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Proteómica de segunda generación: análisis masivo de proteínas
Identificación de la proteína
BASE DE DATOS
Proteoma
Espectro de fragmentación
Digestión tríptica
péptidos
Separación de los péptidos por cromatografía líquida
+
péptido
fragmentos
Espectrometría de masas
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Cuantificación diferencial de proteomas mediante técnicas de segunda generación
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• Cada muestra se analiza por separado en paralelo en las mismas condiciones cromatográficas:
• Permite comparar N muestras en diferentes carreras.
• Se pueden seguir dos estrategias para la cuantificación: 1. Medida de la intensidad de la señal de cada espectro y/o péptido
2. Número de espectros (“spectral counting”) y/o péptidos identificados (“peptide counting”)
Cuantificación mediante técnicas “label-free” (sin marcaje)
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Isótopos • Átomos isotópicos:
Tienen un neutrón más.
Ejemplo: C12 y C13
Cromatografía líquida
12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bu
nd
ance
15.21
24.55 28.77
16.89 16.29 19.28
25.67 18.19 20.97
22.07 28.15 18.06 19.55 12.80 14.23 22.29 29.46 26.57 27.33 23.26 13.15
Fase reversa
Péptido ligero (A) y pesado (B)
Espectro de masas
>3 Da
A
B
m/z
Inte
nsit
y
Cuantificación del
ratio de los niveles
de intensidad de los
isótopos A y B:
Log2(A/B)
Precisión de la medida determinada por la resolución del espectrómetro de masas y por la
relación señal/ruido de la medida
• Moléculas isotópicas: Tienen más masa que su pareja no isotópica. Presentan
la mismas propiedades fisico-químicas. Un espectrómetro de masas detecta la
diferencia de masa entre los dos.
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Cuantificación (relativa) con Isótopos Estables
15N, SILAC (metabólicos)
ICAT (químico)
iTRAQ (químico)
18O (enzimático)
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Stable Isotope Labelling of Aminoacids (SILAC)
• Suplementa el medio de cultivo con arginina (Arg) marcada con seis 13C:
Identificación en MS2 y cuantificación en MS1
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VENTAJAS:
Se mezclan las muestras para obtener un extracto de proteínas único antes de la digestión tríptica. Disminuye la variabilidad analítica/técnica en la medida
INCONVENIENTES:
X Sólo se puede usar en cultivos celulares, no es aplicable en otro tipo de muestras biológicas.
X Es muy caro y difícil de optimizar
X Puede haber una variabilidad en el cultivo debido a la adición de AAs con isótopos
DESVENTAJAS RESUELTAS ACTUALMENTE:
SuperSILAC: ratón alimentado con AAs marcados
MIX
Cells
Sample A Sample B
C12-Arg C13-Arg
Digest with trypsin
RP-HPLC-MS
Identify by MS/MS and quantify by MS
Denature, reduce & alkylate proteins
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Isotope-Codec Affinity Tag (ICAT)
• Marcaje químico diferencial de las cisteínas de los extractos proteicos:
Se produce una diferencia de masa de 8 Da.
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• Se estima que tan solo el 10% de los péptidos trípticos de un proteóma tienen cisteína.
Identificación en MS2 y cuantificación en MS1
Se requiere un paso de enriquecimiento de cisteínas para poder cuantificar un porcentaje aceptable del proteoma completo.
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VENTAJAS: Todo tipo de muestras biológicas Purificación de péptidos con cisteína
INCONVENIENTES × El marcaje con biotina da fragmentaciones muy
ruidosas × El deuterio altera el tiempo de retención en la
cromatografía líquida de fase reversa × Solo cuantifica péptidos con cisteína: menos
péptidos para cuantificar una proteína.
DESVENTAJAS RESUELTAS Utilización de 13C en vez de deuterio: no
interfiere en la cromatografía líquida Marcaje tras la digestión tríptica: más acceso a
péptidos con cisteína
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Isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ)
• Reactivo específico de aminas (N-terminal y Lisina (K))
• Todos los reactivos tienen la misma masa, pero al fragmentarse se generan reporteros de distinta masa
Identificación y cuantificación en MS2
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Péptidos marcados con iTRAQ aparecen como un único pico en modo MS…
… pero en MS/MS aparecen los picos del grupo reportero específico de cada muestra, que representan la cantidad del péptido en cada muestra mientras aparece un único espectro de fragmentación perteneciente al péptido.
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VENTAJAS: Marcaje de todos los péptidos: más
péptidos distintos para cuantificar una proteína
Permite comparar de 4 a 8 muestras diferentes en un mismo experimento
Mayor señal/ruido en el MS/MS: permite cuantificar proteínas poco abundanes
INCONVENIENTES × Espectrómetros de baja resolución no
fragmenta en rangos de masa tan bajos × Marcaje post-digestión: mayor
variabilidad analítica DESVENTAJAS RESUELTAS Fragmentación PQD para baja resolución Fragmentación HCD para alta resolucióna
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Isobaric tags for relative and absolute quantitation (8-plex-iTRAQ)
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Trypsin-catalyzed 18O incorporation in peptides
H H H H
O18
C
O
R
CH
C
O
R
CH
R
CH
C
O
R
CH
R
CH
C
O
R
CH
R/K
CH HO
C
R
CH
OH
C
R
CH O O
OH
C
R
CH
OH
C
R/K
CH O O
OH
Trypsin-Ser
O-
C
R
CH
C
R
CH
R
CH O O
C
R
CH
R
CH
C
R
CH
R/K
CH O O
Trypsin-Ser
O
C
R
CH
C
R
CH O O
C
R
CH
C
R/K
CH O O
O-
HO18
Trypsin-Ser Non-labeled
peptide Bo
OH-Ser-Trypsin
C
R
CH
C
R
CH
C
O
R
CH
C
R
CH
OH
C
R
CH
OH
C
R
CH
C
O
R
CH
R
CH
C
R
CH
R
CH
OH
C
R
CH O O
OH
C
R
CH
R
CH O O
C
R
CH O O
C
R
CH
R
CH
C
R
CH
C
R
CH
R
CH
C
O
R
CH
R
CH
C
R
CH
R
CH
OH
C
R
CH
OH
C
R
CH
R
CH
C
O
R
CH
R/K
CH
C
R
CH
R/K
CH
OH
C
R/K
CH O O
OH
C
R
CH
R/K
CH O O
C
R/K
CH O O
C
R
CH
R/K
CH
Trypsin-Ser Trypsin-Ser
HO18 O O O O O18 O18-
H H H H
O18
O18
O18- O18
HO18 HO18
Trypsin-Ser
mono-labeled peptide B1
(+2Da)
di-labeled peptide
B2 (+4 Da)
Trypsin-Ser-OH
Marcaje enzimático con 18O
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Extracto proteínas B
digestión
digestión
marcaje
marcaje
H 2 H 2
H 2 H 2 H 2 H 2 H 2 H 2
H 2 H 2
(+4 Da)
mezcla
B
B
A
Identificación masiva
Extracto proteínas A
Cuantificación masiva
log2(A/B)
Se produce una variación de masa de hasta +4Da
4 Da
Identificación en MS2 y cuantificación en MS
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VENTAJAS: Marcaje de todos los péptidos Más barato Cromatografía “micro” hay coelución de los
isótopos en la cromatografía INCONVENIENTES × Solo se pueden comparar dos muestras × Cromatografía “nano” acoplada a alta
resolución, da problemas de no coelución de los isótopos
DESVENTAJAS RESUELTAS Integración de los valores de todo el pico
cromatográfico
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Técnicas de cuantificación dirigida de proteínas
Multiple Reaction Monitoring (MRM)
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Transition 1
Transition 2
Transition 3
La señal de los iones fragmentos se monitoriza a lo largo de todo el tiempo de elución del pico cromatográfico
Se pueden monitorizar varias decenas de proteínas con péptidos proteotípicos de masa conocida en un único análisis sin necesidad
de fraccionar un proteoma
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1. Seleccionar los péptidos proteotípicos que van a servir para cuantificar las proteínas de interés. Normalmente se eligen 2 o 3 péptidos por proteína. Estos péptidos se sintetizan usando Arg o Lys pesadas (C13) del extremo C-terminal del péptido y servirán como estándares internos para el análisis de MRM.
2. Configurar y optimizar los parámetros del MS para conseguir la máxima transmisión y sensibilidad de cada transición MRM de cada péptido y evitar interferencias debidas a muestras complejas.
3. Para definir los límites de detección y cuantificación (LOD y LOQ), se realizan curvas de calibración para cada péptido sintético.
Pasos: