DANIELA ALARCÓN BOLÍVAR

ANÍBAL CABRALES LÓPEZ

MEDICINA

UPB-2014

INTRODUCTION

Chronic lymphocytic leukemia is the most common type in adults. There is a defect in receptor signaling B cells, specifically in the BTK

A therapeutic advance is the development of antagonists such as ibrutinib. This seems to be more effective compared to other as imatinib for have different properties.

The administration of these drugs can cause mutations, which generate resistance.

INHIBIDOR

• Ibrutinib is an irreversible enzyme inhibitor of BTK, that binds to the site C481 and has been shown to have clinically significant activity in patients with relapsed CLL.

• Ibrutinib promotes apoptosis, inhibits proliferation, and also prevents the survival of tumor cells, inactivating the enzyme BTK.

BRUTON'S TYROSINE KINASE

• The BTK is necessary for the development, differentiation and signaling of B lymphocytes, alteration is associated with two diseases, X-linked agammaglobulinemia and chronic lymphocytic leukemia.

• It acts by phosphorylating the enzyme PLC Gamma 2

• It has an important immune function, in immune innate and adaptive system

OBJETIVO GENERAL

• IDENTIFICAR LA RESISTENCIA AL INHIBIDOR IBRUTINIB ASOCIADA A MUTACIONES EN DIFERENTES ENZIMAS COMO LA BTK Y LA PLC GAMA 2 EN LA LEUCEMIA LINFOCÍTICA CRÓNICA.

MATERIALES Y MÉTODOS

• AISLAMIENTO DE DNA HUMANO:

1. Lisis celular de GR y nuclear de GB

2. Tratamiento con RNAasa (opcional)

3. Precipitación de proteínas

4. Precipitación de DNA

5. Almacenamiento de DNA con TE (TRIS y EDTA)

Extraído de esta forma el DNA puede ser evaluado en diferentes pruebas moleculares.

MATERIALES Y MÉTODOS

SECUENCIACIÓN DEL DNA: Existen diferentes tipos

• Maxam-Gilbert: está basado en la transformación química del DNA y la separación de bases específicas.

• Terminación de la cadena: fue desarrollado por Sanger. Se basa en la formación de una nueva cadena de DNA con didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs) mediante la actividad de una DNA polimerasa

• Ion Torrent: está basada en la detección de los iones de hidrogeno generados en la polimerización del DNA, utiliza polimerasas naturales por tanto la reacción ocurre en tiempo realSe extrajo el ADN a partir de células criopreservadas. Se analizaron: BTK y PLCγ2

Permite conocer la secuencia de nucleótidos de un fragmento de DNA

Permite detectar cualquier mutación en un gen determinado y establecer el perfil alélico de un individuo

Se aplica en la caracterización e identificación del genoma humano

MATERIALES Y MÉTODOS

PCR:

• Desnaturalización del DNA para dar hebras sencillas: calentamiento

• Alineamiento: Hibridación específica de la hebra sencilla con primer y DNTp’s

• Síntesis: replicación de la hebra sencilla por una DNA polimerasa a partir de un primer como cebador

Para realizar la PCR se necesita principalmente:

DNA Plantilla

Primers que hibridan con regiones específicas conocidas como DNA

DNT’ps

DNA polimerasa

Su objetivo es la amplificación directa de una secuencia de DNA o indirecta de una de RNA.

Algunas funciones: Clonación Secuenciación Plimorfismos mutaciones

MATERIALES Y MÉTODOS

• TRANSFECCIÓN: técnica empleada para introducir fragmentos de DNA adicional en células de mamíferos mediante plásmidos, virus u otras herramientas para la transferencia.

- Electroporación

- Liposomas: se fusiona con la membrana e introducen el material

Transitoria: el DNA fransfectado al no ser insertado en el genoma se pierde en la mitosis

Estable: se debe añadir un gen que proporcione una ventaja adaptativa, como la resistencia. Una porción de las células transfectadas va a transferir a su genoma DNA exogeno

Permitir la introducción de ácidos nucleicos en el interior de las células, esto ha permitido en gran medida ampliar los conocimientos acerca de la regulación génica

MATERIALES Y MÉTODOS

ENSAYO ENZIMÁTICO INVITRO

• Se utilizaron células HEK (Células embrionarias humanas) que expresaban EBNA (Epstein-Barr Nuclear Antigens)

• Las proteínas fueron purificadas por cromatografía de afinidad, esta permite separar mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando.

• Las proteínas purificadas fueron utilizadas en el ensayo enzimático de quinasa: ensayo químico para medir actividades enzimáticas. Permite conocer la cinéticas enzimáticas y la inhibición enzimática.

Sustrato consumido o producto generado.

MATERIALES Y MÉTODOS

• CITOMETRIA DE FLUJO: permite analizar una población de proteínas en una muestra donde hayan diferentes poblaciones, además brinda, analiza y correlaciona diferentes datos como tamaño celular. Es de gran especificidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

• INMUNOBLOT:

1. Separación de proteínas por electroforesis en gel SDS-PAGE según su tamaño

2. Transferencia a un filtro con anticuerpos

3. Se evidencia cual contra cual proteína está dirigido el anticuerpo

En la práctica clínica se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas como el VIH.

RESULTADOS

RESULTADOS

DISCUSSION

CONCLUSIONS

1. The ibrutinib is the most important irreversible BTK inhibitor and is relevant for treating CLL and many others cancers.

2. The c481s mutation in BTK confers relative resistance to ibrutinib by preventing irreversible binding.

3. The resintance of irreversible BTK inhibitors is give through mutation of a cysteine residue in a binding site.

4. When the acts ibrunitib, inactive kinase and induces apoptosis of cells with CLL

BIBLIOGRAFÍA

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• MARTÍNEZ SÁNCHEZ LINA MARÍA… [Y OTROS]. 2012. 7ª ED. LIBRO DE CLASE. BIOLOGÍA MOLECULAR. EDITORIAL UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA. MEDELLIN.

Daniela Alarcón B.