REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİI

DR. ONUR YILMAZ

2017

Rekombinasyon: Yenibileşim - yenidenoluşum. Bir molekülün-hücrenin, atasal “wild type” yada ilkin (orijinal) yapısından farklılık göstermesidurumudur.

I - In vivo rekombinasyon

II- In vitro rekombinasyon

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ VE GEN MÜHENDİSLİĞİNİN TANIMI VE UYGULAMA ALANLARI

Rekombinant DNA teknolojisine ilişkin deneysel çalışmalar 1944 yılında genetik bilginin nükleik asitlerde depolandığının bulunması ile başlamıştır.

Rekombinant DNA teknolojisinin gerçek hikayesi 1970 yılında Smith’in mikroorganizmalarda bulunan ve DNA’yı spesifik bölgelerden kesen restriksiyonendonükleaz enzimlerini bulması ile başlamıştır.

1860-1865: Gregor Mendel Bezelye çaprazlamaları iledöllere “gen” geçişini ilk kez ortaya çıkardı.

1953 : Watson ve Crick DNA' nın çift iplikli sarmalyapısı keşfedildi.

1957 : Kornberg DNA polimeraz izole edildi

1966: Nırenberg ve ark Genetik kod çözümlendi.

1967 : Gellert DNA ligaz izole edildi.

Rekombinant DNA Teknolojisinin Gelişimi

1970: Hamilton Smith Restriksiyon enzimlerini (DNA makasları) keşfetti DNA yı belli noktalardan kesebilen enzimler

1972-73: Jackson ve ark : İlk r-DNA molekülü oluşturuldu.

1972-73: Boyer ve ark Gen klonlama tekniğinde plazmidler keşfedildi

1975: Southern hibridizasyon tekniği geliştirildi. "Southern Blot " tekniği.

1975: Kan ve ark: ilk prenatal teşhis

Walter Gilbert, Allan Maxam , ve Fred Sanger ayrı ayrı laboratuvarlarda DNA nınşifresini çözecek DNA baz dizisini ortaya çıkaran “DNA dizileme” metodunu geliştirdiler

1978: Yuet Wai Kan ve Andree-Marie Dozy “restriction-fragment-lengthpolymorphism” (RFLP) yöntemini geliştirdiler

1979: Goeddel ve ark, ilk rekombinant – insülin

1982: Palmiter ve Brinster Transgenik fareler

1982: Spradling ve Rubin Transgenik meyve sinekleri üretildi.

1985-1990: Kary Mullis arkadaşları polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) adı verilen , hızlı DNA klonlaması ve dizi tepitinde önemli bir teknik geliştirdiler

1986: İlk hastalık (kronik granulomatos) geni pozisyonelklonlama ile tayin edildi

1987: Rekombinant hepatit B aşısı üretildi.

1989: ABD de İnsan Genomu Araştırma Ulusal Merkezi kuruldu

1994: İlk transgenik domates satış izni aldı

1993: Stilman ve Hall İnsan embriyosunun klonlanması çalışmaları

1997: Wilmut Koyun klonlanması (Erişkin memeli hücrelerinden)

1998: İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı

2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003) DNA çipleri Farmakogenetikteatılımlar, Kök Hücre - tedavi

REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİNDE KULLANILAN YÖNTEMLER

Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi

DNA nın Klonlanması

DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması

Nukleik asit hibridizasyonu

Genetik Mühendisliği

DNA-RNA MODİFİKASYON ENZİMLERİ

DNA-RNA MODİFİKASYON ENZİMLERİ

DNA/RNA modifikasyon enzimleri, katalizledikleri reaksiyonların tipine göre 4 anasınıfa ayrılabilirler

DNA/RNA Modifikasyon Enzimleri

Nükleazlar Ligazlar PolimerazlarKinaz ve

Fosfotazlar

11

NÜKLEAZLAR

Nükleazlar bir DNA /RNA zincirinde bir nükleotidin sonraki ile bağlantısını,

fosfodiester bağlarını kırarak yıkar. İki farklı tip nükleaz çeşidi vardır:

Ekzonükleazlar (Uçlardan kesim): DNA /RNA molekülünün bir ucundan bir kerede bir

nükleotidi uzaklaştırır. Ekzonükleazlar, uzaklaştırdıkları iplik sayısına göre ayrılırlar.

Endonükleazlar (Dahili kesim): DNA /RNA molekülünde içteki fosfodiester bağlarını

kırar. Endonükleazlar da aynı şekilde sınıflandırılır.

NÜKLEAZLAR

DNA-NÜKLEAZLAR

13

DNAZ-1

İnek pankreasından elde edilir.

DNA’nın hem tek hemde iki ipliğini birden kesebilen bir endonükleazdır.

RNA veya protein saflaştırmasında DNA'yı yok etmek için,

Shotgun sekans ile DNA kütüphanesi oluşturmada,

DNA-protein bağlanma yerlerini haritalamak (DNAse I footprinting).

DNA'nın nick translokasyon yöntemiyle radyokatif işaretlenmesi amacıyla

DNA'nın tek zincirinde kesikler yaratmakta kullanılır.

14

NÜKLEAZLAR

DNAZ-1

EKZONUKLEAZ-III

Çift iplikli DNA'nın 3' uçlarından nükleotitler çıkarır.

Genelde linear DNA moleküllerinin uçlarından farklı miktarlarda kısaltmalar

elde etmek için kullanılır.

Çift iplikli DNA’da 3’5’ yönünde ekzonükleaz akivitesi gösterir.

Tek iplik üzerinde etkili olmaz.

BAL-31

Alteromonas espejiana bakterisinden saflaştırılır,

Hem ekzonukleaz hem de endonükleaz aktivitesi gösterir,

DNA tek iplikli olduğu durumlarda endonükleaz aktivitesi gösterir.

DNA tek iplikli olmadığı durumlarda çift iplikli DNA’yı hem 3’- hem de 5’- yönünde

keser (Ekzonükleaz aktivitesi).

BAL-31

RNA-NÜKLEAZLAR

RİBONÜKLEAZ-A

Pirimidin bazlarında RNA’yı degrede eder.

Bir nükleotitin 5’-riboz ile komsu pirimidin

nükleotitin 3’-ribozundaki fosfat grubu

arasındaki fosfodiester bağından keser.

Genomik ve plazmit DNA hazırlamada,

DNA ve RNA’daki tek baz mutasyonlarının

taranmasında kullanılır.

RİBONÜKLEAZ-H

RNA'yı pirimidin bazlarında keser.

DNA/RNA hibritlerinde eşleşmemiş bazların olduğu noktalarda RNA'yı keserek

mutasyonlarının haritalanması için kullanılır.

DNA izolasyonunda RNA'yı yok etmek amacıyla kullanılır.

cDNA oluştururken RNA primerinin uzaklaştırılmasında,

Oligo(dT) varlığında mRNA’dan poliA kuyruğunun çıkarılmasında kullanılır.

RİBONÜKLEAZ-H

RİBONÜKLEAZ-H

DNA/RNA-NÜKLEAZLAR

S1-NÜKLEAZ

Aspergillus orizae’den elde edilir,

Düşük konsantrasyonda kullanılınca hem DNA hem

RNA'nın tek iplikli halini keser.

Yüksek konsantrasyonda çift iplikli nükleik asitleri

(DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA) keser.

S1-NÜKLEAZ

DNA-DNA veya DNA-RNA hibridlerinde tek iplikli bölgeleri ortamdan uzaklaştırır.

DNA:RNA komplekslerinin haritalanmasında

Tek iplikli uç uzantıları olan DNA parçalarının uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır.

MUNG BEAN NÜKLEAZ

Mung fasulyesi (Vigna radiata) filizlerinden elde edilen tek iplikli DNA veya RNA’ya

özgü bir nükleazdır.

Yapışkan uçlu DNA moleküllerinin uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır.

Dizinin ApN bölgesinde yüksek oranda verim gösterir. CpC ve CpG de verim

oldukça düşüktür.

Tek iplikli DNA veya RNA’ya S1 nükleazdan spesifitesi daha fazla olduğu için tek ipliğe

özgü nükleaz gerektiren çoğu uygulamada özellikle kullanılır.

Çift iplikli DNA’yı küt uçlu yapar.

LİGAZLAR

İki büyük molekül arasında bir kimyasal bağ oluşturarak onları birleştiren bir

enzimdir,

Genelde reaksiyonu sırasında bu büyük moleküllerden birine ait küçük bir

kimyasal grup hidroliz olur.

LİGAZLAR

DNA-LİGAZLAR

31

LİGAZLAR Hücredeki DNA ligazın işlevi, çift zincirli DNA molekülünün tek zincirde meydana

gelen kırıkları tamir etmektir.

Pekçok organizmadan elde edilen DNA ligazlar

çift zincirli DNA’nın iki ayrı fragmentini (3’-OH

ve 5’-P) fosfodiester bağı ile birbirine

bağlayabilir.

DNA LİGAZ

32

T4 DNA LİGAZ

Escherichia coli bakteriyofaj T4 kodlar,

DNA ve RNA’daki 5’-fosfat ile 3’-hidroksil uçları arasındaki fosfodiester bağını katalizler.

Kofaktör olarak ATP ve Mg+2 gerekir.

Hem küt uçlu kesimi hem de yapışkan uçlu kesimi ligasyon yapabilir.

Bu enzim ile

Bir vektöre DNA parçası eklenir.

DNA parçası ile Linker veya adaptör ligasyonu yapılır.

Kısa uzantılı yapışkan uçların ligasyonu düşük sıcaklıkta(4-8 °C) uzun süre içinde (genelde bir gece boyunca) gerçekleştirilir.

5' ucunda fosfat olmayan DNA'ların ligaz tarafındanbirleştirilebilmesi için 5' uçlarının fosforile edilmesigerekir.

Küt uçlu DNA'ların da ligasyonu mümkündür amareaksiyon çok daha yavaştır. Reaksiyon ortamındapolietilen glikol ve 150-200 mM NaCl bulunması DNA moleküllerinin ligasyonunu kolaylaştırır.

T4 DNA LİGAZ

NA molekülünün 3' hidroksil ucu ile bir diğerinin 5' fosfat ucu arasında bir fosfodiesterbağ oluşturmaktır.

DNA sentezi sırasında oluşan Okazaki parçalarının birleştirilmesi, ayrıca DNA tamiri içingereklidir.

ECOLİ DNA LİGAZ

RNA-LİGAZLAR

36

T4 RNA LİGAZ

T4 bakteriyofaj tarafından kodlanan bir enzimdir.

Kofaktör olarak ATP’ye ihtiyaç vardır.

RNA’nın 3’-OH ucuna 5’-fosfat ucunun bağlanmasını katalizler.

RNA-RNA ligasyonu yapabildiği gibi DNA-RNA ligasyonu da yapabilir, ancak yavaş olur.

DNA-DNA ligasyonu oldukça yavaştır ve bu ligasyon çift zincirli nükleik asitleri tanımada başarısız olmaktadır.

POLİMERAZLAR

38

POLİMERAZLAR

İşlevi RNA ve DNA gibi nükleik asit polimerleri ile ilgilidir,

Esas fonksiyonu, mevcut bir DNA veya RNA kalıbı kullanarak, yeni bir DNA veya RNA'nın polimerizasyonudur,

Bir grup başka enzim veya protein eşliğinde, çözeltide bulunan nükleotitleri alırlar ve bir polinükleotit iplikçiğin karşısında yeni bir polinükleotit iplikçiğinin sentezini katalizler.

39

POLİMERAZLAR

DNA-POLİMERAZLAR

41

DNA POLİMERAZ I

Hem ikileşme hem de tamir mekanizması içerir,

Mg+2 iyonuna gerek duyar,

RNA polimerazdan farklı olarak, sentezlediği yeni ipliği sadece nükleotitlerdenbaşlayarak uzatamaz, ancak mevcut bir DNA zincirini uzatabilir.

DNA POLİMERAZ I

43

KLENOW FRAGMENT

DNA nükleotit dizilerinin bulunmasında kullanılan ve ekzonükleaz faaliyetlerinesahip DNA polimeraz I enziminin parçası olan bir proteindir.

Polimeraz I’den farkı 5’3’ yönünde ekzonükleaz aktivitesi gösterir.

44

KLENOW FRAGMENT

Tek iplikli DNA’dan çift iplikli DNA eldesinde,

Küt uçlu DNA parçası yapımında,

Radyoaktif DNA problarının hazırlanmasında,

Dizilemede kullanılır.

45

T4 DNA POLİMERAZ

Tek iplikli DNA’da Klenow fragmentinden çokdaha spesifik 3’5’ yönünde ekzonukleazaktivitesi gösterir,

5’3’ekzonükleaz aktivitesi göstermez,

Güçlü 3’5’ ekzonükleaz aktivitesi ile DNA parçalarının 3’ ucunun işaretlenmesinde,

DNA parçasını küt uçlu yapmada kullanılır.

46

T4 DNA POLİMERAZ

47

T7 DNA POLİMERAZ 5’3’yönünde DNA sentezler,

Çok uzun DNA fragmanlarını sentezleyebilir,

Tek ve çift iplik üzerinde klenowfragmentinden 1000 kat daha güçlü 3’5’ ekzonükleaz aktivitesi gösterir,

Hem ikileşme hem de tamir mekanizmasıiçerir,

5’ overhang DNA’yı keserek o bölgeyi doldurma,

Apoptosiste DNA parçalanmasının belirlenmesi,

Kalıntı genomik DNA’nın ortamdanuzaklaştırılarak halkasal DNA’nın purifiyeedilmesinde kullanılır.

RNA-POLİMERAZLAR

49

T7 RNA POLİMERAZ

DNA’dan 5’3’yönünde RNA sentezler,

Hibridizasyonda,

Genomik DNA sekanslama Için kalıp olarakkullanılır.

50

SP6 RNA POLİMERAZ

Salmonella typhimurium LT2 dan enfekte olan faj SP6 DNA’sının kodladığı birenzimdir.

Template olarak SP6 promotor dizisi, subtsrat olarak NTP içeren çift iplikliDNA dizisinin kullanıldığı 5´→ 3´ yönünde RNA sentezler.

Northern ve southern hibridizasyonunda işaretli RNA problarınınhazırlanmasında,

Invitro translasyon Için RNA sentezinde kullanılır.

SP6 RNA POLİMERAZ

KİNAZ VE FOSFOTAZLAR

53

T4 POLİNUKLEOTİT KİNAZ

T4 bakteriyofajı genomundan kodlanan bir enzimdir.

DNA ve RNA’nın 5’-OH ucuna ATP’nin -fosfat’ının transferini katalizler.

ATP varlığında 5’-OH ucuna fosfat ekler.

ADP varlığında 5’-ucundaki fosfatın koparılmasını sağlar.

DNA ve RNA’nın 5’-ucunun işaretlenmesini sağlar.

Yapay DNA linkerların 5’-ucuna fosfat bağlanmasını sağlar.

DNA veya RNA’nın 5’-ucunun 32P veya 33P ile işaretlenmesinde yaygın olarak kullanılır.

ADP varlığında 5’-ucundaki fosfat grupları ve ATP’nin değiş-tokuş mekanizmasınıkatalizler.

54

T4 POLİNUKLEOTİT KİNAZ

55

BAKTERİYEL ALKALEN FOSFOTAZ

DNA ve RNA’dan 3’- ve 5’- uçlarında bulunan fosfat grubunu ortamdan uzaklaştırır.

Koparılan parçaların tekrar ligasyonunu önlemek amacıyla vektör DNA’nın 5’-fosfat

ucundaki fosfatı koparır.

T4 polinükleotit kinaz ile işaretlemeden önce nükleik asitlerin 5’-ucundaki fosfatın

koparılmasını sağlar.

En etkili alkali ortamda işlev görür.

Sekanslamadan önce PCR ürünündeki degrede DNA’nın temizlenmesinde kullanılır.

56

BAKTERİYEL ALKALEN FOSFOTAZ

Bu enzimler işgalci DNA ‘yı keserek, onu zararsız hale getirirler.

Virüs ve yabancı DNA’lardan bakteriyi korur