zong yi hu et al- neurosteroids: oligodendrocyte mitochondria convert cholesterol to pregnenolone

8/3/2019 Zong Yi Hu et al- Neurosteroids: Oligodendrocyte mitochondria convert cholesterol to pregnenolone

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P r o c . N a d l . A c a d . S c i . USAV o l . 8 4 , p p . 8 2 1 5 - 8 2 1 9 , D e c e m b e r 1 9 8 7B i o c h e m i s t r y

N e u r o s t e r o i d s : O l i g o d e n d r o c y t e m i t o c h o n d r i a c o n v e r t c h o l e s t e r o lt o p r e g n e n o l o n e

( r a t b r a i n / g l i a l c e l l s / A 5 - 3 I 8 - h y d r o x y s t e r o i d s / c y t o c h r o m e P - 4 5 O , ' )

ZONG Y i H u * , E L I A N E B O U R R E A U , I N G R I D J U N G - T E S T A S , PAUL R O B E L , AND E T I E N N E - E M I L E BAULIEU

I n s t i t u t N a t i o n a l d e l a S a n t d e t d e l a R e c h e r c h e M dd i c a le U ni t d 3 3 a n d F a c u l t d d e M d d e c i n e , U n i v e r s i t t P a r i s - S u d , L a b H o r m o n e s ,9 4 2 7 5 B i c e t r e C e d e x , F r a n c e

C o m m u n i c a t e d b y S e y m o u r L i e b e r m a n , J u l y 2 4 , 1 9 8 7

ABSTRACT O l i g o d en d r o c y t e m i t o c h o n d r i a f r o m 2 1 - d a y -

o l d S p r a g u e - D a w l e y m a l e r a t s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 0 nM[ 3 l H ] c h o l e s t e r o l . I t y i e l d e d [ 3 l H ] p r e g n e n o l o n e a t a r a t e o f 2 . 5 ±

0 . 7 a n d 5 - [ 3 H j p r e g n e n e - 3 f i , 2 0 a - d i o l a t a r a t e o f 2 . 5 ± 1 . 1 p m o l

p e r mg o f p r o t e i n p e r h r . C u l t ur e s o f g l i a l c e l l s f r o m 1 9 - t o2 1 - d a y - o l d f e t u s e s ( a m i x e d p o p u l a t i o n o f a s t r o c y t e s a n d

o l i g o d e n d r o c y t e s ) w e r e i n c u b a t e d f o r 2 4 h r w i t h [ 3 H ] m e v a l o n -o l a c t o n e . [ 3 H ] C h o l e s t e r o l , [ 3 H ] p r e g n e n o l o n e , a n d 5 - [ 3 H J p r e g -

n e n e - 3 f i , 2 0 a - d i o l w e r e c h a r a c t e r i z e d i n c e l l u l a r e x t r a c t s . T h ef o r m a t i o n o f t h e 3 H - l a b e l e d s t e r o i d s w a s i n c r e a s e d b y d i b u t y r y lcAMP ( 0 . 2 mM) a d d e d t o t h e c u l t u r e m e d i u m . T h e a c t i v ec h o l e s t e r o l s i d e - c h a i n c l e a v a g e m e c h a n i s m , r e c e n t l y s u g g e s t e d

i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y a n d a l r e a d y o b s e r v e d i n c u l t u r e s o f C6g l i o m a c e l l s , r e i n f o r c e s t h e c o n c e p t o f " n e u r o s t e r o i d s " a p p l i e dt o A 5 - 3 f i - h y d r o x y s t e r o i d s p r e v i o u s l y i s o l a t e d f r o m b r a i n .

We h a v e c h a r a c t e r i z e d t w o A 5 - 3 f 3 - h y d r o x y s t e r o i d m e t a b o -

l i t e s o f c h o l e s t e r o l , p r e g n e n o l o n e ( 3 , 8 - h y d r o x y - 5 - p r e g n e n e -2 0 - o n e ) a n d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e ( 3 f 3 - h y d r o x y - 5 - a n d r o s -t e n e - 1 7 - o n e ) , i n t h e b r a i n o f s e v e r a l m a m m a l i a n s p e c i e s ( r a t ,m o u s e , m o n k e y , a n d o c c a s i o n a l l y p i g a n d h u m a n ) . D e f i n i t i v ei d e n t i f i c a t i o n o f t h e s t e r o i d m o i e t y w a s m a d e i n r a t b r a i ne x t r a c t s b y g a s / l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c t r o m e t r y

( 1 - 3 ) . P r e g n e n o l o n e h a s a l s o b e e n i d e n t i f i e d i n a c e t o n ep o w d e r o f r a b b i t b r a i n b y i t s m a s s s p e c t r u m ( 4 ) . T h e

A 5 - 3 p 8 - h y d r o x y s t e r o i d s p e r s i s t e d i n b r a i n a f t e r r e m o v a l o f

s t e r o i d o g e n i c o r g a n s , a n d we t h e r e f o r e p r o p o s e d t h a t t h e i rf o r m a t i o n o r a c c u m u l a t i o n i n t h e r a t b r a i n d e p e n d s o n i n s i t um e c h a n i s m s u n r e l a t e d t o t h e p e r i p h e r a l e n d o c r i n e g l a n ds y s t e m .

H o w e v e r , b o t h S . L i e b e r m a n ' s a n d o u r g r o u p w e r e u n a b l e

u p t o now t o c o n c l u s i v e l y d e m o n s t r a t e t h e b i o s y n t h e s i s o f

p r e g n e n o l o n e i n b r a i n ( 3 , 4 ) . P r e g n e n o l o n e i s t h e k e y s t e r o i ds y n t h e s i z e d f r o m c h o l e s t e r o l i n s t e r o i d o g e n i c g l a n d s ( 5 , 6 ) .T h e o x i d a t i v e s i d e - c h a i n c l e a v a g e o f c h o l e s t e r o l i s o p e r a t e d

b y a s p e c i f i c e n z y m e c o m p l e x , w h i c h i n c l u d e s c y t o c h r o m e

P - 4 5 0 , C C ( 7 ) . We h a v e u s e d s p e c i f i c a n t i b o d i e s t o t h e b o v i n e

a d r e n a l P - 4 5 0 f o r t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f

t h e e n z y m e i n t h e a d u l t r a t b r a i n , a n d we h a v e f o u n d t h a t t h ew h i t e m a t t e r w a s s e l e c t i v e l y i m m u n o s t a i n e d t h r o u g h o u t t h eb r a i n ( 8 ) . S i n c e t h e m y e l i n o f t h e w h i t e m a t t e r i s m a d e b y a

p a r t i c u l a r t y p e o f g l i a l c e l l s , t h e o l i g o d e n d r o c y t e s , we h a v e

i s o l a t e d o l i g o d e n d r o c y t e m i t o c h o n d r i a , i n c u b a t e d t h e m w i t h

[ 3 H ] c h o l e s t e r o l , a n d o b t a i n e d [ 3 H l p r e g n e n o l o n e a n d i t s r e -d u c e d d e r i v a t i v e 5 - [ 3 H ] p r e g n e n e - 3 , 3 , 2 0 a - d i o l . I n a d d i t i o n ,c u l t u r e s o f f e t a l g l i a l c e l l s , i n c u b a t e d w i t h [ 3 H ] m e v a l o n a t e ,p r o d u c e d [ 3 H ] c h o l e s t e r o l , [ 3 H ] p r e g n e n o l o n e , a n d 5 - [ 3 H i p r e g -n e n e - 3 , B , 2 0 a - d i o l .

MATERIALS AND METHODS

P r e p a r a t i o n o f O l i g o d e n d r o c y t e s . T w e n t y - o n e - d a y - o l d m a l eS p r a g u e - D a w l e y r a t s ( C D 1 s t r a i n ; I f f a C r e d o , L ' A r b r e s l e ,F r a n c e ) , k e p t u n d e r a 1 2 - h r l i g h t / 1 2 - h r d a r k s c h e d u l e , w e r ek i l l e d b y d e c a p i t a t i o n 1 o r 2 h r a f t e r l i g h t s w e r e t u r n e d o n .A d r e n a l s a n d t h e a n t e r i o r p a r t o f t h e b r a i n ( e x c l u d i n g t h ec e r e b e l l u m , t h e p o n s , a n d t h e o l f a c t o r y b u l b s ) w e r e q u i c k l yr e m o v e d . B r a i n s o f 2 0 r a t s w e r e c o l l e c t e d i n H a n k s ' b a l a n c e d

s a l t s o l u t i o n ( w i t h o u t C a 2 ' a n d M g 2 + ) c o n t a i n i n g p e n i c i l l i na n d s t r e p t o m y c i n , b u f f e r e d w i t h H e p e s ( 1 m M ) , a n d a d j u s t e dt o pH 7 . 4 w i t h s o d i u m b i c a r b o n a t e . T h e m e t h o d o f L i s a k e ta l . ( 9 ) , a s m o d i f i e d b y H i r a m a y a e t a l . ( 1 0 ) , w a s u s e d . B r i e f l y ,b r a i n m i n c e s w e r e t r y p s i n i z e d ( 0 . 1 % f o r 3 0 m i n a t 3 7 0 C ) ,f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 0 x g f o r 5 m i n a t 4 0 C a n dw a s h i n g w i t h H a n k s ' b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n . T h e f i n a l c e l ls u s p e n s i o n w a s f i l t e r e d t h r o u g h a n y l o n f i l t e r ( m e s h , 6 3 , u m )t o r e m o v e d e b r i s a n d b l o o d v e s s e l s . A P e r c o l l g r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o n w a s t h e n p e r f o r m e d a t 1 5 0 0 rpm i n a S o r v a l lSW 2 7 r o t o r f o r 4 5 m i n a t 4 0 C . T h e u p p e r l a y e r c o n t a i n i n gm y e l i n w a s c a r e f u l l y a s p i r a t e d , w h i l e t h e l o w e r l a y e r a n d t h ep e l l e t c o n t a i n i n g c e l l d e b r i s a n d e r y t h r o c y t e s w e r e d i s c a r d e d .T h e i n t e r m e d i a t e l a y e r , e n r i c h e d i n o l i g o d e n d r o c y t e s , w a sd i l u t e d w i t h H a n k s ' b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n a n d r e c e n t r i f u g e dt h r e e t i m e s a t 2 0 0 x g f o r 5 m i n . C e l l s w e r e c o un t e d i n a

h e m o c y t o m e t e r . U n d e r p h a s e c o n t r a s t , t h e o l i g o d e n d r o c y t e sa p p e a r e d a s s m a l l b i r e f r i n g e n t c e l l s . T h e m a i n c o n t a m i n a n t sw e r e l a r g e c e l l n u c l e i .

P r e p a r a t i o n o f M i t o c h o n d r i a a n d I n c u b a t i o n w i t h [ 3 1 H ] C h o -l e s t e r o l . O l i g o d e n d r o c y t e s o r a d r e n a l s w e r e h o m o g e n i z e d i n0 . 2 5 M s u c r o s e / 0 . 5 mM EDTA ( K + ) / 1 0 mM T r i s - H C I , pH7 . 4 , a t 4 ° C . M i t o c h o n d r i a w e r e p r e p a r e d b y d i f f e r e n t i a lc e n t r i f u g a t i o n ( 1 1 ) . T h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d b y Mason e t a l .( 1 2 ) w e r e u s e d f o r s i d e - c h a i n c l e a v a g e o f c h o l e s t e r o l . M i t o -

c h o n d r i a w e r e r e s u s p e n d e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 2 5 Ms u c r o s e , 2 0 mM K C I , 1 0 mM K 2 H P O 4 , 5 mM M g C l 2 , 1 5 mMt r i e t h a n o l a m i n e , a n d 1 9 , u M t r i l o s t a n e ( S t e r l i n g - W i n t h r o p ,P a r i s ) . T h e l a t t e r i s a c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f 3 , 3 - h y d r o x y -s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y , w h i c h m i g h t d e c r e a s e p r e g -n e n o l o n e l e v e l s i n o u r e x p e r i m e n t s . T h e f i n a l p r o t e i n c o n -

c e n t r a t i o n w a s 0 . 8 m g / m l f o r b r a i n ( c o r r e s p o n d i n g t o - 3 0 x

1 0 6 c e l l s ) a n d 1 - 2 m g / m l f o r a d r e n a l m i t o c h o n d r i a . [ 3 H ] C h o -l e s t e r o l w a s a d d e d ( 5 x 1 0 6 c p m , 0 . 1 n m o l ) a f t e r s u s p e n s i o n

i n 0 . 1 m l o f T r i s b u f f e r ( p H 7 . 4 ) c o n t a i n i n g 2 0 , u g o f Tween 8 0

( 1 3 ) . T h e r e a c t i o n w a s i n i t i a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 0 mM

i s o c i t r a t e t o g e n e r a t e NADPH. A l t e r n a t i v e l y , a NADPH-g e n e r a t i n g s y s t e m was u s e d : 0 . 7 5 mg o f NADP+, 2 . 5 mg o f

g l u c o s e 6 - p h o s p h a t e , 0 . 5 u n i t o f g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y -d r o g e n a s e ( f r o m B a k e r s ' y e a s t ; 2 6 0 u n i t s p e r mg o f p r o t e i n ;S i g m a ) , 9 5 , g o f M g C l 2 i n a t o t a l v o l o f 0 . 1 m l o f p h o s p h a t eb u f f e r ( 0 . 1 M) ( p H 7 . 4 ) . T h e r e a c t i o n was i n i t i a t e d b y t h e

*On l e a v e f r o m t h e S h a n g h a i R e s e a r c h I n s t i t u t e o f E n d o c r i n o l o g y ,S h a n g h a i , P e o p l e ' s R e p u b l i c o f C h i n a .

8215

T h e p u b l i c a t i o n c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e r e d e f r a y e d i n p a r t b y p a g e c h a r g ep a y m e n t . T h i s a r t i c l e m u s t t h e r e f o r e b e h e r e b y m a r k e d " a d v e r t i s e m e n t "

i n a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C . § 1 7 3 4 s o l e l y t o i n d i c a t e t h i s f a c t .



P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 )

T a b l e 1 . TL C o f p r e g n e no l o n e ( 1 ) , p r e g n e n o l o n e a c e t a t e ( l a c ) , 5 - p r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 a - d i o l ( I l a ) , 5 - p r e g n e n e - 3 , 8 , 2 0 a - d i o l d i a c e t a t e ( h I a a c ) ,

5 - p r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 , 8 - d i o l ( 1 I b ) , a n d c h o l e s t e r o l ( C h o l )

I I a c I l a Ia a c I l b C h o l

TLC1 0 . 3 8 ± 0 . 0 3 ( 2 0 ) ND 0 . 2 9 ± 0 . 0 1 ( 2 0 ) ND 0 . 2 8 ± 0 . 0 1 ( 6 ) 0 . 5 9 ± 0 . 0 4 ( 2 0 )TLC2 0 . 5 1 ± 0 . 0 2 ( 6 ) 0 . 8 2 ± 0 . 0 2 ( 7 ) 0 . 3 1 ± 0 . 0 1 ( 6 ) 0 . 8 4 ± 0 . 0 1 ( 7 ) 0 . 3 3 ± 0 . 0 2 ( 6 ) 0 . 5 7 ± 0 . 0 3 ( 6 )TLC3 0 . 1 0 ± 0 . 0 1 ( 6 ) 0 . 3 7 ± 0 . 0 7 ( 6 ) 0 . 0 5 ± 0 . 0 4 ( 5 ) 0 . 4 8 ± 0 . 0 2 ( 6 ) 0 . 0 6 ± 0 . 0 1 ( 6 ) 0 . 2 3 ± 0 . 0 2 ( 6 )

C h r o m a t o g r a m s w e r e o n s i l i c a g e l F - 2 5 4 p l a t e s . T L C 1 , c y c l o h e x a n e / e t h y l a c e t a t e ( 3 : 2 ) ; T L C 2 , b e n z e n e / e t h a n o l ( 9 : 1 ) ; T L C 3 , c y c l o h e x a n e /e t h y l a c e t a t e ( 8 : 2 ) . R f , m e a n ± SD ( n u m b e r o f d e t e r m i n a t i o n s ) . ND, n o t d o n e .

a d d i t i o n o f t h e g e n e r a t i n g s y s t e m w a r m e d a t r o o m t e m p e r -

a t u r e 5 m i n b e f o r e u s e .T h e f i n a l v o l o f t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e ( a d j u s t e d t o pH 7 . 4 )

w a s 1 m l , a n d 0 . 2 5 - m l s a mp l es w e r e r e m o v e d a t 0 , 3 0 , 6 0 , a n d1 2 0 m i n o f i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C u n d e r a i r . E a c h o n e w a s d i l u t e dt o 2 m l w i t h w a t e r a t 4 ° C a n d e x t r a c t e d w i t h e t h y l a c e t a t e . T h ee x t r a c t w a s t a k e n t o d r y n e s s u n d e r n i t r o g e n a n d r e d i s s o l v e di n 2 m l o f b en z e ne .

C e l l C u l t u r e . S p r a g u e - D a w l e y r a t s w e r e k i l l e d b e t w e e n t h e1 9 t h a n d t h e 2 1 s t d a y o f p r e g n a n c y b y d e c a p i t a t i o n . T h ef e t u s e s o f o n e o r t w o f e m a l e s w e r e r e m o v e d u n d e r s t e r i l ec o n d i t i o n s a n d p l a c e d i n D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i -um s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % 6 f e t a l c a l f s e r u m ( D M E M - F C S 1 0 ) ,p e n i c i l l i n ( 1 0 0 u n i t s / m l ) , a n d s t r e p t o m y c i n ( 1 0 0 , g / m l ) . T h ec e r e b r a l h e m i s p h e r e s w e r e d i s s e c t e d a n d t h e m e n i n g e s a n d

b l o o d v e s s e l s w e r e c a r e f u l l y r e m o v e d . T h e b r a i n t i s s u e w a sc o l l e c t e d i n DMEM-FCS10, g e n t l y d i s p e r s e d b y r e p e a t e da s p i r n t i o n t h r o u g h a 1 0 - m l d i s p o s a b l e p i p e t t e , a n d p a s s e dt h r o u g h a n y l o n f i l t e r o f 8 2 - , u m m e s h . T h e c e l l s o b t a i n e d f r o mt w o h e m i s p h e r e s w e r e s e e d e d i n 7 5 - c m 2 c u l t u r e f l a s k s c o a t e dw i t h p o l y - L - l y s i n e h y d r o b r o m i d e ( 1 8 0 k D a ; 2 9 j i g p e r m l o fw a t e r ; S i g m a ) ( 1 4 ) . T h e c e l l v i a b i l i t y w a s a s s e s s e d b y t r y p a n

b l u e e x c l u s i o n a t t h e t i m e o f p l a t i n g a n d w a s - 9 5 % . C e l l sw e r e c u l t u r e d i n 1 5 m l o f DMEM-FCS10 c o n t a i n i n g i n s u l i n ( 5, u g / m l ) i n a h u m i d i f i e d i n c u b a t o r a t 3 7 ° C u n d e r 5 % C 0 2 / 9 5 %a i r . T h e m e d i u m w a s r e p l a c e d o n d a y s 1 a n d 6 . On d a y 9 , t h ec e l l s w e r e r e m o v e d b y t r y p s i n i z a t i o n ( 0 . 2 5 % t r y p s i n a n d 3mM EDTA i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e , P B S ) , p o o l e d i nDMEM-FCS10, a n d i d e n t i c a l n u m b e r s o f c e l l s w e r e p l a t e d i np o l y - L - l y s i n e - c o a t e d P e t r i d i s h e s ( d i a m e t e r , 1 0 0 m m ) . E a c hd i s h c o n t a i n e d t h e c e l l s c o r r e s p o n d i n g t o o n e c e r e b r a l h e m i -

s p h e r e . T h e c u l t u r e s w e r e c o n t i n u e d u n t i l d a y 2 0 i n DMEM-F C S 1 0 , r e p l a c i n g c u l t u r e m e d i u m e v e r y 3 - 4 d a y s . U n d e rt h e s e c o n d i t i o n s , g l i a l c e l l s m u l t i p l i e d a n d r e a c h e d c o n f l u -e n c y a f t e r - 3 d a y s o f s e c o n d a r y c u l t u r e . T h e d a y b e f o r e t h ee x p e r i m e n t s ( d a y 2 1 ) FCS w a s r e p l a c e d b y 5 % c h a r c o a l -t r e a t e d c a l f s e r u m (DMEM-CSCX) a n d t h i s m e d i u m w a s u s e df o r i n c u b a t i n g c e l l s w i t h t h e r a d i o a c t i v e p r e c u r s o r s .

I n c u b a t i o n o f C e l l s w i t h [ 3 H ] M e v a l o n o l a c t o n e . T h i s p r e c u r -s o r o f c e l l u l a r c h o l e s t e r o l w a s u s ed b ec a u s e i t r e a d i l y e n t e r st h e c e l l s . E a c h P e t r i d i s h , c o n t a i n i n g - 1 0 6 g l i a l c e l l s , w a s

i n c u b a t e d f o r 2 4 h r w i t h 5 m l o f DMEM-CSCX c o n t a i n i n g 0 . 1 ,1 , o r 1 0 t C i o f [ 5 - 3 H ( N ) ] m e v a l o n o l a c t o n e p e r m l ( N e wE n g l a n d N uc le a r; 3 0 C i / m m o l ; 1 C i = 3 7 G B q ) , 2 0 , u Mt r i l o s t a n e , a n d 2 0 AM m e v i n o l i n ( M e r c k S h a r p & D o h m e ; a ni n h i b i t o r o f h y d r o x y m e t h y l g l u t a r y l - C o A r e d u c t a s e j t h e k e ye n z y m e i n m e v a l o n a t e b i o s y n t h e s i s ) . When i n d i c a t e d , 0 . 2mM d i b u t y r y l cAMP w a s a d d e d . A t t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n ,t h e m e d i u m w a s d e c a n t e d , t h e c e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h0 . 5 m l o f P B S , r e c o v e r e d b y s c r a p i n g w i t h a r u b b e r p o l i c e -m a n , c e n t r i f u g e d , r e s u s p e n d e d i n 5 m l o f P B S , a n d e x t r a c t e d

w i t h 5 m l o f e t h y l a c e t a t e t h r e e t i m e s . T h e e x t r a c t s w e r et a k e n t o d r y n e s s u n d e r n i t r o g e n a n d r e d i s s o l v e d i n 1 m l o fb e n z e n e .

C h a r a c t e r i z a t i o n o f [ 3 H j P r e g n e n o l o n e a n d 5 - [ 3 H ] P r e g n e n e -3 f i , 2 0 a - d i b l . We h a v e p r e v i o u s l y u s e d c e l i t e m i c r o c o l u m n

c h r o m a t o g r a p h y t o i s o l a t e p r e g n e n o l o n e f r o m b r a i n ( 3 ) .P r o p y l e n e g l y c o l ( 0 . 4 m l f o r 1 g o f a c t i v a t e d c e l i t e 5 3 5 ) W a st h e s t a t i o n a r y p h a s e . E x t r a c t s w e r e d ep o s i t ed o n t o t h ec o l u m n i n i s o o c t a n e s o l u t i o n a n d e l u t e d w i t h i s o o c t a n e /b e n z e n e ( 9 2 : 8 ) ( v o l / v o l ) , p r e g n e n o l o n e p a s s e d i n t h e 1 8 - t o2 5 - m l v o l u m e . T h r e e t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T L C ) s y s -t e m s w e r e a l s o u s e d ( T a b l e 1 ) , a f t e r a d d i t i o n o f = 1 0 , u t g o f t h ec o r r e s p o n d i n g r e f e r e n c e c o m p o u n d . P o o l e d s a m p l e s f r o m

TLC1 c o n t a i n i n g = 2 5 0 0 dpm o f e i t h e r p r e g n e n o l o n e o r 5 -p r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 a - d i o l w e r e a c e t y l a t e d w i t h a c e t i c a n h y d r i d e /p y r i d i n e ( 1 : 1 ) a t r o o m t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t . P r e g n e n o l o n e

a c e t a t e w a s r e c h r o m a t o g r a p h e d w i t h T L C 2 , W h e r e a s 5 -p r e g n e n e - 3 , B , 2 0 a - d i o l d i a c e t a t e w a s r e c h r o m a t o g r a p h e d w i t h

TLC2 a n d - 3 . F u r t h e r i d e n t i f i c a t i o n o f p r e g n e n o l o n e w a so b t a i n e d b y HPLC p e r f o r m e d w i t h a h y p e r s y l C - 1 8 c o l u m n

w i t h a 5 0 - 8 0 % o g r a d i e n t o f m e t h a n o l i n w a t e r , a n d a f l o w r a t eo f 1 m l / m i n . T h e r e t e n t i o n t i m e o f t h e r e f e r e n c e c o m p o u n dw a s 2 7 . 5 m i n . F i n a l l y , r e c r y s t a l l i z a t i o n a f t e r r e v e r s e i s o t o p i cd i l u t i o n w a s p e r f o r m e d t o c o n f i r m t h e i d e n t i t y o f p r e g n e n o -

l o n e a n d o f 5 - p r e g n e n e - 3 , , 2 0 a - d i o l .O t h e r M e t h o d s . P r o t e i n s w e r e m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f

B r a d f o r d u s i n g t h e B i o - R a d k i t , a n d DNA w a s m e a s u r e d b yt h e d i p h e n y l a m i n e m e t h o d o f B u t t o n . A d e q u a t e v o l u m e s o f

c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y f r a c t i o n s w e r e t a k e n t o d r y n e s s ,w h e r e a s TL C a r e a s w e r e s c r a p e d a n d d i r e c t l y c o u n t e d i n 5 m l

Extract, taken up in benzene

TL C 1

C y c l o h e x a n e / E t h y l a c e t a t e 3 : 2

Celite

TL C 2

B e n z e n e / E t h a n o l 9 : 1

A c e t y l a t i o n

TL C 2

m ic r o cC t w i c e )

olumn

Reverse

IsotopicDilution

HPLC

Hypersyl C 1 8

F I G . 1 . I d e n t i f i c a t i o n o f [ 3 H ] p r e g n e n o l o n e .

8 2 1 6 ! B i o c h e m i s t r y : Hu e t a l .



P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 ) 8 2 1 7

o f P i c o - F l u o r 1 5 ( P a c k a r d ) i n a T r i - C a r b 4 6 6 0 s p e c t r o p h o -

t o m e t e r ( P a c k a r d ) , w i t h = 5 0 % y i e l d .

Extr act, taken up i n benzene

RESULTS

C h a r a c t er i z a ti o n o f P r e g n e n o l o n e a n d o f 5 - P r e g n e n e - 3 f i , -2 0 a - d i o l . B e s i d e s t h e p a r t i t i o n c h r o m a t o g r a p h y o n c e l i t e , t h eTL C w i t h s y s t e m s 1 a n d 2 a n d t h e r e v e r s e - p h a s e HPLC, t h e

t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d [ 3 H ] p r e g n e n o l o n e w a s a c e t y l a t e d a n dr e c h r o m a t o g r a p h ed o n TLC2 ( F i g . 1 ) . T h e R f o f t h e p r o d u c t

w a s t h e s a m e a s t h a t o f a u t h e n t i c 3 , 3 - a c e t o x y - 5 - p r e g n e n e - 3 -o n e . F i n a l l y , r e c r y s t a l l i z a t i o n a f t e r r e v e r s e i s o t o p i c d i l u t i o nc o n f i r m e d t h e i d e n t i t y o f p r e gn e n o l o n e ( T a b l e 2 ) , w i t h a ne s t i m a t e d d e g r e e o f p u r i t y o f 9 5 % .Due t o t h e l o w a m o u n t o f r a d i o a c t i v e m a t e r i a l a n d t o t h e

l a c k o f r a d i o a c t i v e r e f e r e n c e c o m p o u n d , 5 - [ 3 H ] p r e g n e n e -3 f 3 , 2 0 a - d i o l w a s t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d b y TLC1 a n d TLC2( w h e r e i t w a s s l i g h t l y m o r e p o l a r t h a n i t s 2 0 , 8 - i s o m e r 5 -p r e g n e n e - 3 , f , 2 0 f 8 - d i o l ) , a n d b y a c e t y l a t i o n a n d r e c h r o m a t o g -

r a p h y o n TLC3 ( F i g . 2 ) . T h e R f o f t h e p r o d u c t w a s t h e s a m ea s t h a t o f a u t h e n t i c 5 - p r e g n e n e - 3 1 8 , 2 0 a - d i o l d i a c e t a t e . F i n a l -l y , r e c r y s t a l l i z a t i o n a f t e r r e v e r s e i s o t o p i c d i l u t i o n c o n f i r m e d t h ei d e n t i t y o f 5 - p r e g n e n e - 3 1 3 , 2 0 a - d i o l ( T a b l e 3 ) w i t h a n e s t i -m a t e d d e g r e e o f p u r i t y o f 6 1 % .

[ 3 H ] C h o l e s t e r o l C o n v e r s i o n t o P r e g n e n o l o n e b y O l i g o d e n -

d r o c y t e M i t o c h o n d r i a . I n t h r e e e x p e r i m e n t s , t h e c o n v e r s i o n

r a t e o f [ 3 H ] c h o l e s t e r o l t o [ 3 H ] p r e g n e n o l o n e b y b r a i n m i t o -c h o n d r i a w a s 2 . 5 ± 0 . 7 ( m e a n ± S D ) p m o l p e r mg o f p r o t e i np e r h r . C h o l e s t e r o l a n d p r e g n e n o l o n e r e p r e s e n t e d 8 1 - 8 7 % o f

t o t a l r a d i o a c t i v i t y . I n t w o c o n t r o l e x p e r i m e n t s , t h e c o n v e r -

s i o n r a t e b y a d r e n a l m i t o c h o n d r i a w a s 1 4 . 5 a n d 1 5 . 2 p m o l p e r

mg o f p r o t e i n p e r h r , w i t h c h o l e s t e r o l a n d p r e g n e n o l o n e

r e p r e s e n t i n g 9 1 - 9 4 % o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y . T h e s e r e s u l t sw e r e n o t o b t a i n e d u n d e r i n i t i a l v e l o c i t y c o n d i t i o n s , t h ec o n c e n t r a t i o n o f Tween 8 0 may n e e d t o b e a d j u s t e d , a n d t h u s

t h e 1 - 2 % c o n v e r s i o n o f [ 3 H ] c h o l e s t e r o l t o [ 3 H ] p r e g n e n o l o n ep r o b a b l y w a s s u b o p t i m a l . N e i t h e r z e r o t i m e c o n t r o l s n o r

b o i l e d m i t o c h o n d r i a f o r m e d a n y m e t a b o l i t e . A r a d i o a c t i v ec o m p o u n d w i t h t h e R f o f 5 - p r e g n e n e - 3 , 8 , 2 0 a - d i o l w a s o b -

s e r v e d , w i t h a c o n v e r s i o n r a t e o f 2 . 5 ± 1 . 2 p m o l p e r mg o fp r o t e i n p e r h r . R a d i o a c t i v e m e t a b o l i t e s m o r e p o l a r t h a n

p r e g n e n o l o n e a n d 5 - p r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 a - d i o l w e r e d e t e c t e d b u tn o t i d e n t i f i e d . A m i n o g l u t e t h i m i d e ( 5 0 0 , u M ) , a n i n h i b i t o r o f

c h o l e s t e r o l s i d e - c h a i n c l e a v a g e , c o m p l e t e l y c o u n t e r a c t e d t h ef o r ma t i o n o f p r e g n e n o l o n e , 5 - p r e g n e n e - 3 , f , 2 0 a - d i o l , a n d o f

p o l a r m e t a b o l i t e s . When w h o l e b r a i n i n s t e a d o f o l i g o d e n d r o -c y t e s w a s u s ed t o p r e p a r e m i t o c h o n d r i a , n o m e t a b o l i t e w a s

f o u n d , e v e n w h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n w a s i n c r e a s e dt o 5 m g / m l . N e g a t i v e r e s u l t s w e r e a l s o o b t a i n e d w i t h k i d n e y

m i t o c h o n d r i a . H o w e v e r , l i v e r m i t o c h o n d r i a m e t a b o l i z e d

[ 3 H ] c h o l e s t e r o l t o s e v e r a l c o m p o u n d s , i n c l u d i n g o n e w i t h t h eR f o f p r e g n e n o l o ne o n T L C 1 , w i t h a c o n v e r s i o n r a t e o f 1 . 2p m o l p e r mg o f p r o t e i n p e r h r .

T a b l e 2 . R e v e r s e i s o t o p i c d i l u t i o n o f [ 3 H ] p r e g n e n o l o n e f o r m e da f t e r i n c u b a t i o n o f o l i g o d e n d r o c y t e m i t o c h o n d r i a w i t h

[ 3 H ] c h o l e s t e r o l

S p e c i f i c a c t i v i t i e s , d p m / m g

M o t h e r C/ MS o l v e n t s C r y s t a l s ( C ) l i q u o r s ( M ) r a t i o

I s o o c t a n e / b e n z e n e 1 2 2 1 2 5 2 6 0 . 4 9C y c l o h e x a n e / e t h y l a c e t a t e 1 1 3 9 1 5 2 7 0 . 7 5M e t h a n o l / w a t e r 1 1 7 5 1 1 3 8 1 . 0 3M e t h a n o l / w a t e r 1 1 1 3 1 0 4 2 1 . 0 6

T h e o r e t i c a l 1 1 7 4

P r e g n e n o l o n e ( 5 0 m g ) w a s m i x e d w i t h 5 8 , 7 1 0 dpm o f p u t a t i v e[ 3 H ] p r e g n e n o l o n e f o r m e d f r o m [ 3 H ] c h o l e s t e r o l .

TL C 1

cyclohexane/ethyl acetate 3 : 2

Reverse

Acetylation Isotopic

/ L3Dilution

TL C 2 TL C 3

benzene/ethanol

9:1

cyclohexane/ethyl acetate

8 : 2

F I G . 2 . I d e n t i f i c a t i o n o f 5 - [ P H ] p r e g n e n e - 3 p 8 , 2 0 a - d i o l .

[ 3 1 H ] C h o l e s t e r o l C o n v e r s i o n t o 5 - P r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 a - d i o l b yO l i g o d e n d r o c y t e m i t o c h o n d r i a . To f a v o r t h e f o r m a t i o n o fr e d u c e d m e t a b o l i t e s b y t h e m i t o c h o n d r i a l p r e p a r a t i o n s , a

N A D P H - g e n e r a t i n g s y s t e m w a s u s e d i n t w o e x p e r i m e n t s .T h e c o n v e r s i o n r a t e o f [ 3 H ] c h o l e s t e r o l t o [ 3 H ] p r e g n e n o l o n ew a s i n d e e d d e c r e a s e d t o 0 . 5 7 a n d 0 . 3 2 p m o l p e r mg o f p r o t e i np e r h r , w h e r e a s t h e c o n v e r s i o n t o 5 - p r e g n e n e - 3 1 f , 2 0 a - d i o lw a s 4 . 9 a n d 3 . 6 p m o l p e r mg o f p r o t e i n p e r h r , r e s p e c t i v e l y .O n l y t r a c e s o f 5 - p r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 f 3 - d i o l w e r e d e t e c t e d . C h o -l e s t e r o l , p r e g n e n o l o n e , a n d 5 - p r e g n e n e - 3 / 3 , 2 0 a - d i o l r e p r e -s e n t e d 9 3 - 9 5 % o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y . T h e s e r e s u l t s w e r e n o t

o b t a i n e d u n d e r i n i t i a l v e l o c i t y c n d i t i o n s , a n d t h e i n c u b a t i o nc o n d i t i o n s may n o t h a v e b ee n - o t i m a l .

[ 3 H ] M e v a l o n o l a c t o n e C o n v e r s i o n t o P r e g n e n o l o n e a n d t o

5 - P r e g n e n e - 3 p , 2 0 a - d i o l b y G l i a l C e l l C u l t u r e s . C h r o m a t o g r a -

p h y o f c e l l e x t r a c t s w i t h TLC1 y i e l d e d s e v e r a l r a d i o a c t i v e

f r a c t i o n s ( F i g . 2 ) . T h e q u a n t i t a t i v e l y m a j o r o n e m i g r a t e dc l o s e t o t h e s o l v e n t f r o n t . I t d i d n o t r e l e a s e a n y p r e g n e n o l o n eo r 5 - p r e g n e n e - 3 ( 3 , 2 0 a - d i o l a f t e r s a p o n i f i c a t i o n . [ 3 H ] C h o l e s -t e r o l w a s t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d a t R f 0 . 5 8 . P r e g n e n o l o n e a n d

5 - p r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 a - d i o l w e r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e i r R f w i t h

T L C 1 . F r a c t i o n s o f t h e e l u a t e s w e r e a c e t y l a t e d , c h r o m a t o -

g r a p h e d w i t h TLC s y s t e m s 2 a n d 3 , a n d m i g r a t e d a s a u t h e n t i c3 , 8 - a c e t o x y - 5 - p r e g n e n e - 2 0 - o n e a n d 5 - p r e g n e n e - 3 , 3 , 2 0 a - d i o ld i a c e t a t e . T h e p e r c e n t a g e c o n v e r s i o n o f [ 3 H ] m e v a l o n o l a c -t o n e t o c o m b i n e d p r e g n e n o l o n e a n d 5 - p r e g n e n e - 3 / 3 , 2 0 a - d i o lw a s l a r g e r w i t h t h e 0 . 1 , u C i / m l t h a n w i t h t h e 1 , u C i / m lc o n c e n t r a t i o n , b u t i t w a s a b o u t t h e s a m e w h e n e x p r e s s e d i nf m o l p e r mg o f DNA p e r 2 4 h r ( T a b l e 4 ) . No s t e r o i d s w e r e

d e t e c t e d w i t h a 1 0 , C i / m l c o n c e n t r a t i o n o f [ 3 H ] m e v a l o n o .

T a b l e 3 . R e v e r s e i s o t o p i c d i l u t i o n o f 5 - [ 3 H ] p r e g n e n e - 3 f 3 , 2 0 a - d i o lf o r m e d a f t e r i n c u b a t i o n o f o l i g o d e n d r o c y t e m i t o c h o n d r i a w i t h

[ 3 H ] c h o l e s t e r o l

S p e c i f i c a c t i v i t i e s , d p m / n g

M o t h e r C/ MS o l v e n t s C r y s t a l s ( C ) l i q u o r s ( M ) r a t i o

E t h y l a c e t a t e / c y c l o h e x a n e 3 0 0 7 6 8 5 0 0 . 4 4

A c e t o n e / h e x a n e 2 2 5 5 3 1 4 4 0 . 7 1E t h y l a c e t a t e / h e x a n e 2 3 9 3 2 5 1 9 0 . 9 5

A c e t o n e / c y c l o h e x a n e 2 3 1 3 2 0 0 9 1 . 1 5T h e o r e t i c a l 3 7 9 2

5 - P r e g n e n e - 3 , 3 , 2 0 a - d i o l ( 1 0 m g ) was m i x e d w i t h 3 7 , 9 2 0 d p m o f

p u t a t i v e 5 - [ 3 H ] p r e g n e n e - 3 , 3 , 2 0 a - d i o l f o r m e d f r o m [ 3 H ~ c h o l e s t e r o l .

B i o c h e m i s t r y : Hu e t a l .



P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 )

T a b l e 4 . [ 3 H ] M e v a l o n o l a c t o n e (MVA) m e t a b o l i s m b y g l i a l c e l l c u l t u r e s

R a d i o a c t i v i t y i n M e t a b o l i t e s i n c e l l e x t r a c tc e l l e x t r a c t , %

[ 3 H ] M V A p e r o f [ 3 H ] M V A i n C h I I l a I + I l a , f m o l p e r mgi n c u b a t i o n , p m o l m e d i u m % t o t a l r a d i o a c t i v i t y o f DNA p e r 2 4 h r

C o n t r o l 3 1 0 . 9 7 . 2 1 5 . 0 1 1 . 0 1 4 0Bt2cAMP 2 8 2 . 0 1 7 . 0 1 7 . 0 7 . 0 2 7 0

C o n t r o l 1 6 8 0 . 9 9 . 4 1 . 9 2 . 7 1 3 0

Bt2cAMP 1 7 5 1 . 0 6 . 8 6 . 7 0 . 7 2 5 0T h e g l i a l c e l l s f r o m 2 1 - d a y - o l d r a t f e t a l f o r e b r a i n s w e r e c u l t u r e d f o r 3 w e e k s a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . F r e s h

c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n i n g [ 3 H ] M V A a t t h e c o n c e n t r a t i o n s i n d i c a t e d w a s t h e n a d d e d f o r 4 8 h r a n d t h e c e l l u l a r r a d i o a c t i v i t yw a s a n a l y z e d . C h o l , c h o l e s t e r o l ; I , p r e g n e n o l o n e ; I l a , 5 - p r e g n e n e - 3 1 3 , 2 0 a - d i o l ; B t 2 c A M P , d i b u t y r y l cAMP.

l a c t o n e . I n c u l t u r e s i n w h i c h d i b u t y r y l cAMP w a s a d d e d t ot h e c u l t u r e m e d i u m , t h e c o n v e r s i o n o f [ 3 H ] m e v a l o n o l a c t o n et o c o m b i n e d p r e g n e n o l o n e a n d 5 - p r e g n e n e - 3 , 8 , 2 0 a - d i o l w a sa l m o s t t w i c e a s l a r g e a s i n t h e c o n t r o l c u l t u r e s . C o m p o u n d sm o r e p o l a r t h a n 5 - p r e g n e n e - 3 , f , 2 0 a - d i o l w e r e a l s o o b s e r v e d ,a s i n t h e e x p e r i m e n t s w i t h o l i g o d e n d r o c y t e m i t o c h o n d r i a .

DISCUSSION

P r e g n e n o l o ne h a s b e e n p r e v i o u s l y d e t e c t e d a n d m e a s u r e dt h r o u g h o u t t h e b r a i n ( 2 ) . B a s e d o n t h e r e s u l t s o b t a i n e d a f t e r

a d r e n a l e c t o m y a n d c a s t r a t i o n ( 2 ) , a n d o n t h e o n t o g e n e t i cp a t t e r n o f p r e g n e n o l o n e c o n c e n t r a t i o n s ( 3 ) , we c o n c l u d e dt h a t b r a i n p r e g n e n o l o n e w a s a p p a r e n t l y i n d e p e n d e n t o f

p e r i p h e r a l s o u r c e s . We a t t e m p t e d b u t f a i l e d t o o b t a i n t h ef o r m a t i o n o f r a d i o a c t i v e p r e g n e n o l o n e a f t e r i n c u b a t i o n o f[ 3 H ] c h o l e s t e r o l o r [ 3 H ] m e v a l o n a t e w i t h b r a i n s l i c e s , h o m o g -e n a t e s , o r m i t o c h o n d r i a . T h e n e g a t i v e r e s u l t s w e r e p r o b a b l yd u e t o t h e r e l a t i v e l y l o w n u m b e r o f o l i g o d e n d r o c y t e s i nw h o l e b r a i n , a n d / o r t o t h e l a c k o f a c c es s o f r a d i o a c t i v ep r e c u r s o r i n t o m i t o c h o n d r i a o f c e l l s e m b e d d e d i n m y e l i ns h e e t s . I n f a c t , we h a d p r e v i o u s l y o b s e r v e d s y n t h e s i s o fp r e g n e n o l o n e b y c u l t u r e d r a t C 6 g l i o m a c e l l s i n c u b a t e d w i t h

m e v a l o n a t e o r c h o l e s t e r o l ( 3 ) . T h e r e l e v a n c e o f t h i s f i n d i n g t ot h e p h y s i o l o g i c a l s i t u a t i o n i n n o r m a l g l i a l c e l l s , h o w e v e r , w a su n c e r t a i n . I n c i d e n t a l l y , n e g a t i v e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t ht w o n e u r o b l a s t o m a c e l l l i n e s ( n e u r o - 2 a a n d NOF) a n d w i t h

t h e m o u s e f i b r o b l a s t L - 9 1 9 c e l l l i n e . T h e r e f o r e , t h e i m m u -n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f P - 4 5 0 a n d o f a d r e n o d o x i n i nt h e w h i t e m a t t e r w a s c r i t i c a l i n d e s i g n a t i n g o l i g o d e n d r o c y t e sa s a c e l l t y p e l i k e l y r e s p o n s i b l e f o r s t e r o i d p r o d u c t i o n ( 8 ) .

I n t h i s r e p o r t , we s h o w t h a t p r e p a r a t i o n s e n r i c h e d i n r a to l i g o d e n d r o g l i a l c e l l s c a n i n d ee d p e r f o r m t h e c o n v er s i o n o fc h o l e s t e r o l t o p r e g n e n o l o n e , t o 5 - p r e g n e n e - 3 , 8 , 2 0 a - d i o l , a n dt o p o l a r u n i d e n t i f i e d c o m p o u n d ( s ) , l i k e w i s e h y d r o x y l a t e d

m e t a b o l i t e ( s ) o f p r e gn en o l o ne , t h u s s h o w i n g t h a t t h e s i d e -c h a i n c l e a v a g e m e c h a n i s m i s n o t r e s t r i c t e d t o s t e r o i d o g e n i ce n d o c r i n e g l a n d s a n d c a n o c c u r i n c e l l s o f t h e c e n t r a l n e r v o u s

s y s t e m . T h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t w o i d e n t i f i e d s t e r o i d sw a s b a s e d o n c h r o m a t o g r a p h y i n s e v e r a l s y s t e m s , f o r m a t i o n

o f a c e t a t e d e r i v a t i v e s a n d r e c h r o m a t o g r a p h y , a n d c r y s t a l l i -z a t i o n t o c o n s t a n t s p e c i f i c a c t i v i t y a f t e r i s o t o p i c d i l u t i o n . T h ep r e s e n c e o f 2 0 a - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y h a sb e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d i n r a t a n d b a b o o n b r a i n ( 1 5 ) .

T h e d e m o n s t r a t i o n o f d e n o v o s t e r o i d b i o s y n t h e s i s b yn o r m a l b r a i n c e l l s b r i n g s a d d i t i o n a l s u p p o r t t o t h e t e r m o f" n e u r o s t e r o i d s " a p p l i e d t o b r a i n p r e g n e n o l o n e a n d d e h y d r o -

e p i a n d r o s t e r o n e .P r e g n e n o l o n e i s f o u n d i n b r a i n n o t o n l y a s t h e u n c o n j u -

g a t e d s t e r o i d , b u t a l s o a s t h e s u l f a t e e s t e r a n d , q u a n t i t a t i v e l y ,m o s t l y a s f a t t y a c i d e s t e r s ( 3 , 1 6 ) . S i n c e c h o l e s t e r o l s u l f a t ea n d s h o r t - c h a i n f a t t y a c i d e s t e r s c a n b e s u b s t r a t e s o f t h es i d e - c h a i n c l e a v a g e c o m p l e x e s ( 7 ) , e x p e r i m e n t s w i l l b e n e c -e s s a r y t o e v a l u a t e t h e i r e f f i c i e n c y a s p r e c u r s o r s o f p r e g n e n -

o l o n e i n t h e b r a i n .

I n t h e a d u l t m a l e r a t , t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r e g n e n o l o n ew a s o f t h e o r d er o f 1 0 0 p m o l p e r g o f t i s s u e ( i n c l u d i n g t h e

u n c o n j u g a t e d , s u l f a t e , a n d f a t t y a c i d e s t e r f o r m s ) , w i t h l a r g e ra m o u n t s i n t h e o l f a c t o r y b u l b s a n d h y p o t h a l a m u s , a n d

s m a l l e r o n e s i n t h e c e r e b r a l c o r t e x , a l t h o u g h w i t h i n t h e s a m eo r d e r o f m a g n i t u d e ( 3 ) . S u c h g e n e r a l i z e d d i s t r i b u t i o n c a n no wb e e x p l a i n e d b y a p r o p e r t y o f o l i g o d e n d r o c y t e s , w h a t e v e rt h e i r l o c a l i z a t i o n i n b r a i n .

I n o l i g o d e n d r o c y t e s , p r e g n e n o l o n e may u n d e r g o f u r t h e rm e t a b o l i s m t o t h e C - 1 9 s t e r o i d , s i d e - c h a i n c l e a v e d d e h y d r o -

e p i a n d r o s t e r o n e , a n d / o r t o p r o g e s t e r o n e a n d / o r 5 - p r e g n e n e -

3 j 3 , 2 0 a - d i o l , a n d / o r t o c o n j u g a t e s ( s u l f a t e a n d f a t t y a c i de s t e r s ) . T h e d e mo n s t r a t i o n o f s t e r o i d f o r m a t i o n i s p r e s e n t l yl i m i t e d t o t h e r a t s p e c i e s . H o w e v e r , we know t h a t p r e g n e n -

o l o n e p e r s i s t s i n m o n k e y b r a i n a f t e r c a s t r a t i o n a n d a d r e n a l

s u p p r e s s i o n ( 1 6 ) . F u r t h e r m o r e , i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s ,l i k e w i s e n e u r o n s , h a v e b e e n f o u n d i n s e v e r a l r a t b r a i n a r e a s

r e l a t e d t o o l f a c t o r y p a t h w a y s ( 8 ) . T h u s , s t e r o i d o g e n e s i sp r e s u m a b l y ma y n o t b e r e s t r i c t e d t o g l i a l c e l l s . Ho w t h i so b s e r v a t i o n r e l a t e s t o t h e v a r i a t i o n o f p r e g n e n o l o n e r e c o r d e di n d i f f e r e n t p a r t s o f m a l e r a t b r a i n e x p o s e d t o t h e s c e n t o f

e i t h e r m a l e s o r f e m a l e s ( 1 7 ) m e r i t s f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n .T h e p h y s i o l o g i c a l r o l e s o f p r e g n e n o l o n e a s a n e u r o s t e r o i d

a n d i t s m e c h a n i s m ( s ) o f a c t i o n a r e s t i l l p o o r l y u n d e r s t o o d .

T h e c o n v e r s i o n o f p r e g n e n o l o n e t o p r o g e s t e r o n e i s a l r e a d yd o c u m e n t e d . D i r e c t a p p l i c a t i o n o f p r e g n e n o l o n e s u l f a t e h a s

b e e n r e p o r t e d t o c h a n g e t h e f i r i n g r a t e s o f s i n g l e n e u r o n s ( 3 ) .

P r e g n e n o l o n e c o u l d b i n d t o y e t u n s u s p e c t e d r e c e p t o r ( s ) ,i n t r a c e l l u l a r o r l o c a t e d a t t h e m e m b r a n e l e v e l . I n f a v o r o f t h el a s t p o s s i b i l i t y , a r e c e n t r e p o r t i n d i c a t e s t h a t p r e g n e n o l o n es u l f a t e i n t e r a c t s w i t h t h e y - a m i n o b u t y r i c a c i d ( G A B A ) r e -c e p t o r a n d b e h a v e s a s a n a n t a g o n i s t o f G A B A e r g i c n e u r o -

t r a n s m i s s i o n ( 1 8 ) .

E . B . i s r e c i p i e n t o f a R o u s s e l - U c l a f f e l l o w s h i p .

1 . C o r p e c h o t , C . , R o b e l , P . , A x e l s o n , M . , S j o v a l l , J . & B a u l i e u ,E . E . ( 1 9 8 1 ) P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 8 , 4 7 0 4 - 4 7 0 7 .

2 . C o r p e c h o t , C . , S y n g u e l a k i s , M . , T a l h a , S . , A x e l s o n , M . ,S j o v a l l , J . , V i h k o , R . , B a u l i e u , E . E . & R o b e l , P . ( 1 9 8 3 ) B r a i n

R e s . 2 7 0 , 1 1 9 - 1 2 5 .3 . R o b e l , P . , C o r p e c h o t , C . , C l a r k e , C . , G r o y e r , A . , S y n g u e l a k i s ,

M . , V o u r c ' h , C . & B a u l i e u , E . E . ( 1 9 8 6 ) i n N e u r o e n d o c r i n eM o l e c u l a r B i o l o g y , e d s . F i n k , G . , H a r m a r , A . J . & M c K e r n s ,K . W. ( P l e n u m , New Y o r k ) , p p . 3 6 7 - 3 7 7 .

4 . L i e b e r m a n , S . J . ( 1 9 8 6 ) E n d o c r i n o l o g y 1 1 1 , 5 1 9 - 5 2 9 .5 . H e c h t e r , O . , Z a f f a r o n i , A . , J a c o b s o n , R . P . , L e v y , H . ,

J e a n l o z , R . W . , S c h e n k e r , V . & P i n c u s , G . ( 1 9 5 1 ) R e c e n t

P r o g . H o r m . R e s . 6 , 2 1 5 - 2 4 6 .

6 . B r o w n , M . S . , K o v a n e n , P . T . & G o l d s t e i n , J . L . ( 1 9 7 9 )R e c e n t P r o g . H o r m . R e s . 3 5 , 2 1 5 - 2 5 7 .

7 . L i e b e r m a n , S . , G r e e n f i e l d , N . S . & W o l f s o n , A . ( 1 9 8 1 ) E n -

d o c r . R e v . 5 , 1 2 8 - 1 4 8 .

8 . L e G o a s c o g n e , C . , R o b e l , P . , G o u ~ z o u , M . , S a n a n e s , N . ,B a u l i e u , E . E . & W a t e r m a n , M . ( 1 9 8 7 ) S c i e n c e 2 3 7 ,1 2 1 2 - 1 2 1 5 .

9 . L i s a k , R . P . , P l e a s u r e , D . W . , S i l b e r g , D . H . , M a n n i n g , M . C .& S a i d a , T . ( 1 9 8 1 ) B r a i n R e s . 2 2 3 , 1 0 7 - 1 2 2 .

1 0 . H i r a m a y a , M . , S i l b e r b e r g , D . H . , L i s a k , R . P . & P l e a s u r e ,

8 2 1 8 B i o c h e m i s t r y : Hu e t a l .



B i o c h e m i s t r y : Hu e t a l .

D . E . ( 1 9 8 3 ) J . N e u r o p a t h o l . E x p . N e u r o l . 4 2 , 1 6 - 2 8 .1 1 . D e m b r i , A . & M i c h e l , R . ( 1 9 8 1 ) C . R . S e a n c e s S o c . B i o l . P a r i s

7 5 , 4 5 7 - 4 6 1 .1 2 . M a s o n , J . I . , M u r r y , B . A . , O l c o t t , M . & S h e e t s , J . L . ( 1 9 8 5 )

B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 4 , 1 0 8 7 - 1 0 9 2 .

1 3 . H o c h b e r g , R . B . , V a n d e r H o e v e n , T . A . , W e l c h , M . &L i e b e r m a n , S . ( 1 9 7 4 ) B i o c h e m i s t r y 1 3 , 6 0 3 - 6 0 9 .

1 4 . Y a v i n , E . & Y a v i n , Z . ( 1 9 8 3 ) J . C e l l . B i o . 6 2 , 5 4 0 - 5 4 6 .1 5 . H e r r m a n n , W. L . , L e R o y H e i n r i c h s , W . & T a b e i , T . ( 1 9 7 3 )

Am . J . O b s t e t . G y n e c o l . 1 1 7 , 6 7 9 - 6 8 8 .

P r o c . N a t i . A c a d . S c i . USA 8 4 ( 1 9 8 7 ) 8 2 1 9

1 6 . R o b e l , P . , B o u r r e a u , E . , C o r p d c h o t , C . , D a n g , D . , H a l b e r g ,

F . , C l a r k e , C . , H a u g , M . , S c h l e g e l , M . L . , S y n g u e l a k i s , M . ,V o u r c ' h , C . & B a u l i e u , E . E . ( 1 9 8 7 ) J . S t e r o i d B i o c h e m . 2 6 , i np r e s s .

1 7 . B a u l i e u , E . E . , R o b e l , P . , V a t i e r , O . , H a u g , M . , L eG o a s c o g n e , C . & B o u r r e a u , E . ( 1 9 8 7 ) i n R e c e p t o r I n t e r a c -t i o n s , e d s . F u x e, K . & A g n a t i , L . F . ( M a c m i l l a n , B a s i n g s t o k e ,

U . K . ) , i n p r e s s .1 8 . M a j e w s k a , M . D . & S c h w a r t z , R . D . ( 1 9 8 7 ) B r a i n R e s . 4 0 4 ,

3 5 5 - 3 6 0 .

zong yi hu et al- neurosteroids: oligodendrocyte mitochondria convert cholesterol to pregnenolone

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