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Rodrigo José Custodio

Hipóxia sanguínea relacionada a doenças respiratórias agudas e a regulação do

sistema IGF em crianças.

Tese de doutorado apresentada à

Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo

para obtenção do título de Doutor em

Saúde da Criança e do Adolescente –

Opção: Investigação em Pediatria.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Eduardo

Martinelli Júnior

Ribeirão Preto

2010

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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Catalogação da Publicação

Preparada pela Biblioteca Central do Campus da Universidade de São Paulo de

Ribeirão Preto

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo

FICHA CATALOGRÁFICA

Custodio, Rodrigo José

Hipóxia sanguínea relacionada a doenças respiratórias agudas

e a regulação do sistema IGF em crianças. Ribeirão Preto, 2010.

129 p.: il. ; 30cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Saúde da Criança e do

Adolescente – Opção: Investigação em Pediatria.

Orientador: Martinelli Júnior, Carlos Eduardo.

1. IGF. 2. IGFBPs. 3. IGF1R. 4. Hipóxia. 5. Criança.

Custodio RJ. Hipóxia sanguínea relacionada a doenças respiratórias agudas e a

regulação do sistema IGF em crianças.

Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Saúde da Criança e do

Adolescente – Opção: Investigação em Pediatria.

Aprovado em:

Banca Examinadora

Prof. Dr.________________________________ Instituição:_____________________

Julgamento:______________________________ Assinatura:_____________________









Dedicatória

Aos meus inesquecíveis e amados pais, Vanderlei (in memorian) e Neli,

paradigmas de retidão e honestidade que alicerçaram no esforço contínuo todo o meu

progresso;

Aos meus irmãos, Fabrício, Letícia e Ludmila: a palavra irmão encerra

tudo;

Aos meus cunhados Carla, Júnior e Rogério por completarem a grande

família;

Aos meus sobrinhos Giovana, Enzo, Laura e Isadora pela imensa alegria

que nos proporcionam;

Aos meus sogros, Antônio e Maria, colaboradores sempre presentes e

zelosos, impossível imaginar a conclusão desse trabalho sem o enorme auxílio prestado;

À Viviane. Minha eterna colega de sala de aula, namorada, noiva, esposa,

colega de profissão, mãe, crítica, pesquisadora, entusiasta Viviane. Pessoa, que viveu, e

vive profundamente todos os meus mais importantes momentos e que realmente sabe

como os sinto;

Ao Plínio e ao Henrique, que trouxeram consigo uma nova perspectiva

para a minha vida, e que, nesse pouco tempo de convívio, já mudaram meus passos

diversas vezes, ensinando-me a enxergar muito além dos meus prévios e parcos limites.

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Martinelli Júnior pela orientação segura,

tranquila e sempre otimista durante a condução desse estudo; pela minha formação em

endocrinologia pediátrica e muito além dela; pela convivência deveras agradável como

colega na endocrinologia; pela amizade honesta e cuidadosa que surgiu durante todos

esses anos; enfim, por ter apontado direções na minha vida que jamais imaginei nem

sequer entrever, obrigado.

Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Scrideli, além de proporcionar toda

disponibilidade do Laboratório de Pediatria do HCFMRPUSP, colaborou com sugestões

imprescindíveis quanto às técnicas laboratoriais e análise da expressão do gene IGF1R;

as observações, sempre pertinentes, foram fundamentais para o avanço desse estudo.

À Profa. Dra. Palmira Cupo e à Profa. Dra. Sylvia Evelyn Hering pelos

exemplos que são como professoras e pediatras, e por toda a colaboração constante na

minha formação como médico. Pela oportunidade de trabalhar na Enfermaria de

Pediatria da Unidade de Emergência do HCFMRPUSP onde pude aprender muito e em

diversas dimensões, principalmente na maneira como atua um médico; enfim, pela

colaboração no recrutamento de indivíduos participantes desse estudo oriundos da

Enfermaria pela qual são responsáveis. Agradeço também, especialmente à Profa. Dra.

Palmira, pelas valiosas sugestões na elaboração desse estudo.

À Profa. Dra. Maria Célia Cervi e à Dra. Márcia de Lima Isaac pelo

auxílio em efetuar as observações em pacientes internados sob seus cuidados na

Enfermaria de Moléstias Infecciosas da Unidade de Emergência do HCFMRPUSP.

À Profa Dra. Enilza Espreáfico que, nesse momento importante, jamais

poderia me esquecer de tudo o que me proporcionou ainda como aluno de iniciação

científica. Foram marcas indeléveis em meu conhecimento como pesquisador que

facilitaram substancialmente o meu progresso acadêmico. Agradeço imensamente.

À Profa. Dra. Alcione Artioli Machado, ao Prof. Dr. João Carlos da

Costa e à Profa. Dra. Maria Inez Machado Fernandes por continuarem o trabalho

cuidadoso da Profa. Enilza, guiando-me pelo método científico, porém naquela ocasião

com enfoque médico.

À equipe de Enfermagem da Pediatria da Unidade de Emergência do

HCFMRPUSP, especialmente, às enfermeiras Suzete, Estela, Ana Cláudia, Valéria,

Márcia, Jaqueline, Sandra e Marilurdes pelo auxílio na coleta das amostras; e a todas

Auxiliares de Enfermagem, em especial à Lindamir, Rita, Maria Antônia, enfim a todas,

pela paciência com que atenderam os meus telefones em momentos mais improváveis.

Aos colegas Regina e Wagner pela convivência e a compreensão durante

a condução desse estudo.

À responsável pelo Laboratório de Toxicologia da Unidade de

Emergência do HCFMRPUSP Maria José Leite e a Consuelo, Juliana, e especialmente à

Marisa Elias Amêndola por ter colaborado de forma constante com o adequado

acondicionamento das amostras, sempre prestativa.

A todos os médicos residentes do Departamento de Puericultura e

Pediatria da FMRPUSP que cumpriram seus programas entre os anos de 2006 e 2009,

pela tolerância com a minha insistência em incluir novos indivíduos no estudo e pela

efetiva inclusão desses. Sem a vigilância desse imenso grupo, esse estudo seria inviável.

A todos os técnicos e pós-graduandos que frequentam e trabalham no

Laboratório de Pediatria do HCFMRPUSP. Não poderia deixar de citar, dentre eles, a

Dra. Rosane Queiroz, Maria Angélica Abdalla de Freitas Cortez, Vanessa da Silva

Silveira, Priscila Leite e Daniel Antunes Moreno, por tudo, enfim, por tudo que me

ensinaram com a mais profunda paciência e rara harmonia vista nesse tipo de ambiente

de trabalho.

Aos pós-graduandos do Departamento de Puericultura e Pediatria,

especialmente àqueles da Divisão de Endocrinologia Pediátrica: Soraya Sader Milani,

Fábio Rosa, Ana Cláudia, Sabrina e Marcelo Ruiz pela convivência, compreensão e

sugestões durante a coleta e análises laboratoriais.

Às secretárias do Departamento de Puericultura e Pediatria da

FMRPUSP, Dulcides, Vera e Sandra pela amizade e colaboração durante toda a pós-

graduação.

Às famílias das crianças que permitiram a inclusão de seus filhos nesse

estudo: agradeço profundamente.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) e

ao Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq) pelo auxílio financeiro.

“Sonhar é acordar-se para dentro”.

Mário Quintana

“...Ah, eu quero te dizer que o instante de te ver custou tanto penar

Não vou me arrepender,

Só vim te convencer que eu vim prá não morrer

De tanto te esperar,

Eu quero te contar das chuvas que apanhei

Das noites que varei

No escuro a te buscar

Eu quero te mostrar

As marcas que ganhei

Nas lutas contra o rei

Nas discussões com Deus,

E agora que cheguei

Eu quero a recompensa

Eu quero a prenda imensa

Dos carinhos teus...”

Chico Buarque de Hollanda.

Resumo

CUSTODIO RJ. Hipóxia sanguínea relacionada a doenças respiratórias agudas e a

regulação do sistema IGF em crianças [tese]. Ribeirão Preto: Universidade de São

Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2010. 129 f.

A hipóxia, relacionada à restrição do crescimento intra-uterino em

animais, foi capaz de promover aumento na concentração sérica da IGFBP-1 sem

alterações nas concentrações séricas de IGF-I. Além disso, a hipóxia grave provoca

aumento na expressão do IGF1R de cones neuronais de crescimento dos fetos de

ovelhas. Entretanto, em situações clínicas graves, houve redução das concentrações

séricas do IGF-I e aumento da IGFBP-1 sérica. Porém, há pouca informação sobre a

regulação do sistema IGF exercida pela hipóxia aguda em humanos. O objetivo desse

estudo foi avaliar o sistema IGF e sua relação com a hipóxia aguda em crianças

previamente normais. Para tanto foram dosadas as concentrações séricas de IGF-I,

IGFBP-1, IGFBP-3 e insulina e quantificada a expressão do IGF1R em linfócitos de 27

crianças (14 meninos e 13 meninas) de 15 dias a 9,5 anos de idade com hipóxia aguda

devida a problemas respiratórios e após sua recuperação, na mesma criança cujos

valores são mostrados em médias (±DP) e medianas (P25 – P75). As concentrações de

IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3 e insulina foram determinadas por ELISA específico. Os

linfócitos periféricos foram isolados de outras células utilizando Fycoll-Hypaque® e,

após, o RNA foi extraído. A expressão do mRNA do IGF1R foi obtida mediante

realização de RT-PCR em tempo real. As análises estatísticas foram realizadas por

pareamento. A saturação de oxigênio foi 87,8 (±3,5)% durante a hipóxia e 96,3

(±1,2)% após recuperação (p<0.0001). Houve redução das concentrações séricas de

IGF-I durante a hipóxia aguda: 21,3 (±37,8) e 60,2 (±58,6); e medianas de 12,3 (6,24 –

20,14) e 54,8 (24,51 – 72) ng/ml (p < 0,0001); assim como das concentrações séricas da

IGFBP-3: 1,53 (±0,8) e 2,34 (±0,7); e medianas de 1,32 (0,86 – 2,17) e 2,25 (1,9 – 2,78)

mg/l (p = 0,0002). As concentrações séricas da IGFBP-1 aumentaram na hipóxia: 135,3

(±79,3) e 75,2 (±55,5); e medianas de 115,5 (77,4 – 171,6) e 68,5 (28,25 – 106,8) ng/ml

(p = 0,0014). As concentrações séricas de insulina permaneceram inalteradas: 11,7 (±7)

e 14,5 (±9,6) e medianas de 9,1 (8,48 – 11,1) e 9,8 (8,79 – 18,6) µUI/ml, nas situações

de hipóxia e sem hipóxia (p = 0,132), respectivamente. Houve aumento da expressão do

IGF1R nos linfócitos onde as médias e medianas durante a hipóxia e sem hipóxia foram

de 1,61 (±1,26) e 1,21 (±1,1); e de 1,28 (0,8 – 2,11) e 0,93 (0,41 – 1,7),

respectivamente. Após pareamento, houve diferença significativa na expressão do

IGF1R entre as duas situações (p = 0,0373). Os dados apresentados, analisados em

conjunto, sugerem que a hipóxia aguda, provavelmente, associada a fatores infecciosos,

foi capaz de estimular alterações do sistema IGF com a redução do estímulo anabólico

provocado pelo IGF-I e o aumento na expressão do gene codificador do IGF1R sugere

um mecanismo compensatório de ativação tecidual.

Palavras-chave: sistema IGF, hipóxia, crianças.

Abstract - Summary

CUSTODIO RJ. Blood hypoxia related to acute respiratory diseases and the

regulation of the IGF system in children [thesis]. Ribeirão Preto: Universidade de São

Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2010. 129 f.

Hypoxia related to intrauterine growth restriction promotes an increase in

serum IGFBP-1 concentrations in animals, with no changes in serum IGF-I

concentrations. In addition, severe hypoxia provokes an increase in IGF1R expression

in the neuronal growth cones of sheep fetuses. However, in serious clinical situations

there is a reduction of serum IGF-1 and an increase of serum IGFBP-1. Little

information is available about the regulation of the IGF system by acute hypoxia in

humans. The objective of the present study was to assess the IGF system and its relation

to acute hypoxia in previously normal children. To this end, the serum concentrations of

IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3 and insulin were determined and the expression of IGF1R

was quantitated in the lymphocytes of 27 children (14 boys and 13 girls) aged 15 days

to 9.5 years with acute hypoxia due to respiratory problems, during the crisis and after

their recovery. Data are reported as means ± SD and medians (P25 – P75). IGF-I, IGFBP-

1, IGFBP-3 and insulin concentrations were determined by specific ELISA. Peripheral

lymphocytes were isolated from other cells using Fycoll-Hypaque® and RNA was then

extracted. The expression of IGF1R mRNA was obtained by real time RT-PCR.

Statistical analyses were performed by pairing. Oxygen saturation was 87.8 ± 3.5%

during hypoxia and 96.3 ± 1.2% after recovery (p<0.0001). Mean serum IGF-I

concentrations were reduced during acute hypoxia: 213 ± 37.8 and 60.2 ± 58.6, with

medians of 12.3 (6.24 – 20.14) and 54.8 (24.51 – 72) ng/ml (p < 0.0001); as also were

mean serum IGFBP-3 concentrations: 1.53 ± 0.8 and 2.34 ± 0.7, with medians of 1.32

(0.86 – 2.17) and 2.25 (1.9 – 2.78) mg/l (p = 0.0002). Mean serum IGFBP-1

concentrations increased during hypoxia: 135.3 ± 79.3 and 75.2 ± 55.5, with medians of

115.5 (77.4 – 171.6) and 68.5 (28.25 – 106.8) ng/ml (p = 0.0014). Mean serum insulin

concentrations were unchanged: 11.7 ± 7 and 14.5 ± 9.6, with medians of 9.1 (8.48 –

11.1) and 9.8 (8.79 – 18.6) µIU/ml, in the presence and absence of hypoxia (p = 0.132),

respectively. There was an increase in IGF1R expression in lymphocytes, with means

and medians in the presence and absence of hypoxia of 1.61 ± 1.26 and 1.21 ±1.1, and

1.28 (0.8 – 2.11) and 0.93 (0.41 – 1.7), respectively. After pairing, a significant

difference in IGF1R expression was observed between the two situations (p = 0.0373).

Taken as a whole, these data suggest that acute hypoxia, probably associated with

infectious factors, was able to stimulate changes in the IGF system leading to the

reduction of the anabolic stimulus provoked by IGF-I and the increased expression of

the gene coding for IGF1R suggests a compensatory tissue-activating mechanism.

Key-words: IGF system, hypoxia, children.

Lista de abreviaturas

ADAM-9: a disintegrin and metallo-protease-9;

ALS: subunidade protéica ácido-lábil;

Bcl2 e BclX: nomenclatura derivada de B cell lymphoma;

cDNA: DNA complementar;

CRE: elementos regulatórios responsivos ao AMPc;

DEPC: dietilpirocarbonato;

DNA: ácido desoxirribonucléico;

dNTPs: desoxirribonucleotídeos fosfatados;

DP: desvio-padrão;

EDP: escore de desvio-padrão;

EDTA: etil-diamino-tetracético;

Foxo1, -o3: fator de transcrição forkhead box O1, -O3

GH: growth hormone ou hormônio de crescimento;

HIF-1 α e β: hypoxia-inducible factor-1 α e β;

HOMA-IR: homeostasis model assessment of insulin resistance;

HRE: elementos de resposta à hipóxia;

HRP: peroxidase de rábano;

IGF-I, -II: insulin-like growth factor -I, –II, ou fator de crescimento

insulina símile I, -II;

IGF1R: receptor tipo 1 de IGFs;

IGF2R: receptor tipo 2 de IGFs;

IGFBPs: Insulin-like growth factor binding proteins ou proteínas ligantes

de IGFs;

IGFBP-rPs: IGFBP-related proteins ou proteínas relacionadas às

IGFBPs;

IRS-1 e -2: substrato do receptor de insulina-1, -2;

Kb: quilobases;

Kd: dissociation constant ou constante de dissociação

kDa: quilodaltons;

MAPK: mitogen-activated protein kinase ou proteína cinase mitogênica

ativada;

MPC: morte celular programada;

mRNA: RNA mensageiro;

mTOR: mammalian target of rapamycin;

NSILA: nonsuppressible insulin-like activity ou atividade insulina-simile

não suprimível;

PAPP-A: pregnancy-associated plasma protein-A;

pb: pares de bases;

PBS: phosphate-buffered saline;

PDK-1: phosphoinositide-dependent kinase-1 ou fosfoinositol-

dependente cinase-1;

PI3K: phosphoinositide 3-kinase ou fosfatidil-inusitol-3-cinase;

PIP3: fosfatidilinositol 3,4,5-fosfato;

PKA: proteína cinase A;

PKB: Akt/proteína cinase B;

proMBP: pró-forma da proteína básica maior de eosinófilos;

QR: Quantificação relativa;

RCIU: restrição do crescimento intra-uterino;

RN: recém-nascido;

RNA: ácido ribonucléico;

RT-PCR: reverse transcription polymerase chain reaction ou transcrição

reversa - reação em cadeia da polimerase;

qPCR: PCR em tempo real;

RNs: Recém-nascidos;

RPM: rotações por minuto;

SH2: Src homology 2;

TGF- β: transforming growth factor-β;

TMB: tetrametilbenzidina.

SUMÁRIO

I - Introdução.................................................................................................................17

I.1 – O sistema IGF..........................................................................................................18

I.2 – Os receptores de IGFs.............................................................................................21

I.3 – As proteínas transportadoras dos IGFs....................................................................26

I.4 - O sistema IGF e sua relação com situações de hipóxia...........................................38

II – Objetivos..................................................................................................................44

III – Casuística e Métodos.............................................................................................46

III.1 – Crianças participantes...........................................................................................47

III.2 - Critérios de Exclusão............................................................................................50

III.3 - Desenho Experimental..........................................................................................51

III.4 - Dosagem Laboratorial...........................................................................................53

III.4.1. - Ensaio imunoenzimático do IGF-I....................................................................53

III.4.2 - Ensaio imunoenzimático da IGFBP-1................................................................54

III.4.3 - Ensaio imunoenzimático da IGFBP-3................................................................56

III.4.4 - Ensaio imunoenzimático de insulina..................................................................57

III.5 - Avaliação da expressão do IGF1R........................................................................59

III.5.1 – Separação de linfócitos......................................................................................59

III.5.2 – Extração do RNA...............................................................................................60

III.5.3 – Quantificação do RNA......................................................................................61

III.5.4 – Síntese da primeira fita de cDNA......................................................................61

III.5.5 – Controles endógenos.........................................................................................62

III.5.6 – RT-PCR.............................................................................................................62

III.5.7 – qPCR..................................................................................................................65

III.5.8 – Quantificação da expressão gênica....................................................................69

III.6 - Análise estatística..................................................................................................70

IV – Resultados..............................................................................................................71

IV.1 – Concentrações séricas de IGF-I...........................................................................72

IV.2 – Concentrações séricas de IGFBP-1.....................................................................75

IV.3 – Concentrações séricas de IGFBP-3.....................................................................78

IV.4 – Concentrações séricas de Insulina.......................................................................81

IV.5 – Expressão do IGF1R...........................................................................................84

IV.6 – Síntese dos resultados...........................................................................................88

V – Discussão..................................................................................................................90

VI – Conclusões............................................................................................................107

VII – Referências bibliográficas.................................................................................109

VIII – Apêndices e Anexos..........................................................................................126

17

I – Introdução

18

I.1 - O sistema IGF

O crescimento e o desenvolvimento do corpo humano são regulados por uma

rede complexa de fatores de ação local e sistêmica, dentre esses podem ser destacados os

integrantes do denominado sistema IGF.

Historicamente, verificou-se que os efeitos promotores do crescimento

provocados pelo hormônio de crescimento ou GH eram mediados por um fator hepático,

inicialmente chamado de “fator de sulfatação”, que tinha sua síntese estimulada pelo

próprio GH (SALMON; DAUGHDAY, 1957; HALL, 1972). Simultaneamente, outro

grupo de pesquisadores identificou uma fração, de atividade semelhante à insulina, presente

no soro, que não era suprimível quando adicionados anticorpos anti-insulina, chamada de

NSILA (FROESCH et al., 1963; ZAPF et al., 1978). Posteriormente, observou-se que esses

dois fatores eram idênticos, sendo unificada a nomenclatura para “somatomedinas”, termo

que permaneceu até o momento no qual foram sequenciados e, a partir de então, chamados

de IGFs.

A família dos IGFs é composta por 2 fatores de crescimento peptídicos: o

IGF-I e o IGF-II. Ambos apresentam alto grau de homologia com a pró-insulina, pois suas

estruturas são compostas por 4 domínios (A, B, C e D) sendo os 3 primeiros similares ao

pró-hormônio e 50% das sequências de aminoácidos dos IGFs são semelhantes à molécula

de insulina (JUUL, 2003). As moléculas do IGF-I e do IGF-II são compostas por

sequências únicas de 70 e 67 aminoácidos, respectivamente. Apresentam estruturas

constituídas por 3 pontes dissulfídricas internas sendo que o peso molecular do IGF-I é de

19

7649 dáltons e do IGF-II é de 7471 dáltons. Na figura 1 estão esquematizadas as moléculas

de IGF-I e IGF-II.

Figura 1 – Esquemas representativos das moléculas de IGF-I (1a) e IGF-II (1b)

reproduzido de MILANI, 2009 (com autorização). Os círculos brancos representam

aminoácidos distintos entre as moléculas; os verdes aminoácidos comuns e os marrons são

os aminoácidos suprimidos da molécula do IGF-I para a composição do IGF-II.

O gene codificador do IGF-I localiza-se no braço longo do cromossomo 12,

estende-se por 73 kb sendo constituído por 6 exons e 4 promoters. O IGF-II tem o seu gene

20

composto por 9 exons e 4 promoters no braço curto do cromossomo 11 e estende-se por 40

kb (SARA; HALL, 1990; SCHOFIELD, 1991; SUSSENBACH et al., 1991).

Os IGFs são produzidos na maioria dos tecidos e órgãos, entretanto o fígado

é a fonte responsável pela maior parte das concentrações plasmáticas circulantes desses

fatores, o que aponta para as ações tanto endócrinas como parácrinas dos IGFs. Não há

órgão onde ocorra armazenamento e, da mesma forma, não há órgão-alvo específico

(THISSEN; KETELSLEGERS; UNDERWOOD, 1994). Os IGFs apresentam diversas

ações biológicas sendo consideradas principais aquelas relacionadas à proliferação e

diferenciação celulares. IGF-I e IGF-II promovem tanto o aumento na síntese de DNA

quanto a divisão celular, portanto são considerados importantes estímulos mitogênicos

(JONES; CLEMMONS, 1995). São descritos inúmeros tipos celulares, tais como,

osteoblastos, adipócitos e oligodendrócitos nos quais os IGFs atuam como indutores da

diferenciação celular (SARA; HALL, 1990). Ainda no ciclo celular, os IGFs são capazes de

influenciar na MCP, processo no qual ocorre o desmantelamento e o acondicionamento do

material celular. Vários tipos celulares tiveram esse processo inibido pela resultante de

ações promovida pelo sistema IGF. Tal efeito inibidor da MCP foi descrito em

osteoblastos, células de melanoma, mioblastos cardíacos, células neuronais e epiteliais

(VINCENT; FELDMAN, 2002).

Além das ações que influenciam o ciclo celular em geral, os IGFs também

são capazes de mimetizar a ação hipoglicemiante da insulina quando administrados em

bolus. Esse efeito é conseguido mediante o aumento na captação periférica e redução da

produção hepática de glicose, além do aumento da sensibilidade à insulina (JONES;

CLEMMONS, 1995). A diminuição da proteólise e o aumento da síntese protéica são

outros exemplos de ações insulina-símile do IGF-I (MAURAS; BEAUFRERE, 1995).

21

A regulação da síntese dos IGFs é complexa e envolve diversos fatores,

sendo o GH considerado um dos principais promotores da síntese do IGF-I. Em crianças e

adultos normais as concentrações de IGF-I relacionam-se com a secreção espontânea de

GH (RUDMAN et al., 1981; BLUM et al., 1993). Por outro lado, deve ser lembrado que

baixas concentrações séricas de IGF-I são relacionadas à baixa ingestão protéica em

crianças, o que demonstra a influência exercida por outros fatores, como os nutricionais

(BOUHADDIOUI et al., 1989).

I.2 - Os receptores de IGFs

Os IGFs atuam mediante interação com dois receptores diferentes chamados

de IGF1R e IGF2R.

O IGF1R apresenta grande semelhança estrutural com receptor da insulina

sendo ambos compostos por 2 subunidades α e 2 subunidades β de 135 kDa e 90 kDa,

respectivamente (RECHLER; NISSLEY, 1985). Cada subunidade α é ligada a uma

subunidade β através de uma ponte dissulfídrica e as duas subunidades α são interligadas

através de 2 pontes dissulfídricas formando assim um heterotetrâmero β-α-α-β (LEROITH

et al., 1995).

Um resíduo de metionina inicia a estrutura primária do precursor do IGF1R

e é seguido por uma sequência sinalizadora de 30 aminoácidos rica em treonina e serina

precedendo a extremidade N-terminal do receptor. Após o peptídeo sinalizador, um resíduo

de ácido glutâmico inicia a subunidade α que contém uma região rica em cisteína (24

aminoácidos) e 11 sítios potenciais de glicosilação sendo essa subunidade localizada

totalmente na região extracelular. O sítio de clivagem existente entre as subunidades α e β

22

localiza-se entre os aminoácidos 706 e 711, em uma sequência composta por arginina,

lisina, arginina e arginina. Portanto, a cadeia β inicia-se na posição 711 com uma

asparagina. A subunidade β apresenta, em sua porção extracelular, 5 potenciais sítios de

glicosilação que são seguidos por uma única sequência de aminoácidos hidrofóbicos

composta por 24 aminoácidos localizados entre as posições 906 e 929 que perfaz a porção

transmembrânica do IGF1R. Além disso, essa região é flanqueada, em sua porção C-

terminal, por aminoácidos básicos que facilitam a fixação do receptor à membrana. Os

domínios intra-citoplasmáticos das subunidades β que apresentam atividade tirosina-cinase

são localizados numa região composta por 257 aminoácidos entre as posições 973 e 1229.

Esses sítios são capazes de promover a sinalização interna a partir da ligação, em regiões

ricas em cisteína nas subunidades α, com os IGFs (ULLRICH et al., 1986; VINCENT;

FELDMAN, 2002). A estrutura cristalizada de 3 primeiros domínios da subunidade α foi

descrita em 1998 por Garrett et al. Essa região é responsável pela interação desse receptor

com seus ligantes: IGF-I, IGF-II e insulina. Esse fragmento é compostos por 462

aminoácidos distribuídos em 3 domínios: L1, rico em cisteína e L2. Os domínios L1 e 2 são

formados por β hélice única torcida enquanto que o domínio rico em cisteína contém 8

módulos de pontes dissulfídricas e intercala os outros 2. Esses domínios, nessa sequência,

delimitam um espaço central na molécula capaz de comportar moléculas ligantes

(GARRETT et al., 1998). Sob a forma cristalizada, a distância entre os domínios L-1 e -2,

imposta pelo domínio rico em cisteína, parece ser grande, entretanto, em solução,

provavelmente, uma rotação de até 25º do domínio L-2 pode ser capaz de facilitar o contato

de regiões dos domínios L com os ligantes. Com isso, apesar do domínio rico em cisteína

da subunidade α parecer ser o responsável pela alta afinidade do IGF1R aos IGFs, os outros

domínios também colaboram para essa interação, haja vista que mutações nos domínios L

23

provocam alterações nas afinidades com os IGFs (GARRETT et al., 1998; DUPONT et al.,

2003).

O IGF1R tem alta afinidade pelos IGFs e, principalmente, para o IGF-I. A

afinidade para o IGF-II, embora alta, é menor quando ambas são comparadas. Dada a

homologia existente entre o IGF1R e os receptores de insulina, os IGFs podem interagir

com os receptores de insulina, embora com afinidade menor, e, da mesma forma, à insulina

pode ligar-se ao IGF1R com afinidade também menor que os IGFs (NEELY et al., 1991;

JONES; CLEMMONS, 1995).

Após a ligação dos IGFs às cadeias α do IGF1R, ocorre a internalização do

sinal através dos domínios transmembrânicos e as cadeias β respondem com alterações de

conformação que estimulam a atividade tirosina-cinase dessas cadeias em seus respectivos

domínios onde ocorre a autofosforilação nos resíduos de tirosina (O‟CONNOR et al.,

1997).

O IGF1R atua mediante ativação de múltiplas vias de sinalização, dentre elas a

via da PI3K e da MAPK. Como exemplo pode ser citada a expressão do fator de crescimento

vascular endotelial que é induzida via ativação da MAPK em células que expressam

excessivamente o IGF1R (MIELE et al., 2000).

Dentre diversos mecanismos que são ativados após o processo de

autofosforilação nas cadeias β, destacam-se aqueles relacionados com a MCP. Tal

fenômeno é geneticamente programado e facilita a remoção celular pela fagocitose.

Também foi observado que a expressão do IGF1R é relacionada ao grau de indução da

MCP, sendo que a expressão desse receptor diminui a suscetibilidade a esse processo

(RESNICOFF et al., 1995). A regulação da MCP é exemplo de ação mediada pelo IGF1R

onde parte dos mecanismos conhecidos utilizados após a ligação dos IGFs nesse receptor

24

são conhecidos. Nesse processo, uma vez iniciada a autofosforilação, vários substratos

protéicos associados são fosforilados e diversas vias são ativadas sendo que muitas delas

são envolvidas no impedimento da MCP (VINCENT; FELDMAN, 2002). Após a

autofosforilação do IGF1R, a fosforilação do IRS-1 promove a ativação da PI3K, sendo

essa via melhor conhecida nesse efeito da ativação do IGF1R. Essa ativação é obtida

através da ligação entre o domínio SH2 da PI3K ao IRS-1 levando ao aumento do PIP3. Em

concentrações altas o PIP3 liga-se à PKB e à PDK-1. Após essa ligação, a PDK-1 promove

a fosforilação do Akt/PKB, proteína ribossomal p70 cinase S6, proteína cinase C e PKA,

sendo essas 3 últimas consideradas partes de um mecanismo que também protege a célula

da MCP. A ativação do Akt/PKB também é considerada fundamental no impedimento da

MCP, pois aumenta a atividade de fatores anti-apoptóticos tais como Bcl2 e BclX. Por

outro lado, o Akt/PKB ativado inibe fatores que contribuem na MCP (VINCENT;

FELDMAN, 2002).

A análise da expressão através da técnica de cDNA microarray possibilitou a

identificação dos genes que tem sua expressão estimulada mediante ativação do IGF1R.

Tais genes habitualmente são envolvidos em várias funções celulares incluindo a

proliferação, diferenciação e MCP, porém vale destacar que mais da metade deles são

associados à mitogênese e à diferenciação. Como exemplos, podem ser citados os

receptores 3 e 4 de interleucinas (envolvidos no crescimento celular) e o fator neurotrófico

derivado da linhagem celular da glia (importante no desenvolvimento e manutenção de

neurônios), que têm sua expressão gênica estimulada após a ativação do IGF1R (KEEGAN

et al., 1994; AIRAKSINEN; SAARMA, 2002). Além desses exemplos relacionados ao

desenvolvimento celular, deve ser destacado o aumento da expressão do gene Twist

(DUPONT et al., 2003). Esse gene pertence à família de fatores de transcrição básicos em

25

forma de hélice-alça-hélice, os quais desempenham papel fundamental na diferenciação

celular de vertebrados e invertebrados (OLSON; KLEIN, 1994). O tratamento de células

NWTb3 (linhagem celular desenvolvida a partir de fibroblastos de camundongos e que

apresenta expressão aumentada de IGF1R) com IGF-1 foi capaz de aumentar o mRNA do

gene Twist. Esse aumento ocorre de forma dependente da ativação do IGF1R conforme

verificado em estudos que utilizaram culturas celulares, além disso, o mesmo efeito é

observado em músculo, quando injeções de IGF-1 são realizadas na veia cava. A via de

sinalização que ativa a MAPK parece ser crucial para que o aumento no mRNA do gene

Twist ocorra (DUPONT et al., 2003).

O gene codificador do IGF1R localiza-se no braço longo do cromossomo 15

(15q26.3), estima-se que possua mais que 100 kb e é composto por 21 exons e 20 íntrons. A

subunidade α é codificada pelos exons 1 até o 11, já a β pelos exons 12 ao 21. O primeiro

exon contém uma extensa sequência 5‟ não traduzida, definindo um sítio de início de

transcrição e, dessa forma, codifica somente os 2 primeiros aminoácidos da subunidade α.

Os exons 2 a 6 são responsáveis pelos domínios de ligação aos IGFs presentes nas

subunidades α do receptor. Cinco exons (16-20) são responsáveis pelo domínio tirosina-

cinase presente na subunidade β e o exon 14 pelo domínio transmembrânico. O exon

terminal do gene que codifica o IGF1R também contém uma ampla sequência 3‟ não

traduzida. A homologia organizacional desse gene quando comparado ao gene codificador

do receptor de insulina é notável. Dentre os 21 exons, 12 apresentam tamanho idêntico ao

gene homólogo do receptor de insulina e, no restante de exons, com exceção do primeiro e

do último, a diferença de tamanho não ultrapassa 15 nucleotídeos. Essa similaridade

observada na estrutura gênica é mantida mesmo nas regiões dos receptores onde a

homologia não é grande (ABBOTT et al., 1992; ABUZZAHAB et al., 2003).

26

O IGF2R é estruturalmente diferente do IGF1R e do receptor de insulina,

sendo idêntico ao receptor de manose-6-fosfato e não apresenta atividade tirosina-cinase

presente no IGF1R. O IGF2R apresenta peso molecular de 220-250 kDa e alta afinidade

pelo IGF-II sendo os sítios de ligação do IGF-II e da manose-6-fosfato provavelmente

diferentes (NEELY et al., 1991; JONES; CLEMMONS, 1995). Nota-se que, uma vez

ligados, IGF2R e IGF-II, o complexo formado é internalizado e degradado (NIELSEN,

1992). O papel fisiológico desse receptor ainda não é claro, embora existam indícios de que

participe do processo de clearance do IGF-II.

Vale salientar que, além do IGF1R e IGF2R, existem receptores híbridos

constituídos por dímeros α-β do IGF1R e dímeros α-β do receptor de insulina que

apresentam afinidade pelos IGFs semelhante àquela apresentada pelo IGF1R e menor pela

insulina (SOOS; SIDDLE, 1989; SOOS et al., 1993).

I.3 - As proteínas transportadoras dos IGFs

A regulação das ações promovidas pelos IGFs é influenciada pela presença

das proteínas transportadoras de IGFs ou IGFBPs. Até o momento, foram bem

caracterizadas 6 proteínas de mamíferos dessa família, chamadas de IGFBP-1, -2, -3, -4, -5

e -6. Nos fluidos biológicos, grande parte dos IGFs é encontrada em associação com as

IGFBPs que apresentam grande afinidade pelos mesmos (Kd de 10-10

M). Tal afinidade é

maior que a apresentada pelo próprio IGF1R a esses fatores de crescimento (Kd de 10-8

- 10-

9 M).

Atualmente, esse grupo de proteínas é classificado como uma família. Essa

classificação é baseada na grande homologia existente nas estruturas primárias sendo de até

27

50% entre as 6 proteínas e de 80% quando comparadas diversas espécies de mamíferos

(RECHLER, 1993; KELLEY et al., 1996). Além disso, e principalmente, as IGFBPs são

proteínas ricas em resíduos de cisteína localizados na porção N-terminal e C-terminal e

apresentam afinidade alta pelos IGFs, provavelmente proporcionada pela conformação

terciária desses dois domínios. É importante salientar que é justamente a alta afinidade

pelos IGFs a principal característica que define essas proteínas como sendo ligantes dos

IGFs e componentes de uma família (HWA; YOUNGMAN; ROSENFELD, 1999).

No entanto, na década passada, foram descritas diversas proteínas que

também apresentavam regiões ricas em cisteína e porções N-terminais semelhantes àquelas

presentes nas IGFBPs e que, funcionalmente, também ligavam-se aos IGFs com grande

afinidade, porém menor que as proteínas originalmente ligantes. Além disso, apesar de

apresentar um domínio N-terminal semelhante ao das IGFBPs, o restante da estrutura

dessas proteínas era diferente das IGFBPs. Em função dessas peculiaridades e semelhanças,

essas moléculas foram chamadas de IGFBP-rPs e, no seu conjunto, IGFBPs e IGFBP-rPs

puderam ser agrupadas em uma superfamília de proteínas (BAXTER et al., 1998). Existem

aproximadamente 9 proteínas com características que permitem agrupá-las nessa

classificação, assim denominadas: IGFBP-rP1, -rP2, -rP3, -rP4, -rP5, -rP6, -rP7, -rP8 e -

rP9. Observa-se grande semelhança na porção N-terminal entre esse grupo e as IGFBPs,

variando entre 40% a 57% (HWA; YOUNGMAN; ROSENFELD, 1999). A afinidade da

IGFBP-rP1, -rP2 e –rP3 pelos IGFs foi mensurada, sendo sempre menor que aquelas

verificadas em relação às IGFBPs. Provavelmente, a ausência do domínio C-terminal e,

portanto, também da configuração terciária contribuem para essa afinidade reduzida. Por

outro lado, observou-se que a IGFBP-rP1 e –rP3 são capazes de se ligar à insulina com

afinidade semelhante aos IGFs (AKAOGI et al., 1996; BURREN et al., 1999).

28

As IGFBPs apresentam elevado grau de especificidade e afinidade pelos

IGFs e, além de aumentar a meia vida desses fatores de crescimento, tais proteínas também

podem facilitar ou inibir as suas ações biológicas. Deve ser ressaltado que, além das ações

dependentes dos IGFs, também foram descritas ações dessas proteínas transportadoras que

são independentes dos IGFs (MOHAN; BAYLING, 2002). Habitualmente, são produzidas

diversas IGFBPs num mesmo tecido do organismo. No entanto, a produção de uma, ou no

máximo duas, dessas proteínas é maior que as demais, tornando a concentração de

determinadas IGFBPs maior em alguns tecidos específicos (RECHLER, 1993; KELLEY et

al., 1996; BAXTER, 2000; CLEMMONS, 2001).

Em geral, as estruturas primárias das IGFBPs dos mamíferos têm, em

comum, 3 domínios distintos de tamanhos equivalentes: o conservado domínio N-terminal,

a região mediana (extremamente variável) e o domínio C-terminal também conservado

(HWA; YOUNGMAN; ROSENFELD, 1999).

O domínio N-terminal contém entre 80 e 93 aminoácidos na molécula

madura. Dentre os 16 a 20 resíduos de cisteína encontrados no pré-peptídeo, 10 (na IGFBP-

6) a 12 (no restante das IGFBPs) estão nesse domínio. O grande número de cisteína

encontrado nesse domínio sustenta a hipótese de que essa região seja altamente conservada.

Além disso, existem evidências de que pontes dissulfídricas sejam formadas dentro desse

mesmo domínio, portanto, sem formações dessa natureza com o domínio C-terminal

(FORBES et al., 1998). Essas pontes dissulfidricas internas, presentes no domínio N-

terminal, formam 2 subdomínios: um composto por 6 cisteínas e outro por 4 na IGFBP-6

(NEUMANN; MARINARO; BACH, 1998). Além desses subdomínios, existe no domínio

N-terminal dentre as IGFBPs um motif composto por GCGCCxxC bem conservado entre as

IGFBPs (exceto na IGFBP-6, onde o número de cisteínas é menor). É postulado que esse

29

motif seja importante nas interações entre IGFs e IGFBPs uma vez que também é

encontrado nas IGFBP-rPs, porém a importância atribuída a esse motif pode ser sutil, uma

vez que a conservação dessa região não é completa na IGFBP-6 (HWA; YOUNGMAN;

ROSENFELD, 1999).

A região mediana das IGFBPs humanas separa os domínios N- e C-terminal

estendendo-se do aminoácido 55 ao 95. É uma região extremamente variável e parece não

haver semelhanças entre as diversas IGFBPs, dado que a similaridade entre elas é menor

que 15%.

Após a tradução, as IGFBPs podem sofrer diversas modificações, dentre

elas, destacam-se a glicosilação, a proteólise, a fosforilação e a ligação à matriz

extracelular, que são responsáveis por mudanças na afinidade das IGFBPs pelos IGFs. Com

isso, essas modificações sofridas pelas IGFBPs são capazes de promover uma regulação

diferenciada das ações desses fatores de crescimento. Além desses processos, as IGFBPs

também podem ser alvo de glicosilação (MOHAN; BAYLING, 2002).

Apesar da variabilidade da região mediana, provavelmente, é nessa

localização que ocorrem algumas das modificações pós-traducionais, dentre elas a

glicosilação e a fosforilação. A N-glicosilação ocorre em resíduos de asparagina localizados

em sequências consensuais (Asn-X-Ser/Thr), que são em número de 3, identificadas na

IGFBP-3 (ZAPF et al., 1988). A capacidade de ligação com alta afinidade com os IGFs não

parece ser influenciada pela glicosilação, embora possa conferir algum grau de resistência à

proteólise das IGFBPs (NEUMANN; MARINARO; BACH, 1998).

Foi descrito que, dentre as 6 IGFBPs, ao menos 3 (IGFBP-1, -3 e -5) são

modificadas após sua tradução pela fosforilação (HWA; YOUNGMAN; ROSENFELD,

1999; MOHAN; BAYLING, 2002). Nessas 3 proteínas, esse processo ocorre em resíduos

30

de serina localizados na região mediana. Exemplo disso é verificado na IGFBP-1 onde 2

resíduos de serina da região mediana são fosforilados e somente 1 resíduo da porção C-

terminal também é fosforilado (JONES et al., 1993c). A IGFBP-3 humana pode ser

fosforilada nas serinas que ocupam a posição 111 e 113. O processo de fosforilação dessa

IGFBP parece ser regulado pelos IGFs mediante interação com o IGF1R (COVERLEY;

BAXTER, 1997).

A região C-terminal é altamente conservada sendo a semelhança

compartilhada entre as 6 proteínas humanas de aproximadamente 34%. Nessa região, ao

menos 6 cisteínas são envolvidas na formação de ligações dissulfídricas dentro desse

domínio (FORBES et al., 1998). A estrutura primária da região próxima às últimas 5

cisteínas é semelhante (40%). Dado esse fato, a estrutura terciária dessa região

provavelmente é idêntica. Outro dado interessante observado sobre essa região é a

semelhança de 37% na sequência de aminoácidos presentes entre as cisteínas com outros

domínios de outras proteínas tais como o domínio tipo I da tireoglobulina (MALTHIERY;

LISSITZKY, 1987). A função desse domínio ainda não é conhecida, porém poderia estar

associada à interação com os IGFs, matriz extracelular e superfície celular (HWA; OH;

ROSENFELD, 1999).

É notório que a disposição dessas regiões que compõem as IGFBPs está

relacionada às suas diversas funções dependentes ou independentes dos IGFs. Diferentes

estudos demonstram uma participação importante da região N-terminal na interação com os

IGFs. Substituições de aminoácidos em determinadas posições da região N-terminal

promove reduções importantes da afinidade das IGFBPs pelos IGFs. Com precisão maior,

os 2 subdomínios propostos por Neumann, Marinaro e Bach (1998), localizados nessa

região, apresentam papel de destaque na afinidade com os IGFs. Entretanto, ambas, a

31

região C-terminal e a região mediana, também parecem ter importância nessa interação

IGFs-IGFBPs. A região mediana parece não ligar-se diretamente aos IGFs, porém colabora

com a alta afinidade da IGFBPs, garantindo uma estrutura ternária da molécula capaz de

interagir adequadamente com os IGFs (HWA; OH; ROSENFELD, 1999).

A estrutura gênica codificadora das IGFBPs também apresenta grande

semelhança entre si. Todas essas proteínas são codificadas por uma estrutura gênica comum

composta por 4 exons, dentre as quais, a única exceção é a IGFBP-3 que é codificada por 5

exons sendo que o quinto não é traduzido. O exon 1 corresponde à porção N-terminal em

todas as IGFBPs, o exon 2 corresponde à região mediana e, ambos, 3 e o 4 à C-terminal,

refletindo, dessa forma, a sua estrutura primária.

A IGFBP-1 foi a primeira IGFBP identificada e sequenciada; é constituída

por 234 aminoácidos e tem peso molecular de 30 kDa. Inicialmente isolada no líquido

amniótico, onde sua concentração é aproximadamente 1000 vezes maior que no soro,

apresenta, dentre as ações dependentes de IGFs, a capacidade de inibir essas ações

demonstrada em diversos estudos in vitro e in vivo (POVOA et al., 1984; LEE et al., 1997;

MOHAN; BAYLING, 2002). Entretanto, a transfecção da IGFBP-1 promoveu um estímulo

na migração de células ovarianas de hamster chinês. Vale ressaltar que essas células não

produzem IGFs e não respondem quando a eles são expostas, demonstrando-se, dessa

forma, uma ação da IGFBP-1, que independe dos IGFs (JONES et al., 1993b). Após a

expressão dessa proteína, a afinidade da IGFBP-1 pelos IGFs também pode ser modulada

pela fosforilação nos resíduos de serina localizados nas posições 101, 119 e 169. A forma

fosforilada tem sua afinidade pelo IGF-I aumentada em até 6 vezes (JONES et al., 1991).

As concentrações séricas de IGFBP-1 apresentam variação circadiana

evidente e sua expressão pode ser suprimida após refeições, coincidindo, inversamente,

32

com a secreção de insulina. A produção hepática também é inversamente regulada pela

insulinemia portal, sendo observado que nos pacientes diabéticos as concentrações séricas

de IGFBP-1 estão elevadas (COTERRIL et al., 1988; HOLLY et al., 1990; BRISMAR et

al., 1994). Portanto, a insulina constitui-se, assim, no principal regulador da produção de

IGFBP-1. Outros hormônios, dentre eles GH, cortisol e glucagon, também colaboram nessa

regulação. Em situações experimentais de hipoinsulinemia, houve aumento das

concentrações séricas de IGFBP-1 após a administração de cortisol e glucagon, entretanto o

GH apresentou ação inibidora nessa situação (CONOVER; DIVERTIE; LEE, 1993;

HILDING et al., 1993). Após a ligação com a insulina, ocorre a autofosforilação do

receptor de insulina e a fosforilação de substratos específicos (IRS-1 e -2). As fosfotirosinas

ligam-se a uma subunidade reguladora da PI3K chamada p85. Consequentemente, ocorre a

ativação de outras proteínas, dentre elas a proteína cinase B/Akt. A insulina regula a

expressão do gene da IGFBP-1, inibindo-a, através desse mecanismo que utiliza a PI3K

(BAND; POSNER, 1997). Entretanto, a partir da PI3K duas vias são potencialmente usadas

para que a inibição da expressão da IGFBP-1 ocorra. Uma delas envolve a ativação da Akt

que acaba por afetar a transcrição de fatores, tais como o Foxo1, Foxa2 e Foxo3. Após a

exclusão nuclear desses fatores, há inibição da ligação do Foxo1, –a2 e -o3 ao elemento

responsivo à insulina no promotor do gene IGFBP-1 (MOUNIER; DUMAS; POSNER,

2006). Noutra via, há ativação da mTOR, uma proteína com domínio catalítico semelhante

à PI3K, que é ativada downstream PI3K. A partir da ativação da mTOR há diminuição da

expressão do mRNA da IGFBP-1 independente da modulação do Foxo1 (PATEL et al.,

2002). Entretanto, recentemente, um estudo observou a importância de uma via mTOR-

dependente, que pode ser ativada independentemente da ativação da PI3K, e que pode

regular a expressão da IGFBP-1 na ausência de fosforilação do Foxo1 e -3. A fosforilação

33

do Foxo1 e -o3 não foi necessária nem suficiente para o efeito da insulina na transcrição do

gene da IGFBP-1, entretanto pareceu ter o papel de aumentar e consolidar o efeito

inibitório da insulina (MOUNIER; DUMAS; POSNER, 2006).

O gene humano codificador da IGFBP-1 é localizado no braço curto do

cromossomo 7 (7p14), separado somente por 20 kb região do gene codificador da IGFBP-3.

Estende-se por 5,2 kb e possui 4 exons que geram um mRNA de 1,6 kb. De forma

semelhante ao que ocorre nos genes das outras IGFBPs, o gene codificador da IGFBP-1

tem seu exon 1 composto por menos que 600 pb, correspondente à região N-terminal, já os

exons 2 e 3 são compostos por menos de 230 pb e correspondem a regiões variáveis da

molécula, que ainda tem na sua composição o sítio conservado C-terminal, correspondente

ao exon 4 (HWA; OH; ROSENFELD, 1999).

Aproximadamente 75% dos IGFs circulam sob a forma de um complexo

formado pela IGFBP-3 em associação com a ALS. Esse complexo ternário tem peso

molecular de 150 kDa e, portanto, não atravessa a barreira endotelial o que aumenta a vida

média desses fatores de 10 minutos, quando na forma livre, para 15 horas sob a forma de

complexos (ZAPF, 1995; BAXTER; MARTIN, 1989; BAXTER, 2000). A IGFBP-5

também apresenta a capacidade de formar complexos ternários com os IGFs e ALS, porém

a importância, em comparação com a IGFBP-3, parece ser menor (TWIGG et al., 1998;

BAXTER et al., 2002). A IGFBP-3 também pode ser fosforilada, porém esse processo

parece não alterar a sua afinidade pelos IGFs, diferentemente do que ocorre com a IGFBP-

1, além disso, quando ligada a fibroblastos, tem sua afinidade pelos IGFs diminuída em 40

vezes, ao ser comparada com a afinidade da IGFBP-3 em solução (CONOVER; POWELL,

1991; COVERLEY; BAXTER, 1997). Foram observadas algumas ações da IGFBP-3 que

são independentes dos IGFs em fibroblastos de camundongos e linhagens de células

34

humanas de câncer de mama (VILLAUDY et al., 1991; OH et al., 1993). A ALS é um

membro da família de proteínas “ricas em repetição” de leucina, sendo composta por quase

25% desse aminoácido; tem essa denominação devido ao fato de que se torna

irreversivelmente desnaturada quando submetida à acidificação do meio até um pH de 4 ou

menor. Assim como a IGFBP-3, a secreção da ALS é regulada principalmente pelo GH

(BAXTER; DAI, 1994). A presença dessa subunidade é fundamental no aumento

observado na meia-vida proporcionado pelo complexo ternário. Tanto em modelos animais,

quanto em humanos, as concentrações séricas totais de IGF-1 são reduzidas na deficiência

da ALS (BOISCLAIR et al., 2001; HWA et al., 2006).

A segunda proteína ligante de IGFs mais abundante no plasma é a IGFBP-2

sendo composta por 289 aminoácidos e possui um peso molecular de 31,3 kDa

(DAUGHADAY, 1995). Na vida intra-uterina, é a IGFBP que predomina na circulação e

tem no fígado a sua principal fonte de expressão. É encontrada em altas concentrações no

líquor e sêmen (ROSENFELD et al., 1994). O gene que codifica a IGFBP-2 localiza-se no

braço longo do cromossomo 2. Possui 4 exons e sua extensão é de 32 kb (HWA;

YOUNGMAN; ROSENFELD, 1999). Essa proteína liga-se com maior afinidade ao IGF-II

que ao IGF-I e é capaz de carrear os IGFs, através da transposição da barreira endotelial,

para os diversos tecidos. Concentrações elevadas dessa proteína são observadas em

pacientes com diabetes, hipopituitarismo, nanismo de Laron e em vários tipos de tumores,

embora os mecanismos envolvidos na sua regulação ainda não sejam completamente

conhecidos (CLEMMONS et al., 1991; CAMACHO-HÜBNER et al., 1991; COTTERILL

et al., 1992; JUUL, 2003). Em uma deficiência genética e isolada do GH, por uma mutação

no receptor do GHRH, não houve diferença entre as concentrações de IGFBP-2 e IGFBP-1

entre os indivíduos afetados e os controles em todas as faixas etárias (AGUIAR-

35

OLIVEIRA et al., 1999). Entretanto, situações de restrição protéica provocam aumento nas

concentrações séricas de IGFBP-2 em adultos e crianças (SMITH; UNDERWOOD;

CLEMMONS, 1995).

A IGFBP-4 apresenta uma massa molecular de 26 kDa sendo composta por

237 aminoácidos. O gene codificador dessa proteína localiza-se no braço longo do

cromossomo 17, mede aproximadamente 15,3 kb e sua estrutura também é formada por 4

exons (HWA; YOUNGMAN; ROSENFELD, 1999). Essa proteína apresenta alta afinidade

pelo IGF-I e IGF-II e também atravessa o endotélio juntamente com os fatores de

crescimento (COHICK; CLEMMONS, 1993). IGF-I e IGF-II promovem aumento nas

concentrações da IGFBP-4 em células de carcinoma mamário e fibroblastos fetais em

cultura, porém sem aumento concomitante da expressão do mRNA correspondente. Tal fato

indica um provável mecanismo regulatório pós-tradução (CAMACHO-HÜBNER et al.,

1992). Dentre esses mecanismos, destaca-se a proteólise de que essa IGFBP possa ser

substrato. Provavelmente, a protease envolvida nessa reação é a chamada PAPP-A que

promove a proteólise da IGFBP-4 com relativa especificidade. A PAPP-A é produzida por

uma grande variedade de células dentre as quais podem ser citados os fibroblastos, as

células da granulosa e os osteoblastos. Além disso, é presente no soro em indivíduos

normais e em mulheres grávidas (LAWRENCE et al., 1999; BYUN et al., 2001;

CONOVER et al., 2001; MOHAN; BAYLINK, 2002). Os IGFs parecem exercer papel

importante nessa proteólise uma vez que, quando ligados à IGFBP-4, expõem o sítio de

clivagem dessa proteína ligante à PAPP-A (QIN et al., 2000). Por outro lado, a proMBP

liga-se à PAPP-A e bloqueia a proteólise da IGFBP-4 (GIUDICE et al., 2002).

Outros hormônios parecem estar ligados ao controle da expressão da IGFBP-

4. O tratamento de células de osteossarcoma TE89 com GH produziu aumento e diminuição

36

das concentrações da IGFBP-4 em culturas de alta e baixa densidade celulares

respectivamente (MOHAN et al., 1992). O paratormônio produziu aumento da expressão

dessa proteína em culturas de osteoblastos (LATOUR et al., 1990). Outros hormônios

sistêmicos podem ser citados como reguladores da IGFBP-4 em osteoblastos tais como a

1,25 diidroxi-vitamina D3 e os glicocorticóides. Além dos IGFs, outros fatores de

crescimento locais também colaboram nessa regulação dentre eles destacando-se as

proteínas morfogenéticas ósseas, TGF- β e interleucinas (MOHAN; BAYLINK, 1999). A

IGFBP-4 apresentou efeitos inibitórios sobre a bioatividade dos IGFs em diversos estudos,

além disso, os fragmentos resultantes da proteólise dessa IGFBP também parecem não

interferir na ação dos IGFs (JONES; CLEMMONS, 1995).

A IGFBP-5 é composta por 252 aminoácidos apresentando peso molecular

de 31 kDa (DAUGHDAY, 1995). O gene codificador dessa proteína, com tamanho de 33

kb, localiza-se no braço longo do cromossomo 2 apresentando 4 exons o que gera um

mRNA de 6 kb (HWA; YOUNGMAN; ROSENFELD, 1999). É a IGFBP mais abundante

no tecido ósseo (CLAYTON; GILL, 2001). Vale lembrar que, da mesma forma que a

IGFBP-3, a IGFBP-5 também pode formar complexos ternários com os IGFs e a ALS,

porém, quando comparado com a IGFBP-3, a importância desses complexos parece ser

menor (TWIGG et al., 1998; BAXTER et al., 2002). Observou-se que, in vitro, o IGF-I é

capaz de aumentar a concentração de IGFBP-5, porém sem aumento do seu mRNA. Essa

observação, em conjunto com o fato de que a insulina foi incapaz, quando estimulou o

IGF1R, de aumentar as concentrações da IGFBP-5, ou seja, de forma independente do

receptor, levou a elaboração da hipótese de que os IGFs poderiam proteger a IGFBP-5 da

ação de proteases específicas (CAMACHO-HÜBNER et al., 1992; CONOVER; KIEFER,

1993). Vale lembrar que, mais recentemente, algumas dessas proteases foram identificadas.

37

Dentre elas, o complemento C1s produzido por células de músculo liso (BUSBY et al.,

2000) e a ADAM-9 (MOHAN et al., 2002), produzida por osteoblastos humanos, são

relativamente específicas para essa IGFBP. Os glicocorticóides produziram redução do

mRNA da IGFBP-5 em células semelhantes aos osteoblastos em cultura (CONOVER;

KIEFER, 1993). De forma semelhante ao que ocorre com a IGFBP-4, a IGFBP-5 parece ser

regulada também por outros hormônios, tais como, o GH, o paratormônio e a 1,25-diidroxi-

vitamina D3, além de fatores locais, como as proteínas morfogenéticas ósseas, TGF- β e

interleucinas (MOHAN; BAYLINK, 1999).

O estímulo às ações dos IGFs na presença da IGFBP-5 é verificado em

diversos estudos. Essa proteína, quando ligada à matriz extracelular em cultura de

fibroblasto, potencializa a ação do IGF-I aumentando a síntese de DNA e o crescimento

celular mediante a redução da afinidade da IGFBP-5 pelo IGF-I (JONES et al., 1993a).

Além disso, fragmentos dessa IGFBP parecem ser capazes de potencializar as ações dos

IGFs em osteoblastos (ANDRESS et al., 1993).

A IGFBP-6 é formada por 216 aminoácidos, apresentando peso molecular de

22,8 kDa na sua forma não glicosilada. O gene que codifica essa proteína está localizado no

cromossomo 12 e, também, é composto por 4 exons, gerando um mRNA de 1,1 kb (HWA;

YOUNGMAN; ROSENFELD, 1999). É a menor dentre as IGFBPs sendo, ao lado da

IGFBP-2, a IGFBP mais abundante no líquor (ROGHANI et al., 1991).

As IGFBPs, portanto, são importantes colaboradoras no sistema IGF, pois,

além de aumentar a vida média dos IGFs, modulam suas ações endócrinas e parácrinas

através do controle de suas concentrações nos tecidos e células e da interação com os seus

receptores, estão sujeitas a outros diversos mecanismos regulatórios importantes para o

crescimento e desenvolvimento celulares (JONES; CLEMMONS, 1995).

38

I.4 - O sistema IGF e sua relação com situações de hipóxia

Diversos estudos analisaram o sistema IGF perante situações de hipóxia,

utilizando como modelo experimental o crescimento intra-uterino, que depende

fundamentalmente da função placentária adequada e da oferta de substratos e oxigênio ao

feto e é regulado por complexos mecanismos, incluindo fatores genéticos e ambientais.

Devido à potente ação mitogênica e à colaboração na diferenciação celular,

IGF-I e II são considerados importantes reguladores do crescimento fetal (McLELLAN et

al., 1992). Camundongos que não apresentaram genes para IGF-I e II nasceram pequenos e

muitos morreram precocemente (POWELL-BRAXTON et al., 1993; LIU et al., 1998). Em

seres humanos, as concentrações séricas de IGF-I, pesquisadas em amostras obtidas de

cordocentese, apresentam-se crescentes em fetos normais entre 18 e 40 semanas de

gestação (LANGFORD; NICOLAIDES; MIELL, 1998). Ademais, RNs considerados

pequenos para a idade gestacional tiveram concentrações séricas menores de IGF-I no

sangue de cordão umbilical (GIUDICE et al., 1995). Há somente a descrição de um

paciente com deleção do gene codificador do IGF-I que, além do prejuízo neurológico,

apresentava grave restrição do crescimento pré-natal (WOODS et al., 1996).

A causa mais comum de RCIU é a insuficiência placentária caracterizada

pela oferta inadequada de nutrientes e oxigênio para a placenta e, portanto, para o feto

(POPOVICI et al., 2001). Sob esse aspecto, a hipóxia, como ferramenta de experimentação

in vivo, têm sido amplamente utilizada na compreensão do papel dos IGFs na RCIU. Nesse

sentido, fetos ovinos submetidos à hipóxia por redução do fluxo sanguíneo uterino

apresentaram aumento nas concentrações séricas de IGFBP-1 e redução da IGFBP-2, sendo

39

que, nessa análise, não houve variações significativas das concentrações séricas de IGFBP-

3 e IGFBP-4 (McLELLAN et al., 1992). Da mesma forma, filhotes de ratas submetidas à

hipóxia apresentaram, além da RCIU, concentrações séricas de IGFBP-1 e IGFBP-2 1,75

vezes maiores que os controles e concentrações séricas de IGFBP-4 2,5 vezes também

maiores. As concentrações séricas de IGF-II tenderam a ser maiores alcançando exatamente

o nível de significância (p = 0,05), entretanto as concentrações séricas de IGF-I foram

semelhantes àquelas observadas nos controles. A expressão do mRNA de IGFBP-1 e

IGFBP-2 nos fígados fetais submetidos à hipóxia foram 4 e 6 vezes maiores que os

controles, respectivamente (TAPANAINEN et al., 1994).

Em hepatócitos fetais humanos, obtidos de fetos entre 18 e 22 semanas de

gestação, e, posteriormente, postos em cultura, a hipóxia também provocou aumento de 3

vezes no mRNA da IGFBP-1. As concentrações dessa proteína no meio de cultura

aumentaram 3 vezes quando comparadas com situação de normoxia. Ainda nesse estudo, as

concentrações de IGFBP-3 aumentaram significativamente, IGFBP-2 e IGFBP-4 também

aumentaram, porém não significativamente. A produção da IGFBP-1 nesses hepatócitos

fetais submetidos à hipóxia, reforçou a hipótese de que o fígado poderia ser a fonte primária

da produção dessa proteína em fetos com RCIU (POPOVICI et al., 2001).

Corroborando a relação entre o crescimento intra-uterino e a IGFBP-1,

recentemente, a expressão de pequenas quantidades de IGFBP-1 foi verificada em tecidos

de peixe Danio rerio (popularmente conhecido como paulistinha) em diversos estágios do

desenvolvimento embrionário. A hipóxia, em embriões desse peixe, também provocou

aumento na transcrição hepática da IGFBP-1 e, em adultos, houve aumento no seu mRNA

(MAURES; DUAN, 2002).

40

Alguns estudos procuraram relacionar a presença de fetos com RCIU e as

concentrações de IGF-I e IGFBP-1 no líquido amniótico e no plasma materno, no entanto,

não se evidenciou correlação positiva com as concentrações desses fatores (BAHTIA et al.,

2002). Recentemente, através de amniocentese, as concentrações de IGF-I, IGFBP-1 e

leptina foram avaliadas com a mesma finalidade, no entanto, a correlação com RCIU não

foi observada (ROIG et al., 2005). Percebe-se, portanto, que a hipóxia é capaz de estimular

um conjunto de alterações metabólicas que visam proteger o indivíduo através da inibição

de processos que requeiram grandes aportes de energia.

A análise da expressão através da técnica de cDNA microarray também

possibilitou a identificação dos genes que tem sua expressão induzida mediante ao estímulo

do IGF-I. Esses genes responsivos ao IGF-I podem ser divididos em diversas categorias:

relacionados ao ciclo celular, fatores de transcrição, relacionados ao metabolismo, etc.

Porém vale ressaltar que, além de um grande número deles estar relacionado à angiogênese,

vários deles também foram responsivos ao HIF-1α. De fato, o próprio IGF-I também foi

capaz de induzir a translocação nuclear do HIF-1α (DUPONT et al., 2003).

A importância da integridade funcional do IGF1R e do IGF2R no

desenvolvimento humano é demonstrada quando são descritos indivíduos que apresentam

alterações no seu funcionamento. Várias mutações no gene que codifica o IGF1R foram

observadas em diversos sítios do receptor podendo resultar, inclusive, em alterações do

desenvolvimento dos indivíduos portadores dessas alterações. No momento, diversos

estudos foram realizados sendo observadas relações importantes entre o desenvolvimento

intra-uterino humano e o IGF1R. Exemplo dessa relação é encontrado na mutação em

heterozigose que provocou a substituição de uma arginina por um ácido glutâmico no

códon 709. Descrita em dois indivíduos (mãe e filha) com RCIU sem causa aparente, tal

41

mutação, localizada no exon 11, provocou a perda do sítio de clivagem do pró-receptor tipo

1 de IGF impedindo a formação das cadeias α e β resultando em retardo do crescimento pré

e pós-natal e retardo mental em um desses indivíduos (filha) (KAWASHIMA et al., 2005).

Aproximadamente 10% das crianças nascidas com RCIU permanecem com baixa estatura.

Nesse aspecto, alguns estudos procuraram demonstrar relação entre essa

característica clínica e alterações do IGF1R. Em 2003, 2 grupos de crianças com baixa

estatura foram avaliados, sendo que em um deles havia RCIU sem causa aparente (42

crianças) e o outro era composto por crianças somente com baixa estatura. No primeiro

grupo (RCIU associada à baixa estatura), havia um indivíduo com mutação composta em

heterozigose que alterava a sequência de aminoácidos de arginina para glutamina na

posição 108 num alelo e lisina para asparagina na posição 115 no outro alelo, ambas no

exon 2 do gene IGF1R. Nesse caso, além dos problemas com o crescimento pré e pós-natal,

houve discreto atraso da aquisição motora sendo que as concentrações de IGF-I sérico e

ALS estavam acentuadamente acima do normal e a IGFBP-3 no limite superior da

normalidade de acordo com os parâmetros do método aplicado pelos autores. Entretanto, a

paciente não apresentou redução do seu quociente de inteligência e apresentou puberdade

com início e progressão normais. A ligação entre o IGF1R e o IGF-1 esteve reduzida e

houve necessidade de concentrações maiores de IGF-I para que a atividade de fosforilação

no receptor fosse igual aos controles em culturas de fibroblastos. Nota-se, portanto, que

esse indivíduo apresentou uma mutação missense em heterozigose composta numa região

conservada da molécula do IGF1R associada a características de resistência ao IGF-1. A

mudança nas cargas dos aminoácidos envolvidos (de básica para neutra) provavelmente

alterou o sítio de ligação do receptor proporcionando a redução na ligação com o IGF-1

(ABUZZAHAB et al., 2003).

42

Além desse exemplo, também pode ser citada a mutação em heterozigose no

exon 2 (cadeia α) resultando na substituição de uma arginina por um códon de terminação

no resíduo 59 em outros 2 indivíduos (irmãos) com RCIU e discreto atraso do

desenvolvimento neuropsicomotor associados à microcefalia. Essa mutação provocou

resistência à ação do IGF-1 sendo necessária dose 10 vezes maior desse fator para se obter

fosforilação semelhante aos controles (RAILE et al., 2006).

Apesar das diversas relações observadas entre o IGF1R e RCIU associada à

baixa estatura, existem poucas análises do comportamento da expressão desse receptor nos

diversos tecidos em situações de hipóxia, tanto em fetos quanto em indivíduos adultos. Um

estudo, no qual ovelhas foram submetidas à hipóxia aguda, induzida pela substituição de

oxigênio por nitrogênio após intubação durante a gestação, verificou que fetos ovinos

apresentaram aumento na presença e na expressão do IGF1R nos cones de crescimento

neuronais do cérebro e cerebelo (MORGAN; CHAO, 2004).

Por outro lado, em indivíduos fora do período neonatal, as concentrações

reduzidas de IGF-I sérico foram observadas em crianças em bom estado nutricional com

doenças cardíacas congênitas cianosantes (DÜNDAR; AKÇORAL; SAYLAM et al., 2000).

As concentrações séricas de IGF-I também foram menores em crianças que desenvolveram

bronquiolite por vírus sincicial respiratório quando comparadas com as concentrações

nessas mesmas crianças após 3 meses do evento respiratório agudo (TASKER et al., 2004).

Concentrações séricas aumentadas de IGFBP-1 foram observadas em crianças nascidas

com acidose mista (componente respiratório e metabólico presentes simultaneamente)

(TAZUKE et al., 1998).

Entretanto, existem poucas informações sobre a relação entre a oxigenação

sanguínea e o sistema IGF, particularmente a respeito da IGFBP-1, IGF1R e seus

43

reguladores, nos seres humanos. Portanto, novas abordagens são necessárias para melhor

compreensão do comportamento desses fatores nessas condições, a fim de se obter melhor

entendimento desses mecanismos adaptativos.

44

II – Objetivos

45

II.1 – Objetivos

O objetivo geral desse estudo foi avaliar os diferentes componentes do

sistema IGF e sua relação com a oxigenação sanguínea associada a doenças respiratórias

agudas em crianças.

II.1.1 - Objetivos específicos:

Comparar as concentrações séricas de IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3 e insulina

em crianças nas situações de hipóxia aguda, associada a infecções respiratórias, e após a

sua resolução;

Comparar a expressão do mRNA do IGF1R na situação de hipóxia aguda

associada a doenças respiratórias agudas em crianças.

46

III - Casuística e Métodos

47

III.1 – Crianças participantes

Foram selecionadas 27 crianças dentre as quais 14 eram do sexo masculino e

13 do sexo feminino, com idades que variaram entre 15 dias e 9 anos e 6 meses. O paciente

com maior idade era do sexo masculino e, no momento da sua participação do estudo, não

apresentava sinais de puberdade. O tempo de internação hospitalar foi em média de 8 (±3,3)

e mediana de 7 dias. Os dados gerais e antropométricos de todos os indivíduos são

apresentados na tabela 1.

Todos os indivíduos apresentaram desconforto respiratório devido a diversas

situações clínicas (7 pacientes com sibilância, 4 com sibilância associada à pneumonia, 6

com bronquiolite, 2 com bronquiolite associada à pneumonia, 2 com pneumonia, 6 com

pneumonia associada a derrame e/ou espessamento pleural). Vale ressaltar que os

diagnósticos foram baseados em dados clínicos dos indivíduos sendo as etiologias diversas.

Durante as suas evoluções, todas essas crianças apresentaram saturações de oxigênio,

verificada em oximetria de pulso, menores que 95% e necessitaram de oferta suplementar

de oxigênio de qualquer natureza (cateter nasal, capela ou máscara não-reinalante).

Nenhuma criança necessitou de cuidados intensivos ou de respiração auxiliada por

aparelhos e cada uma participou somente uma vez do estudo.

Vinte crianças apresentaram história de febre que antecedeu a admissão

hospitalar e somente 7 estiveram sem febre no momento da sua inclusão no estudo; 13

pacientes não utilizaram antibióticos durante a sua evolução sendo que os 14 restantes

usaram esquemas terapêuticos diversos (3 utilizaram penicilina cristalina endovenosa

seguida de amoxicilina oral e 11 utilizaram ampicilina endovenosa seguida de amoxicilina).

48

Vale ressaltar que nenhuma das 7 crianças afebris utilizaram antibióticos durante sua

evolução clínica. Na tabela 2 são mostrados as crianças de acordo com o diagnóstico

clínico, oximetria de pulso na admissão hospitalar e o tempo de terapia com oxigênio que

precedeu a primeira coleta de amostras.

O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do

Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP (HCFMRPUSP)

em 22 de maio de 2006 de acordo com o Processo HCRP no. 5231/2006 (Anexo A).

O contato com os responsáveis pelas crianças foi realizado no momento do

atendimento na Unidade de Emergência do HCFMRPUSP. Após apresentação da pesquisa,

esclarecimento de possíveis dúvidas e concordância da participação das crianças no estudo,

o termo de consentimento livre e esclarecido foi assinado por um responsável.

49

Tabela 1 – Identificação, idade, sexo, peso, estatura e ou comprimento, escores de desvio-

padrão e dias de internação dos pacientes.

Id. Idade

(meses) Sexo

Peso

(g)

Est.

(cm)

EDP

E/I

EDP

P/E

EDP

P/I

Intern.

(d)

1 20 M 11100 83,5 -0,24 -0,58 -0,61 6

2 9,3 M 7630 72 -0,27 -1,88 -1,71 8

3 2,8 M 5640 55,5 -1,91 1,88 -0,2 6

4 0,8 F 3300 48,5 -1,94 NA -0,95 12

5 8,3 F 10500 71,5 0,73 2,22 2,26 10

6 34 M 13400 93 -0,12 -0,47 -0,56 10

7 7,3 F 8255 68 0 0,56 0,43 11

8 66 M 17000 110 -0,65 -1,03 -1,2 7

9 6,7 F 7120 68 0,34 -0,92 -0,5 6

10 10,5 F 7250 72 -0,16 -1,99 -1,88 6

11 5,7 M 6000 64 -1,21 -1,17 -1,71 4

12 5,3 M 5600 61,5 -1,85 -0,73 -1,88 12

13 5,4 M 9260 64 -0,22 3,22 1,88 4

14 1 M 4500 53 -0,61 1,06 0,33 6

15 4,7 F 6675 62 -0,57 0,81 0,23 4

16 9,1 M 8530 70 -0,88 -0,02 -0,67 6

17 2,5 F 5180 60,5 0,94 -0,8 0,17 7

18 32 M 15800 96 1,25 0,65 1,08 6

19 2,2 F 5160 53 -1,8 2,47 0,44 10

20 4,3 F 6500 64 0,53 -0,25 0,3 15

21 2,3 F 4760 57 -0,26 0 -0,23 3

22 10,5 F 9600 74 0,56 0,29 -0,39 13

23 14 M 9600 76 -0,84 -0,54 -1 4

24 2 F 3340 49 -0,9 0,13 -0,21 14

25 2,8 M 5800 58 -0,96 1,04 -0,03 10

26 114 M 28800 132 -0,49 0,25 -0,22 7

27 0,5 F 4200 54 1,01 0,22 1,29 9

Total/Média

(DP) 27 14M/13F 8 (±3,3)

NA: não se aplica; Id.: Identificação; M: Masculino; F: feminino; Est.: estatura/comprimento; Intern.:

internação; d: (dias); g: (gramas); cm (centímetros); EDP: escore de desvio-padrão; E/I: estatura para idade;

P/E: peso para estatura; P/I: peso para idade.

50

Tabela 2 – Pacientes de acordo com o diagnóstico clínico, oximetria de pulso na admissão

hospitalar e tempo de terapia com oxigênio antes da primeira coleta de amostras.

Pacientes Diagnóstico

clínico

Oximetria de pulso na

admissão hospitalar (%)

Tempo de terapia com

oxigênio antes da primeira

coleta (min)

1 pn+dp 86 30

2 sbl+pn 90 90

3 sbl+pn 87 20

4 brl+pn 88 Não usou

5 pn+dp 81 17

6 pn 84 50

7 pn+dp 87 30

8 sbl 88 Não usou

9 sbl+pn 90 Não usou

10 sbl+pn 90 20

11 sbl 89 Não usou

12 brl 91 Não usou

13 sbl 89 60

14 brl 80 38

15 brl 92 Não usou

16 pn+dp 95 Não usou

17 pn 89 30

18 sbl 87 90

19 sbl 90 Não usou

20 brl+pn 89 20

21 sbl 89 Não usou

22 pn+dp 87 3

23 sbl 91 Não usou

24 brl 84 5

25 brl 90 60

26 pn+dp 80 15*

27 brl 88 30 pn+dp: pneumonia com derrame pleural; sbl+pn: sibilância com pneumonia; pn: pneumonia; sbl: sibilância;

brl+pn: bronquiolite com pneumonia; brl: bronquiolite; *tempo estimado.

III.2 - Critérios de Exclusão

Foram excluídas do estudo as crianças consideradas desnutridas, para tanto

foram calculados escores Z (desvio-padrão) das relações estatura por idade (E/I), peso por

estatura (P/E) e peso por idade (P/I) utilizando-se como padrão de referência os dados do

51

National Center for Health Statistics (CDC, 2000), sendo considerados indivíduos com

stunting aqueles que apresentaram o indicador E/I abaixo de -2 escores z dos valores de

referência; wasting quando o indicador P/E foi menor que -2 escores z; e, underweight

aqueles com o indicador P/I menor que -2 escores z (WORLD HEALTH

ORGANIZATION, 1995). Os dados de todas as crianças que participaram do estudo são

apresentados na tabela 1.

Também foram excluídas as crianças que em qualquer momento da

avaliação utilizaram corticóides ou que apresentavam síndromes genéticas, malformações

de sistema nervoso, infecções congênitas e endocrinopatias.

III.3 - Desenho Experimental

A coleta do material de todos os pacientes foi realizada no momento da sua

admissão no Pronto Atendimento de Pediatria em conjunto com a coleta de exames

pertinentes à investigação clínica e, preferencialmente, antes do início da oxigenioterapia.

Foram incluídos somente indivíduos que apresentaram saturações de oxigênio, verificadas

mediante oximetria de pulso, menores que 95% (momento de hipóxia). Amostras com

volume total de 2 ml a 5 ml de sangue foram obtidas em frascos com gel de separação para

a avaliação das concentrações de IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3, insulina; e, em frascos

contendo EDTA, foi colhido sangue total para a obtenção de linfócitos dos quais foi

extraído o RNA para a verificação da expressão do IGF1R. As amostras foram

armazenadas a 4oC por curto período de tempo e, assim que possível, foram

definitivamente armazenadas a -70oC. Da mesma forma, no dia da alta hospitalar, ou seja,

52

quando o paciente não mais precisava de oferta suplementar de oxigênio novas amostras

foram coletadas, obtendo, assim, o pareamento das amostras em 2 momentos: na situação

de hipóxia e fora dela, na mesma criança. A coleta das amostras fora da hipóxia foi

realizada no dia da alta hospitalar em todos os indivíduos. Nos casos em que a coleta de

gasometria foi desnecessária, a oximetria de pulso foi o critério adotado como parâmetro de

oxigenação sanguínea tanto durante a hipóxia quanto fora dela.

Na primeira coleta, ou seja, durante o momento de hipóxia, 10 crianças

estavam sem oxigênio e, dentre as 17 que estavam usando oxigênio naquele momento, o

período de uso foi em média de 37,1 (±26,4) minutos com mediana de 30 minutos.

O período de jejum médio antes da primeira coleta do material foi de 3,3

(±2,2) horas com mediana de 2,75. Na segunda coleta, o jejum médio foi de 3,2 (±0,9)

horas com mediana de 3. A oximetria de pulso foi realizada em todos os indivíduos nos

momentos de hipoxemia e fora dela (quando a oferta suplementar de oxigênio não foi

necessária). Essa medida foi realizada com oxímetro de pulso modelo DX 2405 – Oxímetro

de Pulso – Oxyplenthy Super Bright (Dixtal – Brasil). No momento da hipoxemia, em

média a oximetria de pulso foi de 87,8 (±3,5) % e mediana de 88 (86,5 – 90); enquanto que

no momento de ausência de hipoxemia essa medida foi em média de 96,3 (±1,3) % e

mediana de 96 (95,5 – 97).

53

III.4 - Dosagem Laboratorial

III.4.1. - Ensaio imunoenzimático do IGF-I

As concentrações séricas de IGF-I foram determinadas no Laboratório de

Pediatria do HCFMRP-USP utilizando o kit DSL-10-5600 Active® IGF-I ELISA da

Diagnostic Systems Laboratories (DSL – Webster, Texas, EUA). Esse kit é composto por

um imunoensaio enzimático tratando-se, portanto, de um ELISA (enzyme linked immuno

sorbent assay) de “um passo” do tipo sanduíche.

Nesse ensaio, houve uma etapa na qual o IGF-I foi separado de suas

proteínas de ligação no soro. Essa extração, que ocorreu previamente ao ensaio

propriamente dito, foi essencial para a precisa determinação das concentrações de IGF-I.

No ensaio, padrões, amostras e controles em duplicata foram encubados com

anticorpo anti-IGF-I marcado com enzima HRP em cavidades de microtitulação revestidas

com outro anticorpo anti-IGF-I durante 2 horas em temperatura ambiente (~25oC) agitados

a 500-700 rpm em agitadora orbital The Jitterbug™ model 130000 (Boekel Scientific,

Pennsylvania, EUA). Após a encubação, as cavidades foram lavadas 5 vezes em lavadora

automática Immunowash Model 1575 (Bio-Rad Laboratories, EUA) utilizando-se o tampão

de lavagem que acompanhou o kit para a dosagem do IGF-I. Após a lavagem, as cavidades

foram encubadas com o substrato TMB por 10 minutos. Uma solução ácida de interrupção

foi adicionada e o grau de reposição enzimática foi determinado por medida de absorbância

em duplo comprimento de onda a 450 e 620 nm na leitora iMarkTM

Microplate Absorbance

54

Reader (Bio-Rad Laboratories, EUA). Após a leitura, os dados obtidos foram

encaminhados para análise no software Microplate Manager® (Bio-Rad Laboratories,

EUA) conectado à leitora.

Nesse tipo de ensaio, a absorbância medida é diretamente proporcional à

concentração de IGF-I presente na amostra. Um conjunto de padrões de IGF-I foi utilizado

para plotar a absorbância da curva padrão versus a concentração de IGF-I, e, a partir dessa

curva, as concentrações nas amostras desconhecidas foram calculadas. A curva padrão foi

construída a partir das seguintes concentrações: 11, 43, 147, 273 e 600 ng/ml.

Todas as concentrações séricas de um mesmo indivíduo com e sem hipóxia

foram obtidas no mesmo ensaio em duplicatas e os resultados expressos em ng/ml. Os

coeficientes de variação intra- e inter-ensaios foram, respectivamente, 6,05% e 10,8%. A

sensibilidade do ensaio foi de 0,03 ng/ml.

III.4.2 - Ensaio imunoenzimático da IGFBP-1

As concentrações séricas de IGFBP-1 foram determinadas no Laboratório de

Pediatria do HCFMRP-USP utilizando o kit DSL-10-78001 Active® Total IGFBP-1

ELISA da Diagnostic Systems Laboratories (DSL – Webster, Texas, EUA). Esse kit é

composto por um imunoensaio enzimático tratando-se, portanto, de um ELISA (enzyme

linked immuno sorbent assay) de “dois passos” do tipo sanduíche.

No ensaio, padrões, amostras e controles em duplicata foram encubados em

cavidades de microtitulação os quais foram revestidos com anticorpos anti-IGFBP-1

durante 1 hora em temperatura ambiente (~25°C) agitados a 500-700 rpm em agitadora

55

orbital The Jitterbug™ model 130000 (Boekel Scientific, Pennsylvania, EUA). Após essa

encubação, as cavidades foram lavadas 5 vezes em lavadora automática Immunowash

Model 1575 (Bio-Rad Laboratories, EUA) utilizando-se o tampão de lavagem que

acompanhou o kit para a dosagem do IGFBP-1. Houve, então, nova encubação onde as

cavidades foram tratadas com outro anticorpo anti-IGFBP-1 marcado com enzima HRP

durante 30 minutos em temperatura ambiente (~25°C) agitados a 500-700 rpm em agitadora

orbital. Após essa segunda encubação e lavagem idêntica ao primeiro procedimento, as

cavidades foram encubadas com o substrato TMB por 10 minutos. Uma solução ácida foi

adicionada e o grau de reposição enzimática foi determinado por medida de absorbância em

duplo comprimento de onda a 450 e 620 nm na leitora iMarkTM

Microplate Absorbance

Reader (Bio-Rad Laboratories, EUA). Após a leitura, os dados obtidos foram

encaminhados para análise no software Microplate Manager® (Bio-Rad Laboratories,

EUA) conectado à leitora.


concentração de IGFBP-1 presente na amostra. Um conjunto de padrões de IGFBP-1 foi

utilizado para plotar a absorbância da curva padrão versus a concentração de IGFBP-1, e, a

partir dessa curva, as concentrações nas amostras desconhecidas foram calculadas. A curva

padrão foi construída a partir das seguintes concentrações: 0,6; 3; 12; 37; 78 e 155 ng/ml.


foram obtidas no mesmo ensaio em duplicatas e os resultados expressos em ng/ml. Os


sensibilidade do ensaio foi 0,025 ng/ml.

56

III.4.3 - Ensaio imunoenzimático da IGFBP-3

As concentrações séricas de IGFBP-3 foram determinadas no Laboratório de

Pediatria do HCFMRP-USP utilizando o kit DSL-10-6600 Active® Total IGFBP-3 ELISA

da Diagnostic Systems Laboratories (DSL – Webster, Texas, EUA). Esse kit é composto

por um imunoensaio enzimático tratando-se, portanto, de um ELISA (enzyme linked

immuno sorbent assay) de “dois passos” do tipo sanduíche.

Nesse ensaio, houve uma etapa na qual as amostras foram diluídas em 1:100

utilizando-se diluente próprio componente do kit.

No ensaio, padrões, amostras e controles em duplicata foram encubados em

cavidades de microtitulação os quais foram revestidos com anticorpo policlonal anti-

IGFBP-3 durante 2 horas em temperatura ambiente (~25°C) agitados a 500-700 rpm em

agitadora orbital The Jitterbug™ model 130000 (Boekel Scientific, Pennsylvania, EUA).

Após essa encubação, as cavidades foram lavadas 5 vezes em lavadora automática

Immunowash Model 1575 (Bio-Rad Laboratories, EUA) utilizando-se o tampão de lavagem

que acompanhou o kit para a dosagem do IGFBP-3. Houve, então, nova encubação onde as

cavidades foram tratadas com outro anticorpo policlonal anti-IGFBP-3 marcado com

enzima HRP durante 1 hora em temperatura ambiente (~25°C) agitados a 500-700 rpm em

agitadora orbital. Após essa segunda encubação e lavagem idêntica ao primeiro

procedimento, as cavidades foram encubadas com o substrato TMB por 10 minutos. Uma

solução ácida foi adicionada e o grau de reposição enzimática foi determinado por medida

de absorbância em duplo comprimento de onda a 450 e 620 nm na leitora iMarkTM

Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad Laboratories, EUA). Após a leitura, os dados

57

obtidos foram encaminhados para análise no software Microplate Manager® (Bio-Rad

Laboratories, EUA) conectado à leitora.


concentração de IGFBP-3 presente na amostra. Um conjunto de padrões de IGFBP-3 foi

utilizado para plotar a absorbância da curva padrão versus a concentração de IGFBP-3, e, a


padrão foi construída a partir das seguintes concentrações: 1,2; 4; 15; 39 e 74 ng/ml.


foram obtidas no mesmo ensaio em duplicatas e os resultados obtidos em ng/ml. Os


sensibilidade do ensaio foi de 0,04 ng/ml. As concentrações obtidas em ng/ml foram

corrigidas pelo fator de diluição e, após, transformadas em mg/l, sendo que foi nessa

unidade que foram reportadas nos resultados.

III.4.4 - Ensaio imunoenzimático de insulina

As concentrações séricas de insulina foram determinadas no Laboratório de

Pediatria do HCFMRP-USP utilizando o kit DSL-10-1600 Active® Insulina ELISA da

Diagnostic Systems Laboratories (DSL – Webster, Texas, EUA). Esse kit é composto por

um imunoensaio enzimático tratando-se, portanto, de um ELISA (enzyme linked immuno

sorbent assay) de “um passo” do tipo sanduíche.

No ensaio, padrões, amostras e controles em duplicata foram encubados com

anticorpo anti-insulina marcado com enzima HRP em cavidades de microtitulação

58

revestidas com outro anticorpo anti-insulina durante 1 hora em temperatura ambiente

(~25oC) agitados a 500-700 rpm em agitadora orbital The Jitterbug™ model 130000

(Boekel Scientific, Pennsylvania, EUA). Após a encubação, as cavidades foram lavadas 5

vezes em lavadora automática Immunowash Model 1575 (Bio-Rad Laboratories, EUA)

utilizando-se o tampão de lavagem que acompanhou o kit para a dosagem da insulina. Após

a lavagem, as cavidades foram encubadas com o substrato TMB por 10 minutos. Uma

solução ácida de interrupção foi adicionada e o grau de reposição enzimática foi

determinado por medida de absorbância em duplo comprimento de onda a 450 e 620 nm na

leitora iMarkTM

Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad Laboratories, EUA). Após a

leitura, os dados obtidos foram encaminhados para análise no software Microplate

Manager® (Bio-Rad Laboratories, EUA) conectado à leitora.


concentração de insulina presente na amostra. Um conjunto de padrões de insulina foi

utilizado para plotar a absorbância da curva padrão versus a concentração de insulina, e, a


padrão foi construída a partir das seguintes concentrações: 3,5; 8,5; 25 e 84 µUI/ml.


foram obtidas no mesmo ensaio em duplicatas e os resultados expressos em µUI/ml. Os

coeficientes de variação intra- e inter-ensaios foram, respectivamente, 10,9% e 16%. A

sensibilidade do ensaio foi de 0,26 µUI/ml.

59

III.5 - Avaliação da expressão do IGF1R

III.5.1 – Separação de linfócitos

Amostras de sangue foram colhidas em frascos roxos contendo EDTA com

volumes que variaram entre 0,5 e 1 ml. Foi adicionada a esse material quantidade suficiente

de tampão PBS para obtenção do volume final de 5 ml. Essa solução foi posta sobre a

mesma quantidade de Ficoll-Hypaque® (Histopaque, Sigma Chemical, EUA) que

proporciona um gradiente de densidade para separação de linfócitos de outros elementos do

sangue total, e centrifugada a 1500 rpm durante 30 minutos. Obtiveram-se quatro camadas

distintas em ordem do sobrenadante para o precipitado: soro, células mononucleares que

compõem a camada opaca, Ficoll-Hypaque® e hemácias. Após desprezar as hemácias por

inversão, foram procedidas 3 lavagens acrescentando-se tampão PBS em quantidade

suficiente para 20 ml e centrifugando-se a 2500 rpm durante 10 minutos. Ao final, as

células foram ressuspensas com 500 µl de PBS, produzindo-se, dessa forma, 2 alíquotas de

250 µl às quais foram adicionados 750 µl de TRIzol LS Reagent® (Invitrogen, EUA) cada

uma, numa proporção de 3:1, sendo, então, homogeneizadas e imediatamente armazenadas

em congelador a -80oC até o momento da extração do RNA total dos linfócitos assim

separados.

60

III.5.2 – Extração do RNA

Depois de descongeladas, foram adicionados 200 µl de clorofórmio às

amostras armazenadas em TRIzol LS Reagent® (Invitrogen, EUA) sendo procedida, em

seguida, agitação vigorosa durante 15 segundos. As amostras permaneceram em repouso

por 3 minutos em temperatura ambiente e, após, centrifugadas a 13200 rpm por 15 minutos

a 4ºC. Obtiveram-se 3 fases assim descritas no sentido do sobrenadante para o precipitado:

fase superior (incolor) onde o RNA total está dissolvido, interfase de coloração branca onde

está dissolvido o DNA e proteínas; e a fase inferior de coloração rosa onde está o fenol e o

clorofórmio. A fase aquosa foi transferida para um novo tubo identificado onde foram

adicionados 500 µl de álcool isopropílico a 100% gelado e, imediatamente, postas no gelo.

As amostras, então, permaneceram a -20ºC por pelo menos 12 horas (overnight).

No dia seguinte, foram centrifugadas a 13200 rpm durante 20 minutos a 4ºC,

com isso, foi formado um pellet contendo o RNA total, sendo desprezado o sobrenadante.

Às amostras, foram acrescentados 1000 µl de etanol a 75% seguido novamente de

centrifugação a 13200 rpm por 5 minutos a 4ºC. Desprezou-se a fase superior e o pellet

seco foi dissolvido em 50 µl de água tratada com DEPC, sendo, após identificação correta,

estocado a -80oC até o momento da obtenção do cDNA.

61

III.5.3 – Quantificação do RNA

A quantificação do RNA foi obtida mediante espectrofotometria de onda em

aparelho Gene Quant Pro Spec® (Amersham Bioscience). Nesse método, a obtenção da

concentração de RNA baseia-se na relação entre 1 unidade em A260 ser igual a 40 µg/ml de

RNA dissolvido em água.

III.5.4 – Síntese da primeira fita de cDNA

Após a quantificação de RNA total das amostras armazenadas em freezer a -

80oC, o cDNA foi obtido a partir de aproximadamente 1000 µg de RNA. Foi utilizado o kit

High Capacity® (Applied Biosystems, EUA) onde, para o volume calculado da amostra de

RNA a ser reversamente transcrito, foram adicionados 1 µl de c/NTP, 2,5 µl de random P,

1,25 µl de Multiscribe, 0,63 µl de inibidor de RNase (RNase-Out, Invitrogen, EUA), 2,5 µl

de tampão e 15,12 µl de água tratada com DEPC. Essa mistura foi posta a 25ºC durante 10

minutos e, a seguir, a 37oC durante 2 horas sendo, então, estocada a -20ºC até o momento

da qPCR.

Naquelas amostras onde a quantificação de RNA não foi possível, utilizou-se

a quantidade de RNA de acordo com as recomendações do fabricante do kit High

Capacity® (Applied Biosystems, EUA).

62

III.5.5 – Controles endógenos

Os genes de controle endógeno (housekeeping) são utilizados para a

normalização dos níveis da expressão dos genes de estudo (alvo). Nesse estudo, foram

escolhidos dois genes para controle endógeno: B2M (β2-microglobulina) e o GUSB (β-

glicuronidase).

O B2M localiza-se no braço longo do cromossomo 15 (15q21-q22.2) e

codifica uma proteína relacionada ao complexo de histocompatibilidade maior de classe 1

chamada β-2 microglobulina. O gene GUSB localiza-se no braço longo do cromossomo 7

(7q21.11) e codifica a proteína β-glicuronidase presente em todas as células nucleadas,

sendo que sua expressão é mantida constante em diversos tipos celulares e diferentes

situações do ciclo celular mantendo sua expressão estável. Tais genes, em estudos

anteriores, apresentaram melhor desempenho durante a qPCR quando a expressão gênica

foi analisada em linfócitos humanos (BEILLARD et al., 2003).

Além de controle endógeno, o gene GUSB também foi empregado para

testar a integridade das amostras de cDNA em RT-PCR convencional (conforme descrição

a seguir).

III.5.6 – RT-PCR

Todas as amostras de cDNA obtidas após a sua síntese foram submetidas à

transcrição reversa convencional utilizando primers para amplificação do gene utilizado

para controle endógeno GUSB. Nessa reação, 1,0 µl do cDNA de cada amostra foi

63

adicionado a uma solução contendo 18,8 µl de água, 2,5 µl de solução tampão 5x

(Invitrogen, Brasil), 1,0 µl de cloreto de magnésio 50 nM (Invitrogen, Brasil), 0,5 µl de

solução 10 mM de cada dNTP, 15 pM de cada primer (sense e antisense), 0,2 µl de Taq-

polimerase 5 U/µl (Platinum Taq DNA polymerase, Invitrogen, Brasil), perfazendo um

volume total de 25 µl. As melhores condições de desnaturação, pareamento e amplificação

já haviam sido padronizadas previamente. As amostras foram, então, postas no

termociclador PTC-200 (MJ Research, Inc, EUA) sob as seguintes condições: desnaturação

inicial a 94ºC durante 4 minutos e pareamento a 60ºC por 2 minutos, seguidos de 38 ciclos

compostos por desnaturação a 94ºC, pareamento a 60ºC e extensão a 72ºC durante 1 minuto

cada, seguidos por um ciclo de extensão final a 72ºC durante 10 minutos.

Após a RT-PCR, os seus produtos foram submetidos à eletroforese em gel de

agarose a 2% com brometo de etídeo (descrito no apêndice A). Com isso, demonstrou-se a

integridade do cDNA e a sua capacidade de amplificação. A figura 2 mostra a visualização

do gel de eletroforese do produto de RT-PCR para o gene GUSB.

64

Figura 2 – Imagens obtidas dos géis de agarose a 2% com os produtos da amplificação do

gene GUSB após uma RT-PCR de todos os cDNAs das amostras coletadas.

65

III.5.7 – qPCR

O mRNA total foi extraído a partir de linfócitos periféricos (BERNABEI et

al, 2003) e, após a sua quantificação e obtenção do cDNA, esse foi submetido à técnica de

qPCR que permite a quantificação da expressão de um gene alvo. Tal procedimento permite

que no mesmo aparelho, a reação de transcrição reversa, amplificação do cDNA e

quantificação específica da expressão de um gene, no caso desse estudo, o gene IGF1R,

seja realizada. Para tanto, é necessária a presença de um marcador fluorescente que emite

um sinal quando excitado, por exemplo, por um laser. Esse processo é totalmente

automatizado sendo que no momento em que um feixe de laser é direcionado através dos

tubos ópticos utilizados durante as reações, os dados da fluorescência emitida pelas

amostras são coletados e analisados por um programa de computador possibilitando, dessa

forma, a quantificação (BUSTIN, 2000).

Habitualmente, dois sistemas de sondas fluorescentes têm sido utilizados:

aqueles nos quais as sondas tipo TaqMan® (Applied Biosystems, EUA) são usadas e

aqueles onde o marcador é do tipo SYBR Green® (Applied Biosystems, EUA). Ambos os

sistemas apresentam eficiências semelhantes, porém, quando comparados, apresentam

algumas diferenças em função do princípio básico das reações. Deve ser ressaltado que os

sistemas que utilizam sondas TaqMan® (Applied Biosystems, EUA) apresenta melhor

especificidade dado o uso de sondas específicas para o gene alvo. Esses sistemas são

compostos por 2 primers específicos e uma sonda com 2 fluorocromos diferentes. Um dos

fluorocromos é chamado de reporter e localiza-se na extremidade 5‟ da sonda, o outro

localizado na extremidade 3‟ da sonda é chamado de quencher (repressor). A proximidade

de ambos fluorocromos proporciona uma inibição da fluorescência do reporter através de

66

um fenômeno de transferência de energia conhecido como FRET (fluorescence ressonance

energy transference). A sonda, durante a qPCR, sofre hibridização com uma sequência

específica de interesse. No momento em que ocorre cada ciclo de extensão, a Taq-

polimerase cliva o reporter da sonda, separando-o do quencher o que proporciona a

emissão da fluorescência característica do reporter que é captada e analisada pelo aparelho.

Essa técnica, portanto, é capaz de medir a formação de produtos da amplificação dos

fragmentos de cDNA de forma reprodutível e precisa. É importante observar que a análise

deve ser realizada na fase exponencial da qPCR e que a fluorescência detectada é

proporcional à quantidade de sonda degradada e, portanto, ao produto da RT-PCR

acumulado (SCRIDELI; TONE, 2007).

A leitura obtida pelo aparelho de qPCR foi expressa na forma de número de

ciclos de PCR necessários para que um determinado nível de fluorescência fosse

significativamente detectável assim chamado de ciclo threshold ou Ct. Tal resultado

possibilitou o cálculo do ΔCt onde houve a normalização dos dados oriundos das amostras

em relação aos genes de controle endógeno. Além disso, também foram normalizados os

resultados obtidos das amostras em relação ao ΔCt de um calibrador, e a partir de então, foi

calculado o ΔΔCt das amostras.

Nesse estudo, a expressão do gene IGF1R (gene alvo) foi quantificada

utilizando-se sondas específicas TaqMan® (Applied Biosystems, EUA) durante a

realização da qRT-PCR sendo que todas as reações foram realizadas no aparelho 7500

Real-time PCR System® (Applied Biosystems, EUA) disponibilizado no Laboratório de

Pediatria do HCFMRPUSP.

Todas as reações foram preparadas em duplicatas imersas em gelo e sob

proteção de luz em placas de polipropileno contendo 96 poços próprios para esse fim

67

(UltraAmp 96-well Semi-Skirt PCR plates, Sorenson BioScience Inc, EUA). Todos os

genes do estudo (controles endógenos, GUSB e B2M, e o alvo, IGF1R) foram amplificados

nas amostras do estudo e também nas amostras do calibrador (nesse estudo, o cDNA foi

obtido de um indivíduo normal). Em paralelo, foram acrescentadas reações que não

continham cDNA (controles brancos) e, caso houvesse algum tipo de contaminação nessas

amostras, uma nova reação era realizada.

Nos poços foram colocados 10 µl de TaqMan® Universal Master Mix

(Applied Biosystems, EUA); 1 µl de sonda TaqMan® (Applied Biosystems, EUA)

específica para o gene (GUSB ou B2M ou IGF1R) e 9 µl do cDNA oriundo das amostras e

diluído na proporção de 1:50 em água, totalizando um volume final da reação de 20 µl. A

seguir, a placa foi coberta com adesivo plástico para microplacas resistente a álcool e a

altas temperaturas (Adhesive PCR film, ABgene) e seu conteúdo foi centrifugado durante 3

minutos a 3000 rpm. Os reagentes, dessa forma acondicionados, foram, então, submetidos

às condições para a realização da qPCR no aparelho 7500 Real-time PCR System®

(Applied Biosystems, EUA). Tais condições de temperatura foram as seguintes: pré-

aquecimento até 50ºC durante 2 minutos seguidos de desnaturação realizada a 95ºC durante

10 minutos e, após, ciclos de amplificação e quantificação nos quais as amostras foram

submetidas a 95ºC por 15 segundos e 60ºC por 60 segundos nessa ordem por 40 vezes. A

figura 3 exemplifica um gráfico de amplificação da qPCR.

68

a)

b)

Figura 3 – Imagens obtidas pelo software do aparelho 7500 Real-time PCR Systems® que

representam as curvas de amplificação do gene IGF1R em duas amostras do indivíduo 17.

Na primeira amostra (a), a amplificação na situação de hipóxia aguda; na segunda amostra

(b), a amplificação no momento sem hipóxia. A linha verde representa o threshold (0,01).

69

III.5.8 – Quantificação da expressão gênica

Conforme supracitado, cada amostra foi amplificada em duplicata e, ao

mesmo tempo, para cada gene a ser verificado, foram preparadas, na mesma placa, reações

contendo cDNA obtido de linfócitos extraídos de sangue periférico de um indivíduo

normal. Essa amostra, denominada calibrador, foi utilizada como referência na comparação

entre as amostras na análise da expressão gênica em todas as reações. O calibrador não foi

considerado como referência normal e, sim, somente como parâmetro da expressão gênica

dos genes abordados nesse estudo.

Foram incluídas na análise somente as amostras cujas diferenças de

amplificação entre as duplicatas foi de, no máximo, 1,5 ciclos. As amostras que excederam

tal limite foram repetidas a fim de se obter resultados confiáveis.

O momento em que todas as amostras apresentaram a mesma intensidade de

fluorescência (threshold) foi determinado manualmente sendo fixado em 0,1 para todos os

genes e utilizado em todas as reações de qPCR na sua fase exponencial. Dado o threshold,

o software do aparelho 7500 Real-time PCR Systems® forneceu os valores de Ct de cada

amostra testada. A média aritmética dos valores de Ct das duplicatas foi utilizada para o

cálculo do ΔΔCt.

Nesse estudo, a quantificação da expressão gênica realizada foi a relativa.

Essa modalidade de quantificação determina a mudança na expressão de uma sequência de

ácido nucléico (alvo) em relação a uma mesma sequência presente numa amostra de

calibrador. Uma vez que 2 amostras de um mesmo indivíduo foram obtidas em situações

diferentes, esse tipo de quantificação pode ser usada na comparação entre as expressões

70

verificadas na situação inicial (hipóxia aguda associada a infecções respiratórias) e na

situação final (sem hipóxia).

III.6 - Análise estatística

Todas as variáveis tiveram as médias, desvios-padrão, medianas e análises

interquartílicas calculados. Os resultados foram mostrados na forma de média (±DP) e

medianas (P25 – P75)

O teste de Wilcoxon foi aplicado respectivamente na análise das variáveis

com ou sem distribuição normal, antes e após o tratamento da hipoxemia.

O teste D‟Agostino e Pearson foi utilizado para verificar a normalidade das

variáveis.

Significância estatística será assumida para P 0,05.

71

IV – Resultados

72

IV.1 – Concentrações séricas de IGF-I

As concentrações séricas de IGF-I foram obtidas nas amostras colhidas

durante o momento de hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e após a

recuperação da mesma em cada um dos 24 indivíduos, sendo que dentre os 27 indivíduos

inicialmente selecionados, em 3 deles as amostras durante a hipóxia mostraram-se com

volumes insuficientes para a dosagem, fato que ocasionou a exclusão desses sujeitos nessa

análise.

Na tabela 3 estão os resultados obtidos das concentrações séricas de IGF-I

nas crianças durante a hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e quando a

normalidade foi restabelecida. Os resultados observados em conjunto, de acordo com a

situação hipóxia ou ausência dela, apresentaram médias de 21,3 (±37,8) e 60,2 (±58,6)

ng/ml, respectivamente. As medianas, sob esse mesmo aspecto, foram 12,3 (6,24 – 24,14)

em hipóxia e 54,8 (24,51 – 72) ng/ml na ausência dela.

A figura 4 ilustra o comportamento das concentrações séricas de IGF-I de

cada indivíduo, inicialmente, na hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e, após,

na ausência dela.

Cada indivíduo avaliado foi representado por um símbolo gráfico e uma cor

específicos, sendo que nas figuras 3, 4, 5, 6 e 7 essa representação gráfica se repete e que

cada indivíduo, portanto, conserva a mesma representação em todas as figuras.

Na ausência de padrão de normalidade para as concentrações séricas de IGF-

I em crianças com idade inferior a 2 anos, 23 indivíduos tiveram suas concentrações

comparadas com a referência apresentada nas instruções do fabricante. A mediana

73

apontada, para essa faixa etária, é de 55,25 ng/ml (intervalo entre 13,26 e 82,95 ng/ml), de

acordo com referência apontada pelo fabricante do kit. Na situação de hipóxia, 14 crianças

estiveram abaixo do intervalo normal; na ausência de hipóxia, somente 4 estavam com

concentrações inferiores. As outras 4 crianças (idade superior a 2 anos), tiveram os EDP

das concentrações séricas de IGF-I calculados. A criança número 6 variou de -2,25 para -

2,13 EDP; a criança número 8 variou de -2,3 para -1,67 EDP; a número 18 de -0,3 para

0,88 EDP; e a número 26 de -2,54 para -2,19 EDP, nas situações de hipóxia e após a

recuperação, respectivamente.

As observações foram realizadas em 2 situações diferentes num mesmo

indivíduo, portanto esses mesmos resultados foram pareados e o teste de Wilcoxon foi

utilizado. Houve diferença significativa entre as situações de hipóxia e sem hipóxia (p <

0,0001).

74

Tabela 3 – Concentrações séricas de IGF-I (ng/ml) dos pacientes durante a hipóxia aguda

associada a infecções respiratórias e, após, nos mesmos indivíduos, na ausência dela.

Valores expressos em média, DP e mediana.

Pacientes

Concentrações séricas

de IGF-I (ng/ml)

Hipóxia Sem

hipóxia

1 11,5 26,0

2 16,3 70,0

3 19,2 49,5

4 12,7 108,8

5 0,62 73,8

6 12,3 22,5

7 1,8 53,7

8 20,4 83,5

9 1,3 24,0

10 6,0 38,5

11 9,9 5,0

12 8,0 9,3

13 34,6 59,5

14 32,2 45,3

15 4,4 3,5

16 5,7 56,0

17 10,5 61,5

18 192,9 300,5

19 25,3 58,2

20 7,1 7,4

21 33,8 72,3

23 13,5 71,2

24 18,3 95,8

26 12,4 49,8

Média 21,3 60,2

DP 37,8 58,6

Mediana 12,3 54,8

75

Concentrações séricas de IGF-I

0

50

100

150

200

250

300

350

Hipóxia Sem hipóxia

ng

/dl

Figura 4 – Concentrações séricas de IGF-I (ng/ml) dos pacientes durante a hipóxia aguda

associada a infecções respiratórias e, após, na ausência dela.

IV.2 – Concentrações séricas de IGFBP-1

As concentrações séricas de IGFBP-1 foram obtidas nas amostras colhidas

durante o momento de hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e fora dessa

condição em 26 crianças, sendo que em 1, dentre as 27 selecionadas, a amostra durante a

hipóxia mostrou-se com volume insuficiente para a dosagen, fato que ocasionou a sua

exclusão nessa análise.

Na tabela 4, encontram-se os resultados obtidos das concentrações séricas de

IGFBP-1 nos indivíduos durante a hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e no

76

momento quando a normalidade foi restabelecida. Os resultados observados em conjunto de

acordo com a situação hipóxia ou ausência dela apresentaram médias de 135,3 (±79,3) e

75,3 (±55,5) ng/ml, respectivamente. As medianas, sob esse mesmo aspecto, foram 115,5

(77,4 – 171,6) em hipóxia e 68,6 (28,25 – 106,8) ng/ml na ausência dela. Da mesma forma,

a figura 5 ilustra o comportamento das concentrações séricas de IGFBP-1 de cada criança,

inicialmente, na hipóxia e, após, na ausência dela.

Os resultados foram pareados e o teste de Wilcoxon foi utilizado o que

também mostrou diferença significativa entre as situações de hipóxia e sem hipóxia (p =

0,0014).

77

Tabela 4 – Concentrações séricas de IGFBP-1 (ng/ml) dos pacientes durante a hipóxia

aguda associada a infecções respiratórias e, após, nos mesmos indivíduos, na ausência dela.

Valores expressos em média, DP e mediana.

Pacientes


de IGFBP-1(ng/ml)

Hipóxia Sem

hipóxia

1 105,7 137,6

2 193,4 63,2

3 95,4 86,9

4 175,4 12,2

5 136,4 15,5

6 169,7 179,6

7 78,7 37,2

8 170,4 37,8

9 140,9 56,9

10 224,9 103,8

11 109,3 88

12 155,3 93

13 53,2 18,7

14 31,6 30,5

15 65,9 207

16 211,2 81

17 113,5 20,1

18 111,8 124,1

19 330,2 170,2

20 117,5 104,2

21 40,9 73,9

23 157,7 37,1

24 73,6 21,4

25 331,3 114,6

26 10,5 8,6

27 113,3 33,1

Média 135,3 75,3

DP 79,3 55,5

Mediana 115,5 68,6

78

Concentrações séricas de IGFBP-1

0

50

100

150

200

250

300

350


ng

dl

Figura 5 – Concentrações séricas de IGFBP-1 (ng/ml) dos pacientes durante a hipóxia

aguda associada a infecções respiratórias e, após, na ausência dela.

IV.3 – Concentrações séricas de IGFBP-3

As concentrações séricas da IGFBP-3 foram obtidas nas amostras colhidas


condição em 25 crianças, sendo que, dentre as 27 incialmente selecionadas, em 2 delas as

amostras durante a hipóxia mostraram-se com volumes insuficientes para a dosagem, fato

que ocasionou a exclusão desses sujeitos nessa análise.

79

Na tabela 5, estão os resultados obtidos das concentrações séricas da IGFBP-

3 nos pacientes durante a hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e após, quando

a normalidade foi restabelecida. Os resultados observados em conjunto de acordo com a

situação hipóxia ou ausência dela apresentaram médias de 1,53 (±0,8) e 2,34 (±0,7) mg/l,

respectivamente. As medianas, sob esse mesmo aspecto, foram 1,32 (0,86 – 2,17) mg/l em

hipóxia e 2,25 (1,9 – 2,78) mg/l em condições normais.

Da mesma forma, a figura 6 ilustra o comportamento das concentrações

séricas da IGFBP-3 de cada indivíduo, inicialmente, na hipóxia aguda associada a infecções

respiratórias e, após, na ausência dela.

Os resultados das concentrações séricas de IGFBP-3 foram pareados e o

teste de Wilcoxon foi utilizado o que mostrou diferença significativa entre as situações de

hipóxia e sem hipóxia (p = 0,0002).

80

Tabela 5 – Concentrações séricas de IGFBP-3 (mg/l) dos pacientes durante a hipóxia

aguda associada a infecções respiratórias e, após, na ausência dela. Valores expressos em

média, DP e mediana.

Pacientes


de IGFBP-3 (mg/l)

Hipóxia Sem

hipóxia

1 0,56 1,46

2 2,21 2,68

3 1,65 2,80

4 0,72 2,48

5 0,52 2,08

6 1,05 1,60

7 0,41 2,45

8 1,29 2,80

9 0,72 2,32

11 2,26 1,24

12 2,28 2,12

13 2,57 2,92

14 1,25 1,38

15 1,32 1,45

16 0,6 2,21

17 2,13 3,00

18 3,49 4,1

19 1,87 2,01

20 2,06 1,8

21 2,25 2,75

23 1,16 2,25

24 1,91 2,24

25 1,84 2,06

26 0,99 2,52

27 1,24 3,77

Média 1,53 2,34

DP 0,8 0,7

Mediana 1,32 2,25

81

Concentrações séricas de IGFBP-3

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5


mg

/l

Figura 6 – Concentrações séricas de IGFBP-3 (mg/l) dos pacientes durante a hipóxia aguda

associada a infecções respiratórias e, após, nos mesmos indivíduos, na ausência dela.

IV.4 – Concentrações séricas de Insulina

As concentrações séricas de insulina foram obtidas nas amostras colhidas


condição em 25 crianças, sendo que em 2 delas as amostras durante a hipóxia mostraram-se

com volumes insuficientes para as dosagens, fato que ocasionou a exclusão desses

pacientes nessa análise.

82

Na tabela 6, estão os resultados obtidos das concentrações séricas de insulina

nas crianças durante a hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e quando a

normalidade foi restabelecida. Os resultados observados em conjunto de acordo com a

situação hipóxia ou ausência dela apresentaram médias de 11,7 (±7) e 14,5 (±9,6) µUI/ml,

respectivamente. As medianas, sob esse mesmo aspecto, foram 9,1 (8,48 – 11,1) em

hipóxia e 9,8 (8,79 – 18,6) µUI/ml em condições normais. Da mesma forma, a figura 7

ilustra o comportamento das concentrações séricas de insulina de cada indivíduo,

inicialmente, na hipóxia e, após, na ausência dela.

Os resultados das concentrações séricas de insulina dos indivíduos foram

pareados e o teste de Wilcoxon foi utilizado. Nessa análise, não houve diferença

significativa entre as situações de hipóxia e sem hipóxia (p = 0,132).

83

Tabela 6 – Concentrações séricas de insulina (µUI/ml) dos pacientes durante a hipóxia

aguda associada a infecções respiratórias e, após, na ausência dela. Valores expressos em

média, DP e mediana.

Pacientes


de insulina (µUI/ml)

Hipóxia Sem

Hipóxia

1 8,0 20,2

2 9,6 8,9

3 11,1 8,4

4 12,8 20,8

5 8,3 11,8

6 8,5 9,1

7 10,2 42,4

9 8,4 11,0

10 8,5 8,6

11 11,9 8,8

12 9,3 8,9

13 20,3 34,2

14 33,7 9,6

15 8,4 8,8

16 9,0 17,0

17 33,2 9,8

18 10,6 8,6

19 9,1 8,8

20 9,0 8,4

21 9,0 10,7

23 7,5 8,1

24 8,7 10,5

25 9,3 21,8

26 7,9 35,2

27 11,0 12,0

Média 11,7 14,5

DP 7,0 9,6

Mediana 9,1 9,8

84

Concentrações séricas de Insulina

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Hipóxia Sem Hipóxia

mic

roU

I/m

l

Figura 7 – Concentrações séricas de insulina (µUI/ml) dos pacientes durante a hipóxia

aguda associada a infecções respiratórias e, após, na ausência dela.

IV.5 – Expressão do IGF1R

Foram realizadas qPCRs de todas as amostras de 26 indivíduos, sendo que 1

indivíduo foi excluído dessa análise pois, apesar do fato de que a sua amostra apresentou

amplificação adequada quando foi testada utilizando RT-PCR para o gene GUSB, as

amostras, quando submetidas à qPCR, não apresentaram amplificação adequada, além de

apresentarem por diversas vezes duplicatas díspares. Os resultados obtidos de todos os

85

indivíduos nas duas situações (hipóxia e sem hipóxia), quando agrupados em conjunto,

mostraram um Ct, em média, de 32,33 (±2,45) e mediana de 32,34.

A expressão relativa do IGF1R foi quantificada mediante utilização do

cálculo do ∆∆Ct. Assim, os resultados foram analisados em conjunto, os indivíduos quando

na situação de hipóxia apresentaram quantificação relativa da expressão do IGF1R em

média de 1,61 (±1,26) e mediana de 1,28 (0,8 – 2,11). Fora da hipóxia a quantificação

relativa da expressão desse receptor foi em média 1,21 (±1,1) e a mediana foi de 0,93 (0,41

– 1,7).

Na tabela 7, encontram-se os resultados da quantificação relativa do gene

IGF1R de todos os indivíduos nas situações de hipóxia aguda associada a infecções

respiratórias e normalidade. Deve ser ressaltado que esses resultados são relativos à

expressão do gene alvo em comparação a um indivíduo (calibrador). Nessa tabela, a

quantificação da expressão do gene IGF1R é mostrada de acordo com a situação de

oxigenação sanguínea das crianças, bem como os valores da média, desvio-padrão e

mediana.

A figura 8 mostra a evolução da expressão do gene do receptor tipo 1 de IGF

nos indivíduos quando em hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e, após

melhora clínica, fora dessa condição.

86

Tabela 7 – Quantificação relativa da expressão do IGF1R em linfócitos de sangue

periférico, de acordo com a situação hipóxia aguda associada a infecções respiratórias ou

sem hipóxia. Valores expressos em média, DP e mediana.

Pacientes

Quantificação

Relativa

Hipóxia Sem

hipóxia

1 2,77 1,98

2 0,33 0,46

3 1,39 0,86

4 1,70 4,60

5 4,54 1,59

6 0,65 0,50

7 2,03 1,46

8 1,81 0,49

9 1,15 0,99

10 0,25 0,10

11 0,27 0,22

12 1,12 0,25

13 1,04 0,05

14 1,62 1,55

15 1,91 0,21

16 2,55 1,10

17 1,31 0,79

18 0,82 1,17

19 5,61 3,14

20 2,36 0,52

21 1,25 2,70

22 0,10 0,27

24 1,17 2,62

25 0,76 0,73

26 0,87 1,01

27 2,45 2,06

Média 1,61 1,21

DP 1,26 1,1

Mediana 1,28 0,93

87

Expressão do gene IGF1R

0

1

2

3

4

5

6

Hipóxia Sem Hipóxia

Figura 8 – Expressão relativa do IGF1R em linfócitos de sangue periférico de pacientes em

hipóxia aguda associada a infecções respiratórias e, após, na ausência dela.

Considerando-se que as mesmas crianças foram observadas em 2 situações

diferentes, os resultados da quantificação relativa do IGF1R demonstraram aumento

significativo na expressão relativa do IGF1R na situação de hipóxia (p = 0,0373).

88

IV.6 – Síntese dos resultados

Na tabela 8 são apresentadas as médias (±DP), as medianas e os níveis de

significância alcançados quando da comparação dos resultados das concentrações séricas de

IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3, insulina e expressão do IGF1R nos linfócitos de sangue

periférico, além da própria oximetria de pulso nas situações de hipóxia associada à infecção

respiratória aguda e sem hipóxia. Nessa tabela, os resultados e suas comparações são

apresentados de forma sintética o que permite maior clareza dos dados encontrados.

89

Tabela 8 – Médias (±DP) e medianas (análise interquartílica) da oximetria de pulso,

concentrações séricas de IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3 e insulina; e expressão do IGF1R.

Níveis de significância estatística encontrados na comparação entre as situações de hipóxia

e fora dela.

Hipóxia Sem hipóxia P com pareamento*

Saturação de

oxigênio (%)

87,8 (±3,5)**

88 (86,5 – 90)

96,3 (±1,3)**

96 (95,5 – 97)

< 0,0001

IGF-I (ng/ml)

21,3 (±37,8)

12,3 (6,24 – 20,14)

60,2 (±58,6)

54,8 (24,51 – 72)

< 0,0001

IGFBP-1 (ng/ml)

135,3 (±79,3)

115,5 (77,4 – 171,6)

75,2 (±55,5)**

68,5 (28,25 – 106,8)

0,0014

IGFBP-3 (mg/l)

1,53 (±0,8)**

1,32 (0,86 – 2,17)

2,34 (±0,7)**

2,25 (1,9 – 2,78)

0,0002

Insulina (µUI/ml)

11,7 (±7)

9,1 (8,48 – 11,1)

14,5 (±9,6)

9,8 (8,79 – 18,6)

0,132

Expressão do IGF1R

1,61 (±1,26)

1,28 (0,8 – 2,11)

1,21 (±1,1)

0,93 (0,41 – 1,7)

0,0373

*Teste de Wilcoxon pareado; ** variáveis com distribuição normal.

90

V – Discussão

91

O principal objetivo desse estudo foi verificar a resposta de componentes do

sistema IGF à hipóxia aguda em crianças. Os resultados obtidos mostraram uma redução

significativa das concentrações séricas de IGF-I e de IGFBP-3, aumento das concentrações

séricas de IGFBP-1, concentrações séricas de insulina inalteradas e aumento da expressão

do IGF1R em crianças durante a hipóxia aguda.

A RCIU, situação na qual provavelmente há hipóxia crônica, tem sido

instrumento de estudo do comportamento do sistema IGF mediante restrição de oxigênio.

Sob esse aspecto, estudos procuraram relacionar fetos com RCIU e concentrações de IGF-I

e IGFBP-1 no líquido amniótico e no plasma materno, no entanto, não houve correlação

entre RCIU e as concentrações desses fatores (BAHTIA et al., 2002). Em outra análise, as

concentrações amnióticas de IGF-I, IGFBP-1 e leptina foram avaliadas e, novamente, não

houve correlação com a RCIU (ROIG et al., 2005). Alguns modelos animais de hipóxia

intra-uterina também demonstraram que as concentrações séricas de IGF-I e –II nos filhotes

de ovinos e de murinos, apesar da acidose e da RCIU a que foram submetidos, não se

alteravam mediante estímulo hipoxêmico, apesar da redução ocorrida do mRNA hepático

do IGF-I (McLELLAN et al., 1992; TAPANAINEN et al., 1994). As concentrações de

IGF-II tenderam a ser maiores alcançando exatamente o nível de significância (p=0,05) em

filhotes de ratos (TAPANAINEN et al., 1994).

Os efeitos da hipóxia aguda intermitente em fetos ovinos pré e a termo no

sistema IGF foi verificada em estudo no qual a oclusão episódica (90 segundos) do cordão

umbilical era realizada a cada 30 minutos durante 3 a 5 horas por dia durante 4 dias. As

concentrações séricas de IGF-I, IGF-II, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3 e IGFBP-4

permaneceram inalteradas durante todo o período de 4 dias (GREEM et al., 2000). Vale

92

ressaltar que em alguns desses estudos houve também a restrição de nutrientes, uma vez

que houve redução experimental do fluxo sanguíneo uterino ou redução da circulação

umbilical.

A redução das concentrações plasmáticas do IGF-I na hipóxia aguda em

crianças com infecções respiratórias verificada no presente estudo diverge de alguns dados

obtidos em análises realizadas em animais e nas situações de RCIU em humanos. Essas

análises foram obtidas em filhotes de animais submetidos à hipóxia durante a gestação ou

em RNs humanos. As crianças que participaram do presente estudo já não estavam sob a

influência do meio intra-uterino quando foram submetidos à hipóxia, portanto foram

submetidos à restrição aguda de oxigênio diretamente.

O sistema IGF também foi abordado em situações de hipoxemia devido a

cardiopatias congênitas sendo que, dentre essas patologias, aquelas que provocam cianose

estão mais comumente relacionadas a prejuízos importantes do crescimento quando

comparadas às cardiopatias congênitas não cianosantes. Um estudo comparou crianças com

cardiopatias congênitas cianosantes bem nutridas e mal nutridas com controles normais

pareados para idade e sexo abordando as concentrações séricas de IGF-I e sua relação com

a hipoxemia crônica. Observou-se que as concentrações séricas de IGF-I do grupo com

estado nutricional comprometido foram as menores dentre os 3 grupos (p < 0,05).

Entretanto, as crianças cardiopatas consideradas bem nutridas apresentaram concentrações

séricas de IGF-I reduzidas quando comparadas aos controles (p < 0,05) (DÜNDAR;

AKÇORAL; SAYLAM et al., 2000). Salienta-se que nessa análise, não houve influência de

outros fatores, como os estados infecciosos; e, além disso, o efeito hipoxêmico verificado

nessa análise também não foi agudo. Na presente avaliação, além do fato de que processos

infecciosos estiveram envolvidos na etiologia da hipóxia, essa instalou-se de forma aguda e,

93

contudo, esteve também relacionada a reduções significativas das concentrações séricas de

IGF-I em crianças.

Por outro lado, abordando o comportamento do sistema IGF em quadros

infecciosos, as concentrações séricas de GH, IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3 e insulina foram

obtidas em 27 crianças admitidas em unidade de terapia intensiva apresentando choque

séptico por meningococcemia. Em 12 delas, um perfil de secreção de GH de 6 horas

evidenciou que, dentre os não sobreviventes, as medianas foram maiores que dentre aqueles

que sobreviveram. As concentrações séricas de IGF-I total estiveram reduzidas em todas as

crianças participantes do estudo quando comparadas a crianças normais. A média de

escores de desvio-padrão do IGF-I sérico total foi menor entre aqueles que não

sobreviveram, porém os dados obtidos não atingiram significância estatística. Entretanto, as

concentrações séricas de IGF-I livre foram menores naquelas crianças não sobreviventes.

As concentrações séricas de IGFBP-1, no momento da admissão hospitalar, mostraram-se

extremamente elevadas nos indivíduos não sobreviventes, sendo que, nos sobreviventes, as

concentrações séricas dessa proteína reduziram-se significativamente nas 48 horas

seguintes sem correlação com as concentrações séricas de insulina. No momento da

admissão hospitalar, as concentrações séricas de IGFBP-3, tanto em sobreviventes quanto

em não sobreviventes, apresentavam-se reduzidas quanto comparadas com pares saudáveis,

com aumento significativo durante a evolução nos indivíduos sobreviventes (DE GROOF

et al., 2002). A inclusão das crianças nesse estudo baseou-se em achados clínicos

sugestivos de meningococcemia, aliados a culturas positivas para o referido agente

(Neisseria meningitidis). Além disso, os indivíduos deveriam apresentar também

hipotensão ou outros sinais indiretos de hipoperfusão tecidual, tais como, acidose

metabólica inexplicada, hipoxemia arterial (pO2 menor que 75 mmHg ou oximetria de

94

pulso menor que 96%) ou insuficiência renal aguda. Os dados apresentados por De Groof et

al. em 2002 foram semelhantes aos que foram observados no presente estudo quanto à

evolução das concentrações séricas do IGF-I, IGFBP-1, IGFBP-3 e insulina. Apesar do fato

de que um dos principais critérios de inclusão adotados por De Groof et al. em 2002 foi a

infecção grave por Neisseria meningitidis, deve ser ressaltado que para ser considerado

grave o estado clínico do indivíduo incluído, a criança deveria apresentar outras alterações

que per se cursam com graus variados de hipoxemia tecidual.

Em outro estudo, uma coorte de 32 crianças com bronquiolite,

comprovadamente provocada pelo vírus sincicial respiratório, foi avaliada mediante

obtenção das concentrações séricas de cortisol, prolactina, leptina, IGF-I e GH durante o

quadro respiratório agudo e 3 meses após o evento crítico. Dessa coorte, 13 indivíduos

necessitaram de ventilação mecânica e cuidados intensivos; e 19 foram acompanhados sem

esse tipo de assistência, porém, como critério de inclusão no estudo, necessitaram de oferta

suplementar de oxigênio a fim de manter a oximetria de pulso acima de 92%. Nos

indivíduos que utilizaram ventilação mecânica, as concentrações séricas de prolactina e GH

foram maiores quando comparadas com aquelas obtidas em pacientes que foram mantidos

em enfermaria, portanto, sem assistência ventilatória mecânica; o comportamento das

concentrações séricas desses hormônios também foi semelhante quando as suas

concentrações séricas foram comparadas com as concentrações séricas obtidas na situação

de convalescência, ou seja, 3 meses após o evento agudo. Além disso, os pacientes que

necessitaram de ventilação mecânica apresentaram concentrações séricas de IGF-I e leptina

menores que os indivíduos internados que não necessitaram dessa assistência. Dentre esses

hormônios avaliados, somente IGF-I e cortisol apresentaram diferença significativa quando

comparadas as concentrações séricas obtidas na internação sem o auxílio da ventilação

95

mecânica e a convalescência, onde as concentrações séricas do IGF-I foram menores

durante o evento agudo (TASKER et al., 2004). A evolução das concentrações séricas de

IGF-I também foi semelhante aos dados ora observados, porém sem as informações

complementares oriundas de outros componentes do sistema IGF.

Em ambos os estudos supracitados, houve inclusão de indivíduos com algum

grau de hipóxia e, além dos quadros infecciosos bem estabelecidos, diversos participantes

necessitaram de ventilação mecânica. Nessas análises também houve relação entre a

gravidade do quadro clínico e a resposta mais acentuada dos componentes do sistema IGF,

tais como redução das concentrações séricas de IGF-I e aumento das concentrações séricas

de IGFBP-1. Apesar da ausência de crianças que necessitassem de ventilação mecânica ou

que tivessem apresentado choque séptico, esses dados foram semelhantes aos encontrados

no presente estudo, ademais, deve ser ressaltado que há grande dificuldade em controlar os

efeitos no sistema IGF do estado infeccioso, da hipóxia e do tratamento per se, uma vez que

são utilizadas medicações, sedação, oferta suplementar de oxigênio, o que em seu conjunto,

provavelmente, pode representar dificuldade na identificação do real desencadeador da

resposta observada. Além disso, os dados ora apresentados sugerem uma recuperação

precoce das concentrações de IGF-I, visto que a estada hospitalar das crianças foi em média

de apenas 8 dias. Esse intervalo de tempo em que as amostras foram colhidas foi suficiente

para que houvesse aumento significativo em relação às concentrações verificadas no evento

agudo.

Em fetos ovinos submetidos à hipóxia intra-uterina mediante redução do

fluxo sanguíneo do útero, houve queda da saturação e da pressão parcial de oxigênio, além

da redução significativa do pH arterial nas primeiras 8 horas. Sob o efeito dessa hipóxia,

houve aumento de 80% e redução de 50% das concentrações plasmáticas da IGFBP-1 e

96

IGFBP-2, respectivamente, sendo que tais alterações já eram presentes após 4 horas da

ligação das artérias uterinas. Ainda nesse estudo, as fontes produtoras de IGFBPs foram

pesquisadas sendo que o fígado (IGFBP-1 e -2) e os rins (IGFBP-2) foram os tecidos onde

o mRNA de cada uma dessas proteínas foi detectado. Em situação de hipóxia, houve

aumento de 10 vezes no mRNA da IGFBP-1 no fígado e, nos fetos que tiveram maior

aumento nesse mRNA, também houve detecção nos rins. Deve ser ressaltado que esse

estudo foi o primeiro a demonstrar in vivo que os genes responsáveis pela IGFBP-1 e pela

IGFBP-2 poderiam ser induzidos ou suprimidos dentro de 2 a 4 horas do início da condição

patológica instalada (McLELLAN et al., 1992). Da mesma forma, ratas submetidas à

hipóxia (atmosfera com 13-14% de oxigênio) por 7 dias durante a gestação apresentaram

filhotes com RCIU. Os filhotes apresentaram redução do peso em 24%, seus fígados e

placentas foram 20% e 10% mais leves, respectivamente, que os controles. As

concentrações séricas da IGFBP-1 e -2 foram 1,75 vezes maior que os controles enquanto

que a concentração sérica de IGFBP-4 foi 2,5 vezes maior. A expressão do mRNA de

IGFBP-1 e IGFBP-2 nos fígados fetais submetidos à hipóxia foram 4 e 6 vezes maiores que

os controles, respectivamente. O mRNA hepático da IGFBP-4 não apresentou alteração

(TAPANAINEN et al., 1994).

A presença de IGFBP-1 em tecidos de peixe Danio rerio em estágios

precoces do desenvolvimento embrionário permitiu o estudo da expressão dessa proteína

em embriões, haja vista que os estudos realizados em mamíferos foram em fetos de estágios

avançados do desenvolvimento intra-uterino, muito provavelmente devido às dificuldades

inerentes ao acesso de fetos em estágios mais precoces. Porém, nesse estudo realizado em

peixes, os embriões vivem livremente em água sendo, portanto, facilmente acessíveis à

pesquisa. Dessa forma, foram detectados transcritos de IGFBP-1 em todo o

97

desenvolvimento embrionário, inicialmente em pequenas quantidades e, subsequentemente,

em maiores quantidades em tecidos esqueléticos da porção anterior do corpo, tornando-se

indetectável ao término do desenvolvimento embrionário. Nos estágios mais tardios, a

produção concentrou-se no fígado. No período embrionário tardio, a hipóxia (ambiente com

10% da concentração de oxigênio) durante 24 horas provocou aumento na detecção

hepática da transcrição da IGFBP-1. O mesmo procedimento em peixes adultos provocou

aumentos de até 280 vezes o mRNA da IGFBP-1 quando comparados com peixes em

condições normais. Por outro lado, a restrição nutricional foi capaz de promover aumentos

significativos nas concentrações séricas de IGFBP-1 em peixes adultos, sendo que após 2

semanas nessa condição, houve aumento de até 10 vezes no mRNA hepático da IGFBP-1

(MAURES; DUAN, 2002). Embora esses estudos tenham sido realizados em peixes, a

análise estrutural da IGFBP-1 demonstra semelhanças estruturais importantes com a

proteína humana, além de constituir o único modelo vertebrado com essa finalidade.

Apesar das controvérsias apontadas nos estudos em relação ao

comportamento das concentrações das IGFBPs e suas expressões nas situações de hipóxia,

em todos esses estudos houve aumento na quantidade de mRNA da IGFBP-1. Portanto,

comparando-se esses estudos prévios, houve semelhança entre os resultados obtidos das

concentrações séricas de IGFBP-1 e de sua expressão na hipóxia, associada ou não, à

restrição de nutrientes em animais adultos ou fetos, havendo aumento tanto da expressão,

principalmente hepática, quanto das concentrações da IGFBP-1 (McLELLAN et al., 1992;

TAPANAINEN et al., 1994; MAURES; DUAN, 2002). Além disso, em nenhuma dessas

análises, foram incluídos animais com infecções. Os resultados do presente estudo no qual

as concentrações séricas de IGFBP-1 estiveram aumentadas em crianças com hipóxia

associada a doenças respiratórias agudas são semelhantes aos encontrados nos modelos

98

animais supracitados de hipóxia intra-uterina. Entretanto, deve ser ressaltado que, durante

restrição nutricional, habitualmente há queda das concentrações plasmáticas de insulina, o

que promove aumento nas concentrações de IGFBP-1, uma vez que a expressão e secreção

da IGFBP-1 têm como um de seus principais reguladores a insulina. No presente estudo, as

concentrações séricas de insulina permaneceram inalteradas quando as situações de hipóxia

e ausência dela foram comparadas. Esse dado sugere que a regulação realizada pela insulina

na produção de IGFBP-1, na presente análise, foi menos importante que outros efeitos

regulatórios, tais como a própria hipóxia ou o insulto infeccioso. Da mesma forma,

pacientes com choque séptico devido à meningococcemia e indivíduos com bronquiolite

por vírus sincicial respiratório internados em unidade de terapia intensiva, apresentaram

aumento significativo das concentrações de IGFBP-1 correlacionadas com a gravidade do

quadro clínico (DE GROOF et al., 2002; TASKER et al., 2004). Portanto, as

concentrações séricas aumentadas de IGFBP-1 ora observadas, apesar da dificuldade

encontrada em controlar a provável influência do componente infeccioso, são semelhantes

àquelas verificadas em outras situações de hipóxia.

A maioria das respostas de transcrição observadas durante a hipóxia é obtida

mediante ativação do sistema que envolve o HIF-1. Na realidade, esse fator é um

heterodímero composto por 2 subunidades (HIF-1α e HIF-1β) (WANG; SEMENZA, 1995)

onde o HIF-1β é expresso constitutiva e independentemente da disponibilidade de oxigênio

no núcleo de todas as células. Entretanto, o HIF-1α é extremamente lábil e, em condições

de oferta adequada de oxigênio, é hidroxilado em resíduos de prolina permitindo a ligação

com o produto do gene de supressão tumoral de von Hippel-Lindau (pVHL), um

componente de reconhecimento do complexo ubiquitina-ligase, o que torna o HIF-1α alvo

de degradação proteassomal (McLELLAN et al., 1992; WANG; SEMENZA, 1995; OHH et

99

al., 2000). Nas situações onde a disponibilidade de oxigênio é reduzida, ocorre bloqueio

dessa hidroxilação dos resíduos de prolina permitindo o acúmulo de HIF-1α e a formação

do complexo α-β no núcleo celular. Com isso, ocorre a ligação às sequências de DNA

chamadas de HRE, que são necessárias à transcrição gênica específica da situação de

hipóxia (KAJIMURA; AIDA; DUAN, 2006).

Em 1998, foi observado aumento significativo das concentrações circulantes

de IGFBP-1 em sangue de artéria umbilical de crianças nascidas com acidose mista

(componentes respiratório e metabólico presentes simultaneamente) (TAZUKE et al.,

1998). Nesse mesmo estudo, células de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) foram

encubadas em ambiente contendo pO2 de 2% e tiveram, com isso, aumento significativo na

concentração de IGFBP-1 no meio de cultura e no seu mRNA. Os autores, analisando a

estrutura do gene dessa proteína, consideraram haver 3 prováveis HREs no intron 1 e

concluíram que a resposta da IGFBP-1 à hipóxia poderia ocorrer mediante ativação das

HREs. Além disso, a co-transfecção de plasmídio que expressa HIF-1α constitutivamente

proporcionou aumento de até 4 vezes na atividade do gene repórter. A sequência de

nucleotídeos que compõe o promoter desse gene apresenta diversos elementos regulatórios

responsivos ao AMPc (CRE), aos glicocorticóides (GRE-I e II), à insulina (IRS-A e B),

além do fator nuclear de hepatócito (HNF-1) e do elemento TATA (MURRAY; PERDEW,

2008). Os dados obtidos no presente estudo demonstram que o aumento das concentrações

séricas de IGFBP-1 pode fazer parte do repertório de respostas do sistema IGF mediante

estímulo hipoxêmico nos seres humanos, particularmente em crianças, inclusive com

mecanismos moleculares, ao menos, parcialmente descritos. É importante ressaltar que essa

proteína ligante, dentre as suas diversas ações, é capaz de inibir as ações biológicas do IGF-

I, fato que, aliado à redução das suas concentrações séricas, também colaboraria num

100

possível mecanismo de contenção do crescimento durante o evento hipoxêmico agudo,

dado que não foi avaliado na presente análise. Ademais, ao observar o número de

elementos regulatórios, até o momento conhecidos, aliado à falta de informações precisas

sobre a forma como atuam, fica evidente que a regulação do gene codificador da IGFBP-1 é

complexa e composta por diversos elementos que atuam de forma coordenada ou

independente.

As concentrações séricas de IGF-I e IGFBP-3 foram avaliadas em 94

crianças com cardiopatias congênitas, procurando correlacionar esses parâmetros com a

presença ou ausência de cianose e com o estado nutricional, em um estudo prospectivo e

randomizado. Observou-se que dentre os indivíduos com cardiopatia cianosante havia

número significativamente maior de crianças com estado nutricional comprometido.

Ademais, as concentrações séricas de IGF-I foram menores dentre os cardiopatas quando

comparados aos controles (p < 0,001) e menores dentre aqueles com cardiopatias

cianosantes quando comparados aos cardiopatas sem cianose (p < 0,001). Ambos os

grupos, cianótico e não cianótico, apresentaram concentrações séricas de IGF-I menores

que os controles (p < 0,001). Os autores concluíram que a presença de cianose foi o fator

que mais influenciou a redução nas concentrações séricas de IGF-I (DINLEYICI et al.,

2007).

Sob o mesmo aspecto, as concentrações séricas de IGF-I e IGFBP-3 do

sangue de cordão umbilical foram avaliadas em estudo controlado, no qual 18 recém-

nascidos de termo que sofreram asfixia perinatal aguda, foram comparados a controles

normais. As concentrações séricas, tanto do IGF-I quanto da IGFBP-3, foram menores nos

indivíduos que sofreram asfixia e apresentaram correlação positiva com o escore de Apgar

do primeiro e do quinto minutos de vida e com o pH do sangue arterial umbilical, além de

101

correlação negativa com a pCO2 e com o lactato. Esses dados demonstraram que a

exposição à hipóxia e à acidose ao nascimento relacionaram-se a reduções nas

concentrações séricas do IGF-I e da IGFBP-3 (DINLEYICI et al., 2006). Apesar do quadro

infeccioso presente em todos os indivíduos selecionados para o presente estudo, essas duas

análises (DINLEYICI et al., 2006; DINLEYICI et al., 2007) também registraram reduções

nas concentrações séricas de IGF-I e IGFBP-3 semelhantes àquelas aqui observadas,

demonstrando, na ausência de estados infecciosos, influência da hipóxia no sistema IGF.

Entretanto, ao menos em um desses estudos (DINLEYICI et al., 2006), foram avaliados

indivíduos no momento do nascimento, situação a qual, inclusive sob o aspecto da

oxigenação sanguínea, é marcada por várias alterações inerentes ao nascimento que

culminam com o abandono do padrão de circulação fetal. Por outro lado, as concentrações

séricas de IGFBP-3 e IGFBP-4 não apresentaram variações significativas quando avaliadas

em fetos ovinos submetidos à hipóxia devido à restrição do fluxo sanguíneo após ligadura

das artérias uterinas e, em cultura de hepatócitos fetais, a hipóxia promoveu aumento

significativo das concentrações de IGFBP-3, sendo que as concentrações de IGFBP-2 e

IGFBP-4 também aumentaram, porém não significativamente (McLELLAN et al., 1992;

POPOVICI et al., 2001).

Células normais submetidas à hipoxia apresentam redução significativa da

síntese protéica. O mesmo comportamento é observado em células tumorais. Entretanto,

algumas linhagens celulares oriundas de tumor pancreático (AsPC-1) que são resistentes a

baixas concentrações de oxigênio, apesar da redução de até 20% da síntese protéica durante

a hipóxia, apresentaram aumento na síntese de IGFBP-1 e IGFBP-3 (KOGA et al., 2008).

A influência da hipóxia no metabolismo glicêmico, abordando as

concentrações de insulina nessa situação, foi analisada em 8 adultos jovens expostos a

102

atmosferas pobres em oxigênio. Durante a oferta normal e baixa de oxigênio, esses

indivíduos ingeriram 75 g de glicose, sendo avaliados diversos parâmetros a cada 30

minutos até 2 horas após a ingestão. Comparando-se as diferentes situações de oferta de

oxigênio, não houve diferença significativa entre as concentrações séricas de insulina e

peptídeo C, assim como não houve alteração na sensibilidade insulínica, abordada mediante

obtenção do HOMA-IR (KELLY et al. 2009). As concentrações séricas de insulina também

permaneceram inalteradas durante a evolução clínica das crianças que participaram do

presente estudo, dado que foi semelhante ao observado em adultos submetidos à hipóxia,

que simulou a exposição desses indivíduos a altitudes elevadas, o que apontou, em seu

conjunto, para a ausência de efeitos da hipóxia sobre as concentrações séricas de insulina.

Existem diversas relações observadas entre o IGF1R e a RCIU associada à

baixa estatura, porém há poucas análises do comportamento da expressão do IGF1R em

situações de hipóxia, tanto em fetos quanto em crianças ou indivíduos adultos. Porém,

ovelhas submetidas à hipóxia aguda durante a gestação apresentaram aumento na presença

e na expressão do IGF1R nos cones de crescimento neuronais do cérebro e cerebelo nos

seus fetos. É importante ressaltar que a mistura de gases oferecida às ovelhas gestantes

apresentavam concentrações de oxigênio entre 20% e 0%. As reduções da quantidade de

oxigênio foram de 5% a cada 30 minutos, até o momento no qual, os fetos apresentaram

hipóxia grave observada em gasometrias colhidas seriadamente. A concentração de IGF1R

nos cones de crescimento neuronais em condições normais é alta, dessa forma, os autores

propuseram que esse comportamento observado do IGF1R provavelmente seria uma

resposta adaptativa à situação de hipóxia na tentativa de manter o crescimento neuronal em

padrões normais, através da facilitação da ligação entre receptor e IGF-1 (MORGAN;

CHAO, 2004). Em tumores, incluindo melanomas, câncer de cólon, pâncreas, próstata e

103

rins, observou-se expressão elevada do IGF1R (BOHULA; PLAYFORD; MACAULAY,

2003). Além disso, a ativação desse receptor foi capaz de proteger as células tumorais de

diversos agentes favorecedores da apoptose nos tumores sólidos presentes no meio

extracelular, tais como, estresse osmolar, deprivação de nutrientes e hipóxia no micro-

ambiente tumoral (PERETZ et al., 2002). Parte dessas observações foi realizada em tecidos

tumorais e, apesar disso, elas apontam para a existência de uma relação entre os IGFs, o

IGF1R e as adaptações ocorridas nas situações de hipóxia. Nesse mesmo sentido, IGFs e

insulina foram capazes de aumentar a resposta à hipóxia mediante a ativação das vias AKT

e MAPK de sinalização, o que promoveu a estabilização dos fatores HIF-α e β e a

consequente ligação às sequências HRE, necessária à transcrição de diversos genes nas

situações de hipóxia (TREINS et al., 2005). Os dados do presente estudo também

evidenciaram o aumento da expressão do gene IGF1R em linfócitos de sangue periférico de

crianças em hipóxia aguda associada a quadros infecciosos respiratórios.

A expressão do IGF1R já foi demonstrada em todas as subpopulações de

células mononucleares de sangue periférico, em estudos que utilizaram a citometria de

fluxo e anticorpos monoclonais contra o IGF1R (KOOIJMAN et al., 1992). Não houve

diferença nessa expressão quando diferentes indivíduos foram comparados entre si, no

entanto, houve grandes diferenças entre os vários tipos celulares de um mesmo indivíduo.

Em geral, a expressão do IGF1R é baixa nas células sanguíneas, quando são comparadas

com outros tecidos do organismo. Os monócitos e os linfócitos CD4+ apresentaram

expressão do IGF1R significativamente maior que linfócitos CD8+ e linfócitos B, sendo

que esses últimos compuseram a subpopulação que menos expressa o IGF1R (KOOIJMAN

et al., 1992). Outras análises também verificaram que o IGF-I foi capaz de modular a ação

de células T in vitro (TAPSON et al., 1988; JOHNSON, JONES, KOZAK, 1992).

104

As células NK (natural killer) são linfócitos envolvidos na vigilância

direcionada a infecções virais e doenças neoplásicas. A atividade citotóxica desse tipo

celular foi estimulada, in vitro, quando no meio de cultura foi adicionado IGF-I o que

demonstrou que os IGF1R são funcionais em células NK (KOOIJMAN et al., 1992).

Posteriormente, a cinética da expressão do IGF1R foi avaliada, mediante técnicas de

citometria de fluxo e RT-PCR, em linfócitos T ativados por um desafio imunológico no

período entre 0 e 48 horas após essa ativação. Nos linfócitos T estimulados, observou-se

um movimento de internalização dos IGF1Rs que se encontravam na membrana celular

alcançando o mínimo de receptores entre 1 e 6 horas após o início da ativação imunológica

associada à concomitante redução do mRNA do IGF1R nesse período. Seguiu-se a esse

fenômeno, um aumento do número de IGF1R na superfície celular acompanhado pelo

aumento no mRNA no citoplasma que ao final da avaliação (48 horas) atingiu patamares

superiores aos encontrados no momento da ativação, fato que levou os autores a concluir

que houve uma síntese de novo do IGF1R após a ativação dos linfócitos T (SEGRETIN et

al., 2003). O uso da fitohemaglutinina no estímulo de linfócitos T humanos in vitro,

demonstrou que a síntese de novo do IGF1R foi observada em linfócitos T CD4+ e CD8+

ativados, e que as células não ativadas não apresentaram esse processamento do IGF1R

(STENTZ; KITABCHI, 2004). Portanto, os linfócitos na condição de células pertencentes

ao sistema imunológico, têm suas funções habitualmente estimuladas quando são expostos

a desafios infecciosos. As crianças que compuseram a amostra ora avaliada apresentaram

diagnósticos clínicos que, na sua totalidade, apresentavam agressões ao organismo de

etiologia infecciosa. Apesar do fato de não ter sido avaliada a resposta imunológica das

crianças participantes, seus linfócitos provavelmente foram estimulados, haja vista os

quadros infecciosos que cursaram com a hipóxia. O aumento na expressão do gene

105

codificador do IGF1R verificado nesses pacientes pode fazer parte da ativação dessas

células, conforme estudos supracitados. Portanto, os resultados do presente estudo apontam

no mesmo sentido, porém a técnica utilizada para avaliar a expressão do IGF1R foi

diferente, além de que a observação foi realizada em crianças in vivo.

A resposta tecidual à hipóxia aguda, no presente estudo, foi analisada

somente em células sanguíneas. Nessas condições, não há dado prévio na literatura que

permita comparação, porém esses resultados, por outro lado, também podem sugerir um

provável mecanismo de compensação mediante a redução das concentrações séricas de

IGF-I e IGFBP-3, e o aumento concomitante das concentrações séricas de IGFBP-1,

sugerindo um fenômeno de up regulation, como descrito em estudo recente (MILANI,

2009).

O conjunto de alterações que foram observadas na presente análise apontou

para uma provável redução das ações biológicas do IGF-I durante o evento hipoxêmico

agudo associado à infecção respiratória, haja vista a redução da concentração sérica desse

fator associada à redução da concentração sérica de IGFBP-3 e ao aumento na concentração

sérica de IGFBP-1. Considerando-se também os resultados obtidos em outros estudos

encontrados na literatura, surge a necessidade de se refletir sobre a real natureza desse

comportamento do sistema IGF. Sob esse aspecto, tais alterações poderiam fazer parte de

um repertório maior de respostas adaptativas, que visam à proteção do indivíduo durante

um episódio de estresse orgânico, e, portanto, provavelmente sem necessidade de

intervenção. Por outro lado, esse ambiente proporcionado por essas oscilações dos

componentes do sistema IGF, durante um evento agudo, poderia ser uma resposta ao estado

hipoxêmico associada a resultados realmente danosos ao crescimento e desenvolvimento.

Nessa eventualidade, pode-se especular a validade da utilização do IGF-I como terapêutica

106

para essas situações na tentativa de minimizar os efeitos dessa resposta do sistema IGF

sobre o desenvolvimento infantil. Entretanto, é importante salientar que estudos anteriores,

nos quais foi utilizado GH em pacientes criticamente enfermos, mostraram resultados que

contra-indicam o seu uso, podendo ser considerado somente em algumas subclasses desses

indivíduos (TAKALA et al., 1999; CARROLL et al., 2004; SCHUETZ et al., 2009).

Concluindo, o presente estudo demonstrou a redução das concentrações

séricas de IGF-I e IGFBP-3, o aumento das concentrações séricas de IGFBP-1 associadas a

concentrações séricas de insulina inalteradas e o aumento da expressão do IGF1R, em

crianças em situação de hipóxia aguda. Os dados apresentados, analisados em conjunto,

sugerem que a hipóxia aguda, provavelmente, associada a fatores infecciosos, foi capaz de

estimular um padrão de alterações que estaria relacionado à redução do estímulo anabólico

provocado pelo IGF-I. Ademais, o aumento na expressão do IGF1R sugere um mecanismo

de proteção tecidual, compensando a redução das concentrações séricas do IGF-I e o

aumento das concentrações séricas da IGFBP-1, não associado a alterações nas

concentrações séricas de insulina. Porém, para que os diversos mecanismos envolvidos

sejam conhecidos, inclusive com melhor controle dos diferentes fatores envolvidos na

resposta do sistema IGF, são necessárias análises mais profundas do comportamento desse

sistema perante estímulos hipoxêmicos isolados em seres humanos.

107

VI - Conclusões

108

VI – Conclusões

1) Crianças com hipóxia aguda associada a infecções respiratórias

apresentaram durante o evento agudo redução das concentrações séricas de IGF-I e IGFBP-

3, aumento das concentrações séricas de IGFBP-1 e da expressão do gene do IGF1R em

linfócitos periféricos;

2) Não houve diferença nas concentrações séricas de insulina entre as

situações de hipóxia aguda associada a infecções respiratórias em crianças, e após sua

recuperação;

3) Não foi possível, nesse modelo experimental, controlar o provável efeito

dos estados infecciosos presentes nos indivíduos participantes;

4) Os dados apresentados, analisados em conjunto, sugerem que a hipóxia

aguda, provavelmente, associada a fatores infecciosos, foi capaz de estimular um padrão de

alterações do sistema IGF, que estaria relacionado à redução do estímulo anabólico

provocado pelo IGF-I e essa redução associada ao aumento na expressão do gene

codificador do IGF1R sugere um mecanismo compensatório de ativação tecidual em

resposta a necessidade do organismo.

109

VII – Referências bibliográficas

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126

VIII – Apêndices e anexos

127

Apêndice A - Protocolos utilizados no Laboratório de Oncologia Pediátrica do

HCFMRPUSP

1 – Preparação do tampão PBS (Phosphate-buffered saline)

Dissolver 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 em 800 ml de água

destilada.

Ajustar o pH para 7,4 com HCl.

Acrescentar água quantidade suficiente para 1 litro.

Aliquotar a solução e esterilizar em autoclave por 20 minutos.

Armazenar em geladeira.

2 – Tratamento da água com DEPC

Acrescentar DEPC (diethyl pyrocarbonate) ao volume de água desejado em

concentração final de 0,1%.

Deixar a solução overnight e, no dia seguinte, esterilizar em autoclave por 20

minutos.

3 – Preparação da solução tampão TBE (10 X)

128

Dissolver 108g de Tris;

55 g de ácido bórico;

40 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0.

Acrescentar água suficiente para 1 litro.

4 – Preparação do gel de agarose a 1% para RNA

Lavar a cuba e pentes a serem utilizados com solução contendo removedores

de RNase.

Enxaguar com água destilada.

Acrescentar 1 g de agarose a 100 ml de solução tampão (TBE) preparada

com água tratada com DEPC e aquecer até a dissolução completa da agarose.

Acrescentar 3 µl de brometo de etídio em concentração de 10 mg/ml.

Verter gentilmente o gel para polimerização.

5 – Preparação do gel de agarose a 2%

Acrescentar 2 g de agarose a 100 ml de solução tampão (TBE) e aquecer até

a dissolução completa da agarose.

Acrescentar 3 µl de brometo de etídio em concentração de 10 mg/ml.

Verter gentilmente o gel para polimerização.

129

Anexo A - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do HCFMRP-USP

130

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