PRACTICA N8

TECNICA DE RECUENTO DE BACTERIAS

SEMESTRE 2012-2

INTRODUCCION

Cuando se va realizar el estudio de cualquier tipo de muestra es importante determinar el nmero de unidades formadoras de colonias que se formaron en la muestra. De igual forma para conocer la capacidad que tiene el microrganismo de reproducirse en un determinado tiempo; para ello existen varios mtodos para determinar el nmero total de unidades formadoras de colonias en una muestra.

MARCO TEORICOMETODO DIRECTO:*RECUENTO POR OBSERVACION AL MICROSCOPIO EN PLACA DEL HEMACITOMETROMETODOS INDIRECTOS:*TECNICAS TURBIDIMETRICAS: Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que incide sobre ellos. La turbidimetria consiste en medir esa cantidad de luz transmitida a travs de la suspensin, para realizar una curva de crecimiento y as visualizar el comportamiento bacteriano en un tiempo determinado, obteniendo una representacin grafica de este crecimiento; normalmente el crecimiento bacteriano se expresa como un aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta es directamente proporcional al numero de bacterias presentes en las suspensin.Absorbancia=2*log% de transmitancia*RECUENTO DE MICROORGANISMOS POR DILUCIONES SERIADAS: Frecuentemente las muestras que hay que estudiar tienen un nmero muy elevado de microrganismos, por lo tanto se requiere diluirlas para poder contarlos. Para ello se realizan diluciones seriadas, que posteriormente se siembran en placas con medio de cultivo; esta tcnica nos permite conocer el nmero de microrganismos viables en una determinada muestra.

OBJETIVOS*Calcular el nmero de unidades formadoras de colonias (UFC/ml de muestra)

MATERIALES*Matraz de 250 ml con 50 ml de caldo nutritivo*bao mara con agitacin*pipetas estriles de 1, 5, 10 ml, solucin salina estril*cultivo de Escherichia coli en agar nutritivo*tubos con 9 ml de agua peptonada estril*esptula de Drigalski o rastrillos*agar nutritivo AN*muestra a analizar

METODOS

PROCEDIMIENTO

1. Tomar un ml de muestra con una pipeta estril y aadir a un tubo de 9 ml de agua peptonada estril. Esta dilucin es 1/ 10 =10^-1 2. se debe agitar el tubo para lograr una buena homogenizacin de la suspensin. De esta forma la muestra se diluyo 10 veces de la muestra inicial3. se debe repetir la misma operacin a partir de la primera dilucin, para conseguir la dilucin de 10^-2, se transfiere al siguiente tubo 1 ml, que da una dilucin 10^-3 y as sucesivamente con el resto de tubos.4. sembrar 3 placas de agar nutritivo, con 0.1 ml de cada una de las tres ultimas diluciones realizadas (3 ,4 ,5). Este inoculo debe extenderse de forma homognea por toda la superficie de la placa, para lo cual se utiliza el rastrillo esterilizado.5. incubar la caja a 37c por 24 horas.6. contar las colonias de las placas que presentan un nmero entre 30 y 300. Un nmero mayor a 300 colonias puede ser excesivo para poder contarlas exactamente.7. calcular con estos datos las UFC/ml de la muestra.

RESULTADOS

Al realizar todo el procedimiento, despus se obtuvieron tres agares nutritivos (EMB) obtenidos de las ltimas diluciones de los tubos: *tubo 3 con una dilucin de 10^-4 dio en el agar una concentracin de 10^-5*tubo 4 con una dilucin de 10^-5 dio en el agar una concentracin de 10^-6*tubo 5 con una dilucin de 10^ -6 dio en el agar una concentracin de 10^-7 hubo un exceso de dilucin al pasar de un tubo al otro por esto se formaron tantas UFCDILUCIONOBSERVADASAJUSTADO

10^-516281628*10^-5

10^-611721172*10^-6

10^-7714714*10^-7

CALCULADO:DILUCIONOBSERVADASUFC/ml

10^-516281.628*10^8

10^-611721.172*10^9

10^-77147.14*10^9

*solucin 10^-5: 1.628*10^8 UFC/ml*solucin 10^-6: 1.172*10^9 UFC/ml*solucin 10^-7: 7.14*10^9 UFC/ml

*solucin 10^-5: es la caja en la que mas unidades formadoras de colonias se pueden observar ya que es la que menos diluida esta.

*solucin 10^-6: en esta caja tambin se formaron bastantes unidades formadoras de colonias, pero un poco menos que la anterior ya que esta mas diluida.

*solucin 10^-7: en esta caja es en la que menos unidades formadoras de colonias se observan porque es la solucin que esta mas diluida.

CONCLUSIONES

* Las diluciones seriadas se realizan con el fin de diluir una muestra muy concentrada para poder realizar el conteo de sus microrganismos.* Cuando se comienza a realizar las diluciones se deben colocar en un vortex para homogenizar la solucin.*La caja de Petri que contiene la solucin mas diluida debe tener la menor cantidad de unidades formadoras de colonias.*La caja de Petri que contiene la solucin menos diluida debe tener la mayor cantidad de unidades formadoras de colonias.*Cuando se forman demasiadas unidades formadoras de colonias se puede dividir la caja de Petri en 2 o 4 cuadrantes y contar las UFC en un solo cuadrante, luego esta cantidad contada se puede multiplicar por 2 o por 4 respectivamente dependiendo si se dividi la caja en 2 o 4 cuadrantes.

PREGUNTAS DE CONSULTA

1. Como se realiza la evaluacin cualitativa de una suspensin bacteriana?R/: Se debe tener en cuenta que si la concentracin es muy alta se requiere diluir la muestra, para un mejor estudio e identificacin de microrganismos y de caractersticas como el aspecto de las colonias, despus de las diluciones se siembra determinada cantidad d las ultimas diluciones en agares nutritivos para poder contarlas 2. Como se calcula el nmero de unidades formadoras de colonia/ml (UFC/ml) en una muestra?R/: De los ltimos 3 tubos se tomaron 0.1 ml de cada uno y se sembraron en 3 agares nutritivos respectivamente, una muestra en un agar despus se dejo incubar para que se desarrollara y creciera el microrganismo a 37c, despus volvimos a ver las cajas ya con los microrganismos y sus colonias all se hizo el conteo y se obtuvo un valor observado de cada dilucin.3. Que utilidad tiene calcular clulas viables, como se expresan los resultados?R/: Las clulas viables son aquellas que tienen la capacidad de multiplicarse en un medio solido formando una colonia el conteo de estas clulas viables sirve para determinar la cantidad de microrganismos que hay en una muestra especifica es decir para identificar que tan contaminada se encuentra; En el caso de alimentos el numero total de clulas viables calculadas, se considera como un indicador de las caractersticas higinicas generales del alimento. 4. Que diferencia se puede presentar al hacer recuento directo de microrganismos y recuento de clulas viables?R/: La diferencia entre estas dos tcnicas esta en que el recuento directo de microrganismos Es una tcnica para determinar el nmero total de organismos de una muestra: Se utilizan cmaras de recuento (cmara de Petroff-Hauser) y visualizacin al microscopio. Este es un mtodo rpido que calcula el nmero total de clulas de una muestra pero no distingue entre las clulas viables (vivas) o no viables (sin vida) y por lo contrario el recuento de clulas viables solo cuenta las clulas que tienen capacidad para multiplicarse o que expresan muy bien su metabolismo.

BIBLIOGRAFIA

http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/3_4_3recuento.htmhttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/recuento-de-bacterias-viables/recuento-texthttp://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/recuento-de-bacterias-viables/recuento-text