robert morfin et al- neurosteroids: pregnenolone in human sciatic nerves

8/3/2019 Robert Morfin et al- Neurosteroids: Pregnenolone in human sciatic nerves

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P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 9 , p p . 6 7 9 0 - 6 7 9 3 , A u g u s t 1 9 9 2N e u r o b i o l o g y

N e u r o s t e r o i d s : P r e g n e n o l o n e i n human s c i a t i c n e r v e s( d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e / m a s s s p e c t r o m e t r y / s t e r o i d s u l f a t e s / s t e r o i d f a t t y a c i d e s t e r s )

ROBERT M O R F I N * t , J A C Q U E S Y O U N G * , C O L E T T E C O R P t C H O T * , B O R J E E G E S T A D t , J A N S J O V A L L t ,AND E T I E N N E - E M I L E B A U L I E U * * I n s t i t u t N a t i o n a l d e l a S a n t d e t d e l a R e c h e r c h e M W d i c a l e U 3 3 , L a b o r a t o i r e H o r m o n e s , 9 4 2 7 6 B i c e t r e C e d e x , F r a n c e ; a n d t D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g i c a lC h e m i s t r y , K a r o l i n s k a I n s t i t u t e t , S t o c k h o l m , S w e d e nC o n t r i b u t e d b y E t i e n n e - E m i l e B a u l i e u , M a r c h 3 0 , 1 9 9 2ABSTRACT T h e c h a r a c t e r i z a t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o fp r e g n e n o l o n e i n h u m a n s c i a t i c n e r v e s w e r e u n d e r t a k e n , f o l -l o w i n g p r e v i o u s d e m o n s t r a t i o n o f t h e s y n t h e s i s o f t h i s s t e r o i di n r a t b r a i n o l i g o d e n d r o c y t e s , t o e x p l o r e t h e h y p o t h e s i s t h a tS c h w a n n c e l l s may d e m o n s t r a t e t h e s a m e b i o s y n t h e t i c a c t i v i t y .P r e g n e n o l o n e w a s d e f i n i t i v e l y i d e n t i f i e d b y m a s s s p e c t r o m e t r ya n d q u a n t i f i e d b y s p e c i f i c r a d i o i n m u n o a s s a y . I t s c o n c e n t r a -t i o n ( m e a n S D , 6 3 . 9 4 5 . 9 n g / g o f w e t t i s s u e , n = 1 2 ) w a s2 1 0 0 t i m e s t h e p l a s m a l e v e l a n d c o n c e n t r a t i o n f o u n d i nt e n d o n s a n d m u s c l e . No c o r r e l a t i o n w a s f o u n d w i t h s e x o r a g e .F r e e d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e a s w e l l a s s u l f a t e a n d f a t t y a c i de s t e r s o f p r e g n e n o l o n e a n d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e w e r e a l s om e a s u r e d . R e s u l t s a r e d i s c u s s e d i n t e r m s o f t h e c o n c e p t t h a tt h e s e " n e u r o s t e r o i d s " m a y b e s y n t h e s i z e d i n t h e p e r i p h e r a ln e r v o u s s y s t e m .P r e g n e n o l o n e ( 3 ( 3 - h y d r o x y - A 5 - p r e g n e n - 2 0 - o n e ) a c c u m u l a t e si n t h e r a t b r a i n i n d e p e n d e n t l y o f e n d o c r i n e g l a n d f u n c t i o n ,a n d i t s s y n t h e s i s f r o m c h o l e s t e r o l i n o l i g o d e n d r o c y t e s h a sb e e n d e m o n s t r a t e d ( 1 , 2 ) , j u s t i f y i n g t h e t e r m " n e u r o s t e r o i d "( 3 ) . M e a s u r e m e n t s b y r a d i o i m m u n o a s s a y h a v e i n d i c a t e d t h a tp r e g n e n o l o n e i s p r e s e n t a l s o i n h u m a n b r a i n a n d c r a n i a ln e r v e s a t l e v e l s s i m i l a r t o t h o s e i n t h e r a t ( i . e . , - 0 . 1 , u m o l / go f w e t t i s s u e ) ( 4 - 6 ) . S i n c e o l i g o d e n d r o c y t e s a n d S c h w a n nc e l l s c a n s h a r e s e v e r a l m e t a b o l i c c h a r a c t e r i s t i c s , i n c l u d i n gt h e s y n t h e s i s o f m y e l i n , t h e q u e s t i o n a r o s e w h e t h e r n e u r o -s t e r o i d s w e r e c o m p o n e n t s ' o f t h e h u m a n p e r i p h e r a l n e r v es y s t e m .I n a b s e n c e o f a n y p r e v i o u s i n f o r m a t i o n w h i c h c o u l d h e l p t oa n s w e r t h i s q u e s t i o n , we d e c i d e d t o i d e n t i f y p r e g n e n o l o n er i g o r o u s l y a n d t o m e a s u r e i t b y s p e c i f i c r a d i o i m m u n o a s s a y i ns c i a t i c n e r v e s o b t a i n e d f r o m h u m a n s s h o r t l y a f t e r d e a t h .S u l f a t e a n d f a t t y a c i d e s t e r s o f p r e g n e n o l o n e w e r e a l s od e t e r m i n e d , a s w e l l a s f r e e a n d e s t e r i f i e d d e h y d r o e p i a n d r o s -t e r o n e ( D H E A ; 3 , 8 - h y d r o x y - A 5 - a n d r o s t e n - 1 7 - o n e ) .

MATERIALS AND M E THODSC h e n o c a l s . [ 1 , 2 , 6 , 7 - 3 H ] D H E A ( 7 9 C i / m m o l ; 1 C i = 3 7G B q ) a n d [ 7 - 3 H I D H E A s u l f a t e a m m o n i u m s a l t ( 1 6 . 3 C i / m o l )w e r e o b t a i n e d f r o m N ew E n g l a n d N u c l e a r . [ 7 - 3 H ] P r e g -n e n o l o n e ( 1 2 . 7 C i / m m o l ) w a s p u r c h a s e d f r o m A m e r s h a m .T h i s s t e r o i d was u s e d f o r t h e m i c r o s c a l e s y n t h e s i s o f[ 7 - 3 H l p r e g n e n o l o n e s u l f a t e ( 7 ) . T h e p u r i t y o f e a c h 3 H - l a b e l e ds t e r o i d w a s c h e c k e d b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y a n d p u -r i f i c a t i o n w a s c a r r i e d o u t w h e n n e c e s s a r y w i t h t h e s y s t e mp r e v i o u s l y r e p o r t e d ( 4 , 7 ) . U n l a b e l e d p r e g n e n o l o n e , p r e g -n e n o l o n e s u l f a t e , DHEA, DHEA s u l f a t e , a n d c o r t i s o l w e r eg e n e r o u s g i f t s f r o m R o u s s e l - U c l a f . A l l s o l v e n t s w e r e o fa n a l y t i c a l g r a d e a n d w e r e p u r c h a s e d e i t h e r f r o m M e r c k o rC a r l o E r b a ( M i l a n o , I t a l y ) .

T i s s u e s . T i s s u e s w e r e o b t a i n e d < 4 8 h r a f t e r d e a t h f r o mc a d a v e r s o f b o t h s e x e s b e q u e a t h e d t o m e d i c a l r e s e a r c h .C o r p s e s w e r e k e p t r e f r i g e r a t e d a t 4 0 C . A g e s r a n g e d f r o m 4 4t o 9 0 y e a r s . C a u s e s o f d e a t h w e r e n o t r e c o r d e d . P o r t i o n s o fs c i a t i c n e r v e s , t e n d o n s , a n d m u s c l e w e r e t a k e n c l o s e t o t h ek n e e . S a m p l e s o f s p l e e n w e r e o b t a i n e d i n o n e c a s e . T h ec o l l e c t e d s a m p l e s ( 0 . 6 7 5 - 4 . 8 7 0 g ) w e r e f i r s t w e i g h e d a n d t h e nf r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n u n t i l p r o c e s s e d f u r t h e r .E x t r a c t i o n a n d P u r i f i c a t i o n P r o c e d u r e s . F r o z e n s a m p l e s i nl i q u i d n i t r o g e n w e r e f i r s t p u l v e r i z e d i n a m o r t a r a n d t h e nh o m o g e n i z e d i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e a t 4 0 C . T h e p r o -c e d u r e u s e d f o r a l l t i s s u e s a m p l e s i n c l u d e d e x t r a c t i o n o f f r e ea n d f a t t y a c i d - e s t e r i f i e d s t e r o i d s w i t h i s o o c t a n e / e t h y l a c e -t a t e , 1 : 1 ( v o l / v o l ) ( 4 ) a n d d e f a t t i n g o f t h e e x t r a c t s b y p a r t i t i o nb e t w e e n i s o o c t a n e a n d 90 % m e t h a n o l ( 8 ) . T h e f a t t y a c i de s t e r s o f t h e s t e r o i d s w e r e p r e s e n t i n i s o o c t a n e . C h r o m a t o g -r a p h y o f t h e r e c o v e r e d 9 0 % o m e t h a n o l m a t e r i a l , o n c e d r i e da n d r e d i s s o l v e d i n f r e s h 9 0 % m e t h a n o l , w a s d o n e o n C 1 8A m p r e p r e v e r s e - p h a s e c a r t r i d g e s ( A m e r s h a m ) . From t h el a t t e r , e l u t i o n w i t h 9 0 % m e t h a n o l y i e l d e d t h e f r e e s t e r o i d s .S a p o n i f i c a t i o n w a s p e r f o r m e d u n d e r n i t r o g e n i n 1 m l o f a 9 5 : 5( v o l / v o l ) m i x t u r e o f 95% ( v o l / v o l ) e t h a n o l a n d 4 0 % ( w t / v o l )KO H f o r 1 h r a t 8 0 C f o l l o w e d b y 1 2 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e .To m e a s u r e t h e s u l f a t e d s t e r o i d s p r e s e n t i n t h e a q u e o u sp h a s e a f t e r i s o o c t a n e / e t h y l a c e t a t e e x t r a c t i o n , s o l v o l y s i sw a s p e r f o r m e d i n t h r e e c a s e s a s f o l l o w s : t h e a q u e o u s p h a s e ,o n c e b r o u g h t t o pH 1 w i t h s u l f u r i c a c i d a n d m a d e 2 0 % o - N a C l ,w a s e x t r a c t e d t h r e e t i m e s w i t h e t h y l a c e t a t e a n d t h e p o o l e de x t r a c t s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 1 6 h r . F u r t h e r p r o c e s s i n gw a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o B u r s t e i n a n d L i e b e r m a n ( 9 ) .F r e e s t e r o i d s r e c o v e r e d i n e a c h o f t h e f r e e , s a p o n i f i e d , a n ds o l v o l y z e d f r a c t i o n s w e r e s e p a r a t e d b y p a r t i t i o n c h r o m a t o g -r a p h y o n c e l i t e m i c r o c o l u m n s b e f o r e r a d i o i m m u n o a s s a y ( 4 ,1 0 ) . T h e a d d i t i o n o f 3 H - l a b e l e d s t e r o i d s a l l o w e d a p p r o p r i a t ec o r r e c t i o n s t o b e m a d e f o r l o s s e s d u r i n g t h e i s o l a t i o n p r o c e -d u r e s .R a d i o i m m u n o a s s a y s . P r e g n e n o l o n e a n d DHEA a n d t h e i rr e s p e c t i v e s u l f a t e a n d f a t t y a c i d e s t e r s w e r e m e a s u r e d b yr a d i o i m m u n o a s s a y s u s i n g s p e c i f i c a n t i b o d i e s ( 5 , 1 1 ) . M e a -s u r e m e n t s w e r e m a d e i n t r i p l i c a t e o n t h r e e d i l u t i o n s o f t h ef r a c t i o n s , t h u s a l l o w i n g t h e c o n s t r u c t i o n o f r e g r e s s i o n l i n e s( m e a s u r e d p i c o g r a m s v e r s u s d i l u t i o n ) w h o s e s l o p e s g a v e t h ec o n c e n t r a t i o n s o f s t e r o i d s i n t h e s a m p l e s . R e s u l t s w e r ee x p r e s s e d a s n a n o g r a m s o f s t e r o i d ( f r e e o r r e l e a s e d f r o mc o n j u g a t e s ) p e r g r a m o f t i s s u e , a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s w e r ec a l c u l a t e d .G a s C h r o m a t o g r a p h y - M a s s S p e c t r o m e t r y ( G C - M S ) . U n -c o n j u g a t e d p r e g n e n o l o n e f r o m s c i a t i c n e r v e s w a s i d e n t i f i e db y GC-MS. A f t e r i n d i v i d u a l m e a s u r e m e n t s b y r a d i o i m m u -n o a s s a y o f t h e f r a c t i o n s f r o m t h e c e l i t e p a r t i t i o n c h r o m a t o g -r a p h y , t h e r e m a i n i n g u n c o n j u g a t e d p r e g n e n o l o n e f r o m t h r e eA b b r e v i a t i o n : DHEA, d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e .t P r e s e n t a d d r e s s : B i o t e c h n o l o g i e , C o n s e r v a t o i r e N a t i o n a l d e s A r t se t M e t i e r s , 2 9 2 r u e S t . M a r t i n , 7 5 1 4 1 P a r i s C e d e x 0 3 , F r a n c e . T o whom r e p r i n t r e q u e s t s s h o u l d b e a d d r e s s e d .

6 7 9 0

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .


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N e u r o b i o l o g y : M o r f i n e t a l .s c i a t i c nerves was p o o l e d . T h e amounts o f p r e g n e n o l o n ei n d i c a t e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y w e r e 8 . 0 5 , 8 . 9 3 , a n d 8 . 2 7 n gi n t h e f r e e , s o l v o l y z e d , a n d s a p o n i f i e d f r a c t i o n s , respec-t i v e l y . To e a c h o f t h e t h r e e s a m p l e s was a d d e d 4 0 , 0 0 0 dpmo f [ 7 - 3 H ] p r e g n e n o l o n e ( 0 . 1 5 8 n g ) . T h e d r i e d s a m p l e s wered i s s o l v e d i n aq u e o u s 9 5 % m e t h a n o l a n d p a s s e d t h r o u g h as m a l l b e d o f t h e a n i o n e x c h a n g e r TEAP-LH-20 i n O H- f o r mt o r e m o v e a c i d s ( 1 2 ) . T h e n e u t r a l f r a c t i o n s w e r e t a k e n t od r y n e s s a n d c o n v e r t e d t o t r i m e t h y l s i l y l e t h e r d e r i v a t i v e s( 1 2 ) . T h e r e a g e n t s w e r e r e m o v e d u n d e r a s t r e a m o f n i t r o g ena n d t h e t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s w e r e d i s s o l v e d i n 3 0 a l o fh e x a n e .G C - M S was c a r r i e d o u t u s i n g a VG 7 0 7 0 E d o u b l e - f o c u s i n gm a s s s p e c t r o m e t e r , a D a n i 3 8 0 0 ga s c h r o m a t o g r a p h , a n d aVG 1 1 - 2 5 0 d a t a s y s t e m (VG A n a l y t i c a l , M a n c h e s t e r , U . K . ) .The c o l u m n ( 2 5 m x 0 . 3 2mm i n t e r n a l d i a m e t e r ) , a f u s e d s i l i c ac a p i l l a r y c o a t e d w i t h c r o s s - l i n k e d m e t h y l s i l i c o n e ( f i l m t h i c k -n e s s , 0 . 2 5 , u m ; Q u a d r e x , N ew H a v e n , C T ) , was d i r e c t l yc o n n e c t e d a n d e x t e n d e d i n t o t h e i o n source. S a m p l e s wer ei n j e c t e d u s i n g an a l l - g l a s s f a l l i n g - n e e d l e s y s t e m . T h e i o nsource was k e p t a t 2 5 0 0 C , t h e a c c e l e r a t i n g v o l t a g e w a s 6 k e V ,t h e i o n i z a t i o n energy 7 0 e V , a n d t h e t r a p c u r r e n t 2 0 0 u A .S p e c t r a were t a k e n b y r e p e t i t i v e m a g n e t i c s c a n n i n g o f t h erange m/z 4 0 0 - 1 0 0 a t a scan r a t e o f 2 sec per d e c a d e ( 0 . 5 - s e ci n t e r s c a n t i m e ) a n d a r e s o l u t i o n o f 1 0 0 0 ( 5 % v a l l e y ) . S u i t a b l ec o n d i t i o n s w e r e e s t a b l i s h e d w i t h t h e t r i m e t h y l s i l y l e t h e r o fa u t h e n t i c p r e g n e n o l o n e . T h e r e t e n t i o n t i m e was a b o u t 1 0 m i na t 2 3 0 ' C . I d e n t i f i c a t i o n o f p r e g n e n o l o n e t r i m e t h y l s i l y l e t h e rf r o m t h e c o m p l e t e mass s p e c t r u m a n d t h e i o n c h r o m a t o g r a m so f m/z 3 8 8 ( M ) , 3 3 2 (M -5 6 ) , 2 9 8 (M -9 0 ) , 2 5 9 (M -1 2 9 ) ,a n d 1 2 9 w a s a c h i e v e d b y i n j e c t i o n o f 0 . 4 4 n g , w h e r e a s 0 . 1 5 ngwas i d e n t i f i e d b y t h e r e t e n t i o n t i m e s o f t h e p e a k s i n t h ec h r o m a t o g r a m s o f m/z 2 9 8 , 2 5 9 , a n d 1 2 9 .

R E S U L T SC h a r a c te r i za t i o n o f P r e g n e n o l o n e . T h e p r e l i m i n a r y i d e n t i -f i c a t i o n o f p r e g n e n o l o n e ( e i t h e r f r e e or r e l e a s e d f r o m i t ss u l f a t e o r f a t t y a c i d e s t e r s ) was b a s e d o n ( i ) p a r t i t i o n c h r o -

m a t o g r a p h y o n c e l i t e c o l u m n s a n d i s o l a t i o n o f e l u a t e s con-t a i n i n g p r e g n e n o l o n e a n d ( i i ) r a d i o i m m u n o a s s a y using as p e c i f i c a n t i s e r u m h a v i n g m i n i m a l c r o s s - r e a c t i o n w i t h o t h e rs t e r o i d s . F o l l o w i n g t h e group s e p a r a t i o n b y p a r t i t i o n a n di o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , t h e f r a c t i o n s c o n t a i n i n g p r e g -n e n o l o n e i n c l u d e d l a r g e amounts o f n e u t r a l c o m p o u n d s ,w h i c h i n t e r f e r e d i n t h e G C - MS a n a l y s i s . H o w e v e r , preg-n e n o l o n e c o u l d b e d e f i n i t i v e l y i d e n t i f i e d i n t h e u n c o n j u g a t e df o r m . P e a k s h a v i n g t h e r e t e n t i o n t i m e o f p r e g n e n o l o n e t r i -m e t h y l s i l y l e t h e r a p p e a r e d i n a l l t h e c h r o m a t o g r a m s o f i o n sc h a r a c t e r i s t i c o f p r e g n e n o l o n e t r i m e t h y l s i l y l e t h e r a n d i t s3 f 3 - t r i m e t h y l s i l o x y - 5 - e n e s t r u c t u r e . E x c e p t f o r a s l i g h t i n -crease o f m / z 1 2 9 d u e t o an a d j a c e n t c o n t a m i n a n t , t h e r e l a t i v ei n t e n s i t i e s o f t h e d i a g n o s t i c a l l y s i g n i f i c a n t p e a k s we re essen-t i a l l y t h e s a m e f o r t h e u n c o n j u g a t e d s t e r o i d f r o m s c i a t i cnerves a n d t h e r e f e r e n c e c o m p o u n d ( T a b l e 1 ) . A p p r o x i m a -t i v e q u a n t i t a t i o n y i e l d e d a v a l u e o f 1 0 ng as c o m p a r e d w i t hT a b l e 1 . R e l a t i v e i n t e n s i t i e s (% o f b a s e p e a k m/z 1 2 9 ) o fd i a g n o s t i c a l l y i m p o r t a n t mass s p e c t r a l p e a k s g i v e n b y t h et r i m e t h y l s i l y l e t h e r s o f p r e g n e n o l o n e a n d o f t h e c o m p o u n di s o l a t e d f r o m human s c i a t i c nerves

R e f e r e n c e Compound f r o mm / z p r e g n e n o l o n e s c i a t i c nerve

3 8 8 ( M + ) 9 . 4 7 . 53 3 2 (M - 5 6 ) 9 . 3 8 . 82 9 8 (M - 9 0 ) 3 0 . 9 1 9 . 72 5 9 (M - 1 2 9 ) 2 2 . 1 1 8 . 71 2 9 1 0 0 . 0 1 0 0 . 0 *

* I n t e n s i t y s l i g h t l y i n c r e a s e d b y a n a d j a c e n t c o n t a m i n a n t .

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 ) 6 7 9 1t h e v a l u e o f 8 . 0 5 n g b y r a d i o i m m u n o a s s a y . T h u s t h e GC -MSv a l u e w a s c o n s i s t e n t w i t h t h e r a d i o i m m u n o a s s a y v a l u e . T h ed a t a p r o v e t h e i d e n t i t y o f u n c o n j u g a t e d p r e g n e n o l o n e .I n c o n t r a s t , G C - MS e v i d e n c e f o r p r e g n e n o l o n e r e l e a s e df r o m i t s s u l f a t e o r f a t t y a c i d e s t e r s c o u l d n o t b e o b t a i n e d .W h i l e i n t e r f e r e n c e b y c o n t a m i n a n t s w a s a n i m p o r t a n t r e a s o n ,p e a k s w i t h t h e r e t e n t i o n t i m e o f p r e g n e n o l o n e t r i m e t h y l s i l y le t h e r w e r e a t l e a s t 5 - 1 0 t i m e s l e s s i n t e n s e i n t h e a n a l y s i s o fc o m p o u n d s r e l e a s e d f r o m t h e s u l f a t e a n d f a t t y a c i d e s t e r st h a n i n t h e a n a l y s i s o f u n c o n j u g a t e d p r e g n e n o l o n e . T h u s , t h ee v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f e s t e r i f i e d p r e g n e n o l o n e r e s t s o nt h e p a r t i t i o n c h r o m a t o g r a p h i c b e h a v i o r o n c e l i t e a n d t h es p e c i f i c i t y o f t h e r a d i o i m m u n o a s s a y . I n t e r f e r e n c e b y o t h e rs t e r o i d s i s u n l i k e l y b u t n o n s p e c i f i c b i n d i n g o f n e u t r a l c o n -t a m i n a n t s may i n f l u e n c e t h e a s s a y .C o n c e n t r a t i o n o f P r e g n e n o l o n e i n Human S c i a t i c N e r v e .T r i p l i c a t e m e a s u r e m e n t s o f p r e g n e n o l o n e w e r e c a r r i e d o u t b yr a d i o i m m u n o a s s a y o n f o u r s e t s o f d i l u t i o n s o f e a c h o f t h et h r e e i s o l a t e d f r a c t i o n s ( u n c o n j u g a t e d f r a c t i o n , s o l v o l y z e ds u l f a t e f r a c t i o n , s a p o n i f i e d f a t t y a c i d f r a c t i o n ) . F r e e p r e g -n e n o l o n e r a n g e d f r o m 2 0 . 4 t o 1 5 9 . 9 n g / g w i t h n o s i g n i f i c a n tr e l a t i o n t o s e x o r a g e o f t h e c o r p s e s ( T a b l e 2 ) . P r e g n e n o l o n es u l f a t e i n t h r e e c a s e s r a n g e d f r o m 1 3 . 2 t o 3 9 . 8 n g / g . P r e g -n e n o l o n e i n t h e s a p o n i f i e d f a t t y a c i d e s t e r f r a c t i o n r a n g e df r o m 1 3 . 0 t o 4 5 . 5 n g / g .C o n c e n t r a t i o n o f DHEA i n Human S c i a t i c N e r v e . F r e eDHEA a n d DHEA r e l e a s e d f r o m s u l f a t e a n d f a t t y a c i d e s t e r sw e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n c e l i t e m i c r o c o l u m n s . T h e DHEA-c o n t a i n i n g f r a c t i o n , c o m p l e t e l y s e p a r a t e d f r o m p r e g -n e n o l o n e , w a s u s e d f o r r a d i o i m m u n o l o g i c a l m e a s u r e m e n t s o fDHEA. C o n c e n t r a t i o n s o f DHEA s u l f a t e w e r e m u c h h i g h e rt h a n t h o s e o f f r e e a n d f a t t y a c i d - e s t e r i f i e d DHEA ( T a b l e 3 ) .C o n c e n t r a t i o n o f P r e g n e n o l o n e i n O t h e r Human T i s s u e s .T e n d o n , m u s c l e , a n d s p l e e n t i s s u e s d e r i v e d f r o m t h e c o r p s eo f a 4 4 - y e a r - o l d woman w e r e c o l l e c t e d a n d p r o c e s s e d a ss c i a t i c n e r v e s a m p l e s . T e n d o n f r o m a 6 1 - y e a r - o l d man w a sa l s o s t u d i e d . R e s u l t s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e o b t a i n e d f o rt h e s c i a t i c n e r v e s ( T a b l e 4 ) . I n t e n d o n s a n d m u s c l e , c o n c e n -t r a t i o n s o f p r e g n e n o l o n e , p r e g n e n o l o n e s u l f a t e , a n d DHEAs u l f a t e w e r e m a r k e d l y l o w e r t h a n i n s c i a t i c n e r v e s . I n c o n -t r a s t , s p l e e n c o n t a i n e d m u c h p r e g n e n o l o n e , p r e g n e n o l o n es u l f a t e , a n d DHEA s u l f a t e , a c t u a l l y s e v e r a l t i m e s m o r ep r e g n e n o l o n e a n d p r e g n e n o l o n e s u l f a t e t h a n i n s c i a t i c n e r v e .H o w e v e r , t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r e g n e n o l o n e e s t e r i f i e d b yf a t t y a c i d s w a s o f t h e s a m e o r d e r o f m a g n i t u d e i n a l l t i s s u e s .T a b l e 2 . C o n c e n t r a t i o n s o f f r e e p r e g n e n o l o n e , p r e g n e n o l o n es u l f a t e , a n d p r e g n e n o l o n e f a t t y a c i d e s t e r s i n h u m a ns c i a t i c n e r v e s

P r e g n e n o l o n e , n g / gF a t t y a c i dA g e S e x F r e e S u l f a t e e s t e r s

5 9 M 2 0 . 4 0 . 4 ND 3 1 . 2 0 . 47 5 M 5 4 . 3 7 . 3 ND 4 3 . 4 1 . 56 4 M 1 0 6 . 7 8 . 6 ND ND7 5 M 2 5 . 9 0 . 7 ND 1 3 . 0 0 . 65 1 M 1 5 9 . 9 9 . 3 ND ND5 8 M 4 4 . 5 2 . 2 2 1 . 5 0 . 8 3 4 . 1 1 . 35 4 M 4 1 . 8 1 . 8 3 9 . 8 1 . 0 3 8 . 2 1 . 28 8 F 4 8 . 0 2 . 0 ND 2 4 . 7 0 . 78 6 F 4 2 . 9 0 . 6 ND 3 0 . 2 1 . 25 1 F 1 5 0 . 9 1 0 . 1 ND ND6 1 M 2 8 . 1 1 . 0 ND 4 5 . 5 1 . 34 4 F 4 3 . 9 2 . 7 1 3 . 2 0 . 7 2 0 . 6 0 . 7

6 3 . 9 4 5 . 9 2 4 . 8 1 1 . 1 3 1 . 2 1 0 . 0T r i p l i c a t e m e a s u r e m e n t s were c a r r i e d o u t b y r a d i o i m m u n o a s s a y .V a l u e s a r e g i v e n a s n a n o g r a m s o f p r e g n e n o l o n e p e r g r a m o f f r e s hs c i a t i c n e r v e ( m e a n S D ) . M , m a l e ; F , f e m a l e ; N D , n o t d e t e r m i n e d .


3/4

P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 )T a b l e 3 . C o n c e n t r a t i o n s o f f r e e DHEA, DHEA s u l f a t e , a n dDHEA f a t t y a c i d e s t e r s i n human s c i a t i c n e r v e s

DHEA, n g / gF a t t y a c i dA g e S e x F r e e S u l f a t e e s t e r s

5 9 M 9 . 2 0 . 3 8 8 . 3 1 . 1 0 . 4 0 . 17 5 M 3 . 6 0 . 2 1 5 0 . 5 4 . 2 0 . 1 0 . 14 4 F ND 1 7 1 . 5 5 . 2 NDT r i p l i c a t e m e a s u r e m e n t s w e r e c a r r i e d o u t b y r a d i o i m m un o a s sa y .V a l u e s a r e g i v e n a s n a n o g r a m s o f DHEA p e r g r a m o f f r e s h s c i a t i cn e r v e ( m e a n S D ) . ND, n o t d e t e r m i n e d .

DISCUSSIONS i n c e p r e g n e n o l o n e a n d DHEA a n d t h e i r s u l f a t e a n d f a t t ya c i d c o r j u g a t e s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d i n t h e r a t b r a i n a n dm e a s u r e d i n h u m a n b r a i n , i t w a s o f i n t e r e s t t o s e e w h e t h e rt h e y w e r e a l s o p r e s e n t i n h u m a n p e r i p h e r a l n e r v e s . S c h w a n nc e l l s s h a r e s e v e r a l d e v e l o p m e n t a l a n d m e t a b o l i c c h a r a c t e r -i s t i c s w i t h o l i g o d e n d r o c y t e s , a n d i n t h e r a t t h e s e m y e l i n -f o r m i n g c e l l s c a n s y n t h e t i z e p r e g n e n o l o n e f r o m c h o l e s t e r o l( 1 ) .I n t h i s w o r k , p r e g ne n o l o ne w a s d e f i n i t i v e l y i d e n t i f i e d i nh u m a n s c i a t i c n e r v e s o b t a i n e d f r o m c o r p s e s w i t h i n 4 8 h r a f t e rd e a t h . P r e g n e n o l o n e w a s m e a s u r e d b y s p e c i f i c r a d i o i m m u -n o a s s a y a s a f r e e c o m p o u n d , a n d a l s o i n f r a c t i o n s o b t a i n e da f t e r s o l v o l y s i s a n d s a p o n i f i c a t i o n , c o n t a i n i n g s u l f a t e a n df a t t y a c i d e s t e r c o n j u g a t e s , r e s p e c t i v e l y . I n a d d i t i o n , DHEAa n d i t s c o n j u g a t e s w e r e m e a s u r e d i n a f e w s c i a t i c n e r v e s .S t e r o i d s i n o t h e r t i s s u e s w e r e a l s o m e a s u r e d i n t w o c a s e s , f o rt e n t a t i v e q u a n t i t a t i v e c o m p a r i s o n .T h e i d e n t i f i c a t i o n o f f r e e p r e g n e n o l o n e i s o l a t e d f r o m c o l -l e c t e d n e r v e s w a s b a s e d u p o n f o u r c r i t e r i a : ( i ) i d e n t i c a lr e t e n t i o n v o l u m e o n c e l i t e p a r t i t i o n c h r o m a t o g r a p h y , ( i i )d e t e c t i o n a n d m e a s u r e m e n t b y a s p e c i f i c r a d i o i m m u n o a s s a y ,( i i i ) i d e n t i c a l r e t e n t i o n t i m e o f t h e t r i m e t h y l s i l y l e t h e r d e r i v -a t i v e u p o n c a p i l l a r y c o l u m n G C , a n d ( i v ) i d e n t i c a l p a t t e r n o fd i a g n o s t i c a l l y i m p o r t a n t i o n s u p o n GC-MS a n a l y s i s . I n a d -d i t i o n , t h e q u a n t i t i e s m e a s u r e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y a n d b yGC-MS a g r e e d w i t h i n 2 0 % . I d e n t i f i c a t i o n o f p r e g n e n o l o n ed e r i v e d f r o m t h e s u l f a t e a n d f a t t y a c i d e s t e r f r a c t i o n s o b -t a i n e d f r o m e x t r a c t s o f t h e s c i a t i c n e r v e s w a s b a s e d o n l yu p o n t h e f i r s t t w o c r i t e r i a .T h e c o n c e n t r a t i o n o f f r e e p r e g n e n o l o n e i n 1 2 s c i a t i c n e r v e sv a r i e d f r o m 2 0 . 4 t o 1 5 9 . 9 n g / g ( m e a n , 6 3 . 9 4 5 . 9 n g / g ) . T h i si s m u c h h i g h e r t h a n t h e p l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f f r e e p r e g -n e n o l o n e m e a s u r e d b y L a c r o i x e t a l . ( 5 ) i n s u b j e c t s o fc o r r e s p o n d i n g a g e , c e r t a i n l y e x c l u d i n g c o n t a m i n a t i o n o fn e r v e e x t r a c t b y p l a s m a , a n d i s c o n s i s t e n t w i t h e i t h e r s e l e c -t i v e a c c u m u l a t i o n o r s y n t h e s i s i n t h e n e r v e s . H o w e v e r , i t i sc l e a r t h a t t h e d i f f e r e n c e o f c o n c e n t r a t i o n d e p e n d s o n t h eb a s i s o f t h e c a l c u l a t i o n a n d w o u l d b e r e d u c e d i f e x p r e s s e d p e rg r a m o f f a t , f o r i n s t a n c e . T h e p r e g n e n o l o n e c o n c e n t r a t i o n s i n

h u m a n s c i a t i c nerves are i n t h e same range as t h o s e r e p o r t e di n h u m a n ( 5 , 6 ) a n d r a t ( 4 ) b r a i n . M y e l i n a t i o n i n t h e p e r i p h e r a lnervous s y s t e m i s c a r r i e d o u t b y S c h w a n n c e l l s i n t h e p l a c eo f o l i g o d e n d r o c y t e s , a n d i t i s p o s s i b l e t h a t S c h w a n n c e l l s a l s os h a r e w i t h o l i g o d e n d r o c y t e s t h e c a p a c i t y t o p r o d u c e neuro-s t e r o i d s f r o m c h o l e s t e r o l .F o r p r e g n e n o l o n e s u l f a t e , t h e v a l u e s o b t a i n e d i n t h r e ecases are o f t h e same o r d e r o f m a g n i t u d e as t h o s e o f preg-n e n o l o n e s u l f a t e d e t e r m i n e d i n t h e p l a s m a i n y o u n g e r a d u l t s( 1 3 - 1 5 ) . S u c h d a t a ar e n o t i n f a v o r o f c o n t a m i n a t i o n b yp l a s m a p r e g n e n o l o n e s u l f a t e , a n d t h i s i s even m o r e so w i t ht h e very l o w v a l u e s f o u n d i n t e n d o n s a n d m u s c l e .T h e c o n c e n t r a t i o n o f p r e g n e n o l o n e f a t t y a c i d e s t e r s i n n i n es c i a t i c nerves ( 3 1 . 2 1 0 . 0 n g / g ) i s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n tf r o m t h a t f o u n d i n o t h e r t i s s u e s b u t i s much h i g h e r t h a n t h a tf o u n d i n p l a s m a ( f i v e d e t e r m i n a t i o n s i n two men a n d twowomen b e t w e e n 4 5 a n d 6 5 yea rs o f age: 5 . 2 + 0 . 8 n g / m l ;C . C . , u n p u b l i s h e d d a t a ) . T h e s e l e v e l s ar e s i m i l a r t o t h o s ep r e v i o u s l y r e p o r t e d i n r a t a n d m o n k e y b r a i n a n d p l a s m a ( 1 0 ) .T h e m o d e o f b i o s y n t h e s i s a n d t h e b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o fs t e r o i d f a t t y a c i d e s t e r s are s t i l l u n k n o w n .F r e e DHEA a n d DHEA s u l f a t e c o n c e n t r a t i o n s i n s c i a t i cnerves average 6 . 4 2 . 8 n g / g a n d 1 3 6 3 5 . 3 n g / g , respec-t i v e l y . F r e e DHEA c o n c e n t r a t i o n i n s c i a t i c nerves i s h i g h e rt h a n t h a t r e p o r t e d i n human p l a s m a ( 5 , 1 6 ) a n d i s d i s t i n c t l yl o w e r t h a n t h a t o f f r e e p r e g n e n o l o n e i n t h e b r a i n . W h e t h e r o rn o t nerve DHEA d e r i v e s f r o m nerve p r e g n e n o l o n e c a n n o t b ed e d u c e d f r o m t h e s e r e s u l t s , as i n t h e case o f b r a i n s t e r o i d s ( 4 ,1 7 ) . T h e very h i g h c o n c e n t r a t i o n o f DHEA s u l f a t e i n humanp l a s m a ( 1 6 ) may e x p l a i n some c o n t a m i n a t i o n o f nerve ex-t r a c t s . H o w e v e r , t h e very s m a l l amounts o f DHEA s u l f a t ef o u n d i n m u s c l e a n d t e n d o n t i s s u e s s u g g e s t t h a t s c i a t i cDHEA s u l f a t e i s n o t a p l a s m a c o n t a m i n a n t b u t i s f o r m e d ora c c u m u l a t e d i n t h e nervous t i s s u e . T h e very l o w v a l u e o fDHEA i n t h e f a t t y a c i d e s t e r i f i e d f r a c t i o n i s c u r i o u s l y i nc o n t r a s t w i t h t h e v a l u e o f p r e g n e n o l o n e f a t t y a c i d e s t e r s , ar e s u l t a l s o f o u n d i n t h e r a t b r a i n ( 1 8 ) . A l a r g e d i s c r e p a n c y w a so b s e r v e d b e t w e e n r a d i o i m m u n o a s s a y s a n d G C - M S d e t e r m i -n a t i o n s o f s t e r o i d s r e l e a s e d f r o m s u l f a t e a n d f a t t y a c i d e s t e rf r a c t i o n s . F u l l c a u t io n s h o u l d b e e x e r t e d i n i n t e r p r e t i n gc o n c e n t r a t i o n s o f t h e s e p r e g n e n o l o n e a n d DHEA d e r i v a t i v e si n a l l t y p e s o f b i o l o g i c a l m a t e r i a l s .T h e p r e l i m i n a r y d e t e r m i n a t i o n s o f p r e g n e n o l o n e i n o t h e rt i s s u e s ar e i n t r i g u i n g . I n t e n d o n s a n d m u s c l e , v a l u e s o f" n e u r o s t e r o i d s " are very l o w , w i t h t h e e x c e p t i o n o f p r e g -n e n o l o n e f a t t y a c i d e s t e r . V a l u e s f o u n d i n t h e s p l e e n , i nc o n t r a s t , i n d i c a t e h i g h l e v e l s o f p r e g n e n o l o n e , p r e g n e n o l o n es u l f a t e , a n d DHEA s u l f a t e . A t l e a s t f o r p r e g n e n o l o n e , t h eh i g h c o n c e n t r a t i o n i n s p l e e n c a n n o t b e e x p l a i n e d b y p l a s m ac o n t a m i n a t i o n a n d i n d e e d i s a l s o c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u sf i n d i n g s i n r a t s p l e e n ( 4 ) . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e h i g h l e v e l so f p r e g n e n o l o n e i s n o t k n o w n .

T a b l e 4 . T i s s u e c o n c e n t r a t i o n s o f p r e g n e n o l o n e a n d DHEAP r e g n e n o l o n e , n g / g

F a t t y a c i d DHEA a sA g e S e x T i s s u e F r e e S u l f a t e e s t e r s s u l f a t e , n g / g6 1 M T e n d o n 3 . 7 0 . 4 1 . 7 0 . 4 2 9 . 3 1 . 8 7 . 5 2 . 1S c i a t i c 2 8 . 1 ND 4 5 . 5 ND4 4 F T e n d o n 8 . 0 1 . 1 3 . 6 0 . 5 5 0 . 8 2 . 3 6 . 9 2 . 0M u s c l e 3 . 3 0 . 2 5 . 2 0 . 6 1 7 . 4 2 . 1 3 . 0 0 . 2S p l e e n 1 2 0 . 0 8 . 8 8 3 . 2 2 . 7 3 6 . 8 2 . 7 2 3 3 . 9 1 2 . 5S c i a t i c 4 3 . 9 2 . 7 1 3 . 2 0 . 7 2 0 . 6 0 . 7 1 7 1 . 5 5 . 2Mean S c i a t i c * 6 3 . 9 4 5 . 9 2 4 . 8 1 1 . 1 3 1 . 2 1 0 . 0 1 3 6 . 8 3 5 . 3T i s s u e c o n c e n t r a t i o n s a r e g i v e n a s n a n o g r a m s o f f r e e s t e r o i d p e r g r a m o f f r e s h t i s s u e ( m e a n S D ) .N D , n o t d e t e r m i n e d .

* M e a n c o n c e n t r a t i o n s f r o m T a b l e s 2 a n d 3 a r e g i v e n f o r c o m p a r i s o n .

6 7 9 2 N e u r o b i o l o g y : M o r f i n e t A


4/4

N e u r o b i o l o g y : M o r f i n e t a l .We t h a n k P r o f . C . C a b r o l a n d M r . M . H a u d y ( A m p h i t h e a t r ed ' A n a t o m i e d e s H 6 p i t a u x d e P a r i s ) f o r p r o v i d i n g t i s s u e s a m p l e s . Wet h a n k C . L e g r i s f o r t y p i n g t h e m a n u s c r i p t . T h i s w o r k h a s b e e ns u p p o r t e d p a r t i a l l y b y t h e F l o r e n c e G o u l d a n d t h e M a t h e r s C h a r i -t a b l e F o u n d a t i o n s .

1 . H u , Z . Y . , B o u r r e a u , E . , J u n g - T e s t a s , I . , R o b e l , P . & B a u l i e u ,E . E . ( 1 9 8 7 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 , 8 2 1 5 - 8 2 1 9 .2 . J u n g - T e s t a s , I . , H u , Z . Y . , R o b e l , P . & B a u l i e u , E . E . ( 1 9 8 9 )E n d o c r i n o l o g y 1 2 5 , 2 0 8 3 - 2 0 9 1 .3 . B a u l i e u , E . E . ( 1 9 9 1 ) i n N e u r o s t e r o i d s a n d B r a i n F u n c t i o n , e d s .C o s t a , E . & P a u l , S . M . ( T h i e m e , N ew Y o r k ) , V o l . 8 , p p . 6 3 - 7 3 .4 . C o r p e c h o t , C . , S y n g u e l a k i s , M . , T a l h a , S . , A x e l s o n , M . ,S j o v a l l , J . , V i h k o , R . , B a u l i e u , E . E . & R o b e l , P . ( 1 9 8 3 ) B r a i nR e s . 2 7 0 , 1 1 9 - 1 2 5 .5 . L a c r o i x , C . , F i e t , J . , B e n a i s , J . P . , G u e u x , B . , B e n e t e , R . ,V i l l e t t e , J . M . , G o u r m e l , B . & D r e u x , C . ( 1 9 8 7 ) J . S t e r o i dB i o c h e m . 2 8 , 3 1 7 - 3 2 5 .6 . L a n t h i e r , A . & P a t wa r d ha n , V . V . ( 1 9 8 6 ) J . S t e r o i d B i o c h e m .2 5 , 4 4 5 - 4 4 9 .7 . B a u l i e u , E . E . , C o r p e c h o t , C . & E m i l i o z z i , R . ( 1 % 3 ) S t e r o i d s2 , 4 2 9 - 4 5 1 .8 . M e l l o n - N u s s b a u m , S . & H o c h b e r g , R . B . ( 1 9 8 0 ) J . B i o l . C h e m .2 5 5 , 5 5 6 6 - 5 5 7 2 .

P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 8 9 ( 1 9 9 2 ) 6 7 9 39 . B u r s t e i n , S . & L i e b e r m a n , S . ( 1 9 5 8 ) J . B i o l . C h e m . 2 3 3 ,3 3 1 - 3 3 5 .1 0 . R o b e l , P . , B o u r r e a u , E . , C o r p o c h o t , C . , D a n g , D . C . , H a l b e r g ,F . , C l a r k e , C . , H a u g , M . , S c h l e g e l , M . L . , S y n g u e l a k i s , M . ,V o u r c ' h , C . & B a u l i e u , E . E . ( 1 9 8 7 ) J . S t e r o i d B i o c h e m . 2 7 ,6 4 9 - 6 5 5 .1 1 . Y o u n g , J . , C o r p d c h o t , C . , H a u g , M . , G o b a i l l e , S . , B a u l i e u ,E . E . & R o b e l , P . ( 1 9 9 1 ) B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun.1 7 4 , 8 9 2 - 8 9 7 .

1 2 . A x e ls o n , M . , S a h l b e r g , B . L . & S j o v a l l , J . ( 1 9 8 1 ) J . C h r o -m a t o g r . B i o m e d . A p p l . 2 2 4 , 3 5 5 - 3 7 0 .1 3 . De P e r e t t i , E . & M a p p u s , E . ( 1 9 8 3 ) J . C l i n . E n d o c r i n o l . M e t a b .5 7 , 5 5 0 - 5 5 6 .1 4 . J a n n e , O . , V i h k o , R . , S j o v a l l , J . & S j o v a l l , K . ( 1 9 6 9 ) C l i n .C h i m . A c t a 2 3 , 4 0 5 - 4 1 2 .1 5 . S j o v a l l , K . ( 1 9 7 0 ) A n n . C l i n . R e s . 2 , 3 9 3 - 4 0 8 .1 6 . Z u m o f f , B . , R o s e n f e l d , R . S . , S t r a i n , G . W . , L e v i n , J . &F u k u s h i m a , D . K . ( 1 9 8 0 ) J . C l i n . E n d o c r i n o l . M e t a b . 5 1 , 3 3 0 -3 3 3 .1 7 . C o r p o c h o t , C . , R o b e l , P . , A x el s o n , M . , S j o v a l l , J . & B a u l i e u ,E . E . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 7 8 , 4 7 0 4 - 4 7 0 7 .1 8 . J o , D . H . , A l t A b d a l l a h , M . , Y o u n g , J . , B a u l i e u , E . E . &R o b e l , P . ( 1 9 8 9 ) S t e r o i d s 5 4 , 2 8 7 - 2 9 7 .

robert morfin et al- neurosteroids: pregnenolone in human sciatic nerves

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