rutinné biochemické vyšetrenia - stuba.skfunkciu (prenáša vyššie karboxylové kyseliny,...

9 Rutinné biochemické vyšetrenia 184

9 RUTINNÉ BIOCHEMICKÉ VYŠETRENIA V nasledujúcom texte sú v abecednom poradí zoradené analyty – organické zložky, ktoré sa najčastejšie v klinickej chémii stanovujú. Anorganické zložky a základné vyšetrenie moču sú uvedené až na konci tejto časti. Pre každý analyt je na úvod stručne uvedený jeho klinický význam. Analytické metódy boli vybrané tak, aby ukázali niektoré bežne používané princípy a postupy analýzy. 9.1 Albumín Albumín v organizme reguluje plazmový objem (reguluje koloidne-osmotický tlak plazmy), plní transportnú funkciu (prenáša vyššie karboxylové kyseliny, lipidy, aminokyseliny, hormóny, ale aj liečivá a toxické látky) a tiež funkciu rezervoára bielkovín (aminokyselín). Stanovenie v sére/plazme

Albumín sa v slabo kyslom prostredí vyskytuje vo forme katiónu, ktorý môže viazať aniónové farbivo obsahujúce skupinu –SO3H za vzniku komplexu. Na stanovenie albumínu sa používajú také farbivá, ktoré s ním tvoria komplexy ľahšie ako s inými bielkovinami prítomnými v sére alebo plazme. Vlnová dĺžka absorpčného maxima vzniknutého komplexu albumín - farbivo je väčšia ako vlnová dĺžka absorpčného maxima samotného farbiva a je pritom mimo oblasti, kde absorbuje bilirubín a hemoglobín. Na kalibráciu sa musí použiť ľudský albumín, pretože afinita farbív k albumínu zvierat je odlišná.

S brómkrezolovým purpurom, 5,5′-dibróm-o-krezolsulfonftaleín, BCP (žltý) tvorí albumín pri pH 5,2 v prítomnosti povrchovo aktívnej látky Brij 35 zelený komplex, ktorého sfarbenie sa meria pri vlnovej dĺžke 600 nm. BCP nie je vhodný na stanovenie albumínu v plazme (fibrinogén zvyšuje výsledky stanovenia). Pri stanovení interferuje zvýšený bilirubín a hemoglobín.

Albumín + BCP → albumín-BCP.

S brómkrezolovou zelenou, 3,3’,5,5’-tetrabróm-m-krezolsulfonftaleín, BCG (žlto-zelený) tvorí albumín pri pH 4,2 komplex (zeleno-modrý), ktorého sfarbenie sa meria pri vlnovej dĺžke 628 nm. Zhodnosť tejto metódy je horšia ako pri použití BCP.

Albumín + BCG → albumín-BCG.

© J. Sádecká, e-Analytické metódy v klinickej chémii, Ústav analytickej chémie STU, 2008


Stanovenie v moči

Stanovenie stopových koncentrácií albumínu v moči sa vykonáva imunoturbidimetriou alebo imunonefelometriou. So špecifickou protilátkou (Ab) proti ľudskému albumínu vzniká precipitát imunokomplexu (Ab-albumín) a meria sa napr. turbidancia inkubačnej zmesi pri 340 nm. 9.2 Alkalické fosfatázy (ALP) ALP sú skupina enzýmov, ktoré súvisia s činnosťou pečene, rastom kostí a placenty. Nárast aktivity ALP sa pozoruje pri poruchách pečene, kostných nádoroch, nádoroch v pečeni. Zníženie ALP indikuje skorbut, chorobu z ožiarenia, ťažkú anémiu a pod.

ALP katalyzujú hydrolýzu takmer všetkých typov monoesterov kyseliny trihydrogénfosforečnej v alkalickom prostredí (optimálne pH je 8-10) na fosfát a zodpovedajúci alkohol, fenol a pod.

R-O-PO(OH)2 + H O R-OH + H⎯⎯→⎯ALP PO . 2 3 4

Reakcia je založená na prenose fosfátovej skupiny z donoru na akceptor; akceptor musí obsahovať v molekule –OH skupinu. V uvedenej reakcii je akceptorom fosfátovej skupiny voda. Reakcia prenosu fosfátovej skupiny (transfosforylácie) prebieha vo vode pomerne pomaly, preto sa ako transfosforylačné tlmivé roztoky používajú aminoalkoholy, napr. N-metyl-D-glukamín (MEG), 2-amino-2-metyl-1-propanol.

Stanovenie katalytickej koncentrácie ALP v sére s 4-nitrofenylfosfátom v transfosforylačných roztokoch (MEG alebo 2-amino-2-metyl-1-propanol)

Reakciu hydrolýzy 4-nitrofenylfosfátu a prenos jeho fosfátovej skupiny na transfosforylačný roztok (R -OH, pH 10,1-10,2) katalyzuje enzým ALP: 1

O2N-C6H4-O-PO(OH)2 + R -OH O⎯⎯→⎯ALP N-C H -OH + R -O-PO(OH) . 1 2 6 4 1 2

Mierou aktivity enzýmu (katalytickej koncentrácie) je množstvo vznikajúceho žltého 4-nitrofenolátu. Jeho absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 401-420 nm. Stanovenie sa vykonáva fotometricky kinetickou metódou alebo metódou konštantného času po zastavení enzýmovej reakcie inhibítorom ALP (roztok EDTA/NaOH blokuje aktívne centrá enzýmu). Postup: Reakciu možno štartovať sérom aj substrátom. Pri štartovaní sérom a kinetickom meraní sa postupuje takto: k inkubačnému roztoku vytemperovanému na 37 oC sa pridá 20 μl séra a po lag-fáze 30 s sa meria absorbancia 4-nitrofenolátu pri vlnovej dĺžke 405 nm po dobu 180 s. Inkubačný roztok obsahuje: MEG 350 mmol/l, pH 10,1 NaCl 70 mmol/l (aktivátor ALP), MgCl 2+

2 0,5 mmol/l (ióny Mg aktivujú enzým a chránia ho pred tepelnou denaturáciou) a 4-nitrofenylfosfát 15 mmol/l.



Celkovú aktivitu ALP tvoria aktivity jednotlivých izoenzýmov pochádzajúcich z rôznych orgánov a tkanív (izoenzým pečeňový, kostný, obličkový, placentárny, črevný). Indikáciou na zistenie aktivity izoenzýmov môže byť napr. nejasné zvýšenie celkovej aktivity ALP (zisťuje sa pôvod zvýšenia). Kostný izoALP je rýchlejšie a vo väčšom rozsahu inaktivovaný zohriatím na teplotu 56 oC než pečeňový. Na inhibíciu črevného a placentárneho izoALP sa používa L-fenyl-alanín. Diagnosticky významná hodnota Q sa vypočíta ako pomer aktivity ALP po tepelnej inaktivácii s L-fenylalanínom (ALPZF) k aktivite ALP pred tepelnou inaktiváciou inhibítorom L-fenylalanínom (ALP ). Zohriatím séra na 56 oF C sa prakticky úplne inaktivuje kostná frakcia izoALP, pričom pečeňový izoALP je inaktivovaný minimálne. Na vylúčenie vplyvu črevného izoALP sa používa jeho inhibícia L-fenylalanínom v zohriatom aj nezohriatom sére. 9.3 Aminotransferázy (transaminázy)

Aminotransferázy sú skupina vnútrobunkových enzýmov, ktoré sa v organizme zúčastňujú na metabolizme dusíka (aminokyselín). Pri poškodení pečene, srdcových ochoreniach a ochorení kostného svalstva sa pozorujú zvýšené hodnoty týchto enzýmov v krvi. Veľký význam má mitochondriálna aspartátaminotransferáza, ktorej zvýšenie poukazuje na ťažké poškodenie hepatocytov. Aminotransferázy sú enzýmy, ktoré katalyzujú vnútornú premenu aminokyselín a 2–oxokyselín prenosom aminoskupiny. Ide o dva enzýmy: aspartátaminotransferáza (AST) a alanínamino-transferáza (ALT). Ako koenzým pri prenose aminoskupiny pôsobí pyridoxal-5′-fosfát (P5P). P5P sa naviaže na apoenzým (AST, ALT), prijme aminoskupinu z aspartátu alebo alanínu (vytvorí sa väzba enzýmpyridoxamín-5′-fosfát) a prenesie ju na 2-oxoglutarát za vzniku L-glutamátu. Dvojica 2-oxoglutarát/L-glutamát sa uplatňuje ako akceptor aminoskupiny a produkt vo všetkých reakciách prenosu aminoskupiny.

AST, Aspartát: 2-oxoglutarátaminotransferáza

Tento enzým katalyzuje reakciu L-aspartátu a 2-oxoglutarátu za vzniku oxalacetátu a L-gluta-mátu. AST prenosom aminoskupiny na oxokyselinu vytvára predpoklady pre vstup oxokyseliny do Krebsovho cyklu a metabolizáciu aminokyseliny na močovinu. Stanovenie katalytickej koncentrácie AST s NADH podľa IFCC

Princípom stanovenia je konverzia L-aspartátu a 2-oxoglutarátu účinkom enzýmu AST na oxalacetát a L-glutamát: - - - -OOC-(CHNH2)-CH2-COO + OOC-CO-CH2-CH2-COO ⎯⎯⎯ →⎯ P5P AST,

⎯⎯⎯ →⎯ P5P AST, - -OOC-(CHNH2)-CH2-CH2-COO + -OOC-CO-CH -COO-. 2

L-aspartát + 2-oxoglutarát L-glutamát + oxalacetát. ⎯⎯⎯ →⎯ P5P AST,



Oxalacetát sa potom redukuje pôsobením NADH na L-malát za katalytického účinku enzýmu malátdehydrogenáza (MD). Meria sa pokles absorbancie NADH pri vlnovej dĺžke 339 nm (NAD+ pri tejto vlnovej dĺžke žiarenia neabsorbuje).

- -OOC-CO-CH2-COO + NADH + H+ - -⎯⎯→⎯MD OOC-CH(OH)-CH2-COO + NAD+.

+Oxalacetát + NADH + H L-malát + NAD+⎯⎯→⎯MD .

Postup:

Reakčná zmes má zloženie: TRIS 80 mmol/l, pH 7,65, L-aspartát 240 mmol/l, NADH 0,18 mmol/l, P5P 0,1 mmol/l, MD 10 μkat/l, LD 15 μkat/l. Zmes sa vytemperuje na 37 oC. K 2 ml reakčnej zmesi sa pridá 0,2 ml séra a 300 s sa predinkubuje pri 37 oC.

(Pri tejto predinkubácii dochádza k odstráneniu endogénneho pyruvátu prítomného v sére jeho redukciou na L-laktát. Táto reakcia je katalyzovaná laktátdehydrogenázou (LD):

⎯→⎯LDEndogénny - + -OOC-CO-CH3 + NADH + H OOC-CH(OH)-CH3 + NAD+.

L-laktát + NAD⎯→⎯LDEndogénny pyruvát + NADH + H+ +.

V tejto fáze AST nereaguje, pretože do reakcie chýba jeden reaktant a to 2-oxoglutarát.

Sérum okrem pyruvátu obsahuje aj endogénnu LD. Ak by sa pyruvát v predinkubačnej dobe neodstránil, NADH by po naštartovaní reakcie 2-oxoglutarátom reagoval nielen s oxalacetátom, ale aj s týmto endogénnym pyruvátom, čím by sa falošne zvyšovali výsledky stanovenia AST).

Potom sa pridá 0,2 ml 2-oxoglutarátu 144 mmol/l, zmes sa dôkladne premieša a po lag-fáze 90 s sa meria absorbancia po dobu 180 s (namerať treba najmenej 6 hodnôt). Katalytická aktivita AST je úmerná poklesu absorbancie pri 339 nm. Enzýmy MD a LD musia byť v reakčnej zmesi v dostatočnom nadbytku, aby celé enzýmové stanovenie záviselo len od katalytickej aktivity AST.

ALT, L-alanín: 2-oxoglutarátaminotransferáza

Enzým katalyzuje reakciu L-alanínu a 2-oxoglutarátu za vzniku pyruvátu a L-glutamátu. Stanovenie katalytickej koncentrácie ALT s NADH podľa IFCC

Princípom stanovenia je konverzia L-alanínu a 2-oxoglutarátu účinkom enzýmu ALT na pyruvát a L-glutamát:

- -OOC-(CHNH2)-CH3 + OOC-CO-CH2-CH2-COO- ⎯⎯⎯ →⎯ P5P ALT,

⎯⎯⎯ →⎯ P5P ALT, - -OOC-(CHNH2)-CH2-CH2-COO + -OOC-CO-CH . 3

⎯⎯⎯ →⎯ P5P ALT,L-alanín + 2-oxoglutarát L-glutamát + pyruvát.



Pyruvát sa potom redukuje s NADH na L-laktát za katalytického účinku enzýmu laktát-dehydrogenáza (LD). Meria sa pokles absorbancie NADH pri vlnovej dĺžke 339 nm.

-OOC-CO-CH3 + NADH + H+ -⎯→⎯LD OOC-CH(OH)-CH + NAD+. 3

+Pyruvát + NADH + H L-laktát + NAD+⎯→⎯LD .

Postup:

Postup stanovenia je podobný ako u AST, len s tým rozdielom, že v reakčnej zmesi sa použije len jeden enzým, a to LD v dostatočnom nadbytku. V predinkubačnej fáze sa podobne ako pri stanovení AST najskôr odstráni endogénny pyruvát:

⎯→⎯LDEndogénny - + -OOC-CO-CH3 + NADH + H OOC-CH(OH)-CH3 + NAD+.

Potom sa naštartuje vlastné stanovenie ALT pridaním 2-oxoglutarátu a prebehnú už uvedené reakcie:

⎯⎯⎯ →⎯ P5P ALT,-OOC-(CHNH2)-CH3 + -OOC-CO-CH2-CH2-COO-

⎯⎯⎯ →⎯ P5P ALT, -OOC-(CHNH2)-CH2-CH2-COO- + -OOC-CO-CH3.

⎯→⎯LD -- +OOC-CO-CH3 + NADH + H OOC-CH(OH)-CH3 + NAD+. 9.4 α-amyláza α-amyláza je enzým tvorený pankreasom a slinnými žľazami, časť vzniká aj v pečeni. Enzým katalyzuje štiepenie polysacharidov za vzniku dextrínov až maltózy. V sére a moči možno stanoviť dva izoenzýmy, slinný a pankreatický, ktoré svojimi aktivitami odrážajú stav tkaniva, z ktorého pochádzajú. Zvýšená aktivita pankreatického izoenzýmu sa pozoruje pri akútnej pankreatitíde a zvýšená aktivita slinného izoenzýmu pri ochoreniach slinných žliaz. Fotometrické stanovenie α-amylázy

Enzým α-amyláza katalyzuje hydrolýzu definovaného oligosacharidu označeného 4-nitro-fenolom za vzniku nižších oligosacharidov s naviazaným 4-nitrofenolom. Ak je do reakcie zaradený aj enzým α-glukozidáza, štiepením vznikajú voľné oligosacharidy, glukóza a 4-nitro-fenol. Stanovenie je založené na meraní absorbancie uvoľneného 4-nitrofenolu pri vlnovej dĺžke 405 nm.

Vyšší oligosacharid-4-nitrofenol ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ →⎯ aglukozidáz- amyláza,- αα

⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ aglukozidáz- amyláza,- αα → nižšie oligosacharidy + glukóza + 4-nitrofenol.



Stanovenie izoenzýmov α-amylázy

Na stanovenie izoenzýmov α-amylázy sa používajú separačné alebo inhibičné metódy. Zo separačných metód je najrozšírenejšia elektroforéza v agarózovom géli, kde sa α-amyláza rozdelí na pankreatický (1-2 frakcie) a slinný (1-2 frakcie) izoenzým. Ďalšie separačné metódy sú: izoelektrická fokusácia, gélová filtrácia a ionexová chromatografia. V inhibičných metódach sa využíva inhibícia slinnej izo-α-amylázy účinkom špecifického inhibítora (glykoproteín z obilných zŕn). Aktivita α-amylázy je potom úmerná aktivite pankreatického izoenzýmu.

9.5 Bielkoviny Bielkoviny plnia v organizme rôzne funkcie. Sú zdrojom pre výstavbu a obnovu buniek a tkanív, tvoria súčasť enzýmov a niektorých hormónov. Podieľajú sa na imunitných reakciách, zrážaní krvi, transportných procesoch, sú zdrojom výživy a energie, podieľajú sa na udržiavaní acidobázickej rovnováhy a koloidne-osmotického tlaku. Celkové bielkoviny Referenčná metóda (Kjeldahlova metóda)

Je založená na stanovení celkového dusíka v bielkovinách. Najskôr sa v určitom podiele vzorky séra stanoví celkový dusík. Potom sa v rovnakom podiele z tej istej vzorky vyzrážajú bielkoviny kyselinou trichlóroctovou a po ich oddelení odstredením sa v supernatante stanoví nebielko-vinový dusík. Dusík v bielkovinách sa potom vypočíta ako rozdiel:

Dusík v bielkovinách = celkový dusík − nebielkovinový dusík.

Metóda sa používa na stanovenie celkových bielkovín v sérach určených na kontrolu presnosti analytických metód a na stanovenie bielkovín vo vzorkách, ktoré sa používajú na prípravu štandardných roztokov. Metóda je časovo veľmi náročná, a preto sa v rutinnej praxi nepoužíva. Odporúčaná metóda s biuretovým činidlom

Princípom stanovenia je reakcia bielkovín a peptidov (zložiek obsahujúcich minimálne dve peptidové väzby -CO-NH-) s biuretovým činidlom. Biuretové činidlo je alkalický roztok iónov Cu2+, vínanu sodno-draselného a KI. Zložky s dvoma a viacerými peptidovými väzbami poskytujú s biuretovým činidlom červenofialový komplex, ktorého absorpčné maximum je pri vlnovej dĺžke 545 nm.

minimálne 2 -CO-NH- + biuretové činidlo → červenofialový komplex.

Na kalibráciu sa používa ľudský sérový albumín alebo sérum, v ktorom bola stanovená koncen-trácia bielkovín Kjeldahlovou metódou.



2+Pri stanovení bielkovín v lipemickom sére (sérum zakalené tukmi) vytvárajú tuky s Cu iónmi z biuretového činidla zrazeniu Cu2+-mydiel. Vznikajúci zákal interferuje pri fotometrickom stanovení bielkovín, preto sa tuky najskôr oddelia extrakciou do acetónu. Pridaný acetón súčasne vyzráža bielkoviny. Zrazenina bielkovín sa oddelí od supernatantu odstredením. Supernatant sa odstráni a vyzrážané bielkoviny sa rozpustia priamo v roztoku biuretového činidla. Metódy na separáciu, identifikáciu a stanovenie jednotlivých bielkovín Metódy na separáciu bielkovín

Na rutinné účely je vhodná separácia bielkovín elektroforézou na acetylcelulózových fóliách alebo elektroforézou na agarovom alebo agarózovom géli (časť 7.4). Rozdelené frakcie bielkovín sa porovnajú s elektroforeogramom séra zdravého človeka, analyzovaného na tej istej vrstve. V prípade patologického nálezu sa vykoná cielené stanovenie jednotlivých bielkovín imuno-chemickými metódami. Na obr. 7-26 je uvedený elektroforeogram a denzitometrický záznam sérových bielkovín. Na zázname sú vyznačené najvýznamnejšie frakcie sérových bielkovín. Na obr. 7-34 sú uvedené najvýznamnejšie bielkoviny, ktoré tieto jednotlivé frakcie tvoria. Klinický význam: pokles frakcie albumínu svedčí o chronickom ochorení obličiek. Zvýšená frakcia α- alebo γ-globulínov sa pozoruje pri zápalových ochoreniach. Zvýšené β-globulíny sa pozorujú pri chronickom ochorení obličiek a u diabetikov. Znížené alebo chýbajúce γ-globulíny poukazujú na náchylnosť k infekciám. Metódy na identifikáciu bielkovín

Na identifikáciu bielkovín sa najčastejšie používajú imunofixácie a imunoelektroforéza (časť 7.6). Metódy majú vysokú rozlišovaciu schopnosť a citlivosť. Sú významné hlavne pri identifi-kácii monoklonálnych imunoglobulínov (paraproteínov) a Bence-Jonesovej bielkoviny. Imuno-fixačné metódy sú v porovnaní s imunoelektroforézou citlivejšie, časovo menej náročné, jedno-duchšie sa interpretujú a sú vhodné aj na identifikáciu monoklonálnych proteínov. Paraproteíny sa označujú tiež ako M-gradient. Na elektroforeograme bielkovín tvoria v oblasti β- až γ-globulínov úzky vrchol, označovaný ako M-gradient. Paraproteíny a Bence-Jonesova bielkovina sú imunoglobulíny, ktoré majú odlišne usporiadanú štruktúru. Paraproteíny sú obvykle zložené z kompletných molekúl. Podľa toho, ktorá časť molekuly imunoglobulínu má zmenené poradie aminokyselín v reťazci, môžu sa vyskytovať paraproteíny s ľahkými reťazcami lambda a paraproteíny s ľahkými reťazcami kappa (napr. IgG-λ, IgG-κ, IgA-λ a IgA-κ).

Patraproteíny môžu byť tvorené aj nekompletnými molekulami monoklonálnych imunoglobulínov: príkladom je Bence-Jonesova bielkovina, tvorená len ľahkými reťazcami lambda a kappa. Vyskytuje sa v krvi aj moči pri ťažkých ochoreniach spôsobených poruchou syntézy imunoglobulínov. V krvi sú teda prítomné neúplné molekuly imunoglobulínu a pretože majú malú molovú hmotnosť, prechádzajú do moču. V sére zdravých jedincov sa para-proteíny nevyskytujú. Vyskytujú sa pri mnohopočetnom myelome a Waldenströmovej makroglobulinemii (malígny rast atypických lymfocytov produkujúcich jeden typ monoklonálneho IgM). Môžu sa vyskytovať aj paraproteíny s nekompletnou molekulou tvorenou len ťažkými reťazcami (tzv. Franklinova choroba).



Špecifické metódy na stanovenie koncentrácie jednotlivých bielkovín

Bielkoviny možno stanoviť kvantitatívnymi imunometódami uvedenými v časti 7.6. Z nich sa najčastejšie využíva radiálna imunodifúzia podľa Manciniovej a elektroimunodifúzia podľa Laurella. Okrem toho sa používajú aj imunoturbidimetrické a imunonefelometrické metódy. Uvedené techniky umožňujú stanovenie prakticky všetkých bielkovín za predpokladu, že je k dispozícii príslušné monovalentné antisérum potrebnej kvality a že koncentrácia stanovovanej bielkoviny je vyššia ako 10 mg/l. Na stanovenie bielkovín s koncentráciou nižšou ako 10 mg/l sú uvedené techniky už málo citlivé, a preto sa na ich stanovenie používajú imunometódy s označeným reaktantom (ELISA, FIA a RIA). Tieto metódy sú vhodné na stanovenie IgE, IgD, α -fetoproteínu, β -mikroglobulínu a iných. 1 2

Reaktanty (bielkoviny) akútnej fázy

Sú to bielkoviny, ktorých koncentrácia rýchlo a výrazne stúpa pri akútnych zápalových ochoreniach (C-reaktívny proteín, α -antitrypsín, α1 1-kyslý glykoproteín, haptoglobín, cerulo-plazmín, fibrinogén), pri infarkte myokardu (C-reaktívny proteín, haptoglobín) a pri nádorových ochoreniach (α -antitrypsín, α1 1-kyslý glykoproteín, haptoglobín, ceruloplazmín). Výnimkou je transferín, ktorého hodnota naopak pri dlhotrvajúcich a ťažkých ochoreniach klesá. Na stanovenie tohto typu bielkovín sa používa predovšetkým imunoturbidimetria. 9.6 Bilirubín a estery bilirubínu Bilirubín nie je jednotná látka, v skutočnosti je to celá skupina tetrapyrolov. Kvantitatívne prevažuje v krvi bilirubín IXa. Zvýšené hodnoty sa zistia pri poškodení hepatocytov vírusmi, toxínmi, pri nadprodukcii bilirubínu (anémia) a pri dedičných poruchách. Bilirubíny možno podľa ich vlastností a výskytu v plazme (podľa IFCC) rozdeliť na:

o Bilirubín (označoval sa ako nekonjugovaný, neesterifikovaný, nepriamo reagujúci biliru-bín, nepriamy bilirubín) reaguje s diazóniovými soľami len v prítomnosti akcelerátorov ako sú kofeín a alkohol. Je naviazaný na albumín nekovalentnými väzbami a nerozpustný vo vode. Akcelerátory uvoľnia bilirubín z väzby bilirubín-fosfolipid-albumín a rozpustia ho.

o Estery bilirubínu (označovali sa ako konjugovaný, tzv. priamo reagujúci bilirubín s diazóniovými soľami, priamy bilirubín) reagujú s diazóniovými soľami okamžite, bez akcelerátora. Estery bilirubínu sú mono- a diglukuronidy bilirubínu a estery bilirubínu viazané na fosfolipidy a albumín.



Stanovenie kopulačnou reakciou s diazóniovou soľou

V súčasnosti je medzinárodne odporúčaná IFCC metóda na stanovenie celkového bilirubínu vychádzajúca v podstate z pôvodnej metódy Jendrassika a Grofa opísanej v r. 1938. Stanovenie je založené na kopulačnej reakcii bilirubínu s diazotovanou kyselinou sulfanilovou v kyslom prostredí, pri ktorej vzniká červený azobilirubín:

Bilirubín + kyselina sulfanilová + NaNO + HCl červený azobilirubín. ⎯⎯⎯ →⎯ r akceleráto2

Azobilirubín je azofarbivo, ktoré má vlastnosti acidobázického indikátora − v slabokyslom a neutrálnom roztoku je červený, v silno alkalickom prostredí je modrý. Namiesto kyseliny sulfanilovej možno použiť napr. 2,4-dichlóranilín (DCA). Obvykle sa stanovuje celkový bilirubín (s akcelerátorom), pri zvýšenom obsahu aj priamy bilirubín (bez akcelerátora). Stanovenie celkového bilirubínu: v reakčnej kyvete sa zmieša roztok kyseliny sulfanilovej v HCl s roztokom akcelerátora (zmes kofeínu, octanu sodného a benzoanu sodného) a vzorkou. Pridá sa roztok dusitanu sodného a po 5-10 min sa zmeria absorbancia červeného azobilirubínu pri vlnovej dĺžke 430-460 nm. Ak sa na stanovenie použije modrá forma azobilirubínu, po prebehnutí kopulácie sa pridá alkalický tlmivý roztok (pH 12, NaOH s vínanom sodno-draselným) a meria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke 580-620 nm.

Stanovenie priameho bilirubínu: Vykonáva sa bez akcelerátora zastavením diazotačnej reakcie prídavkom kyseliny askorbovej obvykle po 10 min. Kyselina askorbová rozloží diazóniovú soľ potrebnú na kopuláciu, a tým zastaví reakciu. V priebehu 10 min zreagujú priame formy bilirubínu. Ak by sa reakcia nechala prebiehať dlhšie, postupne by reagovali aj ďalšie formy bilirubínu. Merať možno buď priamo červenú formu v kyslom prostredí, alebo v alkalickom prostredí modrú formu azobilirubínu. 9.7 Glukóza Glukóza ako najdôležitejší monosacharid je základným zdrojom energie. Ak prevyšuje jej prísun spotrebu, glukóza sa ukladá vo forme glykogénu. Pri poklese koncentrácie glukózy dochádza k spätnému odbúravaniu glykogénu. V krvi je koncentrácia glukózy regulovaná viacerými hormónmi. Inzulín znižuje koncentráciu glukózy tvorbou glykogénu; glukagón a adrenalín zvyšujú koncentráciu glukózy odbúravaním glykogénu. Ďalšie hormóny, ktoré tiež zvyšujú koncentráciu glukózy, sú glukokortikoidy, rastový hormón a hormóny štítnej žľazy. Glukóza je najčastejšie stanovovaný analyt, pretože poruchy metabolizmu sacharidov sa vyskytujú veľmi často a môžu viesť k závažným poškodeniam organizmu.

Hypoglykémia (glukóza < 3,8 mmol/l) je príznak ochorenia pankreasu, vrodených porúch metabolizmu glukózy a pečeňových karcinómov.

Hyperglykémiou (glukóza > 7,8 mmol/l) sa prejavuje diabetes, ťažká infekcia, tumor mozgu, ale vyskytuje sa aj pri podávaní tiazidových diuretík a neuroleptík.



Stanovenie s glukózaoxidázou (GOD), peroxidázou (POD) a oxidačnou kopuláciou (kondenzáciou)

Princípom metódy je oxidácia glukózy katalyzovaná enzýmom GOD, pričom vzniká kyselina glukonová a peroxid vodíka:

Glukóza + O2 + H O kyselina glukonová + H⎯⎯→⎯GOD O . 2 2 2

Reakciou vzniknutý H O2 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu 4-aminoantipyrínu s fenolom (katalyzovaná peroxidázou POD), pri ktorej vzniká červeno sfarbené chinónimínové farbivo. Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 500 nm.

R-NH2 + C6H5-OH + 2 H2O R-N=C⎯⎯→⎯POD H =O + 4 H O. 2 6 4 2

O možno stanoviť aj amperometricky Clarkovou elektródou (časť 7.7). H2 2

Stanovenie s hexokinázou (HK) a glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6PD)

Enzým hexokináza katalyzuje fosforyláciu glukózy (aj iných sacharidov):

Glukóza + ATP glukóza-6-fosfát + ADP. ⎯→⎯HK

+ Reakciou vzniknutý glukóza-6-fosfát sa potom oxiduje s NAD v prítomnosti katalyzátora glukóza-6-fosfátdehydrogenáza:

+Glukóza-6-fosfát + NAD glukonolakton-6-fosfát + NADH + H+⎯⎯ →⎯G6PD .

Koncentrácia glukózy sa vypočíta z prírastku absorbancie vznikajúceho NADH meranej pri vlnovej dĺžke 340 nm. 9.8 γ-glutamyltransferáza (GGT) GGT je takmer špecifický enzým pečene a žlčových ciest, kde je jeho aktivita najvyššia. GGT sa používa napr. na diagnostikovanie a monitorovanie priebehu hepatitídy. Stanovenie katalytickej koncentrácie GGT podľa IFCC

GGT katalyzuje reakciu prenosu aminoskupiny (γ-glutamyl) na aminokyselinu, alebo peptid. Pri stanovení GGT metódou podľa IFCC tento enzým katalyzuje reakciu glycylglycínu s L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilidom za vzniku dvoch produktov: 5-amino-2-nitrobenzoátu a L-γ-glutamyl-glycylglycínu. 5-amino-2-nitrobenzoát je intenzívne žlto sfarbený a jeho množstvo sa stanovuje fotometricky meraním absorbancie pri 405 nm. Rýchlosť zmeny absorbancie je priamo úmerná katalytickej koncentrácii enzýmu GGT.

L-γ-glutamyl-3-karboxy-4-nitroanilid + glycylglycín ⎯⎯→⎯GGT

⎯⎯→⎯GGT L-γ-glutamyl-glycylglycín + 5-amino-2-nitrobenzoát.



9.9 Cholesterol a jeho frakcie HDL a LDL

Cholesterol je súčasťou membrán všetkých živočíšnych buniek, je základnou látkou biosyntézy steroidných hormónov a žlčových kyselín. V krvi je viazaný do lipoproteínových komplexov, asi 70 % cholesterolu je vo forme esterov. Zvýšená koncentrácia cholesterolu je najznámejší a najzávažnejší rizikový faktor rozvoja arteriosklerózy. Zvyčajne sa stanovuje celkový cholesterol (voľný a jeho estery) a jeho frakcie HDL-cholesterol (high density lipoprotein cholesterol) a LDL-cholesterol (low density lipoprotein cholesterol). Menej často sa stanovuje VLDL-cholesterol (very low density lipoprotein cholesterol). Označe-nie frakcií HDL, LDL a VLDL vzniklo z delenia lipoproteínov odstreďovaním na základe ich rozdielnej hustoty. Enzýmové stanovenie celkového cholesterolu oxidačnou kopuláciou

Pôsobením detergentov (PEG) sa uvoľní cholesterol z väzby na lipoproteíny. Pretože v sére sa asi 70 % cholesterolu vyskytuje vo forme esterov, pred stanovením celkového cholesterolu je potrebné tieto estery najskôr hydrolyzovať. Estery cholesterolu sa hydrolyzujú za katalytického účinku enzýmu cholesterolesteráza (CHE), pričom sa uvoľňuje cholesterol:

Estery cholesterolu + H O cholesterol + vyššie karboxylové kyseliny. ⎯⎯→⎯CHE2

Cholesterol (voľný a vzniknutý hydrolýzou esterov) sa oxiduje za katalytického účinku enzýmu cholesteroloxidáza (CHO), pričom vzniká peroxid vodíka:

4Cholesterol + O ⎯⎯→⎯CHO -cholesten-3-on + H2 2O . 2

Reakciou vzniknutý H O2 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu 4-aminoantipyrínu s fenolom (katalyzovaná peroxidázou POD), pri ktorej vzniká červeno sfarbené chinónimínové farbivo. Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 500 nm.


Stanovenie HDL-cholesterolu

Na oddelenie HDL-cholesterolu od LDL- a VLDL-frakcie sa používajú rôzne spôsoby:

o LDL-frakcia a VLDL-frakcia sa vyzráža precipitačným činidlom (kyselina fosfo-volfrámová a chlorid horečnatý) a v supernatante sa stanoví HDL-cholesterol ako pri prechádzajúcej metóde (stanovenie celkového cholesterolu).

o LDL- a VLDL-frakcia vytvára s dextránsulfátom a α-cyklodextrínom v slabo alkalickom prostredí v prítomnosti Mg2+ vo vode rozpustné komplexy, v ktorých je reaktivita cholesterolu nízka (neinterferujú pri stanovení HDL-cholesterolu).

o Na oddelenie HDL–cholesterolu sa použijú špecifické protilátky, ktoré s LDL- a VLDL- frakciou tvoria rozpustné imunokomplexy. Tieto imunokomplexy nereagujú v nasledujú-cich enzýmových reakciách s CHE a CHO, a preto ich nie je nutné z reakčnej zmesi odstraňovať. Postup je podobný ako pri stanovení celkového cholesterolu.



Stanovenie LDL-cholesterolu

Na oddelenie LDL–cholesterolu od HDL- a VLDL-frakcie sa používajú špecifické protilátky naviazané na latexové častice, ktoré s HDL- a VLDL- frakciou tvoria imunokomplexy Po oddelení latexových častíc odstredením sa v supernatante stanoví LDL-cholesterol. Postup stanovenia je podobný ako pri metóde na stanovenie celkového cholesterolu. 9.10 Cholínesteráza Cholínesteráza je skupina enzýmov, ktoré katalyzujú štiepenie esterov cholínu. Znížená aktivita sa vyskytuje pri ochorení pečene, pri otrave organofosfátmi a pri infarkte myokardu. Fotometrické stanovenie

Cholínesteráza štiepi substrát butyryltiocholínjodid na tiocholín a butyrát. Tiocholín potom reaguje s kyselinou ditio-bis-nitrobenzoovou (DTNB) za vzniku žlto sfarbenej kyseliny 5-mer-kapto-2-nitrobenzoovej, ktorej absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 420 nm.

Butyryltiocholín + H O tiocholín + butyrát ⎯⎯⎯⎯⎯ rázacholíneste →2

Tiocholín + DTNB → 5-merkapto-2-nitrobenzoová kyselina.

9.11 Imunoglobulíny Imunoglobulíny sú súčasťou γ-globulínovej a čiastočne β-globulínovej frakcie bielkovín a sú nositeľom látkovej imunity. Súčasné zvýšenie všetkých imunoglobulínov sa pozoruje u infekcií - je to imunitná odpoveď organizmu na infekciu. Zníženie imunoglobulínov má za následok náchylnosť na infekciu. Imunoglobulíny IgA, IgD, IgE, IgG a IgM sa stanovujú v sére po ich rozdelení napr. dvojrozmernou imunoelektroforézou, imunofixáciami, alebo sa stanovujú individuálne pomocou špecifických protilátok proti jednotlivým imunoglobulínom. Rýchle stanovenie jednotlivých imunoglobulínov umožňuje imunoturbidimetria, imunonefelometria a ELISA. Imunoturbidimetrické stanovenie imunoglobulínov

Imunoturbidimetrické stanovenie je založené na reakcii jednotlivých imunoglobulínov so špecifickou protilátkou proti príslušnému ľudskému imunoglobulínu (napr. stanovenie IgG s kozím antisérom proti ľudskému IgG). Pri reakcii vzniká precipitát príslušného imuno-komplexu. Meria sa turbidancia inkubačnej zmesi pri 340 nm.



9.12 Kreatinín Koncentrácia kreatinínu v krvi je úmerná množstvu svalovej hmoty a v podstate nepodlieha väčším zmenám s výnimkou ochorenia obličiek, kedy stúpa. Používa sa na vyšetrenie funkcie obličiek. Zvýšená hodnota poukazuje na zníženú glomerulárnu filtráciu pri akútnom zlyhaní obličiek, pri pokročilom diabete, traumách a popáleninách. Znížené hodnoty nemajú praktický význam. Stanovenie Jaffého reakciou

Princípom fotometrického stanovenia v sére aj moči je reakcia kreatinínu s alkalickým roztokom kyseliny pikrovej, pri ktorej vzniká červenooranžový komplex kreatinínu s pikrátom v pomere 1:1. Z množstva kreatinínu v sére a moči sa počíta kreatinínová clearance ako test na funkciu obličiek. Jaffého reakcia nie je špecifická, interferuje napr. bilirubín, pyruvát, kreatín. Enzýmové stanovenie

Kreatinín sa hydrolyzuje vodou za katalytického pôsobenia enzýmu kreatinínáza na kreatín. Kreatín sa hydrolyzuje v prítomnosti ďalšieho enzýmu kreatínáza na sarkozín a močovinu. Sarkozín sa potom oxiduje na glycín, táto reakcia je katalyzovaná sarkozínoxidázou. Reakciou vzniknutý H O2 2 sa použije na oxidačnú kopuláciu (kondenzáciu) 4-aminoantipyrínu s fenolom (katalyzovaná peroxidázou POD), pri ktorej vzniká červeno sfarbené chinónimínové farbivo. Meria sa absorbancia vzniknutého chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 550 nm rovnovážnou alebo kinetickou metódou. Pri stanovení neinterferuje bilirubín, chylózne sérum a rôzne chromogény. U pacientov zaradených v transplantačnom programe a na hemodialýze sa musí použiť enzýmové stanovenie.

Kretinín + H O kreatín ⎯⎯⎯⎯ zakreatiníná →

→

2

O sarkozín + močovina ⎯⎯⎯ →⎯kreatínázaKreatín + H2

Sarkozín + O2 + H O glycín + HCOH + H⎯⎯⎯⎯⎯ idázasarkosínox O2 2 2


9.13 Kreatínkináza (CK) Enzým kreatínkináza sa nachádza v bunkách kostného svalu, mozgu a srdcového svalu. Zvýšená aktivita CK sa pozoruje pri ochorení kostného svalstva, zvýšenej telesnej námahe a infarkte myokardu. Molekula CK sa skladá z dvoch podjednotiek označovaných B a M. Celková aktivita CK je tvorená aktivitou troch izoenzýmov CK-MM (hlavne kostné svalstvo), CK-MB (srdcové svalstvo) a CK-BB (mozgové tkanivo, črevá, prostata). Celkovú aktivitu CK v krvnom sére tvorí predovšetkým CK-MM, len malý podiel CK-MB a izoenzým CK-BB prakticky nie je prítomný (zdraví jedinci). Ak aktivita CK-MB a celková aktivita CK prevyšuje horné referenčné medze a ak podiel aktivity CK-MB je 6 % celkovej aktivity CK, potom s veľkou pravdepodobnosťou ide o infarkt myokardu.



Stanovenie celkovej aktivity CK

Kreatínkináza (ATP-Kreatín N-fosfotransferáza) katalyzuje konverziu kreatínfosfátu a adenozín-difosfátu (ADP) na kreatín a adenozíntrifosfát (ATP). Vzniknutý ATP reaguje s glukózou za katalytického účinku enzýmu hexokináza (HK), pričom vzniká ADP a glukóza-6-fosfát. Katalytická koncentrácia CK sa potom vyhodnotí detekčnou reakciou, pri ktorej reaguje glukóza-6-fosfát s NADP+ za vzniku NADPH. Táto reakcia je katalyzovaná enzýmom glukóza-6-fosfátdehydrogenáza (G6PD). Rýchlosť redukcie NADP+ na NAD PH je funkciou katalytickej koncentrácie CK. Meria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke 339 nm (absorbuje len NADPH). Katalytická koncentrácia CK je úmerná prírastku absorbancie NADPH.

Kreatínfosfát + ADP keratín + ATP ⎯→⎯CK

Glukóza + ATP glukóza-6-fosfát + ADP ⎯⎯→⎯ HK

+Glukóza-6-fosfát + NADP glukonolakton-6-fosfát + NADPH + H+⎯⎯ →⎯G6PD .

Postup:

Reakčná zmes obsahuje: imidazol ako tlmivý roztok, Mg2+ a N-acetylcysteín ako aktivátory reakcie, adenozín-monofosfát (AMP) blokujúci interferencie myokinázy. Reakčná zmes sa vytemperuje na 37°C a pridá sa vzorka (sérum alebo plazma). Reakcia sa štartuje substrátom (kreatínfosfát) a po lag-fáze 120 s sa meria absorbancia po dobu 120 s pri 339 nm (absorbuje len NADPH). Katalytická koncentrácia CK je úmerná prírastku absorbancie.

Enzým myokináza (adenylátkináza, AK) katalyzuje reakciu:

2 ADP ATP + AMP. ⎯⎯→←AK

Pretože enzým AK je endogénnou zložkou séra, táto reakcia by mohla spôsobiť interferencie pri stanovení a falošne zvyšovať hodnotu CK. Ak je v reakčnej zmesi nadbytok AMP, rovnováha reakcie sa posunie v smere vzniku ADP. Stanovenie izoenzýmu CK-MB

Pri stanovení CK-MB sa využíva imunoinhibícia. Protilátky proti CK-M inhibujú celkovú aktivitu izoenzýmu CK-MM (má hlavný podiel na celkovej aktivite CK) ako aj podjednotky CK-M izoenzýmu CK-MB. Aktivita sa potom stanoví ako pri celkovej CK. Nameraná aktivita neinhibovanej podjednotky CK-B určuje aktivitu CK-MB.

CK-MM + CK-MB (podjednotka CK-M a CK-B) + anti-CK-M →

→ inhibovaná (CK-MM a podjednotka CK-M) + aktívna podjednotka CK-B.



9.14 Kyselina močová Kyselina močová je konečným produktom metabolizmu purínov. Vzniká rozpadom bunkových jadier potravy, ale aj vlastného organizmu. Zvýšené hodnoty sa objavujú pri dne a zvýšenom metabolizme nukleoproteínov (leukémia). Enzýmové stanovenie v sére/plazme

Stanovenie je založené na oxidácii kyseliny močovej kyslíkom katalyzovanej enzýmom urikáza. Pri reakcii vzniká alantoín a peroxid vodíka.

Kyselina močová + 2 H2O + O alantoín + CO⎯⎯ →⎯urikáza + H O . 2 2 2 2

Koncentráciu kyseliny močovej možno určiť meraním poklesu absorbancie pri vlnovej dĺžke 290 nm (absorbuje kyselina močová). Druhá možnosť je stanovenie vznikajúceho H O2 2 (vznik chinónimínového farbiva reakciou 4-aminoantipyrínu a derivátu fenolu s enzýmom POD a meranie absorbancie pri vlnovej dĺžke 500 nm, podobne ako pri stanovení glukózy alebo cholesterolu). Pri stanovení kyseliny močovej interferuje bilirubín a kyselina askorbová, ktoré sa nachádzajú vo vzorkách ako endogénne zložky o koncentrácii porovnateľnej s koncentráciou kyseliny močovej. Obidve zložky môžu spotrebovávať H O2 2 na svoju oxidáciu (bilirubín na biliverdín a kyselina askorbová na kyselinu dehydroaskorbovú). Preto sa do reakčnej zmesi pridáva bilirubínoxidáza a askorbátoxidáza. V tomto prípade sa bilirubín a kyselina askorbová oxidujú kyslíkom, nie H O . 2 2

9.15 Kyslé fosfatázy (ACP) Enzým ACP je tvorený rozsiahlou skupinou tkanivovo špecifických izoenzýmov (pečeňový, kostný, prostatový, erytrocytárny, trombocytárny, leukocytárny). Významný je predovšetkým prostatový izoenzým ACP (označuje sa ACPP), ktorého zvýšená aktivita indikuje karcinóm prostaty. ACP katalyzuje hydrolýzu monoesterov kyseliny o-fosforečnej v kyslom prostredí. Reakcia je zhodná s reakciou alkalickej fosfatázy (ALP), odlišuje sa len hodnotou pH (optimálne pH 5,1).

R-O-PO(OH)2 + H O R-OH + H⎯⎯→⎯ACP PO . 2 3 4

Stanovenie ACP je založené na podobnej reakcii ako stanovenie ALP:

O2N-C6H4-O-PO(OH)2 + R -OH O⎯⎯→⎯ACP N-C H -OH + R -O-PO(OH) . 1 2 6 4 1 2

Reakciou hydrolýzy 4-nitrofenylfosfátu pri pH 5,1 vzniká 4-nitrofenolát. Absorbancia vznikajú-ceho žltého 4-nitrofenolátu sa meria pri vlnovej dĺžke 405 nm.



Na stanovenie nie je možné použiť kinetickú metódu, pretože aktivita ACP je nízka. Stanovenie sa vykonáva fotometricky metódou konštantného času po zastavení enzýmovej reakcie inhibítorom ACP (roztok EDTA/NaOH blokuje aktívne centrá enzýmu). Ako substrát enzýmovej reakcie sa používa aj 1-naftylfosfát. Hydrolýzou 1-naftylfosfátu vzniká 1-naftol, ktorý sa kopulačnou reakciou s diazóniovou soľou prevedie na azofarbivo. Vznikajúce azofarbivo možno merať aj kinetickou metódou. Na stanovenie izoenzýmov sa využívajú inhibičné metódy. Napr. prídavkom L-vínanu sa inhibuje prostatový a leukocytárny izoenzým. Najskôr sa stanoví celková aktivita ACP (bez inhibítora), potom sa stanoví aktivita po inhibícii s L-vínanom a aktivita prostatového izoenzýmu sa zistí z rozdielu týchto dvoch aktivít. Na stanovenie sa používajú aj imunochemické metódy pomocou antiséra obsahujúceho špecific-ké protilátky proti ľudskému ACPP. 9.16 Laktát Kyselina mliečna (laktát) vzniká z kyseliny pyrohroznovej pri anaeróbnej glykolýze. Zvýšené hodnoty sa pozorujú vtedy, keď tkanivá nemajú k dispozícii dostatok kyslíka na vstup kyseliny mliečnej do Krebsovho cyklu, alebo keď je tento vstup obmedzený (zvýšená svalová aktivita, poruchy cirkulácie, dýchania, šokové stavy, poruchy pečene). V mozgovomiechovom moku sa zvýšené hodnoty laktátu zistia pri hnisavých zápaloch mozgových blán. Enzýmové stanovenie s L-laktátdehydrogenázou (LD)

L-laktát sa oxiduje s NAD+ na pyruvát za katalytického pôsobenia enzýmu LD. Meria sa nárast absorbancie NADH pri vlnovej dĺžke 340 nm.

+ pyruvát + NADH + H+⎯→⎯LD . L-laktát + NAD

Pretože rovnováha tejto reakcie je normálne posunutá vľavo, pracuje sa v intervale pH 9-10 a s nadbytkom NAD+. Na posunutie rovnováhy vpravo sa do reakčnej schémy zahrnie aj ALT a L-glutamát. ALT katalyzuje reakciu pyruvátu s L-glutamátom, čím sa odčerpáva pyruvát a rovnováha reakcie oxidácie L-laktátu sa posúva vpravo.

L-glutamát + pyruvát ⎯⎯→⎯ALT L-alanín + 2-oxoglutarát.

9.17 Laktátdehydrogenáza (LD) LD je cytoplazmový enzým vyskytujúci sa v mnohých tkanivách (pečeň, obličky, srdcové a kostné svaly, nádorové bunky). V krvnom sére sa vyskytuje niekoľko izoenzýmov LD, ktoré sa môžu stanoviť po ich rozdelení elektroforézou alebo imunoinhibičnými metódami. Zvýšená aktivita LD súvisí s rôznymi chorobnými stavmi (infarkt myokardu, anémia, leukémia, ochorenie pečene, tumory).



Stanovenie katalytickej koncentrácie LD s NAD+ podľa IFCC

Enzým LD katalyzuje oxidáciu L-laktátu s NAD+ na pyruvát: +L-laktát + NAD pyruvát + NADH + H+⎯→⎯LD .

Postup:

Ako tlmivý roztok sa používa N-metyl-D-glukamín (MEG), pH 9,4. Reakcia sa štartuje roztokom NAD+, zmes sa dôkladne premieša a po lag-fáze 90 s sa meria absorbancia po dobu 180 s (namerať najmenej šesť bodov) pri vlnovej dĺžke 339 nm. Pri 339 nm absorbuje len NADH. Katalytická koncentrácia LD je úmerná prírastku absorbancie pri 339 nm. 9.18 Lipáza Enzým lipáza katalyzuje postupnú hydrolýzu triacylglycerolov na glycerol a vyššie karboxylové kyseliny. Zvýšená aktivita enzýmu sa pozoruje pri akútnom zápale pankreasu. Fotometrické stanovenie

Fotometrické stanovenie využíva syntetický substrát (napr. 1,2-diacylglycerol) a sekvenciu reakcií s enzýmami lipáza, kolipáza, monoglyceridlipáza, glycerolkináza a L-α-glycerol-fosfátoxidáza. Produktom reakcie je H O2 2, ktorý v prítomnosti enzýmu POD oxiduje 4-amino-antipyrín na chinónimínové farbivo (meria sa jeho absorbancia pri vlnovej dĺžke 550 nm). Iná možnosť je využiť H O2 2 na oxidáciu leukobáz a merať absorbanciu takto vzniknutých produktov. 9.19 Močovina (urea) Močovina vzniká v pečeni ako jeden z hlavných produktov metabolizmu bielkovín. Jej hlavný podiel sa vylučuje močom, malé množstvo sa vylučuje potom. Zvýšená koncentrácia sa pozoruje pri viac ako 50 % znížení glomerulárnej filtrácie (pri normálnom príjme proteínov), pri obmedzenom prekrvení obličiek, v prípade obličkových kameňov a nádorov, pri nadmernom príjme proteínov. Znížené hodnoty sa pozorujú pri zníženom príjme proteínov, pri dedičných poruchách syntézy proteínov a pri ťažkých ochoreniach pečene. Enzýmové stanovenie s NADH

+Enzým ureáza hydrolyzuje močovinu na CO a NH : 2 4

NH2-CO-NH2 + H O CO⎯⎯ →⎯ureáza + 2 NH2 2 3

+NH3 + H2O → NH + OH-. 4



+ Vzniknutý NH4 reaguje s 2-oxoglutarátom a NADH za katalytického pôsobenia enzýmu glutamátdehydrogenáza (GLD):

+ +NH + 2-oxoglutarát + 2 NADH L-glutamát + NAD⎯⎯→⎯GLD + H O. 4 2

Meria sa pokles absorbancie NADH pri 340 nm metódou end-point alebo kinetickou metódou. Enzýmové stanovenie s ISE

Na stanovenie močoviny v sére sa používajú aj jednoúčelové analyzátory vybavené napr. ureázou imobilizovanou na membráne ISE (časť 7.7). 9.20 Triacylglyceroly Triacylglyceroly obsahujú glycerol, na ktorý sú esterickou väzbou viazané tri vyššie karboxylové kyseliny (prevažne C16-C18). V krvnom sére sú, podobne ako cholesterol, súčasťou lipoproteínov a slúžia predovšetkým na zaistenie energie. Zvýšená koncentrácia je rizikovým faktorom arteriosklerózy. Enzýmové stanovenie

Triacylglyceroly sa hydrolyzujú v prítomnosti enzýmu lipáza na glycerol a zodpovedajúce vyššie karboxylové kyseliny. Glycerol sa potom fosforyluje za katalytického účinku enzýmu glycerolkináza na glycerol-3-fosfát. Glycerol-3-fosfat sa oxiduje pôsobením enzýmu glycerol-fosfátoxidáza na dihydroxyacetónfostát. Vzniknutý H2O2 sa využije v reakcii vzniku červeného chinónimínového farbiva. Meria sa absorbancia pri vlnovej dĺžke 500 nm.

Triacylglyceroly + 3 H O glycerol + 3 vyššie karboxylové kyseliny ⎯⎯ →⎯ lipáza2

Glycerol + ATP glycerol-3-fosfát + ADP ⎯⎯⎯⎯⎯ názaglycerolki →

→Glycerol-3-fosfát + O dihydroxyacetónfosfát + H⎯⎯⎯⎯⎯⎯ asfátoxidázglycerolfo2 2O2


Pri jednostupňových metódach takto reaguje nielen glycerol uvoľnený z triacylglycerolov, ale aj voľný glycerol (endogénny) prítomný v biologickej vzorke; stanoví sa teda celkový glycerol. Ak sa celý vyššie uvedený postup analýzy zrealizuje bez prídavku enzýmu lipáza, možno meraním absorbancie stanoviť voľný glycerol vo vzorke. Množstvo triacylglycerolov sa potom vypočíta ako rozdiel:

Triacylglyceroly = celkový glycerol – voľný glycerol.



9.21 Troponín T Troponín sa spolu s ďalšími bielkovinami podieľa na štruktúre priečne pruhovaného svalu a má vplyv na reguláciu kontrakcie srdcového svalu. U človeka boli opísané tri formy troponínu T, z nich jedna je špecifická pre srdce a dve pre kostné svalstvo. Troponín T má špecifický význam pre včasné stanovenie infarktu myokardu. (Iné markery infarktu myokardu sú CK, CK-MB, LD a myoglobín). Dôkaz a diferenciácia troponínu T zo srdcového svalu od troponínu T z kostného svalstva sa dosiahne pomocou špecifických monoklonálnych protilátok proti troponínu T zo srdca. Testy sú založené na sendvičovej technike s využitím komplexu streptavidín/biotín. Princíp rýchleho diagnostického testu bol uvedený v časti 7-6. Stanovenie metódou ELISA

Používa sa dvojica monoklonálnych protilátok Ab a Ab proti troponínu T. Protilátka Ab1 2 1 je označená biotínom (obr. 9-1). Druhá protilátka je označená peroxidázou Ab2POD. Na stene mikroskúmavky je naviazaný streptavidín.

Obr. 9-1 Princíp detekcie pri stanovení troponínu T sendvičovou metódou ELISA

Tetrametylbenzidín + H2O2 Benzidínová modrá Difenyldichinón

POD

Troponín T

Biotín Streptavidín

Ab1

Ab2

Imunoreakciou Ab , troponínu T a Ab1 2POD vznikne sendvičový komplex. Po vymytí zvyšku reagentov sa pridá H2O2 a vhodný chromogén (napr. tetrametylbenzidín). Chromogén sa oxiduje na príslušné farbivo (v príklade je to benzidínová modrá, ktorá sa v kyslom prostredí zmení na červené difenyldichinóny s absorpčným maximom pri vlnovej dĺžke 405 nm). Ako chromogén sa môže použiť tiež ABTS (amónna soľ kyseliny 2,2′-azino-bis(3-etylbenzotiazolín-6-sulfónovej).



9.22 Sodík a draslík Na+ tvorí hlavný podiel katiónov v plazme. Asi 95 % sa vylučuje močom, zvyšok potom a stolicou. Sodík a draslík sa stanovujú vo všetkých telových tekutinách, najčastejšie v sére. Stanovenie Na a K plameňovou atómovou emisnou spektrometriou (FAES)

Na stanovenie Na sa využíva jeho základná spektrálna čiara 589 nm, stanovenie K využíva jeho základnú čiaru 768 nm. Vzorka sa riedi roztokom LiCl alebo CsCl, ktoré sa uplatňujú ako spektrálne pufre (stabilizuje ionizačnú – efektívnu – teplotu plameňa). Li plní v skutočnosti aj funkciu vnútorného štandardu. Vzorka sa obvykle riedi 50 až 200 krát. Riediaci roztok niekedy obsahuje aj povrchovoaktívnu látku (Brij 35) na zlepšenie atomizácie. Stanovenie Na a K iónovo-selektívnymi elektródami

Na stanovenie Na+ sa využíva elektróda so sklenou membránou, na stanovenie K+ elektróda s kvapalnou membránou s valinomycínom (časť 7.2). Použitím ISE sa nestanovuje koncentrácia Na+, ale jeho aktivita, ktorej hodnota je ovplyvnená aktivitou všetkých elektrolytov v roztoku. Potenciometrické stanovenie môže byť priame (na stanovenie sa použije nezriedená vzorka krvi, plazmy, séra), alebo nepriame (meria sa zriedená vzorka). Priamou potenciometriou sa stanoví množstvo Na+ vo vodnej fáze plazmy alebo séra. Sérum obsahuje okrem vody aj bielkoviny a lipidy, ktoré zaberajú významnú časť objemu vzorky. Z tohto dôvodu priama potenciometria poskytuje vyššie výsledky ako FAES a nepriama potenciometria. Priama potenciometria stanovuje skutočnú fyziologicky účinnú koncentráciu, nezávislú od koncentrácie bielkovín a lipidov; z tohto pohľadu sa priama potenciometria javí ako klinicky užitočnejšia metóda. Neprejavuje sa u nej napr. vplyv chylozity, ktorý znižuje koncentráciu Na a K pri stanovení metódou FAES. 9.23 Horčík a vápnik Horčík sa v organizme zúčastňuje všetkých reakcií, pri ktorých dochádza k prenosu fosfátovej skupiny. Všetky reakcie, ktorých sa zúčastňuje ATP, majú za substrát komplex ATP s horčíkom. Zvýšenie aj zníženie množstva Mg sa pozoruje napr. pri poruchách obličiek. Vápnik sa v organizme nachádza buď ako voľný, alebo viazaný do komplexov s bielkovinami (albumínom) alebo anorganickými aniónmi. Z hľadiska biologického účinku je zaujímavý voľný vápnik. Zvýšené hodnoty Ca (aj celkového) možno zistiť u pacientov s karcinómom. Stanovenie celkového Ca a Mg v sére metódou atómovej absorpčnej spektrometrie (AAS)

Na stanovenie celkového vápnika a horčíka je vhodná AAS. Používa sa plameň acetylén/vzduch a meria sa čiara vápnika 422 nm a čiara horčíka 285 nm. Vzorka séra sa zriedi (1:50) roztokom



LaCl3 v HCl (spektrálny pufer), ktorý uvoľní Mg2+ 2+ a Ca z komplexov s fosfátmi a súčasne zriedi viskózne bielkoviny.

Stanovenie voľného Ca a Mg iónovo-selektívnymi elektródami 2+ 2+Stanovenie voľného Ca sa vykonáva ISE s membránou selektívnou na Ca . Pretože sa meria

aktivita Ca2+ +, je stanovenie ovplyvňované predovšetkým koncentráciou Na a K+ (iónovou silou). Používa sa priama potenciometria (meranie nezriedenej vzorky). Ak sa použije nepriama potenciometria, pri ktorej sa vzorka riedi, stanoví sa celkový vápnik. Stanovenie voľného Mg2+ sa vykonáva ISE s membránou selektívnou na Mg2+ podobne ako pri Ca2+.

Spektrofotometrické stanovenie Mg s Magonom

V alkalickom (pH 9,5) a čiastočne nevodnom (50 % etanol) prostredí reaguje Magon s iónmi Mg2+ za vzniku červeno sfarbeného komplexu, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 505 nm. Magon je 1-(2-hydroxyazo)-2-naftol-3-(2,4-dimetyl)-karboxyanilid.

Spektrofotometrické stanovenie Mg s Calmagitom

V čiastočne nevodnom alkalickom prostredí reaguje Mg2+ s Calmagitom za vzniku červeno sfarbeného komplexu, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 540 nm. Calmagit je kyselina 3-hydroxy-4-(2-hydroxy-5-metylfenylazo)-1-naftalénsulfónová.

Stanovenie Mg enzýmovou UV metódou s hexokinázou (HK) a glukóza-6-fosfátdehydrogenázou (G6PD)

Mg 2+ a enzým hexokináza katalyzujú fosforyláciu glukózy (aj iných sacharidov):

Glukóza + ATP glukóza-6-fosfát + ADP. ⎯⎯⎯ →⎯+2Mg HK,

Reakciou vzniknutý glukóza-6-fosfát sa potom oxiduje s NAD+ v prítomnosti katalyzátora glukóza-6-fosfátdehydrogenáza:

+Glukóza-6-fosfát + NAD glukonolakton-6-fosfát + NADH + H+⎯⎯ →⎯G6PD .

Koncentrácia Mg 2+ sa vypočíta z prírastku absorbancie NADH meranej pri 340 nm.

Spektrofotometrické stanovenie Ca s o-krezoftaleínkomplexónom (CPC)

V čiastočne nevodnom alkalickom prostredí reaguje Ca2+ s CPC za vzniku červeno sfarbeného komplexu, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 580 nm. CPC je 3′,3″-bis[[bis(karb-oxy-metyl)amino]-metyl]- 5′,5″-dimetylfenolftaleín.



Spektrofotometrické stanovenie Ca s Arzénazo III

Arzénazo III (kyselina 1,8-dihydroxynaftalén-3,6-disulfo-2,7-bis(azo-1)benzén-2-arzínová) vytvára v imidazolovom tlmivom roztoku (pH 6) s Ca2+ modro sfarbený komplex, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 650 nm. 9.24 Chloridy Chloridový anión je hlavný anión v mimobunkovej tekutine. Z buniek obsahujú najviac chloridov erytrocyty, najmenej svalové bunky. Spolu s Na+ sa podieľa na regulácii osmotického tlaku. Zmeny v koncentrácii Cl- sú vo väčšine prípadov súbežné so zmenami v koncentrácii Na+, pretože podliehajú rovnakej regulácii.

Coulometrické stanovenie chloridov

Koncentrácia Cl- sa stanoví z množstva elektrického prúdu potrebného na uvoľnenie takého množstva Ag+, ktoré je práve potrebné na prevedenie Cl- na nerozpustný AgCl (časť 7.2).

Stanovenie chloridov iónovo-selektívnou elektródou

V automatických analyzátoroch sa používa priama potenciometria s ISE. 9.25 Fosfor Fosfor sa v ľudskom organizme nachádza ako kyselina fosforečná a jej deriváty.

Celkový fosfor možno rozdeliť na:

o fosfor rozpustný v kyselinách. Ide o fosfor, ktorý zostane v supernatante po deproteinácii séra kyselinou trichlóroctovou. Jeho súčasťou je aj tzv. anorganický fosfor,

o fosfolipidy – ide o zložky obsahujúce fosfor, ktoré sa extrahujú z plazmy organickými rozpúšťadlami,

o fosfoproteíny – zrazenina po deproteinácii kyselinou trichlóroctovou obsahuje fosfo-proteíny aj fosfolipidy.

Stanovenie anorganického fosforu s molybdénanom amónnym

Anorganický fosfor sa stanovuje v supernatante po deproteinácii séra kyselinou trichlóroctovou. Princípom stanovenia je reakcia fosforečnanov s molybdénanom amónnym podľa schémy:

(NH )4 3PO + 12 MoO → (NH )4 3 4 3PO (MoO )4 3 12.



Reakciou vzniká žltý komplex (NH )4 3PO (MoO )4 3 12, ktorého absorbancia sa meria pri vlnovej dĺžke 340 nm. Komplex sa môže ďalej zredukovať na fosfomolybdénovú modrú (absorbancia sa potom meria pri vlnovej dĺžke 600-700 nm).

Stanovenie fosfolipidov po mineralizácii

Po deproteinácii séra kyselinou trichlóroctovou sa k zrazenine bielkovín obsahujúcej aj fosfolipidy pridá zmes HClO a HNO4 3 a opatrne sa zohreje na kúpeli. Zrazenina sa rozpustí, roztok sa odfarbí a zo zmesi unikajú biele dymy. Vzniknutý anorganický fosfor sa stanoví s molybdénanom amónnym.

Enzýmové stanovenie fosfolipidov

Enzým fosfolipáza D uvoľňuje anorganický fosfor z fosfolipidov (hydrolýza). Reakciou vznikne cholín, ktorý sa oxiduje enzýmom cholínoxidáza na betaín a vzniká peroxid vodíka. Peroxid vodíka sa využíva na oxidačnú kopuláciu 4-aminoantipyrinu s fenolom na chinónimínové farbivo. Oxidačná kopulácia je katalyzovaná enzýmom peroxidáza. Meria sa absorbancia chinónimínového farbiva pri vlnovej dĺžke 500 nm.

Fosfolipidy + H O cholín + H⎯⎯⎯⎯⎯ D afosfolipáz PO→

→

2 3 4

Cholín + 2 O betaín + H⎯⎯⎯⎯⎯ ázacholínoxid O2 2 2


V tab. 9-1 sú uvedené referenčné a odporúčané metódy pre niektoré analyty.




Tabuľka 9-1 Prehľad referenčných a odporúčaných metód pre niektoré analyty

Analyt Referenčná metóda Odporúčaná metóda Analyty v krvnom sére Na+ ID-MS, FAES, IC FAES (s Li+ ako spektrálnym pufrom), ISE K+ ID-MS, FAES, IC FAES (s Li+ ako spektrálnym pufrom), ISE Ca2+ ID-MS, FAAS, IC FAAS, FAES (s Li+ ako spektrálnym pufrom), ISE Cl- coulometria, NAA coulometria, ISE Fosfáty anorgan. ID-MS, IC UV molybdénová modrá Mg celkový FAAS, IC FAAS, enzýmová UV metóda, fotometrické metódy, ISE Li+ FAAS, IC FAAS, FAES, ISE Celková bielkovina reakcia s biuretovým č. reakcia s biuretovým činidlom Albumín fotometrické metódy (BCG, BCP), imunoturbidimetria,

imunonefelometria Bilirubín celkový Doumas-Perry Jendrassik-Gróf, fotometrické metódy s DCA Cholesterol ID-GC/MS,

ID-LC/MS metóda CHO-PAP

Glukóza ID-GC/MS GOD-PAP fotometricky alebo elektrochemicky, metóda s hexokinázou, enzýmové elektródy (biosenzory)

Kyselina močová ID-GC/MS, HPLC enzýmové fotometrické metódy Močovina ID-GC/MS UV enzýmová metóda s GLD, elektrochemické stanovenie

(biosenzory) Kreatinín ID-GC/MS,

ID-LC/MS enzýmové metódy, HPLC, Jaffé bez deproteinácie

Triacylglyceroly ID-GC/MS metóda s GPO-PAP ALP s roztokom MEG alebo IFCC s roztokom AMPr AST IFCC/IRMM IFCC/IRMM ALT IFCC/IRMM IFCC/IRMM CK IFCC/IRMM IFCC/IRMM IgA, IgG, IgM imunoturbidimetria, imunonefelometria Parametre acidobázických rovnováh Na+, K+ ID-MS, FAES, IC ISE Cl- coulometria, NAA ISE pH meranie sklenou

elektródou, IFCC sklená elektróda

pCO2 meranie pomocou tonometrie podľa IFCC

ISE

Analyty v moči Na+ ID-MS, FAES, IC FAES (s Li+ ako spektrálnym pufrom), ISE K+ ID-MS, FAES, IC FAES (s Li+ ako spektrálnym pufrom), ISE Ca2+ ID-MS, FAAS, IC FAAS, FAES (s Li+ ako spektrálnym pufrom), ISE Cl- coulometria, NAA coulometria, ISE Fosfáty anorg. ID-MS, IC UV molybdénová modrá Kyselina močová ID-GC/MS, HPLC enzýmové fotometrické metódy Močovina ID-GC/MS UV enzýmová metóda s GLD, elektrochemické stanovenie

(biosenzory) Kreatinín ID-GC/MS, HPLC enzýmové metódy, HPLC, Jaffé bez deproteinácie Glukóza ID-GC/MS GOD-PAP fotometricky alebo elektrochemicky, metóda

s hexokinázou, enzýmové elektródy Použité skratky:

ALP alkalická fosfatáza GPO glycerolfosfátoxidáza ALT alanínaminotransferáza CHO cholesteroloxidáza AMPr 2-amino-2-metyl-1-propanol IC iónová chromatografia AST aspartátaminotransferáza ID-MS izotopové zrieďovanie-MS BCG 3,3’,5,5’-tetrabróm--m-krezolsulfoftaleín IFCC International Federation of Clinical Chemistry BCP CK

5,5′-dibróm-o-krezolsulfoftaleín kreatínkináza

ISE

and Laboratory Medicine iónovo-selektívna elektróda

DCA 2,4-dichlóranilín IRMM Institute of Reference Materials and Measurements

FAAS plameňová atómová absorpčná spektrometria MEG N-metyl-D-glukamín FAES plameňová atómová emisná spektrometria NAA nukleárna aktivačná analýza GLD glutamátdehydrogenáza PAP 4-aminoantipyrín GOD glukózaoxidáza PAP 4-aminoantipyrín


9.26 Základné vyšetrenie moču Základné vyšetrenie moču najčastejšie predstavuje určenie pH, semikvantitatívne stanovenie bielkovín, bilirubínu, urobilinogénu, ketolátok, glukózy, krvi (hemoglobínu/erytrocytov), leuko-cytov, dusitanov, hustoty moču a vitamínu C. Na semikvantitatívnu analýzu sa používajú hlavne diagnostické prúžky (obr. 9-2). Diagnostické prúžky sú papierové pásiky obsahujúce analytický systém v suchom stave. Zóny pre jednotlivé analyty sú nalepené na plastovej podložke. Prúžok sa ponorí na 2-3 sekundy do moču, vzorka nasiakne do podložky, zvlhčí ju a naštartuje príslušné analytické reakcie. Prúžok sa vyberie, prebytočný moč sa zotrie o hranu skúmavky a papierik sa položí na bielu podložku.

Obr. 9-2 Diagnostický prúžok pre určenie 3 analytov v moči (v kruhu je znázornený detail reakčnej zóny pre jeden analyt)

reakčná zóna 6 × 6 mm

nosič

nylonová sieťka papier s činidlami absorpčný papier

Sfarbenie príslušnej reakčnej zóny sa vyhodnocuje obvykle po 1 min vizuálnym porovnaním s farebnou stupnicou pre daný analyt alebo sa vyhodnotí denzitometricky. V tab. 9-2 sú uvedené príklady diagnostických prúžkov na biochemické orientačné vyšetrenie moču. Diagnostické prúžky môžu byť monofunkčné (vyšetrenie jedného parametra), polyfunkčné (až 10 parametrov), alebo špeciálne. Krvné farbivo sa môže nachádzať v moči vo forme hemoglobínu a erytrocytov. Vzácnejšie sa vyšetruje aj myoglobín. Celé erytrocyty možno zistiť len v čerstvom moči bezprostredne po odbere. Reakčná zóna diagnostického prúžku obsahuje stabilizované organické peroxidy (napr. peroxyhydrát močoviny) a chromogén (napr. tetrametylbezidín, benzidín). Princípom testova-cieho prúžku je rozklad organických peroxidov hemoglobínom (pôsobí ako pseudo-peroxidáza) za vzniku H O , ktorý oxiduje prítomný chromogén za vzniku modrého produktu: 2 2

Chromogén + H2O farbivo + 2 H⎯⎯→⎯hém O. 2 2

Ketolátky sú metabolity zahŕňajúce predovšetkým kyselinu acetoctovú (30 %), β-hydroxy-maslovú (65 %) a acetón (3 %). Kyselina acetoctová poskytuje s nitroprusidom sodným v alkalickom prostredí v prítomnosti síranu amónneho ružové až fialové sfarbenie. Acetón reaguje menej intenzívne a kyselina β-hydroxymaslová túto reakciu neposkytuje.



Tabuľka 9-2 Diagnostické prúžky na orientačné vyšetrenie moču

Reakčná zóna Citlivosť Špecifická na Interferencie

Hemoglobín, 0,3 hemoglobín, myoglobín kyselina askorbová erytrocyty mg/l Ketolátky 0,3-0,5 kyselina acetoctová – vysoká, látky na báze fenolftaleínu alebo sulfoftaleínu

mmol/l acetón – nižšia Bilirubín 2,5-3,0 konjugovaný bilirubín kyselina askorbová, urobilinogén, svetlo

mg/l Urobilinogén 8,0 urobilinogén, sterkobilinogén svetlo, fenazopyridín, bilirubín

μmol/l Glukóza 0,1 D-glukóza kyselina askorbová, zvyšky čistiacich prostriedkov

mmol/l (peroxidy a iné oxidačné látky) Bielkoviny 0,1 albumín, menej špecifická látky na báze chinínu, alkaloidy, alkalický moč pH>8,

g/l pre ostatné bielkoviny zvyšky čistiacich prostriedkov, dezinfekčných prostriedkov (kvartérne amóniové soli)

pH cudzorodé látky kyslej a alkalickej povahy, starý moč má pH 9,0.

Dusitany 1,0 dusitany kyselina askorbová, diuréza, fenazopyridín mg/l

Kyselina 0,2-0,3 nešpecifická redox reakcia redukujúce látky v moči askorbová mmol/l Leukocyty 10 granulocyty, histiocyty intenzitu zafarbenia zvyšuje alkalické pH, vysoká

leu/μl hustota moču a vysoká koncentrácia bilirubínu

Do moču preniká jedine bilirubín konjugovaný (estery bilirubínu, priamy bilirubín). Testovací prúžok využíva reakciu bilirubínu s diazóniovou soľou v kyslom prostredí, pri ktorej vzniká ružovo sfarbené azofarbivo.

Urobilinogén vzniká spolu so sterkobilinogénom v tenkom čreve redukciou bilirubínu. Väčšina urobilinogénu sa za normálnych okolností vstrebáva črevnou sliznicou a odbúrava v pečeni. Len nepatrná časť sa dostane do krvného obehu, z ktorého sa vylučuje prostredníctvom obličiek do moču. Testovacie prúžky obsahujú v reakčnej zóne stabilizovanú diazóniovú soľ, ktorá v kyslom prostredí tvorí s urobilinogénom a sterkobilinogénom ružové až červené sfarbenie.

Testovací prúžok na glukózu obsahuje v reakčnej zóne enzýmy GOD, POD a chromogén (leuko-báza: o-tolidin, tetrametylbenzidín alebo 4-aminoantipyrin s fenolom). Glukóza sa v reakčnej zóne oxiduje glukózaoxidázou a vznikajúci peroxid vodíka oxiduje chromogén na modrozelený (ak je chromogén leukobáza) alebo červenohnedý produkt (ak vzniká chinónimínové farbivo z 4-aminoantipyrínu a fenolu).

Princíp testovacích prúžkov na bielkoviny je založený na využití tzv. proteínovej chyby špeciál-nych indikátorov pH (tetrabrómfenolová modrá, sulfoftaleíny), ktoré v prítomnosti bielkovín reagujú v kyslom prostredí ‘alkalicky‘. Tieto indikátory sa pri pH 3,5 (je zaistené tlmivým roz-tokom prítomným v indikátorovej zóne) sfarbia bez prítomnosti bielkovín na žlto a v prítomnosti bielkovín reagujú ako v zásaditej oblasti a ich sfarbenie prechádza zo zelenej do modrej. Intenzita sfarbenia sa porovná s farebnou stupnicou, z ktorej sa semikvantitatívne určí koncen-trácia bielkovín aj pH moču.

Na určenie pH sa používajú testovacie prúžky obsahujúce v reakčnej zóne zmesný acidobázický indikátor: metylčerveň a brómtymolová modrá. Farebná zmena zóny je od oranžovej cez zelenú až do modrej v intervale pH 4 až 9.



Dusitany vznikajú v organizme redukciou dusičnanov, napr. pôsobením niektorých patogénnych baktérií. Dôkaz dusitanov potom poukazuje na infekciu močového traktu (Escherichia coli, Proteus, Klebsiella, Aerobacter, Citrobacter, Salmonella). Dusitany reagujú v reakčnej zóne so sulfanilamidom v kyslom prostredí za vzniku diazóniovej soli, ktorá kopulačnou reakciou s chinolínovým chromogénom vytvára ružové sfarbenie.

Kyselina askorbová redukuje kyselinu fosfomolybdénovú v reakčnej zóne testovacieho prúžku na molybdénovú modrú. Kyselina askorbová sa určuje predovšetkým preto, že pri jej vysokom príjme v potrave sa prebytok vylučuje močom, a jej vysoká koncentrácia potom interferuje pri mnohých stanoveniach (všetky reakcie s H O2 2, pri ktorých kyselina askorbová rýchlo rozkladá diazóniové soli využívané v kopulačných reakciách).

Leukocyty (test esterázovej aktivity granulocytov). Zvýšené vylučovanie leukocytov močom je hlavným príznakom hnisavého zápalu obličiek a močových ciest. Leukocyturiu možno zistiť stanovením zvýšenej aktivity špecifickej esterázy uvoľňovanej z granulocytov. Esteráza granulo-cytov uvoľňuje v reakčnej zóne z indoxylesteru indoxyl, ktorý sa oxiduje vzdušným kyslíkom na modro sfarbený produkt. Indoxyl môže ďalej reagovať s diazóniovou soľou za vzniku azo-farbiva.

Stanovenie hustoty moču. V reakčnej zóne prúžku na stanovenie hustoty prebieha výmena iónov z moču za ióny H+ polyelektrolytov (kopolymér metylvinyléteru s kyselinou maleínovou). Výmennou reakciou uvoľnené H+ ióny okysľujú slabo tlmený acidobázický indikátor (v reakčnej zóne pôvodne v alkalickej forme) za plynulej zmeny sfarbenia. Zmena sfarbenia závisí hlavne od množstva iónov Na+ + +, K a NH4 , pretože ich koncentrácia je v moči najvyššia. Čím je ich koncentrácia vyššia, tým viac H+ sa uvoľní, a tým kyslejšie reaguje indikátor. Indikátorom je napr. brómtymolová modrá s farebným prechodom modrá – žltá v intervale pH 7,6-6,0. Farebná stupnica pre hustotu moču má potom farebnú škálu od tmavomodrej cez modrozelenú a zelenú do žltej. Z princípu testu je zrejmé, že takto stanovená hustota neposkytuje informáciu o množ-stve neelektrolytov v moči. Špeciálny diagnostický prúžok − tehotenský test (hCG, moč) Ľudský choriový gonadotropín (Human Chorionic Gonadotropin, hCG) je glykoproteín, ktorý sa objavuje v sére aj moči ženy prakticky okamžite po oplodnení a jeho koncentrácia v moči v tehotenstve prudko rastie. Testovací prúžok je vhodný na kvalitatívne a semikvantitatívne určenie hCG vizuálnym vyhodnotením jeho reakcie s dvoma špecifickými protilátkami. Testovací prúžok (obr. 9-3) obsahuje v dolnej časti sorbovanú protilátku (Ab1) označenú farbivom *(Ab *) proti hCG. Vyššie je imobilizovaná protilátka (Ab ) proti Ab1 2 1* a v tretej časti je imobilizovaná protilátka (Ab ) proti hCG-Ab3 1*. Po ponorení testovacieho prúžku do moču vzorka difunduje smerom dohora.



V negatívnom prípade vzorka unáša prakticky len označenú protilátku Ab1*, ktorá sa vychytáva v kontrolnej zóne s Ab2 za vzniku farebného komplexu Ab -Ab2 1*. V kontrolnej zóne vznikne farebný prúžok. V pozitívnom prípade difunduje označená protilátka Ab1* a jej komplex s hCG zo vzorky (hCG-Ab *). Prvá zóna s Ab1 2 zachytí nezreagovanú Ab * a vznikne prvý prúžok Ab -Ab1 2 1* (kontrolná zóna). Druhá zóna s Ab zachytí komplex hCG-Ab * a vznikne komplex Ab -hCG-Ab3 1 3 1*, čo sa prejaví druhým farebným prúžkom (odčítanie vzorky v testovacej zóne).

Testovacia zóna

Kontrolná zóna

hCG

Ab2-Ab1*

Ab3- hCG-Ab1*

Pozitívny test

Ab3

Ab2

Ab1*

Testovací prúžok

Ab3

Ab2-Ab1*

Negatívny test

Obr. 9-3 Tehotenský test testovacím prúžkom

Mikroskopické vyšetrenie močového sedimentu

Okrem fyzikálneho (pH, hustota) a chemického vyšetrenia moču (diagnostické prúžky) sa mikroskopickým vyšetrením hodnotia orgánové a kryštalické súčasti moču. Obvykle sa prezerá zahustený močový sediment získaný odstredením moču. Počet častíc sa vyhodnocuje mikro-skopicky pri zväčšení 20-krát, prezerá sa aspoň 20 zorných polí. Močový sediment možno pred odčítaním v komôrke vyfarbiť. K moču sa pred odstredením pridá činidlo obsahujúce kontrastnú látku (napr. Floxin), vhodnú leukobázu a H O . Leukobáza a H O2 2 2 2 sa využije na vyfarbenie leukocytov na modro a erytrocytov na červeno na základe ich pseudoperoxidázovej aktivity. Kontrastná látka vyfarbí ostatné elementy (valce, epitelie) na slabo ružovo. Vyšetrenie močového sedimentu sa vykonáva predovšetkým pri pozitívnej reakcii na leukocyty (prítomnosť leukocytov a erytrocytov v moči svedčí o ochorení obličiek, infekcii močových ciest).



Kontrolné otázky Opíšte stanovenie albumínu. Opíšte stanovenie ALP a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie AST a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie ALT a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie bielkovín. Opíšte stanovenie glukózy a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie cholesterolu a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie imunoglobulínov. Opíšte stanovenie kreatinínu a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie laktátu a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie LD a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie triacylglycerolov a napíšte reakcie. Opíšte stanovenie Na a K. Opíšte stanovenie Ca a Mg. Opíšte stanovenie chloridov. Opíšte stanovenie fosforu. Opíšte základné vyšetrenie moču - ktoré parametre sa určujú (vyšetrujú). Opíšte princíp diagnostického testovacieho prúžku na semikvantitatívne určenie glukózy v moči. Opíšte princíp diagnostického testovacieho prúžku na semikvantitatívne určenie bielkovín v moči. Opíšte princíp diagnostického testovacieho prúžku na určenie pH moču.


rutinné biochemické vyšetrenia - stuba.skfunkciu (prenáša vyššie karboxylové kyseliny,...

Documents