HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis bahan obat, baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.SISTEM PERALATAN HPLCInstrumentasiHPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1. Wadah Fase gerak dan Fase gerakWadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut(1).Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.4)Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.2)

2. PompaPompa yang cocok digunakan untukHPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalamHPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.6)

3. Tempat penyuntikan sampelSampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik sampel

4. Kolom dan Fase diamAda 2 jenis kolom padaHPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagianHPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit). Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.3]Kebanyakan fase diam padaHPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.

5. Detektor HPLCDetektor padaHPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.3. Stabil dalam pengopersiannya.4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.2)Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC dengan karakteristik detektor seperti berikut :DetektorSensitifitas (g/ml)Kisaran linierKarakteristik

Absorbansi Uv-visFotometer filterSpektrofotometerspektrometerphoto-diode array5 x 10-105 x 10-10> 2 x 10-10104105105Sensitivitas bagus, paling sering digunakan, selektif terhadap gugus-gugus dan struktur-struktur yang tidak jenuh.

Fluoresensi10-12104Sensitifitas sangat bagus, selektif, Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.

Indeks bias5 x 10-7

104Hampir bersifat universal akan tetapi sensitivitasnya sedang. Sangat sensitif terhadap suhu, dan tidak dapat digunakan pada elusi bergradien

ElektrokimiaKonduktimetriAmperometri10-810-12104105Peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak, tidak dapat digunakan pada elusi bergradien. Hanya mendeteksi solut-solut ionik. Sensitifitas sangat bagus, selektif tetapi timbul masalah dengan adanya kontaminasi elektroda.

JENIS HPLCPemisahan denganHPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kaliHPLC dikelompokkan menjadiHPLC fase normal danHPLC fase terbalik.Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:1. Kromatografi AdsorbsiPrinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.3)

2.Kromatografi fase terikatKebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3)

3. Kromatografi penukar ionKCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.2)

5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.2)

DERIVATISASI PADA HPLCDerivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi padaHPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik4. Menstabilkan analit yang sensitif.5)Detektor yang paling banyak digunakan dalamHPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri.7)Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.7)

Berbagai macam bahan penderivat telah tersedia antara lain :Gugus fungsionalReagen untuk dapat dideteksi dengan UV-VisReagen untuk dapat dideteksi dengan Fluoresen

Asam-asam kaboksilat; asam-asam lemak;asam-asam fosfatp-nitrobenzil-N,N-diisopropilisourea (PNBDI); 3,5-dinitrobenzil-N,N-diisopropilisourea (DNBDI);p-bromofenasil bromida (PBPB)4-bromometil-7-asetoksikumarin;4-bromometil-7-metoksikumarin;

Alkohol3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).

Aldehid; ketonp-nitrobenziloksiamin hidroklorida (PNBA); 3,5-dinitrobenziloksiamin hidroklorida (DNBA);Dansil hidrazin

Amin primerFluoresamino-ftalaldehid (OPA)

Amin primer (1o) dan sekunder (2o)3,5-dinitrobenzil klorida (DNBC);N-suksinimidil-p-nitrofenilasetat (SNPA);N-suksinimidil-3,5-dinitrofenilasetat (SDNPA); 4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsyl-Cl); 1-naftilisosianat (NIC-1).7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F); Dansil klorida

Asam-asam amino (peptida)4-dimetilaminiazobenzen-4-sulfinil (Dabsil-Cl)Fluoresamino-ftalaldehid (OPA)7-kloro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-Cl); 7-fluoro-4-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol (NBD-F);

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization).

Referensi:

1. Settle, F (Editor), 1997,Handbook of Instrumental Techniques for Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey, USA.2. Meyer, F.R., 2004,Practical High-Performance Liquid Chromatography, 4thEd., John Wiley & Sons, New York.3. Kealey, D and Haines, P.J., 2002,Instant Notes: Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publishers Limited, New York.4. Kenkel, J., 2002,Analytical Chemistry for Technicians, 3th. Edition., CRC Press, U.S.A.5. Snyder, L. R., Kirkland, S.J., and Glajch, J.L., 1997,Practical HPLC Method Development, John Wiley & Son, New York.6. Munson, J.W., 1981,Phrarmaceutical Analysis: Modern Methods,Part A and B, diterjemahkan oleh Harjana dan Soemadi, Airlangga University Press, Surabaya.7. Cserhati, T. And Forgacs, E., 1999,Chromatography in Food science and Technology, Technomic Publishing, Lancaster, Basel.

Kromatografi adalah salah satu teknik pemisahan dan pemurnian suatu senyawa berdasarkan perbedaan distribusinya terhadap fase gerak dan fase diam. Dengan metode kromatografi, hampir setiap campuran kimia mulai dari berat molekul rendah sampai tinggi, dapat dipisahkan menjadi komponen-komponennya (Gritteret al., 1991).Macam kromatografi yang dapat digunakan untuk memisahkan campuran zat-zat kimia yang terkandung dalam tumbuhan antara lain kromatografi lapis tipis, kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi gas, kromatografi cair kinerja tinggi (Harborne, 1987).Kromatografi merupakan suatu metode pemisahan suatu senyawa dari campurannya karena perbedaan keseimbangan distribusi senyawa diantara 2 fase yaitu fase diam dan fase gerak (koefisien distribusi). Migrasi suatu senyawa hanya terjadi apabila senyawa trsebut dalam fase gerak, sehingga kecepatan migrasi senyawa proporsional terhadap koefisien distribusinya. Senyawa dengan distribusi yang tinggi pada fase diam akan bergerak lebih lambat dalam kolom dan terpisah dari senyawa dengan distribusi rendah pada fase diam (Hamiltonet al., 1982; Sastrohamidjojo, 2001).Kromatografi adalah metode yang digunakan untuk memisahkan komponen dalam sampel, dimana komponen tersebut didistribusikan diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak/mobil. Fasa diam berupa padatan/cair yang dilapiskan pada padatan/gel. Pada pemisahan ini senyawa-senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan dalam sistem yang bergerak mengalir melalui suatu sistem yang diam, dan selama pengaliran fasa mobil akan terjadi pelarutan, adsorpsi, dan penguapan. Pada prinsipnya semua cara pemisahan kromatografi mengalami proses yang sama yaitu adanya distribusi komponen-komponen dalam fasa diam dan fasa gerak dengan memanfaatkan perbedaan-perbedaan sifat-sifat fisik komponen yang hendak dipisahkan (Mulja, 1995). Perbedaaan sifat tersebut diantaranya :1. Kelarutan yang berbeda terhadap suatu pelarut2. Sifat untuk bertaut (adsorpsi) yang berbeda satu sama lain dengan suatu serbuk bahan padat3. Sifat dapat menguap pada temperatur yang berbeda satu sama lain.Berdasarkan asas terjadinya proses pemisahan maka kromatografi dibedakan menjadi 4 (Mulja, 1995), yaitu :1. Kromatografi dengan asas adsorpsi.Kromatografi jenis ini menggunakan fasa diam padat dan fasa gerak cair atau gas. Pemisahan komponen-komponennya akan sangat bergantung pada perbedaan polaritas molekul-molekul yang akan dipisahkan.1. Kromatografi dengan asas partisi.Kromatografi jenis ini memakai fasa diam cair dan fasa gerak cair. Pemisahan komponen-komponen akan sangat tergantung pada perbedaan Kd (Koefisien distribusi) molekul-molekul yang dipisahkan.1. Kromatografi dengan asas filtrasi.Kromatografi jenis ini memakai fasa padat yang mempunyai sifat filtrasi terhadap komponen yang mempunyai massa molekul relatif (Mr) yang tinggi dan fasa padat tersebut dimiliki oleh gel atau sejenisnya sedangkan fasa geraknya adalah cairan. Kromatografi dengan dasar filtrasi ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk (struktur dan ukuran molekul).1. Kromatografi dengan asas suhu kritik.Pada dasarnya merupakan pengembangan dari kromatografi gas, sebagai fasa mobil dipakai CO2dalam keadaan superkritik.Secara teori, pemisahan kromatografi yang paling baik akan diperoleh jika fase diam mempunyai luas permukaan sebesar-besarnya sehingga terjadi keseimbangan yang baik antara fase gerak dan fase diam. Persyaratan kedua agar pemisahan baik adalah fase gerak bergerak dengan cepat sehingga difusi yang terjadi sekecil-kecilnya. Untuk memperoleh permukaan fase diam yang luas, maka penjerap atau fase diam harus berupa serbuk halus. Sedangkan untuk memaksa fase gerak bergerak cepat melalui fase diam yang berupa serbuk halus, harus digunakan tekanan tinggi. Persyaratan tersebut menghasilkan teknikhigh pressure liquid chromatography, yang selanjutnya lebih dikenal sebagaihigh performance liquid chromatography(HPLC) atau kromatografi cair kinerja tinggi (Gritteret al., 1991).High Performance Liquid Chromatography(HPLC)High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode pemisahan yang dikembangkan dari asas proses pemisahan adsorpsi dan partisi ke arah yang lebih luas yaitu proses pemisahan yang berdasarkan afinitas, filtrasi gel, dan ion yang berpasangan yang prosesnya tetap dilaksanakan di dalam kolom yang disertai pemakaian pelarut dengan tekanan tinggi (Mulja,1995).HPLCadalah teknik yang berkembang dari kromatografi kolom yang memiliki beberapa keuntungan diantaranya ukuran fasa diamnya lebih kecil, kolom lebih pendek sehingga waktu elusi atau waktu retensi (tR) lebih pendek dan analisisnya berlangsung cepat, pelarut dan kolom dapat dipakai berulang kali serta ketepatan dan ketelitiannya yang relatif tinggi. Apabila dibandingkan dengan kromatografi gas maka HPLC tidak dipengaruhi oleh volatilitas dan stabilitas bahan (Lindsay, 1992).Dasar pemisahan HPLC adalah perbedaan kecepatan migrasi dari komponen-komponen sampel yang terjadi karena adanya perbedaan kesetimbangan distribusi dalam fasa diam dan fasa gerak untuk senyawa-senyawa yang berbeda. HPLC sangat ideal untuk memisahkan molekul-molekul dari sampel organik dalam sampel biologis, bahan-bahan alam yang mudah mengalami perubahan, senyawa yang kurang stabil, dan senyawa dengan berat molekul tinggi (Mulja, 1995; Lindsay, 1992).HPLC pada dasarnya adalah suatu bentuk kromatografi kolom yang menggunakan kolom yang terbuat dari bahan kemasan ukuran partikel kecil dan berbentuk teratur. Karena kehalusan kemasan, untuk mendapatkan laju aliran yang memadai, digunakan tekanan sampai 10.000 psi. Cara ini memungkinkan peneliti menganalisis komponen flavonoid dalam suatu campuran secara kuantitatif pada aras resolusi dan kepekaan yang tinggi (< 50 ng) (Markham, 1987).Dalam HPLC, terdapat suatu detektor yang sangat peka untuk menganalisis larutan yang keluar dari kolom. Secara umum, alat yang digunakan untuk deteksi dalam kromatografi kolom berdasarkan pada perbedaan sifat fisika dan kimia dari analit dan pelarut. Pada sistem kromatografi cair, sifat fisik dari sampel dan fase gerak sering kali sama sehingga ada 2 tipe dasar detektor yang dikembangkan untuk penggunaan pada sistem kromatografi cair, yaitu: 1). Mengukur perbedaan sifat umum yang ada baik pada sampel maupun fase gerak, misalnya detektor perbedaan indeks bias, konduktivitas dan konstanta dielektrik; 2). Mengukur sifat yang spesifik pada sampel, dengan membersihkan fase gerak sebelum deteksi (flame ionization detector(FID) danelectron capture detector(ECD)) atau tanpa membersihkan fase gerak sebelum deteksi dilakukan (detektor UV, polarografi dan radioaktivitas). Karakteristik detektor yang ideal untuk HPLC, antara lain: memiliki sensitivitas tinggi, memberikan respon terhadap semua solut (memiliki spesifisitas yang dapat diprediksi), memiliki respon linier terhadap seri konsentrasi solut, ruang kosong yang rendah, tidak destruktif, tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan fase gerak, dan mudah digunakan (Hamiltonet al., 1982; Swadesh, 2000).Dalam penggunaan HPLC, ada 2 teknik yang sering dilakukan yaitu elusi secara isokratik dan gradien. Kromatografi isokratik cenderung lebih sensitif terhadap perubahan fase gerak, temperatur, kecepatan pompa dan komposisi sampel. Sedangkan kromatografi gradien biasanya kurang sensitif terhadap variasi kecil faktor-faktor diatas, tetapi sangat sensitif terhadap kolom, waktu ekuilibrasi dan preparasi gradien. Parameter teoritis dari kromatografi isokratik digambarkan dengan model lempeng (plate). Senyawa yang dianalisis akan terdistribusi antara fase diam dan fase gerak. Pada saat tertentu, suatu molekul akan ditransfer pada fase diam dalam kolom. Kemudian, molekul tersebut akan lepas dari kolom dan terbawa kembali oleh fase gerak sampai pada tempat dimana molekul tersebut terikat lagi pada fase diam. Proses ini terjadi secara kontinyu. Lokasi dimana analit ditransfer ke fase diam secara teoritis disebut lempeng (plate) dan jarak antara lempeng satu dengan yang lain disebut tinggi lempeng (plate height). Parameter yang digunakan untuk menentukan kemampuan pemisahan dalam penggunaan HPLC adalah faktor kapasitas, waktu retensi, lebar pada tinggi setengah puncak, jumlah lempeng teoritis, resolusi dan faktor selektivitas (Swadesh, 2000).foto: id.wikipedia.org

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa kiral.

2.2 Jenis- Jenis HPLCPemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:1. Kromatografi AdsorbsiPrinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.2. Kromatografi fase terikat (Kromatografi Partisi)Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.3. Kromatografi penukar ionHPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.4. Kromatografi Pasangan ionKromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.5. Kromatografi Eksklusi UkuranKromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.6. Kromatografi AfinitasDalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.3 Instrument HPLCInstrumentasiHPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak(Reservoir), pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cairdapat dilihat pada gambar di bawahini :

2.3.1 Wadah fase gerak (Reservoir)Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

vFase GerakFasegerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasegerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasegerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.

vPersyaratan fasegerak HPLC:

1.Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis.2.Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi.3.Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom.4.Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun.5.Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise).6.Sesuai dengan detector.

vJenisHPLCberdasarkan kepolaran fasediam dan fasegerak:

a)HPLC fasenormal: HPLC dengan kombinasi antara fasediam polar dan fasegerak non-polar. Fasediam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasegerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter.b)HPLC faseterbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasediam non-polar dan fasegerak polar. Fasegerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitril.Fasegerak yang baik memberikan factor kapasitas k pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasegerak yang memberikan k antara 2-5

2.3.2 PompaPompa yang cocok digunakan untukHPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalamHPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC:a)Pompa reciprocatingPompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.b)Pompa displacementPompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut.c)Pompa pneumaticDalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (