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Purification de protéines - stratégies

1CHM 3102

Propriétés des protéines et stratégie de purification

• Instabilité à la température• Stabilité au pH• Stabilité au solvants organiques• Nécessité d’utiliser des détergents• Sel (force ionique)• Co-facteur et stabilité d’activité• Sensibilité aux protéases• Sensibilité aux métaux• Activité redox• Poids moléculaire• Charge• Affinité biospécifiques• Modifications post-traductionelles• Hydrophobicité


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Définir la pureté nécessaire

99% Utilisation thérapeutique, études in vivo

95-99% Cristallographie, caractérisationphysico-chimiques

< 95 % Antigène pour production d’anticorps, séquençage d’Edman

Minimiser les étapes de purification

Pure

téFinitionHaute pureté

Purif. Interm.Enlever les impuretés

CaptureIsoler, concentreret stabiliser

PréparationExtraction, clarification

Étapes


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Étapes de purification

Amersham BiosciencesProtein PurificationHandbook18-1132-29

Echange d’ion

Interaction hydrophobique

Affinite

Exclusion

Phaseinverse

Chromatographie par échange d’ions

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Principe de séparation

Concentration de proteines de charge opposee

Gradient de force ionique et déplacementde protéine faiblement associée à la résine

Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique


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Types de résines

Résine Groupes fonctionnels pH oper.________________________________________________________

Anion

Diethylaminoethyl -O-CH2-CH2-N+H(CH2-CH3)2 3-8

Amino ethyl quaternaire -O-CH2-CH2-N+H(C2H5)2–CH2-CHOH-CH3 3-11

Ammonium quaternaire -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 3-11

Cation

Carboxymethyl -O-CH2-COO- 5-11

Methyl sulfonate -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-SO3- 4-11

Sulfopropyl -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3- 4-11


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Sélection selon le pI de la protéineChar

ge

net

te

pI

102 4 6 8

Gamme de stabilité

Courbe de titration théorique


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Sélection du pH et ordre d’élution

pH acide inférieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeusede cation

pH basique supérieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeused’anion.

pH moins basique. Uneprotéine positivementchargée (rouge) interagitavec la résine cationiqueet peut être séparée des autres. Alternativementles autres protéinespeuvent etre séparéesavec une résine anionique, alors que la protéine en rouge n’est pas retenue.

pH moins acide. Uneprotéine negativementchargée(bleu) interagitavec la résine anionique et peut être séparée des autres. Alternativement les autres protéines peuventetre séparées avec unerésine anionique, alors quela protéine en bleu n’estpas retenue. résine échangeuse d’anion

résine échangeuse de cation


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Force ionique et facteur de capacité

Ln(k

’)

1/√I

lysosyme α-chymotrypsinogen

Cytochrome C

ou: Ap: Aire du polyelectrolyteσp: Densité de chargeF : Constante de Faradayε0: Cst. Permittivitéεr: Cst dielectrique de la phase mobileI : Force ioniqueΦ: Rapport volume occupé par phase

stationnaire et mobile: Vs/Vm

Anal. Chem, 63, 1867 (1991)


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Sélectivité et élution

Gradient linéaire

Elution par plateau


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Diamètre des particules et résolution

Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21


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Caractéristiques des résines


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Tampons

Purifying proteins for proteomicsR.J. Simpson, p. 127


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Exemples de séparation


Anion (faible)

Anion (fort)

Anion (fort)

Anion (faible)


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Exemples de séparation


Résine échangeuse de cation


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Chromatographie d’exclusion moléculaire

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Phase stationnaire : pores de taille contrôléeGels (agarose, dextrane, polyacrylamide)Supports rigides (silice poreuse)

Phase mobileSolubilise l’échantillonGonfle le gelCompatible avec le système de détectionIsocratiqueEx : TRIS, phosphate, NaCl, et detergent neutre

Séparationbasée sur la taille des molécules, et donc leur aptitude à pénétrer dans le réseau de pores


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Gel, structure et porosité

Harris, 6e Ed. p. 652Structure de polyacrylamide


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Coefficient de distribution et masse moléculaire

ViV0

Vm

VR = V0 + KD Vi KD = VR – V0Vm – V0

Volume mort, V0 est determiné en utilisant le dextran blue 2000 (Mr = 2 x 106 Da). Vmcorrespond au volume de la phase mobile et est la somme du volume mort et du volume interne Vi.


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Exemple de séparation

L’ordre d’élution est inversementproportionel à la masse moléculaire.

Utilité pour l’observation et le contrôledu repliement et de l’aggrégation de protéines. Frequemment utilisée pour désaler les protéines par exempleaprès digestion ou modification chimique.

Harris, 6e Ed. p. 653


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Gamme de linéarite

Diamètre des pores de la phase stationnaire de polystyrene

Harris, 6e Ed. p. 653

Pour chaque phase stationnaire il existe un domaine ou le log Mr et le volume d’élution est linéaire. La gamme de masse augmente avec la dimension des pores (Ex: G2000SW, pore 13 nm, separation: 0.5-60 kDa et G5000SW, pore 100 nm, separation > 1.5 MDa)


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Tampons volatils recommandés

pH Tampons Contre-ion pK-pour tampon

2.0 Formic acid H+ 3.75

2.3-3.5 Pyridine/formic acid HCOO- 3.75; 5.25

3.0-5.0 Trimethylamine/formic acid HCOO- 3.75; 9.25

3.0-6.0 Pyridine/acetic acid CH3COO- 4.76; 5.25

4.0-6.0 Trimethylamine/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25

6.8-8.8 Trimethylamine/HCI CI- 9.25

7.0-8.5 Ammonia/formic acid HCOO- 3.75; 9.25

8.5-10.0 Ammonia/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25

7.0-12.0 Trimethylamine/carbonate CO32- 6.50; 9.25

7.9 Ammonium bicarbonate HCO3- 6.50; 9.25

8.0-9.5 Ammonium carbonate/ammonia CO3

2- 6.50; 9.25

8.5-10.5 Ethanolamine/HCI CI- 10.0

8.5 Ammonium carbonate CO32- 6.50; 9.25

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