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RELATÓRIO DE ESTÁGIO
UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
UNIDADE DE BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL – FACULDADE DE CIÊNCIAS E
TECNOLOGIA, MONTE DA CAPARICA
Efeito da conservação sob atmosferas modificadas na
composição de pigmentos de plantas silvestres.
Setembro de 2007
Ana Lúcia da Silva Gomes
Carla Maria Oliveira Nunes Ferreira
O orientador responsável
Doutor Paulo Renato Costa Figueiredo, Professor associado da universidade
Lusófona de Humanidades e Tecnologias (ULHT) e investigador da unidade de
biotecnologia Ambiental.
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ÍNDICE
Introdução ……………………………………………………………….. 4
Protocolo do Relatório ………………………………………………….. 5
1.Introdução teórica ……………………………………………………... 5
1.1-Vaccinum myrtillus………………………………………………… 5
1.2-Antocianinas………………………………………………………... 6
1.3-Atmosferas modificadas……………………………………………. 8
2.Materiais e Métodos …………………………………………………... 9
2.1-Extracção…………………………………………………………… 9
2.2 –Filtração…………………………………………………………… 10
2.3- Remoção por arrasto……………………………………………….. 10
2.4-Concentração dos extractos………………………………………… 11
2.5-Cromatografia Líquida ou HPLC………………………………….. 12
3.Actividade experimental ………………………………………………. 13
4.Observação ……………………………………………………………. 14
5.Apresentação dos Resultados………………………………………….. 15
6.Discussão dos Resultados / Conclusão………………………………… 17
7.Criticas ………………………………………………………………… 19
8.Bibliografia…………………………………………………………….. 20
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INTRODUÇÃO
Este relatório foi desenvolvido no âmbito do estágio “ Efeito da
conservação sob atmosferas modificadas na composição de pigmentos de
plantas silvestres”, pertencente ao projecto de Ocupação Cientifica dos
Jovens nas Férias criado pela entidade Ciência viva, compreendido entre 3
de Setembro de 2007 e 7 de Setembro de 2007.
O trabalho envolve a colheita das flores, acondicionamento em
atmosfera aeróbia e anaeróbia e análise das antocianinas das flores frescas e
preservadas recorrendo a HPLC-DAD.
Os Alunos envolvidos no projecto:
Ana Lúcia da Silva Gomes
Carla Maria Oliveira Nunes Ferreira
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PROTOCOLO DO RELATÓRIO
1-Introdução teórica:
1.1-Vaccinum myrtillus
Classificação Cientifica
Fig.1- Vaccinum myrtillus
Como o objectivo do trabalho é extrair antocianinas de plantas
silvestres, utiliza-mos o mirtilo uma vez que este possui em grandes
quantidades este tipo de pigmento.
O mirtilo, também conhecido como arando ou uva-do-monte
(Vaccinum myrtillus) é um arbusto que pertence à família Ericaceae
(família da azálea). As plantas são arbustos de pequeno porte que crescem
em sub-bosques de florestas temperadas na Europa. Vive em Portugal em
regiões nas quais o inverno é rigoroso, porque necessita em média de 500
horas anuais de temperatura entre os 10º e os 12º centígrados, daí a enorme
dificuldade em cultivá-lo na maior parte do território, é na zona do médio
Vouga, no vale do Rio Vouga que se encontra o local ideal para a produção
deste fruto, nos concelhos de Oliveira de Frades, Sever do Vouga, Águeda
e Albergaria-a-Velha, sendo Sever do Vouga o que reúne as melhores
condições.
Reino Plantae
Divisão Magnoliophyta
Classe Magnoliopsida
Ordem Ericales
Família Ericaceae
Género Vaccinium
Espécie V. myrtillus
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Uso medicinal
Fortalecimento das paredes das artérias;
Previne a destruição do colagenio;
Prevenção de varizes;
Rico em antocianinas daí a sua eficácia no combate aos radicais
livres;
1.2-ANTOCIANINAS
O que são as antocianinas?
Existem três grandes Famílias de pigmentos que dão cor ás plantas:
as clorofilas, os carotenóides e os Flavonóides.
As Antocianinas constituem o maior grupo de Flavonóides
responsáveis pelas cores ciânicas que vão desde o rosa passando pelo
vermelho e violeta até ao azul da maioria das flores, frutos e folhas das
angiospérmicas.
Quase todos os polifenóides absorvem radiação na banda do
ultravioleta, no entanto as antocianinas são o único sub grupo dos
polifenóides que absorvem radiação na banda do visível.
As Antocianinas são armazenadas no vacúolo das células da planta, e
são responsáveis pela pigmentação das plantas e frutos.
Para obtermos uma porção de antocianinas são necessários muitos
meios e múltiplas técnicas de purificação, tornando-se desvantajoso quando
se pretendo produzir à escala industrial.
Das Antocianinas glicosiladas conhecidas, só seis delas (a
pelargonidina, a delfinidina, a cianidina, a petunidina, a malvinidina e a
peonidina) se encontram mais frequentemente nas plantas. A que existe em
maior quantidade nas folhas das plantas é a cianidina-3 - glicosilada, que
lhes confere o aspecto avermelhado.
Fig.2- Estrutura química da cianidina-3-
glicosilada
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Qual a sua estrutura?
As antocianinas são constituídas por três anéis benzénicos, um grupo
hidróxido e açúcares (as glicosiladas).
Num meio ácido existe predominantemente o catião flavilio, na sua
forma estável, apresentando a solução uma coloração estável
(avermelhado).
Num meio neutro existe a perda de protões, apresentando uma
coloração roxa escura.
Num meio básico fica na sua forma aniónica e instável devido á
perda de protões e a quebra dos anéis de benzeno pelo OH- da água, e a cor
vai se alterando e clareando ( azul - amarelo - incolor).
Fig.3- Estrutura química da Antocianina.
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Quais as suas aplicações?
Têm havido, nos últimos tempos um maior interesse na produção de
antocianinas devido ao seu potencial como suplemento alimentar para os
seres humanos e na produção de corantes alimentares naturais a fim de se
substituir os corantes sintéticos, uma vez que os corantes produzidos
através de processos naturais são mais saudáveis, seguros e podem dar
origem a uma grande gama de cores.
As antocianinas e outros polifenóides existentes em frutos, vegetais,
vinhos possuem propriedades que contribuem para a redução do risco de
desenvolvimento de doenças crónicas, como o cancro, doenças
cardiovasculares, doença de alzheimer, dando também um contributo na
inibição de vírus e como antioxidante desempenha um papel importante na
prevenção de doenças provocadas pela oxidação.
No entanto, sempre que ocorre uma mudança de pH ou
temperatura as antocianinas tornam-se instáveis, essa instabilidade torna-se
assim o maior obstáculo das antocianinas face à sua aplicação na indústria
alimentar.
1.3-O que são atmosferas modificadas?
Durante esta actividade experimental iremos submeter amostras de
uma solução com antocianinas a dois tipos de atmosferas de modo a
verificar os efeitos sobre o pigmento.
Na atmosfera anaeróbia é retirado da amostra o oxigénio através de
remoção por arrasto sendo este gás substituído por azoto.
Na atmosfera aeróbia não lhe foi retirado nenhum fluido (gás), uma
vez que durante a preparação houve a entrada de oxigénio.
É necessário termos a noção do que são a s atmosferas modificadas
uma vez que durante a nossa actividade experimental pretendemos observar
o efeito da oxidação pelo oxigénio na conservação das antocianinas.
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2-Materiais e métodos:
2.1-Extracção:
Materiais:
Água destilada
Etanol
Mirtilo
Balão erlenmyer
Agitador magnético
Barra de agitação
Papel de alumínio
Procedimento:
Iniciamos a preparação do solvente, onde misturámos etanol e água
numa proporção volumétrica de (50:50, v/v), onde colocámos umas bagas
de mirtilo e uma barra de agitação para auxiliar na extracção das
antocianinas, deixando a solução envolvida em papel de alumínio (para
evitar a foto-oxidação) durante cinco horas.
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2.2-Filtração:
Materiais:
Bomba de vácuo
Kitasato
Membrana de celulose Millipore tipo GV, 0.22 m
Funil de filtração
Membrana de celulose Millipor tipo Millex-HV 0.45 m
Procedimento:
Vertemos a solução de água + etanol + mirtilo para o funil de
filtração ligámos a bomba de vácuo fazendo-se passar a solução pela
membrana de celulose de modo a filtrar as impurezas.
Depois da solução já filtrada passámos com a pipeta de Pasteur uma
porção de solução para uma seringa com uma membrana de celulose
filtrando novamente a solução antes de ser introduzida nos Vial (Frascos
de pequenas dimensões próprios para injecção na coluna de
cromatografia).
2.3-Remoção por arrasto: Substituição de oxigénio por azoto
Após a purificação da solução retirámos duas porções desse fluido que
introduzimos em dois frascos vial. Um deles foi
submetido a uma atmosfera anaeróbia onde foi
removido o oxigénio por arrasto sendo este
substituído por azoto (essa substituição ocorre devido
á diferença de pressão entre os dois gases), e o outro
frasco manteve-se em atmosfera aeróbia.
Fig.4-As duas amostras obtidas
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2.4-Concentração dos estratos:
Material
Evaporador Rotativo
Procedimento
Para tornar uma porção da solução previamente filtrada mais
concentrada utilizámos o evaporador rotativo, aparelho que permite
evaporar solventes a baixa temperatura e recorrendo a baixa pressão (T =
40ºC).
Depois de definirmos uma temperatura para a água de aquecimento
da solução (T=40ºC), verificámos se o aparelho estava sob baixa pressão e
colocámos o balão com a solução para concentrar. Após sujeitar a solução a
estas condições o etanol, sendo o mais volátil dos solventes, será o primeiro
a evaporar e posteriormente evaporar-se-á a água, obtendo assim uma
solução mais concentrada do que a inicial, da qual retirámos uma porção e
encerrámos num Vial.
Fig.5-Evaporador Rotativo
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2.5-Cromatografia líquida ou HPLC (High Performance Liquid
Chromatography)
A cromatografia é um processo de separação físico-química, cuja
aplicação permite a análise qualitativa e quantitativa duma amostra.
Condições cromatográficas:
O fluxo (velocidade de passagem dos solventes ao longo do
tempo).
A percentagem de diluentes.
A cromatografia líquida é uma técnica que utiliza como fase móvel
um solvente ou mistura de solventes e como fase estacionária um material
polimérico. A amostra é injectada sob a forma de uma solução.
A fase móvel é então bombeada a alta pressão para o interior da
coluna onde se processa a eluição dos componentes da solução. A
separação cromatográfica ocorre porque diferentes moléculas têm
diferentes solubilidades na fase móvel e diferente afinidade para a fase
estacionária. Assim, serão eluidas em primeiro lugar as moléculas com
mais afinidade para a fase móvel e em último lugar para moléculas com
mais afinidade para a fase estacionária.
Fig.6- HPLC
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3-Actividade Experimental
As amostras obtidas: a concentrada, e as outras duas amostras uma
conservada em ambiente aeróbio e outra em ambiente anaeróbio foram
analisadas no aparelho de HPLC, Spectra Systems com detector de vector
de iodos UV6000LP (Grupo Thermo Electron). A recolha de dados e a sua
análise foi efectuada utilizando o software Finnigan Xcalibur 1.4.
A coluna de fase reversa utilizada foi uma C18 5 ODB (250 x 4.6 mm,
tamanho de partícula 5 m Interchim Uptisphere, Montluçon, France).
A evolução das amostras obtidas foi seguida através de cromatografia
líquida (HPLC) de acordo com Corrales et al.1
Foram usadas duas fases móveis desigadas por A e B. Ambas as fases
móveis são formadas por água, ácido fórmico e acetonitrilo, no entanto
estes constituintes estão em proporções diferentes em cada fase móvel:
A- 87:10:3 v/v/v respectivamente.
B- 40:10:50 v/v/v respectivamente.
Utilizámos como fases móveis as substâncias a cima referidas porque
estamos a trabalhar com amostras de substâncias hidrossoluveis, para
manter o ph constante ao longo da análise e para compensar o facto da água
ser um solvente agressivo para a coluna, respectivamente.
O gradiente de eluição usado foi de 10 para 25% B (10 minutos), 15
% B (3 minutos), de 15 para 25% B (7 minutos), 25 para 55% B (30
minutos) de 55 para 100% B ( 1 minuto), 100% B ( 5 minutos), de 100 %
para 10% B (0.1 minuto).
O fluxo foi de 1.0 ml/min e o volume de injecção das amostras foi de
20 l .
Fig.7- HPLC
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4-Observações:
No início da actividade experimental elaboramos três soluções: uma
solução de água + etanol + mirtilo, que abordámos anteriormente. As outras
soluções elaboradas foram uma constituída por metanol + ácido clorídrico
+ perpétuas rochas (solução 1), e a outra constituída por metanol + ácido
clorídrico + mirtilo (solução 2). Ambas foram sujeitas a agitação magnética
de modo a serem extraídos os pigmentos.
Após a extracção dos pigmentos ambas as soluções apresentavam
uma coloração avermelhada, no entanto a solução 1 continha betalaínas
(pigmentos existentes em espécies mais características e menos frequentes
na natureza; tem um estrutura azotada, e existem duas espécies principais
as betacianinas, de coloração amarelada, e as betaninas , de coloração
roxa/avermelhada) enquanto que a solução 2 continha antocianinas. Isto é
comprovado uma vez que a solução 1 não alterava a sua coloração quando
lhe eram adicionadas soluções ácidas ou básicas, já na solução 2 verificava-
se uma alteração da cor quando se alterava o pH.
Na solução 2 quando se adicionava uma solução ácida a cor ficava
avermelhada (e estável), quando se tinha uma solução neutra a cor era rosa
claro, e quando se adicionava uma solução básica a cor variava entre os
verdes e os amarelos até ficar incolor.
Portanto quando há presença de betalaínas numa solução, como na
solução 1, mesmo que se faça variar os valores de pH a coloração da
solução mantém-se estável. Quando na presença de antocianinas, como na
solução 2, a coloração varia conforme o pH, não sendo por isso estável.
Fig.8- Coloração obtida quando se fez variar o pH fig.9- Soluções 1 e 2
dos estratos preparados inicialmente respectivamente
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5- Apresentação dos resultados
Fig.10 - Cromatograma da amostra em atmosfera aeróbia
Fig.11-Cromatograma da amostra em atmosfera anaeróbia.
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Fig.12 – Espectro de absorção da amostra em atmosfera anaeróbia
Fig.13 – Espectro de absorção da amostra em atmosfera aeróbia.
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6-Discussão dos resultados /Conclusão
Foram observados, tanto na amostra em atmosfera aeróbia, como na
amostra conservada em atmosfera anaeróbia, dez picos que correspondem a
dez espécies de antocianinas.
Ao analisar os cromatogramas e espectros de absorção foi conferido
especial interesse aos três primeiros picos dos gráficos, uma vez que tem
um comportamento semelhante e por serem os mais intensos contribuem
mais para a estabilidade da cor da amostra.
No cromatograma:
No gráfico da amostra em atmosfera aeróbia verificou-
se um decréscimo proporcional da intensidade dos picos
ao longo do tempo devido á acção do oxigénio, dado
que se tentou minimizar a acção da luz e da temperatura.
Existiu oxidação das antocianinas presentes na amostra.
No gráfico da amostra em atmosfera anaeróbia não se
verificou uma redução significativa da intensidade dos
picos, logo podemos deduzir que não ocorreu oxidação.
NOTA: É de notar que o sistema de desarejamento pode não ter sido
o mais apropriado podendo ter interferido nos resultados finais, uma vez
que pode ter havido retenção de oxigénio na amostra.
Nos espectros de absorção:
No gráfico da amostra em atmosfera aeróbia houve uma
redução da intensidade dos picos, uma vez que o
oxigénio oxidou as antocianinas.
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No gráfico da amostra em atmosfera anaeróbia,
verificou-se um ligeiro aumento da intensidade dos
picos, no entanto isso deveu-se apenas a ligeira
diminuição do volume da solução e consequente
aumento da concentração, mas este aumento não é muito
significativo, Sendo o mais importante o facto de não ter
ocorrido uma diminuição acentuada da intensidade tal
como ocorreu no gráfico da atmosfera anaeróbia.
CONCLUSÃO:
Através da observação e discussão dos resultados obtidos
podemos concluir que a conservação das antocianinas para posterior
utilização é mais eficaz se for feita em ambiente anaeróbio pois este
protege ou evita a degradação dos pigmentos, o que não acontece na
presença de oxigénio, pois verifica-se uma oxidação e consequente perda
de cor ao longo do tempo.
Assim no nosso entender, deveríamos apostar na produção e
utilização de corantes naturais uma vez que estes são mais saudáveis
relativamente aos corantes sintéticos e desenvolver técnicas de produção
destes pigmentos em meio anaeróbio uma vez que é deste modo em que
estes se conservam e não apresentam qualquer tipo de degradação e ainda
apostar no estudo das antocianinas como contributo ao nível da saúde.
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7- Criticas
Após a elaboração desta actividade laboratorial podemos verificar
que foram ocorrendo determinadas “falhas” que podem ter condicionado os
resultados observados e conclusões obtidas, tal como não ter havido um
controlo rigoroso da atmosfera anaeróbia; a actuação dos factores da luz e
temperatura sobre as amostras que poderá ter afectado os resultados; o
facto dos extractos não ter sido completamente purificada e ainda o facto
da experiência se ter desenrolado num espaço de tempo relativamente curto.
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8-Bibliografia
>1 Corrales , M . et al . Extraction of anthocyanins from grape by-
products assisted by ultrasonics , high hydrostatic pressure or pulsed
electric fields: A comparison. Innovate Food Science and Emerging
Tecnologies (2007), doi:10.1016 / j.ifset.2007.06.002
>Faria ,Ana et al .Antioxidant Properties of Prepared Blueberry
(Vaccinium myrtillus) Extracts. Journal of Agricultural and Food
Chemistry(2005).Americam Chemical Society 10.1021/jf0511300.
Published on web 07/23/2005
>Manetas,Yiannis . Why some leaves are anthocyanic and why most
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Department of Biology , University of Patras, GR -26500 Patras Greece .
2005 Elsevier GmbH. doi:10.1016/j.flora.2005.06.010
>Brouillard,Raymond et al . Phytochemistry of Fruit and Vegetable-
Molecular ineractions of phenolic compounds in relation to the colour of
fruit and vegetables. Proceedings of the Phytochemical Society of Europe.
Clarendon Press , Oxford .1997
>M.Andersen, Oyvind and Jordheim ,Monica.Chapter 10 in
Flavonoids :Chemistry,Biochemistry and applications,(eds.O.M.Andersen,
K.R.Markhom) .2006,CRC Press. Boca Raton,USA
>www.scirus.com
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