Reakční kinetika enzymových reakcí

• studuje časový průběh enzymových reakcí za různých reakčních podmínek

• zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy

- uvažujme monomolekulární přeměnu

S P

např.:

hexosafosfátisomerasa

D-glukosa-6-fosfát D-fruktosa-6-fosfát

Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P]

monomolekulární přeměny S P.

k1 = 0,01 s-1, k-1 = 0 s

-1 pro případ 1 ("nevratná reakce") k1 = 0,006 s

-1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce)

T] [V, . dtν

dcv =v

tt i

i

00olimlim

Definujme „počáteční reakční rychlost“ -rychlost reakce na počátku experimentu, kdy koncentrace produktů je nulová:

αi - stechiometrický faktor - hodnoty pro reaktanty (substráty) reakce dosazujeme jako záporné a pro produkty reakce jako kladné

-definována pouze pro pokusy in vitro, kde jedině lze zajistit nulovou v koncentraci produktů reakce - měření k definovanému objemu roztoku o dané koncentraci [S], přidáme určité

množství enzymu a vhodnou analytickou metodou sledujeme množství vznikajícího

produktu. Rychlost reakce můžeme určit jako směrnici časové závislosti koncentrace

produktu při kontinuálním měření v čase nula. Obvykle necháme reakci probíhat po

určitou dobu, poté ji přerušíme (např. zdenaturováním enzymu) a změříme koncentraci

produktu; počáteční reakční rychlost se pak vypočte jako podíl koncentrace produktu a

příslušného času. NUTNO DÁT POZOR ABYCHOM BYLI DOSTATEČNĚ DALEKO

OD TERMODYNAMICKÉ ROVNOVÁHY (Obvykle přípustný pokles max. o 5 % )

- zanedbáme zpětnou reakci řízenou konstantou k-2

vd P

dt =

[ ] d S

dt

[ ] = -

Cesta k rovnici Michaelise a Mentenové

- enzym: volný (E) a s obsazeným vazebným centrem (ES)

[E0] = [E] + [ES]

kde [E0] značí celkovou koncentraci aktivního enzymu

- substrát volný a vázaný, a pro jeho celkovou koncentraci analogicky platí [S0] = [S] + [ES] (zanedbá se; koncentrace [S] v ES

obvykle nepatrná vzledem ke koncentraci volného [S]

-produkt se u „nevratného“ modelu vyskytuje v jediném ději, kdy vzniká rozpadem komplexu ES;

počáteční reakční rychlost enzymové reakce je proto vyjádřena vztahem:

[ES]2o . = kv

Rychlost vzniku (nebo zániku) komplexu ES je dána součtem rychlostí dílčích dějů:

Za [E] dosadíme [Eo] - [ES] a získáme vztah

Pokud [S] >> [E] je rychlost změny koncentrace komplexu ES výrazně nižší než změna

koncentrace substrátů i produktů. Lze tedy položit časovou derivaci rovnou nule, čímž

po úpravě získáme:

[ES] = k . [E].[S]

k+ k + k . [S]

1 o

-1 2 1

Počáteční reakční rychlost je dána prostým vynásobením konstantou k2 (viz výše), takže

po vykrácení zlomku na pravé straně konstantou k1 získáme vztah:

[S]

[S] . ][E

1

21-

o2o

k

+ kk

. k = v

Závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu

KM – má rozměr koncentrace; je rovna konc. substrátu při Vlim /2; charakterizuje daný enzym za

definovaných podmínek; Nízká hodnota KM - vysoká afinita enzymu k substrátu

Příklad

Při studiu enzymové reakce byly pro následující výchozí koncentrace substrátu změřeny počáteční rychlosti reakce:

S [mol/dm3] 6,25 .10-6 7,5 . 10-5 1,0 .10-4 1,0 .10-3 1,0 .10-2

vo [nmol/dm3 . min] 15 56,25 60 74,9 75

a) Odhadněte hodnoty Km a Vlim.

b) Jaká bude počáteční rychlost při koncentracích substrátu

2,5 . 10 –5 a 5 . 10-5 mol/dm3 ?

Dvojnásobně reciproký výnos – snadné určení Vlim a KM ze získaných dat Jiné metody – software, odhad

0

Další důležité pojmy:

definice limitní rychlosti: Vlim = k2 . [Eo]

= číslo přeměny („turnover number“) = molekulová (molární) aktivita enzymu

Katalytická aktivita enzymového preparátu ( množství aktivního enzymu)

K čemu to? - kupuji enzym (cena za jednotku)

- kolik potřebuji enzymu pro reakci

- koncentrace katalytické aktivity (kat/ml) - klin. biochemie

Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za

definovaných podmínek (pH, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol

(1 mol) substrátu za 1 sec (1 min).

V

Ek k

o

catlim

[ ] 2

- počet molů substrátu, které je 1 mol enzymu schopen přeměnit při saturaci

substrátem za jednotku času = kolik molekul substrátu je za stejných podmínek

schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času

když [E0] = [ES]

Číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu

Závislost v0 na [E] při [S]=konst.

Závislost počáteční reakční rychlosti na pH a teplotě

Allosterický efekt (ze Slovníku Biochemických pojmů; M. Kodíček)

(Z řeckého allós = jiný, stereós = prostor)

- konformační změna v určité části molekuly

biopolymeru vyvolaná jistou změnou v jiné části

molekuly; Touto změnou může být kovalentní

modifikace (např. fosforylace enzymu)

či nekovalentní vazba nízkomolekulárního

či makromolekulárního Efektoru (např. vazba

nekompetitivního inhibitoru na enzym, positivní homotropní allosterický efekt u hemoglobinu,

vyvolání konformační změny membránového receptoru vazbou bílkovinného hormonu apod.).

Allosterický efekt se uplatňuje zásadním způsobem při regulaci biologické aktivity mnoha bílkovin.

- positivní homotropní allosterický efekt (allosterické enzymy)

-hemoglobin – „čestný enzym“

v0

[S]

"Nemichaelisovské enzymy“

http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/biopolymery.htmlhttp://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/fosforylace.htmlhttp://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/enzymy.htmlhttp://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/efektory.htmlhttp://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/inhibitor.htmlhttp://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/hemoglobin.htmlhttp://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/receptory.htmlhttp://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/hesla/hormony.html

vV S

K So

n

n=

.[ ]

+ [ ]

lim

Positivní homotropní alosterický efekt

Hillova rovnice; n - koeficient sigmoidity - čím vyšší má hodnotu, tím více se závislost v0 na [S] liší

od hyperboly a má výraznější tvar sigmoidy. Hodnota n bývá často rovna počtu enzymově aktivních

podjednotek v oligomerním enzymu. Sigmoidita – fyziologický význam; citlivá reakce změny [S].

Konstanta K souvisí s hodnotou [S]½, což je koncentrace substrátu potřebná k dosažení v0 =Vlim/2, vztahem:

v0 na [S] pro enzym kde působí positivní homotropní allosterický efekt hodnoty

a) Symetrický (Monodův). Dva konformační stavy; vysoká/nízká afinita k substrátu. Navázáním

první molekuly substrátu je aktivní konformace stabilizována, schopnost ostatních podjednotek

vázat a přeměňovat substrát se prudce zvýší a na závislosti v0 na [S] - inflexní bod. Přechod z

jedné konformace do druhé je náhlý bez stabilních meziproduktů a všechny podjednotky mají

stejnou konformaci (s vysokou nebo nízkou afinitou); proto symetrický

b) Sekvenční. Přepokládá se zde, že vazba prvního substrátu indukuje v enzymu konformační

změny, které se postupně šíří od jedné podjednotky k druhé a převádějí jejich aktivní místa do

konformace o vyšší schopnosti vázat a přeměňovat substrát.

Dva molekulové modely pro positivní homotropní allosterický efekt

Jakákoliv látka snižující rychlost enzymové reakce, může být považována za inhibitor. Možná je i tzv. - inhibice substrátem: - při velmi vysokých [S] hodnota v0 může klesat (místo aby limitovala k hodnotě Vlim). Substrát je do vazebného centra vázán řadou nekovalentních interakcí. Při velmi vysoké koncentraci substrátu se může do aktiv. centra „tisknout“ více molekul substrátu, přičemž žádná z nich nemá takovou orientaci, aby katalytické skupiny mohly realizovat její chemickou přeměnu.

Inhibice enzymů

[S]

v0

KE I

EII =

[ ].[ ]

[ ]v

V S

KI

KS

o

M

I

=.[ ]

. +[ ]

]

lim

[1

KM´ = , V´lim = Vlim KI

KM

I

. +[ ]

1

Kompetitivní inhibice

Zdroj: http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/images/1cf9e9bb.jpg

Kompetitivní inhibice

KES I

ESII =

[ ].[ ]

[ ]

Akompetitivní inhibice

v

V

I

K

S

K

I

K

So

I

M

I

=

+[ ]

]

+[ ]

]

lim.[

[

1

1

Zdroj: http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/practical_biochemistry/images/me44be66.jpg

Akompetitivní inhibice

Nekompetitivní inhibice

KE S

ES

EI S

ESIS =

[ ].[ ]

[ ]

].[ ]

[ ]

[

KE I

EI

ES I

ESII =

[ ].[ ]

[ ]

].[ ]

[ ]

[

v

V S

I

KK S

o

I

S

=.[ ]

+[ ]

+ [ ]

lim

.1

V

I

KI

lim

([ ]

)1

V´lim =

Nekompetitivní inhibice

Regulace enzymové aktivity

INHIBICE:

- nevratná

- vratná:

a) substrátem

b) kompetitivní (competitive)

c) akompetitivní (acompetitive)

d) nekompetitivní (noncompetitive)

Další typy inhibice: -smíšená -ireverzibilní

Závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu a) neinhibované reakce, b) při kompetitivní inhibici, c) při akompetitivní inhibici a d) při nekompetitivní inhibici

• na úrovni transkripce a translace (konstitutivní a induktivní)

• pomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými

enzymy)

- nevratné (aktivace štěpením peptidové vazby - proenzymy)

- vratné (fosforylace, adenylace...)

• efektory (aktivátory a inhibitory)

- allosterický efekt

Regulace enzymové aktivity

(připomenutí - viz minulá přednáška)

Imobilizace enzymů

Vazba na nosič Zachycení (entrapment)

sorpcí Kovalentní vazbou V matrici gelu Opouzdření

(encapsulation)

Imobilizované enzymy

Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány,

zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně

Využití enzymů → aplikovaná enzymologie

využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk:

průmysl potravinářský a nepotravinářský

klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů)

farmaceutika

Technologicky významné enzymy

Hydrolasy (80%) – 50% proteasy, 50% glykosidasy

Isomerasy GI (12% !)

Oxidoreduktasy – (GOD - analytika)

Ostatní (5 - 7%)

Zdroje technických preparátů enzymů:

Mikrobiální (bakterie a plísně) - extremofilní MO

Rostlinné

Živočišné

Rekombinantní technologie

Příklady

Biodetergenty

(proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy)

Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy)

Mlékárenství (chymosin)

Hydrolýza proteinů

…….

Biotechnologie

Definice?

Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému

nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich

přirozené nebo modifikované podobě.

Přednosti:

surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu

prostředí

Nevýhody:

Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?

Biotechnologické směry

1. Průmyslová mikrobiologie

a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová)

b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity,

biopolymery),

c) Biotransformace

d) Biomasa

2. Průmyslové biotechnologie

3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace)

4. Živočišné biotechnologie

5. Biotechnologie užitkových rostlin

6. Veterinární a medicínské biotechnologie

Regulace enzymové

aktivity