Amplificación de ADN in vitro

PCR REACCION EN CADENA

DE LA POLIMERASA

María Soledad Depix Docente Escuela Tecnología

Médica UNIVERSIDAD SANTO TOMAS

Clonación acelular

• Elementos genéticamente idénticos entre sí y con su precursor

KARY MULLIS

Premio Nobel de Química 1993

Polimerase Chain Reaction PCR

1983

PCR

• Es una técnica molecular que permite

amplificar selectivamente una región concreta de ADN que puede ser un gen o un fragmento de ADN, de modo que partiendo de cantidades iniciales pequeñísimas (una sola copia) podrían obtenerse varios miles de millones de copias.

• El punto central de la técnica de PCR es la síntesis de ADN desde un punto concreto, repetida durante un número elevado de veces(ciclos). Por lo tanto, hay dos elementos esenciales de la técnica:

• Conseguir que la amplificación se limite exclusivamente a la región genómica de interés

• Utilizar algún tipo de Polimerasa que permita repetir el proceso de síntesis de ADN muchas veces

Amplificación in vitro de DNA

• Herramienta imprescindible en BM, diagnóstico de enfermedades infecciosas, genéticas, medicina forense, determinación de paternidad, criminalística

• El objetivo de esta técnica es amplificar directamente un gen o fragmento de DNA o indirectamente un RNA

• Es requisito imprescindible que se conozca parte de la región a amplificar

La reacción de PCR en 3 pasos:

1. Desnaturalización: 94°C - 96°C separa la doble hélice en 2 hebras sencillas, eliminación

de estructuras secundarias, tiempo depende del contenido de G+C

2. Alineación o hibridación: Los partidores se unen a

sitios específicos en cada hebra del ADN, la temperatura depende de la Tm de los partidores, varía entre 50-65°C

3. Extensión o elongación: 68 - 72°C: La DNA polimerasa

adiciona los nucleótidos, al extremo 3´libre de los partidores, usando como molde la secuencia original

Etapas opcionales de una reacción de PCR

• Desnaturalización inicial

Al inicio de la reacción de PCR, su función es permitir una mejor separación de las hebras de ADN, en particular cuando el ADN presenta varias estructuras secundarias, dura entre 3 a 5 minutos

• Elongación final

Esta etapa adicional permite que los fragmentos amplificados puedan ser completamente extendidos, hasta el tamaño que se quiere amplificar

• Mantención busca mantener la integridad de los fragmentos amplificados, por lo que se agrega un paso final a 4°C

MECANISMO DE LA PCR

En la PCR hay una amplificación exponencial

DNA Molde, diana o blanco

DNA molde o templado

• Homogenizados

• Extractos crudos de tejidos

• Sangre, muestras clínicas en general

• DNA y RNA extraídos

• Mezclas de DNA obtenidos con Enzimas de restricción

• Etc

Componentes de una reacción de PCR

• Se necesitan cantidades mínimas de DNA – Picogramos es suficiente 100 a 200ng

– Se puede detectar 1 sola bacteria (20 fgr de DNA)

• Funciona en mezclas complejas de DNAs

• No requiere purificaciones complicadas

• DNA parcialmente degradado

• INHIBIDORES

DNA molde

Componentes de una reacción de PCR

• Agua libre de nucleasas (estéril)

• Catión divalente (MgCl2) cofactor de la ADN polimerasa 1 a 4 mM

• Desoxinucleótidos (dNTP´s) 20 a 200uM

• Sol. amortiguadora (Buffer 10X) y sales KCl 50 mM

• Oligonucleótidos (Partidores) 0.1-a 0.5uM

• Enzima (Taq Polimerasa)

Desoxinucleótidos dNTP´s

• Son 4 los dNTP´s involucrados en una PCR típica: dATP, dCTP, dGTP, dTTP

• Provee de nucleótidos (base + azúcar + fosfato) a la reacción

para la síntesis de ADN • Se incorporan un ADN molde de manera complementaria

para realizar una copia exacta • Los dNTP´s pueden ser utilizados eficientemente en las reacciones de PCR en forma de: dig-dUTP, biotin-dNTP´s, ddNTP´s, fluorescent-dNTP´s, etc

Sol. amortiguadora y sales para PCR

Consideraciones para el diseño de

partidores para PCR • Longitud de los partidores (usualmente 18-24

nts)

• Temperaturas de fusión Tm similares (usualmente 44-55% G-C)

• Extremos ricos en GC

• Distancia entre partidores (ideal entre 150-500 pb pero hasta 2 Kb)

Partidores

• Se conoce su secuencia • Es el factor mas importante para la eficiencia y la

especificidad del proceso • Deben estar presentes en exceso • Requieren de un cuidadoso diseño

• Reglas de diseño: (a) longitud = 18-25 (b) Contenido de G+C entre 40-60% (c) Evitar las secuencias repetidas (dímeros

de partidor) (d) Valores de Tm de no mas de 5°C uno del

otro

5´GCATTC………………..……………………..ATCGGA 3´

5´GCATTC….…………………………………..ATCGGA 3´

3´CGTAAG………………..…...………………..TAGCCT 5´

3´CGTAAG……………………………………..TAGCCT 5´

TAGCCT 5´

5´GCATTC

DISEÑO DE PARTIDORES

• Pol termoestables: activas a 95ºC

óptimo a 72ºC • No tiene actividad exonucleasa 3´_5´ 1 a 1.25 U en la reacción 100nt/seg. • La enzima Taq polimerasa fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus en 1976 • Esta bacteria vive en ambientes con altas temperaturas, las enzimas que se extraen de ella son termoestables

Taq Polimerasa

Enzimas termoestables

comerciales:

ADYUVANTES DE LA PCR

• Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR.

• Se usa DMSO, glicerol o BSA.

• El adyuvante más utilizado es el BSA. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa

• Condiciones para reacción en el

termociclador:

Desnaturalización inicial

1 ciclo : 94

C por 2.5 minutos.

desnaturalización

94

C por30 segundos

hibridación

54

C por1 minuto

elongación

72

C por 30 segundos los tres pasos

por 32 ciclos

Elongación final 1 ciclo 72

C por 10

minutos

Detección e Identificación

Criterio de Identificación Sistema de detección

Tamaño

Tamaño fragmentos

Tamaño + secuencia sonda Secuencia sonda Secuencia sonda

Secuencia completa

• Electroforesis

• Enzimas de restricción

• Hibridación • Southern • Dot blot • Hibridación en líquido

• Secuenciación

Análisis de la Muestra

• Digestión de los productos amplificados ya que poseen secuencias que son reconocidas por enzimas de restricción.

• Se pueden aislar los productos amplificados y someterlos a Hibridación, (Southern Blot)

• Secuenciación del producto amplificado

Análisis de la Muestra

• La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante electroforesis

• Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución deseada, se utilizaran diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

Análisis de la Muestra

• La posterior visualización se puede realizar con

bromuro de etidio (lámpara de luz UV), tinción

de plata, fluorescencia, radioactividad, sybr

safe Ladder: pesos conocidos

1: Fragmento a 1857 pb

2 y 4: Fragmento a 800 pb

3: No hay producto

5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios)

Hibridación en medio líquido detección en placa

S

B

D D

E

Amplificado

marcado

Pocillo de poliestireno

1.- Hibridación

2.- Inmunodetección

Sustrato

Color

E

La estandarización de una PCR

Ventajas y Desventajas de la PCR

DESVENTAJAS

• Contaminación

• Introducción de una nueva tecnología

VENTAJAS

Alta sensibilidad

Alta especificidad

Poca muestra

Sin purificaciones complicadas

Rapidez

Automatización

¡¡Evitar la contaminación!!

• Contaminación muestra a muestra

– Utilizar material de un solo uso (desechable)

– Utilizar pipetas con filtro

– Abrir los tubos uno a uno

– Utilizar soluciones decontaminantes

– Utilizar controles

Contaminación por producto

amplificado

– Separar FÍSICAMENTE las zonas de extracción de ADN y análisis de amplificados.

– Utilizar material de laboratorio diferente en ambas zonas.

– Evitar protocolos de PCR “nested” – Utilizar métodos de descontaminación

• Luz UV • HCl • Enzimas: Uracil-N-Glycosylase (UNG)

– Utilizar reactivos pre-PCR ya preparados, analizados y conservados en alícuotas.

Controles de la reacción de PCR

• Control de reactivo

• Control negativo

• Control positivo

• Control interno: Competitivo

No competitivo

Materiales para PCR

• Termociclador “Thermo

cycler”

• Microcentrífuga

• Micropipetas de 2, 20 y

200 ul

• Microtubos para “PCR”,

estériles

• Puntas estériles

• Agua destilada,

desionizada y estéril

• ADN molde (ADN en

estudio)

• Partidores

• dNTP’s (dATP, dTTP,

dCTP, dGTP de [25 μM]

c/u)

• 10X buffer para PCR

(Solución amortiguadora

para “PCR”)

• MgCl2 (25 mM)

• BSA

• Polimerasa Taq

TIPOS DE CONTAMINACIÓN

CONTAMINACION

RESUMEN

Diseño de un protocolo de PCR

• Amplificación

– Selección gen-pareja de oligos • Sensibilidad

• Especificidad

– Optimización de PCR • Límite de detección sobre DNA purificado

• Elección método de extracción DNA – Límite de detección en muestras

• Elección método detección de amplificado – Recursos

• Comparación del método de PCR con los métodos clásicos – Fiabilidad del método