química de productos naturales: generalidades de cromatografía- utmach
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Dra. Haydelba D’ Armas, PhD
Mayo de 2014
CROMATOGRAFÍA
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TECNICAS SEPARATIVAS
Clasificación:
Precipitación.
líquido - líquido
Extracción
en fase sólida
Destilación
Cromatografía
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CROMATOGRAFÍA
Definición:
“Es una técnica capaz de separar compuestos enbase a diferencias de su afinidad por una faseestacionaria y una móvil”.
Sistema Cromatográfico:
Fase Móvil
Fase Estacionaria
Soluto
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Proceso físico - químico que rige la separación:
• Adsorción:El soluto se adsorbe en la superficie de las partículassólidas de la fase estacionaria. Es un fenómenosuperficial, aumentado con la formación de puentesde hidrógeno
• Partición o Reparto:
El soluto se equilibra entre el líquido de la faseestacionaria y la fase móvil, por diferencia desolubilidad. Hasta llegar a un equilibrio
Proceso Cromatográfico (1)
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• Intercambio Iónico:
Los aniones o cationes se separan en base a unacolumna rellena con un intercambiador de iones (resina)
• Exclusión Molecular, Filtración o Permeación en Gel:
No existen interacciones entre la fase estacionariay el soluto. Se separa por tamaño de partícula
Proceso Cromatográfico (2)
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Fase
estacionaria
Fase
móvil
Proceso
cromatográfico
Capa fina
Columna
Adsorción
I. Iónico
Exc. Molecular
AdsorciónColumna
Papel
Capa fina
Columna
Partición
ParticiónColumna
Líquida
Líquida
Líquida
Sólida
Gas
Gas
Técnica
cromatográfica
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7
1. Fundamentos
Fig.1
Tswett (1872-1919)
Fase
móvil
Fase
estacionaria
Pigmentos
vegetales
Chroma: color
Graphein: escribir CROMATOGRAFÍA
1903: usó columnas de adsorción para separar
pigmentos vegetales
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Según la disposición de la fase estacionaria:
•Cromatografía plana:Cromatografía en capa finaCromatografía en papel
•Cromatografía en columna:Cromatografía de líquidos Cromatografía de gasesCromatografía de fluidos supercríticos
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Fase estacionaria
Papel Cromatografía en papel
Adsorbente sobre soporte Cromatografía
en capa finaGel de sílice, poliamida….
Lámina de vidrio, de plástico o
metálica
CROMATOGRAFÍA PLANA
METODOLOGÍA DE TRABAJO
12 3 4
5
Papel
Tapadera
Fase
móvil
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Cromatografía en capa fina (CCF)
CCF en solventes de distintas polaridades
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La fase móvil se mueve por capilaridad, gravedado bajo la acción de un campo eléctrico (electro-cromatografía)
x
b
a Rf
ab
a - distancia recorrida por el analito.
b - distancia recorrida por el frente
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•La cromatografía en capa fina es una técnica paradeterminar el número de componentes de unamezcla y como una prueba preliminar para realizaruna cromatografía en columna, entre otros•El proceso de cromatografía en columna secontrola por cromatografía en capa fina, de talmanera que se puede separar cada componente dela mezcla•La cromatografía en columna se usa para separargrandes cantidades de material: >100 mg. Elproceso de cromatografía consta de una fase móvil(eluyente) y una fase estacionaria (adsorbente), loscuales dependen de las sustancias
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Fase Móvil
-COOH-OH-NH2
-SH-CHO- CO-COOR-OCH3
Hidrocarburos No SaturadosHidrocarburos Saturados
Ácidos carboxílicosAlcoholesAminasTiolesAldehidosCetonasEsteresÉteres
Alta
Baja
Polaridad
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H2SO4
I2
Lámpara ultravioletaNo Destructivo
Destructivo
Técnica de Revelado: bañado o pulverizaciónClasificación de reveladores.
H2SO4 (o con molibdato de amonio o vainilina)
Lámpara ultravioleta
I2
Ftalato de anilina (azúcares)
Ninhidrina (Amino-ácidos) Resorcina (Cetosas)Difenilamina + UV 254 (I. Clorados)
Generales
Selectivo
Específico
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CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
LECHO CROMATOGRÁFICOf. estacionaria
EMPAQUETADO
COLUMNA
COLUMNA
llave
MUESTRA
APLICACIÓN
MUESTRA
RESERVORIOf. móvil
ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES
FLUJOgravedad
DIFUSIÓN
SEPARACIÓN O FRACCIONAMIENTO
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Fase
estacionaria
Fase
móvil
Muestra
(A+B)
A
B
A B
B
B
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Según el tipo de fase móvil:
•Cromatografía de líquidos (LC)
•Cromatografía de gases (GC)
•Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)
En columna o en superficie plana
En columna
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Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio
LC Reparto Líquido adsorbido sobre un
sólido
Distribución entre líquidos
inmiscibles
Adsorción Sólido Adsorción
Intercambio
iónico
Resina de Intercambio Iónico Intercambio iónico
Exclusión por
tamaños
Líquido en intersticios de un
sólido polimérico
Distribución/Exclusión
GC Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un
sólido
Distribución entre gas y
líquido
Gas-sólido Sólido Adsorción
SFC Especies orgánicas enlazadas a
superficie sólida
Distribución entre fluido
supercrítico y superficie
enlazada
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA
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El proceso cromatográfico
Detector ● ● ● ●
Faseestacionaria
Fasemóvil
Muestra(A+B)
●
A
B
t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
●●
Señ
al a
nal
ític
a
Tiempo, min t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
A B
B
B
AB
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Parámetros fundamentales
Res
pu
esta
del
det
ecto
r
TiempoInyección
CH4 Octano Noidentificado
Nonano
tr´ = tr - tm
25
tr =tiempo de retención o el que transcurre desde el momentode la inyección de la muestra hasta la aparición de la máximaconcentración del compuesto eluido en el detector
tm= tiempo muerto o cuando un compuesto no sufre ninguna interacción con la faseestacionaria. tr´ = tiempo de retención corregido o la interacción del soluto con la faseestacionaria
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Aplicaciones de la cromatografía ANÁLISIS CUALITATIVOSe
ñal
an
alít
ica
Tiempo
CH4 Octano Nonano Decano
Disolución estándar
Señ
al a
nal
ític
a
Tiempo
CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano?
Muestra
La muestra no contienemetano ni octano.Si los contiene será aconcentraciones inferioresa los correspondienteslímites de detección
Identificación positiva: - Comparación de datos de retención- Uso de detectores en línea
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27
Se
ña
l a
na
lítica
Tiempotrtm
Altura, h
Área
Concentración, ng ml-1
0 5 10 15 20 25 30
Áre
a d
e p
ico, s
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Preparación de disoluciones patrón
Obtención de sus cromatogramas
MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO
A. Calibración con patrones:
ANÁLISIS CUANTITATIVO •La cromatografía cuantitativa encolumna se basa en lacomparación de la altura, o delárea, del pico del analito con lade uno o más estándares•Equipos modernos: integracióndel área
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Método consiste en introducir en cada disolución estándar, así como en lamuestra, una cantidad exactamente medida de una sustancia estándar, a la quese llama patrón interno. La relación entre las áreas (o alturas) del analito y delestándar interno, es el parámetro que representado frente a la concentración deanalito, origina una línea recta, cuya ecuación permite calcular la concentraciónde analito en la muestra.
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Cromatografía de gases
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Cromatógrafo de Gases
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☯Gas de acarreo
☯Controladores de flujo
☯Inyectores
☯Columnas
☯Detectores
☯Sistema de datos
Principales componentes
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Gas de acarreo
Portador o fase móvil, es el que transporta a loscompuestos a través de la columna.
Químicamente inerte, puro (>99%), seco
Se aconseja colocar un filtro de carbón activo y unatrampa para humedad antes de la entrada del gas alinstrumento.
El tipo de gas acarreador depende de la velocidadrequerida para el análisis y el tipo de detector a emplear.
Los más utilizados son helio, nitrógeno, hidrógeno o unamezcla argón con 5 % de metano.
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Inyectores
En el puerto de inyección se lleva acabo la introducción de la muestra
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☛Es donde ocurre la separación y es el “corazón” de uncromatógrafo.
☛Columnas empacadas de: cobre, aluminio, acero inoxidable,vidrio ó teflón.
☛Columnas capilares de sílice fundida recubiertas conpoliimida.
☛El empaque puede ser un sólido, un líquido o un sólidorecubierto por un líquido.
Columnas
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Se construyen con tubo de acero inoxidable, niquel o vidrio.
Los diámetros interiores van de 1,6 a 9 mm.
La longitud suele ser inferior a los 3 m.
Se rellenan de un material adsorbente adecuado a las sustancias
que se quiere separar.
Columnas cromatográficas empacadas
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Se construyen con sílice fundida.
Los diámetros interiores suelen ser de 200-250
mm.
La longitud suele ser superior a los 20 m.
Hay dos tipos:
Empacadas con partículas sólidas ocupando el total del
diámetro de la columna (micro-empacadas)
Tubulares abiertas, con trayectoria para el flujo abierta y sin
restricción por el centro de la columna
Columnas cromatográficas capilares
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Ejemplos de fases estacionarias en
cromatografía de gases
Separaciones por punto de ebullición de compuestos
en un intervalo amplio de masas moleculares:
Escualano
Polidimetilsiloxano
Para hidrocarburos insaturados y otros compuestos
polidifenildimetilsiloxano
policarboranometilcianoetilsilicón
Para compuestos nitrogenados
poliamida
policianoetilmetilsilicon
Para alcoholes, ésteres, cetonas y acetatos
polietilenglicol
pentaeritritol tetracianoetilado
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• Las columnas cromatográficas se enrollan, se sujetan en unsoporte y se introducen en el interior de un horno
• El horno debe poderse calentar y enfriar rápidamente
• La temperatura se debe poder programar para poder trabajar enrégimen de gradiente
• Muchas aplicaciones y métodos cromatográficos requierencomenzar a temperaturas por debajo de la ambiental
HORNO
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Detector de Ionización a la Llama (FID)
Consiste de una llama dehidrógeno-aire y una placacolectora. El efluente de lacolumna pasa a través de la llama,que ioniza las moléculasorgánicas.
Los iones se recogen en unelectrodo de polarizaciónnegativa y producen una señaleléctrica.
El FID es extremadamentesensible y es el detector másampliamente utilizado, sudesventaja es que destruye lamuestra.
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Detector de Espectrometríade Masas, MSD
*El espectrómetro de masasusa la relación masa-carga(m/z) de moléculas ionizadas.
*Es una técnica muy poderosaque permite cuantificar,identificar y da informaciónacerca de la estructura decompuestos desconocidos.
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*La operación general del espectrómetro de masas es:
a) crea iones en fase gaseosa
b) separa los iones en base a su relación (m/z).
c) mide la cantidad de iones de cada relación (m/z).
Detector-analizador de masas
Una vez ionizadas las moléculas, estas pasan al analizador de iones el
cual los transporta hacia el detector: Existen diferentes tipos de
analizadores los que son utilizados de acuerdo a las necesidades.
Dentro de los analizadores podemos citar, la trampa de iones, el
sector magnético, el tiempo de vuelo, el cuadrupolo, etc.
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El cuadrupolo consiste de cuatro cilindros metálicos paralelos, endonde dos de ellos tienen un potencial (U + Vcos(wt)) y los otros dos–(U + Vcos(wt)), lo que le da un rango de frecuencia, los iones concierta relación (m/z), pasan a través del cuadrupolo, los que no soneliminados. En este sistema se necesita un alto vacío, para eltransporte de los iones a través del analizador (10-9 torr).
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La cromatografía es un método, usado
primariamente para la separación de los
componentes de una muestra, en la cual los
componentes se distribuyen en dos fases.
El HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) o CLAR (Cromatografía
Líquida de Alta Resolución) es el método más
moderno para realización de cromatografías.
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Si es un gas: Modalidad cromatográfica gaseosa.
Si es un líquido: Cromatografía líquida.
•Cromatografía en capa delgada
•Cromatografía líquida en columna abierta
•HPLC
Diferencias. Fase Móvil
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Sistema HPLC
HPLC SolventReservoirs
RheodyneInjector
HPLCColumn
9010 SolventDelivery System
9050 VariableUV/Vis Detector
9060 Polychrom(Diode Array) Detector Computer
Workstation
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51
CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (PARTES DE UN HPLC)
Desgasificador
de disolventes
Abastecimiento
de disolvente
Filtro
Bomba de alta presión
Válvula de seguridad y purga
Columna analítica
Espacio térmico
Lectura
Amplificador
Recoleccióno descarga
Descarga
Gases disueltos
Jeringa o válvula para la muestra
Introducción de la muestraPreco-
lumna
Medidorde presión
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%A %B %C Flow Rate Pressure{H2O} {MeOH} (mL/min) (atmos.)
Varian 9010 Solvent Delivery System
throughpulse
dampener
Rheodyne
Injector
Co
lum
n
Ternary Pumpfrom solvent
reservoirto
detector
through pump
to column
to injector
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Varian 9060Polychrom Detector
UV Spectrum
ChromatogramReset
Ready
UV Spectrum{shows full UV abs.}
Chromatogram{shows peaks, Rt}
AB
S.
Time
AB
S.
Wavelength
UVmaxUVmax
Rt Rt
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HPLC Chromatograms
Rt = 3.0 min.faster movingless retained
Rt = 5.2 min.slower movingmore retained
0 1 2 3 4 5 6 7
Time (minutes)
Ab
sorb
ance
Approximationof peak area by
triangulation
Area =base x height
2
base
height
Peak A Peak B
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Chromatography Stationary Phases
relatively polar surface
O O O
| | |
OSiOSiOSiOH
| | |
O O O
| | |
OSiOSiOSiOH
| | |
O O O
bulk (SiO2)x surface
relatively nonpolar surface
Silica Gel
O O O
| | |
OSiOSiOSiOR
| | |
O O O
| | |
OSiOSiOSiOR
| | |
O O O
bulk (SiO2)x surface
Derivatized Silica Gel
Where R = C18H37
hydrocarbon chain (octadecylsilyl deriv.
silica or “C18”)
“normal phase” “reversed phase”
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Hay dos tipos de fases estacionarias:
Fase Normal: el componente principal de la fase estacionaria esmuy polar(ej. silice) y la fase móvil es poco o medianamentepolar. Bajo estas condiciones los compuestos poco polareseluyen primero
Fase Reversa: La fase estacionaria es poco polar, normalmente silica tratada (siloxano) con R de C8H17 (C-8 o n-octil) a C18H37 carbonos(C-18 o n-octildecil). La fase móvil es polar y en estas condiciones los compuestos menos polares son mas retenidos, eluyendo primero los más polares junto con la fase móvil
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57
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA vs CROMATOGRAFIA DE GASES
Son al día de hoy dos poderosísimas herramientas de análisis
Ambas admiten acoplamiento con otras técnicas de detección
(hibridación de técnicas, por ejemplo con espectrometría de
masas o plasmas..etc)
La cromatografía de gases, requiere muestras gaseosas o
fácilmente volatilizables.
El resto de muestras que no poseen esas características pueden
ser analizadas por HPLC.
Ambas técnicas por su versatilidad, y por las diversas posibilidades
que ofrece la selección de la columna cromatográfica, permiten
abordar análisis de multicomponentes en muestras de diversa
procedencia, con elevada precisión y sensibilidad (dependiendo del
detector).
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EJEMPLO CG
58
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AgradecimientoS
Senescyt (ecuador) a través del proyecto prometeo
Universidad técnica de machala: institución de vinculación