reacción en cadena de la polimerasa
TRANSCRIPT
Reacción en cadena de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)polimerasa (PCR)
Fundamentos y aplicacionesFundamentos y aplicaciones
QFB Roger Iván López DíazQFB Roger Iván López Díaz
Técnica de PCRTécnica de PCR
Desarrollada por el Dr. Kary Mullis en 1983.Desarrollada por el Dr. Kary Mullis en 1983.
Es un método para la amplificación exponencial selectiva de una Es un método para la amplificación exponencial selectiva de una región elegida dentro de una molécula de ADN.región elegida dentro de una molécula de ADN.
Permite el copiado in vitro de ADN y ADNc.Permite el copiado in vitro de ADN y ADNc.
Requerimientos de la pruebaRequerimientos de la prueba
Agua libre de nucleasas.
Catión divalente (MgCl2).
Desoxinucleótidos (dNTPs).
Solución amortiguadora y sales.
Oligonucleótidos (primers).
Enzima (Taq polimerasa).
5´-GTTGACTTGATAGGCTA -3´
Agua libre de nucleasasAgua libre de nucleasas
Agua grado PCR libre de RNAsas y DNAsas.Agua grado PCR libre de RNAsas y DNAsas.
Provee el medio en el cual se llevaran a cabo Provee el medio en el cual se llevaran a cabo las reacciones necesarias para la replicación del las reacciones necesarias para la replicación del ADN.ADN.
Catión divalenteCatión divalente
Los iones de magnesio estimulan a la enzima Taq polimerasa para que incorpore los dNTP´s.
DesoxinucleótidosDesoxinucleótidos
Son 4 los dNTP´s involucrados en un PCR típico; dATP, dCTP, dGTP, dTTP.
Provee de nucleótidos (base + azúcar + fosfato) a la reacción para la síntesis de ADN.
Se incorporan a un ADN molde de manera complementaria, para realizar una copia exacta de este.
Sol. Amortiguadora y sales para Sol. Amortiguadora y sales para PCR.PCR.
AmortiguadorAmortiguadorMantiene el pH Mantiene el pH óptimo para que la óptimo para que la enzima actúe.enzima actúe.
SalesSales
Proporcionan la Proporcionan la fuerza iónica fuerza iónica adecuada para una adecuada para una máxima actividad de máxima actividad de la enzima.la enzima.
Influye en la Tm e Influye en la Tm e hibridación.hibridación.
OligonucleótidosOligonucleótidos
Secuencias cortas de ADN (18-25 bases), que Secuencias cortas de ADN (18-25 bases), que sirven como punto de inicio de la replicación del sirven como punto de inicio de la replicación del ADN.ADN.Moléculas lineales con un grupo hidroxilo en el Moléculas lineales con un grupo hidroxilo en el extremo 3´.extremo 3´.Secuencias complementarias al ADN blanco.Secuencias complementarias al ADN blanco.Se unen al ADN molde deacuerdo a las reglas Se unen al ADN molde deacuerdo a las reglas de complementariedad de bases.de complementariedad de bases.
Taq polimerasaTaq polimerasa
Dirige la síntesis de ADN durante Dirige la síntesis de ADN durante la replicación.la replicación.
La Taq polimerasa fue aislada de La Taq polimerasa fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus en la bacteria Thermus aquaticus en 1976.1976.
Es termoestable y actúa en la Es termoestable y actúa en la presencia de iones de magnesio.presencia de iones de magnesio.
La temperatura óptima de la La temperatura óptima de la enzima son 72ºC.enzima son 72ºC.
Pasos de la técnica de PCRPasos de la técnica de PCR
Las cadenas de ADN son separadas en dos hebras sencillas.
Los primers se unen por complementariedad a las cadenas molde, deacuerdo a su Tm.
La enzima Taq polimerasa, adiciona los nucleótidos correspondientes en las nuevas cadenas sintetizadas por complementariedad de pares de bases.
DesnaturalizaciónDesnaturalización
Es el primer paso en la Es el primer paso en la técnica de PCR, en la cuál técnica de PCR, en la cuál las cadenas las cadenas complementarias de ADN complementarias de ADN son separadas por son separadas por calentamiento.calentamiento.
Los puentes de hidrógeno Los puentes de hidrógeno entre las dos hebras de entre las dos hebras de ADN son rotos y estas se ADN son rotos y estas se separan.separan.
AlineaciónAlineación
3’
5’
5’
3’
Alineación de los primers Alineación de los primers 3’
5’
5’
3’3’ 5’3’5’
Proceso en el que dos secuencias de ADN (primers y cadena molde) forman puentes de hidrógeno.
La alineación se lleva a cabo por enfriamiento de la mezcla de reacción, después del paso de desnaturalización según la Tm de los primers empleados.
Elongación del ADNElongación del ADN
La Taq polimerasa se une al templado de ADN y comienza a adicionar los nucleótidos que son complementarios a la cadena molde.
La temperatura óptima de acción de la enzima Taq polimerasa son 72ºC.
Ciclo de replicaciónCiclo de replicación
Desnaturalización.Alineación.
Elongación.
Análisis del producto amplificado Análisis del producto amplificado por PCR convencionalpor PCR convencional
Después de la amplificación al obtener el ADN de interés, este Después de la amplificación al obtener el ADN de interés, este puede ser colocado en un gel de agarosa para realizar el puede ser colocado en un gel de agarosa para realizar el corrimiento electroforético, teñirlo y observarlo con luz ultravioleta corrimiento electroforético, teñirlo y observarlo con luz ultravioleta (UV).(UV).
La electroforesis es el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico.
Los ácidos nucleicos están cargados de forma negativa debido a su esqueleto de grupos fosfato, por lo que migrarán hacia el polo
positivo o ánodo.
Gel de agarosaGel de agarosa
La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene La agarosa es un polisacárido extraído de algas marinas que tiene la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura la propiedad de mantenerse en estado sólido a temperatura ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida.ambiente pero que a altas temperaturas se torna líquida.Gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 a 45°C y funde a Gelifica a temperaturas comprendidas entre 32 a 45°C y funde a temperaturas entre 80 a 95°C.temperaturas entre 80 a 95°C.La agarosa es un producto natural y no tóxico, por lo que puede ser La agarosa es un producto natural y no tóxico, por lo que puede ser manejado libremente y de forma cómoda en el trabajo.manejado libremente y de forma cómoda en el trabajo.La concentración de agarosa típicamente utilizada para La concentración de agarosa típicamente utilizada para electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%, dependiendo del tamaño electroforesis está entre el 0.5 % y el 2%, dependiendo del tamaño del poro requerido para la corrida electroforética y este a su vez del del poro requerido para la corrida electroforética y este a su vez del tamaño del ácido nucleico a analizar.tamaño del ácido nucleico a analizar.la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la la concentración de agarosa define el tamaño de los poros de la matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y matriz, a mayor concentración, menor el tamaño de los poros y viceversa.viceversa.
Bromuro de etidioBromuro de etidio
Es un colorante fluorescente que tiene la capacidad de intercalarse Es un colorante fluorescente que tiene la capacidad de intercalarse entre las bases nitrogenadas de ADN y ARN.entre las bases nitrogenadas de ADN y ARN.
Debido a esta propiedad, es un agente mutagénico y debe Debido a esta propiedad, es un agente mutagénico y debe manejarse con cuidado, usando equipo de protección y las buenas manejarse con cuidado, usando equipo de protección y las buenas prácticas de laboratorio establecidas.prácticas de laboratorio establecidas.
Bromuro de etidio
Bases nitrogenadas
Bases nitrogenadas
Radiación UVRadiación UV
Los efectos biológicos de esta radiación se inician por una Los efectos biológicos de esta radiación se inician por una absorción fotoquímica a nivel de moléculas de importancia absorción fotoquímica a nivel de moléculas de importancia biológica, las más importantes en este sentido son los ácidos biológica, las más importantes en este sentido son los ácidos nucleicos, seguidos por las proteínas. nucleicos, seguidos por las proteínas.
Es importante tomar las medidas necesarias para no exponerse a Es importante tomar las medidas necesarias para no exponerse a este tipo de radiación durante la revelación de los productos este tipo de radiación durante la revelación de los productos amplificados en el gel de agarosa.amplificados en el gel de agarosa.
PCR en tiempo realPCR en tiempo real
En esta técnica de laboratorio, los procesos de amplificación y En esta técnica de laboratorio, los procesos de amplificación y detección se producen simultáneamente en el mismo vial cerrado, detección se producen simultáneamente en el mismo vial cerrado, sin necesidad de acciones posteriores.sin necesidad de acciones posteriores.
Los termocicladores para llevarla a cabo, incorporan un lector de Los termocicladores para llevarla a cabo, incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir en cualquier fluorescencia y están diseñados para poder medir en cualquier momento de la amplificación del material genético, la fluorescencia momento de la amplificación del material genético, la fluorescencia emitida en cada uno de los viales donde se realice esta.emitida en cada uno de los viales donde se realice esta.
Los sistemas de detección para la PCR en tiempo real pueden ser Los sistemas de detección para la PCR en tiempo real pueden ser de 2 tipos: agentes intercalantes o sondas específicas marcadas de 2 tipos: agentes intercalantes o sondas específicas marcadas con fluorocromos.con fluorocromos.
Agentes intercalantesAgentes intercalantesFluorocromos que aumentan notablemente la emisión de Fluorocromos que aumentan notablemente la emisión de fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice.fluorescencia cuando se unen a ADN de doble hélice.
El más empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I.El más empleado en PCR en tiempo real es el SYBR Green I.
El incremento de ADN en cada ciclo, se refleja en un aumento El incremento de ADN en cada ciclo, se refleja en un aumento proporcional de fluorescencia emitida en cada vial donde se realiza proporcional de fluorescencia emitida en cada vial donde se realiza la amplificación.la amplificación.
Uno de los inconvenientes de estos es su baja especificidad, que se Uno de los inconvenientes de estos es su baja especificidad, que se puede mejorar con el empleo de condiciones óptimas de reacción y puede mejorar con el empleo de condiciones óptimas de reacción y con una selección cuidadosa de los primers o cebadorescon una selección cuidadosa de los primers o cebadores
Sondas de hibridación específicasSondas de hibridación específicas
Sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un Sondas marcadas con dos tipos de fluorocromos, un donador y un aceptor.aceptor.
El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente El proceso se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas.mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas.
Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas Las más utilizadas son las sondas de hidrólisis, denominadas también sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y las también sondas TaqMan, las sondas molecular beacons y las sondas FRET.sondas FRET.
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un aumento de hibridación de las sondas, lo que
conlleva un aumento en la misma proporción de fluorescencia emitida.
Sondas de hidrólisisSondas de hidrólisisSon oligonucleótidos marcados con un Son oligonucleótidos marcados con un fluorocromo donador en el extremo 5´ fluorocromo donador en el extremo 5´ que emite fluorescencia al ser excitado que emite fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3´ que y un aceptor en el extremo 3´ que absorbe la fluorescencia liberada por el absorbe la fluorescencia liberada por el donador.donador.Mientras la sonda este intacta, la Mientras la sonda este intacta, la fluorescencia emitida por el donador es fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor.absorbida por el aceptor.Durante la síntesis de la nueva cadena Durante la síntesis de la nueva cadena por la Taq polimerasa, que tiene por la Taq polimerasa, que tiene actividad 5´ exonucleasa, el extremo 5´ actividad 5´ exonucleasa, el extremo 5´ de la sonda es hidrolizado, de la sonda es hidrolizado, produciéndose la liberación del produciéndose la liberación del fluorocromo donador.fluorocromo donador.Una vez que el donador y aceptor están Una vez que el donador y aceptor están espacialmente alejados, la fluorescencia espacialmente alejados, la fluorescencia emitida por el primero es captada por el emitida por el primero es captada por el lector.lector.
Molecular beaconsMolecular beacons
Parecidas a las sondas de hidrólisis.Parecidas a las sondas de hidrólisis.
Tienen una molécula donadora en el Tienen una molécula donadora en el extremo 5´ y una molécula aceptora en extremo 5´ y una molécula aceptora en el extremo 3´, además tienen una el extremo 3´, además tienen una estructura secundaria en forma de asa, estructura secundaria en forma de asa, que se pliega y mantiene unidas ambas que se pliega y mantiene unidas ambas moléculas.moléculas.
Al no estar hibridada con el ADN molde, Al no estar hibridada con el ADN molde, la fluorescencia emitida por el donador la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es es absorbida por el aceptor y no es captada por el lector del equipo.captada por el lector del equipo.
Al hibridarse con el ADN diana, la sonda Al hibridarse con el ADN diana, la sonda se abre, alejándose donador y aceptor, se abre, alejándose donador y aceptor, pudiendo detectarse la fluorescencia pudiendo detectarse la fluorescencia emitida por el primero.emitida por el primero.
Sondas FRETSondas FRET
El sistema se compone de 2 sondas que se unen a secuencias El sistema se compone de 2 sondas que se unen a secuencias adyacentes del ADN diana.adyacentes del ADN diana.
Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra un Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra un aceptor en el extremo 5’.aceptor en el extremo 5’.
Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluorocromos están próximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energía al próximos. Al ser excitado, el donador transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector aceptor que, a su vez, emite la fluorescencia que detecta el lector del equipo.del equipo.
Lector
Equipo de amplificación y Equipo de amplificación y detección en PCR de tiempo realdetección en PCR de tiempo real
Cada tubo pasa frente la misma fuente de luz excitatoria, la cual atraviesa las
paredes laterales, y la fluorescencia emitida retorna al mismo sistema de
detección, en este caso un tubo fotomultiplicador.
LEDS y filtros que determinan rangos de
longitud de onda.
Todos los tubos pasan por el detector cada 150 milisegundos.
La rotación garantiza la
uniformidad de la temperatura del aire del sistema.
Curvas de amplificaciónCurvas de amplificación
Constan de 3 partes diferentes:Constan de 3 partes diferentes:
La fase inicial donde no se La fase inicial donde no se puede medir la acumulación del puede medir la acumulación del producto de PCR pues hay producto de PCR pues hay pocos cambios en la señal de pocos cambios en la señal de fluorescencia, lo que define la fluorescencia, lo que define la línea basal.línea basal.
La fase exponencial, donde la La fase exponencial, donde la fluorescencia cambia a medida fluorescencia cambia a medida que se forman más productos.que se forman más productos.
La fase de meseta, donde no se La fase de meseta, donde no se distinguen cambios en la distinguen cambios en la fluorescencia a pesar de que se fluorescencia a pesar de que se siguen acumulando productos.siguen acumulando productos.
Línea basal
Fase exponencial Meseta
Comparación de PCR tiempo real y Comparación de PCR tiempo real y PCR convencionalPCR convencional
PCR convencionalPCR convencional
Prueba de detección de punto Prueba de detección de punto final.final.
Detección por empleo de geles Detección por empleo de geles de agarosa, aparte de la de agarosa, aparte de la reacción de PCR.reacción de PCR.
Poder de resolución limitado.Poder de resolución limitado.
Obtención de resultados en Obtención de resultados en dos pasos (amplificación y dos pasos (amplificación y detección).detección).
Más tiempo en obtención de Más tiempo en obtención de resultados.resultados.
PCR tiempo realPCR tiempo real
Prueba de detección de la Prueba de detección de la cinética de la reacción.cinética de la reacción.
Detección simultanea durante Detección simultanea durante el proceso de amplificación.el proceso de amplificación.
Detección de cambios Detección de cambios mínimos en la secuencias y mínimos en la secuencias y con cantidades pequeñas del con cantidades pequeñas del ADN blanco.ADN blanco.
Prueba simultanea Prueba simultanea (amplificación y detección) con (amplificación y detección) con menor tiempo de espera.menor tiempo de espera.