-PAGE


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Cuba de electroforesis con 4 geles sembrados y listos para correr

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Electrodo

s

SDS-PAGE


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Comienzo de la corrida electrofortica

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Burbujeo

SDS-PAGE


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No se sabe a ciencia cierta cul es el mecanismo de adhesin a las protenas deeste colorante, pero se especula que se puede unir al grupo amino o bien quereconoce y se une a los siguientes aminocidos:

TINCIN CON COMASSIE BLUE


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Patrn del markerKaleidoscope prestainedstandards de BIO-RAD

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

BSA(Seroalbmina bovina.

66,00 kDa)

Protena acuantificar:

Eg95 ( 37,40

kDa)

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TINCIN CON COMASSIE BLUE


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*Es la transferencia de las protenas a una membrana*

Finalizada la PAGE, se puede obtener informacin acerca de las protenas si stas setransfieren desde el gel a una membrana.

El proceso de transferencia se denomina blotting y fue originariamente descriptopor E. M. Southern para el ADN (Southern blot); posteriormente y continuando con lamisma terminologa, se describi para el caso del ARN y las protenas (Northern yWestern blot respectivamente).

Una vez en la membrana, las protenas estn accesibles a diferencia de en el gel-para interaccionar con otras molculas que permitan su identificacin; en la mayorade los casos, estas molculas son anticuerpos y el proceso se conoce comoimmunoblotting, pero tambin pueden ser lecitinas, cidos nucleicos, receptores ocualquier otro ligando.

WESTERN BLOT


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Membrana de nitrocelulosa:posee una buena

capacidad de unin deprotenas (250g/cm2), que

quedan unidas a lamembrana de forma no

covalente medianteinteracciones electrostticas

e hidrofbicas.

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WESTERN BLOT


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WESTERN BLOT


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Membrana transferida y teidareversiblemente con rojo ponceau

43MarkerEstndarMuestras

REVELADO


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REVELADO


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Mtodo indirecto de deteccin: el anticuerpo primario sin marcarreacciona con el antgeno. Luego, un anticuerpo secundario

marcado se une al primario y reacciona con el sustrato.

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REVELADO


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Placas radiogrficas: confirman la identidad de la protena de inters

La presencia de bandas indica inequvocamente -por medio del pegado delanticuerpo especfico- que la protena sembrada es la de inters. Si el

anticuerpo 1rio. no se pega, el 2rio. tampoco y no hay revelado (es decir, nose impresiona la placa)

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REVELADO

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