reacción en cadena de la polimerasa
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Reacción en cadena de la polimerasa Introduccion Concepto fundamentos Aplicaciones Materiales Etapas Ventaja/DesventadaTRANSCRIPT
Reacción en cadena de la polimerasa
Conocida como PCR por, es una técnica de biología molecular desarrollada en 1987 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo.
Equipo 2
En teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
Universidad Autónoma de YucatánFacultad de Odontología
Mariceli López
Maria Jose Nuñez
Carlos Cetina
Aleika Romero
Jordan Rodríguez
Miguel Villaseñor
Bibiana Dzib
Índice Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR)
Concepto
Fundamentos de la técnica
Utilidad
Elementos que se requieren para realizar
la prueba
Material y Equipo
Etapas de la Técnica
Ventajas y Desventajas
Conclusión
Mariceli López
Maria Jose Nuñez
Carlos Cetina
Aleika Romero
Jordan Rodríguez
Miguel Villaseñor
Bibiana Dzib
Concepto
¿Qué es PCR?
La reacción en cadena de la polimerasa es considerada una técnica biotecnológica cuya finalidad es la amplificación o reproducción in vitro de un número de copias
de una región específica de ADNAl simular la forma en como se replica al ADN de forma natural
La reacción en cadena de la polimerasa fue desarrollada en 1983 por el Doctor Kary MullisPremio Nobel Química (1993)
Conceptos
Sensibilidad• la capacidad del
test para detectar la enfermedad.
Especifidad•
se puede definir la especificidad
como la capacidad para
detectar a los sanos.
Eficiencia: • se refiere a la
amplificación máxima que se puede obtener en un número determinado
de ciclos.
Fidelidad• se refiere a los errores que
comete la ADN polimerasa durante la amplificación.
• Este concepto es de especial importancia en la secuenciación, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.
conceptos
PROCESO PCR
Partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde
En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, O sea que las dos cadenas de DNA se separen y para que esto pase se eleva la temperatura aproximadamente a 90°C
• El siguiente paso consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde
• Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC
la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios
¿Qué se ha obtenido tras un ciclo de
PCR?
Únicamente una copia de un pequeño fragmento del DNA molde
La temperatura depende de los cebadores
PROCESO PCR
Estos cuatro componentes
son los elementos
básicos que es necesario
incorporar a la reacción para que se complete
una PCR.
Componentes de la PCR
ADN
•Este DNA se conoce como DNA •molde.
• El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es
• decir, el DNA que queremos amplificar.DNA polimerasa (sintético)
•Una enzima capaz de generar una copia de DNA a partir del DNA molde:
•una•La reacción se lleva a cabo en un tampón apropiado
•para el funcionamiento de la enzima polimerasa. Además, como
•cofactores de la polimerasa se añaden cationes divalentes, generalmente
•en forma de cloruro de magnesio
cebadores o primers (sintéticos)
• Iniciadores de la reacción• Son necesarios por tanto
moléculas cortas de • DNA de cadena sencilla.
Nucleótidos Libres
• las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos libre
Partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde
Conclusión ADN
Molde
DNA polimer
asa
cebadores o
primers
Nucleótids
Libres
Desnaturalizar el ADN, eleva la temperatura aprox a 90°C
• Descenso de la entre 35 y 60ºC
la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios
Es una técnica de biología molecular desarrollada en 1987 por Dr.Mullis que Permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA
PCRLa reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular.
Fundamentos de la técnica
La reacción en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la década de 1980.
Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica y biológica para una gran variedad de aplicaciones.
Entre ellas se incluyen La clonación de ADN para
la secuenciació
n,
La filogenia basada en
ADN
El análisis funcional de
genes
El diagnóstico
de trastornos hereditarios
La identificación de huellas genéticas
(usada en técnicas forenses y test de
paternidad)
La detección y diagnóstico
de enfermedades infecciosas
Forma de clonación “in vitro”
Sistema de amplificación que nos permite la obtención de un millón de copias del DNA original en pocas horas
¿Cuáles son los fundamentos?
EXTENSIÓN DEL CEBADOR
La DNA polimerasa realiza la extensión del primer utilizando la cadena complementaria como molde
Eventos de la replicación del DNA
Apertura de las cadenas (origen de replicación)
Colocacion de los iniciadores (primers de RNA)
Sintesis de la cadena de DNA (partiendo de los iniciadores)
Eliminación de los iniciadores
Unión de los fragmentos de DNA (por la enzima DNA ligasa)
Elementos que se requieren en la sintesis de DNA por PCR
Hebra templado
Iniciador (cebador, primer) secuencia corta de nucleótidos complementaria de la hebra templado.
dNTPs: desoxirribonucleótidos tri-fosfato
DNA polimerasa
Ventajas de PCR sobre otras técnicas
Alta sensibilidadAlta especifidadRapidez
Desvantajas: PROBLEMAS DE CONTAMINACIÓN
Utilidad
Objetivo:
Obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.
.
Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil:
identificar con una muy alta
probabilidad virus o bacterias causantes
de una enfermeda
d
identificar personas (cadávere
s)
o hacer investigac
ión científica sobre el
ADN amplificad
o
Aplicaciones en la investigación básica
Conocimiento de la estructura y función de los genes.
El análisis de los niveles de los distintos ARN mensajeros (ARNm) presentes en una célula.
La técnica PCR puede ser utilizada, en algunos casos, para clonar genes cuya secuencia de bases es desconocida.
Puede ser utilizada para cambiar la información contenida en un segmento de ADN.
Aplicaciones en el diagnóstico médico
Existen métodos de detección por PCR de agentes infecciosos como los virus de las hepatitis B y C, del papiloma humano, de Epstein Barr y citomegálico.
Es posible detectar regiones del genoma del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) a partir de sangre extraída de pacientes seropositivos.
La técnica PCR ha facilitado enormemente el diagnóstico de enfermedades hereditarias como hemoglobinopatías (talasemias y anemia falciforme), la fenilcetonuria, las hemofilias A y B, la deficiencia de alfa 1 antitripsina, la distrofia muscular y la fibrosis quística.
En enfermedades oncológicas pueden detectarse mutaciones de oncogenes.
Se han implementado métodos que utilizan la PCR destinados a la evaluación del riesgo de padecer trastornos autoinmunes, tales como diabetes de tipo I, enfermedad celíaca, pénfigo vulgaris, miastenia gravis y esclerosis múltiple.
Elementos que se requieren para realizar la prueba
Elementos que se requieren para realizar la prueba Son 4
elementos básicos
1) DNA molde
El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento.
La concentración de la DNA molde en la reacción depende de la fuente utilizada.
Se requieren aproximadamente de 300 nanogramos a 1 microgramo de DNA genómico.
2) DNA polimerasa
Es una enzima capaz de copiar una secuencia de nucleótidos.
Inicialmente se utilizaba la DNA polimerasa de Escherichia coli. → inestabilidad térmica
Existe una gran variedad de polimerasas con diferentes capacidades a la hora de trabajar con diferentes temperaturas.
La más habitual es la Taq DNA polimerasa, de la bacteria Thermus aquaticus, → capaz de funcionar a altas temperaturas
Para conseguir una alta fidelidad es común usar la polimerasa Phusion, mucho más cara, pero es más rápida y con menor frecuencia de error.
3) Cebadores o primers
También son conocidos como oligonucleótidos sintéticos iniciadores.
Iniciadores de la reacción
La longitud de los oligonucleótidos es de 15 a 30 nucleótidos.
Su secuencia debe presentar la mayor similitud posible con la secuencia del DNA blanco, ya que de ello depende el éxito y la especificidad de la amplificación.
La complementariedad debe de ser cerca de un 100% en las ultimas 5 a 6 bases del extremo 3’ del oligonucleótido → para asegurar la amplificación.
4) Nucleótidos libres
Desoxirribonucleótidos de trifosfato (dNTPs)
Las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de estos.
Las concentraciones mínimas disminuyen el índice de incorporación errónea de los nucleótidos
Concentraciones muy altas disminuyen la especificidad de la reacción.
Concentraciones entre 20 y 200 μM proporcionan resultados óptimos.
Otros elementos
Buffer: Es una solución específica que magnifica la
actividad de la polimerasa y mantiene el pH adecuado para su funcionamiento, normalmente contiene cloruro de magnesio
.
Iones divalentes:Actuan como cofactores de la polimerasa,
generalmente en forma de cloruro de magnesio (MgCl2).
UtilidadMaterial y Equipo
Equipo:
Termociclador
Materiales necesitamos a nivel
prácticoMicrotubos.MicropipetasPuntas para las micropipetas
Hielo
Material:
Los 4 desoxirribonucleótidos-trifosfato (dNTP).
Dos cebadores o iniciadores.
Iones divalentes. (Mg2+) y (MgCl2).
Iones monovalentes.Una solución tampón o buffer.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas.
ADN molde.
Tipos de PCR
PCR anidada.PCR de extención solapada.
PCR in situ.PCR multiple.PCR con transcriptasa inversa.
UtilidadMaterial y EquipoEtapas de la Técnica
Equipo:
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma:
partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde.
¿Cómo tiene lugar esta reacción? Como veremos a continuación los cambios de temperatura constituyen la base para que se completen los pasos necesarios.
El proceso se lleva a cabo en tres fases
ETAPAS DE LA TÉCNICA
Desnaturalización Hibridación Elongación
En primer lugar es necesario que el DNA se desnaturalice, es decir, que las dos cadenas de DNA se separen. Esta primera fase se conoce como desnaturalización y se lleva a cabo elevando la temperatura a alrededor de 94ºC.
Desnaturalización
Consiste en un descenso de la temperatura para permitir que los cebadores se unan por complementariedad al DNA molde. Temperaturas habituales en esta fase oscilan entre 35 y 60ºC
Especificidad de la reacción.
HIBRIDACIÓN
Por último, en la fase de elongación o extensión, la enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir del extremo 3’ libre de la región en que han hibridado los cebadores. La temperatura a la que se lleva a cabo esta fase depende de la enzima polimerasa empleada; si se utiliza Taq polimerasa la temperatura de elongación suele ser de 72ºC.
Elongación o extensión
.
Únicamente una copia de un pequeño fragmento del DNA molde. En este primer ciclo, los fragmentos generados no tienen el mismo tamaño: la copia de cada una de las cadenas se inicia, a partir del extremo 3’, en el punto en el que el cebador hibrida con el DNA molde y termina en el momento en el que la enzima polimerasa no es capaz de añadir más nucleótidos (es decir, que la nueva cadena formada no tiene un tamaño definido).
¿QUÉ SE HA OBTENIDO TRAS UN CICLO DE PCR?
UtilidadVentajas y Desventajas
VENTAJAS DEL “PCR”
Rapidez y sencillez de uso
La PCR permite clonar ADN en pocas horas, utilizando equipos relativamente poco sofisticados.
Una reacción de PCR típica consiste en 30 ciclos de desnaturalización, síntesis y reasociación.
Cada ciclo dura típicamente de 3 a 5 minutos y se utiliza un termociclador que lleva un microprocesador para programar los cambios de temperaturas y el número de ciclos deseado.
Por supuesto, el diseño y síntesis de los oligonucleótidos cebadores también lleva tiempo, pero este proceso ha sido simplificado gracias a la aparición de programas informáticos para el diseño de los cebadores.
Una vez que se pone a punto, la reacción puede ser repetida de forma sencilla.
VENTAJAS
Sensibilidad La PCR puede amplificar
secuencias a partir de cantidades ínfimas de ADN diana, incluso a partir de ADN contenido en una sola célula.
La elevada sensibilidad ha permitido:
Desarrollo de nuevos métodos para el estudio de la patogénesis molecular
La aparición de numerosas aplicaciones (ciencia forense, diagnóstico, estudios de paleontología molecular, etc) donde las muestras pueden contener muy pocas células.
Sin embargo, el hecho de que el método tenga una sensibilidad tan elevada significa también que se deben extremar las precauciones para evitar la contaminación de la muestra con ADN extraño.
VENTAJAS
Robustez La PCR permite la
amplificación de secuencias específicas de material que contiene ADN muy degradado, o incluido en un medio que hace problemática su purificación convencional.
Esto hace que el método resulte muy adecuado para estudios de antropología y paleontología molecular,
El método se ha empleado con éxito también para la amplificación de ADN de muestras de tejidos fijadas con formol, lo cual ha tenido importantes aplicaciones en patología molecular.
DESVENTAJAS DE “PCR”
Necesidad de disponer de información sobre la secuencia del ADN diana
Para poder construir oligonucleótidos específicos que actúen como cebadores para la amplificación selectiva de una secuencia particular de ADN se necesita:
Disponer de alguna información previa sobre la propia secuencia a amplificar.
La región de interés ya debió haber sido parcialmente caracterizada, a menudo mediante la aplicación de métodos de clonación basados en sistemas celulares.
Tamaño corto de los productos de la PCR
Una desventaja clara de la PCR como método de clonación de ADN ha sido el tamaño de las secuencias de ADN que permite clonar.
La información de que se dispone sobre la mayor parte de secuencias clonadas por PCR sitúa el tamaño de los fragmentos clonados entre 0 y 5 Kb, tendiendo hacia el extremo inferior.
Los fragmentos pequeños se amplifican muy fácilmente, pero conforme aumenta su tamaño -> difícil obtener una amplificación eficiente.
DESVENTAJAS
Infidelidad en la replicación del ADN
La clonación del ADN en células pasa por la replicación del ADN in vivo, proceso asociado a una gran fidelidad de copiado debido a la existencia, en la célula, de mecanismos de lectura y corrección de errores.
Sin embargo, cuando el ADN se replica in vitro la tasa de errores cometidos durante el copiado se dispara.
DESVENTAJAS
Peligro de contaminación
La facilidad con que se amplifica el ADN exige evitar el peligro de contaminación inherente al poder multiplicador de la reacción.
En un tubo en el que se ha realizado una reacción de PCR hay tal cantidad de ADN, que al salir caliente del termociclador y abrir este, el vapor alcanza el ambiente del laboratorio.
Hay peligro de contaminarse con otro ADN incluso puede ser del mismo investigador u otro.
DESVENTAJAS
DESVENTAJAS
Necesidad de primers específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar
La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN
UtilidadMaterial y EquipoConclusión
ConclusiónFinal
La reacción en cadena de la polimerasa o PCR es una técnica fundamental para la mayor parte de las aplicaciones de la biología molecular. Se ha presentado la base teórica y práctica de la PCR. Existen muchas variantes de la PCR convencional, como son la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa [6] (que permite cuantificar la cantidad de producto amplificado) o la PCR por transcripción inversa (mediante la cual se obtiene una copia de DNA complementario, DNAc, utilizando como molde ácido ribonucleico, RNA). Existe gran cantidad de información referida tanto a la PCR convencional como a sus variantes .
Bibliografías
http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/10700/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf
http://www.cobach-elr.com/academias/quimicas/biologia/biologia/curtis/histo/05bio/26.htm
http://www.chlaep.org.uy/descargas/curso_tb_mico_bacterias/reaccion_en_cadena_polimerasa.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2013/ir132d.pdf
http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2010_1/tecnicadepcr.pdf