Research Collection

Doctoral Thesis

Therapeutic protein formulation for sustained deliveryformulation aspects and stability

Author(s): Gietz, Ursula Margrit

Publication Date: 1997

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-001827531

Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted

This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For moreinformation please consult the Terms of use.

ETH Library

DfeaETH ex. 13 '0. Okt. 1997

Diss. ETHNr. 12177

Therapeutic protein formulation for sustained

delivery: Formulation aspects and stability

A dissertation

submitted to the

Swiss Federal Institute of TechnologyZurich

Presented byUrsula Margrit Gietz

Pharmacist

born on February 14,1967

Citizen of Switzerland

Accepted on the recommendation of

Prof. Dr. H.P. Merkle, examiner

Dr. T. Arvinte, co-examiner

Dr. A. Drake, co-examiner

3

Abstract

The subject of this thesis is the preparation, characterization and

optimization of slow release formulations of recombinant protein drugs.

The major focus is on recombinant hirudin (rHir), an anticoagulant protein

of 65 amino acids, which was shown to precipitate with zinc salts to form

Zn-rHir suspensions with prolonged activity in rats (Arvinte, 1994). Both

formulation and stability aspects will be addressed. Preliminary data will

also be presented on TGF-P3, a transforming growth factor. Here the

subject is the validation of a crystalhzation process.

Formulation of Zn-rHir suspensions. At given rHir and zinc salt

concentrations, a maximum yield of pelletable rHir (obtained by

centrifugation) was reached at pH 7.1. A precipitation curve was obtained

when the percentage of pelletable rHir was plotted versus die molar ratio

of zinc to rHir. The highest precipitation efficiency of 100% pelletable

rHir was observed at a zinc to rHir ratio of 28. Electron microscopic

investigations of such Zn-rHir suspensions typically revealed 20 nm-

particles as the smallest observed unit. Upon light microscopy,

agglomerates of up to 200 um were obtained and are suggested to consist

of agglomerates of the 20 nm-particles. Concerning me efficiency of

precipitation, ZnCh, Znfc, ZnBft, and ZnN03 resulted in similar sigmoidal

precipitation curves and stable Zn-rHir suspensions. The precipitation

efficiency of ZnSC<4 was much lower, and aged ZnSQt-based Zn-rHir

suspensions showed an almost rHir-free pellet. These phenomena were

concluded to be due to me low concentration (1.5 mM) needed for a

ZnSCU solution to form basic zinc sulfate as compared to the higher

concentrations required witii die omer zinc salts to form their basic salts

(> 40 mM) (chapter I).

Zn-rHir release studies. To investigate die release of

peptides/proteins from formulations such as me Zn-rHir suspensions, an in

vitro model was set up. In 5 mL glass vials, die formulations were

suspended in agarose gel (2%) and coated with an extra layer of protein-

free agarose. The two agarose layers were topped widi receiver solution

4

where the released protein was analyzed at given time intervals. The in

vitro model was validated witii commercial (fast, intermediate, and slow

acting) insulin formulations, and a good correlation witii die biological

activity in humans was obtained. For rHir formulations, fastest release was

observed widi aqueous rHir solution, followed by a Zn-rHir suspension

witii 76% pelletable rHir, and slowest release was found for die Zn-rHir

suspension with 100% pelletable rHir. Good discrimination of die release

profiles was only observed in HEPES buffer whereas phosphate buffer and

serum were unable to discriminate between die various insulin and rHir

formulations, indicating an interaction of die formulations with diese

receiver solutions (chapter II).

Chemical stability of rHir. The chemical degradation of rHir

investigated under various conditions is discussed in chapter III. For tiiis

purpose, first Asn and Asp related chemical degradation in peptides and

proteins is reviewed (chapter III.1). Deamidation at Asn and isomerization

at Asp residues occur via a succinimide intermediate. At slightly acidic

pH, die rate determining step in die deamidation and isomerization

reaction is die hydrolysis of die succinimide ring; at neutral to basic

conditions, succinimide formation is rate-limiting. Asn and Asp are most

labile when followed by Gly. The effects of buffer species and ionic

strength on diese degradation reactions are not yet fully clear. A major

determinant of Asn and Asp related degradation in peptides and proteins,

however, is die higher order structure witiiin die molecules. Rigid higher

order structures hinder die degradation in comparison to flexible structures

(chapter m.l).

The major degradation products of rHir are the succinimides at Asp33-Gly34 (Q5) and Asp^-Gly54 (Q4) in acidic solution or after multiple

lyophilization (Grossenbacher et al., 1993). To get further information

about die degradation kinetics and mechanisms of rHir over the full pH

range (pH 1.0 - 9.5), two different capillary electrophoresis (CE) metiiods

were used. One metiiod involved die determination of die degradation

kinetics on die basis of rHir itself; die odier metiiod involved die

quantitation of Q4 and Q5 separately. High rates of rHir degradation were

5

observed at strong acidic and alkaline pH's, whereas the stability optimum

was obtained around neutral pH. At slighdy acidic conditions (pH 3 - 5),

Q4 and Q5 were die major degradation products whereas at neutral to

alkaline pH values, Q4 and Q5 were undetectable. At neutral pH, peaks

suggested to represent isomerized and/or deamidated analogs became

apparent. At alkaline pH, a strong decrease in the total peak area was

observed probably due to die polymerization of rHir via S-S bonds. When

degraded at pH 4.0, twofold higher Q4 man Q5 concentrations were

observed, which can be explained by Q4 being formed in die highly

flexible Gln49-Gln65 C-terminal tail, whereas Q5 forms in die less flexible

Gly31-Lys36 loop consisting of only 6 amino acids (chapter M.2).

The degradation of rHir in a Zn-rHir suspension was also investigated

by CE. Arrhenius-type studies (at 50, 40, 30, and 25 °C) involving die Zn-

rHir suspension and an aqueous rHir solution for comparison resulted in

activation energies of 26.3 and 24.9 kcal/mol, respectively. Improved

stability of rHir in the Zn-rHir suspensions versus aqueous rHir solution

was obtained and documented as die shelf-lives (t 90%, 95% confidence

limit) of 23 versus 3 days at 25 °C, and of 292 versus 147 days at 4 °C,

respectively. Degradation of rHir in die Zn-rHir suspension resulted in

markedly lower Q4 levels as compared to Q5, whereas in aqueous rHir

solution only slighdy lower Q5 tiian Q4 levels were observed. This

observation, coupled witii die fact tiiat a typical rHir degradation found in

aqueous solution is missing in die Zn-rHir suspension (probably die

isoAsp53 analog), led to die proposal tiiat zinc specifically inhibits Q4

(Asp53-Gly54) formation and die subsequent isomerization to isoAsp53

(chapter ni.3).

Strategies to stabilize rHir in aqueous solution and in die lyophilized

state were also addressed. In solution, high concentrations (15 -50%) of

non-reducing sugars and sugar alcohols showed a stabilizing effect or no

effect, whereas reducing sugars destabilized rHir, potentially due to die

Maillard reaction. In the lyophilized state, trehalose and sucrose stabilized

rHir as compared to mannitol, possibly due to an amorphous state of

trehalose and sucrose when lyophilized, instead of die crystalline state of

mannitol. The pH of die solution prior to freeze-drying was critical. A

6

solution pH ~7 resulted in more stable powders tiian starting with pH ~4.

Impoved stability of rHir in die solid state was observed when potassium

instead of sodium phosphate-citrate buffer was used for lyophilization.This is suggested to be due to a lower pH shift during freezing of the

potassium compared to die sodium buffer. The use of various metal salts

as excipients resulted in more stable powders when calcium and

magnesium salts were chosen. Botii, die formation of Q4 and Q5 were

suppressed when CaCh was used as an excipient to lyophilize rHir. This

suppression of die Q4 and Q5 formation is suggested to be due to an

interaction of die metal ion witii die labile Asp33-Gly34 (Q5) and Asp53-Gly54 (Q4) sites (chapter ffl.4).

TGF-p3 crystallization. Finally, crystallization of TGF-P3, a tissue

growtii factor, was evaluated witii respect to its potential to form slow

release formulations. A scale up from die hanging drop metiiod (4 uL) to a

batch method (2 mL) was performed. Seed concentrations were found to

critically influence crystal sizes A dioxane concentration between 10 and

15% in die medium was required for crystalhzation. Further progress in

the use of TGF-P3 crystallization for slow release purposes will require

biological activity and stabiliy tests witii such crystals.

Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit gilt Untersuchungen zur Herstellung, Opti-

mierung und Charakterisierung von langsam freisetzenden Formulierungenrekombinanter Proteine. Der Schwerpunkt liegt bei rekombinantem

Hirudin (rHir; 65 Aminosauren), einem Antikoagulans. Wie Arvinte

(1994) zeigte, lasst sich rHir durch Zugabe von Zinksalzen fallen. Das

Ergebnis sind Zn-rHir-Suspensionen, die gegeniiber rHir-Losungen nach

s.c.-Applikation in Ratten eine verlangerte biologische Wirkung aufwei-

sen. Die vorliegende Arbeit enthalt Studien zur Herstellung, Charak¬

terisierung und Stabilitat solcher Suspensionen. Ebenfalls unter dem

Aspekt von Depotformulierungen fur Proteine befasst sich ein weiteres

Kapitel mit den Moglichkeiten der Kristallisation von TGF-P3, dem trans-

formierenden Wachstumsfaktor-P3. Erste Daten dazu werden vorgestellt.

7

Formulierung von Zn-rHir-Suspensionen. Als optimaler pH zur

Fallung von rHir bei gegebener rHir- und Zinksalzkonzentration wurde pH

7.1 ermittelt. Zwischen dem bei pH 7.1 fallbaren Prozentsatz an rHir und

dem steigenden molaren Verhaltnissen von Zink zu rHir bestanden

sigmoide Beziehungen (Fallungskurven). 100%ige Fallungen von rHir

wurden bei einem Zink zu rHir Verhaltnis von -28:1 beobachtet.

Elektronenmikroskopische Untersuchungen an solchen Suspensionen

zeigten typische, ca. 20 nm grosse Partikel von unregelmassiger Form.

Mittels Lichtmikroskopie wurden bis zu 200 Jim grosse Agglomerate

beobachtet Es wurde angenommen, dass diese Agglomerate aus den

typischen 20 nm-Partikeln bestehen. ZnCh, Znl2, ZnBr2, und Z11NO3

zeigten ahnliche Fallungskurven und resultierten in Suspensionen mit

stabilem Prozentsatz an fallbarem rHir. Mit ZnS04 war die Fallung

dagegen deutiich weniger effizient. Auch gaben die auf ZnS04-Fallungen

basierenden Zn-rHir-Suspensionen schon nach kurzer Zeit grosse Anteile

an zunachst gebundenem rHir wieder ab. Diese Beobachtung wurde auf

eine Umwandlung der Fallung in basisches Zinksulfat zuriickgefuhrt, das

rHir nicht im gleichen Mass bindet. Bei pH 7.1 bildet sich basisches

Zinksulfat bereits in Gegenwart von nur 1.5 mM ZnS04. Die

erforderlichen Konzentrationen der anderen Zinksalze zur Bildung der

basischen Salze liegen mit >40 mM weit hoher (Kapitel I).

Freigabestudien von Zn-rHir. Zur Bestimmung der Freigabe von

Proteinen aus Depot-Formulierungen wurde ein In-vitro-Freigabemodell

entwickelt: Als Vorbereitung wurde der Boden von 5 mL-Probenvials mit

der Suspension einer Protein-Formulierung in 2%igem Agarosegel und

einer zusatzlichen Lage aus proteinfreiem Agarosegel beschichtet. Die

Doppelschicht wurde mit Freigabemedium uberschichtet, in dem das frei-

gesetzte Protein nach bestimmten Zeiten analysiert wurde. Das In-vitro-

Freigabemodell wurde mittels kommerziell erhaltlichen Insulin-Formulie-

rungen validiert. Dabei ergab sich eine gute Korrelation zwischen der mitt-

leren Verweildauer der Formulierungen in-vitro und der Dauer ihrer bio-

logischen Aktivitat im Menschen. Ein Vergleich verschiedener rHir-For-

mulierungen zeigte fur rHir-Losung die schnellste Freigabe, gefolgt von

Zn-rHir-Suspension mit 76% gefalltem rHir. Die langsamste Freigabe

8

wurde fur eine Suspension mit 100% gefalltem rHir ermittelt. Nur in

HEPES-Puffer konnten die Freigabekinetiken der verschiedenen rHir- und

Insulin-Formulierungen gut differenziert werden. In Phosphatpuffer oder

in Serum ergaben sich dagegen einheitliche Freigabeprofile. Dies wurde

auf die Bindung von Zn-Ionen an Phosphationen bzw. an Serumproteine

zurtickgefuhrt (Kapitel II).

Chemische Stabilitat von rHir. Gegenstand von Kapitel HI ist die

chemische Stabilitat von rHir unter verschiedenen Bedingungen. Ein erster

Abschnitt (III. 1) entiialt einen Literaturiiberblick iiber die chemische De¬

gradation in Peptiden und Proteinen beziiglich Asn- und Asp-Resten. Die

Deamidierung von Asn und die Isomerisierung von Asp verlaufen beide

fiber einen Ringschluss zum Succinimid. Bei leicht saurem pH bestimmt

die Ringoffnung des Succinimids den weiteren kinetischen Ablauf. Unter

neutralen bis basischen Bedingungen ist jedoch die Bildung des Succin¬

imids geschwindigkeitsbestimmend. Asn- und Asp-Gruppen neigen

besonders dann zur Instabilitat, wenn sie als Asn-Gly oder Asp-Gly vorlie-

gen. Die Effekte von Pufferkomponenten und der lonenstarke sind noch

nicht abschliessend geklart. Grundsatzliche Unterschiede zwischen Pepti¬den und Proteinen beziiglich der Instabilitat der Asn- und Asp-Reste lassen

sich mit dem hoheren Ordnungsgrad der Proteine erklaren. Sie ffihrt in

Proteinen zur einer Hemmung der Degradation an den beiden Amino¬

sauren, wahrend die flexibleren Strukturen der Peptide die Degradation

fdrdern. (Kapitel H3.1)

Hauptdegradationsprodukte von rHir in saurer Losung oder nach

mehrmaliger Lyophihsation sind die aus Asp33-Gly34 bzw. aus Asp^-Gly54hergeleiteten Succinimide Q5 bzw. Q4 (Grossenbacher et al., 1993). Im

Interesse von Kenntnissen fiber die Degradationskinetik und zu den

beteiligten Mechanismen wurde die Degradation von rHir im Bereich von

pH 1 bis 9.5 mittels Kapillarelektrophorese (CE) untersucht. Dabei wurde

mit zwei verschiedenen CE-Metiioden gearbeitet. Eine Metiiode diente zur

direkten Bestimmung von rHir. Mit der zweiten Metiiode liessen sich Q4

und Q5 einzeln quantifizieren. Hohe Zerfallsraten wurden unter stark sau-

ren und stark alkalischen Bedingungen beobachtet, die hochste Stabilitat

9

im neutralen pH-Bereich. Bei leicht sauren Bedingungen (pH 3-5) sind

die Hauptdegradationsprodukte Q4 und Q5 . Dagegen waren Q4 und Q5

bei neutralen bis alkalischen pH Werten direkt nicht detektierbar. Bei neu-

tralem pH wurden weitere Degradationsprodukte beobachtet, von denen

angenommen werde konnte, dass es sich um isomerisierte und/oder

deamidierte Produkte handelte. Bei alkalischem pH erfolgte eine starke

Abnahme der totalen Peakflachen, was fur eine Polymerisation von rHir

via S-S-Bruckenbindungen spricht. Bei pH 4.0 ftihrte die Degradation von

rHir zu etwa doppelt so hohen Konzentrationen von Q4 als zu Q5. Dies

wurde auf die freie Beweglichkeit von Asp53-Gly54 im hoch flexiblen C-

terminalen Gln49-Gln65-Rest zurfickgeffihrt, wohingegen Asp33-Gly34 im

Bereich der weniger flexiblen und daher stabileren Gly31-Lys36-Schleife

liegt (Kapitel m.2).

Auch die Degradation von rHir in Zn-rHir-Suspension wurde mittels

CE untersucht. Ausgehend von je einem Arrhenius-Diagramm (50, 40, 30

und 25 °C) fur Zn-rHir-Suspension und wassrige rHir Losung wurden

praktisch identische Aktivierungsenergien von 26.3 bzw. 24.9 kcal/mol

bestimmt. Im Vergleich zur wassrigen Losung verhielt sich die Zn-rHir-

Suspension stabiler. Die Haltbarkeitsfristen (ts>o% mit P = 95%) bei 25 °C

betrugen ffir die Zn-rHir-Suspension 23 bzw. fur die Losung 3 Tage; bei

4 °C waren es 292 bzw. 147 Tage. In Zn-rHir-Suspension wurde nur die

Degradation zu Q4 gehemmt, die zu Q5 blieb mehr oder weniger unveran-

dert. In wasseriger Losung wurde eine etwas geringere Bildung von Q5 als

von Q4 beobachtet. Dies und der aus der CE abgeleitete Hinweis, dass

isoAsp53-rHir sich vermutiich nur in Losung bildet, nicht aber in Zn-rHir-

Suspension, ffihrten zur Schlussfolgerung, dass die Fallung mit Zinksalzen

die Bildung von Q4 (Asp53-GlyM) und damit verbunden auch die Isomeri-

sierung zu isoAsp53 hemmt (Kapitel H1.3).

Stabilisierungsstrategien fur rHir in Losung und in lyophilisiertem

Zustand waren Gegenstand von Kapitel ffl.4. Nicht reduzierende Zucker

und Zuckeralkohole ffihrten in Losung bei erhohter Konzentration (15 -

50%) entweder zu einer Stabilisierung oder bheben ohne Effekt.

Reduzierende Zucker wirkten sich destabilisierend aus. Eine denkbare

10

Ursache ist die Maillard-Reaktion. Im Lyophilisat stabihsierten Trehalose

und Sucrose starker als Mannitol, was wohl auf amorphe Trehalose und

Sucrose im Lyophilisat zurfickzufuhren ist. Wichtig war weiterhin der pH

der Losung vor dem Lyophilisieren: Eine Ausgangslosung von pH ~7

fuhrte zu stabileren Lyophilisaten als Losungen mit pH ~4. Eine Verbes¬

serung der Stabilitat von rHir im Lyophilisat ergab sich auch dann, wenn

Kalium- anstelle von Natriumphosphatcitrat-Puffer verwendet wurde. Der

Grund fur diese Verbesserung liegt wahrscheinlich in der im Kaliumpuffer

gegenuber Natriumpuffer geringeren pH-Anderung wahrend des Ein-

frierens. Metallsalze tragen dann zur Stabilisierung bei, wenn Kalzium-

und Magnesiumsalze verwendet wurden. Beim Einsatz von CaCb als

Hilfsstoff zur Lypophihsierung wurde sowohl die Bildung von Q4 als auch

von Q5 gehemmt. Dies kann durch eine stabilisierende Interaktion mit den

kritischen Aminosauresequenzen erklart werden (Kapitel III.4).

TGF-P3 Kristallisation. Die Kristallisation von TGF-P3 wurde hin-

sichtlich der Formulierung einer langsam freisetzenden Formulierung

untersucht. Gegenstand der Untersuchungen war ein Scaling-up der

Metiiode des hangenden Tropfens (4 uL) zur Batch-Metiiode (2 mL). Ein¬

satz und Konzentration der zugesetzten Impfkeime zur AuslSsung der

Kristallisation bestimmten die erzielte Kristallgrosse. Voraussetzung fur

die Kristallisationsprozess war der Zusatz von Dioxan (10 - 15%) im

Kristallisiermedium. Kristallisation war auch unter Konvektion des

Kristallisiermediums moglich. Die biologische Aktivitat und Stabilitat

solcher Kristalle wird in Folgeprojekten untersucht (Kapitel IV).

Arvinte, T. (1994) Pharmaceutical compositions containing hirudin.

Europ. Pat. 0624375 A2.

Grossenbacher, H., Marki, W., Coulot, M., MUller, D., Richter, W.J.

(1993) Characterization of succinimide-type dehydration products of

recombinant hirudin variant 1 by electrospray tandem mass

spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry 7, 1082-

1085.